CN1806046A - 检测胰岛淀粉样蛋白突变基因的方法及其核酸探针和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
一端标记了荧光染料且荧光染料的荧光在杂交发生时会减弱的核酸探针，其中在碱基序列上含有突变的该核酸产生了胰岛淀粉样蛋白的氨基酸序列上第20位的丝氨酸被甘氨酸替代的突变(IAPP S20G突变)。该核酸探针的碱基序列与得自由SEQ ID NO：1代表的结束于247位的碱基序列互补，由13－30个碱基组成，荧光染料标记在5’端。用该荧光探针，测定荧光染料的荧光以进行熔点曲线分析。根据熔点曲线分析的结果来检测突变。
Description
技术领域
本发明涉及到检测胰岛淀粉样蛋白突变基因的方法及其核酸探针和试剂盒。
背景技术
胰岛淀粉样多肽(IAPP)是高发于2型糖尿病病人胰岛内的淀粉样沉淀物的主要成份，与胰岛素一道由胰岛β细胞分泌入血液中。在日本2型糖尿病病人中大约有2.6％的病人有IAPP氨基酸序列第20位上的丝氨酸被甘氨酸替代的错义突变，特别是，在年轻病人中该突变大约占到了10％。据说该突变的存在增大了糖尿病发病的危险。
如果导致IAPP第20位上甘氨酸替代丝氨酸的突变(又称为“S20G突变”)存在，一个限制性内切酶的识别位点将会在突变位置形成，这样，能用PCR扩增DNA的方法扩增包含有突变位点的片段，再用限制性内切酶消化扩增产物并用电泳分离确定该DNA能否被消化来检测突变(PCR-RFLP)(例子参见The Japanese Journal of ClinicalPathology，卷44，8，页778-782，1996)。
因为PCR扩增几个分子的模板数亿次，甚至极微量的污染即可引起假阳性或假阴性的结果。用PCR-RFLP的方法，PCR完成后需要收集扩增产物并用限制性内切酶进行处理，这样扩增产物有可能污染后续的反应体系，因此可得到一个假阳性或假阴性的结果。
进一步来说，PCR完成后用限制性内切酶处理DNA，再用电泳分离，这样，检测的时间就相当长。另外，该过程复杂，难以实行自动化检测。
更进一步，一个众所周知的方法是用PCR扩增含有突变的区域，然后用荧光染料标记的核酸探针进行熔点曲线分析，根据熔点曲线分析的结果分析突变(Clinical Chemistry，vol.46，5，pp.631-635，2000；Japanese Patent Application Laid-open(Kokai)No.2002-119291)。
发明公开
本发明的目的是要鉴别一个有效检测IAPP上S20G突变的猝灭探针并进而提供检测IAPP上S20G突变的方法和试剂盒。
关于上述利用探针方法的文献只提到，涉及到探针设计，探针应该被设计为：当一个末端标记了荧光染料的探针与一个靶核酸杂交后，探针与核酸的杂交子应该形成两个或两个以上的核苷酸对且至少在末端有一个GC对。关于IAPP上的S20G突变，本发明的发明人设计了一个能够满足上述条件的猝灭探针并进行了尝试性检测，然而，可用于检测的猝灭探针没有一个是能够轻易获得的。
本发明的发明人发现，根据IAPP上含S20G突变的特殊序列设计猝灭探针，可以通过用猝灭探针进行熔点曲线分析来检测IAPP上的S20G突变
以下由本发明提供：
(1)一段末端标记了荧光染料且荧光染料的荧光在杂交发生时会减弱的核酸探针，该核酸探针具有一段与SEQ ID NO：1的核苷酸序列中一段结束于247位的序列互补的序列，长度为13-30个核苷酸，荧光染料标记在所述探针的5′端。
(2)(1)中的核酸探针，其中该核酸探针具有SEQ ID NO：12或13的核苷酸序列。
(3)一种检测突变的方法，包括使用荧光染料标记的核酸探针并测定荧光染料的荧光来对有单核苷酸多态性位点的核酸进行熔点曲线分析，并根据熔点曲线分析的结果来检测突变，其中单核苷酸多态性为编码胰岛淀粉样多肽的核酸上的一个核苷酸序列的突变，该突变导致了胰岛淀粉样多肽氨基酸序列上20位的丝氨酸被甘氨酸替代的突变，所述核酸探针为(1)或(2)中定义的核酸探针。
(4)(3)中的方法，其中样品中具有单核苷酸多态位点的核酸区段被扩增，以获取有单核苷酸多态性的核酸。
(5)(4)中的方法，其中扩增通过DNA多聚酶法来进行。
(6)(5)中的方法，其中扩增在有核酸探针存在的条件下进行。
(7)(3)中定义的方法的试剂盒，包括一个末端标记了荧光染料且荧光染料的荧光在杂交发生时会减弱的核酸探针，该核酸探针具有一段与SEQ ID NO：1的核苷酸序列中一段结束于247位的核苷酸序列互补的核苷酸序列，长度为13-30个核苷酸，荧光染料标记在所述探针的5′端。
(8)(7)中的试剂盒，其中核酸探针具有SEQ ID NO：12或13的核苷酸序列。
(9)(7)或(8)中的试剂盒，还包含通过DNA多聚酶法扩增编码胰岛淀粉样多肽的核酸上的核苷酸序列中含有突变的区段的引物，该突变导致了胰岛淀粉样多肽氨基酸序列上20位的丝氨酸被甘氨酸替代的突变。
附图简述
图1显示不能鉴别突变的猝灭探针的位置。
图2显示能够鉴别突变的猝灭探针的位置。
图3显示了就基因组DNA绝对量而言，实施例1的方法的敏感性。
图4显示实施例1中方法的可重复性。
图5显示了就测定突变型比率而言，实施例1的方法的敏感性和定量性。
实施本发明的最佳模式
<1>本发明的探针和本发明的检测方法
本发明的探针是末端标记有荧光染料且一旦杂交发生其荧光染料的荧光会减弱的核酸探针，该核酸探针具有一段与SEQ ID NO：1序列中一段结束于247位的序列互补的序列，长度为13-30个核苷酸，荧光染料标记在所述探针的5′端。
在本说明书中，一段核苷酸序列互补于目标核苷酸序列意味着该段核苷酸序列与目标核苷酸序列全长互补。
除了具有一段与SEQ ID NO：1序列中一段结束于247位的序列互补的序列(含有IAPP上S20G突变型的核苷酸的序列)，长度为13-30个核苷酸外，本发明的探针可以与专利文件1中描述的猝灭探针相似。本发明使用的猝灭探针核苷酸序列的例子包括SEQ ID NO：12或13的核苷酸序列。作为荧光染料，专利文件1中描述的那些均可被用，其具体例子包括FAM(商标)、TAMRA(商标)、BODIPY(商标)、FL等。荧光染料可以通过常用的方法联接到寡核苷酸上，如通过专利文献1中描述的方法。
本发明的检测方法是用分析具有单核苷酸多态性的位点的核酸的熔点曲线分析法来检测突变，即用荧光染料标记的核酸探针，测定荧光染料的荧光，并根据熔点曲线分析的结果来检测突变。其特征在于单核苷酸多态性为导致胰岛淀粉样多肽氨基酸序列上20位的丝氨酸被甘氨酸替代的编码胰岛淀粉样多肽的核酸上的一个核苷酸序列的突变，其核酸探针为本发明的探针。
本发明的检测方法可以根据常用的核酸扩增和熔点曲线分析法(Tm分析)进行，但扩增的区段是编码IAPP的DNA上含有S20G突变的区段，且使用本发明的探针。
作为核酸扩增的方法，多聚酶法为优选，其实例为PCR、ICAN、LAMP等。当用多聚酶进行扩增时，以在本发明的探针存在的条件下进行扩增为优选。本领域技术人员能很容易地根据所用探针调节扩增和其他反应条件。在这一方法中，只有探针的熔解值(Tm)分析是在核酸扩增后进行的，因此没有必要在反应完成后再处理扩增产物，这样，就没有污染扩增产物的危险。再者，检测和扩增使用的是同一仪器，甚至没有必要移出反应管，所以，容易实现方法的自动化操作。
以下将用PCR的例子为样板对本方法作进一步阐述，PCR使用的引物对可以用设计常规PCR引物对同样的方法来设计，只是设计时要能使与本发明的探针杂交的区段被扩增出来，引物的长度和熔解温度通常分别为10-40个核苷酸和40-70℃，优选的为15-25个核苷酸和55-60℃，引物对的引物在长度上可以不同，然而，引物的熔解温度最好能大致相同(通常差别在2℃之间)。熔解值为用最邻近法计算所得到的值。引物对的例子包括具有SEQ ID NOS：2和3核苷酸序列的引物对。
PCR优选在有本发明的探针存在的条件下进行，这样，在扩增反应完成后无需再对扩增产物作任何操作就能进行熔解温度分析。本领域技术人员能够很容易地根据所用探针调节引物的Tm值及PCR的反应条件。
以下是组成PCR反应混合物的一个典型例子：
表1
| DNA片段引物探针核苷酸DNA多聚酶Tris-HCl(pH8.4-9.0)MgCl2KCl甘油(液体终体积：10-100μl) | 101-108分子反应200-1000nM100-1000nm各20-200nM0.01-0.03U/μl5-20mM1.5-3mM10-100mM0-20％ |
另外，以下是温度循环的一个典型例子，通常将重复该温度循环25-40次。
(1)90-98℃变性1-60秒
(2)60-70℃退火10-60秒
(3)60-75℃延长10-180秒
当退火和延长同时进行时，例如可在60-70℃条件下反应10-180秒。
除了要测定标记在本发明的探针上的荧光染料的荧光外，Tm分析能用常规方法进行。荧光检测可用适合于本荧光染料波长的激发光和测定发射波长的光的强度来完成，Tm分析时温度的增高速率通常为0.1-1℃/秒。Tm分析时对反应混合物成分并无特别限制，只要探针和含有与探针核苷酸序列互补序列的核酸能相互杂交即可。但一价阳离子浓度通常应为1.1-5mM，pH值通常应为7-9。由于DNA多聚酶法如PCR扩增的反应混合物，通常都能满足这些条件，其扩增完成后的反应混合物能被直接用于Tm分析。
IAPP上S20G突变可根据Tm分析结果以常规方式来检测。本发明的检测方法不仅能够检测突变的存在与否，还能定量突变型DNA以及确定野生型DNA与突变型DNA的比率。
<2>本发明的试剂盒
本发明的试剂盒是用于本发明第二种检测方法的试剂盒，该试剂盒的特征是包含末端标记有荧光染料且荧光染料的荧光在杂交发生时会减弱(猝灭探针)的核酸探针，该核酸探针具有一段与SEQ IDNO：1序列中一段结束于247位的序列互补的序列，长度为13-30个核苷酸，其荧光染料标记在所述探针的5′端。
就本发明的探针而言，猝灭探针为如上描述的。
本发明的试剂盒可以包括有本发明的检测方法所需的用于核酸扩增的试剂，特别是，除了猝灭探针外，还包括DNA多聚酶扩增所需的引物。
在本发明的试剂盒中，猝灭探针，引物和其他试剂可作为单一试剂提供，或其中的一部分可作为混合物提供。
实施例
将以下列实施例为参考对本发明作更具体地阐述。
实施例1
表2列出的引物是根据人IAPP基因上(SEQ ID NO：1)含S20G突变的核苷酸序列来设计的，由此，含有S20G突变的区段就能被扩增出来。引物在SEQ ID NO：1上的位置和其核苷酸数在表2中均有标示。
表2
| 引物名 | 序列(5’-3’) | 核苷酸数 | 位置 | SEQ ID NO： |
| FR | CacatgtgcaacgcagcgCtcttgccatatgtattggatccc | 1824 | 192-209296-273 | 23 |
然后，设计了表3中列出的末端有C的探针。探针在SEQ ID NO：1上的位置和其核苷酸数在表3中均有标示。进一步，核苷酸序列中的大写字母代表IAPP上的S20G突变位点，3’端的(P)代表磷酸化。探针用常规方法标记了BODIPY(商标)FL或TAMRA(商标)。
表3
| 探针名 | 序列(5’-3’) | 核苷酸数 | 位置 | SEQ ID NO |
| 5FL-mt-5-145FL-mt-5-155FL-wt-5-225FL-mt-5-223FL-wt-4-253FL-mt-3-225FL-wt-2-245FL-mt-2-245FL-mt-1-215T-mt-1-215FL-mt-1-185T-mt-1-185FL-wt-1-18 | (BODIPY FL)-cattccGgcaacaa-(p)(BODIPY FL)-cattccGgcaacaac(p)(BODIPY FL)-cattccAgcaacaactttggtg-(p)(BODIPY FL)-cattccGgcaacaactttggtg-(p)caccaaagttgttgcTggaatgaac-(BODIPY FL)gaatggcaccaaagttgttgcC-(BODIPY FL)(BODIPY FL)-cTggaatgaactaaaaaatttgcc-(p)(BODIPY FL)-cCggaatgaactaaaaaatttgcc-(p)(BODIPY FL)-caaagttgttgcCggaatgaa-(p)(6-TAMRA)-caaagttgttgcCggaatgaa-(p)(BODIPY FL)-caaaaaagttgttgcCggaat-(p)(6-TAMRA)-caaagttgttgcCggaat-(p)(BODIPY FL)-caaagttgttgcTggaat-(p) | 14152222252224242121181818 | 229-242229-243229-250229-250250-226256-235236-213236-213247-227247-227247-230247-230247-230 | 45678910111212131314 |
用Smart Cycler系统(Cephied)在下述条件下对一个引入了IAPPS20G周围约600bp区段的质粒样品进行了PCR和Tm分析，Tm分析时的激发波长和检测波长分别为450-495nm和505-537nm(BODIPY FL)、527-555和565-605(TAMRA)。
表4
| 反应混合物的组成 |
| H2O10x Gene Taq缓冲液40％甘油10mM各dATP、dUTP、dGTP、dCTP2U/μl尿嘧啶-N-糖基化酶5μM探针100μM MgCl2100μM引物F100μM引物R5U/μl Gene Taq FP样品(0-2000拷贝)总量 | 15.95μl2.5μl3.125μl0.5μl0.05μl1μl0.375μl0.25μl0.125μl0.125μl1μl25μl |
表5
| 反应条件 |
| 50℃，2分钟↓95℃，2分钟↓95℃，1秒钟66℃，18秒钟 (50循环)↓Tm分析(1℃/秒钟) |
用各个探针分别进行PCR和Tm分析，结果发现，只有用5FL-mt-1-18、5T-mt-1-18、5FL-mt-1-21和5T-mt-1-21探针时，才能观察到可用于Tm分析的荧光强度变化。在图1和图2上可见与含有IAPP上S20G突变的核苷酸序列有关的探针的位置，图中显示的野生型序列(SEQ ID NO：15)和突变型序列(SEQ ID NO：16)对应于SEQ ID NO：1核苷酸序列上第213-262位核苷酸。再有，F在图中代表荧光染料。在图1和图2显示的位置的基础上，探针能否用于Tm分析取决于与荧光染料结合的C的位置，探针的长度并不是那么重要，只要多态性位点被包含于其中即可。
下面通过使用探针5F1-mt-1-21，对基因组DNA绝对量的敏感性，以及突变型的可重复性和检测突变率的敏感性进行了检验。
用含有0、20、200和2000拷贝的基因组DNA(野生型)而不是质粒重复了上述方法，结果见图3。如图3所示，低至20拷贝的基因组DNA也能被检出。
然后，构建了具有野生型序列的质粒(除SEQ ID NO：1核苷酸序列上285位核苷酸为A外，其余与前述质粒相同)，并制备了10份野生型质粒与突变型质粒的混合样品(wt/mt)，利用这些样品以及一份只含野生型质粒的样品(wt/wt)和一份只含突变型质粒的样品(mt/mt)对上述方法进行了重复，结果见图4。如图4所示，该方法具有很好的可重复性。
进一步，用改变野生型质粒与突变型质粒的比率的办法重复了上述方法，结果见图5。由图可见两个峰值的改变，可根据两个峰值的比率来决定突变率。
在图3-图5中，纵轴代表荧光强度的负一级导数值(-dF/dt)，水平轴代表温度(℃)。
工业适用性
本发明提供一个用于有效检测IAPP上S20G突变的猝灭探针，继而提供用它检测IAPP S20G突变的方法和相应的试剂盒。因为Tm分析只需数十秒钟就能完成，所以检测时间明显缩短。根据本发明的优选的方案，其中有探针存在的核酸扩增和Tm分析是结合在一起的，只是探针的Tm分析在核酸扩增后进行，这样就没有必要在反应完成后对扩增产物进行操作，因此没有污染扩增产物的危险。进一步，因为检测与扩增所用仪器为同一仪器，甚至没有移出反应管的必要，所以，也易实现方法的自动化操作。
序列表
<110>爱科来株式会社(Arkray，Inc.)
<120>检测胰岛淀粉样蛋白突变基因的方法及其核酸探针和试剂盒
<130>G866-OPC4053
<150>JP 2003-114380
<151>2003-04-18
<160>16
<210>1
<211>600
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>allele
<222>235
<400>1
aatctcagcc atctaggtgt ttgcaaacca aaacactgag ttacttatgt gaaaattgtt 60
tctttggttt tcatcaatac aagatatttg atgtcacatg gctggatcca gctaaaattc 120
taaggctcta acttttcaca tttgttccat gttaccagtc atcaggtgga aaagcggaaa 180
tgcaacactg ccacatgtgc aacgcagcgc ctggcaaatt ttttagttca ttccggcaac 240
aactttggtg ccattctctc atctaccaac gtgggatcca atacgtatgg caagaggaat 300
gcagtagagg ttttaaagag agagccactg aattacttgc ccctttagag gacaatgtaa 360
ctctatagtt attgttttat gttctagtga tttcctgtat aatttaacag tgcccttttc 420
atctccagtg tgaatatatg gtctgtgtgt ctgatgtttg ttgctaggac atataccttc 480
tcaaaagatt gttttatatg tagtactaac taaggtccca taataaaaag atagtatctt 540
ttaaaatgaa atgtttttgc tatagatttg tattttaaaa cataagaacg tcattttggg 600
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
cacatgtgca acgcagcg 18
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
ctcttgccat atgtattgga tccc 24
<210>4
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>4
cattccggca acaa 14
<210>5
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>5
cattccggca acaac 15
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>6
cattccagca acaactttgg tg 22
<210>7
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>7
cattccggca acaactttgg tg 22
<210>8
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>8
caccaaagtt gttgctggaa tgaac 25
<210>9
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>9
gaatggcacc aaagttgttg cc 22
<210>10
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>10
ctggaatgaa ctaaaaaatt tgcc 24
<210>11
<211>24
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<213>人工序列
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ccggaatgaa ctaaaaaatt tgcc 24
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<213>人工序列
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caaagttgtt gccggaat 18
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<400>13
caaagttgtt gccggaatga a 21
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<213>人工序列
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<213>人(Homo sapiens)
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ggcaaatttt ttagttcatt ccagcaacaa ctttggtgcc attctctcat 50
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<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>16
ggcaaatttt ttagttcatt ccggcaacaa ctttggtgcc attctctcat 50
Claims (9)
1.一段末端标记了荧光染料且其荧光染料的荧光在杂交发生时会减弱的核酸探针，该核酸探针具有一段与SEQ ID NO：1序列中一段结束于247位的序列互补的序列，长度为13-30个核苷酸，荧光染料标记在所述探针的5’端。
2.权利要求1的核酸探针，其中该核酸探针具有SEQ ID NO：12或13的核苷酸序列。
3.一种检测突变的方法，包括使用荧光染料标记的核酸探针并测定荧光染料的荧光来对有单核苷酸多态性位点的核酸进行熔点曲线分析，并根据熔点曲线分析的结果来检测突变，其中单核苷酸多态性为编码胰岛淀粉样多肽的核酸上的一个核苷酸序列的突变，该突变导致了胰岛淀粉样多肽氨基酸序列上20位的丝氨酸被甘氨酸替代的突变，所述核酸探针为权利要求1或2中定义的核酸探针。
4.权利要求3的方法，其中样品中含有单核苷酸多态性位点的核酸区段被扩增，以获得具有单核苷酸多态性的核酸。
5.权利要求4的方法，其中扩增用DNA多聚酶法进行。
6.权利要求5的方法，其中扩增在核酸探针存在下进行。
7.权利要求3中定义的方法的试剂盒，该试剂盒包括末端标记有荧光染料且荧光染料的荧光在杂交发生时会减弱的核酸探针，该核酸探针具有一段与SEQ ID NO：1的核苷酸序列中一段结束于247位的核苷酸序列互补的核苷酸序列，长度为13-30个核苷酸，荧光染料标记在所述探针的5’端。
8.权利要求7的试剂盒，其中核酸探针具有SEQ ID NO：12或13的核苷酸序列。
9.权利要求7或8的试剂盒，还包含通过DNA多聚酶法扩增编码胰岛淀粉样多肽的核酸上的核苷酸序列中含有突变的区段的引物，该突变导致了胰岛淀粉样多肽氨基酸序列上第20位的丝氨酸被甘氨酸替代的突变。
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