CN104297314B - 一种电化学膀胱癌dna传感器的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明解决所述电化学膀胱癌DNA传感器的技术方案是，通过电化学方法将玻碳电极表面羧基化，再将膀胱癌细胞特异DNA探针组装到玻碳电极上，制备膀胱癌DNA传感器。以玻碳电极为基底电极，依次进行电极羧基化和探针单链DNA组装，其中玻碳电极羧基化是为了固定探针DNA，探针DNA是识别元件，生物连接剂是1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨丙基)碳二亚胺和N‑羟基琥珀酰亚胺。其特征在于，获得高灵敏度的电化学膀胱癌DNA传感器。这种传感器灵敏度高，稳定性强，选择性好，其检测结果优于传统DNA检测方法。该制备方法包括：1.电化学膀胱癌DNA传感器的制备；2.电化学膀胱癌DNA传感器与目标DNA的杂交；3.传感器的电化学信号检测。该传感器操作方法简单，便于实际推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及膀胱癌DNA检测技术，具体为一种电化学膀胱癌DNA传感器的制备方法。该传感器将核酸杂交技术与电化学技术有机结合，通过循环伏安(CV)和差分脉冲(DPV)法的峰信号来检测膀胱癌的特异DNA。
背景技术
脱氧核糖核酸(DNA)对于所有生命体来说是一种最重要的基础生物分子。因此，对于DNA序列的识别和定量分析在基因诊断，疾病预防以及微生物检测领域有着非常重要的意义。近年来，随着生物技术的飞速发展和电子信息技术的长足进步，DNA序列检测技术也突飞猛进，检测方法的研究也取得了重大进展。如荧光检测法，荧光耦合聚合酶链反应法(PCR)，化学发光检测法，光密度成像检测法等这些DNA检测方法已经被应用于DNA的科学研究和临床检测。但是，上述检测方法在检测过程中，操作难度大，技术较为复杂，所需专业仪器昂贵，这些因素都使得DNA检测技术的发展收到了很大程度的制约。所以，新型电化学DNA传感器的开发与应用有着极其重要的意义。
目前，传统的DNA分子检测方法主要有荧光法(Audrey et al.Chem.Rev.，2008，109-139)，这种方法通过荧光共振转移原理(FRET)使发光体在遇到目标DNA后其荧光强度产生变化，通过对荧光信号的表征分析对目标DNA进行检测。但是，该方法前期样品制备复杂，实验误差较大，实验周期长，所需仪器昂贵，不利于快速、准确、方便地检测DNA序列。另外一种常用的DNA分子检测方法是压电晶体传感器法。这种传感器的构建依据是通过DNA杂交前后的质量变化，对DNA分子进行检测。该方法操作相对简单，但实验中所需要的石英晶体声微天平价格昂贵，并且检测的精度并不是很高。
电化学检测法是近年来新发展的一种高效并且准确可靠的分析检测方法，该方法在分析检测领域已经收到了人们广泛的关注和研究。因此，利用电化学法构建电化学DNA生物传感器并应用于DNA序列的检测也逐渐成为了一项新的DNA检测技术。目前，电化学DNA生物传感器的种类主要有发卡探针型传感器(Jin et al.，Biosens.Bioelectron..2007，1126-1130)，适体型传感器(Yan et al.，Sens.Actuat.B-Chem..2011，1380-1385)，以及层层自组装型传感器(Pandey et al.，Sens.Actuat.B-Chem..2011，333-340)。相对于传统的DNA检测方法，电化学DNA检测法具有选择性高、灵敏度好、稳定性强、检测成本低廉、能在复杂的体系中快速检测等特点。因此，新型电化学DNA传感器的创新开发具有非常重要的实际意义。
膀胱癌是目前世界上最常见的癌症之一，世界上患有膀胱癌疾病的患者多达2700万人(Kim et al.，Biosens.Bioelectron..2013，152-157)。由于膀胱癌的高复发率和癌细胞扩散的高速率(Du et al.，J.Photochem.Photobiol.B.2014，1-10)，所以膀胱癌的早期预防和诊断就显得非常重要。目前，对于膀胱癌的临床检测手段主要是通过常规的医学仪器(如CT，B超等)进行检查和确诊。这种传统的检查方法通常需要3至5天才可得到检查结果，并且需要医师反复查看才能最终确诊。相比于这种方法，电化学检测法可以实现高效，准确并且方便地对膀胱癌细胞进行体外检测。
发明内容
针对传统DNA检测技术的不足，本发明要解决的主要技术问题是，开发一种新型的电化学膀胱癌DNA传感器。该传感器具有很好的灵敏性，选择性和稳定性，适用于DNA分析技术。其检测效率，检测灵敏度以及目标DNA选择性均优于传统DNA检测方法，且制备工艺简单，成本低廉，适用性好，便于实际推广应用。
本发明解决所述电化学膀胱癌DNA传感器的技术方案是，通过电化学蚀刻方法将玻碳电极(GCE)表面羧基化，再将氨基标记的膀胱癌细胞特异DNA探针组装到玻碳电极上，制备膀胱癌DNA生物传感器。以玻碳电极为基底电极，依次进行电极羧基化和探针单链DNA(ssDNA)的组装，其中玻碳电极羧基化是为了固定探针ssDNA，探针ssDNA是识别元件，生物连接剂是1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。其特征在于，获得高灵敏度的电化学膀胱癌DNA传感器。这种传感器检测效率高，灵敏度好，稳定性强，选择性好，其检测结果明显优于传统DNA检测方法。
本发明解决所述电化学膀胱癌DNA传感器的技术方案是，通过电化学蚀刻方法和生物偶联的方法将膀胱癌细胞特异DNA探针组装到玻碳电极上，制备灵敏度高，选择性强，检测速度快的DNA生物传感器。该制备方法包括：
1.电化学膀胱癌DNA传感器的制备包括下面两个步骤：
1.1玻碳电极的羧基化：玻碳电极在使用前应进行预处理。将玻碳电极在粒径为50nm的氧化铝泥浆中抛光处理1-60min成表面镜面，然后在0.1-2.0mol/L硝酸，无水乙醇和超纯水中依次超声清洗1-60min，去除电极表面杂质，最后用高纯氮气吹干电极表面。处理干净后的玻碳电极在0.01-1.0mol/L硫酸溶液中通过电化学工作站进行循环伏安法活化，符合要求后，在超纯水中浸泡备用。将上述处理好的玻碳电极，浸入0.05～2mol/L氢氧化钠溶液中进行表面羧基化，采用循环伏安法扫描1-50圈，扫描速度为1～200mV/s，扫描范围-2～2V.
1.2单链DNA探针的组装：用微量进样器取0.1-100μl探针ssDNA和0.01-5mlEDC/NHS连接剂滴加到电极表面，于0-50℃恒温下密封静置1-24小时，再依次用Tris-HCl缓冲液(pH为7.0-9.0)、二次水冲洗电极表面以除去未组装的探针ssDNA，进而完成膀胱癌DNA传感器的制备。
2.电化学膀胱癌DNA传感器与目标DNA的杂交
将上述ssDNA/GCE电极置于0.1-50ml一定浓度互补目标DNA杂交液中，10-100℃恒温反应1-10h后取出，依次用Tris-HCl缓冲液(pH为7.0-9.0)、二次水冲洗电极表面除去未杂交的目标DNA，即完成了DNA分子在电极表面的杂交。然后将得到的双链DNA(dsDNA)修饰的玻碳电极dsDNA/CdTe置于1-100μmol/L的亚甲基蓝(MB)溶液中浸泡1-100min，使得MB分子嵌入DNA双链结构中；将处理好的电极用Tris-HCl缓冲液(pH为7.0-9.0)、二次水冲洗除去未反应的MB分子。
3.传感器的电化学信号检测
采用循环伏安法(CV)和差分脉冲伏安法(DPV)进行检测，以不同修饰的金电极作为工作电极，铂片电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，亚甲基蓝为指示剂，应用电化学工作站测试不同修饰电极的循环伏安曲线、差分脉冲伏安曲线。检测底液如无特别说明均为0.01-1mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.0-9.0)，扫描电位-2～2V，扫描速度为1-100mV/s。观察峰型变化，记录还原峰电流值。
附图说明
图1为ssDNA/GCE探针与目标DNA杂交过程的循环伏安图：a.玻碳电极；b.ssDNA/GCE；c.MB/dsDNA/GCE
图2为ssDNA/GCE探针与不同目标DNA杂交后的差分脉冲伏安曲线图：a.玻碳电极；b.多错配序列DNA；c.单碱基错配DNA；d.完全互补DNA
具体实施方式：
下面结合实施例进一步叙述本发明。
本发明解决所述电化学膀胱癌DNA传感器的技术方案是，通过电化学蚀刻方法将玻碳电极(GCE)表面羧基化，再将氨基标记的膀胱癌细胞特异DNA探针组装到玻碳电极上，制备膀胱癌DNA生物传感器。以玻碳电极为基底电极，依次进行电极羧基化和探针单链DNA(ssDNA)的组装，其中玻碳电极羧基化是为了固定探针ssDNA，探针ssDNA是识别元件，。生物连接剂是1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。所述的ssDNA探针序列可以根据A-T，G-C对应的原则得出。
上述DNA链段是下述DNA编码序列：
具有膀胱癌细胞特征的DNA编码序列，例如：
5’-CAGTAGACGGGGGTGTCTCGCGAC-3’：
实施例1
1.电化学膀胱癌DNA传感器的制备：
1.1玻碳电极的羧基化：玻碳电极在使用前应进行预处理。将玻碳电极在粒径为50nm的氧化铝泥浆中抛光处理5min成表面镜面，然后在0.1mol/L硝酸，无水乙醇和超纯水中依次超声清洗3min，去除电极表面杂质，最后用高纯氮气吹干电极表面。处理干净后的玻碳电极在0.5mol/L硫酸溶液中通过电化学工作站进行循环伏安法活化，符合要求后，在超纯水中浸泡备用。将上述处理好的玻碳电极，浸入0.1mol/L氢氧化钠溶液中进行表面羧基化，采用循环伏安法扫描1圈，扫描速度为50mV/s，扫描范围-0.4～1.4V.
1.2用微量进样器取5μl探针ssDNA和0.1ml EDC/NHS连接剂滴加到电极表面，于20℃恒温下密封静置2h，再依次用Tris-HCl缓冲液(pH为7.0)、二次水冲洗电极表面以除去未组装的探针ssDNA，进而完成膀胱癌DNA传感器的制备。
2.电化学膀胱癌DNA传感器与目标DNA的杂交
将上述ssDNA/GCE电极置于5ml一定浓度互补目标DNA杂交液中，25℃恒温反应2h后取出，依次用Tris-HCl缓冲液(pH为7.0)、二次水冲洗电极表面除去未杂交的目标DNA，即完成了DNA分子在电极表面的杂交。然后将得到的双链DNA(dsDNA)修饰的玻碳电极dsDNA/CdTe置于5μmol/L的亚甲基蓝(MB)溶液中浸泡5min，使得MB分子嵌入DNA双链结构中；将处理好的电极用Tris-HCl缓冲液(pH为7.0)、二次水冲洗除去未反应的MB分子。
3.传感器的电化学信号检测
采用循环伏安法(CV)和差分脉冲伏安法(DPV)进行检测，以不同修饰的金电极作为工作电极，铂片电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，亚甲基蓝为指示剂，应用电化学工作站测试不同修饰电极的循环伏安曲线、差分脉冲伏安曲线。检测底液均为0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH为7.0)，扫描电位-0.8～0.6V，扫描速度为10mV/s。观察峰型变化，记录还原峰电流值。
实施例2
1.电化学膀胱癌DNA传感器的制备：
1.1玻碳电极的羧基化：玻碳电极在使用前应进行预处理。将玻碳电极在粒径为50nm的氧化铝泥浆中抛光处理10min成表面镜面，然后在1mol/L硝酸，无水乙醇和超纯水中依次超声清洗5min，去除电极表面杂质，最后用高纯氮气吹干电极表面。处理干净后的玻碳电极在0.1mol/L硫酸溶液中通过电化学工作站进行循环伏安法活化，符合要求后，在超纯水中浸泡备用。将上述处理好的玻碳电极，浸入1mol/L氢氧化钠溶液中进行表面羧基化，采用循环伏安法扫描5圈，扫描速度为100mV/s，扫描范围-0.6～1.4V.
1.2用微量进样器取20μl探针ssDNA和0.1ml EDC/NHS连接剂滴加到电极表面，于35℃恒温下密封静置1小时，再依次用Tris-HCl缓冲液(pH为7.2)、二次水冲洗电极表面以除去未组装的探针ssDNA，进而完成膀胱癌DNA传感器的制备。
2.电化学膀胱癌DNA传感器与目标DNA的杂交
将上述ssDNA/GCE电极置于2ml一定浓度互补目标DNA杂交液中，30℃叵温反应3h后取出，依次用Tris-HCl缓冲液(pH为7.2)、二次水冲洗电极表面除去未杂交的目标DNA，即完成了DNA分子在电极表面的杂交。然后将得到的双链DNA(dsDNA)修饰的玻碳电极dsDNA/CdTe置于10μmol/L的亚甲基蓝(MB)溶液中浸泡10min，使得MB分子嵌入DNA双链结构中；将处理好的电极用Tris-HCl缓冲液(pH为7.2)、二次水冲洗除去未反应的MB分子。
3.传感器的电化学信号检测
采用循环伏安法(CV)和差分脉冲伏安法(DPV)进行检测，以不同修饰的金电极作为工作电极，铂片电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，亚甲基蓝为指示剂，应用电化学工作站测试不同修饰电极的循环伏安曲线、差分脉冲伏安曲线。检测底液如无特别说明均为0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH为7.2)，扫描电位-0.9～0.7V，扫描速度为50mV/s。观察峰型变化，记录还原峰电流值。
实施例3
1.电化学膀胱癌DNA传感器的制备包括下面两个步骤：
1.1玻碳电极的羧基化：玻碳电极在使用前应进行预处理。将玻碳电极在粒径为50nm的氧化铝泥浆中抛光处理20min成表面镜面，然后在1mol/L硝酸，无水乙醇和超纯水中依次超声清洗10min，去除电极表面杂质，最后用高纯氮气吹干电极表面。处理干净后的玻碳电极在1.0mol/L硫酸溶液中通过电化学工作站进行循环伏安法活化，符合要求后，在超纯水中浸泡备用。将上述处理好的玻碳电极，浸入0.8mol/L氢氧化钠溶液中进行表面羧基化，采用循环伏安法扫描10圈，扫描速度为30mV/s，扫描范围-0.6-1.8V.
1.2用微量进样器取15μl探针ssDNA和1.5ml EDC/NHS连接剂滴加到电极表面，于37℃恒温下密封静置1小时，再依次用Tris-HCl缓冲液(pH为7.5)、二次水冲洗电极表面以除去未组装的探针ssDNA，进而完成膀胱癌DNA传感器的制备。
2.电化学膀胱癌DNA传感器与目标DNA的杂交
将上述ssDNA/GCE电极置于2ml一定浓度互补目标DNA杂交液中，37℃恒温反应1.5h后取出，依次用Tris-HCl缓冲液(pH为7.5)、二次水冲洗电极表面除去未杂交的目标DNA，即完成了DNA分子在电极表面的杂交。然后将得到的双链DNA(dsDNA)修饰的玻碳电极dsDNA/CdTe置于20μmol/L的亚甲基蓝(MB)溶液中浸泡3min，使得MB分子嵌入DNA双链结构中；将处理好的电极用Tris-HCl缓冲液(pH为7.5)、二次水冲洗除去未反应的MB分子。
3.传感器的电化学信号检测
采用循环伏安法(CV)和差分脉冲伏安法(DPV)进行检测，以不同修饰的金电极作为工作电极，铂片电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，亚甲基蓝为指示剂，应用电化学工作站测试不同修饰电极的循环伏安曲线、差分脉冲伏安曲线。检测底液如无特别说明均为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH为7.5)，扫描电位-0.5-1.0V，扫描速度为100mV/s。观察峰型变化，记录还原峰电流值。
Claims (3)
1.一种电化学膀胱癌DNA传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)玻碳电极的羧基化：将玻碳电极浸入0.05～2mol/L的氢氧化钠溶液中进行表面羧基化，采用循环伏安法扫描1-50圈圈数，扫描速度为1～200mV/s，扫描范围-2～2V；
(2)单链DNA探针的组装：用微量进样器取0.1-100μl的探针单链DNA和0.1-5mlEDC/NHS连接剂滴加到电极表面，于0-50℃恒温下密封静置1-24小时，再依次用Tris-HCl缓冲液，pH为6.0-9.0，二次水冲洗电极表面以除去未组装的探针单链DNA，进而完成膀胱癌DNA传感器的制备。
2.根据权利要求1所述的电化学膀胱癌DNA传感器的制备方法，其特征在于，在步骤(1)之前，还对玻碳电极表面进行预处理：先将玻碳电极在粒径用氧化铝泥浆抛光处理1-30min，然后在0.1-1.0mol/L硝酸，无水乙醇和超纯水中依次超声清洗1-10min，最后用高纯氮气吹干电极表面；处理后的玻碳电极在0.01-1.0mol/L硫酸溶液中通过电化学工作站进行循环伏安法活化，符合要求后，在超纯水中浸泡备用。
3.如权利要求1或2所述的制备方法制得的电化学膀胱癌DNA传感器。
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