CN111926067A

CN111926067A - 用于荧光定量pcr的双探针组合物、试剂盒、用途及方法

Info

Publication number: CN111926067A
Application number: CN202011013466.7A
Authority: CN
Inventors: 颜进; 刘佳; 邓中平; 戴立忠
Original assignee: Sansure Biotech Inc
Current assignee: Hunan Shengweier Medical Inspection Co ltd
Priority date: 2020-09-24
Filing date: 2020-09-24
Publication date: 2020-11-13
Anticipated expiration: 2040-09-24
Also published as: CN111926067B

Abstract

本发明涉及分子生物学检测领域，具体地，本发明涉及一种用于荧光定量PCR的检测组合物。本发明公开了一种用于荧光定量PCR的双探针组合物，所述组合物包括第一探针和第二探针，所述第一探针和第二探针分别用于检测待测模板的不同链，并且所述探针从5’端至3’端依次可分为三个区域：A区、B区、C区。组合物提高了检测结果信噪比，灵敏度更高。

Description

用于荧光定量PCR的双探针组合物、试剂盒、用途及方法

技术领域

本发明涉及分子生物学检测领域，具体地，本发明涉及一种用于荧光定量PCR的检测组合物。

背景技术

PCR是聚合酶链式反应的英文缩写（Polymerase Chain Reaction），是广为人知的技术。PCR技术已经被广泛用于生物学、分子生物学、生物化学、生物医学等学科，尤其是应用于临床医学分子诊断。在PCR反应中，基本的反应组成包括：双链DNA模板（待扩增的DNA片段，也叫靶标或靶基因）、DNA聚合酶、4种单核苷酸（ATP、CTP、GTP、TTP）、两条位于模板两端的DNA引物、和反应缓冲液。这些组分以适当的比例混合，在一定的温度循环条件下，DNA就会随着温度循环被以指数增加的速度被扩增复制。

实时荧光定量PCR（RealTime-PCR）技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用检测每个循环荧光信号积累实时监测整个PCR进程。荧光定量PCR有两种常见的方法，一种为荧光染料法，一种为荧光探针法。由于荧光染料法特异性较差，目前广泛应用的检测系统为荧光探针法，而在这之中，Taqman探针体系又最为常用。

Taqman探针是由报告荧光基团、淬灭基团和和模板特异性匹配的寡核苷酸序列组成，在PCR循环中会结合到模板上。报告荧光基团和淬灭基团分别标记于寡核苷酸序列的两端。寡核苷酸序列探针在溶液中由于柔性缠绕现象，探针两端的距离相隔很近。此时在荧光能量共振转移（Fuorescence Resonance Energy Transfer, FRET）机制下，报告荧光基团的荧光信号会被淬灭基团吸收，使得报告荧光基团的荧光信号比单独存在时低很多。荧光能量共振转移效应会随着报告荧光基团与淬灭基团空间距离的增加而急剧降低。实时荧光定量PCR过程中，探针和模板杂交后变为刚性的双链分子，探针两端的空间距离增加，破坏了荧光能量共振转移效应，从而使荧光监测系统可接收到报告荧光基团的荧光信号。进一步的，在Taq DNA聚合酶5’外切酶的作用下，杂交在模板上的探针被水解，使得报告荧光基团与淬灭基团彻底分离，信号得以稳定地释放。在此过程中，每扩增一条DNA链，就有一个报告荧光基团因脱离淬灭基团而释放出增益的荧光信号。随着每一个循环中DNA模板成倍地复制，产生的信号也成倍地增加，直到突破检测系统的信噪比（S/N，Signal-to-NoiseRatio）。

检测结果的信噪比是评价探针系统的一个重要指标。信噪比是指探针分子在杂交或水解后被检测到的荧光信号值与在杂交前游离于溶液中完整探针的荧光值的比值。高信噪比的检测系统可以更早地识别出PCR的扩增信号，因此有更高的检测效率。

降低背景噪音为提高信噪比的主要途径。目前，已经进行了一些尝试来降低噪音，从而提高信噪比。

例如，在常规探针的3’端或5’端增加与另一端序列的互补序列，使探针在低温下形成颈环结构，两端的荧光基团和淬灭基团的空间距离极低，从而得到较低的荧光背景。但是，在荧光定量PCR体系的应用中，颈环结构的设计较难优化：如果颈环结构的Tm值高于退火温度，则退火延伸时保持颈环结构的探针较难与模板杂交，利用率低；如颈环结构的Tm值低于退火温度，则退火延伸时已打开颈环结构的探针并不能得到较低的荧光背景。

又例如，Amplisensor复合探针技术也被用来降低噪音，该技术分别在两条探针上标记荧光基团和淬灭基团。两探针长度不同，其中淬灭探针的5′末端多出7个碱基(GCGTCCC )，该技术还具有PCR 半套式引物。PCR 扩增前需用连接酶将荧光探针与PCR 半套式引物连接，半套式引物的5′末端应有一段与长探针互补的序列，以便连接酶将引物与探针连接，从而释放出淬灭探针部分，破坏了FRET，而产生荧光。这种技术下由于荧光基团和淬灭基团的空间距离较近，因此拥有更低的荧光本底。但是，该方法在反应前需要进行繁琐的Amplisensor的标记，且荧光基团探针作为引物可能会由于产生引物二聚体而生成非特异的扩增信号，因此未能大规模应用。

此外，Juergen Loeffler等在模板上设计两条探针，在和模板杂合状态下，使其中一条标记淬灭集团探针的3’端与另一条标记有荧光基团探针的5’端紧密相邻。通过减少荧光基团和淬灭基团空间距离，增强FRET效应，实现本底信号的降低。这种方案需要在靶标序列上设计两条连续的探针，无疑大大增加了设计难度。由于引物和探针均需要设计在保守区段的序列上，尤其在针对序列变异度较高的病原体时，该设计极难具有可实现性。

王升启等使用长短两条探针组成复合探针，其中长探针上在5’端标记荧光基团，短探针上在3’端标记淬灭基团。两条探针设计的Tm值存在一定差异，使得在扩增循环中长探针优先与模板结合。但实践测试表面，两条互补的探针会在Taq酶5’外切酶活性的作用下产生非特异的荧光信号。

因此，本领域存在着对提高实时荧光定量PCR的检测结果信噪比的需求。

发明内容

有鉴于此，第一方面，本发明提供一种用于荧光定量PCR的双探针组合物，所述组合物包括第一探针和第二探针，所述第一探针和第二探针分别用于检测待测模板的不同链，并且所述探针从5’端至3’端依次可分为三个区域：A区、B区、C区，其中，

所述第一探针和第二探针的A区和B区包括与所述待测模板匹配的序列；

所述第一探针的B区包括与所述第二探针的B区匹配的序列；

所述第一探针和第二探针的C区不与所述待测模板匹配；

其中，所述C区的长度可以为0；

并且其中，所述第一探针与模板配对的第一Tm值和所述第二探针与模板配对的第二Tm值大于等于所述第一探针与第二探针之间相互配对的第三Tm值，且其中所述第三Tm值大于或等于反应体系扩增过程中的退火温度值。

进一步地，所述匹配可以是完全匹配或不完全匹配，只要满足能够行使本发明组合物的功能即可，例如，即所述探针的A区和B区与待测模板可以完全互补配对，也可以部分互补配对，能行使本领域技术人员知晓的荧光定量PCR中探针的常规结合待测模板作用即可；两个探针的B区可以完全互补配对，也可以部分互补配对，只要满足两个探针之间能够形成稳定二聚体的结构即可。

在一些具体的实施方案中，所述匹配包括但不限于为50%或更多序列的互补配对；60%或更多序列的互补配对；70%或更多序列的互补配对；80%或更多序列的互补配对；90%或更多序列的互补配对；95%或更多序列的互补配对；99%或更多序列的互补配对；100%的序列的互补配对，即完全互补配对。此处不旨在限定具体的匹配程度，只要所述匹配程度满足能够行使本发明组合物的功能即可。

根据具体不同的序列，所需的匹配程度可能不同，但是，所需匹配程度是本领域技术人员为了满足荧光定量PCR中探针的常规结合待测模板作用以及两个探针之间能够形成稳定二聚体的结构，能够根据本领域的常规技术手段所确定的（例如软件设计）。

本发明还提供一种用于荧光定量PCR的双探针组合物，所述组合物包括第一探针和第二探针，所述第一探针和第二探针分别用于检测待测模板的不同链，并且所述探针从5’端至3’端依次可分为三个区域：A区、B区、C区，其中，

所述第一探针和第二探针的A区和B区与所述待测模板杂交；

所述第一探针的B区能与所述第二探针的B区杂交；

所述第一探针和第二探针的C区不与所述待测模板杂交;

其中，所述C区的长度可以为0；

在本发明中，第一探针的B区与第二探针的B区杂交形成杂交区。在本发明中，探针的所述A区和B区与待测模板杂交形成杂交区。术语“杂交区”是指可以使得第一探针和第二探针形成稳定二聚体的结构的区域，即，两个探针的B区可以完全互补配对，也可以部分互补配对，只要满足两个探针之间能够形成稳定二聚体的结构即可，或者探针的所述A区和B区与待测模板杂交形成的区域，可以完全互补配对，也可以部分互补配对，只要满足探针的基本功能即可，即所述探针的A区和B区行使本领域技术人员知晓的荧光定量PCR中探针的常规结合待测模板作用即可。

虽然目前已有一些研究在扩增子上设计了两条甚至更多的探针，但这主要为了防止探针结合区域的突变影响信号检测效率（如中国专利CN108517375A等）。在这种设计思路均要求极力避免两条探针与模板的结合区域相互重叠，更加要避免探针之间存在互补以防止“影响探针的结合效率”。如下文所阐明的，这种双（多）探针设计与本发明的双探针的构思截然不同。

具体而言，使用本发明的组合物，在无待测模板的情况下，上游探针和下游探针形成稳定的二聚体结构。在二聚体结构中，一条探针的3’端和另一条探针的5’端的空间距离极为接近，从而达到FRET效应的最佳效果，荧光本底信号极低。提高了荧光定量PCR的检测结果信噪比，使得检测结果灵敏度更高。

而当体系中存在待测模板时，由于探针和模板结合的吉布斯自由能相比探针之间的更低，因此探针优先与各自的模板匹配，进而在DNA聚合酶的5’外切酶的作用下被水解。水解后，两条探针分别释放出的荧光基团，从而可以检测到两份荧光信号。

另外，两条探针具有杂交区，在没特异性模板存在时会相互形成稳定的双链结构。该双链结构的结合力略低于探针与特异性模板的结合力，但远高于与非特异性模板或与引物间的非特异结合力，因此更不容易产生非特异的荧光信号。

进一步地，所述第三Tm值大于反应体系扩增过程中的退火温度值3~5℃。

进一步地，所述第一Tm值和第二Tm值大于所述第三Tm值2~8℃。

进一步地，第一探针或第二探针的两端可分别标记荧光基团或猝灭基团。荧光基团或猝灭基团有多种标记的组合方式。

在一个实施方案中，第一探针的5’端标记有荧光基团，第二探针的3’端标记有猝灭基团。

在一个实施方案中，第一探针的3’端标记有荧光基团，第二探针的5’端标记有猝灭基团。

在一个实施方案中，第一探针的5’端标记有荧光基团并且3’端标记有猝灭基团，第二探针的3’端标记有猝灭基团。

在一个优选的实施方案中，第一探针的5’端标记有荧光基团并且3’端标记有猝灭基团，第二探针的5’端标记有荧光基团并且3’端标记有荧光基团。

在一个优选的实施方案中，第一探针的5’端标记有猝灭基团并且3’端标记有荧光基团，第二探针的5’端标记有猝灭基团并且3’端标记有荧光基团。

在一个优选的实施方案中，第一探针的5’端和3’端标记有荧光基团，第二探针的5’端和3’端标记有猝灭基团。

在本发明中，术语“荧光基团”是指一类被一定波长的光波（激发光）激发后，能发射出波长大于激发光的光波（发射光）的物质。本文所述荧光基团可以选自FAM、HEX、VIC、ROX、CY5、5-TAMRA、TET、CY3和JOE，但不限于此。

在本发明中，术语“猝灭基团”能够通过荧光共振转移等方式吸收对应荧光基团的发射光的物质。本文所述猝灭基团可以选自Dabcyl、QYS-7、BHQ1、BHQ2、BHQ3，但不限于此。

所述第一探针和第二探针的长度是本领域技术人员可以通过具体需要而确定，例如，第一探针和第二探针的长度可以为15-45nt，更优选为20-30nt。

进一步地，所述A区的长度可以为0-10nt；在优选的情况下，所述A区的长度为3-10nt；在更优选的情况下，所述A区的长度为4-6nt。

进一步地，所述组合物还包括用于扩增待测模板的引物对。

进一步地，所述组合物中探针的浓度为100-300nM，引物的浓度为300-500nM。

第二方面，本发明提供了上述组合物在制备荧光定量PCR试剂盒中的用途。

第三方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述组合物。

进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液以及Mg²⁺中的至少一种。

进一步地，所述试剂盒还包括明胶、甘油、吐温20中的至少一种。

第四方面，提供了一种荧光定量PCR的方法，所述方法包括以下步骤：

1）释放待测样本的核酸；

2）使用如上所述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1）获得的核酸进行荧光定量PCR；

3）获得并分析结果。

进一步地，所述荧光定量PCR的热循环反应条件为：95℃ 1分钟热激活；变性温度5-30秒，退火温度 10-30秒并采集荧光（循环25-50次）。

在一个具体的实施方案中，所述荧光定量PCR的热循环反应条件为：95℃ 1分钟热激活；94℃变性 15秒，60℃退火延伸 30秒并采集荧光（循环45次）

本发明所提及的“样本”指的是含有待测核酸的物质，所述样本可以包括但不限于是动植物细胞、细菌、病毒、真菌等，以及包含这些在内的体液、组织、器官等。

第五方面，提供了一种荧光定量PCR的方法，所述方法包括将样本与上述组合物混合的步骤。

附图说明

图1为在无待测模板的情况下，上游探针和下游探针形成的稳定的二聚体结构图；

图2为本发明双探针组合物的检测原理图；

图3A为本发明双探针组合物与单探针组合物检测EBV病毒的原始信号图，纵坐标代表荧光强度，横坐标代表循环数；

图3B为本发明双探针组合物与单探针组合物检测EBV病毒的分析后结果图，纵坐标代表荧光强度，横坐标代表循环数；

图4A为本发明双探针组合物与上游双探针组合物检测EBV病毒的原始信号图，纵坐标代表荧光强度，横坐标代表循环数；

图4B为本发明双探针组合物与上游双探针组合物检测EBV病毒的分析后结果图，纵坐标代表荧光强度，横坐标代表循环数；

图5A为本发明双探针组合物与双猝灭基团探针组合物检测EBV病毒的原始信号图，纵坐标代表荧光强度，横坐标代表循环数；

图5B为本发明双探针组合物与双猝灭基团探针组合物检测EBV病毒的分析后结果图，纵坐标代表荧光强度，横坐标代表循环数；

图6A为本发明双探针组合物与对比例双探针组合物检测EBV病毒的原始信号图，纵坐标代表荧光强度，横坐标代表循环数；

图6B为本发明双探针组合物与对比例双探针组合物检测EBV病毒的分析后结果图，纵坐标代表荧光强度，横坐标代表循环数；

图7A为本发明双探针组合物与单探针组合物检测人B2M基因的原始信号图，纵坐标代表荧光强度，横坐标代表循环数；

图7B为本发明双探针组合物与单探针组合物检测人B2M基因的分析后结果图，纵坐标代表荧光强度，横坐标代表循环数。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

实施例1、本发明方案设计组合物检测EBV病毒

针对EBV病毒序列，制备按照本发明方案设计的组合物，其具体序列如下表1所示（波浪下划线代表B区，下同）。

使用上述引物和探针构建50μL反应体系，包含400nM引物，200nM探针，10 mMTris-HCl，50 mM KCl，3.5 mM MgCl₂，0.01%（w/v）明胶，0.02%（w/v）吐温20，1%（w/v）甘油，1.5mM dATP，1.5 mM dTTP，1.5 mM dCTP，1.5 mM dGTP，10U Taq DNA聚合酶。

采用以下反应程序进行热循环： 95℃ 1分钟热激活；94℃ 15秒，60℃ 30秒并采集荧光（循环45次）。每组检测3个重复，检测结果如图3A和3B所示。

对比例1、单探针组合物检测EBV病毒

按照实施例1所述的条件进行检测，唯一不同之处在于，将实施例1中的双探针换成常规的单探针，所述常规的单探针的序列（EBV-UP）为：CCAAGAACCCAGACGAGTCCGTA（SEQ IDNO:3）（5’端标记FAM，3’端标记BHQ1）。

图3A为原始信号图，可以看出，本发明的双探针组合物的噪音远小于单探针组合物的噪音（扩增曲线前段），而双探针组合物的荧光信号与单探针组合物的荧光信号相当（扩增曲线后段），因此，双探针组合物的信噪比远大于单探针组合物的信噪比。图3B为分析后的结果，可以看出，双探针组合物的曲线更为挺拔，荧光信号更为强烈，检测效果更好。

对比例2、上游双探针组合物检测EBV病毒

按照实施例1所述的条件进行检测，唯一不同之处在于，将实施例1中的双探针换成均针对模板同一条链的两条探针，所述两条探针的序列分别为：

EBV-UP：CCAAGAACCCAGACGAGTCCGTA（SEQ ID NO:3）（5’端标记FAM，3’端标记BHQ1）；

EBV-UP-2：AAGGGTCCTCGTCCAGCAAGAAG（SEQ ID NO:5）（5’端标记FAM，3’端标记BHQ1）。

图4A为原始信号图，可以看出，本发明的双探针组合物的噪音远小于上游双探针组合物的噪音（扩增曲线前段），而双探针组合物的荧光信号略低于上游双探针组合物的荧光信号（扩增曲线后段），因此，双探针组合物的信噪比大于上游双探针组合物的信噪比。图4B为分析后的结果，可以看出，双探针组合物的曲线更为挺拔，荧光信号更为强烈，检测效果更好。

对比例3、双猝灭基团组合物检测EBV病毒

按照实施例1所述的条件进行检测，唯一不同之处在于，将实施例1中的双探针换成双猝灭基团的单探针，所述双猝灭基团的单探针的序列（EBV-UP-ZEN）为：CCAAGAACCCAGACGAGTCCGTA（SEQ ID NO:3）（5’端标记FAM，3’端标记BHQ1，中部标记ZEN淬灭）。

图5A为原始信号图，可以看出，本发明的双探针组合物的噪音远小于双猝灭基团探针组合物的噪音（扩增曲线前段），而双探针组合物的荧光信号略小于双猝灭基团探针组合物的荧光信号（扩增曲线后段），因此，双探针组合物的信噪比远大于双猝灭基团探针组合物的信噪比。图5B为分析后的结果，可以看出，双探针组合物的曲线更为挺拔，荧光信号更为强烈，检测效果更好。

对比例4、双探针组合物的对比例检测EBV病毒

按照实施例1所述的条件进行检测，唯一不同之处在于，将实施例1中的EBV-LP分别换成如下表2所示的序列。下列序列均为未满足本发明双探针的设计要求。

图6A为原始信号图，可以看出，本发明的双探针组合物的噪音远小于对比例双探针组合物的噪音（扩增曲线前段），而双探针组合物的荧光信号与对比例双探针组合物的荧光信号相当（扩增曲线后段），因此，双探针组合物的信噪比远大于对比例双探针组合物的信噪比。图6B为分析后的结果，可以看出，双探针组合物的曲线更为挺拔，荧光信号更为强烈，检测效果更好。

实施例2、本发明组合物检测人B2M基因mRNA

针对B2M基因序列，制备按照本发明方案设计的组合物，其具体序列如下表3所示。

使用上述引物和探针构建50μL反应体系，包含400nM引物，200nM探针，10 mMTris-HCl，50 mM KCl，3.5 mM MgCl₂，0.01%（w/v）明胶，0.02%（w/v）吐温20，1%（w/v）甘油，1.5mM dATP，1.5 mM dTTP，1.5 mM dCTP，1.5 mM dGTP，10U Taq DNA聚合酶，100U mMLV逆转录酶。

采用以下反应程序进行热循环： 50℃ 30分钟逆转录；95℃ 1分钟热激活；94℃15秒，60℃ 30秒并采集荧光（循环45次），每组检测4个重复，检测结果如图7A和7B所示。

对比例5、单探针组合物检测人B2M基因mRNA

按照实施例7所述的条件进行检测，唯一不同之处在于，将实施例7中的双探针换成常规的单探针，所述常规的单探针的序列（B2M-LP）为：TGTCTCGATCCCACTTAACTATCTTGGAT（SEQID NO:12）（5’端标记FAM，3’端标记BHQ1）。

图7A为原始信号图，可以看出，本发明的双探针组合物的噪音远小于单探针组合物的噪音（扩增曲线前段），而双探针组合物的荧光信号与单探针组合物的荧光信号相当（扩增曲线后段），因此，双探针组合物的信噪比远大于单探针组合物的信噪比。图7B为分析后的结果，可以看出，双探针组合物的曲线更为挺拔，荧光信号更为强烈，检测效果更好。

序列表

<110> 圣湘生物科技股份有限公司

<120> 用于荧光定量PCR的双探针组合物、试剂盒、用途及方法

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttctgctaag cccaacactc 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccctgaaggt gaaccgctta c 21

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccaagaaccc agacgagtcc gta 23

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cccttctacg gactcgtctg ggtt 24

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aagggtcctc gtccagcaag aag 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tacggactcg tctgggttct tgg 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

acggactcgt ctgggttctt ggc 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

actcgtctgg gttcttggcc ccc 23

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gccgtgtgaa ccatgtgac 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cggcatcttc aaacctccat 20

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cagcccaaga tagttaagtg ggatcg 26

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tgtctcgatc ccacttaact atcttggat 29

Claims

1.一种用于荧光定量PCR的双探针组合物，所述组合物包括第一探针和第二探针，所述第一探针和第二探针分别用于检测待测模板的不同链，并且所述探针从5’端至3’端依次可分为三个区域：A区、B区、C区，其中，

所述第一探针和第二探针的A区和B区与所述待测模板完全互补配对；

所述第一探针的B区与所述第二探针的B区完全互补配对；

所述第一探针和第二探针的C区不与所述待测模板互补配对；

其中，所述C区的长度可以为0；

并且其中，所述第一探针与模板配对的第一Tm值和所述第二探针与模板配对的第二Tm值大于所述第一探针与第二探针之间相互配对的第三Tm值，且其中所述第三Tm值大于反应体系扩增过程中的退火温度值。

2.根据权利要求1所述的双探针组合物，其中，所述第三Tm值大于反应体系扩增过程中的退火温度值3~5℃。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述第一Tm值和第二Tm值大于所述第三Tm值2~8℃。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述第一探针或所述第二探针的两端可分别标记荧光基团或猝灭基团。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中，第一探针和第二探针的长度为15-45nt，更优选为20-30nt。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述A区的长度可以为0-10nt；优选地，所述A区的长度为3-10nt；更优选地，所述A区的长度为4-6nt。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物还包括用于扩增待测模板的引物对。

8.如权利要求1~7中任一项所述组合物在制备荧光定量PCR试剂盒中的用途。

9.一种荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1~7中任一项所述组合物。

10.一种荧光定量PCR的方法，所述方法包括将样本与如权利要求1~7中任一项所述组合物混合的步骤。