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苏邵
刘巍
汪联辉
晁洁
邹敏
张池
曹文芳
韩小彦
卢在伟
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Abstract

本发明公开了一种基于DNA构型转换的电化学传感器，包括电极和捕获探针DNA，捕获探针DNA为颈环单链结构，DNA链的3’端修饰亚甲基蓝，5’端修饰巯基，通过巯基与电极相互作用使得捕获探针DNA立在电极表面。本发明中，将电化学指示剂亚甲基蓝(MB)修饰到茎环DNA探针上，通过目标DNA和ATP与探针DNA反应后，造成探针DNA构型的变化，实现电化学信号的改变，完成对目标DNA和ATP的同时检测，而无须更换传感器。即实现了通过一种茎环DNA探针检测两种组分，减少了实验的复杂性。在此基础上，还可以进一步推广到用一种DNA探针，实现任意2种以上目标分子的选择性或同时检测。

Description

一种基于DNA构型转换的电化学传感器
技术领域
本发明属于电化学生物传感器制备及其应用领域，涉及一种基于颈环DNA电化学传感器制备方法和应用。
背景技术
DNA的电化学研究始于20世纪60年代，早期的工作主要集中于DNA的基本电化学行为的研究。随着极谱学的发展，其它电分析化学方法也用于DNA的研究，其范围已经扩大到DNA的结构和形态、DNA探针及传感器的研究。DNA生物传感器在卫生防疫和疾病诊断中越来越发挥重要作用，因其快速、灵敏、操作和仪器设备简单，尤其是它具有分子识别功能,在基因诊断、治疗,和传染性疾病检测等方面做出了很多贡献。
在DNA杂交及识别方面,电化学DNA传感器因成本低,设计简单,设备小巧,能耗低,引起人们重视。通常根据电活性小分子在电化学DNA生物传感器中引起的电化学信号变化的原理不同,可将其分为两类:一类是以非标记型电活性小分子杂交指示剂作为识别元素；另一类是将具有电活性的小分子标记在DNA探针上,利用杂交前后探针上小分子的氧化还原电流的变化进行DNA检测。这种方法将分子信标引入到电极表面,而且不需要任何杂交后处理和外加指示剂,可以方便、直接地指示杂交的进行。
现有的电化学DNA传感器只限于一种构型变化，检测一种待测目标，但是实际应用过程中我们往往需要同时检测两种或者两种以上目标物，这样传统传感器应用便遇到了很大局限。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供可以同时检测两种或者两种以上目标物的电化学DNA传感器。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种基于DNA构型转换的电化学传感器，包括电极和捕获探针DNA，捕获探针DNA为颈环单链结构，DNA链的3，端修饰亚甲基蓝，5，端修饰巯基，通过巯基与电极相互作用使得捕获探针DNA立在电极表面。
上述电极优选为金电极。
进一步，提供了一种制备上述电化学传感器的方法，包括以下步骤：
1)金电极的处理：在硼氢化钠溶液中浸泡电极1h，冲洗后依次用0.3μm和0.05μm氧化铝粉末打磨电极，依次在乙醇、超纯水中超声2分钟，以上处理过的金电极马上在电化学工作站中进行电化学处理，依次在0.5mol/LH2SO4溶液进行快、慢速循环扫描处理；
2)颈环DNA的组装：将颈环DNA分散在Tris-TE缓冲溶液中，进行退火处理，加入三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐(TCEP)断开茎环DNA之间形成的双硫键，将预处理好的颈环DNA溶液滴加到金电极上，盖上电极帽，在常温下培育一定时间，取出电极用超纯水清洗并用氮气吹干；
3)用一定浓度MCH对电极进行封闭，占据电极上未反应的位置点，防止后面假阳性信号的产生。
作为优选，上述硼氢化钠溶液的浓度为1mol/L，由硼氢化钠溶解在质量比1：1的超纯水和乙醇中形成。
作为优选，上述快、慢速循环扫描处理的扫速分别为4V/s和0.1V/s,扫描圈数分别为20圈和2圈。
作为优选，上述稀释Tris-TE缓冲溶液的pH值为7.0，采用以下步骤制备：配制20mmol/L的Tris-base，加入140mmol/LNaCl和5mmol/LMgCl2,，用0.2mol/LHCl调节pH至7.0即得稀释Tris-TE缓冲溶液。
作为优选，上述所述三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐(TCEP)的浓度为颈环DNA的100倍。
作为优选，上述所述步骤2的培育时间为12～16h。
又进一步，本发明还提供了一种将上述方法制备出的电化学传感器用于检测核酸适配体和ATP的方法，包括以下步骤：
(1)根据待测目标物选择合适的颈环DNA，制备电化学传感器，检测电位在-0.5～-0.1V范围内，检测方法为微分脉冲伏安法；
(2)按照要求1和2组装好探针DNA，常温培育12-16h后，清洗并用氮气吹干；
(3)在37℃下，用6-疏基己醇(MCH)对电极封闭1小时，清洗并用氮气吹干；将pH值为7.0的Tris-TE培育的不同浓度核酸适配体DNA滴加在电极表面，37℃培育1h让颈环DNA与核酸适配体充分反应，在-0.5～-0.1V范围内，用微分脉冲伏安法检测；
(4)固定某一核酸适配体浓度，滴加不同浓度的ATP在电极表面，37℃条件下培育1h，同样检测体系进行检测。
有益效果：本发明中，将电化学指示剂亚甲基蓝(MB)修饰到茎环DNA探针上，通过目标DNA和ATP与探针DNA反应后，造成探针DNA构型的变化，实现电化学信号的改变，完成对目标DNA和ATP的同时检测，而无须更换传感器。即实现了通过一种茎环DNA探针检测两种组分，减少了实验的复杂性。在此基础上，还可以进一步推广到用一种DNA探针，实现任意2种以上目标分子的选择性或同时检测。
附图说明
图1为颈环DNA电化学传感器检测核酸适配体DNA的原理示意图。
图2为颈环DNA电化学传感器检测ATP的原理示意图。
图3为颈环DNA检测目标物的微分脉冲伏安曲线。
具体实施方式
捕获探针DNA为5’-thiol-TTTACCTGGACCTTCCTCCGCAATACTCCCCCAGGTTTT-MB-3’，核酸适配体DNA为5’-ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3’，根据目标物选择核酸适配体和颈环DNA。
颈环DNA电化学传感器的构建：
在硼氢化钠溶液中浸泡电极1h，冲洗后依次用0.3μm和0.05μm氧化铝粉末打磨电极，依次用乙醇、超纯水中超声2分钟，在0.5mol/LNaOH溶液，从-0.35～1.5V循环扫描20，在电化学工作站Cell中用0.5mol/LH2SO4溶液处理，最后在新的0.5mol/LH2SO4溶液扫描出金电极特征峰。
将发夹结构的捕获探针分散在pH为7.0的Tris-TE缓冲溶液(制备方法：配制20mmol/L的Tris-base，加入140mmol/LNaCl和5mmol/LMgCl2,，用0.2mol/LHCl调节pH至7.0即得稀释Tris-HCL缓冲溶液)中，为浓度10μmol/L(捕获探针之前是100μmol/L保存在-20℃)。滴加5μL捕获探针DNA溶液到已经处理好电极上，盖上电极帽，防止外界环境的干扰，放在室温培育16h，捕获探针通过金硫键固定到金电极表面。取出电极，用10mmol/LpH为7.0的Tris-HCl对电极进行适当冲洗。在-0.35～1.5V范围内，对培育冲洗好电极进行方波伏安法测定。
核酸适配体检测：
如图1所示，在前面实验基础上，用氮气吹干电极，用2mg·mL-1MCH对电极进行封闭1小时。占据电极上未反应掉的活性位点，杜绝后面假阳性信号的产生。清洗换溶液清洗后，氮气轻轻吹干，再把pH7.0Tris-TE缓冲溶液培育的核酸适配体DNA滴加到电极上，37℃培育1小时，同样条件进行电化学检测。当一定浓度的核酸适配体DNA加入到反应体系后，颈环DNA与核酸适配体DNA杂交形成特定的分子结构，发夹结构解开，此时MB远离金电极表面，所产生的电化学信号明显降低，如图3中箭头a所指示。通过电化学信号的变化与目标物浓度之间的变化关系，实现对目标核酸适配体DNA高灵敏、特异性的检测。
ATP的检测：
如图2所示，在前面实验的基础上，固定某一浓度的核酸适配体，把pH8.0的Tris-HCl缓冲溶液培育的ATP滴加到电极上，37℃培育1小时，同样条件进行电化学检测。当一定浓度的ATP加入到反应体系后，ATP与核酸适配体亲和力大于双链的，核酸适配体结合ATP从双链DNA脱落，双链DNA再变为发卡结构，此时MB靠近金电极表面，所产生的电化学信号明显增强，如图3中箭头b所指示。通过电化学信号的变化与目标物浓度之间的变化关系，实现对目标ATP的高灵敏、特异性的检测。
以上所述仅为本发明的一个具体实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于DNA构型转换的电化学传感器，包括电极和捕获探针DNA，其特征在于：捕获探针DNA为颈环单链结构，DNA链的3’端修饰亚甲基蓝，5’端修饰巯基，通过巯基与电极相互作用使得捕获探针DNA立在电极表面。
2.根据权利要求1所述的一种基于DNA构型转换的电化学传感器，其特征在于：所述电极为金电极。
3.一种制备权利要求2所述的电化学传感器的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)金电极的处理：在硼氢化钠溶液中浸泡电极1h，冲洗后依次用0.3μm和0.05μm氧化铝粉末打磨电极，依次在乙醇、超纯水中超声2分钟，以上处理过的金电极马上在电化学工作站中进行电化学处理，依次在0.5mol/LH2SO4溶液进行快、慢速循环扫描处理；
2)颈环DNA的组装：将颈环DNA分散在Tris-TE缓冲溶液中，进行退火处理，加入三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐断开茎环DNA之间形成的双硫键，将预处理好的颈环DNA溶液滴加到金电极上，盖上电极帽，在常温下培育一定时间，取出电极用超纯水清洗并用氮气吹干；
3)用一定浓度MCH对电极进行封闭，占据电极上未反应的位置点，防止后面假阳性信号的产生。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述硼氢化钠溶液的浓度为1mol/L，由硼氢化钠溶解在质量比1：1的超纯水和乙醇中形成。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述快、慢速循环扫描处理的扫速分别为4V/s和0.1V/s,扫描圈数分别为20圈和2圈。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述Tris-TE缓冲溶液的pH值为7.0，采用以下步骤制备：配制20mmol/L的Tris-base，加入140mmol/LNaCl和5mmol/LMgCl2,，用0.2mol/LHCl调节pH至7.0即得稀释Tris-TE缓冲溶液。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述2-巯基乙醇的浓度为颈环DNA的100倍。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤2中的培育时间为12～16h。
9.一种将使用权利要求3所述的方法制备的电化学传感器用于检测核酸适配体和ATP的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)根据待测目标物选择合适的颈环DNA，制备电化学传感器，检测电位在-0.5～-0.1V范围内，检测方法为微分脉冲伏安法；
2)组装好探针DNA，常温培育12-16h后，清洗并用氮气吹干；
3)在37℃下，用6-疏基己醇对电极封闭1小时，清洗并用氮气吹干，将pH值为7.0的Tris-TE培育的不同浓度核酸适配体DNA滴加在电极表面，37℃培育1h让颈环DNA与核酸适配体充分反应，在-0.5～-0.1V范围内，用微分脉冲伏安法检测；
4)固定某一核酸适配体浓度，滴加不同浓度的ATP在电极表面，37℃条件下培育1h，同样检测体系进行检测。
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