KR101050510B1 - 발현 유전자 검출을 위한 신호 증폭 방법 - Google Patents

발현 유전자 검출을 위한 신호 증폭 방법 Download PDF

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Abstract

고가인 효소를 필요로 하지 않고, 저렴하고 쉬운 조작으로 단시간에 검출할 수 있고, 게다가 리니어 증폭법이나 PCR법을 사용하지 않기 때문에 처음 RNA의 길이나 발현량에 대응한 검출을 가능하게 하는 발현유전자 검출을 위한 신호증폭방법을 제공한다. 역전사반응 및 올리고뉴클레오티드·프로브의 자기집합에 의하여 자기집합체를 형성시키는 자기집합반응을 이용하여 DNA칩에 있어서의 발현유전자의 검출감도를 향상시키도록 했다.
발현유전자, 자기집합체, 자기집합반응, 역전사반응, DNA칩, 리니어증폭법, PCR법, 올리고뉴클레오티드, 프로브, 신호증폭방법

Description

발현 유전자 검출을 위한 신호 증폭 방법{Signal amplification method for detecting expressed gene}
본 발명은 발현 유전자 검출을 위한 신호 증폭 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합반응을 이용하여 검출감도를 향상시켜서 표적 RNA의 길이 및 발현량에 대응해서 목적 유전자를 검출할 수 있는 발현 유전자 검출을 위한 신호 증폭 방법에 관한 것이다.
통상 DNA칩을 사용한 발현 유전자의 검출은 폴리 dT만을 가지는 프라이머 혹은 랜덤 프라이머를 사용하고, 역전사반응에 의하고, Cy3나 Cy5 등의 형광물질로 표지한 핵산을 넣은 표지 cDNA를 프로브로 한다. 또한, 미량의 샘플에 대해서는 리니어 증폭법을 사용하여 안티센스 RNA를 합성하는 것이 일반적이다. (예를 들면 임기양영감수, 「DNA 마이크로어레이 실전 매뉴얼」양토사(羊土社), 2000년 12월 1일, 80~90쪽 참조). 그러나 리니어 증폭법은 제 1사슬 cDNA 합성 후 RN아제H, DNA폴리멜라아제I 및 DNA리가아제의 3종류의 효소를 사용해서 제 2사슬 cDNA를 합성하고, 최종적으로 RNA폴리멜라아제에 의하여 인 비트로(in vitro) 전사반응을 실시하 여 안티센스 RNA를 증폭하는 방법인데, 고액의 효소를 다량 사용하지 않으면 안 되고, 게다가 조작도 상당히 번잡하다는 결점이 있다. 또한, 샘플이 극소량인 경우 리니어 증폭법을 여러번 반복하지 않으면 안 된다. 리니어 증폭법으로 얻어진 안티센스 RNA는 처음 RNA보다 짧아지는 경향이 있고, 처음 RNA의 길이를 정확하게는 반영하지 않는다는 문제점이 있었다.
한편, 본 발명자 등은 효소를 사용하지 않는 새로운 등온핵산증폭법을 보고했다(예를 들면, 미국특허 제6,261,846호 공보, 특허 제3267576호 공보 및 유럽특허출원공개 제1,002,877A호 명세서 참조). 이 방법은 3개소의 영역으로 구성된 1쌍의 올리고뉴클레오티드(Honey Comb Probe, 이하 HCP라고 칭한다)를 사용하는 방법으로 제 1HCP와 제 2HCP의 각각의 3개소의 영역은 서로 상보적인 염기배열을 가지고, 양자를 반응시킨 경우 영역의 1개소와만 혼성하는 모양으로 염기배열을 고안한 것이다. 이 고안에 의해 복수의 1쌍의 HCP를 반응시킨 경우 서로 혼성하여 HCP의 자기집합반응에 의해 집합체를 형성시킬 수 있다.(Probe alternation link self-assembly reaction, 이하, 이 HCP의 자기집합반응에 의한 집합체의 형성법을 PALSAR법이라고 칭한다).
본 발명은 고가인 효소를 필요로 하지 않고 저렴하고 쉬운 조작으로 단시간에 검출할 수 있고, 더욱이 리니어 증폭법이나 PCR법을 사용하지 않기 때문에 처음 RNA의 길이나 발현량에 대응한 검출을 가능하게 하는 발현 유전자 검출을 위한 신호 증폭 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 발현 유전자 검출을 위한 신호 증폭 방법의 제 1태양은 역전사반응 및 올리고뉴클레오티드·프로브의 자기집합에 의하여 자기집합체를 형성시키는 자기집합반응을 이용하여, DNA칩, DNA마이크로어레이, 마이크로웰 또는 구상(球狀) 비즈(본 발명에서는 DNA칩, DNA마이크로어레이, 마이크로웰 또는 구상 비즈를 DNA칩으로 총칭한다)에 있어서의 발현 유전자의 검출 감도를 향상시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 발현 유전자 검출을 위한 신호 증폭 방법의 제 2태양은 역전사반응 및 올리고뉴클레오티드·프로브의 자기집합에 의하여 자기집합체를 형성시키는 자기집합반응을 이용하여, DNA칩에 있어서의 발현 유전자의 검출 감도를 향상시키는 방법으로서, 3' 말단에 폴리dT를 가지고 또 상기 올리고뉴클레오티드·프로브에 혼성하는 것이 가능한 영역을 가지는 제 1프로브를 프라이머로 이용해서 mRNA의 역전사반응을 실시하여 cDNA영역을 가지는 제 2프로브를 형성시키는 공정, 상기 mRNA를 제 2프로브로부터 해리시키는 공정, 상기 제 2프로브를 표적 mRNA의 cDNA영역에 상보적인 영역을 가지는 포착용 프로브에 혼성시키는 공정 및 상기 제 2프로브와 상기 올리고뉴클레오티드·프로브를 이용한 자기집합반응에 의하여 자기집합체를 형성시키는 공정을 가지는 것을 특징으로 한다.
자기집합반응에 의하여 자기집합체를 형성시키는 공정을 실시하는 단계는 특별히 제한되지는 않지만, 제 2프로브를 포착용 프로브에 혼성시키는 공정 후에 실시하는 것이 바람직하다.
자기집합반응으로서, 첫째로 서로 상보적인 염기배열영역이 n(n≥3)개소의 수로 구성된 1쌍의 올리고뉴클레오티드·프로브 복수 쌍을 사용해서 서로 다르게 교차하도록 혼성화시키는 것에 의하여 올리고뉴클레오티드가 자기집합하여, 2가닥 사슬의 자기집합체를 형성시키는 자기집합반응을 이용할 수 있다.
자기집합반응으로서, 둘째로 No.1 및 No.2 1쌍의 올리고뉴클레오티드의 각 올리고뉴클레오티드를 3'측 영역, 중앙 영역 및 5'측 영역의 3개 영역으로 나누고 각 올리고뉴클레오티드의 중앙 영역을 서로 상보적인 염기배열로 해서 다이머프로브를 형성하는 것과 동시에 3'측 영역 및 5'측 영역을 서로 비상보적인 염기배열로 한 1쌍의 다이머 형성용 프로브를 여러 쌍 함유하는 제 1계와, No.3 및 No.4 1쌍의 올리고뉴클레오티드의 각 올리고뉴클레오티드를 3'측 영역 및 5'측 영역의 2개 영역으로 나누고 각 올리고뉴클레오티드의 3'측 영역 및 5'측 영역을 서로 비상보적인 염기배열로 한 1쌍의 가교프로브를 여러 쌍 함유하는 제 2계를 가지고, 가교프로브를 다이머 형성용 프로브에서 형성되는 다이머를 가교할 수 있는 염기배열로 하여 프로브를 혼성화시키는 것에 의하여 올리고뉴클레오티드가 자기집합하여 자기집합체를 형성시키는 자기집합반응을 이용할 수 있다.
상기 프로브의 염기배열을 제 1계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 3'측 영역과 제 2계의 No.3-올리고뉴클레오티드의 3'측 영역, 제 1계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 5'측 영역과 제 2계의 No.4-올리고뉴클레오티드의 5'측 영역, 제 2계의 No.4-올리고뉴클레오티드의 3'측 영역과 제 1계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 3'측 영역, 제 2계의 No.3-올리고뉴클레오티드의 5' 측 영역과 제 1계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 5'측 영역을 각각 상보적인 염기배열로 할 수 있다.
상기 프로브의 염기배열을 제 1계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 3'측 영역과 제 2계의 No.3-올리고뉴클레오티드의 3'측 영역, 제 1계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 5'측 영역과 제 2계의 No.3-올리고뉴클레오티드의 5'측 영역, 제 1계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 3'측 영역과 제 2계의 No.4-올리고뉴클레오티드의 3'측 영역, 제 1계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 5'측 영역과 제 2계의 No.4-올리고뉴클레오티드의 5'측 영역을 각각 상보적인 염기배열로 할 수 있다.
본 발명의 발현 유전자 검출을 위한 신호 증폭 방법의 제 3태양은 역전사반응 및 서로 상보적인 염기배열 영역이 n(n≥3)개소의 수로 구성된 1쌍의 올리고뉴클레오티드·프로브인 제 1HCP 및 제 2HCP 여러 쌍을 사용해서 서로 다르게 교차하도록 혼성화시키는 것에 의하여 올리고뉴클레오티드가 자기집합해서 자기집합체를 형성시키는 자기집합반응을 이용하여 DNA칩에 있어서의 발현유전자의 검출감도를 향상시키는 방법으로서, 3'말단에 폴리dT를 가지고 또 상기 제 1HCP의 염기배열영역을 적어도 일부분 가지는 제 1프로브를 mRNA에 결합시키고 역전사효소를 사용해서 역전사반응시켜서 cDNA영역 및 상기 제 1HCP의 염기배열영역을 적어도 일부분 가지는 제 2프로브를 형성시키고 mRNA를 제거한 후, 상기 제 2프로브를 표적 mRNA의 cDNA영역에 상보적인 영역을 가지는 포착용 프로브에 혼성화시키고, 제 1HCP 및 제 2HCP, 또는 제 2HCP를 첨가하여 올리고뉴클레오티드의 자기집합반응으로 자기집합체를 형성시켜서 신호를 증폭시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 신호증폭방법에 있어서 표적 발현유전자로서는 말단에 폴리A를 함유하는 mRNA를 사용할 수 있다.
상기 DNA칩이 타겟유전자를 포착하기 위한 포착용 프로브를 결합하는 지지체를 가지고, 지지체로서 마이크로플레이트형, 슬라이드글래스형, 미립자형 또는 전기전도성 기판형 등의 지지체를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 마이크로플레이트형과 미립자형 지지체의 재질로는 플라스틱이나 폴리스티렌 등을 사용할 수 있다. 또 슬라이드글래스형 지지체로는 유리나 플라스틱 등의 재료를 사용할 수 있다. 전기전도성 기판형 지지체에는 금전극이나 ITO전극(산화인듐전극) 등을 사용할 수 있다.
상기 자기집합체에 대하여 표지 프로브를 혼성화시키는 것에 의하여 자기집합체의 존재를 검출할 수 있다.
상기 표지 프로브가 발색계 효소, 발광계 효소 또는 방사성 동위원소로 표지한 표지 프로브인 것이 바람직하다.
상기 자기집합체에 대하여 핵산과 결합하는 성질을 가진 형광물질을 가하고 그 형광물질의 광화학적인 변화에 의하여 자기집합체의 존재를 검출할 수 있다.
자기집합체를 형성하는 올리고뉴클레오티드를 미리 형광물질로 표지하여 자기집합체의 존재를 형광물질의 광화학적인 변화에 의하여 검출할 수 있다.
자기집합체를 형성하는 올리고뉴클레오티드를 미리 방사성 동위원소로 표지하여 자기집합체의 존재를 방사성 동위원소에 의하여 검출할 수 있다.
자기집합체를 형성하는 올리고뉴클레오티드를 미리 발색계 효소 또는 발광계 효소로 표지하여 자기집합체의 존재를 광화학적인 변화에 의하여 검출할 수 있다.
상기 올리고뉴클레오티드는 DNA, RNA, PNA 또는 LNA로부터 선택되는 염기로 구성된다.
도1은 본 발명의 신호증폭방법의 공정수순의 일례를 나타내는 플로차트이다.
도2는 본 발명의 신호증폭방법의 공정수순의 제 1예에 있어서의 스텝 200을 원리적으로 나타내는 모식도이다.
도3은 본 발명의 신호증폭방법의 공정수순의 제 1예에 있어서의 스텝 202를 원리적으로 나타내는 모식도이다.
도4는 본 발명의 신호증폭방법의 공정수순의 제 1예에 있어서의 스텝 204를 원리적으로 나타내는 모식도이다.
도5는 본 발명의 신호증폭방법의 공정수순의 제 1예에 있어서의 스텝 206을 원리적으로 나타내는 모식도이다.
도6은 본 발명의 신호증폭방법의 공정수순의 제 1예에 있어서의 스텝 210을 원리적으로 나타내는 모식도이다.
도7은 본 발명의 신호증폭방법의 공정수순의 제 1예에 있어서의 스텝 212를 원리적으로 나타내는 모식도이다.
도8은 본 발명의 신호증폭방법의 공정수순의 제 1예에 있어서의 스텝 214를 원리적으로 나타내는 모식도이다.
도9는 본 발명의 신호증폭방법의 공정수순의 제 2예에 있어서의 스텝 300을 원리적으로 나타내는 모식도이다.
도10은 본 발명의 신호증폭방법의 공정수순의 제 2예에 있어서의 스텝 302를 원리적으로 나타내는 모식도이다.
도11은 본 발명의 신호증폭방법의 공정수순의 제 2예에 있어서의 스텝 304를 원리적으로 나타내는 모식도이다.
도12는 본 발명의 신호증폭방법의 공정수순의 제 2예에 있어서의 스텝 306을 원리적으로 나타내는 모식도이다.
도13은 실시예 1 및 비교예 1의 결과를 나타내는 그래프이다.
이하에 본 발명의 실시 형태를 첨부도면에 기초하여 설명하지만, 이들 실시 형태는 예시적으로 나타낸 것으로 본 발명의 기술사상으로부터 벗어나지 않는 한 다양한 변형이 가능한 것은 말할 것도 없다.
도 1은 본 발명의 발현유전자 검출을 위한 신호 증폭 방법의 공정수순의 일례를 나타내는 플로우차트이다.
도 1에 나타낸 것처럼, 우선 3'말단에 폴리dT를 가지고 또 자기집합반응에 사용되는 적어도 1개의 올리고뉴클레오티드·프로브와 혼성하는 것이 가능한 영역을 가지는 제 1프로브를 준비한다. 제 1프로브를 프라이머로 사용해서 폴리A를 함유하는 mRNA에 결합시키고, 역전사효소에 의하여 mRNA의 역전사반응을 실시하고(스텝 100), 제 1프로브 및 mRNA의 cDNA 영역으로 이루어진 제 2프로브를 형성시킨다. 제 1프로브의 5'측 염기배열을 자기집합반응에 사용되는 올리고뉴클레오티드·프로브의 염기배열을 적어도 일부분 가지도록 구성하는 것이 바람직하다.
다음으로 mRNA를 제 2프로브로부터 해리시킨다(스텝 102). mRNA를 해리하는 방법은 특별히 한정되지 않고 예를 들면, 열변성, 알칼리변성, RN아제H에 의한 RNA소화 등을 이용한 방법을 들 수 있다.
해리 후의 제 2프로브를 표적 mRNA의 cDNA 영역에 상보적인 영역을 가지는 포착용 프로브에 혼성시켜서 제 2프로브를 포착시킨다.(스텝104). 포착용 프로브를 미리 지지체에 결합시켜 두는 것이 바람직하다.
올리고뉴클레오티드·프로브를 첨가하여 자기집합반응에 의하여 제 2프로브와 혼성한 자기집합체를 형성시켜서(스텝 106) 신호를 증폭시킬 수 있다.
시료 중에 표적 mRNA가 존재하지 않는 경우 제 2프로브는 포착용 프로브와 결합하지 않기 때문에 신호 증폭은 되지 않는다. 따라서, 본 발명의 신호증폭방법에 의하여 표적 mRNA의 존재를 확인할 수 있다. 또 본 발명의 신호증폭방법은 리니어증폭법을 사용하지 않기 때문에 처음 RNA의 길이에 대응한 검출이 가능하고, 게다가 PCR법을 사용하지 않기 때문에 발현량에 대응한 신호증폭을 수행할 수 있다.
자기집합반응으로서는 서로 상보적인 3영역으로 구성되고 스스로 자기집합해서 집합체를 형성할 수 있는 한 쌍의 HCP에 의한 자기집합반응(특허 제3267576호 공보, 특허 제3310662호 공보 등 참조)을 이용할 수 있다. 또 스스로 다이머를 형성하는 한 쌍의 다이머 형성용 프로브 및 다이머 형성용 프로브에서 형성되는 다이머를 가교할 수 있는 한 쌍의 가교프로브에 의한 자기집합반응(특개2002-355081호 공보 등 참조)을 이용하는 것도 가능하다.
또 도1에 있어서는 스텝 104 후에 스텝 106을 실시한 경우의 예를 나타냈지만, 스텝 104 전 또는 스텝 104와 동시에 스텝 106을 실시하는 것도 가능하다.
도2 ~ 도8은 본 발명의 발현유전자 검출을 위한 신호증폭방법의 공정수순의 제 1예를 원리적으로 나타내는 모식도이다. 제 1예는 자기집합반응으로서 미리 형광물질(22)로 표지한 한 쌍의 HCP를 사용한 PALSAR법을 이용한 신호증폭법이고, 제 1프로브(12a)로서 3'말단에 폴리dT를 함유하는 HCP를 사용한 경우의 예를 나타낸다.
도2에 도시한 것처럼 타겟유전자인 mRNA(10a)를 검출하기 위하여 제 1프로브(12a)로서 3'말단에 폴리dT를 함유하고 5'측에 HCP의 3영역을 가지는 올리고뉴클레오티드·프로브(HCP-1)를 준비하고(스텝 200), 도3에 나타낸 것처럼, mRNA(10a)의 폴리A 꼬리부분에 3'말단에 폴리dT를 함유하는 HCP-1(12a)을 결합시킨다(스텝 202). 그 후 도4에 나타낸 것처럼 역전사효소를 사용해서 역전사반응시켜서, mRNA의 상보 배열을 가지는 HCP인 제 2프로브(14a)를 만든 후(스텝 204), 도5에 나타낸 것처럼 mRNA(10a)를 해리하여 cDNA 영역과 HCP영역으로 이루어진 한 가닥의 사슬 올리고뉴클레오티드로 한다(스텝 206).
도6에 나타낸 것처럼, 지지체(18) 위에 타겟유전자의 cDNA와 상보적인 영역을 가지는 포착용 프로브(16a)를 결합시켜 두고(스텝 210), 도7에 나타낸 것처럼 상기 형성된 cDNA 영역을 가지는 HCP인 제 2프로브(14a)를 포착용 프로브(16a)에 혼성화시키고(스텝 212), 도8에 나타낸 것처럼 한 쌍의 HCP(HCP-2)를 더 첨가하여 자기집합반응에 의하여 자기집합체(20a)를 형성시켜서(스텝214) 신호증폭을 수행할 수 있다. 또 상기 스텝 206의 표적 mRNA를 제거할 때 세정조작을 실시한 경우는 스텝 214에 있어서 한 쌍의 HCP를 첨가할 필요가 있다.
상기 제 1예로는 HCP-1의 3영역 중 3'측 영역의 일부를 폴리dT로 한 1쌍의 HCP를 사용한 예를 나타냈지만, HCP-1의 3'측 영역을 전부 폴리dT로 하고, HCP-2의 3영역 중 3'측 영역을 전부 폴리A로 한 1쌍의 HCP를 사용할 수도 있다.
도9 ~ 도12는 본 발명의 발현유전자 검출을 위한 신호증폭방법의 공정수순의 제 2예를 원리적으로 나타내는 모식도이다. 제 2예는 자기집합반응으로서 형광물질로 표지되어 있지 않은 1쌍의 HCP를 사용한 PALSAR법을 이용한 신호증폭법이고, 제 1프로브(12b)로서 3'말단에 폴리dT를 함유하고 또 HCP의 상보영역을 1개 함유하고 있는 올리고뉴클레오티드·프로브를 이용한 경우의 예를 나타낸다.
도9에 나타낸 것처럼 타겟유전자의 mRNA(10b)를 검출하기 위하여 제 1프로브(12b)로서 3'말단에 폴리dT를 함유하고, 5'측에 HCP의 상보영역을 1개 가지는 올리고뉴클레오티드·프로브를 준비하여(스텝 300), 도10에 나타낸 것처럼 mRNA(10b)의 폴리A 꼬리부분에 올리고뉴클레오티드·프로브(12b)를 결합시키고, 역전사효소를 사용해서 역전사반응시켜서 mRNA의 상보배열을 가지는 제 2프로브(14b)를 만든다(스텝 302). mRNA(10b)를 해리하여 cDNA 영역과 HCP 영역을 함유하는 한 가닥의 사슬 올리고뉴클레오티드로 한다.
도11에 나타낸 것처럼 상기 제 2프로브(14b)를 지지체(18)에 결합한 포착용 프로브(16b)에 혼성화시키고(스텝 304), 도12에 나타낸 것처럼 한 쌍의 HCP를 첨가 해 자기집합반응에 의하여 자기집합체(20b)를 형성시키고(스텝 306), 형성된 자기집합체(20b)에 대해서 개재물(intercalator)(24) 등을 삽입하여(스텝 308) 신호증폭을 수행할 수 있다. 또 스텝 306과 스텝 308을 동시에 실시할 수도 있다.
한 쌍의 올리고뉴클레오티드·프로브에 미리 검출을 위한 표지 물질로서 예를 들면, I125나 P32 등의 방사성 동위원소, 디곡시제닌이나 아크릴지늄·에스테르 등의 발광물질이나 Cy3·Cy5 등의 형광물질, 4-메틸움벨리페릴린산 등의 형광물질을 이용하기 위한 비오틴 등 형광공명에너지 전이(FRET)를 이용하기 위한 도너 형광색소와 억셉터 형광색소를 부가시켜 두어 표적유전자를 검출하는 것도 가능하다.
또 핵산과 결합하는 성질을 가지는 색소를 첨가하는 것에 의하여 표적 유전자를 검출하는 것도 가능하다. 개재물처럼 핵산과 결합하는 성질을 가지는 형광물질을 사용해서 타겟유전자를 검출하는 것이 바람직하다. 형광물질로서는 핵산과 결합하는 성질을 가지는 형광물질이라면 특별히 한정되지 않지만 예를 들면, SYBR 그린 I 스테인(SYBR Green I stain), SYBR 그린 II 스테인(SYBR Green II stain), SYBR 그린 골드 스테인(SYBR Green Gold stain), 비스트라 그린 스테인(Vistra Green stain), 겔스타 스테인(Gelstar Stain), 라드란트 레드 스테인(Radlant Red stain), 피코그린(PicoGreen), 리보그린(RiboGreen), 올그린(OllGreen), 훼히스트 33258(비스-벤즈아미드)(Hoechst 33258(Bis-Benzimide)), 프로피듐 아이오다이드(Propidium Iodide), 요-프로-1 아이오다이드(Yo-PRO-1 Iodide), 요-프로-3 아이오다이드(YO-PRO-3 Iodide)(이상, Molecular Probes사 제조), 취화(臭化)에티듐, 디 스타마이신 A(Distamycin A), 토토(TOTO), 소라렌(Psoralen), 아크릴지늄오렌지(아크리딘 오렌지), 에이오에이오(AOAO)(호모다이머) 등이 사용될 수 있다.
상기한 한 쌍의 올리고뉴클레오티드를 구성하는 핵산은 통상 DNA 또는 RNA로 구성되지만, 핵산유사체라도 상관없다. 핵산유사체로서 예를 들면, 펩티드핵산(PNA 예를 들면, 국제공개 제92/20702호 팜플렛 참조)이나 락드 핵산(Locked Nucleic Acid)(LNA, 예를 들면 Koshkin AA et al. Tetrahedron 1998. 54, 3607-3630, Koshkin AA et al. J. Am. Chem. Soc. 1998. 120, 13252-13253, 및 Wahlestedt C et al. PNAS. 2000. 97, 5633-5638. 참조)을 들 수 있다. 또 한 쌍의 올리고뉴클레오티드·프로브는 통상 동일 종류의 핵산으로 구성되지만, 예를 들면 DNA프로브와 RNA프로브가 한 쌍으로 되어도 지장이 없다. 즉, 프로브의 핵산 종류는 DNA, RNA 또는 핵산유사체(예를 들면 PNA나 LNA 등)에서 선택할 수 있다. 또 한 개의 프로브 내에서의 핵산구성은 한 종류, 예를 들면 DNA만으로 구성될 필요는 없고 필요에 따라 예를 들면 DNA와 RNA로 구성되는 올리고뉴클레오티드·프로브(키메라프로브)를 사용하는 것도 가능하며 본 발명에 포함된다.
올리고뉴클레오티드·프로브의 각 상보적 염기배열영역의 길이는 염기수로 해서 적어도 5염기이고, 바람직하게는 10~100염기, 더 바람직하게는 15~30염기이다.이들 프로브는 공지의 방법으로 합성할 수 있다. 예를 들면 DNA프로브의 경우 어플라이드바이오시스템사(Applied Biosystems Inc.)의 DNA신시사이저394형을 사용해서 포스포아미다이드법에 따라 합성할 수 있다. 또 다른 방법으로서 인산트리에스테르법, H-포스포네이트법, 티오포스포네이트법 등이 있지만 어떤 방법으로 합성 한 것이어도 괜찮다.
본 발명은 DNA칩으로 포착한 타겟유전자에 대하여 상보적인 영역을 가지는 한 쌍의 HCP로 자기집합체를 형성시키는 것이다. 사용하는 올리고뉴클레오티드·프로브의 가닥수는 특별히 한정되지 않지만 102~1015개의 범위에서 사용될 수 있다. 반응완충액의 조성, 농도는 특별하게 한정되지 않고 핵산증폭에 상용되는 통상의 완충액이 바람직하게 사용될 수 있다. pH도 상용범위이면 적합하고, 바람직하게는 pH7.0~9.0 범위의 것을 사용할 수 있다. 반응온도는 40~80℃, 바람직하게는 55~65℃이다.
본 발명에 있어서 표적 발현유전자(mRNA) 측정용 시료는 핵산을 함유할 가능성이 있는 모든 시료를 적합하게 사용할 수 있다. 표적유전자는 시료에서 적의 조제 또는 분리한 것이어도 바람직하고 특별하게 한정되지 않는다. 예를 들면, 혈액, 혈청, 뇨, 분변, 뇌척수액, 조직액, 세포배양물 등의 생체유래시료, 곰팡이 등의 말단에 폴리A 사슬을 포함하는 mRNA를 가지는 모든 진핵생물 함유 또는 감염한 가능성 있는 시료 등을 들 수 있다. 또, 시료 중의 표적유전자를 공지의 방법으로 증폭한 핵산도 사용가능하다.
실시예
이하에 실시예를 들어서 본 발명을 더 구체적으로 설명하지만 이들 실시예는 예시적으로 나타낸 것으로 한정적으로 해석되어서는 안 되는 것은 말할 것도 없다.
이하에 실시예에서 사용한 시료를 제시한다.
(a) 타겟유전자: 배양세포에서 추출한 전체 RNA
(b) 캡쳐 프로브(포착용 프로브):
1) CP-1: 5'-CACGAAACTACCTTCAACTCCATC-3'
2) CP-2: 5'-TGCCGACAGGATGCAGAAGGA-3'
(c) 프라이머:
1) 제 1프로브(폴리dT-HCP)(78mer): 5'-GCATATAGATATCTCCGGCGCGGATACTTTGT
GATACCGGGAGTTCGCCCTTATAACGTCTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'
2) 폴리dT 프라이머(18mer): 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'
(d) HCP:
1) HCP-1(5' 말단 Cy3 표지, 60mer): 5'-Cy3-CGCCGGAGATATCTATATGCCCGGTAT
CACAAAGTATCCGGACGTTATAAGGGCGAACTC-3'
2) HCP-2(5' 말단 Cy3 표지, 60mer): 5'-Cy3-GCATATAGATATCTCCGGCGCGGATACT
TTGTGATACCGGGAGTTCGCCCTTATAACGTC-3'
(e) 폴리스티렌제 입자 비즈: 1종류의 입자 비즈에 상기 2종류의 캡쳐 프로브를 고정한 것
실시예1
배양세포에서 추출한 전체 RNA를 사용하여 하우스키핑 유전자인 베타-액틴(Beta-actin) 검출을 PALSAR법을 이용해서 시험했다.
(1) RNA 역전사반응 및 역전사 산물의 정제
타겟유전자, 제 1프로브, 역전사효소(SuperScript II: 인비트로젠사 제조) 및 반응 용액(Reaction Buffer, DTT, dNTP, RN아제 저해제)을 사용해서 역전사반응을 37℃에서 2시간 동안 실시했다. 그 후 65℃에서 30분 알칼리처리를 하고, 염산을 사용해서 중화했다. 역전사 산물인 cDNA를 QIA퀵 PCR 정제키트(QIAquick PCR purification Kit)(Qiagen사 제조)를 사용해서 정제했다.
(2) 혼성화
다음으로, [상기 얻어진 cDNA, 입자 비즈, 6×SSC, 0.2% SDS, 5×덴할트용액(Denhalt solution)]의 조성을 전량 50μL로 되도록 조정하여, 42℃에서 2시간동안 혼성화를 실시했다. 종료 후 0.22μm 필터로 통과시켜서 미반응 프로브를 제거하고 2×SSC + 0.1% SDS로 1회, 0.2×SSC로 1회 세정하고 상기 필터로 통과시켰다.
그 후 [상기 얻어진 입자 비즈, HCP-1 및 2(1.5p몰/μL), 1% 차단제(Blocking Reagent)(Roche사 제조), 0.1% N-라우로일사코진(N-lauroylsarcosine), 0.02% SDS, 5×SSC]의 조성(전량 100μL)으로 65℃에서 30분간 혼성화를 실시했다.
(3) 검출
세정 후의 입자 비즈를 플로사이트미터용 시스액에 재현탁하여 플로사이트미터로 HCP에 표지되어 있는 Cy3의 형광을 측정했다.
비교예 1
통상 실시되고 있는 폴리dT 프라이머에 의한 Cy3-dNTP 삽입계를 사용해서 타 겟유전자를 검출했다.
(1) RNA의 역전사 반응 및 해리 반응
프라이머로서 상기 폴리dT 프라이머를 사용하고, dNTP외에 Cy3 표지 dUTP(Amercham사 제조)를 넣은 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 해서 역전사반응 및 역전사 산물의 정제를 실시했다.
(2) 혼성화
다음으로 [상기 얻어진 cDNA, 상기 입자 비즈, 6×SSC, 0.2% SDS, 5×덴할트 용액]의 조성을 전량 50μL로 되도록 조정하여 42℃에서 2시간동안 혼성화를 실시했다. 종료 후 0.22μm 필터로 통과시켜서 미반응 프로브를 제거하고 2×SSC + 0.1% SDS로 1회 세정했다.
(3) 검출
세정 후의 입자 비즈를 플로사이트미터용 시스액에 재현탁하여 플로사이트미터로 입자 비즈 위의 캡쳐 프로브와 결합한 cDNA에 표지되어 있는 Cy3의 형광을 측정했다.
[결과]
실시예 1 및 비교예 1의 결과를 도13에 나타냈다. 형광강도는 각각의 종류에 대해 203개부터 504개의 입자 비즈의 형광강도를 측정하여 그 메디안치를 나타냈다. 도13에 나타낸 것처럼 비교예 1과 비교해서 실시예 1의 검출감도는 현저하게 향상했다.
상술한 바와 같이 본 발명에 따르면 역전사반응만이기 때문에 고가인 효소를 필요로 하지 않고, 저렴하고 쉬운 조작으로 단시간에 검출할 수 있고, 게다가 리니어증폭법이나 PCR법을 사용하지 않기 때문에 처음 RNA의 길이나 발현량에 대응한 검출이 가능하다고 하는 현저한 효과가 있다.
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Claims (20)

  1. 삭제
  2. 역전사반응 및 올리고뉴클레오티드·프로브의 자기집합에 의하여 자기집합체를 형성시키는 자기집합반응을 이용하여 DNA칩에 있어서 발현유전자의 검출감도를 향상시키는 방법으로서,
    3'말단에 폴리dT를 가지고 또 상기 올리고뉴클레오티드·프로브에 혼성하는 것이 가능한 영역을 가지는 제 1프로브를 프라이머로 사용해서 mRNA의 역전사반응을 실시하여 cDNA 영역을 가지는 제 2프로브를 형성시키는 공정,
    상기 mRNA를 상기 제 2프로브로부터 해리시키는 공정,
    상기 제 2프로브를 표적 mRNA의 cDNA 영역에 상보적인 영역을 가지는 포착용 프로브에 혼성화시키는 공정, 및
    상기 제 2프로브와 상기 올리고뉴클레오티드·프로브를 사용한 자기집합반응에 의하여 자기집합체를 형성시키는 공정을 가지는 것을 특징으로 하는 발현유전자 검출을 위한 신호증폭방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 자기집합반응이 서로 상보적인 염기배열영역이 n(n≥3)개소의 수로 구성된 한 쌍의 올리고뉴클레오티드·프로브 여러 쌍을 사용해서 서로 다르게 교차하게 혼성화시키는 것에 의하여 올리고뉴클레오티드가 자기집합하여 2가닥 사슬의 자기집합체를 형성시키는 자기집합반응인 것을 특징으로 하는 발현유전자 검출을 위한 신호 증폭방법.
  4. 역전사 반응 및 서로 상보적인 염기배열영역이 n(n≥3)개소의 수로 구성된 한 쌍의 올리고뉴클레오티드·프로브인 제 1HCP 및 제 2HCP 여러 쌍을 사용해서 서로 다르게 교차하게 혼성화시키는 것에 의하여 올리고뉴클레오티드가 자기집합해서 자기집합체를 형성시키는 자기집합반응을 이용하여 DNA칩에 있어서의 발현유전자의 검출감도를 향상시키는 방법으로서,
    3'말단에 폴리dT를 가지고 또 상기 제 1HCP의 염기배열영역을 적어도 일부분 가지는 제 1프로브를 mRNA에 결합시키고, 역전사효소를 사용해서 역전사반응시켜서, cDNA영역 및 상기 제 1HCP의 염기배열영역을 적어도 일부분 가지는 제 2프로브를 형성시키고, mRNA를 제거한 후 상기 제 2프로브를 표적 mRNA의 cDNA 영역에 상보적인 영역을 가지는 포착용 프로브에 혼성화시키고, 상기 제 1HCP 및 상기 제 2HCP, 또는 상기 제 2HCP를 첨가하여 올리고뉴클레오티드의 자기집합반응에 의하여 자기집합체를 형성시켜서 신호를 증폭시키는 것을 특징으로 하는 발현유전자 검출을 위한 신호증폭방법.
  5. 제 2항에 있어서,
    상기 자기집합반응이 No.1 및 No.2 한 쌍의 올리고뉴클레오티드의 각 올리고뉴클레오티드를 3'측 영역, 중앙 영역 및 5'측 영역의 3개 영역으로 나누고, 각 올리고뉴클레오티드의 중앙 영역을 서로 상보적인 염기배열로 해서 다이머프로브를 형성하는 것과 동시에, 3'측 영역 및 5'측 영역을 서로 비상보적인 염기배열로 한 한 쌍의 다이머 형성용 프로브를 여러 쌍 포함하는 제 1계와,
    No.3 및 No.4 한 쌍의 올리고뉴클레오티드의 각 올리고뉴클레오티드를 3'측 영역 및 5'측 영역의 2개 영역으로 나누고, 각 올리고뉴클레오티드의 3'측 영역 및 5'측 영역을 서로 비상보적인 염기배열로 한 한 쌍의 가교프로브를 여러 쌍 포함하는 제 2계를 가지고,
    상기 가교프로브를 상기 다이머 형성용 프로브에서 형성되는 다이머를 가교할 수 있는 염기배열로 하여 상기 프로브를 혼성화시키는 것에 의하여 올리고뉴클레오티드가 자기집합하여 자기집합체를 형성시키는 자기집합반응인 것을 특징으로 하는 발현유전자 검출을 위한 신호증폭방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 프로브의 염기배열을 제 1계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 3'측 영역과 제 2계의 No.3-올리고뉴클레오티드의 3'측 영역,
    제 1계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 5'측 영역과 제 2계의 No.4-올리고뉴클레오티드의 5'측 영역,
    제 2계의 No.4-올리고뉴클레오티드의 3'측 영역과 제 1계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 3'측 영역,
    제 2계의 No.3-올리고뉴클레오티드의 5'측 영역과 제 1계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 5'측 영역을 각각 상보적인 염기배열로 하는 것을 특징으로 하는 발현유전자 검출을 위한 신호증폭방법.
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 프로브의 염기배열을 제 1계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 3'측 영역과 제 2계의 No.3-올리고뉴클레오티드의 3'측 영역,
    제 1계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 5'측 영역과 제 2계의 No.3-올리고뉴클레오티드의 5'측 영역,
    제 1계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 3'측 영역과 제 2계의 No.4-올리고뉴클레오티드의 3'측 영역,
    제 1계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 5'측 영역과 제 2계의 No.4-올리고뉴클 레오티드의 5'측 영역을 각각 상보적인 염기배열로 하는 것을 특징으로 하는 발현유전자 검출을 위한 신호증폭방법.
  8. 제 2항에 있어서, 상기 포착용 프로브가 지지체에 결합해 있는 것을 특징으로 하는 발현유전자 검출을 위한 신호증폭방법.
  9. 제 4항에 있어서, 상기 포착용 프로브가 지지체에 결합해 있는 것을 특징으로 하는 발현유전자 검출을 위한 신호증폭방법.
  10. 제 8항에 있어서, 상기 지지체가 마이크로플레이트형, 슬라이드글래스형, 미립자형 또는 전기전도성 기판형 지지체인 것을 특징으로 하는 발현유전자 검출을 위한 신호증폭방법.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 지지체가 마이크로플레이트형, 슬라이드글래스형, 미립자형 또는 전기전도성 기판형 지지체인 것을 특징으로 하는 발현유전자 검출을 위한 신호증폭방법.
  12. 제 2항에 있어서, 상기 자기집합체에 대해서 표지프로브를 혼성화시키는 것에 의하여 상기 자기집합체의 존재를 검출하는 것을 특징으로 하는 발현유전자 검출을 위한 신호증폭방법.
  13. 제 4항에 있어서, 상기 자기집합체에 대해서 표지프로브를 혼성화시키는 것에 의하여 상기 자기집합체의 존재를 검출하는 것을 특징으로 하는 발현유전자 검출을 위한 신호증폭방법.
  14. 제 12항에 있어서, 상기 표지프로브가 발색계 효소, 발광계 효소 또는 방사성 동위원소로 표지한 표지 프로브인 것을 특징으로 하는 발현유전자 검출을 위한 신호증폭방법.
  15. 제 13항에 있어서, 상기 표지프로브가 발색계 효소, 발광계 효소 또는 방사성 동위원소로 표지한 표지 프로브인 것을 특징으로 하는 발현유전자 검출을 위한 신호증폭방법.
  16. 제 2항 또는 제 4항에 있어서,
    상기 자기집합체에 대해서 핵산과 결합하는 성질을 가진 형광물질을 가하고, 상기 형광물질의 광화학적인 변화에 의하여 상기 자기집합체의 존재를 검출하는 것을 특징으로 하는 발현유전자 검출을 위한 신호증폭방법.
  17. 제 2항 또는 제 4항에 있어서, 자기집합체를 형성하는 올리고뉴클레오티드를 미리 형광물질로 표지하여 상기 자기집합체의 존재를 형광물질의 광화학적인 변화에 의하여 검출하는 것을 특징으로 하는 발현유전자 검출을 위한 신호증폭방법.
  18. 제 2항 또는 제 4항에 있어서, 미리 자기집합체를 형성하는 올리고뉴클레오티드를 방사성 동위원소로 표지하고, 상기 자기집합체의 존재를 방사성 동위원소에 의하여 검출하는 것을 특징으로 하는 발현유전자 검출을 위한 신호증폭방법.
  19. 제 2항 또는 제 4항에 있어서, 자기집합체를 형성하는 올리고뉴클레오티드를 미리 발색계 효소 또는 발광계 효소로 표지하여 상기 자기집합체의 존재를 광화학적인 변화에 의하여 검출하는 것을 특징으로 하는 발현유전자 검출을 위한 신호증폭방법.
  20. 제 2항 또는 제 4항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 DNA, RNA, PNA 또는 LNA 중에서 선택된 염기로 구성된 것을 특징으로 하는 발현유전자 검출을 위한 신호증폭방법.
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