CN111944873B - 一种检测dna甲基化转移酶的纳米金生物传感器、其检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于DNA甲基化转移酶检测技术领域，具体涉及一种检测DNA甲基化转移酶的纳米金生物传感器、其检测方法及应用。本发明的方法可以同时检测多种DNA甲基化转移酶，并且该方法特异性好，灵敏度高。本发明使用甲基介导的核酸内切酶GlaI来切割的5‑甲基胞嘧啶(5‑mC)的特异性位点，并且将单分子检测与信号探针的循环裂解相结合，可用于单分子水平上同时检测多种DNA甲基化转移酶；进一步还可以用于区分不同种类的DNA甲基化转移酶，筛选潜在的抑制剂，并可测量人血清样品中DNA甲基化转移酶的活性，在生物医学研究，临床诊断，药物发现和癌症治疗方面具有巨大的潜力。

Description

一种检测DNA甲基化转移酶的纳米金生物传感器、其检测方法及应用

技术领域

本发明涉及DNA甲基化转移酶检测技术领域，具体涉及一种检测DNA甲基化转移酶的纳米金生物传感器、其检测方法及应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

DNA甲基化是原核生物和真核生物中特征性表观遗传修饰的最主要形式，它通常发生在胞嘧啶的碳5(C⁵)位置，在胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸岛(CpGI)中产生5-甲基胞嘧啶(5-mC)。每个CpGI都有数十到数百个CpG重复构成主要的基因启动子区域，CpGI的甲基化可能会干扰关键的基因沉默机制，导致多种生理功能的失调，例如基因组印迹，X染色体失活，转位子沉默，胚胎发育和细胞衰老。为了维持细胞DNA甲基化模式，DNA甲基转移酶(MTase)是胞嘧啶甲基化酶的超家族，可以特异性识别回文序列(即5'-CG-3'或5'-GC-3')并催化基因组DNA中甲基从S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)转移到胞嘧啶，平衡甲基化和脱甲基状态。DNA甲基化转移酶的异常表达可能会导致DNA甲基化修饰的功能失常，从而导致各种疾病，例如神经系统疾病，心肌梗塞，糖尿病和癌症，例如肺癌，乳腺癌，肝癌，前列腺癌，肾癌，子宫颈癌，结肠癌和甲状腺癌。因此，DNA甲基化转移酶已成为疾病发作的新型生物标志物和癌症治疗的重要靶标，有效的DNA甲基化转移酶分析技术的发展可能促进基于甲基化酶的治疗策略，临床诊断和药物发现的发展。

迄今为止，现有技术已经开发了用于DNA甲基化转移酶的多种方法。传统方法包括基于放射性标记的凝胶电泳酶联免疫测定和高效液相色谱，但它们存在有害辐射标记的固有缺陷，并且存在以下问题：昂贵的蛋白质抗体，繁琐的样品制备，检测灵敏度低，耗时费力的实验程序。为了克服这些局限性，已经开发了一些新的方法，包括比色法，发光法，电化学法，和荧光测定法。例如，比色测定法利用甲基化反应性DNA-金纳米颗粒(AuNPs)组件和末端保护介导的DNA-AuNP扩散来可视化检测Dam甲基化转移酶和5胞嘧啶DNA甲基转移酶(Dnmt 1)，但是表现出相对较差的灵敏度。发光分析将抗甲基化的切割与体外荧光素酶蛋白表达结合起来用于Dam甲基化转移酶活性分析，但它涉及到探针制备繁琐，荧光素酶表达复杂以及分析时间长的问题。此外，一系列电化学分析和荧光分析利用新型纳米材料和甲基化敏感的限制性内切核酸酶(MSRE)对Dam，M.SssI，Dnmt 1和HaeIII MTase进行了准确定量，但是这些方法涉及复杂的纳米材料合成，繁琐的电极修饰，和耗时的实验程序。为了提高检测灵敏度，现有技术已引入了一些用于DNA甲基化转移酶测定的核酸扩增技术，包括链置换扩增(SDA)，滚环扩增(RCA)，指数等温(EXPAR)，和核酸外切酶/核酸内切酶-辅助信号放大(EASA)。尽管灵敏度有所提高，但复杂的多步反应，复杂的环形模板的合成，多种引物和特殊的聚合酶，都使得这些检测方法产生由非特异性扩增或消化效率低而导致的较高的背景。

值得注意的是，已报道的DNA甲基化转移酶分析中涉及的所有DNA MSRE都是非甲基化依赖性的，并可能对未裂解的琐碎的未甲基化DNA造成假阳性干扰。发明人发现，由于甲基化酶的底物特异性和MSRE的物种稀有性，所有以前的方法只能检测一种类型的DNA甲基化转移酶。因此，开发同时检测多种DNA甲基化转移酶的简单、准确和灵敏的方法仍然是一个巨大的挑战。

发明内容

针对以上研究背景，发明人针对同时检测多种DNA甲基化转移酶的方法进行了研究，提供一种可以同时检测多种DNA甲基化转移酶的方法，且该方法特异性好，灵敏度高。

具体地，本发明的技术方案如下所述：

在本发明的第一方面，提供一种检测DNA甲基化转移酶的纳米金生物传感器，所述纳米金生物传感器包括发夹底物HS1和HS2，甲基介导的核酸内切酶GlaI、Cy5/Cy3-信号探针-AuNP纳米结构和核糖核酸酶RNase HII；

优选的，所述在发夹底物HS1和HS2的茎部分别包含5'-ACGT-3'/3'-TGCA-5'和5'-G-mC-GC-3'/3'-mC-GCG-5'的二核苷酸序列；

优选的，所述Cy5/Cy3-信号探针-AuNP纳米结构由信号探针SP1、SP2和金纳米颗粒(AuNPs)组成；

优选的，所述信号探针SP1和SP2在3'端修饰了巯基(SH)；

进一步优选的，所述信号探针SP1在位于SP1的5'端下游位于4和3个胸腺嘧啶碱基上修饰Cy5荧光团；所述信号探针SP2在位于SP2的5'端下游5个碱基的鸟嘌呤核糖核苷酸碱基上修饰Cy3荧光团；

所述信号探针SP1和SP2通过S-Au共价键连接在金纳米颗粒(AuNPs)的表面上。

在本发明的第二方面，提供一种检测DNA甲基化转移酶的方法，所述方法包括：采用发夹底物HS1和HS2，甲基介导的核酸内切酶GlaI、Cy5/Cy3-信号探针-AuNP纳米结构和核糖核酸酶RNase HII进行循环裂解；

优选的，所述检测方法具体包括以下步骤：

将发夹底物HS1和HS2添加到待测物的反应溶液中进行孵育；向孵育后的产物中加入甲基介导的核酸内切酶GlaI进行孵育；将孵育后得到的产物加入到含有Cy5/Cy3-信号探针-AuNP纳米结构和的核糖核酸酶RNase HII的反应溶液中进行温育，以进行RNase HII介导的循环裂解反应；

循环裂解反应释放出大量Cy5和Cy3分子，通过检测释放到溶液中的Cy5和Cy3分子，测定待测物的活性。

在本发明的第三方面，提供一种第一方面所述检测DNA甲基化转移酶的纳米金生物传感器和/或第二方面所述检测DNA甲基化转移酶的方法在区分不同的DNA甲基化转移酶、筛选DNA甲基化转移酶抑制剂、测量人血清样品中的DNA甲基化转移酶活性中的应用。

本发明的具体实施方式具有以下有益效果：

(1)低背景信号：由于新型核酸内切酶GlaI对5-mC表现出高的特异性；RNase HII能够特异性和有效地切除单个鸟嘌呤核糖核苷酸从而防止非特异性扩增；以及单分子检测超高信噪比使得本发明的实施方式具有较低的背景值。

(2)灵敏度高：在4个数量级的大动态范围内，M.SssI甲基化转移酶的检出限为2.01×10^-3U/mL，M.CviPI甲基化转移酶的检出限为3.39×10^-3U/mL，优于大多数报道的DNA甲基化转移酶的分析检测方法。

(3)特异性好：GlaI对5-mC具有良好的特异性，对各种催化底物具有高活性，可以识别并切割特异性位点甲基化的胞嘧啶，而保留未甲基化的完整的胞嘧啶，从而有效抑制了非特异性切割；RNase HII能够特异性和有效地切除单个鸟嘌呤核糖核苷酸，进而防止非特异性扩增。

(4)可在单分子水平同时检测多种DNA甲基化转移酶，弥补了传统方法只能检测一种类型的DNA MTase的缺陷。

(5)通过合理设计适当的DNA底物，本发明的方法可以扩展到同时检测其他CpG和GpC甲基化转移酶，在生物医学研究、临床诊断、药物发现和癌症治疗中具有巨大潜力。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明中DNA甲基化转移酶的检测原理图；

图2为本发明实施例1中稳态荧光测量和电泳分析分析检测M.SssI和M.CviPI的可行性结果；

(A)M.SssI催化的5-胞嘧啶甲基化的非变性PAGE分析和GlaI对HS1的连续切割；

泳道M，DNA标记(DNA marker)；

泳道1，合成的HS1；

泳道2，合成CP1；

泳道3，M.SssI+GlaI+HS1均存在下的反应产物；

泳道4，GlaI+HS1存在的情况下的反应产物；

(B)M.CviPI催化的5甲基胞嘧啶的非变性PAGE分析和GlaI对HS2的连续切割；

M泳道，DNA标记(DNA marker)；

泳道1，合成的HS2；

泳道2，合成CP2；

泳道3，M.CviPI+GlaI+HS2均存在下的反应产物；

泳道4，GlaI+HS2存在的情况下的反应产物；

(C)在不存在和存在M.SssI的情况下，RNase HII介导的Cy5分子从AuNP纳米结构中释放的荧光测量图；插图显示的是在没有M.SssI的情况下和存在(M.SssI时Cy5的荧光强度；

(D)在不存在和存在M.CviPI的情况下，RNase HII介导的Cy3分子从AuNP纳米结构中释放的荧光测量图；插图显示在不存在和存在M.CviPI的情况下Cy3的荧光强度；SYBRGold用作荧光指示剂；M.SssI甲基化转移酶的浓度为100U/mL，M.CviPI甲基化转移酶的浓度为500U/mL。

图3为本发明实施例1中不同浓度的M.SssI和M.CviPI时Cy3和Cy5技术结果图；

(A)响应于不同浓度M.SssI的Cy5计数的测量；插图显示Cy5计数与M.SssI浓度的对数之间的线性关系；

(B)响应于不同浓度的M.CviPI的Cy3计数的测量；插图显示Cy3计数与M.CviPI浓度的对数之间的线性关系；误差棒代表三个独立实验的标准偏差。

图4为本发明实施例1中检测特异性响应分析结果图，分别响应于100U/mL M.SssI+500U/mL M.CviPI，100U/mL M.SssI，500U/mL M.CviPI，100U/mL Dam，100U/mL MspI，0.1g/L BSA和仅含反应缓冲液的对照组的对Cy5和Cy3计数的测量；误差棒代表三个独立实验的标准偏差。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

正如背景技术中论述的，针对现有技术在DNA甲基化转移酶检测中存在的问题，本发明提出了一种同时检测多种DNA甲基化转移酶的方法。

本发明的检测原理如下(结合图1)：

在M.SssI甲基化转移酶存在的情况下，来自S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基可以转移到HS1的回文序列5'-A-C-G-T-3'的5胞嘧啶中，形成用于GlaI的催化底物5'-A-mC-G-T-3'。随后，甲基化的HS1在5-mC处被GlaI裂解，产生25nt的捕获探针1(CP1)。同样的，在M.CviPI甲基化转移酶存在的情况下，HS2可以被甲基化以形成GlaI的另一种催化底物5'-G-mC-G-mC-3'，甲基化的HS2在二核苷酸序列的中间连续切开(即5'-G-mC-G-mC-3'/3'-mC-G-mC-G-5')，得到23nt的捕获探针2(CP2)。通过将Cy5/Cy3-SP1/SP2-AuNP添加到反应系统中，所得的CP1和CP2可以分别与SP1和SP2杂交，形成DNA双链体(dsDNA)，每个双链体均包含一个G核糖核苷酸。具有G核糖核苷酸的DNA双链体可以充当核糖核酸酶的催化底物(RNaseHII，一种核糖核酸内切酶，可以通过一步水解反应特异性切除掺入基因组DNA中的任何单个核糖核苷酸)，诱导RNase HII介导的信号探针的循环裂解，同时从AuNP纳米结构中释放出大量Cy5和Cy3分子。通过简单地计数释放到溶液中的Cy5和Cy3分子，可以同时定量M.SssI和M.CviPI甲基化转移酶的活性。相反，在不存在M.SssI和M.CviPI甲基化转移酶的情况下，HS1和HS2无法被GlaI甲基化和切割，并且CP1和CP2均不会生成。因此，既没有发生SP1和SP2的切割，也没有Cy5和Cy3分子的释放，因此不能检测到Cy5和Cy3信号。由于GlaI对5-mC的超高特异性，RNase HII催化的单核糖核苷酸切除介导的循环扩增的高特异性和高效性以及单分子检测的高信噪比，因此该方法可以同时以高精度和高灵敏度检测多种DNA甲基化转移酶活性。

该方法包括三个步骤：(1)DNA甲基化转移酶催化5胞嘧啶甲基化以诱导GlaI切割发夹底物，(2)RNase HII介导的信号探针再循环裂解以将Cy5和Cy3从AuNP纳米结构中释放出来，(3)在单分子水平上同时检测Cy5和Cy3分子。

与识别和切割未甲基化DNA的MSRE不同，GlaI是一种新发现的甲基介导的DNA限制性核酸内切酶，对5-mC具有良好的特异性，对各种催化底物具有高活性，可以识别并切割特异性位点甲基化的胞嘧啶，而保留未甲基化的完整的胞嘧啶。通常，基于MSRE的DNA甲基化转移酶分析是基于未裂解的甲基化DNA的确定，并假设未甲基化的DNA被完全裂解。实际上，甲基化的DNA实际上只占整个基因组DNA的很小一部分，因此，即使是不完全裂解的未甲基化的DNA的琐碎部分，也可能造成重大干扰。由于GlaI对甲基化DNA的良好特异性以及对各种催化底物的高活性，甲基化DNA的GlaI裂解片段可以针对非甲基化DNA片段进行特异性和敏感性的检测，该原理可用于同时定量多个低丰度DNA MTase。近年来，由于单分子检测具有超高的灵敏度，高的信噪比和低的样品消耗等显著优势，现已成为物理，化学和生物学领域中一种强大的分析技术，并已成功应用于单分子水平的DNA，miRNA，酶和表观遗传修饰的灵敏检测。本发明利用了GlaI的独特功能和单分子检测技术的固有优势，提供了在单分子水平同时检测多种DNA甲基化转移酶的方法。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与详细说明本发明的技术方案。

实施例

1、信号探针功能化的AuNPs(Cy5/Cy3-SP1/SP2-AuNP)的制备：

用荧光基团(Cy5和Cy3)对粒径为10nm的纳米金颗粒AuNPs进行功能化，并通过盐老化法制备巯基(SH)修饰的信号探针，将6.6nmol信号探针SP1和6.8nmol信号探针SP2一起添加到1mL的纳米金溶液(5.7×10¹²粒子/mL)中，然后在磷酸盐缓冲液(PBS，10mmol/L，NaH₂PO₄/Na₂HPO₄)，pH 7.4)中室温下静置。静置20分钟后，将氯化钠(NaCl，2mol/L氯化钠溶于10mmol/L PBS缓冲液中)添加到上述溶液中，使得NaCl的最终浓度为0.02mol/L。将获得的Cy5/Cy3-SP1/SP2-AuNP悬浮液超声处理约20s，然后在室温下孵育20分钟。然后以每次增加0.1mol/L的氯化钠(NaCl)的浓度间隔重复此过程，直到最终浓度为0.5mol/L。盐化过程后，在室温下孵育过夜。为了除去过量的信号探针，将Cy5/Cy3-SP1/SP2-AuNP悬浮液以13000rpm的转速离心25分钟后除去上清液。将所得的Cy5/Cy3-SP1/SP2-AuNP重悬于PBS缓冲液(60μL，10mmol/L磷酸盐，0.1mol/L NaCl，pH 7.0)中，并保存在4℃以便进一步使用。在信号探针修饰的纳米金溶液中，信号探针的浓度计算为22.1μmol/L。

2、M.SssI和M.CviPI的检测：

为了证明本发明可同时检测多种DNA甲基化转移酶，本实施例将CpG MTase(M.SssI)和GpC MTase(M.CviPI)用作模型酶。M.SssI和M.CviPI可以分别甲基化5'-C-G-3'和5'-G-C-3'回文序列中C5位置的所有胞嘧啶，为研究高级真核生物的胞嘧啶甲基化的表观遗传学做出了重要贡献。

(1)将所有寡核苷酸用1×Tris-EDTA缓冲液(10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)，1mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)，pH 8.0)溶解稀释以制备储备溶液。将发夹底物1(HS1)和发夹底物2(HS2)在杂交缓冲液(1.5mmol/L的氯化镁，10mmol/L的三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，pH 8.0)中稀释至10μmol/L，并在95℃下孵育5分钟，然后缓慢冷却到室温以形成完美的发夹结构。将1.2μL上述HS1和HS2添加到20μL反应溶液中(不同浓度的M.SssI和M.CviPI MTase，320μmol/L SAM，2μL 10×NEBuffer，和2μL 10×GC反应缓冲液)，并在37℃下孵育2小时。

(2)将10μL的上述甲基化产物添加到10μL的反应溶液(2个单位的GlaI和2μL 10×SEBuffer Y)中，并在30℃下孵育80分钟。

(3)将步骤(2)得到的10μL切割产物添加到20μL反应溶液中(4μL Cy5/Cy3-SP1/SP2-AuNP，5个单位的RNase HII，3μL 10×ThermoPol反应缓冲液，3μL 10×杂交缓冲液(10mmol/L的三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，50mmol/L的氯化钠(NaCl)和1mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)(pH 8.0))，并在37℃下温育40分钟，以进行RNase HII介导的循环裂解反应。

3、可行性实验：用超纯水将上述循环裂解反应得到的30μL扩增产物稀释至60μL。荧光光谱通过HitachiF-7000荧光分光光度计(日本东京)测量。以2nm/s的扫描速率记录发射光谱，Cy5的激发波长为640nm，Cy3的激发波长为540nm，Cy5的发射波长为668nm，Cy3的发射波长为568nm，分别对其进行数据分析。为了分析GlaI的裂解产物，在1×TBE缓冲液(9nmol/L Tris-HCl，9mmol/L硼酸，0.2mmol/L EDTA，pH 7.9)中于室温下进行12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析，恒定电压110V，时间45分钟。电泳后，将凝胶用SYBRGold染色，并用ChemiDoc MP Imaging系统(Hercules，California，U.S.A.)进行可视化成像分析。

本实施例进行了稳态荧光测量和电泳分析，以研究提出的方法用于M.SssI和M.CviPI检测的可行性(图2)，通过使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和荧光光谱法验证了该检测方法的可行性。

表1、核苷酸序列

在存在GlaI+HS1的情况下，仅观察到一个43nt的条带(图2A，泳道4)，与合成的HS1的大小(43nt)(图2A，泳道1)一致，表明甲基化或甲基化HS1发生裂解。当存在M.SssII+GlaI+HS1时，检测到两个不同的条带，分别为43nt和25nt(图2A，泳道3)，恰好是合成HS1(43nt)的大小(图2A)，泳道1)和CP1(25nt)(图2A，泳道2)，这表明M.SssI甲基化转移酶可以使回文序列5'-A-C-G-T-3'中的5-胞嘧啶甲基化，从而诱导Gla1对HS1的裂解，从而产生CP1(25nt)。同样，在M.CviPI+GlaI+HS2存在的情况下，观察到两个明显的条带，分别为43nt和23nt(图2B，泳道3)，表明M.CviPI甲基化转移酶能够使回文序列5'-G-mC-GC-3'中的5胞嘧啶甲基化，从而诱导GlaI对HS2的裂解，从而产生CP2(23nt)(图2B，泳道2)。在存在GlaI+HS2的情况下，仅检测到43nt的条带(图2B，泳道4)，与合成的HS2(43nt)(图2B，泳道1)一致，这表明缺少M.CviPI甲基化转移酶时既没有发生甲基化也没有导致HS2裂解。为了验证所提出方法的可行性，进行了荧光测量(图2C和2D)。在不存在DNA甲基化转移酶的情况下，既未检测到明显的Cy5荧光信号(图2C)，也未检测到明显的Cy3荧光信号(图2D)。相比之下，观察到在668nm处有响应M.SssI增强的Cy5荧光信号的特征发射峰(图2C)，和在568nm处响应于M.CviPI增强的Cy3荧光信号的特征发射峰(图2D)。

4、灵敏度实验：

为了研究所提出方法的灵敏度，本实施例在最优的实验条件下，通过测量对应于不同浓度DNA甲基化转移酶的荧光计数来研究灵敏度。当M.SssI甲基化转移酶浓度从0.005增加到100U/mL时，Cy5计数以浓度依赖性的方式增加(图3A)。Cy5计数与M.SssI浓度在0.005至100U/mL范围内的对数呈线性关系。回归方程为N＝80.9log₁₀ C+227.4，相关系数为0.9827，其中N为Cy5计数，C为M.SssI甲基化转移酶浓度(U/mL)(图3A插图)。通过评估阴性对照信号标准偏差的三倍，计算出检出限为2.01×10^-3U/mL。如图3B所示，当M.CviPI甲基化转移酶浓度从0.01U/mL增加到800U/mL时，Cy3计数以浓度依赖性方式增加，Cy3计数与M.CviPI甲基化转移酶浓度在0.01至800U/mL范围内的对数呈线性关系。回归方程为N＝57.8log₁₀ C+223.3，相关系数为0.9896，其中N为测得的Cy3计数，C为M.CviPI甲基化转移酶浓度(U/mL)(图3B的插图)。通过评估阴性对照信号的标准偏差的三倍，计算出的检出限为3.39×10^-3U/mL，优于已报道的DNA甲基化转移酶检测的标准偏差。

5、特异性实验：

为了研究所提出方法的选择性，本实施例使用Dam甲基化转移酶，MspI甲基化转移酶和牛血清白蛋白(BSA)作为阴性对照。即使Dam和MspI甲基化转移酶是DNA甲基化转移酶家族的成员，它们只分别甲基化5'-G-A-T-C-3'和5'-C-C-G-G-3'回文序列中腺嘌呤残基的N6位置和第一个胞嘧啶残基的C5位置。BSA不是DNA甲基化转移酶的一种，它不能催化甲基向基因组DNA中任何碱基残基的转移。如图4所示，在存在Dam甲基化转移酶，MspI甲基化转移酶和BSA的情况下，未观察到Cy5或Cy3荧光信号，这与仅具有反应缓冲液的对照一致(图4)。相反，在M.SssI甲基化转移酶存在时，观察到增强的Cy5荧光信号，但未检测到Cy3的荧光信号。在M.CviPI甲基化转移酶存在的情况下，检测到增强的Cy3荧光信号，但未检测到Cy5的荧光信号。此外，在M.SssI和M.CviPI甲基化转移酶的存在下，可以同时检测Cy5和Cy3荧光信号(图4)。这些结果表明，本实施例的纳米金生物传感器对M.SssI和M.CviPI甲基化转移酶的检测表现出优异的选择性。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种检测DNA甲基化转移酶的纳米金生物传感器，其特征在于，包括发夹底物HS1和HS2，甲基介导的核酸内切酶GlaI、Cy5/Cy3-信号探针-AuNP纳米结构和核糖核酸酶NaseHII；

所述Cy5/Cy3-信号探针-AuNP纳米结构由信号探针SP1、SP2和金纳米颗粒（AuNPs）组成；所述信号探针SP1和SP2在3'端修饰了巯基-SH，所述信号探针SP1和SP2通过S-Au共价键连接在金纳米颗粒（AuNPs）的表面上；所述信号探针SP1在位于SP1的5'端下游5个胸腺嘧啶碱基上修饰Cy5荧光团；所述信号探针SP2在位于SP2的5'端下游4个胸腺嘧啶碱基上修饰Cy3荧光团；

所述发夹底物HS1的核苷酸序列为：5'-GGC TTA CAC GTG TTC TCG ACT CCA TGC TGAACA CGT GTA AGC C-3'；

所述发夹底物HS2的核苷酸序列为：5'-GTC TGG TTG CGC AAT AAC TCT ACT ATC AATTGC GCA ACC AGA C-3'，下划线碱基C分别为修饰的5-mC；

所述Cy5修饰的信号探针SP1的核苷酸序列为：5'-AGC ATG GAG TCG ATT-SH-3' ，下划线碱基T修饰Cy5；

所述Cy3修饰的信号探针SP2的核苷酸序列为：5'-TGA TAG TAG AGT TTT-SH-3'，下划线碱基T修饰Cy3；

所述发夹底物HS1、甲基介导的核酸内切酶GlaI、Cy5-信号探针-SP1-AuNP纳米结构和核糖核酸酶Nase HII是用于检测M.SssI甲基化转移酶；

所述发夹底物HS2、甲基介导的核酸内切酶GlaI、Cy3-信号探针-SP2-AuNP纳米结构和核糖核酸酶Nase HII是用于检测M.CviPI甲基化转移酶。

2.如权利要求1所述的检测DNA甲基化转移酶的纳米金生物传感器，其特征在于，所述发夹底物HS1和HS2的序列与信号探针SP1和SP2的序列部分互补杂交。

3.如权利要求1所述的检测DNA甲基化转移酶的纳米金生物传感器，其特征在于，所述发夹底物HS1和HS2为DNA甲基化转移酶的催化底物，发夹底物HS1和HS2甲基化反应后为DNA核酸内切酶GlaI的识别序列。

4.一种检测DNA甲基化转移酶的方法，其特征在于，所述方法以非诊断和非治疗为目的，所述方法包括：采用发夹底物HS1和HS2，甲基介导的核酸内切酶GlaI、Cy5/Cy3-信号探针-AuNP纳米结构和核糖核酸酶RNase HII进行循环裂解；

所述Cy5/Cy3-信号探针-AuNP纳米结构由信号探针SP1、SP2和金纳米颗粒（AuNPs）组成；所述信号探针SP1和SP2在3'端修饰了巯基-SH，所述信号探针SP1和SP2通过S-Au共价键连接在金纳米颗粒（AuNPs）的表面上；所述信号探针SP1在位于SP1的5'端下游5个胸腺嘧啶碱基上修饰Cy5荧光团；所述信号探针SP2在位于SP2的5'端下游4个个胸腺嘧啶碱基上修饰Cy3荧光团；

所述发夹底物HS1的核苷酸序列为：5'-GGC TTA CAC GTG TTC TCG ACT CCA TGC TGAACA CGT GTA AGC C-3'；

所述发夹底物HS2的核苷酸序列为：5'-GTC TGG TTG CGC AAT AAC TCT ACT ATC AATTGC GCA ACC AGA C-3'，下划线碱基C分别为修饰的5-mC；

所述Cy5修饰的信号探针SP1的核苷酸序列为：5'-AGC ATG GAG TCG ATT-SH-3' ，下划线碱基T修饰Cy5；

所述Cy3修饰的信号探针SP2的核苷酸序列为：5'-TGA TAG TAG AGT TTT-SH-3'，下划线碱基T修饰Cy3；

所述发夹底物HS1、甲基介导的核酸内切酶GlaI、Cy5-信号探针-SP1-AuNP纳米结构和核糖核酸酶Nase HII是用于检测M.SssI甲基化转移酶；

所述发夹底物HS2、甲基介导的核酸内切酶GlaI、Cy3-信号探针-SP2-AuNP纳米结构和核糖核酸酶Nase HII是用于检测M.CviPI甲基化转移酶。

5.如权利要求4所述的检测DNA甲基化转移酶的方法，其特征在于，检测方法具体包括以下步骤：

将发夹底物HS1和HS2添加到待测物的反应溶液中进行孵育；向孵育后的产物中加入甲基介导的核酸内切酶GlaI进行孵育；将孵育后得到的产物加入到含有Cy5/Cy3-信号探针-AuNP纳米结构和核糖核酸酶RNase HII的反应溶液中进行温育，以进行RNase HII介导的循环裂解反应；

循环裂解反应释放出大量Cy5和Cy3分子，对释放出的Cy5和Cy3分子进行检测，以测定待测物的活性。

6.如权利要求5所述的检测DNA甲基化转移酶的方法，其特征在于，对释放出的Cy5和Cy3分子进行检测采用的方法为基于全内反射荧光（TIRF）的单分子成像简单地量化计数。

7.一种权利要求1-3任一权利要求所述的检测DNA甲基化转移酶的纳米金生物传感器和/或权利要求4-6任一权利要求所述的检测DNA甲基化转移酶的方法在区分不同的DNA甲基化转移酶、筛选DNA甲基化转移酶抑制剂中的应用。

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