CN1898397A - 用于rna序列扩增的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于靶RNA序列扩增的方法，其中第一引物包含能够结合所述靶RNA序列的第一区段的7至14个核苷酸的杂交序列、转录增强序列和能够结合所述靶RNA序列的第二区段的锚定物，和/或其中第二引物包含7至14个核苷酸的杂交序列、扩增增强序列和能够结合第一单链cDNA的第二区段的锚定物。本发明还涉及用于靶RNA序列扩增的引物和包含所述引物中的一种或多种的试剂盒。

Description

用于RNA序列扩增的方法
本发明涉及用于扩增靶RNA序列的方法、用于扩增靶RNA序列的引物和包含一种或多种所述引物的试剂盒。
核酸扩增的方法(在所述方法中靶RNA或DNA序列得以扩增)通常应用于分子生物学、生物化学和生物技术领域，并且可能的用途非常多而且仍在不断地增加。扩增方法增加了特定靶核酸序列的拷贝数，所述靶核酸序列通常以非常少的量存在并且存在于多种多样其他核酸(包括RNA和DNA)存在的环境中。
核酸扩增方法特别适用于在诊断例如感染性疾病、遗传性疾病和各种类型的癌症中，帮助检测和定量存在于样品例如血液、精液、组织、毛发、微生物、细胞、肿瘤等中的特定靶核酸序列。此外，核酸扩增方法已用于其他领域，例如在法医科学和在考古学中或用于确立亲子关系，对可能含有微量能提供情报的靶核酸的样品进行检查。
已知几种核酸扩增技术，如聚合酶链式反应(PCR)和基于转录的扩增(TBA)，所述技术基于不同的作用机制但都依赖于一个或多个引物和靶核酸序列或其互补序列的边界的退火。通过引物中包含的连续数目的核苷酸和靶核酸序列中的连续数目的互补核苷酸的杂交提供了引物和靶核酸序列的边界的退火。
引物的有效杂交通常需要至少15个连续互补的核苷酸。如果存在较少的核苷酸，引物的特异性和非特异性退火之间的比例减少到低于这样的点，即在该点靶核酸的有效扩增不再能够发生。然而，至少15个连续互补的核苷酸的要求在只有靶序列的共有序列可被使用的情况下，特别是在当所有来自来源于生物如病毒、细菌和酵母或来源于组织样品如血液、细胞、肿瘤和淋巴液的靶核酸的基因型要被扩增的情况下，限制了例如扩增靶核苷酸的可能性。当由于遗传变异导致单个物种中的共有序列可能发生变化时，因为非互补核苷酸的存在可导致引物的低效(inefficient)杂交发生。
如果已知靶核苷酸序列的几种“遗传变异”，可鉴定核苷酸的保守区段并将其用于引物设计。然而，在一些物种(如RNA病毒)中，优选的保守区段，例如人丙型肝炎病毒的编码区的部分，有时太小而不能用于设计有效的引物。此外，甚至这些保守区段具有突变的趋势，导致引物的杂交有效性降低，该趋势在快速增殖的生物如病毒和细菌中最为明显。因此，在例如常规诊断中极不想要的扩增可能不发生，因为假阴性扩增结果可对于相关的患者造成严重的后果。
因此，很明显存在对使得能够使用靶RNA序列的小区段进行扩增的扩增方法的需要，所述方法较不易在靶序列的杂交区段上产生突变或遗传变异。
在导致本发明的研究中，已发现通过包含下列步骤的扩增方法可消除上述问题：
(a)将第一引物与靶RNA序列退火，所述第一引物包含杂交序列，该杂交序列至少与靶RNA序列的第一区段互补和杂交并与启动子序列有效地连接；
(b)在通过DNA聚合酶催化的反应中延伸所述第一引物，形成第一RNA/cDNA杂交核酸分子；
(c)选择性地除去第一RNA/cDNA杂交核酸分子的靶RNA序列，形成第一单链cDNA序列；
(d)将第二引物与获得的第一单链cDNA序列退火，所述第二引物包含与第一单链cDNA序列的第一区段互补和杂交的杂交序列；
(e)在由DNA聚合酶催化的反应中延伸所述第二引物以形成第一双链DNA分子；和
(f)在由DNA依赖性RNA聚合酶催化的反应中使用步骤(e)中的第一双链DNA分子制备多个RNA转录物，所述RNA转录物与靶RNA序列互补，所述DNA依赖性RNA聚合酶具有对于第一引物中包含的启动子序列的特异性；
其中第一引物包含7至14个核苷酸的杂交序列、转录增强序列和能够结合靶RNA序列的第二区段的锚定物，和/或其中第二引物包含7至14个核苷酸的杂交序列、扩增增强序列和能够结合第一单链cDNA的第二区段的锚定物。
根据本发明，令人惊奇地发现所述引物的至少一个中的连续杂交核苷酸数目的减少仍能允许进行可靠的扩增方法，如果所述引物额外地包含结合不是杂交核苷酸序列的靶RNA序列第二区段的锚定物，所述锚定物以这样的方式结合靶RNA序列的第二区段，即其将杂交序列暴露给第一区段。
因此除了杂交序列以外，锚定物的使用导致两步骤的退火过程：1)锚定物与称作第二区段的靶RNA序列的区段结合，和2)引物的杂交序列与称作第一区段的靶RNA序列的连续互补核苷酸杂交，这些步骤可同时发生或依次发生(即先发生步骤1然后再发生步骤2，或先发生步骤2然后再发生步骤1)。锚定物可以特异性地结合，但锚定物和杂交序列也可一起提供引物与靶RNA的特异性相互作用，例如在锚定物长度为7-14个核苷酸和杂交序列长度为13-7个核苷酸的情况下，此时锚定物和杂交序列单独地都不能进行特异性结合，但其组合是特异性的。
根据本发明，引物的杂交序列的核苷酸数目可以减少至14、13、12、11、10、9、8或7个核苷酸。由于引物中锚定物的存在，导致引物和靶核苷酸序列产生特异性结合，而不用顾及杂交部分最多只含有14个核苷酸从而其自身不能进行特异性杂交这样的事实。因此，通过锚定物和杂交序列的组合可实现引物和靶序列的特异性结合。
参考图16，进一步解释本发明的方法，其中显示了该方法的优选实施方案。在第一步骤期间，存在于第一引物(P1)(通常称为正向引物)中的PNA锚定物结合靶RNA序列(RNA+)的区段。接着，第一引物的杂交序列(H)和所述靶RNA序列的第一区段杂交。
在第一引物和靶RNA序列退火之后，使用DNA聚合酶例如禽成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶聚合酶延伸引物。DNA聚合酶将拷贝靶RNA分子，形成第一RNA/cDNA杂交分子。
同时或随后，优选地通过使用例如RNA酶的酶促消化选择性地除去靶RNA序列。所得的第一单链cDNA序列(DNA-)在扩增方法的随后步骤中用作模板。
该随后步骤需要第二引物(P2)(通常称为反向引物)和形成的第一单链cDNA退火。根据所显示的实施方案，第二引物也包含和单链cDNA的第一区段互补和杂交的杂交序列(H)、扩增增强序列(X)和能够与第一单链cDNA序列的第二区段特异性结合的PNA锚定物。
根据本发明，第一和第二引物都，或只有第一或第二引物，可包含短的杂交序列和锚定物。
在扩增方法的后续步骤中，使用第一单链cDNA序列作为模板通过AMV逆转录酶聚合酶延伸第二引物，产生包含来源于第一引物的双链启动子序列的第一双链DNA分子。
通过DNA依赖性RNA聚合酶，该第一双链DNA分子随后用于制备大量的RNA转录物(RNA-)。启动子位点下游的序列用作模板，意味着RNA转录物不包含正向引物的锚定物序列。
DNA依赖性RNA聚合酶的选择依赖于第一引物中启动子序列的选择，这对本领域技术人员来说是显而易见的。在本发明的优选的实施方案中，启动子序列是T7启动子序列，DNA依赖性RNA聚合酶是T7聚合酶。
在进一步优选的实施方案中，本发明的方法还包括下列步骤：
(g)将第二引物和产生于步骤(f)中的RNA转录物退火；
(h)在由DNA聚合酶催化的反应中延伸第二引物形成第二RNA/cDNA杂交核酸分子；
(i)选择性地除去第二RNA/cDNA杂交分子的RNA以获得第二单链cDNA分子；
(j)将第一引物和获得的第二单链cDNA序列退火；
(k)使用第一引物作为模板，在由DNA聚合酶催化的反应中延伸第二单链cDNA分子的3’末端，形成包含双链启动子位点的第二部分双链DNA分子；
(l)在由DNA依赖性RNA聚合酶催化的反应中，使用步骤(k)的第二部分双链DNA分子制备多个与靶RNA序列互补的RNA转录物，所述DNA依赖性RNA聚合酶具有对于第一引物中的启动子序列的特异性。
这些本发明的扩增方法中的另外的步骤导致了也在图16B中示意性显示的靶RNA序列的自支持性(或循环性)扩增。
在本发明的一个优选实施方案中，第一引物从5’末端至3’末端包含锚定物、转录增强序列和由与7至14个连续核苷酸的靶RNA序列的第一区段互补的7至14个核苷酸构成的杂交序列。
在另一个优选的实施方案中，第二引物从5’末端至3’末端包含锚定物、扩增增强序列和由与7至14个连续核苷酸的第一单链cDNA序列的第一区段互补的7至14个核苷酸构成的杂交序列。
优选地，第一和第二引物的杂交序列分别包含与7至10个连续核苷酸的RNA靶序列或第一单链cDNA序列的第一区段互补的7至10个核苷酸。
由于锚定物的存在，引物能够特异性地结合靶RNA序列。由于其较短的长度，单独的杂交序列不能特异性地结合。
根据本发明，锚定物可以是能够结合靶RNA序列的第二区段的任何化合物。优选地，锚定物是可选地经修饰的寡核苷酸或蛋白质。优选的是可选地经修饰的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含7-22个可选地经修饰的核苷酸，更优选地7-14个、最优选地9-14个核苷酸，所述寡核苷酸结合靶RNA序列的第二区段或单链cDNA序列的第二区段。本领域技术人员理解，对于锚定物的结合，不要求锚定物中的所有核苷酸都与靶RNA序列的第二区段中的对应序列互补。因此，为了引物与靶RNA序列的特异性结合，大约至少90％的锚定物的核苷酸应当是互补的。这使得可以更灵活地选择第二区段而不影响扩增方法的功效。
锚定物的核苷酸可以是RNA和DNA或经修饰的核苷酸，例如封闭的核酸(locked nucleic acid，LNA)或2’-O-甲基修饰的核苷酸，或肽核酸(PNA)。这些修饰提供了更稳定的锚定物或增加了引物的特异性结合特性。
展示与核酸序列的特异性结合的蛋白质或来源于其的片段也可用作锚定物。可通过例如蛋白质工程选择或设计能够和靶RNA序列的第二区段或第一单链cDNA序列的第二区段结合的蛋白质或来源于其的片段。这些蛋白质的例子是polyC结合蛋白、polyA结合蛋白、包含一个或多个锌指的蛋白、限制酶、和/或抗体及其片段例如scFvs、Fabs等。
靶核酸序列的第一和第二区段优选地由0、1、2、3、4、5或6个核苷酸，更优选地由0、1、2、3或4个核苷酸和最优选地由0、1、2或3个核苷酸隔开。当两个区段之间存在超过6个核苷酸时，两步骤的引物退火的效率会降低，从而扩增的效率降低。
在扩增期间产生的单链RNA转录物特别适合采用使用序列特异性探针的基于杂交的检测系统来检测。可在扩增的末期使用电化学发光(ECL)进行检测。使用通过链亲和素-生物素相互作用而附着在磁珠上的特异性捕捉探针来固定RNA转录物，和钌标记的检测探针与转录物杂交。也可使用其他目前已知的检测方法，例如“酶联凝胶测定法”(ELGA)或荧光光谱学。
非常讲究的检测方法是使用分子信标。分子信标是在5’末端标记有荧光团的DNA寡核苷酸。所述序列的3’末端的最末部分与5’末端的最先部分互补并以这样的方式形成发夹茎(hairpin stem)，即在3’末端的淬灭基团吸收荧光团的发射光。发夹环序列与RNA转录物的靶序列互补。因为环序列与靶序列的结合，发夹茎打开从而淬灭基团与荧光团分开。通过荧光计可检测发射光的增加。在扩增期间，发生与RNA转录物的杂交，使得可进行“实时”检测。为确定样品中靶核酸的量，可放入校准物(calibrator)，在分离核酸前加入所述校准物并且将其与靶核酸一起共提取和共扩增。
检测探针可以是靶特异性探针或可以是通有探针(genericprobe)，即针对整合入RNA转录物中的通有序列(generic sequence)例如和扩增增强序列一样的序列的探针。
因此，在本发明方法的优选实施方案中，靶特异性探针与RNA转录物杂交，该RNA转录物和靶RNA序列互补。根据另一优选的实施方案，通有探针和与第二引物的扩增序列一样的序列杂交，使得能够使用一个序列特异性探针检测多种多样不同的经扩增的靶RNA序列。这导致产生了节约成本的检测方法(合成检测探针通常是相对较昂贵的)，并增加了可重复和定量的检测的机会，因为无论怎样的起始材料或靶RNA序列，探针的结合特性在每一种扩增方法中是相当的。
本发明的扩增方法优选地用于病毒的靶RAN序列的扩增，例如从人免疫缺陷病毒(HIV)分离的RNA或从人丙型肝炎病毒分离的RNA，所述病毒只有部分保守的核酸序列。
本发明还涉及包含锚定物和杂交序列的引物。本发明的引物优选地从5’末端至3’末端包含如上所述的锚定物，如下所述的转录增强序列或扩增增强序列，和如上所述的7至14个核苷酸、优选地7至10个核苷酸的杂交序列。
包含锚定物和杂交序列的引物的用途不限于基于转录的扩增(TBA)，这些引物还可用于其他的扩增方法如逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)。
根据本发明的另一方面，本发明涉及用于扩增和/或检测靶RNA序列的试剂盒，其包含至少一种或多种本发明的引物。
本发明的试剂盒还可包含一种或多种序列特异性探针、扩增缓冲液、和/或一种或多种酶例如DNA聚合酶、RNA酶H和DNA依赖性RNA聚合酶。
定义
根据本发明，靶RNA序列定义为要通过扩增方法进行扩增的RNA的特异性区段。
杂交定义为存在于例如引物中的连续数目的核苷酸与例如靶RNA序列中的互补性核苷酸的结合。杂交导致双链核酸分子的形成。
退火定义为引物和靶核酸序列通过例如杂交的缔合。
特异性结合定义为在所使用的条件下，和化合物(例如引物、或引物的部分)与随机的核苷酸序列的结合相比，所述化合物与特异性寡核苷酸序列的优先结合。因此如果化合物只结合一种和相同的核苷酸序列那么所述化合物特异性地(与该核苷酸序列)结合。
如果核酸序列的所有单个核苷酸都是互补的，那么核酸序列就称为互补的，例如寡核苷酸序列读为5’-ATG ACC TGG-3’和互补的寡核苷酸序列读为3’-TAC TGG ACC-5’。
模板定义为要被聚合酶转录的核酸分子。合成的转录物和所述核酸分子互补，或至少与所述核酸分子的一条链互补。RNA和DNA通常都是以5’至3’方向合成的。
转录增强序列是包含启动子例如T7的核酸序列，其关于靶序列是非特异性序列。转录增强序列可任选地包含嘌呤区段(主要由G和/或A组成)。其在锚定物和杂交序列之间产生环。
扩增增强序列关于靶序列是非特异性核酸，但其不包含启动子，即仅包含在锚定物和杂交序列之间产生环的随机序列。
通过下列的附图和实施例进一步举例说明本发明。这些附图和实施例无论如何不是要限定本发明。
附图
图1：显示在后面的附图的曲线图中所使用的图例。
图2：使用锚定性p1引物(图2B：HIV12，表1)或标准p1引物(图2A：HIV1，表2)的HIV RNA(RNA转录物，500、50和5cps)的扩增，两个引物都与标准p2引物(HIV2，表1)和作为探针的分子信标(HIV-MB-WT，表1)组合。无模板的样品(NT)用作负对照。
图3：锚定性p1引物HIV12(表1)和无锚定物的引物HIV11(表1)的示意图。
图4：使用标准p1引物(图4A：HIV1，表1)、锚定性p1引物(图4C：HIV12，表1)、无锚定物的p1引物(图4B：HIV11，表1)或引物HIV12和HIV11的组合(图4D)的HIV RNA(RNA转录物，500、50和5cps)的扩增。所有引物都与标准p2引物(HIV2，表1)和作为探针的分子信标(HIV-MB-WT，表1)组合。无模板的样品(NT)用作负对照。
图5：使用标准p1引物(图5A：HIV1，表1)、具有从22至7个核苷酸变化的不同锚长度的锚定性引物(HIV12(图5B)、17(图5C)、20(图5D)、21(图5E)、22(图5F)，表1)的HIV RNA(总病毒RNA，500、50和5cps)的扩增。所有引物都与标准p2引物(HIV2，表1)和作为探针的分子信标(HIV-MB-WT，表1)组合。无模板的样品(NT)用作负对照。
图6-8：使用具有从14至9个核苷酸变化的不同锚长度的锚定性引物(HIV17(图6A)、20(图7A)、21(图8A)，表1)和含有具有2’-O-甲基核苷酸的锚定物的相同引物(HIV17MET(图6B)、HIV20METa & b(图7B和C)、HIV21 METa & b(图8B和C)，表1)的HIVRNA(总病毒RNA，500、50和5cps)的扩增。所有引物都和标准p2引物(HIV2)和作为探针的分子信标(HIV-MB-WT，表1)组合。无模板的样品(NT)用作负对照。
图9：使用标准p1引物(HIV1，表1)、锚定性引物(HIV17和HIV22，表1)和含有具有LNA核苷酸的锚定物的p1引物(HIV22 LNA1-4，表1)的HIV RNA(总病毒RNA，500、50和5cps)的扩增。所有引物都与标准p2引物(HIV2，表1)和作为探针的分子信标(HIV-MB-WT，表1)组合。无模板的样品(NT)用作负对照。图9A：标准p1引物HIV1；图9B：锚定性引物HIV22 LNA1；图9C：锚定性引物HIV22 LNA2；图9D：锚定性引物HIV17；图9E：锚定性引物HIV22；图9F：锚定性引物HIV22 LNA3；图9G：锚定性引物HIV22 LNA4。
图10：使用锚定性引物(图10A：HIV17和图10C：HIV21，表1)和含有PNA锚定物的p1引物(图10B：HIV17 PNA和图10D：HIV21 PNA，表1)的HIV RNA(总病毒RNA，500、50和5cps)的扩增。所有引物都与标准p2引物(HIV2，表1)和作为探针的分子信标(HIV-MB-WT，表1)组合。无模板的样品(NT)用作负对照。
图11：使用标准p2引物(HIV2(图11A)和HIV26(图11B)，表1)和锚定性p2引物(HIV27(图11C)和HIV29(图11D)，表1)的HIV RNA(总病毒RNA，500、50和5cps)的扩增。所有引物都与标准p1引物(HIV1，表1)和作为探针的分子信标(HIV-MB-WT，表1)组合。无模板的样品(NT)用作负对照。
图12：使用具有从22至14个核苷酸变化的不同锚长度的锚定性p2引物(HIV27(图12A)、31(图12C)、32(图12D)、33(图12E)、29(图12B)，表1)的HIV RNA(总病毒RNA，500、50和5cps)的扩增。所有引物都与标准p1引物(HIV1，表1)和作为探针的分子信标(HIV-MB-WT，表1)组合。无模板的样品(NT)用作负对照。
图13：使用锚定性p1引物(HIV17，表1)和标准p2引物(HIV2，表1)(图13B)或锚定性p2引物(HIV27(图13C)和HIV29(图13D)，表1)的组合的HIV RNA(总病毒RNA，500、50和5cps)的扩增。标准引物组(HIV1/HIV2，表1)用作参照(图13A)。所有都和作为探针的分子信标(HIV-MB-WT，表1)组合。无模板的样品(NT)用作负对照。
图14：使用锚定性p1引物(HCV13(图14B)或HCV46(图14C)，表2)或标准p1引物(HCV1(图14A)，表2)的HCV RNA(RNA转录物，5×105、5×104和5×103cps)的扩增。两种引物都与标准p2引物(HCV2，表2)和作为探针的分子信标(HCV-WT3，表2)组合。无模板的样品(NT)用作负对照。
图15：使用在锚序列和3’杂交序列之间具有3nt的缺口的锚定性p1引物(HCV22(图15B)，表2)的HCV RNA(RNA转录物，5×106和5×105cps)的扩增。锚定性p1引物HCV13(图14A)(表2)用作参照。两种锚定的引物都与标准p2引物(HCV2，表2)和分子信标(HCV-WT3，表2)组合。无模板的样品(NT)用作负对照。
图16：显示本发明的优选实施方案的示意图。P1：第一引物；Y：转录增强序列；T7：T7启动子序列，H：杂交序列；P2：第二引物；X：扩增增强序列；H：杂交序列。
实施例
实施例1
使用锚定性p1引物的HIV RNA的扩增
将Scott Layne HIV颗粒(使用裂解缓冲液(NucliSens，BioMérieux)裂解的经HIV感染的细胞(Layne等人(1992)，Virology 189：695-714))或HIV gag RNA转录物用作用于扩增的输入材料。检测500、50和5cps的输入材料。在NASBA缓冲液(40mM Tris-HCl pH 8.5、12mM MgCl2、70mM KCl、15％v/v DMSO、5mM DTT、1mM每种dNTP、2mM ATP、2mM CTP、2mM UTP、1.5mMGTP、0.5mM ITP、0.2μM的每种引物(正向引物(P1)和反向引物(P2)，表1)、0.1μM分子信标探针(HIV-MB-WT，表1))中进行扩增。将混合物在65℃下温育2分钟以使RNA变性，在41℃下温育2分钟使P1引物和靶杂交。然后，加入NASBA酶(0.08单位的RNA酶H、32个单位的T7RNA聚合酶、6.4个单位的AMV逆转录酶和2.1μg BSA)，通过轻柔拍打和短暂的离心混合反应混合物，然后开始进行扩增和实时检测。将反应混合物在41℃下在NucliSens EasyQ分析仪(NucliSens，BioMerieux)中温育60分钟，每一分钟进行荧光监控。在485nm处激发反应体系并在518nm处测量发射信号。
进行使用锚定性p1引物(HIV12，表1)和标准p2引物(HIV2，表1)的组合的扩增。所述锚定性引物由T7启动子序列上游的22nt锚序列和T7启动子序列下游的7nt杂交序列构成。使用标准p1引物(HIV1，表1)和标准p2引物(HIV2，表1)的扩增用作参照。结果显示使用锚定性引物的扩增的灵敏性可与参照引物的相比(图2)。
实施例2
使用具有非常短的杂交序列的p1引物的HIV RNA的扩增
进行使用与HIV12同一但无锚序列、只含有7个核苷酸的3’杂交靶特异性序列的p1引物(HIV11，表1，图3)和标准p2引物(HIV2，表1)的组合的扩增。HIV1和HIV12(表1)用作参照。扩增如实施例1中所述进行。如图4所示，使用引物HIV11未观察到扩增(图4B)，表明锚序列是有效扩增所必需的。假定锚定物在反应的起始过程中是必需的而在循环阶段不是必需的。因此，在反应的循环阶段加入非锚定的引物可以是有利的。当在同一个相同的扩增反应中同时使用锚定性引物HIV12和引物HIV11时，观察到反应动力学的稍许提高(图4D)。
实施例3
使用具有不同锚长度的锚定性p1引物的HIV RNA的扩增
为研究仍能导致特异性扩增的锚定物的最小长度，设计具有不同锚长度的引物。进行使用具有从22至7个核苷酸变化的不同锚长度(从5’端进行缺失)的锚定性引物(HIV12、15、16、17、20、21、22，表1)和标准p2引物(HIV2，表1)的组合的扩增。标准p1引物HIV1(表1)用作参照。扩增如实施例1中所述进行。和参照(HIV1标准引物和HIV12锚定性引物)相比，缺失直至14个核苷酸仍能产生有效的扩增(图5)。然而，低于14个核苷酸的锚长度显示非常低的扩增或无扩增。预期14个核苷酸或更多个核苷酸的杂交温度高于41℃(扩增温度)。更短的锚定物可具有低于41℃的杂交温度，这可能解释了低效扩增的原因。
实施例4
使用在锚序列上采用2’-O-甲基修饰的核苷酸的锚定性p1引物的HIV RNA的扩增
为了增加锚定物的结合效率，将2’-O-甲基修饰的核苷酸整合入锚定物中。在扩增中使用具有14nt(HIV17 MET，表1)、12nt(HIV20 METa& b，表1)、9nt(HIV21 METa & b，表1)和7nt(HIV22 METa & b)的锚长度的引物。每整合一个2’-O-甲基修饰的核苷酸，预期的解链温度增加大约1.5℃。标准p2引物(HIV2，表1)用作反向引物。如实施例1中描述的一样进行扩增。使用这些具有2’-O-甲基修饰的核苷酸的锚定性引物明显地提高了扩增反应的灵敏性(图6-8)，特别是当使用短于14个核苷酸的锚定物(12 & 9nt锚定物HIV20 MET和HIV21MET)时。具有经2’-O-甲基修饰的核苷酸的7nt锚定性引物(HIV22 MET)因为太短而不能有效扩增(结果未显示)。7个核苷酸的锚定物，即使具有2’-O-甲基修饰的核苷酸，可能还是具有低于41℃的杂交温度，这解释了低效的扩增。
实施例5
使用在锚序列上采用LNA(封闭的核酸)核苷酸的锚定性p1引物的HIV RNA的扩增
为了增加锚定物的结合效率，将LNA核苷酸整合入锚定物。每整合一个LNA核苷酸，预期的Tm增加大约3-8℃。在扩增中使用锚长度为7nt的4种不同的锚定性p1引物(HIV22 LNA 1t/m4，表1)。对所有这些锚定性p1引物和标准p2引物的组合进行检测。扩增如实施例1中所述进行。和7nt DNA锚定性引物HIV22相比，LNA锚定性引物明显地导致提高的扩增灵敏性(表1)(图9)。和14nt锚定性引物HIV17(表1)或标准p1引物HIV1(表1)相比，这些LNA锚定性引物的表现较差。LNA核苷酸在锚序列中的位置似乎影响了扩增效率，因为和引物HIV22 LNA1和2(表1)相比，使用锚定性引物HIV22 LNA3和4(表1)获得了更好的灵敏性。
实施例6
使用在锚序列上采用PNA(肽核酸)的锚定性引物的HIV RNA的扩增
为了增加锚定物的结合稳定性，将PNA核苷酸整合入锚定物中。在扩增中使用具有14nt(HIV17 PNA，表1)、12nt(HIV20 PNA，表1)、9nt(HIV21 PNA，表1)和7nt(HIV22 PNA，表1)的锚长度的引物和标准p2引物(HIV2，表1)的组合。所有的锚定物含有完全的PNA序列。如实施例1中所描述的进行扩增。尽管和DNA锚定性引物相比，观察到敏感性降低了10倍，但也显示出PNA锚定的引物在NASBA中是有功能的(图10)。
实施例7
使用锚定性p2(反向)引物的HIV RNA的扩增
进行使用锚定性p2引物(HIV27和HIV29，表1)和标准p1引物(HIV1，表1)的组合的扩增。标准p2引物(HIV2和HIV26，表1)和标准p1引物(HIV1，表1)的组合用作参照。如实施例1中所描述的进行扩增。对于两组扩增，都观察到和参照扩增相当的动力学和扩增灵敏性(图11)。
实施例8
使用具有不同锚长度的锚定性p2引物的HIV RNA的扩增
进行使用具有从22至14个核苷酸变化的不同锚长度的锚定性p2引物(HIV27、31、32、33和29，表1)和标准p1引物(HIV1，表1)的组合的扩增。如实施例1中所描述的进行扩增。和参照(HIV27锚定性引物，表1)相比，将p2引物的锚序列缩短至14个核苷酸导致相当的扩增效率(图12)。
实施例9
使用锚定性p1引物和锚定性p2引物的HIV RNA的扩增
和标准引物组(HIV1/HIV2，表1)相比，使用锚定性p1引物(HIV17，表1)和锚定性p2引物(HIV27和HIV29，表1)的扩增导致相当的扩增效率(图13)。如实施例1中所描述的进行扩增。
实施例10
使用锚定性p1引物的HCV RNA的扩增
为了HCV RNA的扩增，也利用锚定性p1引物设计NASBA。进行使用锚定性p1引物(HCV13或HCV49，表2)和正常的p2引物(HCV2，表2)的扩增。锚定性引物由T7启动子序列上游的14nt锚序列和T7启动子序列下游的7nt杂交序列组成。使用标准p1引物(HCV1，表2)和标准p2引物(HCV2，表2)的扩增用作对照。分子信标HCV-WT3(表2)用作探针，体外获得的HCV RNA转录物用作输入物。如实施例1中所描述的一样进行扩增，除了在65℃下进行变性步骤5分钟(而不是2分钟)。尽管观察到灵敏性和动力学上的差异，但结果显示锚定的引物可用于HCV RNA的扩增(图14)。
实施例11
使用在锚定物的结合位点和3’杂交序列之间具有3nt的缺口的锚定性p1引物的HCV RNA的扩增
进行使用锚定性p1引物(HCV22，表2)和正常的p2引物(HCV2，表2)的扩增。在该锚定物中，3nt的缺口将锚序列的结合位点与7nt3’杂交序列的结合位点分开。使用锚定性p1引物HCV13(表2)和标准p2引物(HCV2，表2)的扩增用作参照。分子信标HCV-WT3(表2)用作探针，体外获得的HCV RNA转录物用作输入物。如实施例10中所描述的一样进行扩增。结果显示，3nt的缺口可存在于锚定物的结合位点和3’杂交序列的结合位点之间(图15)，并且这些锚定的引物可用于将非保守核苷酸架在引物结合位点上。
表1
Figure A20048003857700221
靶特异性序列用粗体表示，T7启动子序列用斜体表示，Y序列(p1引物)或X序列(p2引物)用斜体并加下划线表示，锚定物中经修饰的核苷酸具有灰色背景
表2
  NR°   序列5’-＞3’
  标准引物
  HCV1(p1)   AATTCTAATACGACTCACTATAGGG CAAGCACCCTATCAGGCAGTA
  HCV2(p2)   GTCTAGCCATGGCGTTAGTA
  锚定性p1引物
  HCV13   CAAGCACCCTATCA AATTCTAATACGACTCACTATAGGG  AAGAGGGCACGAGC GGCAGTA
  HCV22   TCGCAAGCACCCTA AATTCTAATACGACTCACTATAGGG  AAGAGGGCACGAGC GGCAGTA
  HCV49   CAAGCACCCTATCA AATTCTAATACGACTCACTATAGGG  AAACGAGCACGAGC GGCAGTA
  用于实时检测的分子信标
  HCV WT3   gctagc ATTTGGGCGTGCCCCCGCIAGA gctagc(5’FAM/3′dabcyl标记的)
靶特异性序列用粗体表示，T7启动子序列用斜体表示，Y序列(p1引物)或X序列(p2引物)用斜体并加下划线表示

Claims (33)

1.用于扩增靶RNA序列的方法，其包括下列步骤：
(a)将第一引物与靶RNA序列退火，所述第一引物包含杂交序列，该杂交序列至少与靶RNA序列的第一区段互补和杂交，与启动子序列有效地连接；
(b)在通过DNA聚合酶催化的反应中延伸所述第一引物，形成第一RNA/cDNA杂交核酸分子；
(c)选择性地除去第一RNA/cDNA杂交核酸分子的靶RNA序列，形成第一单链cDNA序列；
(d)将第二引物与获得的第一单链cDNA序列退火，所述第二引物包含与第一单链cDNA序列的第一区段互补和杂交的杂交序列；
(e)在由DNA聚合酶催化的反应中延伸所述第二引物以形成第一双链DNA分子；和
(f)在由DNA依赖性RNA聚合酶催化的反应中使用步骤(e)中的第一双链DNA分子制备多个RNA转录物，所述RNA转录物与靶RNA序列互补，所述DNA依赖性RNA聚合酶具有对于第一引物中包含的启动子序列的特异性；
其中第一引物包含7至14个核苷酸的杂交序列、转录增强序列和能够结合靶RNA序列的第二区段的锚定物，和/或其中第二引物包含7至14个核苷酸的杂交序列、扩增增强序列和能够结合第一单链cDNA的第二区段的锚定物。
2.权利要求1所述的方法，其还包括步骤：
(g)将第二引物和产生于步骤(f)中的RNA转录物退火；
(h)在由DNA聚合酶催化的反应中延伸第二引物形成第二RNA/cDNA杂交核酸分子；
(i)选择性地除去第二RNA/cDNA杂交分子的RNA以获得第二单链cDNA分子；
(j)将第一引物和获得的第二单链cDNA序列退火；
(k)使用第一引物作为模板，在由DNA聚合酶催化的反应中延伸第二单链cDNA分子的3’末端，形成包含双链启动子位点的第二部分双链DNA分子；
(l)在由DNA依赖性RNA聚合酶催化的反应中，使用步骤(k)的第二部分双链DNA分子制备多个与靶RNA序列互补的RNA转录物，所述DNA依赖性RNA聚合酶具有对于第一引物中的启动子序列的特异性。
3.权利要求1或2所述的方法，其中第一引物从5’末端至3’末端包含锚定物、转录增强序列和杂交序列，所述杂交序列由与7至14个连续核苷酸的靶RNA序列的第一区段互补的7至14个核苷酸构成。
4.权利要求1或2所述的方法，其中所述第二引物从5’末端至3’末端包含锚定物、扩增增强序列和杂交序列，所述杂交序列由与7至14个连续核苷酸的第一单链cDNA序列的第一区段互补的7至14个核苷酸构成。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述杂交序列包含与7至10个连续核苷酸的靶RNA序列的第一区段互补的7-10个核苷酸。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述锚定物是可选地经修饰的寡核苷酸，其包含7至22个可选地经修饰的核苷酸，所述寡核苷酸结合靶RNA序列的第二区段或结合第一单链cDNA分子的第二区段。
7.权利要求6所述的方法，其中所述锚定物是可选地经修饰的寡核苷酸，其包含7至14个，优选地9至14个可选地经修饰的核苷酸。
8.权利要求6或7所述的方法，其中所述锚定物包括DNA、RNA、2’O-甲基修饰的核苷酸和/或LNA。
9.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述锚定物包括PNA。
10.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述锚定物包括蛋白质或来源于其的片段，其结合靶RNA序列的第二区段或第一单链cDNA分子的第二区段。
11.权利要求10所述的方法，其中所述蛋白质或来源于其的片段选自RNA结合蛋白、polyC结合蛋白、polyA结合蛋白和包含锌指的蛋白、限制酶和抗体或其片段。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述第二区段通过0至6个核苷酸，优选地0至4个核苷酸，更优选地0至3个核苷酸与第一区段隔开。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述转录增强序列读为：5’-AAACGGGCACGAGC-3’。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述扩增增强序列读为：5’-GACTTCAGGACTTCAGG-3’。
15.前述权利要求1至14中任一项的方法，其中所述启动子序列是噬菌体T7启动子序列。
16.前述权利要求1至15中任一项的方法，其中所述DNA聚合酶是禽成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶。
17.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述靶RNA序列是人免疫缺陷病毒(HIV)的片段。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述靶核酸是人丙型肝炎病毒的片段。
19.前述权利要求1-18中任一项的方法，其中通过一种或多种序列特异性探针检测所述RNA转录物。
20.权利要求19所述的方法，其中所述序列特异性探针和与第二引物的扩增序列一样的序列杂交。
21.包含杂交序列和锚定物的引物，所述杂交序列与靶RNA序列的第一区段互补和杂交，所述锚定物结合所述靶RNA序列的第二区段。
22，一种引物，其从5’末端至3’末端包含锚定物、转录增强序列或扩增增强序列和7-14个核苷酸、优选地7-10个核苷酸的杂交序列。
23.权利要求21或22所述的引物，其中所述锚定物是可选地经修饰的寡核苷酸，其包含7至22个可选地经修饰的核苷酸，所述寡核苷酸结合所述靶RNA序列的第二区段或所述第一单链cDNA分子的第二区段。
24.权利要求23所述的引物，其中所述锚定物是可选地经修饰的寡核苷酸，其包含7至14个，优选地9至14个可选地经修饰的核苷酸。
25.权利要求21或22所述的引物，其中所述锚定物包括DNA、RNA、2’O-甲基修饰的核苷酸和/或LNA核苷酸。
26.权利要求21或22所述的引物，其中所述锚定物包括PNA。
27.权利要求21或22所述的引物，其中所述锚定物包括蛋白质或来源于其的片段，其能够特异性地结合所述靶RNA序列的第二区段或所述第一单链cDNA序列的第二区段。
28.权利要求28所述的引物，其中所述蛋白质或来源于其的片段选自RNA结合蛋白、polyC结合蛋白、polyA结合蛋白和包含锌指的蛋白、限制酶和抗体或其片段。
29.权利要求21-29中任一项的引物，其中所述转录增强序列读为：5’-AAACGGGCACGAGC-3’。
30.权利要求21-30中任一项的引物，其中所述扩增增强序列读为：5’-GACTTCAGGACTTCAGG-3’。
31.权利要求21-31中任一项的引物，其中所述启动子序列是噬菌体T7启动子序列。
32.用于扩增和/或检测靶RNA序列的试剂盒，其包含权利要求21-32所述的至少一种或多种引物。
33.权利要求33所述的试剂盒，其还包含一种或多种序列特异性探针、扩增缓冲液和/或一种或多种酶。
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