JP4931595B2 - Ｒｎａ配列の増幅のための方法 - Google Patents
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Description
本発明は、標的ＲＮＡ配列の増幅のための方法、標的ＲＮＡ配列の増幅のためのプライマー及び１又はそれ以上の前記プライマーを含むキットに関する。
標的ＲＮＡ又はＤＮＡ配列を増幅する、核酸増幅法は、一般に分子生物学、生化学及び生物工学の分野において応用され、可能な応用は数多く、さらに増加しつつある。この増幅法は、しばしば小量で、ＲＮＡ及びＤＮＡの両方の多種多様な他の核酸が存在する環境中に存在する、特定標的核酸配列のコピー数を増加させる。
核酸増幅法は、特に、例えば感染症、遺伝性疾患及び様々な種類の癌を診断するときに、血液、精液、組織、毛、微生物、細胞、腫瘍等のような試料中に存在する特定標的核酸配列の検出及び定量を容易にするために使用される。加えて、核酸増幅法は、法医科学及び考古学において又は父子関係を確認するためなどの、情報標的核酸が微小量で存在する可能性がある試料を検討する他の分野でも適用されてきた。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び転写に基づく増幅（ＴＢＡ）のような、いくつかの核酸増幅手法が公知であり、これらは種々の作用機構に基づくが、全て標的核酸配列又はその相補的配列の境界への１又はそれ以上のプライマーのアニーリングに依存する。標的核酸配列の境界へのプライマーのアニーリングは、プライマー内に含まれる連続する数（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ ｎｕｍｂｅｒ）のヌクレオチドの、標的核酸配列内の連続する数の相補的ヌクレオチドへのハイブリッド形成によって与えられる。
プライマーの効率的なハイブリッド形成は、一般に少なくとも１５個の連続する相補的ヌクレオチドを必要とする。より少ないヌクレオチドしか存在しない場合は、プライマーの特異的アニーリングと非特異的アニーリングの比率が、もはや標的核酸の有効な増幅が起こり得ない点より下に低下する。少なくとも１５個の連続相補的ヌクレオチドという必要条件は、しかしながら、例えば標的配列のコンセンサス配列だけが使用できる場合、特にウイルス、細菌及び酵母のような生物、又は血液、細胞、腫瘍及びリンパ液のような組織標本に由来する標的核酸から全ての遺伝子型を増幅しようとする場合に、標的核酸の増幅の可能性を制限する。遺伝的変異の故に、コンセンサス配列が個々の種間で異なる可能性があるとき、非相補的ヌクレオチドの存在の結果としてプライマーの非効率的なハイブリッド形成が起こり得る。
標的ヌクレオチド配列のいくつかの「遺伝的変異」が既知であれば、保存された一連のヌクレオチドを特定し、プライマー設計のために使用することができる。しかし、ヒトＣ型肝炎ウイルスのコード領域の一部などの、ＲＮＡウイルスのような一部の種における好ましい保存された範囲は、時として効率的なプライマーを設計するために使用するには小さすぎることがある。加えて、これらの保存された部分でさえも突然変異する傾向があり、これはウイルス及び細菌のような急速分裂生物において最も著明であって、プライマーのハイブリッド形成の効率低下を生じさせる。結果として、増幅が起こらない可能性があり、これは、例えば常用診断において極めて望ましくない。偽陰性増幅結果は関係する患者にとって重大な影響を及ぼし得るからである。
従って、小さな範囲の標的ＲＮＡ配列を使用した増幅を可能にし、標的配列のハイブリッド形成部分内に突然変異又は遺伝的変異を生じにくい増幅方法が明らかに求められている。
本発明を導いた研究において、上述した問題は、以下の段階：
（ａ）プロモーター配列に作動可能に連結された標的ＲＮＡ配列の少なくとも第一部分に相補的であり、これにハイブリッド形成する、ハイブリッド形成配列を含む第一プライマーを標的ＲＮＡ配列にアニールする段階；
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応において前記第一プライマーを延長し、第一ＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッド核酸分子を形成する段階；
（ｃ）第一ＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッド核酸分子の標的ＲＮＡ配列を選択的に除去して、第一の一本鎖ｃＤＮＡ配列を形成する段階；
（ｄ）前記第一の一本鎖ｃＤＮＡ配列の第一部分に相補的であり、それにハイブリッド形成するハイブリッド形成配列を含む第二プライマーを、得られた第一の一本鎖ｃＤＮＡ配列にアニールする段階；
（ｅ）ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応において前記第二プライマーを延長して、第一の二本鎖ＤＮＡ分子を形成する段階；及び
（ｆ）第一プライマー内に含まれるプロモーター配列に特異性を有するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって触媒される反応において標的ＲＮＡ配列に相補的な多数のＲＮＡ転写産物の作製において、工程（ｅ）の第一の二本鎖ＤＮＡ分子を使用する段階、
を含み、
但し、前記第一プライマーは、７−１４ヌクレオチドのハイブリッド形成配列、転写促進配列及び標的ＲＮＡ配列の第二部分に結合することができるアンカーを含み、及び／又は第二プライマーは、７−１４ヌクレオチドのハイブリッド形成配列、増幅促進配列及び第一の一本鎖ｃＤＮＡの第二部分に結合することができるアンカーを含む、
増幅方法によって回避できることが認められた。
（ａ）プロモーター配列に作動可能に連結された標的ＲＮＡ配列の少なくとも第一部分に相補的であり、これにハイブリッド形成する、ハイブリッド形成配列を含む第一プライマーを標的ＲＮＡ配列にアニールする段階；
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応において前記第一プライマーを延長し、第一ＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッド核酸分子を形成する段階；
（ｃ）第一ＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッド核酸分子の標的ＲＮＡ配列を選択的に除去して、第一の一本鎖ｃＤＮＡ配列を形成する段階；
（ｄ）前記第一の一本鎖ｃＤＮＡ配列の第一部分に相補的であり、それにハイブリッド形成するハイブリッド形成配列を含む第二プライマーを、得られた第一の一本鎖ｃＤＮＡ配列にアニールする段階；
（ｅ）ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応において前記第二プライマーを延長して、第一の二本鎖ＤＮＡ分子を形成する段階；及び
（ｆ）第一プライマー内に含まれるプロモーター配列に特異性を有するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって触媒される反応において標的ＲＮＡ配列に相補的な多数のＲＮＡ転写産物の作製において、工程（ｅ）の第一の二本鎖ＤＮＡ分子を使用する段階、
を含み、
但し、前記第一プライマーは、７−１４ヌクレオチドのハイブリッド形成配列、転写促進配列及び標的ＲＮＡ配列の第二部分に結合することができるアンカーを含み、及び／又は第二プライマーは、７−１４ヌクレオチドのハイブリッド形成配列、増幅促進配列及び第一の一本鎖ｃＤＮＡの第二部分に結合することができるアンカーを含む、
増幅方法によって回避できることが認められた。
本発明によれば、意外にも、プライマーの少なくとも１個における連続ハイブリッド形成ヌクレオチドの数の低下は、前記プライマーが、アンカーがハイブリッド形成配列を第一部分に暴露するように、ハイブリッド形成ヌクレオチド配列ではない、標的ＲＮＡ配列の第二部分に結合するアンカーを付加的に含む場合は、信頼し得る増幅方法を依然可能にすることが認められた。
ハイブリッド形成配列に加えてのアンカーの使用は、従って、２段階アニーリングプロセス：１）第二部分と称する、標的ＲＮＡ配列の部分へのアンカーの結合、及び２）第一部分と称する、標的ＲＮＡ配列の連続相補的ヌクレオチドへのプライマーのハイブリッド形成配列のハイブリッド形成、をもたらし、これらの段階は同時に又は連続的に（すなわち最初に段階１、次に段階２、又は最初に段階２、次に段階１）起こり得る。アンカーは、特異的に結合し得るが、アンカーとハイブリッド形成配列はまた、標的ＲＮＡへのプライマーの特異的相互作用の責任を共に担うことができる。例えばアンカーが７−１４ヌクレオチドの長さであり、ハイブリッド形成配列が１３−７ヌクレオチドの長さである場合、アンカーとハイブリッド形成配列が独立して特異的に結合することはないが、その組合せは特異的である。
本発明によれば、プライマーのハイブリッド形成配列内のヌクレオチドの数は、１４、１３、１２、１１、１０、９、８又は７ヌクレオチドに低下させることができる。プライマー内のアンカーの存在の故に、ハイブリッド形成する部分が最大で１４ヌクレオチドしか含まず、それ自体は特異的にハイブリッド形成することができないという事実に関わりなく、標的ヌクレオチド配列へのプライマーの特異的結合が起こる。従って、アンカーとハイブリッド形成配列の組合せにより、標的配列へのプライマーの特異的結合が達成される。
本発明に従った方法を、この方法の好ましい実施態様を示す図１６を参照してさらに説明する。最初の工程の間に、通常は正プライマーと称される、第一プライマー（Ｐ１）内に存在するＰＮＡアンカーが、標的ＲＮＡ配列（ＲＮＡ＋）の部分に結合する。続いて、第一プライマーのハイブリッド形成配列（Ｈ）が標的ＲＮＡ配列の第一部分にハイブリッド形成する。
標的ＲＮＡ配列への第一プライマーのアニーリング後、鳥類骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素ポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼを使用してプライマーを延長する。ＤＮＡポリメラーゼは標的ＲＮＡ配列をコピーして、第一ＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッド分子を形成する。
同時に又は連続的に、好ましくは、例えばリボヌクレアーゼによる酵素的消化により、標的ＲＮＡ配列を選択的に除去する。生じた第一の一本鎖ｃＤＮＡ配列（ＤＮＡ−）を、増幅方法における続く工程のための鋳型として使用する。
この続く工程は、形成された第一の一本鎖ｃＤＮＡへの、通常は逆プライマーと称される、第二プライマー（Ｐ２）のアニーリングを必要とする。示されている実施態様によれば、第二プライマーはまた、一本鎖ｃＤＮＡの第一部分に相補的であり、これにハイブリッド形成するハイブリッド形成配列（Ｈ）、増幅促進配列（Ｘ）及び第一の一本鎖ｃＤＮＡ配列の第二部分に特異結合することができるＰＮＡアンカーを含む。
本発明によれば、第一及び第二プライマーの両方が、又は第一又は第二プライマーのいずれかだけが、短いハイブリッド形成配列とアンカーを含み得る。
増幅方法の続く工程では、第一の一本鎖ｃＤＮＡ配列を鋳型として使用して、ＡＭＶ逆転写酵素ポリメラーゼによって第二プライマーを延長し、第一プライマーに由来する二本鎖プロモーター配列を含む第一の二本鎖ＤＮＡ分子を生じさせる。
この第一の二本鎖ＤＮＡ分子は、続いて、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによる多数のＲＮＡ転写産物（ＲＮＡ−）の作製のために使用する。プロモーター部位の下流の配列を鋳型として使用するが、これは、ＲＮＡ転写産物が正プライマーのアンカー配列を含まないことを意味する。
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの選択は第一プライマー内のプロモーター配列の選択に依存することは当業者には明白である。本発明の好ましい実施態様では、プロモーター配列はＴ７プロモーター配列であり、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼはＴ７ポリメラーゼである。
さらなる好ましい実施態様では、本発明に従った方法は、以下の段階：
（ｇ）段階（ｆ）で作製されたＲＮＡ転写産物に第二プライマーをアニールする段階；
（ｈ）ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応において前記第二プライマーを延長し、第二ＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッド核酸分子を形成する段階；
（ｉ）第二ＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッド分子のＲＮＡを選択的に除去して、第二の一本鎖ｃＤＮＡ分子を得ること；
（ｊ）得られた第二の一本鎖ｃＤＮＡ配列に第一プライマーをアニールする段階；
（ｋ）第一プライマーを鋳型として使用して、ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応において前記第二の一本鎖ｃＤＮＡ分子の３’末端を延長し、二本鎖プロモーター部位を含む第二の部分的二本鎖ＤＮＡ分子を形成する段階；及び
（ｌ）第一プライマー内のプロモーター配列に特異性を有するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって触媒される反応における標的ＲＮＡ配列に相補的な多数のＲＮＡ転写産物の作製において、工程（ｋ）の第二の二本鎖ＤＮＡ分子を使用する段階、
をさらに含む。
（ｇ）段階（ｆ）で作製されたＲＮＡ転写産物に第二プライマーをアニールする段階；
（ｈ）ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応において前記第二プライマーを延長し、第二ＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッド核酸分子を形成する段階；
（ｉ）第二ＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッド分子のＲＮＡを選択的に除去して、第二の一本鎖ｃＤＮＡ分子を得ること；
（ｊ）得られた第二の一本鎖ｃＤＮＡ配列に第一プライマーをアニールする段階；
（ｋ）第一プライマーを鋳型として使用して、ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応において前記第二の一本鎖ｃＤＮＡ分子の３’末端を延長し、二本鎖プロモーター部位を含む第二の部分的二本鎖ＤＮＡ分子を形成する段階；及び
（ｌ）第一プライマー内のプロモーター配列に特異性を有するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって触媒される反応における標的ＲＮＡ配列に相補的な多数のＲＮＡ転写産物の作製において、工程（ｋ）の第二の二本鎖ＤＮＡ分子を使用する段階、
をさらに含む。
本発明に従った増幅方法のこれらの追加工程は、図１６Ｂにおいても図式的に示す、標的ＲＮＡ配列の自律（又は循環）複製を生じさせる。
本発明の好ましい実施態様では、第一プライマーは、５’末端から３’末端の方向に、アンカー、転写促進配列、及び７−１４個の連続ヌクレオチドの標的ＲＮＡ配列の第一部分に相補的な７−１４ヌクレオチドから成るハイブリッド形成配列を含む。
さらなる好ましい実施態様では、第二プライマーは、５’末端から３’末端の方向に、アンカー、増幅促進配列、及び７−１４個の連続ヌクレオチドの第一の一本鎖ｃＤＮＡ配列の第一部分に相補的な７−１４ヌクレオチドから成るハイブリッド形成配列を含む。
好ましくは、第一及び第二プライマーのハイブリッド形成配列は、それぞれ、７−１０個の連続ヌクレオチドのＲＮＡ標的配列又は第一の一本鎖ｃＤＮＡ配列の第一部分に相補的な７−１０ヌクレオチドを含む。
アンカーの存在の故に、プライマーは標的ＲＮＡ配列に特異的に結合することができる。ハイブリッド形成配列単独では、その長さが短いために、特異的に結合することができない。
本発明によれば、アンカーは、標的ＲＮＡ配列の第二部分に結合することができるいかなる化合物でもあり得る。アンカーは、好ましくは、場合により修飾された、オリゴヌクレオチド又はタンパク質である。標的ＲＮＡ配列の第二部分又は一本鎖ｃＤＮＡ配列の第二部分に結合する、場合により修飾された、７−２２ヌクレオチド、より好ましくは７−１４、最も好ましくは９−１４ヌクレオチドを含む、場合により修飾されたオリゴヌクレオチドが好ましい。当業者は、アンカーの結合のためには、アンカー内の全てのヌクレオチドが標的ＲＮＡ配列の第二部分内の対応する配列に相補的である必要はないことを理解する。従って、標的ＲＮＡ配列へのプライマーの特異的結合のためには、アンカーのヌクレオチドの少なくとも約９０％が相補的であるべきである。これは、増幅方法の効率に影響を及ぼすことなく第二部分のより柔軟な選択を可能にする。
アンカーのヌクレオチドは、ＲＮＡ及びＤＮＡの両方、又はＬｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）又は２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチド、又はペプチド核酸（ＰＮＡ）であり得る。そのような修飾は、より安定なアンカーを提供するか又はプライマーの特異的結合特性を増強する。
核酸配列への特異的結合を示すタンパク質又はそれに由来するフラグメントも、アンカーとして使用することができる。標的ＲＮＡ配列の第二部分又は第一の一本鎖ｃＤＮＡ配列の第二部分に結合することができるタンパク質又はそれに由来するフラグメントは、例えばタンパク質工学によって選択する又は設計することができる。そのようなタンパク質の例は、ポリＣ結合タンパク質、ポリＡ結合タンパク質、及び１又はそれ以上のジンクフィンガー、制限酵素及び／又は抗体及びｓｃＦｖ、Ｆａｂ等のようなそのフラグメントを含むタンパク質である。
標的核酸配列の第一部分と第二部分は、好ましくは、０、１、２、３、４、５又は６ヌクレオチド、より好ましくは０、１、２、３又は４ヌクレオチド、最も好ましくは０、１、２又は３ヌクレオチドによって隔てられる。７個以上のヌクレオチドが上記の２つの部分の間に存在するときは、プライマーの２工程アニーリングの効率、従って増幅の効率が低下する。
増幅の間に生成される一本鎖ＲＮＡ転写産物は、配列特異的プローブによるハイブリッド形成ベースの検出システムの使用に極めて適する。検出は、電気化学発光（ＥＣＬ）を用いて増幅の最後に実施し得る。ストレプトアビジン−ビオチン相互作用によって磁気ビーズに結合した、特異的捕獲プローブを使用して、ＲＮＡ転写産物を固定化し、ルテニウム標識検出プローブを前記転写産物とハイブリッド形成させる。また、例えば「酵素結合ゲルアッセイ（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｇｅｌ ａｓｓａｙ）」（ＥＬＧＡ）又は蛍光分光法などの、現在公知の他の検出方法も使用し得る。
非常に洗練された検出方法は分子ビーコンの使用である。分子ビーコンは、５’末端を蛍光物質で標識したＤＮＡオリゴヌクレオチドである。配列の３’末端の最後の部分は５’末端の最初の部分に相補的であり、３’末端の消光物質が蛍光物質の放出光を吸収するようにヘアピンステムが形成される。ヘアピンループ配列はＲＮＡ転写産物の標的配列に相補的である。標的配列へのループ配列の結合によって、ヘアピンステムが開き、消光物質は蛍光物質から切り離される。放出される光の上昇を蛍光光度計によって検出することができる。増幅の間にＲＮＡ転写産物とのハイブリッド形成が起こり、「リアルタイム」検出を可能にする。試料中の標的核酸の量を定量するために、キャリブレータを含めてもよく、核酸の単離の前に添加し、標的核酸と共抽出して、共増幅する。
検出プローブは、標的特異的プローブであってもよく、又は一般的プローブ、すなわち増幅促進配列と同一の配列のような、ＲＮＡ転写産物に組み込まれた一般的配列に対するプローブであってもよい。
そこで、本発明に従った方法の好ましい実施態様では、標的特異的プローブは、標的ＲＮＡ配列に相補的なＲＮＡ転写産物にハイブリッド形成する。もう１つの好ましい実施態様によれば、包括的プローブを、多種多様な異なる増幅された標的ＲＮＡ配列の検出のために１個の配列特異的プローブを使用することを可能にする、第二プライマーの増幅配列と同一の配列にハイブリッド形成させる。これはコスト効果的な検出方法をもたらし（検出プローブは、一般に、合成するのに比較的費用がかかる。）、プローブの結合特性は出発物質又は標的ＲＮＡ配列に関わりなくあらゆる増幅方法において同等であり得るので、再現性のある定量的な検出のための可能性を上昇させる。
本発明の増幅方法は、好ましくは、ウイルスが部分的にだけ保存された核酸配列を有する、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）から単離されたＲＮＡ又はヒトＣ型肝炎ウイルスから単離されたＲＮＡなどの、ウイルス標的ＲＮＡ配列の増幅のために使用される。
本発明はさらに、アンカーとハイブリッド形成配列を含むプライマーに関する。本発明に従ったプライマーは、好ましくは、５’末端から３’末端の方向に、上記で定義したようなアンカー、以下で定義するような転写促進配列又は増幅促進配列、及び上記で定義したような７−１４ヌクレオチド、好ましくは７−１０ヌクレオチドのハイブリッド形成配列を含む。
アンカーとハイブリッド形成配列を含むプライマーの使用は、転写に基づく増幅（ＴＢＡ）に限定されず、これらのプライマーは、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）のような他の増幅方法においても使用できる。
本発明のもう１つの局面によれば、本発明は、少なくとも１又はそれ以上の本発明に従ったプライマーを含む標的ＲＮＡ配列の増幅及び／又は検出のためのキットに関する。
本発明に従ったキットは、１又はそれ以上の配列特異的プローブ、増幅緩衝液、及び／又はＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ及びＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼなどの１又はそれ以上の酵素をさらに含み得る。
（定義）
本発明によれば、標的ＲＮＡ配列は、増幅方法によって増幅されるべきＲＮＡの特定部分と定義される。
本発明によれば、標的ＲＮＡ配列は、増幅方法によって増幅されるべきＲＮＡの特定部分と定義される。
ハイブリッド形成は、例えばプライマー内に存在する、連続する数のヌクレオチドの、例えば標的ＲＮＡ配列の相補的ヌクレオチドへの結合と定義される。ハイブリッド形成は二本鎖核酸分子の形成を生じさせる。
アニーリングは、例えばハイブリッド形成による、プライマーと標的核酸配列の結合と定義される。
特異的結合は、使用される条件下での、ある化合物（プライマー又はプライマーの部分など）の、ランダムなヌクレオチド配列への結合と比較して、特定オリゴヌクレオチド配列への結合の選択性と定義される。従って、ある化合物が全く同一のヌクレオチド配列に対してのみ結合する場合、その化合物は特異的に結合する。
核酸配列は、その核酸配列の全ての個別ヌクレオチドが相補的である場合、例えば１つのオリゴヌクレオチド配列が５’−ＡＴＧ ＡＣＣ ＴＧＧ−３’であり、その相補的オリゴヌクレオチド配列が３’−ＴＡＣ ＴＧＧ ＡＣＣ−５’である場合、相補的と称される。
鋳型は、ポリメラーゼによって転写される核酸分子と定義される。合成される転写産物は、前記核酸分子に相補的であるか、又は少なくとも核酸分子の１本の鎖に相補的である。ＲＮＡ及びＤＮＡのどちらも、通常は５’から３’方向に合成される。
転写促進配列は、標的配列に対して非特異的配列である、プロモーター、例えばＴ７を含む核酸配列である。転写促進配列は、場合によりプリン伸張部（主としてＧ及び／又はＡによって構成される）を含み得る。これはアンカーとハイブリッド形成配列の間にループを創造する。
増幅促進配列は、標的配列に対して非特異的核酸であるが、プロモーターを含まない、すなわちアンカーとハイブリッド形成配列の間にループを形成するランダムな配列だけを含む。
以下の図面及び実施例によって本発明をさらに例示する。これらの図面及び実施例は、いかなる意味においても本発明を限定することを意図しない。
（実施例）
アンカーｐ１プライマーによるＨＩＶ ＲＮＡの増幅
細胞溶解緩衝液（ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ，ＢｉｏＭ ｅｒｉｅｕｘ）で溶解したＳｃｏｔｔ Ｌａｙｎｅ ＨＩＶ粒子（ＨＩＶ感染細胞（Ｌａｙｎｅら（１９９２）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８９：６９５−７１４）又はＨＩＶ ｇａｇ ＲＮＡ転写産物を増幅のための投入物質（ｉｎｐｕｔ）として使用した。５００、５０及び５ｃｐｓの投入量を試験した。増幅は、ＮＡＳＢＡ緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５、１２ｍＭ ＭｇＣｌ２、７０ｍＭ ＫＣｌ、１５％ ｖ／ｖ ＤＭＳＯ、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ 各々のｄＮＴＰ、２ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＣＴＰ、２ｍＭ ＵＴＰ、１．５ｍＭ ＧＴＰ、０．５ｍＭ ＩＴＰ、各々のプライマー（正プライマー（Ｐ１）及び逆プライマー（Ｐ２）、表１）０．２μＭ、分子ビーコンプローブ（ＨＩＶ−ＭＢ−ＷＴ、表１）０．１μＭ）中で実施した。前記混合物を、ＲＮＡを変性するために６５℃で２分間及びＰ１プライマーを標的にハイブリッド形成させるために４１℃で２分間インキュベートした。続いて、ＮＡＳＢＡ酵素（リボヌクレアーゼＨ０．０８単位、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ３２単位、ＡＭＶ逆転写酵素６．４単位及びＢＳＡ ２．１μｇ）を加え、反応混合物を、静かに軽くたたくこと及び短い遠心分離によって混合し、増幅とリアルタイム検出を開始した。反応混合物を、ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ ＥａｓｙＱ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ，ＢｉｏＭ ｅｒｉｅｕｘ）中で、毎分ごとに蛍光観測しながら４１℃で６０分間インキュベートした。４８５ｎｍで反応を励起し、発光シグナルを５１８ｎｍで測定した。
細胞溶解緩衝液（ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ，ＢｉｏＭ ｅｒｉｅｕｘ）で溶解したＳｃｏｔｔ Ｌａｙｎｅ ＨＩＶ粒子（ＨＩＶ感染細胞（Ｌａｙｎｅら（１９９２）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８９：６９５−７１４）又はＨＩＶ ｇａｇ ＲＮＡ転写産物を増幅のための投入物質（ｉｎｐｕｔ）として使用した。５００、５０及び５ｃｐｓの投入量を試験した。増幅は、ＮＡＳＢＡ緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５、１２ｍＭ ＭｇＣｌ２、７０ｍＭ ＫＣｌ、１５％ ｖ／ｖ ＤＭＳＯ、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ 各々のｄＮＴＰ、２ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＣＴＰ、２ｍＭ ＵＴＰ、１．５ｍＭ ＧＴＰ、０．５ｍＭ ＩＴＰ、各々のプライマー（正プライマー（Ｐ１）及び逆プライマー（Ｐ２）、表１）０．２μＭ、分子ビーコンプローブ（ＨＩＶ−ＭＢ−ＷＴ、表１）０．１μＭ）中で実施した。前記混合物を、ＲＮＡを変性するために６５℃で２分間及びＰ１プライマーを標的にハイブリッド形成させるために４１℃で２分間インキュベートした。続いて、ＮＡＳＢＡ酵素（リボヌクレアーゼＨ０．０８単位、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ３２単位、ＡＭＶ逆転写酵素６．４単位及びＢＳＡ ２．１μｇ）を加え、反応混合物を、静かに軽くたたくこと及び短い遠心分離によって混合し、増幅とリアルタイム検出を開始した。反応混合物を、ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ ＥａｓｙＱ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ，ＢｉｏＭ ｅｒｉｅｕｘ）中で、毎分ごとに蛍光観測しながら４１℃で６０分間インキュベートした。４８５ｎｍで反応を励起し、発光シグナルを５１８ｎｍで測定した。
標準ｐ２プライマー（ＨＩＶ２、表１）と組み合わせて、アンカーｐ１プライマー（ＨＩＶ１２、表１）による増幅を実施した。アンカープライマーは、Ｔ７プロモーター配列の上流の２２ヌクレオチドアンカー配列及びＴ７プロモーター配列の下流の７ヌクレオチドハイブリッド形成配列から成る。標準ｐ１プライマー（ＨＩＶ１、表１）及び標準ｐ２プライマー（ＨＩＶ２、表１）による増幅を基準として使用した。結果は、アンカープライマーによる増幅の感受性は基準プライマーに比肩し得ることを示す（図２）。
非常に短いハイブリッド形成配列を有するｐ１プライマーによるＨＩＶ ＲＮＡの増幅
ＨＩＶ１２と同一であるが、アンカー配列を持たず、７ヌクレオチドの３’ハイブリダイズ標的特異的配列だけを含むｐ１プライマー（ＨＩＶ１１、表１、図３）による増幅を、標準ｐ２プライマー（ＨＩＶ２、表１）と組み合わせて、実施した。ＨＩＶ１及びＨＩＶ１２を基準として使用した（表１）。増幅は実施例１で述べたように実施した。図４に示すように、プライマーＨＩＶ１１による増幅は認められず（図４Ｂ）、効率的な増幅のためにはアンカー配列が必要であることを示唆した。アンカーは、循環期ではなく反応の開始時に必要であると考えられる。従って、アンカーなしプライマーの添加は、反応の循環期には有益であり得る。全く同一の増幅反応においてアンカープライマーＨＩＶ１２とプライマーＨＩＶ１１の両方を使用するとき、反応速度のわずかな改善が認められた（図４Ｄ）。
ＨＩＶ１２と同一であるが、アンカー配列を持たず、７ヌクレオチドの３’ハイブリダイズ標的特異的配列だけを含むｐ１プライマー（ＨＩＶ１１、表１、図３）による増幅を、標準ｐ２プライマー（ＨＩＶ２、表１）と組み合わせて、実施した。ＨＩＶ１及びＨＩＶ１２を基準として使用した（表１）。増幅は実施例１で述べたように実施した。図４に示すように、プライマーＨＩＶ１１による増幅は認められず（図４Ｂ）、効率的な増幅のためにはアンカー配列が必要であることを示唆した。アンカーは、循環期ではなく反応の開始時に必要であると考えられる。従って、アンカーなしプライマーの添加は、反応の循環期には有益であり得る。全く同一の増幅反応においてアンカープライマーＨＩＶ１２とプライマーＨＩＶ１１の両方を使用するとき、反応速度のわずかな改善が認められた（図４Ｄ）。
種々のアンカー長を有するアンカーｐ１プライマーによるＨＩＶ ＲＮＡの増幅
依然特異的増幅を生じさせるアンカーの最小の長さを調べるために、種々のアンカー長を有するプライマーを設計した。標準ｐ２プライマー（ＨＩＶ２、表１）と組み合わせて、２２−７ヌクレオチドの範囲の種々のアンカー長を有する（５’末端から欠失）アンカープライマー（ＨＩＶ１２、１５、１６、１７、２０、２１、２２、表１）による増幅を実施した。標準ｐ１プライマーＨＩＶ１（表１）を基準として使用した。増幅は実施例１で述べたように実施した。１４ヌクレオチドまでの欠失は、基準（ＨＩＶ１標準プライマー及びＨＩＶ１２アンカープライマー）と比較して、まだ効率的な増幅を生じさせる（図５）。しかし、１４ヌクレオチド未満のアンカー長は、ごくわずかしか又は全く増幅を示さない。１４ヌクレオチド又はそれ以上のハイブリッド形成温度は、４１℃（増幅温度）より高いと予想される。より短いアンカーは４１℃未満のハイブリッド形成温度を有すると考えられ、このことが非効率的な増幅を説明し得る。
依然特異的増幅を生じさせるアンカーの最小の長さを調べるために、種々のアンカー長を有するプライマーを設計した。標準ｐ２プライマー（ＨＩＶ２、表１）と組み合わせて、２２−７ヌクレオチドの範囲の種々のアンカー長を有する（５’末端から欠失）アンカープライマー（ＨＩＶ１２、１５、１６、１７、２０、２１、２２、表１）による増幅を実施した。標準ｐ１プライマーＨＩＶ１（表１）を基準として使用した。増幅は実施例１で述べたように実施した。１４ヌクレオチドまでの欠失は、基準（ＨＩＶ１標準プライマー及びＨＩＶ１２アンカープライマー）と比較して、まだ効率的な増幅を生じさせる（図５）。しかし、１４ヌクレオチド未満のアンカー長は、ごくわずかしか又は全く増幅を示さない。１４ヌクレオチド又はそれ以上のハイブリッド形成温度は、４１℃（増幅温度）より高いと予想される。より短いアンカーは４１℃未満のハイブリッド形成温度を有すると考えられ、このことが非効率的な増幅を説明し得る。
アンカー配列内に２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを使用したアンカーｐ１プライマーによるＨＩＶ ＲＮＡの増幅
アンカーの結合効率を高めるため、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドをアンカーに組み込む。１４ヌクレオチドのアンカー長を有するプライマー（ＨＩＶ１７ ＭＥＴ、表１）、１２ｎｔ（ＨＩＶ２０ ＭＥＴａ＆ｂ、表１）、９ｎｔ（ＨＩＶ２１ ＭＥＴａ＆ｂ、表１）および７ｎｔ（ＨＩＶ２２ ＭＥＴａ＆ｂ）を増幅において使用した。予想される融解温度上昇は、組み込まれる２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド当り約１．５℃である。標準ｐ２プライマー（ＨＩＶ２、表１）を逆プライマーとして使用した。増幅は実施例１で述べたように実施した。２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを有するこれらのアンカープライマーを使用することは、特に１４ヌクレオチドより短いアンカー（１２及び９ヌクレオチドのアンカーＨＩＶ２０ ＭＥＴ及びＨＩＶ２１ ＭＥＴ）を使用するとき、明らかに増幅反応の感受性を改善する（図６−８）。２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを有する７ヌクレオチドアンカープライマー（ＨＩＶ２２ ＭＥＴ）は短すぎることがわかる（結果は示していない。）。おそらく、７ヌクレオチドアンカーは、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む場合でも、非効率的増幅を説明する、４１℃より低いハイブリッド形成温度を有する。
アンカーの結合効率を高めるため、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドをアンカーに組み込む。１４ヌクレオチドのアンカー長を有するプライマー（ＨＩＶ１７ ＭＥＴ、表１）、１２ｎｔ（ＨＩＶ２０ ＭＥＴａ＆ｂ、表１）、９ｎｔ（ＨＩＶ２１ ＭＥＴａ＆ｂ、表１）および７ｎｔ（ＨＩＶ２２ ＭＥＴａ＆ｂ）を増幅において使用した。予想される融解温度上昇は、組み込まれる２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド当り約１．５℃である。標準ｐ２プライマー（ＨＩＶ２、表１）を逆プライマーとして使用した。増幅は実施例１で述べたように実施した。２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを有するこれらのアンカープライマーを使用することは、特に１４ヌクレオチドより短いアンカー（１２及び９ヌクレオチドのアンカーＨＩＶ２０ ＭＥＴ及びＨＩＶ２１ ＭＥＴ）を使用するとき、明らかに増幅反応の感受性を改善する（図６−８）。２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを有する７ヌクレオチドアンカープライマー（ＨＩＶ２２ ＭＥＴ）は短すぎることがわかる（結果は示していない。）。おそらく、７ヌクレオチドアンカーは、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む場合でも、非効率的増幅を説明する、４１℃より低いハイブリッド形成温度を有する。
アンカー配列内にＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）ヌクレオチドを使用したアンカーｐ１プライマーによるＨＩＶ ＲＮＡの増幅
アンカーの結合効率を高めるため、ＬＮＡヌクレオチドをアンカーに組み込む。予想されるＴｍ上昇は、組み込まれるＬＮＡヌクレオチド当り約３−８℃である。７ヌクレオチドのアンカー長を有する４つの異なるアンカーｐ１プライマー（ＨＩＶ２２ ＬＮＡ１ｔ／ｍ４、表１）を増幅において使用した。これらのアンカーｐ１プライマー全てを標準ｐ２プライマーと組み合わせて試験した。増幅は実施例１で述べたように実施した。７ヌクレオチドＤＮＡアンカープライマーＨＩＶ２２と比較して、ＬＮＡアンカープライマーは明らかに改善された増幅感受性をもたらす（表１）（図９）。１４ヌクレオチドアンカープライマーＨＩＶ１７（表１）又は標準ｐ１プライマーＨＩＶ１（表１）と比較すると、これらのＬＮＡアンカープライマーの性能は低い。プライマーＨＩＶ２２ ＬＮＡ１及び２（表１）と比べてアンカープライマーＨＩＶ２２ ＬＮＡ３及び４（表１）を使用するとより良好な感受性が得られるので、アンカー配列内のＬＮＡヌクレオチドの位置が増幅効率に影響を及ぼすと思われる。
アンカーの結合効率を高めるため、ＬＮＡヌクレオチドをアンカーに組み込む。予想されるＴｍ上昇は、組み込まれるＬＮＡヌクレオチド当り約３−８℃である。７ヌクレオチドのアンカー長を有する４つの異なるアンカーｐ１プライマー（ＨＩＶ２２ ＬＮＡ１ｔ／ｍ４、表１）を増幅において使用した。これらのアンカーｐ１プライマー全てを標準ｐ２プライマーと組み合わせて試験した。増幅は実施例１で述べたように実施した。７ヌクレオチドＤＮＡアンカープライマーＨＩＶ２２と比較して、ＬＮＡアンカープライマーは明らかに改善された増幅感受性をもたらす（表１）（図９）。１４ヌクレオチドアンカープライマーＨＩＶ１７（表１）又は標準ｐ１プライマーＨＩＶ１（表１）と比較すると、これらのＬＮＡアンカープライマーの性能は低い。プライマーＨＩＶ２２ ＬＮＡ１及び２（表１）と比べてアンカープライマーＨＩＶ２２ ＬＮＡ３及び４（表１）を使用するとより良好な感受性が得られるので、アンカー配列内のＬＮＡヌクレオチドの位置が増幅効率に影響を及ぼすと思われる。
アンカー配列内にＰＮＡ（ペプチド核酸）ヌクレオチドを使用したアンカープライマーによるＨＩＶ ＲＮＡの増幅
アンカーの結合安定性を高めるため、ＰＮＡヌクレオチドをアンカーに組み込む。１４ヌクレオチド（ＨＩＶ１７ ＰＮＡ、表１）、１２ｎｔ（ＨＩＶ２０ ＰＮＡ、表１）、９ｎｔ（ＨＩＶ２１ ＰＮＡ、表１）および７ｎｔ（ＨＩＶ２２ ＰＮＡ、表１）のアンカー長を有するプライマーを、標準ｐ２プライマー（ＨＩＶ２、表１）と組み合わせて増幅において使用した。前記アンカー全てが完全なＰＮＡ配列を含む。増幅は実施例１で述べたように実施した。ＤＮＡアンカープライマーと比較して感受性の１０倍低下が認められたが、ＰＮＡアンカープライマーもＮＡＳＢＡにおいて機能性であることを示した（図１０）。
アンカーの結合安定性を高めるため、ＰＮＡヌクレオチドをアンカーに組み込む。１４ヌクレオチド（ＨＩＶ１７ ＰＮＡ、表１）、１２ｎｔ（ＨＩＶ２０ ＰＮＡ、表１）、９ｎｔ（ＨＩＶ２１ ＰＮＡ、表１）および７ｎｔ（ＨＩＶ２２ ＰＮＡ、表１）のアンカー長を有するプライマーを、標準ｐ２プライマー（ＨＩＶ２、表１）と組み合わせて増幅において使用した。前記アンカー全てが完全なＰＮＡ配列を含む。増幅は実施例１で述べたように実施した。ＤＮＡアンカープライマーと比較して感受性の１０倍低下が認められたが、ＰＮＡアンカープライマーもＮＡＳＢＡにおいて機能性であることを示した（図１０）。
アンカーｐ２（逆）プライマーによるＨＩＶ ＲＮＡの増幅
標準ｐ１プライマー（ＨＩＶ１、表１）と組み合わせてアンカーｐ２プライマー（ＨＩＶ２７及びＨＩＶ２９、表１）による増幅を実施した。標準ｐ２プライマー（ＨＩＶ２及びＨＩＶ２６、表１）を標準ｐ１プライマー（ＨＩＶ１、表１）と組み合わせて基準として使用した。増幅は実施例１で述べたように実施した。両方の増幅に関して、反応速度及び増幅感受性は基準増幅に比肩し得ることが認められた（図１１）。
標準ｐ１プライマー（ＨＩＶ１、表１）と組み合わせてアンカーｐ２プライマー（ＨＩＶ２７及びＨＩＶ２９、表１）による増幅を実施した。標準ｐ２プライマー（ＨＩＶ２及びＨＩＶ２６、表１）を標準ｐ１プライマー（ＨＩＶ１、表１）と組み合わせて基準として使用した。増幅は実施例１で述べたように実施した。両方の増幅に関して、反応速度及び増幅感受性は基準増幅に比肩し得ることが認められた（図１１）。
種々のアンカー長を有するアンカーｐ２プライマーによるＨＩＶ ＲＮＡの増幅
標準ｐ１プライマー（ＨＩＶ１、表１）と組み合わせて、２２−１４ヌクレオチドの範囲の種々のアンカー長を有するアンカーｐ２プライマー（ＨＩＶ２７、３１、３２、３３および２９、表１）による増幅を実施した。増幅は実施例１で述べたように実施した。ｐ２プライマーのアンカー配列を１４ヌクレオチドまで短くすることは、基準（ＨＩＶ２７アンカープライマー、表１）と比較して同等の増幅効率をもたらす（図１２）。
標準ｐ１プライマー（ＨＩＶ１、表１）と組み合わせて、２２−１４ヌクレオチドの範囲の種々のアンカー長を有するアンカーｐ２プライマー（ＨＩＶ２７、３１、３２、３３および２９、表１）による増幅を実施した。増幅は実施例１で述べたように実施した。ｐ２プライマーのアンカー配列を１４ヌクレオチドまで短くすることは、基準（ＨＩＶ２７アンカープライマー、表１）と比較して同等の増幅効率をもたらす（図１２）。
アンカーｐ１プライマー及びアンカーｐ２プライマーによるＨＩＶ ＲＮＡの増幅
アンカーｐ１プライマー（ＨＩＶ１７、表１）及びアンカーｐ２プライマー（ＨＩＶ２７及びＨＩＶ２９、表１）による増幅は、標準プライマーセット（ＨＩＶ１／ＨＩＶ２、表１）と比較して同等の増幅効率をもたらした（図１３）。増幅は実施例１で述べたように実施した。
アンカーｐ１プライマー（ＨＩＶ１７、表１）及びアンカーｐ２プライマー（ＨＩＶ２７及びＨＩＶ２９、表１）による増幅は、標準プライマーセット（ＨＩＶ１／ＨＩＶ２、表１）と比較して同等の増幅効率をもたらした（図１３）。増幅は実施例１で述べたように実施した。
アンカーｐ１プライマーによるＨＣＶ ＲＮＡの増幅
ＨＣＶ ＲＮＡの増幅に関しても、アンカーｐ１プライマーを使用するＮＡＳＢＡを設計した。アンカーｐ１プライマー（ＨＣＶ１３又はＨＣＶ４９、表２）及び通常のｐ２プライマー（ＨＣＶ２、表２）による増幅を実施した。アンカープライマーは、Ｔ７プロモーター配列の上流の１４ヌクレオチドアンカー配列及びＴ７プロモーター配列の下流の７ヌクレオチドハイブリッド形成配列から成る。標準ｐ１プライマー（ＨＣＶ１、表２）及び標準ｐ２プライマー（ＨＣＶ２、表２）による増幅を基準として使用した。分子ビーコンＨＣＶ−ＷＴ３（表２）をプローブとして使用し、インビトロで入手したＨＣＶ ＲＮＡ転写産物を投入物質として使用する。増幅は、６５℃での変性工程を２分間ではなく５分間実施したことを除いて、実施例１で述べたように実施した。感受性及び反応速度の差が認められるが、結果は、アンカー付きプライマーがＨＣＶ ＲＮＡの増幅のために使用できることを示す（図１４）。
ＨＣＶ ＲＮＡの増幅に関しても、アンカーｐ１プライマーを使用するＮＡＳＢＡを設計した。アンカーｐ１プライマー（ＨＣＶ１３又はＨＣＶ４９、表２）及び通常のｐ２プライマー（ＨＣＶ２、表２）による増幅を実施した。アンカープライマーは、Ｔ７プロモーター配列の上流の１４ヌクレオチドアンカー配列及びＴ７プロモーター配列の下流の７ヌクレオチドハイブリッド形成配列から成る。標準ｐ１プライマー（ＨＣＶ１、表２）及び標準ｐ２プライマー（ＨＣＶ２、表２）による増幅を基準として使用した。分子ビーコンＨＣＶ−ＷＴ３（表２）をプローブとして使用し、インビトロで入手したＨＣＶ ＲＮＡ転写産物を投入物質として使用する。増幅は、６５℃での変性工程を２分間ではなく５分間実施したことを除いて、実施例１で述べたように実施した。感受性及び反応速度の差が認められるが、結果は、アンカー付きプライマーがＨＣＶ ＲＮＡの増幅のために使用できることを示す（図１４）。
アンカーの結合部位と３’ハイブリッド形成配列の間に３ヌクレオチドのギャップを有するアンカーｐ１プライマーによるＨＣＶ ＲＮＡの増幅
アンカーｐ１プライマー（ＨＣＶ２２、表２）及び通常のｐ２プライマー（ＨＣＶ２、表２）による増幅を実施した。このアンカーでは、３ヌクレオチドのギャップがアンカー配列の結合部位を７ヌクレオチドの３’ハイブリッド形成配列の結合部位から隔てる。アンカーｐ１プライマーＨＣＶ１３（表２）及び標準ｐ２プライマー（ＨＣＶ２、表２）による増幅を基準として使用した。分子ビーコンＨＣＶ−ＷＴ３（表２）をプローブとして使用し、インビトロで入手したＨＣＶ ＲＮＡ転写産物を投入物質として使用する。増幅は実施例１０で述べたように実施した。結果は、３ヌクレオチドのギャップがアンカーの結合部位と３’ハイブリッド形成配列の結合部位の間に存在し得ること（図１５）及びこれらのアンカー付きプライマーが、プライマー結合部位中における保存されていないヌクレオチドを架橋するために使用できることを示す。
アンカーｐ１プライマー（ＨＣＶ２２、表２）及び通常のｐ２プライマー（ＨＣＶ２、表２）による増幅を実施した。このアンカーでは、３ヌクレオチドのギャップがアンカー配列の結合部位を７ヌクレオチドの３’ハイブリッド形成配列の結合部位から隔てる。アンカーｐ１プライマーＨＣＶ１３（表２）及び標準ｐ２プライマー（ＨＣＶ２、表２）による増幅を基準として使用した。分子ビーコンＨＣＶ−ＷＴ３（表２）をプローブとして使用し、インビトロで入手したＨＣＶ ＲＮＡ転写産物を投入物質として使用する。増幅は実施例１０で述べたように実施した。結果は、３ヌクレオチドのギャップがアンカーの結合部位と３’ハイブリッド形成配列の結合部位の間に存在し得ること（図１５）及びこれらのアンカー付きプライマーが、プライマー結合部位中における保存されていないヌクレオチドを架橋するために使用できることを示す。
Claims (17)
- 標的ＲＮＡ配列の増幅のための方法であって、
以下の段階：
（ａ）プロモーター配列を含む転写促進配列に作動可能に連結された標的ＲＮＡ配列の少なくとも第一部分に相補的であり、これにハイブリッド形成する、ハイブリッド形成配列を含む第一プライマーを標的ＲＮＡ配列にアニールする段階；
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応において前記第一プライマーを延長し、第一ＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッド核酸分子を形成する段階；
（ｃ）第一ＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッド核酸分子の標的ＲＮＡ配列を選択的に除去して、第一の一本鎖ｃＤＮＡ配列を形成する段階；
（ｄ）前記第一の一本鎖ｃＤＮＡ配列の第一部分に相補的であり、これにハイブリッド形成するハイブリッド形成配列を含む第二プライマーを、得られた第一の一本鎖ｃＤＮＡ配列にアニールする段階；
（ｅ）ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応において前記第二プライマーを延長して、第一の二本鎖ＤＮＡ分子を形成する段階；及び
（ｆ）第一プライマー内に含まれるプロモーター配列に特異性を有するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって触媒される反応において標的ＲＮＡ配列に相補的な多数のＲＮＡ転写産物の作製において、工程（ｅ）の第一の二本鎖ＤＮＡ分子を使用する段階、
を含み、
但し、第一プライマーは、５’末端から３’末端の方向に、（１）標的ＲＮＡ配列の第二部分に結合することができるアンカー、（２）標的配列に対して非特異的配列であり、プロモーター配列を含む転写促進配列、及び（３）７から１４個の連続ヌクレオチドの標的ＲＮＡ配列の第一部分に相補的な７から１４ヌクレオチドから成るハイブリッド形成配列から構成され；及び／又は第二プライマーは、５’末端から３’末端の方向に、（１）第一の一本鎖ｃＤＮＡの第二部分に結合することができるアンカー、（２）標的配列に対して非特異的配列である増幅促進配列、及び（３）７から１４個の連続ヌクレオチドの第一の一本鎖ｃＤＮＡの第一部分に相補的な７から１４ヌクレオチドから成るハイブリッド形成配列から構成され；
転写促進配列及び増幅促進配列は、第一プライマー及び／又は第二プライマーが標的ＲＮＡ配列に結合すると、そのプライマーのアンカーとハイブリッド形成配列の間にループを形成し；並びに
標的ＲＮＡ配列の第二部分が、０から６ヌクレオチド、好ましくは０から４ヌクレオチド、より好ましくは０から３ヌクレオチドによって、標的ＲＮＡ配列の第一部分から隔てられている、前記方法。 - 以下の段階：
（ｇ）段階（ｆ）で作製されたＲＮＡ転写産物に第二プライマーをアニールする段階；
（ｈ）ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応において前記第二プライマーを延長し、第二ＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッド核酸分子を形成する段階；
（ｉ）第二ＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッド分子のＲＮＡを選択的に除去して、第二の一本鎖ｃＤＮＡ分子を得る段階；
（ｊ）得られた第二の一本鎖ｃＤＮＡ配列に第一プライマーをアニールする段階；
（ｋ）第一プライマーを鋳型として使用して、ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応において前記第二の一本鎖ｃＤＮＡ分子の３’末端を延長し、二本鎖プロモーター部位を含む第二の部分的二本鎖ＤＮＡ分子を形成すること；及び
（ｌ）第一プライマー内のプロモーター配列に特異性を有するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって触媒される反応のおける標的ＲＮＡ配列に相補的な多数のＲＮＡ転写産物の作製において、工程（ｋ）の第二の二本鎖ＤＮＡ分子を使用する段階、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。 - 前記ハイブリッド形成配列が、７から１０個の連続ヌクレオチドの標的ＲＮＡ配列の第一部分に相補的な７から１０ヌクレオチドを含む、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アンカーが、標的ＲＮＡ配列の第二部分又は第一の一本鎖ｃＤＮＡ分子の第二部分に結合する、７から２２個のヌクレオチドから成るオリゴヌクレオチドであり、ヌクレオチドは修飾されていないか、または少なくとも１つのヌクレオチドが修飾されている、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アンカーが、７から１４個の、好ましくは９から１４個のヌクレオチドから成る、オリゴヌクレオチドである、請求項４に記載の方法。
- 前記アンカーが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、２’Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド及び／又はＬＮＡを含む、請求項４又は５に記載の方法。
- 前記アンカーがＰＮＡを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アンカーが、標的ＲＮＡ配列の第二部分又は第一の一本鎖ｃＤＮＡ分子の第二部分に結合する、タンパク質又はこれに由来するフラグメントを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質又はこれに由来するフラグメントが、ＲＮＡ結合タンパク質、ポリＣ結合タンパク質、ポリＡ結合タンパク質、及びジンクフィンガー、制限酵素及び抗体又はこのフラグメントを含むタンパク質から成る群より選択される、請求項８に記載の方法。
- 前記転写促進配列が：
５’−ＡＡＡＣＧＧＧＣＡＣＧＡＧＣ−３’
である、請求項１から９のいずれかに一項記載の方法。 - 前記増幅促進配列が：
５’−ＧＡＣＴＴＣＡＧＧＡＣＴＴＣＡＧＧ−３’
である、請求項１から９のいずれかに一項記載の方法。 - 前記プロモーター配列が、バクテリオファージＴ７プロモーター配列である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＤＮＡポリメラーゼが、鳥類骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的ＲＮＡ配列が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の部分である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的核酸が、ヒトＣ型肝炎ウイルスの部分である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＲＮＡ転写産物が、１又はそれ以上の配列特異的プローブによって検出される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記配列特異的プローブが、第二プライマーの増幅促進配列と同一の配列にハイブリッド形成する、請求項１６に記載の方法。
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