CN107557448A - 一种血浆游离dna甲基化电化学检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于连续识别与级联放大系统的血浆游离DNA甲基化电化学检测方法及试剂盒,使用不同浓度的生物素标记的甲基化特异性引物,通过此不对称的MSP鉴别亚硫酸氢盐修饰的基因组样品中的甲基化DNA而不是非甲基化等位基因;利用聚合酶的扩增能力,加入不同浓度的引物,产生大量具有生物素标记的单链扩增子,减少了引物二聚体的干扰;通过修饰在金电极表面上的自组装四面体上的DNA纳米结构探针捕获这些扩增子;通过生物素‑亲和素结合作用捕获辣根过氧化物酶缀合的抗生物素蛋白,利用酶的催化过程产生电化学信号。该方法具有良好的灵敏度,能检测单个拷贝的甲基化DNA分子,同时具有良好的特异性,能够在有大量非甲基化DNA干扰下检测出0.1%的甲基化。
Description
技术领域
本发明属于DNA甲基化检测技术领域,涉及一种血浆游离DNA甲基化电化学检测方法及试剂盒。
背景技术
DNA甲基化在哺乳动物中广泛存在,主要表现为在CpG二核苷酸处的胞嘧啶碱基5号碳原子上添加一个甲基。大量研究表明,DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性以及DNA与蛋白相互作用方式的改变,从而控制基因表达。因此,肿瘤抑制基因中启动子区域CpG岛的甲基化通常与癌症,如肺癌的发展有关。累积的证据表明这些甲基化的DNA可以在肿瘤的不同阶段释放到人体循环系统中,这些无细胞的游离DNA被认为是癌症早期检测和行为监测的预后指标。然而,来自癌症的甲基化DNA仅代表复杂临床样本(例如血浆)中总DNA的一小部分,因而,在特异性DNA甲基化模式的精准分析中还是一项持久的技术挑战。
由于这些游离DNA在循环系统中分布很少,《非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识》指出“血液游离DNA片段通常较短,在晚期癌症患者血液中浓度极低,平均约为17μg/L”,因此如何高灵敏高特异地检测这些DNA的甲基化状态就显得尤为重要。目前,DNA甲基化检测的方法主要有亚硫酸氢钠转化,限制酶消化和亲和力富集这三类。其中,亚硫酸氢钠法是最被广泛应用的。这种技术依赖于亚硫酸氢钠处理DNA,将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶,而不改变甲基化的胞嘧啶,从而将表观遗传学差异转化为序列差异,然后通过PCR用甲基化特异性引物扩增这些修饰后的DNA,产物用凝胶电泳鉴定。然而,这种MSP方法仅提供定性分析和低检测灵敏度。定量甲基化特异性PCR(qMSP)利用荧光染料或TaqMan探针的优势来实现定量分析并提高灵敏度。然而它仍然常受非特异性扩增干扰,包括引物二聚体形成和非甲基化等位基因的脱靶扩增,进而降低了它的检测灵敏度和检测特异性。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种血浆游离DNA甲基化电化学检测方法及试剂盒,基于连续识别与级联放大系统的微量检测,以克服现有技术灵敏度不够,特异性不高等缺点。
本发明是通过以下技术方案来实现:
一种血浆游离DNA甲基化电化学检测方法,包括以下操作:
1)根据检测基因设计甲基化特异性引物序列,使用不同浓度的生物素标记引物,然后通过不对称的甲基化特异性PCR(MSP)鉴别亚硫酸氢盐修饰的血浆基因组样品中的甲基化DNA,甲基化特异性引物将特异性识别甲基化的DNA序列;
2)利用热启动Taq聚合酶的扩增能力对甲基化DNA模板进行扩增,通过加入不同浓度的甲基化特异性引物,产生具有生物素标记的单链扩增子;
3)通过修饰在金电极表面上的自组装四面体上的DNA纳米结构探针与这些特异性扩增子上的序列互补杂交,识别捕获特异性扩增子;
4)通过生物素-亲和素结合作用,捕获辣根过氧化物酶缀合的抗生物素蛋白(Avidin-HRP),利用过氧化物酶对测试底物中加入的TMB的催化过程产生电化学信号;
5)将电化学信号与待测甲基化DNA含量之间进行转换,得到待测甲基化DNA含量。
所述引物的特异性识别与扩增是在反应体系中,反义引物链浓度为200nM,正义引物链浓度为20nM,热循环条件为92℃15s,64℃20s,72℃15s,45个循环;
所述的正义链引物核苷酸序列为TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC;
反义链引物核苷酸序列为GACCCCGAACCGCGACCGTAA,5’端标记有生物素;
所述的四面体的固定过程为:将四条链等浓度溶在TM杂交缓冲液中,加入终浓度30mM的用来还原巯基的TCEP溶液;
所述的TM杂交缓冲液含有15mM Tris、50mM MgCl2;
将溶液加热至核酸链充分解开,随后迅速转移至4℃保持30s以上,四条核酸链将俩俩杂交形成四面体结构;其中,四面体结构的底部三个顶点含有巯基,以与金电极表面作用,使四面体有序固定在金表面;顶部伸出的单链探针,用于杂交捕获目标核酸链。
所述的四面体结构中:
四面体探针Tetra A核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示;
四面体探针Tetra B核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示,5’端标记有巯基;
四面体探针Tetra C核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示,5’端标记有巯基;
四面体探针Tetra D核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示,5’端标记有巯基.
所述的不对称MSP扩增的特异性产物为包含150个碱基的单链扩增子;其中5’端前21个碱基为引物区域,2个碱基为间隔,其后34个碱基与四面体探针互补,另外有一条93个碱基的3’端拖尾。
所述在MSP与四面体杂交时,杂交缓冲液含1mM Na2HPO4,1mM KH2PO4,200mM NaCl,2mM MgCl2;
不对称MSP产物与四面体杂交的缓冲液中含有较高的离子强度是为了促进两者间的杂交捕获。
一种血浆游离DNA甲基化电化学检测试剂盒,包括:
用于修饰基因组样品的亚硫酸氢盐修饰试剂包;
甲基化特异性引物,其中反义引物5’端修饰有生物素,反应时通过加入不同浓度的引物,其中正义链引物20nM,反义链引物200nM,扩增后产生大量根据反义引物延伸出的单链,其5’端含有此生物素,被探针捕获后暴露在最上面,能与抗生物素蛋白结合;
用于产生生物素标记的单链扩增子的聚合酶及其反应预混液;
金电极以及能在金电极表面上形成自组装四面体的DNA探针;其中自组装四面体顶部伸出单链探针,以捕获目标核酸链;
生物素-亲和素结合作用所采用的辣根过氧化物酶缀合的抗生物素蛋白酶(Avidin-HRP)。
与现有技术相比,本发明具有以下有益的技术效果:
1)本发明提供的基于连续识别与级联放大系统的血浆游离DNA甲基化电化学检测试剂盒及方法,采用不对称引物浓度的扩增,极大减少了微量核酸样本加入时引物二聚的产生;
2)本发明提供的基于连续识别与级联放大系统的血浆游离DNA甲基化电化学检测试剂盒及方法,采用了两步连续的序列识别过程,具有超高的选择性,能够特异性地扩增及检测目标分子;
3)本发明提供的基于连续识别与级联放大系统的血浆游离DNA甲基化电化学检测试剂盒及方法,采用了级联的放大,整合了聚合酶和过氧化物酶的催化放大体系,具有高灵敏度,可以提高灵敏度到单个甲基化分子拷贝;
4)本发明提供的基于连续识别与级联放大系统的血浆游离DNA甲基化电化学检测试剂盒及方法,设计简单,对于其他基因的甲基化检测,只需要改变引物序列和四面体Tetra A链的探针部分;
5)与传统的实时荧光甲基化特异性PCR(qMSP)方法相比,本发明提供的基于连续识别与级联放大系统的血浆游离DNA甲基化电化学检测试剂盒及方法,上样量很少,可以实现微量检测,尤其有利于检测血浆中游离DNA的甲基化,具有很高的适用范围。
附图说明
图1为本发明的方法流程示意图;
图2为优化杂交反应缓冲液体系和杂交时间;
图3为传统qMSP与非对称MSP二聚体影响的对比;
图4为不同拖尾长度对探针与目标分子杂交的影响;
图5为加入不同量甲基化DNA的电流值响应;
图6为加入不同比率甲基化DNA的电流值响应;
图7为加入不同量或比率甲基化DNA时本方法与实时荧光qMSP的对比图;
图8为本方法与实时荧光qMSP检测11个非小细胞肺癌患者200微升血浆样本中游离DNA甲基化的结果对比。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明,所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明提供的基于连续识别与级联放大系统的血浆游离DNA甲基化电化学检测试剂盒及方法,是一种基于甲基化特异性引物与四面体探针的连续识别和聚合酶过氧化物酶级联放大策略的血浆游离DNA甲基化检测。
本发明使用不同浓度的生物素标记的甲基化特异性引物,通过此不对称的MSP鉴别亚硫酸氢盐修饰的基因组样品中的甲基化DNA而不是非甲基化等位基因;利用聚合酶的扩增能力,加入不同浓度的引物,产生大量具有生物素标记的单链扩增子,减少了引物二聚体的干扰;通过修饰在金电极表面上的自组装四面体上的DNA纳米结构探针捕获这些扩增子,由于刚性支架,有序取向和良好控制的间距,这些探针大大增加了靶标可接近性,并最小化了扩增副产物的非特异性吸附,因此能够进行高效和特异性的杂交并显著降低背景;然后通过生物素-亲和素结合作用捕获辣根过氧化物酶缀合的抗生物素蛋白(Avidin-HRP),利用酶的催化过程产生电化学信号。连续的序列识别过程(甲基化特异退火和特异性界面杂交)和级联的信号放大过程(不对称MSP和HRP酶催化反应)被良好地整合到此方法中。该方法具有良好的灵敏度,能检测单个拷贝的甲基化DNA分子,同时具有良好的特异性,能够在有大量非甲基化DNA干扰下检测出0.1%的甲基化DNA。
一种血浆游离DNA甲基化电化学检测方法,包括以下操作:
1)根据检测基因设计甲基化特异性引物序列,使用不同浓度的生物素标记引物,然后通过不对称的甲基化特异性PCR(MSP)鉴别亚硫酸氢盐修饰的血浆基因组样品中的甲基化DNA,甲基化特异性引物将特异性识别甲基化的DNA序列;
2)利用热启动Taq聚合酶的扩增能力对甲基化DNA模板进行扩增,通过加入不同浓度的甲基化特异性引物,产生具有生物素标记的单链扩增子;
3)通过修饰在金电极表面上的自组装四面体上的DNA纳米结构探针与这些特异性扩增子上的序列互补杂交,识别捕获特异性扩增子;
4)通过生物素-亲和素结合作用,捕获辣根过氧化物酶缀合的抗生物素蛋白(Avidin-HRP),利用过氧化物酶对测试底物中加入的TMB的催化过程产生电化学信号;
5)将电化学信号与待测甲基化DNA含量之间进行转换,得到待测甲基化DNA含量。
参见图1,本发明通过甲基化特异性引物识别经亚硫酸钠反转后的甲基化DNA序列,由聚合酶扩增出大量以单链形式存在的目标分子;四面体结构的探针致密有序地自组装排列在金电极表面,探针特异性地捕获目标分子;目标分子与探针间有34个碱基的互补配对,每个目标分子剩余的碱基拖尾部分不会与四面体骨架产生影响杂交的空间位阻和静电排斥;目标分子5’端含有生物素,暴露在结构上端,特异性捕获加入的辣根过氧化物酶缀合的抗生物素蛋白(Avidin-HRP),此蛋白能够催化TMB的氧化还原反应,进而产生级联放大的电化学信号。
一种血浆游离DNA甲基化电化学检测试剂盒,包括:
用于修饰基因组样品的亚硫酸氢盐修饰试剂包,DNA序列经过亚硫酸氢钠反转后,正常的胞嘧啶变为尿嘧啶(在后续扩增与识别中可视为胸腺嘧啶,与腺嘌呤互补配对),甲基化的胞嘧啶及其他碱基不变。这样,表观遗传学上的差异就变成了碱基序列上的差异;
甲基化特异性引物,其中反义引物5’端修饰有生物素,反应时通过加入不同浓度的引物(正义链引物20nM,反义链引物200nM),扩增后产生大量根据反义引物延伸出的单链,其5’端含有此生物素,被探针捕获后暴露在最上面,能与抗生物素蛋白结合;
用于产生生物素标记的单链扩增子的聚合酶及其反应预混液;
金电极以及能在金电极表面上形成自组装四面体的DNA探针:其中用于组装DNA四面体的四条核酸链中Tetra B,C,D三条链5’端标记有巯基,三链长度均为55个碱基;TetraA链较长,有99个碱基,其3’端向上延伸,具有一个34个碱基的单链探针。此探针与四面体骨架间含有10个胸腺嘧啶碱基的间隔;
生物素-亲和素结合作用所采用的辣根过氧化物酶缀合的抗生物素蛋白酶(Avidin-HRP)。此酶能够催化电化学测试液中加入的TMB,产生一个放大的电化学信号。
具体的给出以下实施例:
本发明检测目标基因组为肺癌患者200微升血浆样本中的游离甲基化DNA。DNA首先经提取后,再由亚硫酸氢钠处理,以此为样本实施本发明检测。检测信号与标准加入量产生的信号进行对比,确定患者血浆样本中甲基化DNA的含量。
使用不同浓度的生物素标记甲基化特异性引物识别与扩增甲基化模板序列。对于正常的甲基化特异性PCR,由于高的引物浓度以及模板序列本身的高相似度,很容易受到引物二聚体的干扰。因此利用不同浓度的引物,最大限度地减少了引物二聚的产生(图3),同时产生大量可供后续杂交检测的单链扩增子。
四面体探针的固定过程为:将四条链等浓度溶在TM杂交缓冲液(15mMTris,50mMMgCl2)中,加入终浓度30mM的TCEP溶液(用来还原巯基,需要新鲜配制);将溶液加热至核酸链充分解开,随后迅速转移至4℃保持30s以上,四条核酸链将俩俩杂交形成四面体结构;其中,四面体结构的底部三个顶点含有巯基,以与金电极表面作用,使四面体有序固定在金表面;顶部伸出的单链探针,用于杂交捕获目标核酸链。
四面体探针捕获特异性扩增子时,两者的碱基序列以及杂交情况如下:特异性产物为包含150个碱基的单链扩增子;其中5’端前21个碱基为引物区域,2个碱基为间隔,其后34个碱基与四面体探针互补,另外有一条93个碱基的3’端拖尾;对应的四面体探针为序列Tetra A,长99个碱基,其中靠近3’端的55个碱基为形成四面体结构的部分,5’端34个碱基为延伸在四面体顶上的单链探针,中间另有10个胸腺嘧啶碱基的间隔。由于四面体探针杂交此特异性扩增子时包含34个碱基的杂交区域,对杂交缓冲液的离子强度有一定的要求。如图2中的上图所示,过高的Na+离子会使背景过高,因此我们选取200mM的Na+离子浓度为最优的杂交缓冲液。另外,如图2中的下图所示,30min的反应时间足够两者充分杂交。
四面体探针捕获单链扩增子时,由于扩增子本身序列较长,会产生一个93个碱基的3’端拖尾。考虑到此拖尾与四面体骨架之间可能产生影响杂交的空间位阻和静电排斥,研究了不同长度拖尾对于杂交的影响。通过不同引物的设计,得到了不同长度的单链扩增子(图3中插入的电泳图,以双链DNA长度的形式展现),分别对应长度为93,68,45,24和0个碱基的拖尾。结果如图3,可以看出在单链扩增子量不足(对扩增产物进行10倍,50倍的稀释)时,信号没有受到影响,进而说明杂交未受到影响。在量足够时,不同长度的拖尾会对杂交产生一定的影响。但是考虑到在检测时不会加入过量的单链扩增子,因此认为本发明中这个拖尾不会对检测信号产生很大的影响。
通过生物素-亲和素结合作用,辣根过氧化物酶缀合的抗生物素蛋白(Avidin-HRP)被捕获在电极表面,利用过氧化物酶对测试底物中加入的TMB的催化过程产生电化学信号;
电化学信号与待测甲基化DNA含量之间的转换关系见图5,图6所示,本发明中电化学信号值与样品中甲基化DNA的含量之间不是绝对定量的,需要根据加入的标准量DNA进行相对定量。
本发明可以检测低至单个分子拷贝的甲基化DNA分子;该检测方法具有超高的特异性,能从1000倍过量的非甲基化干扰中检测出甲基化分子,从而解决了现有检测方法中由于特异性不强灵敏度不高导致的无法准确检测微量核酸样本的难题。如图7,对比传统的甲基化特异性PCR,本发明提供的检测方法在检测甲基化DNA量以及甲基化DNA比率(甲基化DNA与非甲基化DNA混合样中加入不同比率的甲基化DNA)上均具有明显的优势。
在检测实际病人样本时,针对肺癌患者微量(200微升)血浆样本中游离DNA的检测,本发明提供的方法准确检测了这个11个确诊病人的DNA甲基化(图8),相比之下,传统的甲基化特异性PCR无法对如此微量的甲基化DNA上样量进行准确区分。结果表明提出的方法确定了11个非小细胞肺癌患者血浆样本(200微升)中p16INK4a基因启动子的甲基化,其结果与临床诊断和治疗反应监测完全一致。
序列:
以上给出的实施例是实现本发明较优的例子,本发明不限于上述实施例。本领域的技术人员根据本发明技术方案的技术特征所做出的任何非本质的添加、替换,均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 西安交通大学
<120> 一种血浆游离DNA甲基化电化学检测方法及试剂盒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 99
<212> DNA
<213> Tetra A
<400> 1
acattcctaa gtctgaaaca ttacagcttg ctacacgaga agagccgcca tagtattttt 60
tttttcgggg agtagtatgg agttttcggt tgattggtt 99
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> Tetra B
<400> 2
tatcaccagg cagttgacag tgtagcaagc tgtaatagat gcgagggtcc aatac 55
<210> 3
<211> 55
<212> DNA
<213> Tetra C
<400> 3
tcaactgcct ggtgataaaa cgacactacg tgggaatcta ctatggcggc tcttc 55
<210> 4
<211> 55
<212> DNA
<213> Tetra C
<400> 4
ttcagactta ggaatgtgct tcccacgtag tgtcgtttgt attggaccct cgcat 55
Claims (7)
1.一种血浆游离DNA甲基化电化学检测方法,其特征在于,包括以下操作:
1)根据检测基因设计甲基化特异性引物序列,使用不同浓度的生物素标记引物,然后通过不对称的甲基化特异性PCR(MSP)鉴别亚硫酸氢盐修饰的血浆基因组样品中的甲基化DNA,甲基化特异性引物将特异性识别甲基化的DNA序列;
2)利用热启动Taq聚合酶的扩增能力对甲基化DNA模板进行扩增,通过加入不同浓度的甲基化特异性引物,产生具有生物素标记的单链扩增子;
3)通过修饰在金电极表面上的自组装四面体上的DNA纳米结构探针与这些特异性扩增子上的序列互补杂交,识别捕获特异性扩增子;
4)通过生物素-亲和素结合作用,捕获辣根过氧化物酶缀合的抗生物素蛋白(Avidin-HRP),利用过氧化物酶对测试底物中加入的TMB的催化过程产生电化学信号;
5)将电化学信号与待测甲基化DNA含量之间进行转换,得到待测甲基化DNA含量。
2.如权利要求1所述的血浆游离DNA甲基化电化学检测方法,其特征在于,引物的特异性识别与扩增是在反应体系中,反义引物链浓度为200nM,正义引物链浓度为20nM,热循环条件为92℃15s,64℃20s,72℃15s,45个循环;
所述的正义链引物核苷酸序列为TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC;
反义链引物核苷酸序列为GACCCCGAACCGCGACCGTAA,5’端标记有生物素。
3.如权利要求1所述的血浆游离DNA甲基化电化学检测方法,其特征在于,所述的四面体的固定过程为:将四条链等浓度溶在TM杂交缓冲液中,加入终浓度30mM的用来还原巯基的TCEP溶液;
所述的TM杂交缓冲液含有15mM Tris、50mM MgCl2;
将溶液加热至核酸链充分解开,随后迅速转移至4℃保持30s以上,四条核酸链将俩俩杂交形成四面体结构;其中,四面体结构的底部三个顶点含有巯基,以与金电极表面作用,使四面体有序固定在金表面;顶部伸出的单链探针,用于杂交捕获目标核酸链。
4.如权利要求3所述的血浆游离DNA甲基化电化学检测方法,其特征在于,所述的四面体结构中:
四面体探针Tetra A核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示;
四面体探针Tetra B核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示,5’端标记有巯基;
四面体探针Tetra C核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示,5’端标记有巯基;
四面体探针Tetra D核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示,5’端标记有巯基。
5.如权利要求3所述的血浆游离DNA甲基化电化学检测方法,其特征在于,所述的不对称MSP扩增的特异性产物为包含150个碱基的单链扩增子;其中5’端前21个碱基为引物区域,2个碱基为间隔,其后34个碱基与四面体探针互补,另外有一条93个碱基的3’端拖尾。
6.如权利要求1所述的血浆游离DNA甲基化电化学检测方法,其特征在于,所述在MSP与四面体杂交时,杂交缓冲液含1mM Na2HPO4,1mM KH2PO4,200mM NaCl,2mM MgCl2;
不对称MSP产物与四面体杂交的缓冲液中含有较高的离子强度是为了促进两者间的杂交捕获。
7.一种血浆游离DNA甲基化电化学检测试剂盒,其特征在于,包括:
用于修饰基因组样品的亚硫酸氢盐修饰试剂包;
甲基化特异性引物,其中反义引物5’端修饰有生物素,反应时通过加入不同浓度的引物,其中正义链引物20nM,反义链引物200nM,扩增后产生大量根据反义引物延伸出的单链,其5’端含有此生物素,被探针捕获后暴露在最上面,能与抗生物素蛋白结合;
用于产生生物素标记的单链扩增子的聚合酶及其反应预混液;
金电极以及能在金电极表面上形成自组装四面体的DNA探针;其中自组装四面体顶部伸出单链探针,以捕获目标核酸链;
生物素-亲和素结合作用所采用的辣根过氧化物酶缀合的抗生物素蛋白酶(Avidin-HRP)。
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