CN1218048C - 多色荧光物复合扩增str引物设计方法 - Google Patents

Abstract

一种多色荧光物复合扩增STR的引物设计方法，其特征是以公共的一条短引物YPA′与四条在5′端分别加有荧光标记物F1、F2、F3、F4的短引物YPB1′、YPB2′、YPB3′、YPB4′之一构成短引物对；分别在能够与人类基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上一段非人类的基因组序列构成与短引物对配合使用的长引物对。与现有技术相比较，本发明所设计的引物可以在同一反应体系中同时对16个不同的基因座进行扩增，各短引物的结构相似，每条引物间只相差5个碱基，总的短引物数目仅为5条，引物间相互的反应的可能性相对较小，有利于复合PCR的进行，从而能够高效率地大量扩增目的基因片段，实验结果的可重现性极高。

Description

多色荧光物复合扩增STR引物设计方法

技术领域

本发明涉及一种体外一次性扩增多个DNA目的片段的引物设计方法。

背景技术

短串联重复序列(short tandem repeats，简称STR)是由2-7个碱基对作为核心单位，串联重复形成的一类微卫星DNA序列，其片段可采用PCR技术扩增。STR主要由于核心重复单位数目的变化形成了STR基因座的遗传多态性，其等位基因可用银染、荧光标记和放射显影等技术分型。人类基因组中，平均每6～10kb就存在有一个STR基因座，为法医个人识别和亲子鉴定提供了高信息基因座的丰富来源。

STR基因座具有如下特点：(1)在人类基因组中分布广泛，(2)基因片段一般小于400bp，易于扩增并适用于陈旧、降解生物检材的DNA分析，(3)检测的灵敏度比小卫星VNTR基因座高十倍，适用于微量检材的鉴定，(4)同一STR基因座的不同等位基因之间片段长度差别不大，优势扩增不明显。(5)不同STR基因座之间片段长度差别不大，扩增条件相似，可设计在同一反应体系中进行复合扩增，降低成本和检材消耗，提高效率，(6)分析方法简便、判型准确，分型程序明确规范，分型结果图形简单，有利于实现DNA分型的标准化和自动化，有利于分型结果的计算机储存和交换。

复合扩增技术，也叫多重PCR(Multiplex PCR，mpxPCR)，就是在一个反应体系中有多对引物同时扩增多个目标序列。可大幅度地简化操作程序、节省时间和试剂，特别是在法医学鉴定中可以用极少量的检材同时扩增出多个遗传标志而更显其优越性。然而，随着扩增体系中引物数量的增加，引物之间的相互影响越严重，反应动力学变得越复杂，使得复合扩增变得极为困难。目前这种直接混合引物的复合方法使复合的基因位点数目受到限制，已成为进一步增加复合扩增位点的颈瓶和难点，因而探索在不降低灵敏度的情况下复合更多的位点、条件易于优化的新方法对于法医复合扩增的进一步发展很有必要。

基于检测体系的不同，目前世界上将复合扩增主要可以分为两大类：银染复合扩增和荧光复合扩增。银染复合扩增是复合扩增后的产物利用普通电泳槽分离，利用硝酸银进行染色检测的方法。此方法较费时、自动化程度不高，准确性、重复性难以保证。荧光复合扩增是目前世界上用得最普遍的方法。它是在普通的复合扩增的PCR其中一条引物(任何PCR反应都必须有两条引物)的一端加上荧光标记物，PCR扩增产物利用自动激光荧光遗传检测仪进行检测。所加的荧光标记物可以是多种，例如，与ABI310遗传分析仪配套的荧光标记物就有5FAM，JOE，NED，ROX，VIC，PET，LIZ等。

荧光复合扩增较银染复合扩增有以下几个优点：快速、灵敏、省时、准确、自动化程度高、可重复性强等。基于以上几个原因，荧光复合扩增已成为目前世界上用得最普遍同时也是最先进的复合扩增方法。现在，国内外大多数实验室进行荧光复合扩增都采用试剂盒化的方法，即购买试剂公司的荧光复合扩增试剂盒进行实验。目前应用最多的是美国的Applied Biosystems公司和Promega公司的产品。他们的产品主要有以下几种：1. PowerPlexTM 1.1( Promega公司)2.PowerPlex^TM 1.2( Promega公司)3. PowerPlex ^TM  2.1( Promega公司).4. PowerPlex ^TM  16( Promega公司)5.AmpFlSTR( PE Applied Biosystems公司)6. AmpFlSTR Identifiler( PE Applied Biosystems公司)7.AmpFlSTR Profiler( PE Applied Biosystems公司)8. AmpFlSTR Profiler Plus( PE Applied Biosystems公司)9. AmpFlSTR SGM Plus( PE Applied Biosystems公司)10. Y-Plex ^TM  6( Reliagene Technologies公司)。

但这些试剂盒在法医学应用实践中仍然存在以下问题：(1)目前应用最多的是美国的Applied Biosystems公司和Promega公司的产品。AppliedBiosystems公司复合最多的商业化荧光复合扩增试剂盒是STRAmpFLSTRIdentifiler^TM PCR Amplification Kit，包括15个STR基因座：CSF1PO，D3S1358，D5S818，D7S820，D8S1179，D13S317，D16S539，D18S51，D21S11，vWA，FGA，THO1，TPOX，D2S1338和D19S433；已涵盖其全部的商业性STR位点。当采用这些试剂盒的客户做亲子鉴定需要增加遗传标记时则遇到困难。Promega公司情况类似。(2)这些STR基因座都是基于中国群体以外的群体(主要是白人群体)资料而开发的，其中有些基因座，比如TPOX，在中国群体的基因频率分布较差，个人识别能力较低。(3)国外商品化试剂盒价格昂贵。

本申请人在中国发明专利申请02133812.4号中公开了一种复合扩增STR的引物设计方法，该方法以两条非人类的基因组序列

YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)

YPB(5′--TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)，作为一对短引物；同时，在能够与人类基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物对的5′端分别加上该对短引物，得到长引物对。上述方法中短引物的选取是关键，在选定短引物之后，一个待扩增的基因座的长引物也就相应被选定。这是因为，长引物中的能够与人类基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物实际上就是可以与待扩增基因座的人类基因组特异性结合的原始引物，它由待扩增基因座的人类基因组序列所决定，且因待扩增基因座的序列的不同而不同。在上述方法中，所设计的长、短引物能够用于在同一PCR反应体系中同时对四个基因座的目的基因进行复合扩增。在复合扩增的第一阶段，利用长引物扩增出同时带有目的基因片段和与短引物配对的非人类基因组序列的产物；而在复合扩增第二阶段，则利用一对短引物对多个基因座的目的基因片段同时进行扩增。利用上述方法设计的引物能够大量扩增目的基因片段，且无需在实验过程中繁琐地调整各对引物的浓度，简化了整个实验过程，从而具有优点。但是，由于上述方法仍然属于银染复合扩增方法，在对扩增结果进行检测时，必然存在着前面述及的费时、自动化程度不高，准确性较差等弊病，虽然其对实验设备的要求不高，符合当前中国大多数分子生物学实验室的需要，但却不能满足已经具有自动激光荧光遗传检测仪的实验室的更高要求。因此，上述现有方法仍然有待改进。

发明内容

本发明的目的是在沿用上述现有方法基本思路的基础上，重新设计出用于荧光复合扩增的短引物。

本发明的方法是：以公共的一条短引物YPA′

YPA′(5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)，与以下四条在5′端分别加有荧光标记物F1、F2、F3、F4的短引物YPB1′、YPB2′、YPB3′、YPB4′之一构成短引物对：

YPB1′(5′--F1-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)

YPB2′(5′--F2-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-3′)

YPB3′(5′--F3-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′)

YPB4′(5′--F4-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-3′)；

分别在能够与人类基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上一段非人类的基因组序列：

YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)

YPB1(5′--TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)构成与短引物对YPA′、YPB1′配合使用的长引物对YPA-P1和YPB1-P2；

分别在能够与人类基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上一段非人类的基因组序列：

YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)

YPB2(5′--TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-3′)构成与短引物对YPA′、YPB2′配合使用的长引物对YPA-P1和YPB2-P2；

分别在能够与人类基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上一段非人类的基因组序列：

YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)

YPB3(5′--TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′)构成与短引物对YPA′、YPB3′配合使用的长引物对YPA-P1和YPB3-P2；

分别在能够与人类基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上一段非人类的基因组序列：

YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)

YPB4(5′--TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-3′)构成与短引物对YPA′、YPB4′配合使用的长引物对YPA-P1和YPB4-P2。

在本发明中，上述荧光标记物F1、F2、F3、F4的成份和颜色各不相同，它们均可以直接采用前述与荧光遗传检测仪配套的现有荧光标记物，如5FAM、VIC、NED、PET等。

此处，我们选取的4条短引物(YPB1′、YPB2′、YPB3′、YPB4′)不能形成引物二聚体，都是非人类基因组序列，它们的物理动力学特性相似。

上述1条公共短引物分别与4条短引物构成了4对短引物，即YPA′和YPB1′、YPA′和YPB2′、YPA′和YPB3′、YPA′和YPB4′，而除公共短引物YPA′之外的4条不同的短引物上分别加有不同颜色的荧光标记物。

依照前述专利申请所介绍的方法，每对短引物可扩增4个不同的基因座，那么4对不同的短引物就可以扩增16个不同的基因座。单对短引物的复合扩增过程及原理与前述专利申请完全相同，只是短引物的结构与以前不同，与短引物相对应的长引物也与以前不同。

同时，利用前述专利申请介绍的方法，单个复合PCR反应中可以同时扩增4基因座，此时体系中有1对短引物，4对不同基因座特异性的长引物。依此类推，如果我们想要扩增8个基因座，就需要2对不同的短引物和8对不同基因座特异性的长引物；同理，当扩增12个基因座时，就需要3对不同的短引物和12对不同基因座特异性的长引物；当扩增16个基因座时，则需要4对不同的短引物和16对不同基因座特异性的长引物。当然，此处所使用的短引物对已不再是前述专利申请中所给出的短引物对，而是本发明所给出的短引物对(每个短引物对均由一个公共短引物和一个含有荧光标记物的短引物构成)。同时，虽然此处所使用的长引物对也是按前述专利申请所介绍的方法得到，但其却是与本发明所给出的短引物对相对应的长引物对。

利用本发明中所提供的短引物和与之对应的长引物对目的基因座进行复合扩增后，扩增产物的DNA的片段的大小不同、相互分离并含有荧光标记物，从而可以利用荧光遗传检测仪进行检测。

在本发明中，分别由上述YPA′和YPB1′、YPA′和YPB2′、YPA′和YPB3′、YPA′和YPB4′构成4对短引物之后，具有以下几个优点：(1)4对引物中有一条公共引物YPA′，总的短引物数目是5条，这5条短引物就能实现同时对16个不同的基因座进行扩增；国外其他人用8条短引物扩增16个基因座，本发明方案中的短引物数目有所下降。而在复合扩增体系中，引物数越少越有利于PCR的进行。(2)上述加有荧光标记物的短引物的结构相似，每条引物间只相差5个碱基，引物间相互的反应的可能性相对较小，有利于复合PCR的进行。

我们是按照如下原则设计公共引物序列的：(1)公共引物与人类基因组无同源性；(2)不低于特异引物的退火温度；(3)公共引物之间及其与特异引物之间不形成引物二聚体；(4)不形成稳定的二级结构。

另外，本发明在公共短引物YPA′的5′端设置了序列GTTCTT。设置该段序列的目的是：(1)由于引物对中的另外一条短引物的5′端都加上了荧光标记物，因此加入该段序列可以平衡各个引物对。(2)实验证明，设置该段序列有利于复合扩增的进行，结果更好。

在本发明中，实际上是将上述公共短引物YPA′中的荧光标记物去掉，就得到长引物中使用的基因组序列YPA。另外，将短引物YPB1′、YPB2′、YPB3′、YPB4′中的序列GTTCTT去掉，就得到长引物中使用的基因组序列YPB1、YPB2、YPB3、YPB4。

与前述专利申请相同的是，在本发明中，长引物中能够与人类基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、P2实际上就是可以与待扩增基因座的人类基因组特异性结合的原始引物。亦即是说，引物P1、P2的序列由待扩增基因座的人类基因组序列所决定，且因待扩增基因座的序列的不同而不同。同时，对于给定的待扩增基因座来说，其原始引物均已在互联网上GDB基因数据库中公布，公众可以方便地从该基因数据库查到与待扩增基因座相对应的原始引物。

与前述现有技术相比较，本发明所设计的引物可以在同一反应体系中同时对16个不同的基因座进行扩增，各短引物的结构相似，每条引物间只相差5个碱基，总的短引物数目仅为5条，引物间相互的反应的可能性相对较小，有利于复合PCR的进行，从而能够高效率地大量扩增目的基因片段，实验结果的可重现性极高。

本发明的内容结合以下实施例作更进一步的说明，但本发明的内容不仅限于实施例中所涉及的内容。

具体实施方式

实施例1：在本实施例中，我们选用以下四个基因座：DYS434，A10，DYS438，DYS439为一组，标记一种颜色的荧光。

短引物对为

YPA′(5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)

YPB1′(5′--F1-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)

在本实施例的YPB1′中，荧光标记物F1为市售的现有红色荧光标记物ROX，其分子式为

长引物YPA-P1和YPB1-P2为分别在能够与基因座DYS434、A10、DYS438和DYS439的原始引物P1、P2的5′端加上YPA、YPB1而得到的基因组序列。互联网上GDB基因数据库中公布的DYS434基因座的原始引物

P1：5’-CACTCCCTGAGTGCTGGATT-3’

P2：5’-GGAGATGAATGAATGGATGGA-3’

A10基因座的原始引物

P1：5’-CCTGCCATCTCTATTTATCTTGCATATA-3’

P2：5’-ATAAATGGAGATAGTGGGTGGATT-3’

DYS438基因座的原始引物

P1：5’-TGGGGAATAGTTGAACGGTAA-3’

P2：5’-GTGGCAGACGCCTATAATCC-3’

DYS439基因座的原始引物

P1：5’-TCCTGAATGGTACTTCCTAGGTTT-3’

P2：5’-GCCTGGCTTGGAATTCTTTT-3’

在长引物YPA-P1和YPB1-P2中，YPA和YPB1为：

YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)

YPB1(5′--TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)

与之相对应，本实施例中的DYS434、A10、DYS438和DYS439基因座长引物如下表所示：

基因座	长引物
		DYS434A10DYS438DYS439	5′YPA-CACTCCCTGAGTGCTGGATT5′YPB1-GGAGATGAATGAATGGATGGA5′YPA-ATAAATGGAGATAGTGGGTGGATT5′YPB1-CCTGCCATCTCTATTTATCTTGCATATA5′YPA-TGGGGAATAGTTGAACGGTAA5′YPB1-GTGGCAGACGCCTATAATCC5′YPA-TCCTGAATGGTACTTCCTAGGTTT5′YPB1-GCCTGGCTTGGAATTCTTTT

亦即是说，对应于上述各基因座，本实施例中采用的长引物为

DYS434基因座长引物：

YPA-P1：5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-CACTCCCTGAGTGCTGGATT-3′

YPB1-P2：5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-GGAGATGAATGAATGGATGGA-3′

A10基因座长引物：

YPA-P1：5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-CTGCCATCTCTATTTATCTTGCATATA-3’

YPB1-P2：5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-ATAAATGGAGATAGTGGGTGGATT-3’

DYS438基因座长引物：

YPA-P1：5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-TGGGGAATAGTTGAACGGTAA-3’

YPB1-P2：5-′TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-GTGGCAGACGCCTATAATCC-3’

DYS439基因座长引物：

YPA-P1：5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-TCCTGAATGGTACTTCCTAGGTTT-3’

YPB1-P2：5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-GCCTGGCTTGGAATTCTTTT-3’

为进一步说明本实例中所设计引物的使用方法和使用效果，下面继续说明本实施例中所设计的引物用于复合扩增反应时的具体过程。

复合扩增反应在Taq酶(华美，国产)PCR反应体系中进行：总体积37.5μl，DNA模板约3ng、dNTP 7.5μL(0.2mMol/l)、Taq酶(华美，国产)3u、10Xbuffer 3.75μl、Mg²⁺3μl(2.25mmol/L)、BSA 3.751μl、引物混合物(*)2.8μL。

以下为扩增参数：(注：当体系升温到94℃时开始加Taq酶)

94℃            3分钟

94℃            30秒

56℃            1分钟

72℃            30秒            10个循环

90℃            30秒

56℃            30秒

72℃            30秒            22个循环

60℃            30分钟

4℃             保存

在具体进行复合扩增时，每一个复合扩增体系在扩增中实际包含两个连续的反应过程。

第一个过程：基因组模板DNA在94℃变性3分钟后，94℃ 30秒、56℃60秒和72℃ 30秒循环10个周期。这个过程是5’端加有非人类基因组序列的位点特异性引物在起作用，启动复合扩增反应，将四个目标靶序列扩增，同时将非人类基因组序列整合到所扩增的片段上。

第二个过程：上一过程的扩增产物做为PCR反应的模板DNA，90℃ 30秒、56℃ 30秒和72℃ 30秒循环22个周期。这一过程以非人类基因组公共序列主起引发延伸的作用，使得扩增反应继续进行。这一过程中虽然扩增的目标靶序列长度有所不同，但只有一对引物在起作用，实际上是将四重复合扩增反应转变成了“一重扩增反应”。最后60℃保温30分钟。

上述复合扩增后所得到的PCR产物利用ABI310遗传分析仪(PE美国)检测分析。PCR产物0.4μl，GS500 ROX size standard 0.2μl，Hi-Di^TMformamide13μl，混匀编号，放入自动进样盘。电进样15000V、5s。电泳15000v，24分钟。Date Collection软件收集数据，Genescan3.7分析数据，用修改过的ABI AmpFISTR PLUS kit Kazam macro在Genetype3.7自动分型。等位基因的辨认通过与等位基因分型标准物比较来确认，窗口范围+/-0.5bp。

其间，对PCR产物进行电泳分离：

用T＝8％、C＝5％长度20cm的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR产物。1×TBE作电泳缓冲液，取2μl扩增产物加等量载样缓冲液，以GeneRule^TM50bp作为DNA分子碱基数量标准，以自制等位基因ladder作为分型标准物。恒压750V电泳2个小时。

实施例2：在本实施例中，我们选用以下四个基因座：DYS453、DYS513、DYS19和DYS463为一组，标记一种颜色的荧光。

短引物对为

YPA′(5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)

YPB2′(5′--F2-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-3′)

在本实施例的YPB2′中，荧光标记物F2为市售的现有黄色荧光标记物NED，其分子式为

长引物YPA-P1和YPB2-P2为分别在能够与基因座DYS453、DYS513、DYS19和DYS463的原始引物P1、P2的5′端加上YPA、YPB2而得到的基因组序列。互联网上GDB基因数据库中公布的DYS453基因座的原始引物

P1：5′-GGGTAACAGAACAAGACAGT-3′

P2：5′-CTAAAAGTATGGATATTCTTCG-3′

DYS513基因座的原始引物

P1：5′-ATTGATCCATCCGTCTGTCC-3′

P2：5′-GTTGGATGAAGGGAGAGCAG-3′

DYS19基因座的原始引物

P1：5′-CTACTGAGTTTCTGTTATAGT-3′

P2：5′-ATGGCATGTAGTGAGGACA-3′

DYS463基因座的原始引物

P1：5′-AATTCTAGGTTTGAGCAAAGACA-3′

P2：5′-ATGAGGTTGTGTGACTTGACTG-3′

在长引物YPA-P1和YPB2-P2中，YPA和YPB2为：

YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)

YPB2(5′--TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-3′)

与之相对应，本实施例中的DYS453、DYS513、DYS19和DYS463基因座长引物分别为

DYS453基因座长引物：

YPA-P1：5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-GGGTAACAGAACAAGACAGT-3′

YPB2-P2：5′-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-CTAAAAGTATGGATATTCTT-3′

DYS513基因座长引物：

YPA-P1：5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-ATTGATCCATCCGTCTGTCC-3′

YPB2-P2：5′-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-GTTGGATGAAGGGAGAGCAG-3′

DYS19基因座长引物：

YPA-P1：5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-CTACTGAGTTTCTGTTATAGT-3′

YPB2-P2：5′-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-ATGGCATGTAGTGAGGACA-3′

DYS463基因座长引物：

YPA-P1：5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-AATTCTAGGTTTGAGCAAAGACA-3′

YPB2-P2：5′-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-ATGAGGTTGTGTGACTTGACTG-3′

本实例中所设计引物的使用方法和使用效果与实施例1相类似，扩增体系及扩增参数也与实施例1相同，故从略。

实施例3：在本实施例中，我们选用以下四个基因座：DYS456、DYS520、DYS447和DYS552为一组，标记一种颜色的荧光。

短引物对为

YPA′(5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)

YPB3′(5′--F3-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′)

在本实施例的YPB3′中，荧光标记物F3为市售的现有绿色荧光标记物JOE，其分子式为

长引物YPA-P1和YPB3-P2为分别在能够与基因座DYS456、DYS520、DYS447和DYS552的原始引物P1、P2的5′端加上YPA、YPB3而得到的基因组序列。互联网上GDB基因数据库中公布的DYS456基因座的原始引物

P1：5’-CCCATCAACTCAGCCCAAAAC-3’

P2：5’-GGACCTTGTGATAATGTAAGATA-3’

DYS520基因座的原始引物

P1：5’-AACAGCCTGCCCAACATAGT-3’

P2：5’-ACCATCATGCCCTGCAATA-3’

DYS447基因座的原始引物

P1：5’-GGGCTTGCTTTGCGTTATCT-3’

P2：5’-GGTCACAGCATGGCTTGGTT-3’

DYS552基因座的原始引物

P1：5’-CCATAGTGCCGAGGTCAAGT-3’

P2：5’-AACACCTGATGCCTGGTTG-3’

在长引物YPA-P1和YPB3-P2中，YPA和YPB3为：

YPA(5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)

YPB3(5′-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′)

与之相对应，本实施例中的DYS456、DYS520、DYS447和DYS552基因座长引物分别为

DYS456基因座长引物：

YPA-P1：5′-ATTTAGGTGACTATAGAATAC-CCCATCAACTCAGCCCAAAAAC-3′

YPB3-P2：5′-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-GGACCTTGTGATAATGTAAGATA-3′

DYS520基因座长引物：

YPA-P1：5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-AACAGCCTGCCCAACATAGT-3′

YPB3-P2：5′-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-ACCATCATGCCCTGCAATA-3′

DYS447基因座长引物：

YPA-P1：5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-GGGCTTGCTTTGCGTTATCT-3′

YPB3-P2：5′-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-GGTCACAGCATGGCTTGGTT-3′

DYS552基因座长引物：

YPA-P1：5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-CCATAGTGCCGAGGTCAAGT-3′

YPB3-P2：5′-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-AACACCTGATGCCTGGTTG-3′

本实例中所设计引物的使用方法和使用效果与实施例1相类似，扩增体系及扩增参数也与实施例1相同，从略。

实施例4：在本实施例中，我们选用以下四个基因座：DYS523、DYS443、Y-GATA-A8和DYS510为一组，标记一种颜色的荧光。

短引物对为

YPA′(5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)

YPB4′(5′--F4-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-3′)；

在本实施例的YPB4′中，荧光标记物F4为市售的现有蓝色荧光标记物FAM，其分子式为

长引物YPA-P1和YPB4-P2为分别在能够与基因座DYS523、DYS443、Y-GATA-A8和DYS510的原始引物P1、P2的5′端加上YPA、YPB4而得到的基因组序列。互联网上GDB基因数据库中公布的DYS523基因座的原始引物

P1：5′-GGTCAGCAGTGAAAGATAGGC-3′

P2：5′-TCCATCCATCCATCTACCTG-3′

DYS443基因座原始引物

P1：5′-TTTCATTGGCCACCTGACATTAC-3′

P2：5′-CGCTTCCATTTACACTTCCTGTG-3′

YGATA-A8基因座原始引物

P1：5′-CGGCATCTATCTATGTGTCTGTC-3′

P2：5′-AGTAGATACAAAGAGAGCATAGACAAAT-3′

DYS510基因座原始引物

P1：5′-TTTTTCCTCCCTTACCACAGA-3′

P2：5′-TCTGGAGAAGACAGAACTTGTCA-3′

在长引物YPA-P1和YPB4-P2中，YPA和YPB4为：

YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)

YPB4(5′--TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-3′)

与之相对应，本实施例中的DYS523、DYS443、Y-GATA-A8和DYS510基因座长引物分别为

DYS523基因座长引物：

YPA-P1：5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-GGTCAGCAGTGAAAGATAGGC-3′

YPB4-P2：5′-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-TCCATCCATCCATCTACCTG-3′

DYS443基因座长引物：

YPA-P1：5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-TTTCATTGGCCACCTGACATTAC-3′

YPB4-P2：5′-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-CGCTTCCATTTACACTTCCTGTG-3′

Y-GATA-A8基因座长引物：

YPA-P1：5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-CGGCATCTATCTATGTGTCTGTC-3′

YPB4-P2：5′-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-AGTAGATACAAAGAGAGCATAGACAAAT-3′

DYS510基因座长引物：

YPA-P1：5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-TTTTTCCTCCCTTACCACAGA-3′

YPB4-P2：5′-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-TCTGGAGAAGACAGAACTTGTCA-3′

本实例中所设计引物的使用方法和使用效果与实施例1相类似，扩增体系及扩增参数也与实施例1相同，从略。

需要说明的是，也可以将以上实施例1、实施例2、实施例3和实施例4中所给出的长、短引物放在一个扩增体系中使用，利用它们在同一体系中同时对实施例1、2、3、4中所涉及的16个不同的基因座进行复合扩增。同时，各短引物中的荧光标记物可以互换，如在实施例1中，YPB1′中的荧光标记物F1采用的是市售的现有荧光标记物ROX，但该荧光标记物F1也可采用实施例2中所给出的荧光标记物NED、实施例3中所给出的荧光标记物JOE和实施例4中所给出的荧光标记物FAM。依次类推，实施例2、3、4中的荧光标记物F2、F3、F4也可进行更换。

Claims (1)

1、一种多色荧光物复合扩增STR引物设计方法，其特征是：

(1)、以公共的一条短引物

    YPA′     5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′与四条在5′端分别加有荧光标记物F1、F2、F3、F4的短引物YPB1′、YPB2′、YPB3′、YPB4′构成4对短引物，即短引物对YPA′和YPB1′、YPA′和YPB2′、YPA′和 YPB3′、YPA′和YPB4′，所说的短引物YPB1′、YPB2′、YPB3′、YPB4′为：

    YPB1′    5′--F1-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′

    YPB2′    5′--F2-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-3′

    YPB3′    5′--F3-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′

    YPB4′    5′--F4-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-3′；

(2)、分别在能够与人类基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上一段非人类的基因组序列：

    YPA       5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′

    YPB1      5′--TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′

构成与短引物对YPA′、YPB1′配合使用的长引物对YPA-P1和YPB1-P2；

(3)、分别在能够与人类基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上一段非人类的基因组序列：

    YPA       5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′

    YPB2      5′--TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-3′

构成与短引物对YPA′、YPB2′配合使用的长引物对YPA-P1和YPB2-P2；

(4)、分别在能够与人类基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上一段非人类的基因组序列：

    YPA       5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′

    YPB3      5′--TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′

构成与短引物对YPA′、YPB3′配合使用的长引物对YPA-P1和YPB3-P2；

(5)、分别在能够与人类基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上一段非人类的基因组序列：

    YPA       5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′

    YPB4      5′--TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-3′

构成与短引物对YPA′、YPB4′配合使用的长引物对YPA-P1和YPB4-P2。