CN105717182B - 一种用于同步检测淀粉样多肽单体和聚集体的生物传感器及其构建方法和应用 - Google Patents
一种用于同步检测淀粉样多肽单体和聚集体的生物传感器及其构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于同步检测淀粉样多肽单体和聚集体的生物传感器及其构建方法和应用，该生物传感器包括含亚甲基蓝探针的淀粉样多肽聚集体适体和修饰有抗体的DNA，其构建方法是将巯基修饰的cDNA通过化学键合固定在电极上，在所述cDNA上依次通过互补修饰短链DNA、含亚甲基蓝探针的淀粉样多肽聚集体适体及连接有生物素的DNA后，进一步与链霉亲和素及连接有生物素的抗体反应，即得；该生物传感器构建方法简单，其可以用于分别或同时检测淀粉样多肽单体和聚集体，且具有检测更简单、检出限低、灵敏度高、特异性强的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于同步检测淀粉样多肽单体和聚集体的生物传感器，及其构建方法，以及其在检测淀粉样多肽单体和聚集体方面的应用，属于电化学生物传感器领域。
背景技术
阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)是一种起病隐袭，且进行性发展的神经系统退行性疾病。目前，根据世界阿尔兹海默症报告知，目前全世界有大于三千五百万的人都在遭受AD的困扰，并且预计在2030年，患AD的人数会翻倍。因此，能够准备标志和检测AD成为亟待解决的问题。在电极表面构建新型电化学生物传感器可以精确测定标志物Aβ1-40单体和聚集体的量。在之前的研究中虽然可以检测其多肽单体和聚集体的量，但是其检出的最小浓度比较大，因此，需要提高其检测的灵敏度。
发明内容
针对现有的检测AD的方法存在的缺陷，本发明的目的是在于提供一种信号强、特异性强、灵敏度高，且可以用于检测淀粉样多肽单体和聚集体中一种，或者同步检测两者的生物传感器。
本发明的第二个目的是在于一种操作简单、重复性好的构建所述生物传感器的方法。
本发明的第三个目的是在于提供一种所述生物传感器的应用，该生物传感器可以用于分别或同时检测淀粉样多肽单体和聚集体，且具有检测更简单、检出限低、灵敏度高、特异性强的特点。
本发明提供了一种用于同步检测淀粉样多肽单体和聚集体的生物传感器，该传感器包括含亚甲基蓝探针的淀粉样多肽聚集体适体和修饰有抗体的DNA。
优选的方案，含亚甲基蓝探针的淀粉样多肽聚集体适体和修饰有抗体的DNA通过互补修饰在cDNA上，所述cDNA固定在电极上。
优选的方案，修饰有抗体的DNA由连接有生物素的DNA与连接有生物素的抗体通过链霉亲和素界面组装得到。
本发明还提供了一种构建所述的用于同步检测淀粉样多肽单体和聚集体的生物传感器的方法，该方法是将巯基修饰的cDNA通过化学键合固定在电极上，在所述cDNA上依次通过互补修饰短链DNA、含亚甲基蓝探针的淀粉样多肽聚集体适体及连接有生物素的DNA后，进一步与链霉亲和素及连接有生物素的抗体反应，即得。
优选的方案，包括以下步骤：
(1)将电极置于浓度为1～10μM巯基修饰cDNA溶液中，反应14～16h，用水冲洗，去除电极表面游离的cDNA；
(2)将电极置于MCH溶液中，封闭0.5～2h，依次用酒精和水冲洗；
(3)将电极置于浓度为1～10μM的短链DNA溶液中，在室温下反应1～2h，用水冲洗，去除电极表面游离的短链DNA；
(4)在避光环境中，将电极置于浓度为1～10μM的含亚甲基蓝探针的淀粉样多肽聚集体适体溶液中，反应2～3h，用水冲洗，去除电极表面游离的含亚甲基蓝探针的淀粉样多肽聚集体适体；
(5)再将电极置于浓度为1～10μM的连接有生物素的DNA溶液中，反应1～3h，用水冲洗；
(6)将电极置于浓度为0.5～1mg/mL的链霉亲和素溶液中反应0.5～2.5h后，再加入浓度为20nM的连接有biotin的抗体反应，即得。
本发明的技术方案中，短链DNA的引入主要使cDNA能够保持其竖直的结构，有利于后续的DNA连接以及起着支撑的作用。引入的亚甲基蓝探针(MB)为还原性物质，在PBS中测量方波，在-0.276V左右会有明显的亚甲基蓝的峰，根据方波电流的变化量，可以定量检测多肽聚集体的量。链霉亲和素的引入能形成SA-biotin生物结构，可以放大信号。连接有生物素的DNA以及连接有生物素的抗体(antibody-biotin)均能特异性的结合SA，且连接快，牢固。
本发明还提供了所述的用于同步检测淀粉样多肽单体和聚集体的生物传感器的应用，该应用方法是将生物传感器用于检测淀粉样多肽聚集体，或用于检测淀粉样多肽单体，或用于同时检测淀粉样多肽聚集体和淀粉样多肽单体。
优选的方案，将生物传感器用于检测淀粉样多肽聚集体，根据样品加入前后亚甲基蓝电化学信号的变化量来检测淀粉样多肽聚集体含量；或者，将生物传感器用于检测淀粉样多肽单体，根据样品加入前后阻抗的变化量来检测淀粉样多肽单体含量；或者，将生物传感器用于同时检测淀粉样多肽聚集体和淀粉样多肽单体，分别根据样品加入前后亚甲基蓝电化学信号的变化量来检测聚集体含量，根据样品加入前后阻抗的变化量来检测淀粉样多肽单体含量。
较优选的方案，所述的淀粉样多肽单体在检测前先与抗体在25～40℃的温度下反应1～3h，使抗体与淀粉样多肽单体充分结合。
相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益技术效果：
1)本发明的生物传感器在电极表面构建含亚甲基蓝探针(MB)的淀粉样多肽聚集体的适体传以及单体抗体的夹心结构，根据MB的电化学信号以及阻抗的变化量来分步定量检测淀粉样多肽聚集体和单体的含量，引入的适体对于其相应蛋白具有更高的特异性和识别力，使得其检测的灵敏度更高，利用抗体在电极表面形成夹心结构，这种夹心结构具有高特异性，能够很大程度上提高检测的灵敏度。
2)本发明的生物传感器，可以用于分步检测淀粉样蛋白单体和聚集体，也可以同时检测单体和聚集体，且可以抑制淀粉样多肽的聚集，具有稳定性好、灵敏度高、检出限低、特异性强的特点。
3)本发明的生物传感器，构建方法简单、重复性好。
附图说明
【图1】为构建生物传感器的过程示意图；
【图2】为生物传感器构建过程的CV表征；
【图3】为生物传感器构建过程的EIS表征及加入抗体单体夹心结构后的EIS图；
【图4】为测定的oligomer的SWV图，浓度梯度从上到下依次减小；
【图5】为电流变化量的线性关系图，和线性范围内的关系图。
具体实施方式
以下实施例旨在进一步说明本发明内容，而不是限制本发明权利要求的保护范围。
实施例1
1、在电极上构建的生物传感器的方法，步骤如下：
在室温下，电极上修饰10μM的cDNA 16h，然后用二次水冲洗，去除没有修饰上的残留的cDNA，然后在将电极放在MCH中，加入MCH的目的是为了封闭电极上未反应的位点以及使得修饰的cDNA呈直立结构，在MCH中封闭1h后，先用酒精冲洗，再用二次水冲洗干净；然后在电极上修饰10μM DNA1，在室温条件下放置2h，随后用二次水冲洗去除未反应的DNA1；再在电极上修饰10μM的DNA2-MB，由于亚甲基蓝见光容易分解，所以从这一步开始，所有的操作过程都是在黑暗条件下进行的，修饰2h后，用二次水冲洗；随后在电极上修饰10μM的DNA3-biotin 2h，同样用二次水冲洗；随后加入1mg/mL的SA反应1h，再加入20nM带有biotin的抗体。
2、对淀粉样多肽聚集体的定量分析步骤如下：
分别配置不同浓度的聚集体，分别依次加入到以上构建的生物传感器上，由于DNA2是淀粉样多肽聚集体的aptamer，它能够和聚集体形成稳定的聚合结构。根据DNA2上亚甲基蓝信号的变化量来定量分析聚集体。
3、对淀粉样多肽单体的定量分析步骤如下：
分别配置不同浓度的单体及相应的抗体，先在25-40℃的水浴中反应1-3h，使得抗体能够充分的和单体反应，然后加入到以上构建的生物传感器的表面，通过阻抗的变化量来定量检测出单体。
4、对淀粉样多肽的单体和聚集体的同步检测的步骤如下：
分别配置不同浓度的单体，聚集体以及抗体，先在25-40℃的水浴中反应1-3h，使得抗体能够充分的与单体反应，然后将混合后的蛋白溶液滴加在以上的生物传感器上，通过亚甲基蓝信号的变化量来定量检测聚集体，通过阻抗的变化量来定量检测单体。
从图2中可以看出随着电极表面构建的越多，其电流越小，表明生物传感器的成功构建；
从图3中可以看出跟CV图的趋势相同，随着生物传感器的成功构建，其阻抗值逐渐增大，而且加入抗体-单体后，其阻抗值也增大。
从图4中可以看出随着加入的聚集体浓度越大，其电流的变化量越大；
从图5中可以看出在一定范围内，随着浓度越大，其电流的变化量越大，但是达到某一浓度后会趋于平衡，在低浓度范围内有很好的其线性关系。
Claims (6)
1.一种用于同步检测淀粉样多肽单体和聚集体的生物传感器，其特征在于：包括含亚甲基蓝探针的淀粉样多肽聚集体适体和修饰有抗体的DNA；
含亚甲基蓝探针的淀粉样多肽聚集体适体和修饰有抗体的DNA通过互补修饰在cDNA上，所述cDNA固定在电极上；
所述的修饰有抗体的DNA由连接有生物素的DNA与连接有生物素的抗体通过链霉亲和素界面组装得到。
2.构建权利要求1所述的用于同步检测淀粉样多肽单体和聚集体的生物传感器的方法，其特征在于：将巯基修饰的cDNA通过化学键合固定在电极上，在所述cDNA上依次通过互补修饰短链DNA、含亚甲基蓝探针的淀粉样多肽聚集体适体及连接有生物素的DNA后，进一步与链霉亲和素及连接有生物素的抗体反应，即得。
3.根据权利要求2所述的构建用于同步检测淀粉样多肽单体和聚集体的生物传感器的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将电极置于浓度为1～10μM巯基修饰cDNA溶液中，反应14～16h，用水冲洗；
(2)将电极置于MCH溶液中，封闭0.5～2h，依次用酒精和水冲洗；
(3)将电极置于浓度为1～10μM的短链DNA溶液中，在室温下反应1～2h，用水冲洗；
(4)在避光环境中，将电极置于浓度为1～10μM的含亚甲基蓝探针的淀粉样多肽聚集体适体溶液中，反应2～3h，用水冲洗；
(5)再将电极置于浓度为1～10μM的连接有生物素的DNA溶液中，反应1～3h，用水冲洗；
(6)将电极置于浓度为0.5～1mg/mL的链霉亲和素溶液中，反应0.5～2.5h后，再加入浓度为20nM的连接有biotin的抗体反应，即得。
4.权利要求1所述的用于同步检测淀粉样多肽单体和聚集体的生物传感器的应用，其特征在于：将生物传感器用于检测淀粉样多肽聚集体，或用于检测淀粉样多肽单体，或用于同时检测淀粉样多肽聚集体和淀粉样多肽单体。
5.根据权利要求4所述的用于同步检测淀粉样多肽单体和聚集体的生物传感器的应用，其特征在于：
将生物传感器用于检测淀粉样多肽聚集体，根据样品加入前后亚甲基蓝电化学信号的变化量来检测淀粉样多肽聚集体含量；
或者，将生物传感器用于检测淀粉样多肽单体，根据样品加入前后阻抗的变化量来检测淀粉样多肽单体含量；
或者，将生物传感器用于同时检测淀粉样多肽聚集体和淀粉样多肽单体，分别根据样品加入前后亚甲基蓝电化学信号的变化量来检测聚集体含量，根据样品加入前后阻抗的变化量来检测淀粉样多肽单体含量。
6.根据权利要求5所述的用于同步检测淀粉样多肽单体和聚集体的生物传感器的应用，其特征在于：所述的淀粉样多肽单体在检测前先与抗体在25～40℃的温度下反应1～3h，使抗体与淀粉样多肽单体充分结合。
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