CN1062925A - 测定淀粉样蛋白前体蛋白质(APP)mRNA差异表达的方法 - Google Patents
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Abstract
给出了一种定性和定量测定在人体生物组织中
人淀粉样蛋白的前体蛋白质(APP)的各种mRNA
的表达的方法。该方法可用于测定与正常组织有差
异的表达。
Description
阿耳茨海默氏（Alzheimer's）病（AD），一种神经变性疾病，可能是散发的或者家族性的（正染色体控制）其结果是逐渐失去智力和记忆功能，直至完全痴呆（它是痴呆的最普遍的起因）。65岁以上人口的10%和80岁以上的30%都受AD的影响。
由于这种病严重地造成劳动力丧失，且病程很长，它的社会和经济损失是巨大的。
AD的病因尚属未知，迄今为止还没有有效的治疗方法。诊断也有很多问题，因为缺乏特异的临床和实验标记物，其准确的诊断只能在死后，通过对脑组织的病理学分析才能保证。神经病理学诊断系以脑中存在神经纤维缠结（NFT）神经元变性和神经炎或老年斑（SP）为依据。这些同样的损害还从存活的超过35-40岁的三染色体21（Trisomy 21）（Down's综合症，DS）患者到正常的老年人（程变较轻）的脑中都观察到。SP'S代表了AD最特异的病理学标记，是由营养失调神经末梢围绕的淀粉样物胞外沉积和胶质作用组成（Wisniewski，H.M.等人prog.Neuropathol.2，P.101，1973;Perry，E.K.等人，Trends Neurosci.8，P 301，1985）。SP'S以及特别是淀粉样物质的沉积似乎是AD和DS的先兆（Giaccone，G.等人，Neuroci.Lett.97，P.232，1989），它们的数量与痴呆的严重程度有关（Blessed，G.等人，Br.J.Psychiatry 114，P.797，1968）。在内皮层及脑膜血管壁上也观察到同样型式的淀粉样物沉积（Gienner，G.G.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.120，P.1131，1984）。
在SP'S和血管中发现的沉粉样物质已证明是由具39-43个氨基酸残基（PM＝4.2KD）的蛋白质组成，该蛋白质以不溶性寡聚物形式聚集（Blessecl，G.等人，Br.J.Psychiatry 114，P.797，1968;Masters，C.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，P.4245，1985）。这种蛋白质，称为A4或者β（β淀粉样蛋白，βAP），是从一种大得多的前体、β-淀粉样蛋白前体蛋白质（β-APP）衍生而来，该前体具有一个基片结构，从其离析出的CDNA推论出，它是一个具有一大的胶外蛋白质和一小的内胞浆蛋白质的695氨基酸（AA）的膜糖蛋白质（Kang，J.等人，Nature325，P.733，1978）。在该App序列中，βAp片断包括紧靠膜外的28个AA加上反式膜疏水蛋白质最先的11-14个AA.App基因定位于染色体21（Kang，J.等人，Nature325，P.733，1987;Goldgaber，D.等人，Science235，P.877，1987;Robakis，N.K.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84，P.4190，1987;Tanzi，R.E.等人，Science235，P.880，1987）并由两个外显子可选择的连接方式产生至少四种mRNA形式（Ponte，P.等人，Nature331，P.525，1988;Tanzi，R.E.等人，Nature331，P.528，1988;Kitaguchi，C.等人，Nature331，P.530，1988;Golde，T.等人，Neuron4，P.253，1990）：一个外显子编码了56AA区域相似于Kunitz蛋白酶抑制剂（KPI），另一个编码了19AA区域，与在神经元和胸腺细胞中发现的反基因MRC OX-2的同源程度达到47%。第五种形式被验明编码了无βAP，仅膜和内胞浆区域的分泌多肽（de Sauvage，F.等人，Science245，P.451，1989）。
根据编码蛋白质的氨基酸残基数，APP的这四个mRNA被标为APP895APP714、APP751和APP770。mRNA APP895不含这两个选择的序列，mRNA APP714含19AA插入物，mRNA APP751含KPI的56AA插入物，而mRNA APP770既含19AA也含56AA插入物。这4种mRNA按不同比例在所有组织中表达（GaidgaberD.等人，Science235，P.877，1987;Rolakis，N.K.等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA84，P.4190，1987;Tanzi，R.E.等人，Science235，P.880，1987）。然而mRNA的APP695形式于中枢神经系统（CNS）中在很大程度上占统治地位，而在末梢组织中最多的是带KPI插入物的形式（Tanzi，R.E.等人，Nature331，P.528，1988）。mRNA的APP714形式仅存在极小量（Golde，T.等人，Neuron4，P.253，1990）。
除了从神经病理学观察得到的数据外，以下两个考虑因素表明在淀粉样物沉积及AD演变中存在的APP的基因表达的改变起决定性作用。
1、DS患者（他们有APP的三种基因复制品，因为其位于染色体21）表现出对APP的mRNA的高水平表达，并且如果他们存活超过35-40年，总是形成AD。而且，在DS中，βAP的第一次沉积是在明显的神经病理学损害开始以前，由此确定了一个可能的时间一起因关系（Giaccone，G.等人，Neurosci.Lett.97，P.232，1989）。
2、一种罕见形式的遗传性脑出血患者（以在大脑和脑膜血管壁中βAP沉积和扩散外皮沉积物为特征，正如在AD和DS中发现的那样）在APP基因的βAP区域存在一突变点。此种突变在正常人或AD患者或家族AD患者中均从未发现，因此构成了伴有淀粉样蛋白沉积的遗传性大脑出血的基本缺损。并且，一旦突变很靠近APP的正常断裂位点，它便改变予处理酶的效率，引起βAP的不正常释放（Levy，E.等人，Science248，1124，1990）。
然而，对散发的或家族性AD的APP基因或基因连结的突变和复制的大量研究得出不同的结果。因为在AD中APP基因似乎并不是在结构上或定量上被改变，所以βAP的沉积必定来源于APP不正常的新陈代谢或其各种形式mRNA的全部的或差异表达的异常调节。
在表达中APP各种形式的mRNA的比例改变可能影响它翻译后的新陈代谢，引起βAP片断的释放和它的胞外沉积。
最近的研究业已表明，同其它组织相比较，虽然在CNS中，mRNA APP695表达占明显优势，而在AD患者的海马锥体神经元中则恰恰相反，那里是mRNA APP751占优势（Johnson，S.A.Science248，P.854，1990）。此类神经元总是表达mRNA的两种形式，即APP695和APP751，但其比例是2∶1的倒数，对APP751形式有利。这种比例的改变是由于mRNA APP751表达的增加而不是由于mRNA APP695的减少，因为后者的表达保持不变。在被检验区域内mRNA APP751/APP695比例的增加和SP密度之间还存在一个线性关系。因此可以假设各种类型的mRNA APP的差异表达的调节被改变和SP以及AD本身的病理演变之间有关系。这些观察结果以及DS病人和对照者之间的MRNA APP水平之比，比予料的3∶2更高（Tanzi，R.E.等人，Science235，P.880，1987）这一事实强调了在AD的发病机理中，APP表达的调节比其可能的结构变化更重要。
mRNA APP的表达可受各种因素调节：佛波醇酯，肝素连结生长因子以及白细胞介素-1（IL-1）（Goldgaber等人，PNAS Vol.86，P.7606，1989）。IL-1是对损伤，传染或感染的免疫应答最重要的调节剂之一（Dinarello，C.A.FASEB J.2，P.108，1988），并且也在CNS中表达，（Fontana，A.，J.Neurosci.Res.8，P.433，1982），伴随着各种作用，包括随着神经组织损害后的增殖胶质反应（Giulian D.d Lachman L.B.，Science，228 P.497 1987）。在AD和DS脑中发现很高水平的IL-1（Griffin，W.S.T.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86，P.7611，1989），因此在这两种病症中，都存在导至APP基因表达增加的条件。并且有资料已记载AD的APP基因的产生和其它神经变性疾病的淀粉样物质之间可能的相互关系，其它的神经变性疾病指例如人的creutzfeldt-Jacol病或Gerstmannstraussler综合症（Kitamoto，T.等人，Lal.Invest.57，P.230，1987）以及动物的瘙痒病（Scrapie）（De Armond，S.J.等人，Neurology37，P.1271，1987）。
现有资料中的描写表明：
-在有AD倾向的病人中，APP基因的调节被改变是静息事件。
-这样的静息在有特异的消除调节的刺激因素存在时可被激活。
-这种消除调节的刺激因素存在和/或仅在一定的组织中或这些组织的一部份中（因为此处APP基因的表达异常）起作用，在其它组织中，异常表达处于静息。
本发明的目的是一种测定APP基因异常表达的方法，从用生物或化学试剂适当刺激过的组织的体外培养物开始。并且，在此叙述的方法，就其基本点而言，可适用于用对APP的结构/调节关系来识别异常的基因表达。
本发明的方法可以与培养物中的任何类型的人或动物的生物组织一起使用。然而重要的准则是该组织能对人APP的各个mRNA差异表达，例如在此描述的利用人的成纤维细胞的方法。而其它有用的组织，即外周组织可用下面叙述的方法来确定。
本发明的方法总的来说包括：
1、培养一种细胞培养物。
2、处理该细胞培养物使之刺激APP各个mRNA的差异表达。
3、从细胞培养物中提取和收集RNA。
4、将收集来的RNA进行逆转录（RT）。
5、以PCR放大作用放大RT产物。
6、用聚丙烯酰胺凝胶分离放大产物。
7、在UV下染色和显形以测定APP mRNA的差异表达。
1、细胞培养：
取样、培养及体外保养的方法均为实验室常规使用的方法，因此对本领域专业人员来说是熟知的。
在本例中采用的是由散发或家族性AD患者捐赠的和来自相应的正常人和病理学对照者的人成纤维细胞。细胞培养物被保持在加10%FCS以及抗生素的DMEM中。
2、对mRNA表达的刺激作用：
然后用能刺激人RNA上APP差异表达的试剂处理细胞培养物。优选试剂是白细胞介素-1（IL-1）。然而其它试剂也有用，例如动物或人的细胞激动素，促进细胞分化和刺激RNA合成的腺嘌呤的N-取代衍生物。
为了产生刺激作用，一旦达到融合时，使用10μ/ml人β白细胞介素处理细胞24小时，这时就制备了RNA。
3、提取RNA：
然后从这些细胞中提取核糖核酸（RNA）。提取RNA的方法本身是已知的，例如Maniatis等人在Molecular Cloning，Laboratory Manual，2nd Ed（1989）中介绍的方法，这里特别优选的是采用胍/酚的方法。
甲磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤平皿，然后将细胞溶解在溶液A中，该溶液含一种RNAases灭活剂，5M异硫氰酸胍、25mM柠檬酸钠、pH7，0.5%的肌氨酰（Sarcosyl）以及一种还原剂，0.1Mβ巯基乙醇。收集溶胞产物并加入200μl pH42M醋酸钠，摇荡以后加入2ml苯酚的饱和水溶液。再次振荡，加入1ml1∶1的氯仿∶异戊醇混合物。振荡该溶胞产物10秒钟，将其放在冰中10分钟，然后于10，000rpm转速下，在4℃将其离心处理20分钟。收集上层清液，并与等体积异丙醇混合，在-20℃放置1小时，然后在4℃，于10，000rpm下离心处理10分钟。去掉上层清液，将片状沉淀再悬浮在400μl溶液A中。再加入400μl异丙醇，振荡并在-20℃放置1小时。然后再在10，000rpm下，于4℃离心处理10分钟。去掉上层清液，用75%乙醇洗涤片状沉淀然后真空干燥。将RNA再悬浮于水中，然后就可以供随后合成cDNA的处理使用。
4、逆转录：
β-APP cDNA通过逆转录（RT）制备，例如采用Maniatis等人介绍的方法。
使用具有所有胸苷的12-18（优选17）个碱基对的寡核苷酸作为基本序列合成cDNA的第一个拷贝，用oligo（dT）（它通过基因图确定在所有mRNA和MMLV的poly A上）作为酶来摧化逆转录酶反应（RT）。也可使用其它催化酶，例如鸟和鼠转录酶。此反应如下进行：
在2μg全RNA中加入以下试剂：100pM Oligo（dT）（Boehringer）、1OU RNAase抑制剂（Promega），200U MMLV（BRL）以及浓度为0.5mM的核苷酸dATP、dTTP、dCTP和dGTP。反应在有一总体积为20μl的Perkin-Elmer Cetus放大药盒的PCR反应缓冲液存在的条件下进行。在加热mRNA后和寡核苷酸至95℃2分钟，然后将其于冰中冷却后，加入上面所述的所有反应剂，将混合物于42℃放置1小时。
5、放大作用：
使用聚合酶链反应（PCR）技术（Saiki，R.K.等人，Science230，P.130，1985）来测定APP基因的差异表达。使用PCR放大βAPP mRNA被称之为PRT（PCR amplification of reverse transcribed mRNA，Golde，T.E.等人，Neuron，Vol.4，253-267，Feb，1990）。
按此方法，使用两个合成寡核苷酸进行放大反应，并围绕联结区域放置，使得所有尺寸的转录物都能放大。这两个寡核苷酸之间的距离，要能使得相对于695，751和770AA型获得最大信息。
寡核苷酸在APPlied Biosystem Model 380B上采用磷酰胺化学技术合成。合成的寡核苷酸具有如下核苷酸序列：
5'CACAGACTATGCAGATGGGAGTGAAG3'（SEQ.ID No.1）和
5'GGCATCAGGGGTACTGGCTGCTGTTG3（SEQ.ID No.2）
并涉及到Kang，J.等人在Nature325，P.733 1987上发表的由APP画出的序列。第一个寡核苷酸是以APP的碱基对642和667之间的序列为基础的，而第二个寡核苷酸则基于碱基对871和897之间的序列，然而在这种情况下，为进行PCR取其互补序列。
此二种寡核苷酸在55℃处理12个小时并真空干燥。然后将其再悬浮于2.5MpH7的醋酸铵中，并在3倍体积的80%乙醇中使其沉淀，再次干燥，然后再悬浮于水中，并且分光光度计测定其浓度。放大作用在Perkin Elmer Cetus DNA热循环器上进行，使用相对于DNA TM放大剂药盒（Perkin Elmer-Cetus）的那些试剂作为试剂。简言之，使用每种寡核苷酸的100μM混合物，核苷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP，每种0.5μM，前面叙述的反应逆转录酶的1/3以及反应缓冲液，50μl的总混合物带有2U的Tag聚合酶。
将如此获得的50μl反应产物分成三个等分样，并按如下步骤施用于DNA放大剂，于94℃下进行1分钟变性，在54℃下2分钟，并在72℃下拷贝2分钟，总共30次循环，为监测放大反应，各等分样分别在第20，第25和第30次循环时从仪器中取出。
6、分离并测定mRNA表达：
放大的mRNA产物其后进行定量或定性分析测定各种β-APP mRNA的相对表达水平。优选用凝胶电泳进行分离，例如用聚丙烯酰胺凝胶。通过Northern印迹分析，自动射线照相或聚丙烯酰胺凝胶、S1核酸酶保护测定、点渍印迹杂交、引物蔓延牵伸鉴定、溶液杂交、滤纸杂交（Williants等人，Meth.Enz.128，671，1986，Maniatis等人，1989）以及光密度测量等可对被表达mRNA进行分析。然而，优选的方法包括在聚丙烯酰胺凝胺上分离mRNA，接着用溴化3.8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶嗡染色，经染色的凝胶然后对紫外光曝光并照相。
根据本发明，来自径IL-1处理的细胞mRNA的差异表达可通过（A）已知正常细胞各个mRNA产物的比较，（B）IL-1处理细胞各个mRNA产物的比较，（C）阴性的PCR对照的比较以及（D）分子量标记物的比较来分析。当与正常细胞的表达相比较时，在为改变表达经IL处理过细胞中，其mRNA表达的比较，可用于测定与正常组织差异的表达。具体地说，APP751的表达有一个明确增加的变化，由一个增加的APP751对APP695之比值被具体测定。
为通过溴化3.8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶嗡染色法进行分析，将如此获得的放大产物以8%聚丙烯酰胺凝胶进行分离，然后用1μg/ml溴化3.8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶嗡溶液染色并很快在水中洗涤。该凝胶于紫外光下照像，被照像的凝胶示于图1。示于图1的实例中，通道A是正常细胞，通道B是用IL1β处理过的细胞，通道C是阴性的PCR对照，而通道D是Boehringer分子量标记。
参照示于图1的结果：
481bp的型式相应于APP蛋白质的770Aa型
428bp的型式相应于APP蛋白质的751Aa型
256bp的型式相应于APP蛋白质的695Aa型
正如可以看见的，白细胞介素1能控制编码了APP751蛋白质带表达的增加。
本发明就作如上介绍，但很清楚，本方法可以各种方式加以修改，这类修改并不脱离本发明的精神和目的，所以对本领域专业人员来说是显而易见的任何修改都落入以下权利要求的范围之内。
Claims (15)
1、一个测定淀粉样蛋白前体蛋白质(APP)的mRNA差异表达的方法，它包括：
刺激在一个包含一个第一组织的细胞培养物中的mRNA表达；以及
分析来自上述第一组织培养物中被已表达的mRNA产物，使其与正常组织细胞比较，分析其人APP mRNA的差异表达。
2、根据权利要求1的方法，其中对所设的mRNA表达的刺激作用，系通过以人β白细胞介素1（IL-1）处理所说的第一组织培养物进行。
3、根据权利要求1的方法，其中对所说的mRNA表达的刺激作用，系通过以人或动物的细胞激动素处理所说的第一组织来进行。
4、根据权利要求1的方法，其中所说的第一组织是外周细胞组织。
5、根据权利要求4的方法，其中所说的外周组织是人成纤维细胞组织。
6、根据权利要求1的方法，其中所说的组织是来自人的中枢或外周神组织。
7、根据权利要求1的方法，其中由所说被刺激的细胞培养物产生的mRNA产物由聚合酶链反应（PCR）法放大。
8、根据权利要求7的方法，其中所说的PCR采用选自如下序列的至少一个寡核苷酸：
5'CACAGACTATGCAGATGGGAGTGAAG3'（SEQ.ID No.1）和
5'GGCATCAGGGGTACTGGCTGTTG3'（SEQ.ID No.2）。
9、根据权利要求8的方法，其中所说的两种寡核苷酸被同时使用。
10、根据权利要求1的方法，其中所说的分析是对APP mRNA的定量，它是通过在聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离各个所说mRNA后，用溴化3.8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶嗡染色来进行。
11、根据权利要求1的方法，其中所说的分析是通过光密度测量来定量的。
12、用于测定淀粉样前体蛋白质（APP）mRNA的差异表达的方法，它包括：
培养从一个第一组织中得到的人成纤维细胞;
用人白细胞介素1处理所说的成纤维细胞以刺激mRNA的表达;
将这样产生的mRNA产物进行逆转录，使产生βAPP cDNA;
通过聚合酶链反应放大所说的βAPP cDNA;
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离产生的mRNA;以及
分析mRNA产物，通过所说的成纤维细胞与正常组织细胞相比较，以分析出人的APP的mRNA表达的改变。
13、根据权利要求12的方法，其中所说的mRNA产物的分析包括：
用溴化3.8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶嗡染色所述聚丙烯酰胺凝胶。
将所述的染色凝胶对紫外光曝光。
14、根据权利要求12的方法，其中所说的PCR采用选自如下序列的至少一种寡核苷酸：
5'CACAGACTATGCAGATGGGAGTGAAG3'（SEQ ID No.1）
5'GGCATCAGGGGTACTGGCTGCTGTTG3'（SEQ ID No.2）
15、根据权利要求14的方法，其中所说的两种寡核苷酸被同时使用。
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