CN110938673A

CN110938673A - 一种链置换引物介导不对称pcr生成单链dna的方法

Info

Publication number: CN110938673A
Application number: CN201911138081.0A
Authority: CN
Inventors: 张章; 姚娟; 张皛珺
Original assignee: Affiliated Hospital of Southwest Medical University
Current assignee: Affiliated Hospital of Southwest Medical University
Priority date: 2019-11-19
Filing date: 2019-11-19
Publication date: 2020-03-31
Anticipated expiration: 2039-11-19
Also published as: CN110938673B

Abstract

本发明属于分子生物技术领域，具体公开了一种链置换引物介导不对称PCR生成单链DNA的方法，本发明通过双链引物介导的链置换反应，将上游引物设计为双链引物，该引物末端分别标记荧光基团和淬灭基团，这样设计减少了体系的复杂性，增加了引物的特异性并提高了单链DNA的产量，通过荧光强度的积累可以直观的判断出不对称PCR的指数扩增期和线性扩增期。

Description

一种链置换引物介导不对称PCR生成单链DNA的方法

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，特别是涉及一种链置换引物介导不对称PCR生成单链DNA的方法。

背景技术

单核苷酸多态性(SNPs)是单个核苷酸的改变所引起的DNA序列多态性，是人类基因组中最常见、最稳定的变异形式。人类基因组中存在着约30-1000万个SNPs位点，这些SNPs影响着人类对疾病的易感性以及对病原体、化学品、药品、疫苗等的反应。因此SNPs的检测在疾病的风险性评估、诊断、治疗，实现精准医疗等方面均有巨大的价值。

近年来发展的基于核酸扩增和杂交的核酸快速检测技术为SNPs的检测、精准医疗的实施提供了新的契机，其核心包括：获得大量具有杂交活性的靶基因以实现临床样本的高灵敏检测；获得与靶基因相匹配的特异检测探针以实现检测信号的准确输出。

核酸扩增是获得大量具有杂交活性靶基因的主要技术，如聚合酶链式反应(PCR)，依赖解旋酶的等温扩增(HDA)，环介导核酸等温扩增(LAMP)，链替代扩增(SDA)，切刻内切酶核酸恒温扩增(NAR)等。这些技术的发展为从低拷贝样本中获得大量靶基因提供了可能。

不对称PCR、核酸外切酶处理法、变性聚丙烯酰氨凝胶电泳分离法和磁珠捕获法是获得具有杂交活性靶基因最有效的几种方法。核酸外切酶处理法用核酸外切酶作用于扩增的双链DNA，从羟基末端方向逐步水解单核苷酸，从而在DNA双链内部发生碱基渐进缺失的过程，最终产生大量的单链靶基因；变性聚丙烯酰氨凝胶电泳分离法利用扩增产物链长度差异，经变性电泳分离达到获得单链靶基因的效果；磁珠法通过链霉亲和素包被的磁珠捕获生物素标记的扩增产物，然后用NAOH处理获得单链DNA；上述方法均需对PCR产物进行额外的后处理，操作不便，且成本高。不对称PCR用不等量的引物经指数扩增和线性扩增两个阶段来扩增大量的单链靶基因，但这种方法需要优化上下游引物的量，操作繁琐，还可能会产生非特异性目标条带，导致引物特异性低。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种链置换引物介导不对称PCR生成单链DNA的方法，用于解决现有的用于制备单链扩增产物的方法操作复杂、引物特异性低、单链DNA不易获得等问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种链置换引物介导不对称PCR生成单链DNA的方法，将上游引物探针设计为双链引物，通过双链引物介导的链置换反应介导不对称PCR，生成单链DNA。

可选地，所述上游引物探针的末端分别标记有荧光基团和淬灭基团。

可选地，所述方法包括如下步骤：

(1)预变性；(2)若干个变性、引物退火和引物延伸的PCR扩增。

可选地，所述上游引物探针的荧光基团标记序列为：5’-FAM-ATTACAGGGTCAACTGCTATGA-3’，所述上游引物探针的淬灭基团标记序列为：5’-CAGTTGACCCTGTAAT-BHQ-3’；所述下游引物的序列为：5’-CCCAATCCCCCAGCAGGCTCCG-3’。

可选地，检测探针的序列为：5’-SH(CH2)6-CAGGCAAACTCTGAACTGA-methyleneblue-3’。

可选地，所述扩增产物的长度为150-300nt。

可选地，所述上游引物与下游引物的摩尔比为(4-10)∶1。

可选地，所述PCR扩增的循环数为30-50个。

本发明第二方面提供一种采用上述方法在鉴定乙醛脱氢酶2上的应用，包括如下步骤：

(1)人全血基因组核酸的提取；

(2)设计并合成ALDH2的特异性引物和探针：

上游引物探针为末端标记有荧光基团和淬灭基团的双链引物，上游引物探针的荧光基团标记序列为：5’-FAM-ATTACAGGGTCAACTGCTATGA-3’，上游引物探针的淬灭基团标记序列为：5’-CAGTTGACCCTGTAAT-BHQ-3’；

下游引物的序列为：5’-CCCAATCCCCCAGCAGGCTCCG-3’；

检测探针的序列为：5’-SH(CH2)₆-CAGGCAAACTCTGAACTGA-methylene blue-3’；

(3)不对称PCR扩增反应：

①构建PCR反应体系：去离子水20μL，2*HiFi-PCR Master 25μL，DNA模板1μL，上游引物10μmol/L、2μL，下游引物2μmol/L、2μL；

②PCR扩增程序包括如下步骤：95℃，预变性3min；95℃，变性3s；95℃，退火15s；72℃，延伸15s；30-50个循环；

(4)乙醛脱氢酶2基因型判断：将捕获探针固定在金电极上，得到探针修饰的金电极，所述捕获探针能与野生型单链靶基因杂交的捕获探针，且捕获探针末端标记有MB电化学活性分子，采用所述金电极制备电化学生物传感器，并将步骤(3)得到的扩增产物滴加在所述电化学生物传感器上，采用方波伏安法(SWV)检测不对称PCR扩增的ALDH2单链靶基因的基因型，不产生信号的变化的为突变型单链靶基因，产生电流信号的变化的为野生型单链靶基因。

上述电化学生物传感器中，由于金电极上固定了能与野生型单链靶基因杂交的捕获探针，检测时，突变位点的野生型单链靶基因会与捕获探针杂交，使得捕获探针的构象发生变化从而产生电流信号的变化；而突变型单链靶基因不与捕获探针杂交，就不产生信号的变化，从而鉴定出乙醛脱氢酶2的基因型。

可选地，所述捕获探针的制备方式如下：取100μL 10μM的检测探针与1μL 0.1μM的TCEP(三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐)反应，随后将检测探针浓度稀释至1μM，在全程避光条件下把反应溶液放在95℃水浴箱中水浴3-10分钟，然后冷却，形成发夹结构的捕获探针。

可选地，所述检测探针的序列为：5’-SH(CH2)₆-CAGGCAAACTCTGAACTGA-methyleneblue-3’。

本发明第三方面提供一种电化学生物传感器，用于检测不对称PCR扩增得到的单链DNA，所述电化学生物传感器的金电极修饰有捕获探针，所述捕获探针为检测探针与TCEP(三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐)反应制得。

本发明第四方面还提供一种试剂盒，所述试剂盒包含上述方法制备得到的单链DNA。

可选地，所述试剂盒用于鉴定ALDH2、Apo E、CYP2C19基因。

如上所述，本发明的链置换引物介导不对称PCR生成单链DNA的方法，具有以下有益效果：本发明提供了一种简便高效、可以直观判读的用于制备单链扩增产物的不对称PCR方法。与目前通常采用的不对称PCR方法相比，本发明的不对称PCR扩增引物具有以下特点和优点：

1、本发明采用双链引物介导的链置换反应进行不对称PCR，在一定程度上减少了反应体系的复杂性，并增加了引物与模板结合的特异性，减少了非特异性扩增产生的可能性，引物易于设计，并且能直观的在PCR扩增曲线上识别；

2、本发明中，双链引物的末端标记有荧光基团和淬灭基团，可以实现对不对称PCR扩增过程的实时全面监控；

3、本发方法能方便快捷的获得单链目的核酸片段，且单链产率高，有利于后续的杂交反应，可以很大程度上提高杂交效率和杂交信号；并且可以很容易的进行多重不对称PCR反应获得多个单链靶基因。

附图说明

图1为本发明实施例1中双链引物介导的不对称PCR获得大量单链DNA的示意图。

图2为本发明实施例1中不对称PCR与普通PCR扩增曲线图。

图3为本发明实施例2中电化学传感器的电化学表征图。

图4为本发明实施例2中电化学传感器用于ALDH2不对称PCR扩增产物的检测结果图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

本发明提供一种链置换引物介导不对称PCR生成单链DNA的方法，以乙醛脱氢酶2(ALDH2)的鉴定为例，具体实施过程如下：

人类乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase gene，ALDH)是一种四联体蛋白，催化乙醛和其他脂肪族醛氧化。ALDH2基因第12外显子内存在一个单核苷酸多态(singlenucleotide polymorphism，SNP)——rs671，出现碱基置换：鸟嘌呤(G)→腺嘌呤(A)，故导致密码子改变：GAA→AAA，进而发生该酶第504个氨基酸的改变，谷氨酸(Glu)→赖氨酸(Lys)。ALDH2有两个等位基因：野生型(ALDH2*1，*504Glu)，突变型(ALDH2*2，*504Lys)。研究证实，ALDH2这一突变导致酶活性发生显著改变，会严重影响酒精、硝酸甘油等的代谢，且这一突变存在明显的种族差异，其在欧美白种人中少见，而在中、日、韩等东亚黄种人中突变率高达30％-50％。

检测ALDH2的基因型，对揭示个体酒精代谢解毒能力以及正确使用硝酸甘油，具有重要意义。目前测定ALDH2基因型的方法主要采用聚合酶链式反应-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)、手工或自动测序、序列特异性引物PCR等方法，操作繁琐，检测周期长，检测结果不易准确，难以满足临床检验的要求。

实施例1

不对称PCR扩增及其在乙醛脱氢酶2(ALDH2)鉴定上的应用

1.人全血基因组核酸的提取

采取厦门致善磁珠法(Lad-Aid 824s)对人全血基因组进行提取。血液样本为EDTA-K2抗凝的全血。

2.PCR扩增ALDH2的特异性引物和探针

上游双链引物序列(5’-3’)：荧光标记：FAM-ATTACAGGGTCAACTGCTATGA

淬灭标记：CAGTTGACCCTGTAAT-BHQ；

下游引物序列(5’-3’)：CCCAATCCCCCAGCAGGCTCCG；

检测探针序列(5’-3’)：SH(CH2)₆-CAGGCAAACTCTGAACTGA-methylene blue；

扩增产物长度：205nt。

3.试剂准备

3.1提前10～15分钟从-20℃冰箱中取出试剂盒(2*HiFi-PCR Master，即用PCR扩增试剂盒，来自上海生工生物)，并准备好上游引物探针、下游引物和DNA模板。

3.2取出适当容积的无菌EP管，并做好相应标记。加入上述试剂，混匀后2000rpm离心10s。

3.3取出无菌的0.2mL PCR反应管，并做好相应标记，按照20μL/管分装量对2*HiFi-PCR Master进行分装。

3.4盖紧PCR反应管盖后，将PCR反应管转移至样本准备区；剩余试剂放回-20℃冰箱冷冻保存。

3.5打开PCR反应管盖，每管加入DNA模板5μL，盖好PCR反应管，将PCR反应液与DNA模板振荡混匀后2000rpm离心10s，并记录模板加样顺序。

4.不对称PCR扩增程序、荧光采集和结果分析

4.1 PCR反应体系如下：

反应物	用量
		去离子水	20微升
2*HiFi-PCR Master	25微升
		DNA模板	1微升
上游引物探针(10微摩尔/L)	2微升
		下游引物(2微摩尔/L)	2微升

4.2采用CFX96荧光定量PCR仪在FAM绿色荧光通道下对荧光信号进行采集，PCR扩增程序如下：

如图1所示，上游引物为优势双链引物探针，下游引物为普通限制性引物。在指数扩增期，上下游引物均参与PCR，双链引物与DNA模板杂交并延伸后产生S型扩增曲线。当下游引物消耗殆尽后，进入线性扩增期，双链引物探针与模板杂交后产生线性信号。

图2显示为不对称PCR与普通PCR的扩增曲线图。如图2所示，普通PCR分为指数扩增期和稳定期，产生双链扩增产物；而不对称PCR经指数扩增期和线性扩增期产生大量的单链DNA。

实施例2

采用电化学传感的方法检测不对称PCR的单链核酸产物

1.实验方法

1.1金电极的预处理

首先，用氧化铝粉末轻轻地打磨3毫米直径的柱状金电极直至光滑成镜面，接着把打磨好的金电极用超纯水和无水乙醇超声清洗干净。然后，用新鲜配置的食人鱼溶液(98％浓硫酸和30％过氧化氢，3∶1，v/v)活化金电极表面，超纯水清洗后用CV(循环伏安法)在0.1摩尔的硫酸溶液中反复扫描(-0.2V～1.6V)，直到稳定重复的CV曲线出现，用超纯水清洗干净后烘干待用。

1.2金电极的修饰

在裸金电极进行修饰之前，把100μL 10μM的检测探针(实施例1中所列的)与1μL0.1μM的TCEP(三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐，购买于sigma公司)反应1小时来减少二硫键的形成，随后将检测探针浓度稀释至1μM。在全程避光条件下把上述溶液放在95℃水浴箱中水浴5分钟，然后放在冷水中降温30分钟，形成发夹结构的捕获探针。

将10μL的捕获探针溶液滴加在预处理好的金电极上，盖上盖防止液体蒸发，避光，放置在室温中8小时，制成探针修饰的金电极；反复清洗后，滴加1mM的MCH(6-Mercapto-1-hexanol，6-巯基-1-乙醇，购买于sigma公司)溶液在金电极上，封闭金电极表面的非特异性结合位点，并支撑起捕获探针链，37℃条件下孵育2小时，再用超纯水反复清洗去除未结合的多余MCH，得到探针修饰的金电极。

1.3电化学传感器对不对称PCR生成的单链核酸产物的检测

将实施例1中获得10μL PCR扩增产物滴加在制备好的电化学核酸传感器表面，37℃下避光反应2小时；用超纯水冲洗干净以终止杂交反应，并用氮气烘干；将电极用超纯水反复冲洗后烘干后，采用SWV(方波伏安法)在工作液中检测亚甲蓝(MB)的电化学信号。

2.实验结果及分析

2.1图3显示为本实施例中电化学传感器的电化学表征图。其中，A为CV曲线图：(a)(a)裸金电极，(b)捕获探针/金电极，(c)MCH/捕获探针/金电极，(d)单链靶基因/MCH/捕获探针/金电极；B为EIS(电化学阻抗谱法)曲线图：(a)裸金电极，(b)捕获探针/金电极，(c)MCH/捕获探针/金电极，(d)单链靶基因/MCH/捕获探针/金电极。

如图3所示，裸电极的CV曲线呈现出一个明显的氧化还原峰，且Nyquist图形近乎于一条直线，说明金电极的成功打磨(曲线a)；当捕获探针通过金-硫键自组装到金电极表面后，由于带负电的磷酸骨架对电子传递介质的静电排斥作用，CV曲线氧化还原峰下降，峰间距增大，Ret增大，说明捕获探针通过金-硫键成功的固定在了金电极表面(曲线b)；当于金电极表面修饰MCH后，由于MCH对于电子传递的阻碍作用，CV氧化还原峰继续下降，峰间距继续变大，Ret继续增大，说明MCH对金电极表面活性位点的封闭(曲线c)；当加入PCR单链扩增产物后，CV峰间距进一步变大，Ret进一步增加，说明了捕获探针对单链靶基因的捕获(曲线d)。

上述结果证明了电化学传感器的成功构建和实验的可行性。

2.2本实施例中我们用SWV方法对该电化学检测方法进行可行性验证。

图4显示为电化学传感器用于ALDH2不对称PCR扩增产物的检测结果图。

如图4所示，裸电极时没有检测到任何的氧化还原信号(曲线a)，这是由于裸金电极表面没有任何的氧化还原信号分子；当固定上信号分子标记的捕获探针时(曲线b)，捕获探针的发夹结构使大量的MB信号分子靠近电极表面，产生高效的电子转移，出现一个明显的法拉第电流信号并且在-0.272V处出现良好定义的MB峰电流；在捕获探针与加入的不对称PCR单链靶基因杂交后(曲线c)出现电流信号的明显下降，发夹结构的空间构象变化使MB信号分子远离金电极表面，抑制了电子传递。显然，检测信号的下降是由于单链靶基因与捕获探针杂交之后导致不断的MB信号分子远离金电极表面，导致电流信号下降。

综上所述，本方法通过双链引物介导的链置换反应进行不对称PCR，能方便快捷地获得单链目的核酸片段，减少烦琐的条件优化及复杂的操作步骤，且引物设计简单，特异性和通用性强，在不对称PCR技术及单链核酸杂交领域的研究具有较为深远的影响，可以广泛的应用于疾病的风险性评估、诊断、治疗，在实现精准医疗等方面均有巨大的价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

SEQUENCE LISTING

<110> 西南医科大学附属医院

<120> 一种链置换引物介导不对称PCR生成单链DNA的方法

<130> PCQXN198313

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 上游引物探针荧光标记基团

<400> 1

attacagggt caactgctat ga 22

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 上游引物探针淬灭标记基团

<400> 2

cagttgaccc tgtaat 16

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 下游引物

<400> 3

cccaatcccc cagcaggctc cg 22

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 检测探针

<400> 4

shchcaggca aactctgaac tga 23

<210> 5

<211> 470

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 野生型ALDH2基因部分片段

<400> 5

ggcaacagag aaagattcta tctcaaaaaa aaaaattttt ttttaagtta aaaataaaat 60

aaagactttg gggcaataca gggggtcctg ggagtgtaac ccataacccc caagagtgat 120

ttctgcaatc tcgtttcaaa ttacagggtc aactgctatg atgtgtttgg agcccagtca 180

ccctttggtg gctacaagat gtcggggagt ggccgggagt tgggcgagta cgggctgcag 240

gcatacactg aagtgaaaac tgtgagtgtg ggacctgctg ggggctcagg gcctgttggg 300

gcttgagggt ctgctggtgg ctcggagcct gctgggggat tggggtctgt tgggggctcg 360

gggcctgcca gaggttcagg acctgccggg gactcagggc ctgctggaag ttcaggacct 420

gctggggatc agggcctgcc agggatttag ggtctgctgg gcgggccacc 470

<210> 6

<211> 470

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 突变型ALDH2基因部分片段

<400> 6

ggcaacagag aaagattcta tctcaaaaaa aaaaattttt ttttaagtta aaaataaaat 60

aaagactttg gggcaataca gggggtcctg ggagtgtaac ccataacccc caagagtgat 120

ttctgcaatc tcgtttcaaa ttacagggtc aactgctatg atgtgtttgg agcccagtca 180

ccctttggtg gctacaagat gtcggggagt ggccgggagt tgggcgagta cgggctgcag 240

gcatacacta aagtgaaaac tgtgagtgtg ggacctgctg ggggctcagg gcctgttggg 300

gcttgagggt ctgctggtgg ctcggagcct gctgggggat tggggtctgt tgggggctcg 360

gggcctgcca gaggttcagg acctgccggg gactcagggc ctgctggaag ttcaggacct 420

gctggggatc agggcctgcc agggatttag ggtctgctgg gcgggccacc 470

Claims

1.一种链置换引物介导不对称PCR生成单链DNA的方法，其特征在于，将上游引物探针设计为双链引物，采用双链引物介导的链置换反应进行不对称PCR，生成单链DNA。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述上游引物探针的末端分别标记有荧光基团和淬灭基团。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述不对称PCR扩增程序包括如下步骤：

(1)预变性；(2)若干个变性、引物退火和引物延伸的PCR扩增。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述上游引物探针的荧光基团标记序列为：5’-FAM-ATTACAGGGTCAACTGCTATGA-3’，所述上游引物探针的淬灭基团标记序列为：5’-CAGTTGACCCTGTAAT-BHQ-3’；所述下游引物的序列为：5’-CCCAATCCCCCAGCAGGCTCCG-3’；

检测探针的序列为：

5’-SH(CH2)₆-CAGGCAAACTCTGAACTGA-methylene blue-3’。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述扩增产物的长度为150-300nt；

和/或，所述上游引物探针与下游引物的摩尔比为(4-10)∶1。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的循环数为30-50个。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法在鉴定乙醛脱氢酶2上的应用，其特征在于：包括如下步骤：

(1)人全血基因组核酸的提取；

(2)设计并合成ALDH2的特异性引物和探针：

上游引物探针为末端标记有荧光基团和淬灭基团的双链引物，所述上游引物探针的荧光基团标记序列为：5’-FAM-ATTACAGGGTCAACTGCTATGA-3’，所述优势上游引物探针的淬灭基团标记序列为：5’-CAGTTGACCCTGTAAT-BHQ-3’；

下游引物的序列为：5’-CCCAATCCCCCAGCAGGCTCCG-3’；

(3)不对称PCR扩增反应：

①构建PCR反应体系：去离子水20μL，2*HiFi-PCR Master 25μL，DNA模板1uL，上游引物探针10μmol/L、2μL，下游引物2μmol/L、2μL；

(4)乙醛脱氢酶2基因型结果判断：将捕获探针固定在金电极上，得到探针修饰的金电极，所述捕获探针能与野生型单链靶基因杂交的捕获探针，且捕获探针末端标记有MB电化学活性分子，采用所述金电极制备电化学生物传感器，并将步骤(3)得到的扩增产物滴加在所述电化学生物传感器上，采用方波伏安法检测不对称PCR扩增的ALDH2单链靶基因的基因型，不产生信号的变化的为突变型单链靶基因，产生电流信号的变化的为野生型单链靶基因。

8.一种电化学生物传感器，用来于检测不对称PCR扩增得到的单链DNA，其特征在于，所述电化学生物传感器的金电极修饰有捕获探针，所述捕获探针为检测探针与TCEP(三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐)反应制得。

9.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1-7任一项所述的方法制备得到的单链DNA。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于鉴定ALDH2、Apo E、CYP2C19基因。