CN103792372A - 双核酸标记的比率电化学免疫传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于双核酸标记的比率电化学免疫传感器。在金电极表面组装两端分别标记巯基与二茂铁的DNA3，与亚甲基蓝标记的互补DNA1-抗体1杂交，构成比率电化学免疫传感界面。目标蛋白质存在时，DNA2-抗体2、目标蛋白质与DNA1-抗体1形成夹心免疫复合物，产生邻位效应，使DNA2与DNA1杂交，导致DNA1-抗体1脱离传感界面、自由的DNA3在表面形成发夹结构。在该过程中，电化学活性的亚甲基蓝和二茂铁分别远离和靠近电极表面，其氧化电流分别减小和增加。通过检测这两个电流的比值，实现溶液中目标蛋白质的浓度测定。该传感器灵敏度高，检测浓度范围宽，实现了蛋白质的快速、一步化检测，具有临床应用价值。
Description
一、技术领域
本发明为一种基于双核酸标记的比率电化学免疫传感器。用两种分别标记电化学活性分子的核酸链构建双电化学信号免疫传感界面，其中1条链(捕获探针)在电极上以Au-S键固定，另1条链标记抗体，并通过碱基互补配对与捕获探针结合，在免疫反应诱导的邻位效应作用下离开传感器表面，使两种电活性分子分别远离和靠近电极表面，通过检测两种电活性分子的氧化电流之比，实现对目标蛋白质的简单、快速、高灵敏测定。
二、背景技术
免疫分析作为一种高选择性和高灵敏度的分析方法，在环境监测、临床诊断、食品安全等领域得到了日益广泛的应用。在实际应用中，要求发展简单、快速、灵敏的免疫检测方法。
根据免疫分析步骤的不同可分为异相免疫分析和均相免疫分析，后者因为能获得更高的灵敏度且免清洗易于实现自动化而被广泛应用于临床检测。与基于放射分析、荧光、化学发光、电化学发光、表面等离子共振等分析技术的免疫分析方法和传统的酶联免疫分析方法相比，电化学免疫分析具有仪器便宜、操作简便、灵敏度高等独特优点。各种电化学免疫传感器，尤其是安培免疫传感器得到广泛的研究和应用。在传统的电化学免疫方法中，大多使用异相免疫分析，需要多步清洗，耗时且样品容易污染。基于邻位效应发展的免疫分析方法近年来得到发展。在该方法中两种核酸-抗体偶联物与抗原(待测物)进行夹心免疫反应，使得在核酸-抗体偶联物上的两种不同核酸距离靠近，诱发邻位效应；这两种核酸的杂交或者连接产生新的检测核酸，通过检测产生的核酸，间接测定目标蛋白质的浓度。由于该方法可均相进行，具有简单、灵敏度高、特异性好、样品消耗少等优点。然而，该方法基本采用PCR技术来检测产生的检测核酸，步骤复杂，所需时间长。将电化学检测与邻位免疫分析方法结合起来，可以缩短检测时间，降低分析成本。
传统的电化学免疫分析方法都采用单信号检测，检测信号易受环境影响。本发明采用双电化学信号之比进行电化学免疫分析，可提高检测灵敏度和准确性，扩大线性范围，简化检测步骤。
三、发明内容
本发明的内容是：用两种电化学活性分子标记的核酸链构建比率电化学免疫传感界面，通过免疫反应诱导邻位效应，使1种电化学活性分子标记的核酸链离开电极表面，另1种电化学活性分子标记的核酸发生结构变化而使该电化学活性分子接近电极表面，导致它们的氧化信号减少或增加，通过两种电化学活性分子的氧化电流之比进行比率电化学免疫传感。
本发明通过以下技术方案来实现：
通过在金电极表面自组装两端分别标记巯基(SH)与二茂铁(Fc)的捕获探针DNA3，同时基于DNA3与DNA1间的互补杂交，使亚甲基蓝(MB)标记的DNA1-抗体1固定于电极表面，形成比率电化学免疫传感界面。在目标蛋白质存在时，DNA2-抗体2与DNA1-抗体1通过夹心免疫反应形成免疫复合物，并产生邻位效应，该效应促使DNA2与DNA1杂交，导致MB标记的DNA1-抗体1脱离免疫传感界面，同时，DNA3在金电极表面形成发夹结构，使Fc靠近电极表面。通过检测MB和Fc的氧化电流，用Fc和MB氧化电流的比值进行目标蛋白质的浓度测定。
上述捕获探针DNA3从3’端开始的1-4碱基与从5’端开始的1-4碱基完全互补，可形成发卡结构(图2)。
上述DNA1与DNA3及DNA2分别有12及11个碱基完全互补(图3，图4)。
本检测系统测定目标蛋白质的原理：
本发明设计的比率电化学免疫传感器的检测原理如图1所示：将含有目标蛋白质的样品溶液和DNA2-抗体2混合，并将微量混合液滴在比率电化学免疫传感界面，在室温条件下温育40分钟。温育过程中，目标蛋白质与抗体1、抗体2进行夹心免疫反应，并产生邻位效应，促使DNA2取代DNA3与DNA1杂交，导致电化学活性分子MB标记的DNA1-抗体1脱离免疫传感界面，同时DNA3在金电极表面形成发夹结构，使电化学活性分子Fc靠近电极表面。温育完成后，传感器用冲洗液冲洗，然后插入检测溶液，用交流伏安法检测Fc和MB的氧化电流；Fc及MB的氧化电流与目标蛋白质的浓度分别成正及负相关。用Fc与MB氧化电流的比值对目标蛋白质浓度的对数作图，获得标准曲线，通过标准曲线测得待测溶液中目标蛋白质的浓度。
本发明与现有技术相比，具有以下特点：
本发明通过核酸链构建比率电化学免疫传感界面，结合免疫反应诱导的邻位效应、核酸的结构变化和电化学活性分子在电极表面的氧化电流相应，构建一种简单、快速、高灵敏的比率电化学免疫传感器。相对现有免疫分析方法，具有以下特点：
(1)利用核酸链构建电化学免疫传感界面，制备简单、重复性好，同时能使抗体在传感界面有序排列，具有更好的生物传感效率。
(2)利用免疫反应诱导邻位效应设计目标蛋白质的检测原理，简化了分析过程，可实现一步式检测，可在40分钟内完成单个样品的测定。
(3)利用比率电化学信号对目标蛋白质定量，拓宽了检测线性范围，提高了灵敏度，对所选的模型蛋白质的检测限为1.6pg/mL。
(4)无需外加底物溶液。
四、附图说明
图1.双核酸标记的比率电化学免疫传感器及免疫分析过程示意图
图2.捕获探针DNA3的核酸结构示意图
图3.比率电化学免疫传感界面示意图
图4.夹心免疫反应诱导DNA2与DNA1邻位杂交示意图
五、具体实施方式
实施例1：结合附图3，双核酸标记的比率电化学免疫传感器的制备
打磨并清洗直径为2mm的金电极，在处理好的金电极上滴加6μL0.5μM两端分别标记巯基(SH)与二茂铁(Fc)的捕获探针DNA3，避光室温反应2小时，用含0.5MNaCl的0.01M磷酸盐洗液清洗电极，氮气吹干。然后在电极表面滴加6μL1mM巯基己醇，室温反应40分钟，用磷酸盐洗液清洗后氮气吹干。在电极表面继续滴加6μL1μM的MB标记的DNA1-抗体1，室温反应过夜，用磷酸盐洗液清洗后氮气吹干，制成双核酸标记的比率电化学免疫传感器，并保存在4℃条件下待用。
实施例2：结合附图1，以前列腺特异抗原(PSA)为例，说明该比率电化学免疫传感器的应用。
(1)配制样品温育液：把含有目标蛋白质(前列腺特异抗原)的待测溶液和DNA2-抗体2在含0.5M NaCl的0.01M磷酸盐缓冲液中混合，其中DNA2-抗体2的浓度为50nM。
(2)滴加6μL样品温育液于比率电化学免疫传感界面，室温温育40分钟，然后用冲洗液冲洗。
(3)把冲洗后的电极插入检测液，以此电极为工作电极、Ag/AgCl电极为参比电极、铂丝为对电极，在-0.4V至+0.60V电位范围进行交流伏安测定，脉冲振幅为25mV，脉冲频率为25Hz，脉冲宽度为4mV。根据记录的Fc和MB的氧化电流响应，求得它们的比值，用该比值对前列腺特异抗原浓度的对数作图，获得前列腺特异抗原检测的工作曲线，通过工作曲线即可得到待测溶液中目标蛋白质前列腺特异抗原的浓度。
Claims (5)
1.本发明涉及一种双核酸标记的比率电化学免疫传感器。其特征在于该传感器由二茂铁(Fc)标记DNA3捕获探针、亚甲基蓝(MB)标记DNA1-抗体1和DNA2-抗体2组成：DNA3另一端用巯基(SH)修饰，在金电极(Au)上通过Au-S键组装；DNA1与DNA3可以杂交，将MB引到电极表面，形成比率电化学免疫传感界面；在目标蛋白质存在时，DNA2-抗体2与目标物和DNA1-抗体1通过夹心免疫反应形成免疫复合物，并产生邻位效应，该效应促使DNA2与DNA1杂交，导致MB-DNA1-抗体1脱离免疫传感界面，自由的DNA3在金电极表面形成发夹结构，而使Fc向电极表面靠近；通过检测免疫反应后减少的MB的氧化电流和增加的Fc的氧化电流，用Fc和MB的氧化电流之比进行溶液中目标蛋白质的浓度测定。
2.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于所述的捕获探针DNA3的3’端修饰SH，5’端修饰Fc，从3’端开始的1-4碱基与从5’端开始的1-4碱基完全互补，可形成发卡结构。
3.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于所述的DNA1的5’端修饰MB，从5’端开始的4-15碱基与捕获探针DNA3的3’端开始的1-12碱基完全互补。
4.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于所述的DNA2从3’端开始的1-11碱基与DNA1的5’端开始的4-14碱基完全互补。
5.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于如下检测步骤：
(1)将样品溶液和DNA2-抗体2混合，并把混合液滴在比率电化学免疫传感界面进行温育；
(2)传感器用冲洗液冲洗后，插入检测溶液，用交流伏安法进行电化学检测，获得Fc和MB的氧化电流；
(3)求得Fc氧化电流对MB氧化电流的比值，将该比值与目标蛋白质的浓度进行对数作图，获得标准曲线，通过标准曲线测得待测溶液中目标蛋白质的浓度。
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