CN1745180A

CN1745180A - 用于表达基因检测的信号扩增方法

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Publication number: CN1745180A
Application number: CN200480003402.1A
Authority: CN
Inventors: 薄井贡; 藤川利彦
Original assignee: Eisai Co Ltd
Current assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Priority date: 2003-02-14
Filing date: 2004-02-13
Publication date: 2006-03-08
Anticipated expiration: 2024-02-13
Also published as: JP4351210B2; EP1593746B1; AU2004212083A1; KR20050103904A; EP1593746A1; EP1593746A4; JPWO2004072302A1; CA2515734C; WO2004072302A1; KR101050510B1; CA2515734A1; US20060035235A1; CN1745180B; AU2004212083B2

Abstract

本发明提供一种用于表达基因检测的信号扩增方法，不需要高价的酶，而能够低成本、容易操作、在短时间内进行检测，另外由于不使用线性扩增法或PCR法，可以根据原来RNA的长度、表达量进行检测。所述方法是利用逆转录反应以及通过寡核苷酸·探针的自集合形成自集合体的自集合反应，使DNA芯片的表达基因的检测灵敏度提高的方法。

Description

用于表达基因检测的信号扩增方法

技术领域

本发明涉及用于表达基因检测的信号扩增方法，更详细地讲，涉及利用通过寡核苷酸引起的自集合反应，可以使检测灵敏度提高，根据靶RNA的长度以及表达量来检测目的基因的用于表达基因检测的信号扩增方法。

背景技术

通常，使用DNA芯片的表达基因的检测，使用只含有聚dT的引物或随机引物，通过逆转录反应，将整合了用Cy3或Cy5等荧光物质标记的核酸的标记cDNA作为探针。另外，对于微量的样品，一般是使用线性扩增法合成反义RNA(参照例如林崎良英监修，“DNA微阵列实用手册”羊土社、2000年12月1日，p.80-90)。然而，线性扩增法是第1链cDNA合成后，使用RNaseH、DNA聚合酶I、DNA连接酶3种酶，合成第2链cDNA，最终通过RNA聚合酶进行体外转录反应，对反义RNA进行扩增的方法，但存在着必须用多种高价的酶，在其操作上也非常烦杂的缺点。另外，当样品为极微量时，必须要重复多次进行该线性扩增法。存在着通过线性扩增法得到的反义RNA有变得比原来RNA短的倾向，不能正确反映原来RNA长度的问题。

另外，本发明人等报告了不使用酶的新的等温核酸扩增法(参照例如美国专利第6,261,846号公报、专利第3267576号公报、以及欧洲专利申请公开第1,002,877A号说明书)。该方法是使用由3处区域构成的一对寡核苷酸(HoneyComb Probe，以下称为HCP)的方法，在碱基序列上想办法使得第1HCP和第2HCP的各3处区域含有彼此互补的碱基序列，当使两者反应时，只与区域中的一处进行杂交。通过这样的办法，使许多的成对的HCP反应时，彼此进行杂交，通过HCP的自集合反应而形成集合体(Probe alternation link self-assembly reaction，以下将通过该HCP的自集合反应形成集合体的形成法称为PALSAR法)。

发明内容

本发明的目的在于提供不需要高价的酶，而能够低成本、容易操作、在短时间进行检测，另外由于不使用线性扩增法或PCR法，可以根据原来RNA的长度以及表达量进行检测的用于表达基因检测的信号扩增方法。

为了解决上述课题，本发明的用于表达基因检测的信号扩增方法的第1方式特征是：利用逆转录反应以及通过寡核苷酸·探针的自集合形成自集合体的自集合反应，使DNA芯片、DNA微阵列、微孔或球状珠(在本发明中，将DNA芯片、DNA微阵列、微孔或球状珠总称为DNA芯片)的表达基因的检测灵敏度提高。

本发明的用于表达基因检测的信号扩增方法的第2方式特征是：作为利用逆转录反应以及通过寡核苷酸·探针的自集合形成自集合体的自集合反应，使DNA芯片的表达基因的检测灵敏度提高的方法，包括：用在3’末端含有聚dT，而且含有与上述寡核苷酸·探针可进行杂交的区域的第1探针作为引物，进行mRNA的逆转录反应，使含有cDNA区域的第2探针形成的工序；使上述mRNA从上述第2探针解离的工序；使上述第2探针与含有靶mRNA的cDNA区域互补区域的捕捉用探针杂交的工序；以及通过使用上述第2探针和上述寡核苷酸·探针的自集合反应形成自集合体的工序。

在进行通过上述自集合反应形成自集合体的工序的阶段，没有特别限定，最好是在使上述第2探针与上述捕捉用探针杂交的工序后进行。

作为上述自集合反应，第1可以使用如下所述的自集合反应，即，使用多对彼此互补的碱基序列区域由n(n≥3)处数构成的一对寡核苷酸·探针，使得它们交错地进行交叉那样杂交，寡核苷酸自集合，使双链的自集合体形成。

作为上述自集合反应，第2可以使用如下所述的自集合反应，即，具有下述第1系和第2系，所述第1系是包含多对在将No.1和No.2的一对寡核苷酸的各寡核苷酸分为3′侧区域、中央区域以及5′侧区域3个区域，以各寡核苷酸的中央区域作为彼此互补的碱基序列形成二聚体探针的同时，以3′侧区域和5′侧区域作为彼此非互补的碱基序列的一对二聚体形成用探针的第1系，

所述第2系是包含多对在将No.3和No.4的一对寡核苷酸的各寡核苷酸分为3′侧区域和5′侧区域2个区域，以各寡核苷酸的3′侧区域以及5′侧区域作为彼此非互补碱基序列的一对交联探针的第2系，

使该交联探针形成对由该二聚体形成用探针形成的二聚体可进行交联的碱基序列，通过使该探针杂交，寡核苷酸自集合，形成自集合体。

可以使上述探针的碱基序列形成为分别使第1系的No.1-寡核苷酸的3′侧区域和第2系的No.3-寡核苷酸的3′侧区域、第1系的No.2-寡核苷酸的5′侧区域和第2系的No.4-寡核苷酸的5′侧区域、第2系的No.4-寡核苷酸的3′侧区域和第1系的No.2-寡核苷酸的3′侧区域、第2系的No.3-寡核苷酸的5′侧区域和第1系的No.1-寡核苷酸的5′侧区域互补的碱基序列。

可以使上述探针的碱基序列形成为分别使第1系的No.1-寡核苷酸的3′侧区域和第2系的No.3-寡核苷酸的3′侧区域、第1系的No.2-寡核苷酸的5′侧区域和第2系的No.3-寡核苷酸的5′侧区域、第1系的No.2-寡核苷酸的3′侧区域和第2系的No.4-寡核苷酸的3′侧区域、第1系的No.1-寡核苷酸的5′侧区域和第2系的No.4-寡核苷酸的5′侧区域互补的碱基序列。

本发明的用于表达基因检测的信号扩增方法的第3方式特征是：作为利用逆转录反应以及使用彼此互补的碱基序列区域由n(n≥3)处数构成的成对寡核苷酸·探针即第1HCP以及第2HCP的许多对、通过使它们交错地进行交叉那样杂交、寡核苷酸自集合形成自集合体的自集合反应，使DNA芯片的表达基因的检测灵敏度提高的方法，使在3’末端含有聚dT，而且至少含有一部分上述第1HCP的碱基序列区域的第1探针与mRNA结合，使用逆转录酶进行逆转录反应，使至少含有一部分cDNA区域和上述第1HCP的碱基序列区域的第2探针形成，除去mRNA后，使上述第2探针与含有与靶mRNA的cDNA区域互补的区域的捕捉用探针杂交，添加上述第1HCP和上述第2HCP或上述第2HCP，通过寡核苷酸的自集合反应使自集合体形成，使信号扩增。

在本发明的信号扩增方法中，作为靶表达基因可以使用末端含有聚A的mRNA。

上述DNA芯片具有结合用于捕捉靶基因的捕捉用探针的支撑体，作为该支撑体，优选使用微滴板型、载玻片型、微粒子型、或导电性基板型等支撑体。对于上述微滴板型和微粒子型支撑体的材质可以使用塑料或聚苯乙烯等。而在载玻片型支撑体中可以使用玻璃或塑料等材料。对于导电性基板型支撑体可以使用金电极或ITO电极(indium oxide)等。

对于上述自集合体，通过使标记探针杂交，可以进一步检测上述自集合体的存在。

上述标记探针优选为用发色系酶、发光系酶、或放射性同位素标记的标记探针。

对于上述自集合体，添加具有可与核酸结合的性质的荧光物质，可以通过该荧光物质的光化学上的变化检测上述自集合体的存在。

用荧光物质预先对形成自集合体的寡核苷酸进行标记，可以通过荧光物质的光化学上的变化检测上述自集合体的存在。

用放射性同位素预先对形成自集合体的寡核苷酸进行标记，可以通过放射性同位素检测上述自集合体的存在。

用发色系酶或发光系酶预先对形成自集合体的寡核苷酸进行标记，可以通过光化学上的变化检测上述自集合体的存在。

上述寡核苷酸是由选自DNA、RNA、PNA或LNA中任一个的碱基构成。

附图说明

图1是表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的一例的流程图。

图2是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第1例中步骤200的模式图。

图3是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第1例中步骤202的模式图。

图4是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第1例中步骤204的模式图。

图5是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第1例中步骤206的模式图。

图6是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第1例中步骤210的模式图。

图7是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第1例中步骤212的模式图。

图8是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第1例中步骤214的模式图。

图9是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第2例中步骤300的模式图。

图10是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第2例中步骤302的模式图。

图11是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第2例中步骤304的模式图。

图12是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第2例中步骤306的模式图。

图13是表示实施例1以及比较例1的结果的图。

具体实施方式

以下根据附图对本发明的实施方式进行说明，由于这些实施方式是作为例子给出的，不言而喻只要是不脱离本发明的技术思想，可以各种变形都是可能的。

图1是表示本发明的用于表达基因检测的信号扩增方法的工序顺序的一例的流程图。

就象图1所示那样，首先准备在3’末端含有聚dT，而且含有与在自集合反应中使用的寡核苷酸·探针中的至少一个可杂交的区域的第1探针。用该第1探针作为引物，使它与含有聚A的mRNA结合，通过逆转录酶进行mRNA的逆转录反应(步骤100)，使由该第1探针以及该mRNA的cDNA区域构成的第2探针形成。优选使上述第1探针的5’侧的碱基序列的构成，至少部分含有在上述自集合反应中使用的寡核苷酸·探针的碱基序列。

然后，使mRNA从第2探针解离(步骤102)。作为将mRNA解离的方法没有特别限定，例如可以使用热变性、碱变性、通过RNaseH消化RNA等方法。

使解离后的第2探针和具有与靶mRNA的cDNA区域互补的区域的捕捉用探针杂交，捕捉第2探针(步骤104)。优选使捕捉用探针预先结合于支撑体上。

添加寡核苷酸·探针，通过自集合反应使与第2探针杂交的自集合体形成(步骤106)，从而可以使信号扩增。

当样品中不存在靶mRNA时，第2探针由于不与捕捉用探针结合，因此不进行信号扩增。因此，通过本发明的信号扩增方法可以确认靶mRNA的存在。另外，本发明的信号扩增方法由于不使用线性扩增法，所以可以进行与原来RNA的长度对应的检测，另外由于不用PCR法，所以也可以进行与表达量对应的信号扩增。

作为自集合反应，可以利用通过由彼此互补的3区域构成、自身自集合可以形成集合体的一对HCP进行的自集合反应(参照专利第3267576号公报、专利第3310662号公报等)。另外，也可以使用由自身形成二聚体的一对二聚体形成用探针和对由该二聚体形成用探针形成的二聚体进行交联的一对交联探针进行的自集合反应(参照特开2002-355081号公报等)。

另外，在图1中，虽然给出了在步骤104之后进行步骤106时的例子，也可以在步骤104之前或与步骤104同时进行步骤106。

图2～图8是从原理上表示本发明的用于检测表达基因的信号扩增方法的工序顺序的第1例的模式图。第1例是表示作为自集合反应利用预先使用荧光物质(22)标记的一对HCP的PALSAR法的信号扩增法，作为第1探针12a使用在3’末端含有聚dT的HCP情况的例子。

就象图2所表示的那样，为了检测靶基因的mRNA 10a，作为第1探针12a，准备3’末端含有聚dT、5’侧含有HCP的3区域的寡核苷酸·探针(HCP-1)(步骤200)，如图3所示，使3’末端含有聚dT的HCP-1(12a)结合于mRNA 10a的聚A尾巴部分(步骤202)。然后如图4所示，使用逆转录酶进行逆转录反应，制作含有mRNA的互补序列的HCP即第2探针14a后(步骤204)，象图5所示那样，将mRNA 10a解离，成为由cDNA区域和HCP区域构成的单链寡核苷酸(步骤206)。

象图6所示那样，使带有与靶基因的cDNA互补的区域的捕捉用探针16a预先结合于支撑体18上(步骤210)，如图7所示那样，使作为含有上述形成的cDNA区域的HCP的第2探针14a与捕捉用探针16a杂交(步骤212)，就象图8所示那样，添加一对中的又一方HCP(HCP-2)，通过自集合反应使自集合体20a形成(步骤214)，可以进行信号扩增。另外，当除去上述步骤206的靶mRNA，进行清洗操作时，在上述步骤214需要添加一对HCP。

在上述第1例是表示了使用将HCP-1的3区域中的3’侧区域的一部分做成聚dT的一对HCP的例子，也可以使用将HCP-1的3’侧区域都作为聚dT，HCP-2的3区域中的3’侧区域都作成聚A的一对HCP。

图9～图12是从原理上表示本发明的用于检测表达基因的信号扩增方法的工序顺序的第2例的模式图。第2例表示作为自集合反应利用使用没有用荧光物质标记的一对HCP的PALSAR法的信号扩增法，作为第1探针12b使用在3’末端含有聚dT，而且含有一个HCP的互补区域的寡核苷酸·探针情况的例子。

就象图9所表示的那样，为了检测靶基因的mRNA 10b，作为第1探针12b，准备3’末端含有聚dT、5’侧含有1个HCP的互补区域的寡核苷酸·探针(步骤300)，如图10所示，使该寡核苷酸·探针12b与mRNA10b的聚A尾巴部分结合，使用逆转录酶进行逆转录反应，制作含有mRNA的互补序列的HCP的第2探针14b(步骤302)。将mRNA10b解离，成为含有cDNA区域和HCP区域的单链寡核苷酸。

象图11所示那样，使上述第2探针14b与结合于支撑体18的捕捉用探针16b杂交(步骤304)，如图12所示那样，添加一对HCP，通过自集合反应使自集合体20b形成(步骤306)，对于形成的自集合体20b插入嵌入剂24等(步骤308)，可以进行信号扩增。另外，也可以同时进行步骤306和步骤308。

对于一对寡核苷酸·探针预先附加作为用于检测的标记物质，如¹²⁵I或³²P等放射性同位素，异羟基洋地黄毒苷配基或吖啶鎓·酯等发光物质或用于利用Cy3·Cy5等荧光物质、4-methylunbelliferyl phosphate等荧光物质的生物素等，用于利用荧光共振能量转移(FRET)的供体荧光色素和受体荧光色素，也可以检测靶基因。

通过添加具有与核酸结合性质的色素，也可以检测靶基因。使用象嵌入剂那样的具有与核酸结合的性质的荧光物质，检测靶基因是理想的。作为荧光物质，只要是具有与核酸结合的性质的荧光物质，并没有特别限定，例如，可以使用SYBR Green I stain、SYBR Green II stain、SYBR Green Goldstain、Vista Green stain、Gelstar stain、Radlant Red stain、PicoGreen、RiboGreen、011Green、Hoechst 33258(Bis-Benzimide)、Propidium Iodide、YO-PRO-1Iodide、YO-PRO-3 Iodide(以上、Molecular Probes公司生产)、溴化乙锭、Distamycin A、TOTO、Psoralen、吖啶鎓橙(Acridine Orange)、AOAO(homodimer)等。

构成上述的一对寡核苷酸的核酸，通常虽然可以由DNA或RNA构成，但即使是核酸类似物也可以。作为核酸类似物，例如肽核酸(PNA、参照例如国际公开第92/20702号单行本)或Locked Nucleic Acid(LNA，参照例如Koshkin AA et al.Tetrahedron 1998.54，3607-3630.、Koshkin AA etal.J.Am.Chem.Soc.1998.120，13252-13253.、以及Wahlestedt C etal.PNAS.2000.97，5633-5638.)。另外，一对寡核苷酸·探针，通常可以由同种类核酸构成，但即使是例如DNA探针和RNA探针构成一对也可以。即探针的核酸种类可以从DNA、RNA或核酸类似物(例如PNA或LNA等)选择。另外，在一个探针内的核酸组成不需要只是由一种、例如只是由DNA构成，根据需要，也可以使用例如由DNA和RNA构成的寡核苷酸探针(嵌合探针)，都包括在本发明中。

寡核苷酸·探针的各个互补的碱基序列区域的长度，按照碱基数来说，至少为5个碱基，优选10～100个碱基，更优选15～30个碱基。

这些探针可以通过众所周知的方法进行合成。例如DNA探针可以使用应用生物系统公司(Applied Biosystems Inc.)的DNA合成仪394型，根据phosphoamidite法进行合成。另外，作为其它的方法还有磷酸三酯法、H-磷酸酯法、巯基磷酸酯法等，用哪一种方法合成都可以。

本发明对于用DNA芯片捕捉的靶基因，可以通过具有互补区域的一对HCP形成自集合体。使用的寡核苷酸·探针的条数没有特别限定，可以使用10²～10¹⁵条。反应缓冲液的组成、浓度没有特别限定，使用核酸扩增中常用的通常缓冲液是理想的。pH也是常用的范围合适，优选pH7.0～9.0范围。反应温度为40～80℃，优选55～65℃。

本发明中的靶表达基因(mRNA)测定用样品可以使用可能含有该核酸的所有的样品。靶基因可以是从样品经适当制备或分离的样品，没有特别限定。例如，来自血液、血清、尿、粪便、脑脊髓液、组织液、细胞培养物等生物体的样品、霉菌等的带有末端含有聚A链的mRNA的所有真核生物的可能含有或感染的样品等。另外，也可以使用通过众所周知方法对样品中的靶基因进行扩增的核酸。

(实施例)

以下给出实施例，进一步对本发明进行说明，这些实施例由于是给出的例子，不言而喻不应当作为限定地解释。

以下给出了在实施例中使用的材料。

(a)靶基因：从培养细胞提取的总RNA

(b)捕捉用探针：

1)CP-1：5’-CACGAAACTACCTTCAACTCCATC-3’

2)CP-2：5’-TGCCGACAGGATGCAGAAGGA-3’

(c)引物：

1)第1探针(聚dT-HCP)(78mer)：

5’-GCATATAGATATCTCCGGCGCGGATACTTTGTGATACCGGGAGTTCGCCCTTATAACGTCTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’

2)聚dT引物(18mer)：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’

(d)HCP：

1)HCP-1(5’末端Cy3标记、60mer)

5’-Cy3-CGCCGGAGATATCTATATGCCCGGTATCACAAAGTATCCGGACGTTATAAGGGCGAACTC-3’

2)HCP-2(5’末端Cy3标记、60mer)

5’-Cy3-GCATATAGATATCTCCGGCGCGGATACTTTGTGATACCGGGAGTTCGCCCTTATAACGTC-3’

(e)聚苯乙烯制粒子珠：在一种粒子珠上固定了上述2种捕捉用探针后的粒子珠。

(实施例1)

使用从培养细胞提取的总RNA尝试利用PALSAR法对作为看家(house keeping)基因的Beta-actin进行检测。

(1)RNA的逆转录反应以及逆转录产物的纯化

使用上述的靶基因、上述第1探针、逆转录酶(SuperScriptII：invitrogene公司生产)以及反应溶液(反应缓冲液，DTT，dNTP，RNase抑制剂)于37℃下进行2小时逆转录反应。然后于65℃进行30分钟碱处理，用盐酸进行中和。使用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen公司生产)纯化逆转录产物cDNA。

(2)杂交

将[上述获得的cDNA、上述粒子珠、6×SSC、0.2％SDS、5×Denhard溶液]的组成调整到总量50μL，于42℃下进行2小时杂交。杂交结束后，用0.22μm滤膜过滤除去未反应的探针，用2×SSC+0.1％SDS溶液洗1次、用0.2×SSC溶液洗1次，用上述滤膜过滤。

然后，按照[上述获得的上述粒子珠、上述HCP-1以及2(1.5pmol/μL)、1％封闭试剂(Roche公司生产)、0.1％N-lauroylsarcosine、0.02％SDS、5×SSC]的组成(总量100μL)，于65℃下进行30分钟杂交。

(3)检测

将清洗后的粒子珠再悬浮于流式细胞仪用被覆液，用流式细胞仪测定被标记在HCP的Cy3的荧光。

(比较例1)

使用通常进行的通过聚dT引物的Cy3-dNTP整合系，进行靶基因的检测。

(1)RNA的逆转录反应和解离反应

作为引物使用上述聚dT引物，除了dNTP外，整合Cy3标记dUTP(Amercham公司生产)以外，与实施例1同样，进行逆转录反应以及逆转录产物的纯化。

(2)杂交

将[上述获得的cDNA、上述粒子珠、6×SSC、0.2％SDS、5×Denhard溶液]的组成调整到总量50μL，于42℃下进行2小时杂交。结束后，用0.22μm滤膜过滤除去未反应的探针，用2×SSC+0.1％SDS洗1次，进行过滤。

(3)检测

将清洗后的粒子珠再悬浮于流式细胞仪用被覆液，用流式细胞仪测定被标记在粒子珠上的与捕捉用探针结合的cDNA的Cy3的荧光。

[结果]

图13给出了实施例1以及比较例1的结果。荧光强度表示相对于各个种类对从203至504个粒子珠的荧光强度进行测定，给出的它们的中值(median)。就象图13所示的那样，与比较例1相比，实施例1的检测灵敏度显著提高。

产业上利用的可能性

如上所述，如果利用本发明，由于只是逆转录反应，不需要高价的酶，可以低成本、容易操作、在短时间进行检测，另外，由于不使用线性扩增法或PCR法，可以起到对应于原来RNA的长度、表达量的检测成为可能的显著效果。

序列表

图1

图2

图3

Claims

1.一种用于表达基因检测的信号扩增方法，其特征在于，利用逆转录反应和通过寡核苷酸·探针的自集合形成自集合体的自集合反应，使DNA芯片的表达基因的检测灵敏度提高。

2.一种用于表达基因检测的信号扩增方法，其特征在于，是利用逆转录反应和通过寡核苷酸·探针的自集合形成自集合体的自集合反应，使DNA芯片的表达基因的检测灵敏度提高的方法，包括：

利用在3’末端含有聚dT，而且含有与上述寡核苷酸·探针可进行杂交的区域的第1探针作为引物，进行mRNA的逆转录反应，形成含有cDNA区域的第2探针的工序；

使上述mRNA从上述第2探针解离的工序；

使上述第2探针与含有靶mRNA的cDNA区域互补区域的捕捉用探针杂交的工序；以及

通过使用上述第2探针和上述寡核苷酸·探针的自集合反应形成自集合体的工序。

3.根据权利要求1或2所述的信号扩增方法，其特征在于，上述自集合反应是如下所述的自集合反应，即，使用多对彼此互补的碱基序列区域由n(n≥3)处数构成的一对寡核苷酸·探针，通过以交错地交叉的方式杂交，寡核苷酸自集合，形成双链的自集合体。

4.一种用于表达基因检测的信号扩增方法，其特征在于，是利用逆转录反应和如下所述的自集合反应，使DNA芯片的表达基因的检测灵敏度提高的方法，所述自集合反应是使用多对彼此互补的碱基序列区域由n(n≥3)处数构成的一对寡核苷酸·探针即第1HCP以及第2HCP、通过以交错地交叉的方式杂交、寡核苷酸自集合形成自集合体的自集合反应，

使在3’末端含有聚dT，而且至少含有一部分上述第1HCP的碱基序列区域的第1探针与mRNA结合，使用逆转录酶进行逆转录反应，使至少含有一部分cDNA区域和上述第1HCP的碱基序列区域的第2探针形成，除去mRNA后，使上述第2探针和具有与靶mRNA的cDNA区域互补的区域的捕捉用探针杂交，添加上述第1HCP和上述第2HCP或上述第2HCP，通过寡核苷酸的自集合反应形成自集合体，使信号扩增。

5.根据权利要求1或2所述的信号扩增方法，其特征在于，上述自集合反应是如下所述的自集合反应，即，具有下述第1系和第2系，所述第1系是包含多对在将No.1和No.2的一对寡核苷酸的各寡核苷酸分为3′侧区域、中央区域以及5′侧区域3个区域，以各寡核苷酸的中央区域作为彼此互补的碱基序列形成二聚体探针的同时，以3′侧区域和5′侧区域作为彼此非互补的碱基序列的一对二聚体形成用探针的第1系，

6.根据权利要求5所述的信号扩增方法，其特征在于，使上述探针的碱基序列形成为分别使

第1系的No.1-寡核苷酸的3′侧区域和第2系的No.3-寡核苷酸的3′侧区域、

第1系的No.2-寡核苷酸的5′侧区域和第2系的No.4-寡核苷酸的5′侧区域、

第2系的No.4-寡核苷酸的3′侧区域和第1系的No.2-寡核苷酸的3′侧区域、

第2系的No.3-寡核苷酸的5′侧区域和第1系的No.1-寡核苷酸的5′侧区域互补的碱基序列。

7.根据权利要求5所述的信号扩增方法，其特征在于，使上述探针的碱基序列形成为分别使

第1系的No.2-寡核苷酸的5′侧区域和第2系的No.3-寡核苷酸的5′侧区域、

第1系的No.2-寡核苷酸的3′侧区域和第2系的No.4-寡核苷酸的3′侧区域、

第1系的No.1-寡核苷酸的5′侧区域和第2系的No.4-寡核苷酸的5′侧区域互补的碱基序列。

8.根据权利要求2～7中任一项所述的信号扩增方法，其特征在于，上述捕捉用探针结合于支撑体上。

9.根据权利要求8所述的信号扩增方法，其特征在于，上述支撑体是微滴板型、载玻片型、微粒子型、或导电性基板型的支撑体。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的信号扩增方法，其特征在于，对于上述自集合体，通过使标记探针杂交来检测上述自集合体的存在。

11.根据权利要求10所述的用于表达基因检测的信号扩增方法，其特征在于，上述标记探针是用发色系酶、发光系酶、或放射性同位素标记的标记探针。

12.根据权利要求1～9中任一项所述的用于表达基因检测的信号扩增方法，其特征在于，对于上述自集合体，添加具有与核酸结合的性质的荧光物质，通过该荧光物质的光化学上的变化来检测上述自集合体的存在。

13.根据权利要求1～9中任一项所述的用于表达基因检测的信号扩增方法，其特征在于，预先用荧光物质对形成自集合体的寡核苷酸进行标记，通过荧光物质的光化学上的变化来检测上述自集合体的存在。

14.根据权利要求1～9中任一项所述的用于表达基因检测的信号扩增方法，其特征在于，预先用放射性同位素对形成自集合体的寡核苷酸进行标记，通过放射性同位素来检测上述自集合体的存在。

15.根据权利要求1～9中任一项所述的用于表达基因检测的信号扩增方法，其特征在于，预先用发色系酶或发光系酶对形成自集合体的寡核苷酸进行标记，通过光化学上的变化来检测上述自集合体的存在。

16.根据权利要求1～15中任一项所述的用于表达基因检测的信号扩增方法，其特征在于，上述寡核苷酸是由选自DNA、RNA、PNA或LNA中任一个的碱基构成。