JP2003061679A - オリゴヌクレオチドの巨視的な自己集合体の検出方法及びその形成方法。 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】特殊な機械を使用せず、またアガロースゲル電
気泳動のような煩雑な操作を用いずに簡便にＰＡＬＳＡ
Ｒ法により形成された自己集合体を確認する方法を提供
する。 【解決手段】お互いに相補的な部分がｎ（ｎ≧３）カ所
の数から構成される一対のプローブの複数対を用いて、
互い違いに交差するようにハイブリダイゼーションさせ
ることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本
鎖の巨視的な自己集合体を形成させ、この巨視的な自己
集合体を目視で検出する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、微視的なオリゴヌ
クレオチドの自己集合により形成される巨視的な自己集
合体の目視による検出方法、巨視的な自己集合体の形成
方法、及び形成された巨視的な自己集合体に関する。

【０００２】

【関連技術】現在市販されている遺伝子診断キットにお
ける遺伝子の検出法では、遺伝子増幅法であるＰＣＲ法
（USP 4,683,195, USP 4,683,202）やＬＣＲ法（USP 5,
792,607）は、遺伝子の増幅産物をＥＩＡ（エンザイム
・イムノ・アッセイ）による発色・発光を使用し、ま
た、シグナル増幅法であるブランチ（分岐）ＤＮＡアッ
セイやＲＣＡ（ローリング・サイクル・アンプリフィケ
ーション）も同様にＥＩＡを使用して標的遺伝子を検出
していた。

【０００３】しかし、ＥＩＡを用いた測定では、特殊な
機械と試薬が必要であり、操作も煩雑で判定するまでに
１時間以上の時間を要していた。

【０００４】一方、本出願人は、酵素を使用しない新規
な等温核酸増幅法（プローブ自己集合体の作製方法）を
既に提案した（USP 6,261,846、特開２０００−２０１
６８７号及びEP 1,002,877A）。この方法は、３個所の
領域から構成される一対のプローブ（HoneyComb Prob
e、以下ＨＣＰと称する）を用いる方法であり、第１プ
ローブと第２プローブの各々の３個所の領域はお互いに
相補的な塩基配列を有し、両者を反応させた場合、領域
の１個所のみとハイブリダイズする様に各領域の塩基配
列を工夫したものである。この工夫により、複数の一対
のプローブを反応させた場合、お互いにハイブリダイズ
しプローブの自己集合体を形成させることができる（Pr
obe alternation link self-assembly reaction、以
下、ＰＡＬＳＡＲ法と称する）。

【０００５】さらに本出願人は、上記ＰＡＬＳＡＲ法を
利用した新規な遺伝子の検出方法を提案した（特願２０
００−２６１６８７号）。この検出方法においては、切
断されたＨＣＰが自己集合体を形成しないことに着眼
し、標的遺伝子の存在とリガーゼ酵素によって連結され
るＨＣＰと、その連結されたＨＣＰのＰＡＬＳＡＲ法に
よる自己集合体の形成状態をアガロースゲル電気泳動、
およびインターカレーターの挿入による蛍光測定で確認
していた。

【０００６】しかし、アガロースゲル電気泳動やインタ
ーカレーターの挿入による蛍光測定では、特殊な機械が
必要であり、操作も煩雑で判定するまでに３０分以上の
時間を要していた。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、特殊な機械
を使用せず、またアガロースゲル電気泳動のような煩雑
な操作を用いずに簡便にＰＡＬＳＡＲ法により形成され
た自己集合体を確認する方法を提供することを目的とす
る。

【０００８】

【課題を解決するための手段】ＰＡＬＳＡＲ法によって
溶液中で形成された自己集合体は、そのままでは透明で
あるためにアガロースゲル電気泳動やインターカレータ
ーの挿入による蛍光測定が必要であった。

【０００９】本発明ではこの透明の自己集合体を簡便に
目視で確認できることを目的に鋭意研究し、煩雑な操作
を必要とせず、短時間に自己集合体を確認することを可
能にした。

【００１０】本発明の巨視的な自己集合体の検出方法の
態様は、お互いに相補的な部分がｎ（ｎ≧３）カ所の数
から構成される一対のプローブの複数対を用いて、互い
違いに交差するようにハイブリダイゼーションさせるこ
とにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の
巨視的な自己集合体を形成させ、この巨視的な自己集合
体を目視で検出することを特徴とする。なお、目視での
検出とは、肉眼での検出を意味するものである。

【００１１】上記巨視的な自己集合体の検出方法は、第
一に、上記形成された巨視的な自己集合体を、濁度によ
り検出することを特徴とする。

【００１２】上記巨視的な自己集合体の検出方法は、第
二に、上記形成された巨視的な自己集合体を、核酸と結
合する色素を添加させ、変色により検出することを特徴
とする。核酸と結合する色素の添加時期は、特に限定さ
れず、巨視的な自己集合体形成前でもよく、巨視的な自
己集合体形成後でもよい。

【００１３】上記一対のプローブは、１対１でハイブリ
ダイゼーションする時に必ずｎ（ｎ≧３）カ所の相補的
な部分の中で、１カ所ずつが特異的にハイブリダイゼー
ションするように構成される。

【００１４】上記プローブの相補的塩基配列領域の分岐
点に、少なくとも１つのＧ（グアニン）またはＣ（シト
シン）を配置させ、プローブがハイブリダイズした際に
少なくとも１つのＣ−Ｇ結合を相補的塩基配列領域の端
部に形成させることにより、安定した二本鎖の巨視的な
自己集合体を形成させることが可能となる。

【００１５】上記ハイブリダイゼーションの反応温度を
プローブのＴｍ値付近にすることが好適であり、プロー
ブのＴｍ値に対し＋５℃〜−４０℃の範囲の反応温度と
することが好適である。

【００１６】上記核酸と結合する色素としては、蛍光を
有するインターカレーター等が好適に用いられる。

【００１７】本発明の巨視的な自己集合体の形成方法の
第一の態様は、お互いに相補的な部分がｎ（ｎ≧３）カ
所の数から構成される一対のプローブの複数対を用い
て、プローブのＴｍ値付近の反応温度にて、互い違いに
交差するようにハイブリダイゼーションさせることによ
り、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の巨視的
な自己集合体を形成させることを特徴とする。

【００１８】本発明の巨視的な自己集合体の形成方法の
第二の態様は、お互いに相補的な部分がｎ（ｎ≧３）カ
所の数から構成される一対のプローブの複数対を用い
て、プローブのＴｍ値に対し＋５℃〜−４０℃の範囲の
反応温度にて、互い違いに交差するようにハイブリダイ
ゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自
己集合し、二本鎖の巨視的な自己集合体を形成させるこ
とを特徴とする。

【００１９】上記巨視的な自己集合体の形成方法にて形
成された巨視的な自己集合体は、濁度により、目視で検
出することが可能である。

【００２０】核酸と結合する色素を添加し、変色によ
り、目視で検出される巨視的な自己集合体を形成するこ
とが可能である。

【００２１】本発明の巨視的な自己集合体は上記巨視的
な自己集合体の形成方法によって形成されるものであ
る。

【００２２】

【発明の実施の形態】以下に本発明の実施の形態を添付
図面に基づいて説明するが、これらの実施の形態は例示
的に示されるもので、本発明の技術思想から逸脱しない
限り種々の変形が可能なことはいうまでもない。

【００２３】本発明は、お互いに相補的な部分をｎカ所
（ｎ≧３）有する一対のプローブであるＨＣＰを使用
し、両者を等温で酵素不在の条件下で反応させることに
より二本鎖の巨視的な自己集合体を形成させ、形成され
た巨視的な自己集合体を目視により検出するものであ
る。なお、目視による検出とは、肉眼による検出を意味
するものである。使用するプローブの本数は、特に限定
されないが、１０²〜１０^{1 5}本の範囲で用いられる。反
応緩衝液の組成、濃度は特に限定されず、核酸増幅に常
用される通常の緩衝液が好適に使用できる。ｐＨも常用
の範囲で好適であり、好ましくはｐＨ７．０〜ｐＨ９．
０の範囲のものが使用できる。これら条件は特に限定さ
れない。巨視的な自己集合体を形成させるためのオリゴ
ヌクレオチドの濃度は、１００ｐｍｏｌ〜１００μｍｏ
ｌ、好ましくは１ｎｍｏｌ〜１μｍｏｌの範囲で使用す
る。

【００２４】ＨＣＰをさらに具体的な例でいえば、一本
のプローブの中でお互いに相補的な部分の長さ（塩基の
数）は、同一であっても異なってもよく特に限定されな
い。

【００２５】図１は、相補的な領域が３箇所からなる一
対のＨＣＰ（Ｎｏ．１プローブ及びＮｏ．２プローブ）
より形成された巨視的な自己集合体の検出方法の一例を
示す模式図である。同図において、Ｎｏ．１プローブ
は、Ｘ₁領域、Ｘ₂領域及びＸ₃領域を有し、Ｎｏ．２プ
ローブは、Ｘ'₁領域、Ｘ'₂領域及びＸ'₃領域を有してい
る［図１（ａ）］。このＮｏ．１プローブとＮｏ．２プ
ローブは、両者をハイブリダイゼーションさせたとき、
Ｘ₁領域はＸ'₁領域とだけ結合し、Ｘ₂領域はＸ'₂領域と
だけ結合し、Ｘ₃領域はＸ'₃領域とだけ結合するような
構成とされており、３つの結合パターンで一対のプロー
ブが互い違いにハイブリダイゼーションする。［図１
（ｂ）］。

【００２６】３つの結合パターンで互い違いにハイブリ
ダイゼーションした一対のＨＣＰの複数対は、図１
（ｃ）に模式的な一例を示したように、ＰＡＬＳＡＲ法
の原理に従い、オリゴヌクレオチドの自己集合により、
二本鎖の巨視的な自己集合体を形成させることができ
る。

【００２７】図２はお互いに相補的な部分が４カ所の数
から構成される一対のＨＣＰの一例を示す模式図であ
る。同図において、Ｎｏ．３プローブは、Ｘ₁領域、Ｘ₂
領域、Ｘ₃領域及びＸ₄領域を有し、Ｎｏ．４プローブ
は、Ｘ'₁領域、Ｘ'₂領域、Ｘ'₃領域及びＸ'₄領域を有し
ている。このＮｏ．３プローブとＮｏ．４プローブは、
両者をハイブリダイゼーションさせたとき、Ｘ₁領域は
Ｘ'₁領域とだけ結合し、Ｘ₂領域はＸ'₂領域とだけ結合
し、Ｘ₃領域はＸ'₃領域とだけ結合し、Ｘ₄領域はＸ'₄領
域とだけ結合するような構成とされており、４つの結合
パターンで一対のプローブが互い違いにハイブリダイゼ
ーションする。

【００２８】４つの結合パターンで互い違いにハイブリ
ダイゼーションした一対のＨＣＰの複数対は、図３に模
式的な一例を示したように、ＰＡＬＳＡＲ法の原理に従
い、オリゴヌクレオチドの自己集合により、二本鎖の巨
視的な自己集合体を形成させることができる。

【００２９】図４はお互いに相補的な部分が５カ所の数
から構成される一対のＨＣＰの一例を示す模式図であ
る。同図において、Ｎｏ．５ローブは、Ｘ₁領域、Ｘ₂領
域、Ｘ ₃領域、Ｘ₄領域及びＸ₅領域を有し、Ｎｏ．６プ
ローブは、Ｘ'₁領域、Ｘ'₂領域、Ｘ'₃領域、Ｘ'₄領域及
びＸ'₅領域を有している。このＮｏ．５プローブとＮ
ｏ．６プローブは、両者をハイブリダイゼーションさせ
たとき、Ｘ₁領域はＸ'₁領域とだけ結合し、Ｘ₂領域は
Ｘ'₂領域とだけ結合し、Ｘ₃領域はＸ'₃領域とだけ結合
し、Ｘ₄領域はＸ'₄領域とだけ結合し、Ｘ₅領域はＸ'₅領
域とだけ結合するような構成とされており、５つの結合
パターンで一対のプローブが互い違いにハイブリダイゼ
ーションする。

【００３０】５つの結合パターンで互い違いにハイブリ
ダイゼーションした一対のＨＣＰの複数対は、図５に模
式的な一例を示したように、ＰＡＬＳＡＲ法の原理に従
い、オリゴヌクレオチドの自己集合により、二本鎖の巨
視的な自己集合体を形成させることができる。

【００３１】図１〜図５に示したように、一対のＨＣＰ
の相補的な部分が３ヵ所、４ヵ所及び５ヵ所の数から構
成される一対のプローブをハイブリダイゼーションさせ
る方法をもってすれば、理論的にはそれ以上の相補的塩
基配列領域を増すことが可能である。

【００３２】図６はお互いに相補的な部分がｎカ所（ｎ
≧３）の数から構成される一対のＨＣＰのさらに別の例
を示す模式図である。同図において、Ｎｏ．７プローブ
は、Ｘ₁領域、Ｘ₂領域、Ｘ₃領域……Ｘ_n-1領域、Ｘ_n領
域を有し、Ｎｏ．８プローブは、Ｘ'₁領域、Ｘ'₂領域、
Ｘ'₃領域……Ｘ'_n-1領域、Ｘ'_n領域を有している。この
Ｎｏ．７プローブとＮｏ．８プローブは、両者をハイブ
リダイゼーションさせたとき、Ｘ₁領域はＸ'₁領域とだ
け結合し、Ｘ₂領域はＸ'₂領域とだけ結合し、Ｘ ₃領域は
Ｘ'₃領域とだけ結合し、Ｘ_n-1領域はＸ'_n-1とだけ結合
し、Ｘ_n領域はＸ' _n領域とだけ結合するような構成とさ
れており、ｎ個の結合パターンで一対のプローブが互い
違いにハイブリダイゼーションする。

【００３３】ｎ個の結合パターンで互い違いにハイブリ
ダイゼーションした一対のＨＣＰの複数対は、ＰＡＬＳ
ＡＲ法の原理に従い、オリゴヌクレオチドの自己集合に
より、二本鎖の巨視的な自己集合体を形成させることが
できる。

【００３４】ＰＡＬＳＡＲ法で使用する一対のプローブ
を、互い違いに交差してハイブリダイゼーションする時
の分岐点の塩基配列をＧ（グアニン）とＣ（シトシン）
の結合にすることにより、塩基の積み重ね（stacking o
f base）により塩基のπ電子の特殊な相互作用を生じさ
せ、より安定した二本鎖の巨視的な自己集合体を形成さ
せることができる。

【００３５】図７に示したように、ＨＣＰの互い違いに
交差する円形で示した部分の結合をＧとＣにし、円形で
示した分岐点の結合を強固にすることによって、積み重
ね効果（stacking effect、スタッキング効果と称すこ
ともある）が増し、結果的にその分岐点にはさまれてい
る領域のハイブリダイゼーションが安定すると考えられ
る。

【００３６】上記の相補的領域分岐点に配置されるＣま
たはＧの数は少なくとも１塩基であり、複数個であって
も差し支えない。各相補領域の塩基配列を考慮し適宜選
択することができる。複数個のＣまたはＧを配置させる
場合、Ｃ、Ｇの順序は特に限定されず自由に組み合わせ
ることができる。

【００３７】上記ＰＡＬＳＡＲ法の原理に従い形成され
る巨視的な自己集合体は、ＤＮＡ又はオリゴヌクレオチ
ドの２６０ｎｍにおける紫外部の吸収度の強度が減ずる
「ハイポクロミズム」という淡色効果を発現する特徴を有
する、塩基の積み重ねが規則的な高次構造をとるもので
ある。

【００３８】巨視的な自己集合体を形成させるためのハ
イブリダイゼーションの反応温度は、ＨＣＰのＴｍ値付
近の温度を用いることが好ましい。また、巨視的な自己
集合体を形成させるためのハイブリダイゼーションの反
応温度は、好ましくは、ＨＣＰのＴｍ値の＋５℃〜−４
０℃の範囲の反応温度であり、さらに好ましくは、Ｔｍ
値の−５℃〜−３０℃の範囲の反応温度を用いる。

【００３９】プローブのＴｍ値は、「細胞工学別冊 バ
イオ実験イラストレイテッド（株）秀潤社（著者：中
山広樹）」に記載の方法に従い、以下の数式（I）にて
求めることができる。

【００４０】

【数１】 Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６×ｌｏｇ₁₀［Ｓ］ ＋０．４１×（％GC）−（５００／ｎ） ・・・（I）

【００４１】（上記数式（I）において、［S］は塩のモ
ル濃度（M）を、（％GC）はオリゴヌクレオチド中のGC
含量（％）を、ｎはオリゴヌクレオチドの長さ（ｂｐ）
をそれぞれ示す。）

【００４２】上記形成された巨視的な自己集合体は、結
晶化されており、その形状の変化から検出することが可
能である。また、形成された巨視的な自己集合体の濁度
により目視検出が可能である。目視検出の方法は、特に
限定されないが、好ましくは、白色光等の光にかざし
て、その透過光によって確認するか、又は、白板あるい
は黒板等の前にて確認し、さらに好ましくは、遠心分離
にて、沈澱させて確認することが可能である。

【００４３】上記形成された巨視的な自己集合体は、核
酸と結合する色素の添加により、変色による目視検出が
可能となる。本発明における変色とは、色の濃淡の変
化、色素の沈殿、粒子状の発色等、発色の変化を指すも
のである。

【００４４】巨視的な自己集合体の目視検出の方法とし
ては、例えば、巨視的な自己集合体を形成させた反応チ
ューブ（例えば、０．２ｍＬのＰＣＲ用チューブ、２５
μｌのスマートサイクラー用チューブ等）の中に核酸と
結合する色素を添加させることにより、巨視的な自己集
合体中の核酸に色素が結合し、変色により、特殊な機械
を用いずに目視で簡便に確認することができる。

【００４５】また、アガロースゲルで電気泳動させなく
ても、アガロースゲル上に反応液を滴下するだけで、巨
視的な自己集合体に結合した色素の変色により、特殊な
機械を用いずに目視で容易に確認することができる。

【００４６】用いられる色素は、核酸と結合されるもの
であれば、いかなるものでもよく、限定されないが、蛍
光を有するインターカレーターが好適である。

【００４７】すなわち、例えば、巨視的な自己集合体を
形成させた反応チューブ（例えば、０．２ｍＬのＰＣＲ
用チューブ、２５μｌのスマートサイクラー用チューブ
等）の中に核酸と結合する色素を添加させることによ
り、巨視的な自己集合体を形成している２重鎖の中にイ
ンターカレーターが挿入されるため、紫外線ランプを反
応チューブにあてることによりインターカレーターが蛍
光を発するため、特殊な機械を用いずに目視で簡便に確
認することができる。

【００４８】また、アガロースゲルで電気泳動させなく
ても、アガロースゲル上に反応液を滴下するだけで、巨
視的な自己集合体に挿入されたインターカレーターが蛍
光を発するため、特殊な機械を用いずに目視で容易に確
認することができる。

【００４９】核酸と結合する色素として、好適に用いら
れるものとしては、SYBR Green I stain、SYBR Green I
I stain、SYBR Green Gold stain、Vistra Green stai
n、Gelstar stain、Radlant Red stain、PicoGreen、Ri
boGreen、OllGreen、Hoechst33258(Bis-Benzimide)、Pr
opidium lodide、YO-PRO-1 lodide、YO-PRO-3 lodide
（以上、Molecular Probes社製）、臭化エチジウム、Di
stamycin A、TOTO、Psoralen、アクリニジウムオレンジ
（Acridine Orange）、AOAO (homodimer) 等がある。

【００５０】また、使用する色素の濃度は、特に限定さ
れないが、１ｐｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度が好
適であり、１０ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの濃度が
さらに好適である。

【００５１】色素を挿入させる時間は、特に限定されな
いが、３０秒以上置くことが好ましい。

【００５２】色素を挿入における反応温度は、特に限定
されないが、０℃〜８０℃が好適であり、さらに好適に
は１５℃〜４５℃であり、最も好適には常温（１５℃〜
２５℃）である。

【００５３】色素の挿入時期は特に限定されず、巨視的
な自己集合体形成反応前でもよく、巨視的な自己集合体
形成後でもよい。

【００５４】蛍光の確認に使用する紫外線ランプとして
は、長波長のブラックライト、またはトランスイルミネ
ーター等を用いることができる。

【００５５】

【実施例】以下に、本発明の実施例を挙げて説明する
が、本発明がこれらの実施例に限定されるものでないこ
とは勿論である。

【００５６】以下に、使用したプローブの塩基配列を記
す。使用したプローブのＴｍ値は８３．３℃である（但
し、１領域のＴｍ値を示すものである）。 ［１］プローブ１（ＨＣＰ−１） 5'-CTGAGACGCTAACTGCGTTC GACACCCTAT CAGGCAGTAC GTCC
TCACAGTTACAGCGAG-3' ［２］プローブ２（ＨＣＰ−２） 5'-GAACGCAGTTAGCGTCTCAG GTACTGCCTG ATAGGGTGTC CTCG
CTGTAACTGTGAGGAC-3' ［３］プローブ３（パート−１） 5'-CTGAGACGCTAACTGCGTTC GACACCCTAT-3' ［４］プローブ４（パート−２） 5'-CAGGCAGTAC GTCCTCACAGTTACAGCGAG-3' ［５］プローブ５（パート−３） 5'-GAACGCAGTTAGCGTCTCAG GTACTGCCTG-3' ［６］プローブ６（パート−４） 5'-ATAGGGTGTC CTCGCTGTAACTGTGAGGAC-3'

【００５７】（材料） １．互い違いにハイブリダイゼーションできる３つの領
域からなる相補的塩基配列をもった一対のプローブを、
以下、「ＨＣＰ」とよぶ。用いたＨＣＰは各６０塩基
で、各々「ＨＣＰ−１、ＨＣＰ−２」とする［図８
（ａ）］。対照にはＨＣＰと同じ配列のプローブを各々
の中間点で切断してできる計４本の３０塩基のプローブ
を用い、以下、「４パーツ（４ｐａｒｔｓ）」とよぶ。
４パーツは各３０塩基で、各々「パート−１（ｐａｒｔ
−１）、パート−２（ｐａｒｔ−２）、パート−３（ｐ
ａｒｔ−３）、パート−４（ｐａｒｔ−４）」とする
［図８（ｂ）］。切断されたＨＣＰは、連結されている
ＨＣＰとは異なり、巨視的な自己集合体は形成されな
い。これらのプローブは、それぞれ上記したＴｍ値を有
し、ＨＣＰ−１及びＨＣＰ−２のＴｍ値の平均より、Ｈ
ＣＰのＴｍ値を、パート１〜パート４のＴｍ値の平均よ
り４パーツのＴｍ値をそれぞれ求めた。ＨＣＰ、４パー
ツのＴｍ値はそれぞれ８３．３℃である。本実施例にお
いては、Ｔｍ値に対し１７．３℃低い６６℃をハイブリ
ダイゼーションにおいて用いる反応温度とした。 ２．緩衝液として２０×ＳＳＣ（３Ｍ−ＮａＣｌ，０．
３Ｍ−Ｃ₆Ｈ₅Ｏ₇Ｎａ₃・２Ｈ₂Ｏ，ｐＨ ７．０）を用
いた。

【００５８】（実施例１〜４及び比較例１〜４） １．目的 巨視的な自己集合体形成に関するプローブ濃度と反応時
間について検討した。

【００５９】２．方法 （１）反応液の調製 ［実施例１〜４］ ０．２ｍＬチューブに、１００ｐｍ
ｏｌ／μＬに調製したＨＣＰ−１及びＨＣＰ−２をそれ
ぞれ、実施例１では各０．２５μＬ、実施例２では各
０．５μＬ、実施例３では各１μＬ、及び実施例４では
各２μＬずつ加え、２０×ＳＳＣを１２μＬ加えて、滅
菌蒸留水で２０μＬに調製した。すなわち、各反応液中
の一対のＨＣＰの濃度は、それぞれ１．２５ｎｍｏｌ／
ｍＬ（実施例１）、２．５ｎｍｏｌ／ｍＬ（実施例
２）、５ｎｍｏｌ／ｍＬ（実施例３）、及び１０ｎｍｏ
ｌ／ｍＬ（実施例４）である。これらを反応時間の検討
用にそれぞれ６本ずつ調製した。

【００６０】［比較例１〜４］ 対照の４パーツの場合
は、ＨＣＰと同じ量がチューブ内に含まれるように１０
０ｐｍｏｌ／μＬに調製したパート１、パート２、パー
ト３及びパート４をそれぞれ、比較例１では各０．２５
μＬ、比較例２では各０．５μＬ、比較例３では各１μ
Ｌ、及び比較例４では各２μＬずつ加え、２０×ＳＳＣ
を１２μＬ加えて、滅菌蒸留水で２０μＬとした。

【００６１】（２）巨視的な自己集合体の形成反応 上記反応溶液を９４℃にて３０秒間処理した後、６６℃
で０（on ice）、０．５、１、２、４、２０時間反応さ
せ、１５℃まで下げた。反応溶液は４℃で保存した。

【００６２】（３）臭化エチジウムの添加 巨視的な自己集合体の目視による観察の為、反応後の溶
液を別の０．２ｍＬチューブに３μＬとり、臭化エチジ
ウムの１／１０００希釈液（１０μｇ／ｍＬ）３μＬを
添加し（臭化エチジウム濃度：５μｇ／ｍＬ）、室温、
暗所で３０分放置後、滅菌蒸留水５０μＬを添加して希
釈した（即ち、臭化エチジウムの最終濃度は、約０．５
μｇ／ｍＬである）。

【００６３】（４）チューブ内の液中における観察 滅菌蒸留水で希釈後、チューブごとトランスイルミネー
ター（ＵＶＰ社製）上で３０２ｎｍにて観察した。

【００６４】３．結果図９に実施例１〜４及び比較例１
〜４の結果を示す。図９（ａ）〜（ｄ）に示すように、
実施例１〜４のＨＣＰでは、チューブ内に粒子状のもの
が目視により観察できた。これはＨＣＰが巨視的な自己
集合体を形成し、その巨視的な自己集合体に臭化エチジ
ウムがインターカレートして蛍光を発しているためであ
る。また、巨視的な自己集合体は実施例２の場合は１〜
２時間［図９（ｂ）］、実施例３の場合は０．５〜１時
間［図９（ｃ）］の反応で確認でき、形成される巨視的
な自己集合体の量と大きさは、プローブ濃度および反応
時間に依存している。

【００６５】一方、図９（ｅ）〜（ｈ）に示すように、
比較例１〜４の対照の４パーツは反応時間に関わらず粒
子状のものは観察されない。また、プローブ濃度をあげ
てもぼんやりと光る溶液全体の蛍光強度が強くなるだけ
で、いずれの反応時間においても目視で確認できる粒子
状の巨視的な自己集合体は観察されなかった。

【００６６】よって、チューブ内の液中において、巨視
的な自己集合体の形成を目視により確認できることがわ
かった。

【００６７】（実施例５〜７及び比較例５〜７） １．目的 巨視的な自己集合体形成に関するプローブ濃度と反応時
間について検討した。

【００６８】２．方法 （１）反応液の調製 ［実施例５〜７］０．２ｍＬチューブに１００ｐｍｏｌ
／μＬに調製したＨＣＰ−１及びＨＣＰ−２をそれぞ
れ、実施例５では各０．５μＬ、実施例６では各１μ
Ｌ、及び実施例７では各２μＬずつ加え、２０×ＳＳＣ
を１２μＬ加えて、滅菌蒸留水で２０μＬに調製した。
すなわち、各反応液中の一対のＨＣＰの濃度は、それぞ
れ２．５ｎｍｏｌ／ｍＬ（実施例５）、５ｎｍｏｌ／ｍ
Ｌ（実施例６）、及び１０ｎｍｏｌ／ｍＬ（実施例７）
である。これらを反応時間の検討用にそれぞれ６本ずつ
調製した。

【００６９】［比較例５〜７］対照の４パーツの場合
は、ＨＣＰと同じ量がチューブ内に含まれるように１０
０ｐｍｏｌ／μＬに調製したパート１、パート２、パー
ト３及びパート４をそれぞれ、比較例５では各０．５μ
Ｌ、比較例６では各１μＬ、及び比較例７では各２μＬ
ずつ加え、２０×ＳＳＣを１２μＬ加えて、滅菌蒸留水
で２０μＬとした。

【００７０】（２）巨視的な自己集合体の形成反応 上記反応溶液を９４℃にて３０秒間処理した後、６６℃
で０（on ice）、０．５、１、２、４、２０時間反応さ
せ、１５℃まで下げた。反応溶液は４℃で保存した。

【００７１】（３）臭化エチジウムの添加 実施例１〜４及び比較例１〜４と同様の手順及び条件に
より、巨視的な自己集合体の形成反応後の反応溶液に対
し、臭化エチジウムを添加した。

【００７２】（４）アガロースゲル上における観察 この反応溶液を静置後、チューブの底部から８μＬをと
り１％（ヌーシブ３：１）アガロースゲル（宝酒造社
製）上に滴下して、トランスイルミネーター（ＵＶＰ社
製）上で３０２ｎｍにて観察した。

【００７３】３．結果 図１０に実施例５〜７及び比較例５〜７の結果を示す。
図１０（ａ）〜（ｃ）に示すように、実施例５〜７のＨ
ＣＰでは、アガロースゲル上に粒子状のものが目視によ
り観察できた。これはＨＣＰが巨視的な自己集合体を形
成し、その巨視的な自己集合体に臭化エチジウムがイン
ターカレートして蛍光を発しているためである。また、
巨視的な自己集合体は実施例５の場合は１〜２時間、実
施例６の場合は０．５〜１時間の反応で確認でき、形成
される巨視的な自己集合体の量と大きさは、プローブ濃
度および反応時間に依存している。

【００７４】一方、図１０（ｄ）〜（ｆ）に示すよう
に、比較例５〜７の対照の４パーツは反応時間に関わら
ず粒子状のものは観察されない。また、プローブ濃度を
あげてもぼんやりと光る溶液全体の蛍光強度が強くなる
だけで、いずれの反応時間においても目視で確認できる
粒子状の巨視的な自己集合体は観察されなかった。

【００７５】よって、反応液を滴下したアガロースゲル
上において、巨視的な自己集合体の形成を目視により確
認できることがわかった。

【００７６】（実施例８〜９及び比較例８〜９） １．目的 巨視的な自己集合体形成に関する反応温度と反応時間に
ついて検討した。ハイブリダイゼーションの反応温度と
して、６６℃（Ｔｍ値−１７．３℃）と５６℃（Ｔｍ値
−２７．３℃）を用いた。

【００７７】２．方法 （１）反応液の調製 ［実施例８及び９］０．２ｍＬチューブに１００ｐｍｏ
ｌ／μＬに調製したＨＣＰ−１及びＨＣＰ−２をそれぞ
れ１．５μＬ、２０×ＳＳＣを３６μＬ加え、滅菌蒸留
水で６０μＬに調製した。すなわち、各反応液中の一対
のＨＣＰの濃度は、２．５ｎｍｏｌ／ｍＬである。これ
らを反応温度と反応時間の検討用にそれぞれ１４本ずつ
調製した。

【００７８】［比較例８及び９］対照の４パーツの場合
は、ＨＣＰと同じ量がチューブ内に含まれるように１０
０ｐｍｏｌ／μＬに調製したパート１、パート２、パー
ト３及びパート４をそれぞれ１．５μＬ加え、２０×Ｓ
ＳＣを３６μＬ加え、滅菌蒸留水で６０μＬとした。

【００７９】（２）巨視的な自己集合体の形成反応 上記反応溶液を９４℃にて３０秒間処理した後、６６℃
（実施例８及び比較例８）もしくは５６℃（実施例９及
び比較例９）で０（on ice）、０．５、１、２、４、１
６、２０時間反応させ、１５℃まで下げた。反応溶液は
４℃で保存した。

【００８０】（３）アガロースゲル電気泳動法による検
出 この反応溶液８μＬを、０．５％（ヌーシブ３：１）ア
ガロースゲル（宝酒造社製）を用いて、１００Ｖ、３０
分間の電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルを臭化エチ
ジウムで染色した。

【００８１】３．結果 図１１に実施例８及び比較例８の結果を示し、図１２に
実施例９及び比較例９の結果を示す。図１１に示される
ように、６６℃反応における０．５％アガロースゲル電
気泳動による検出では、実施例８のＨＣＰの方はウェル
にとどまる大きさの巨視的な自己集合体が形成されてお
り、０．５時間反応においてもすでに形成が開始されて
いる。また、アガロースゲルの下流まで泳動される、巨
視的な自己集合体を形成しなかった未反応のプローブの
残量から、反応時間に依存してより多くの巨視的な自己
集合体が形成されていることが確認できる。比較例８の
対照の４パーツではいずれもアガロースゲルの下流まで
泳動されており、反応時間に関わらず巨視的な自己集合
体が形成されていないことがわかる。

【００８２】一方、図１２に示されるように、５６℃反
応における０．５％アガロースゲル電気泳動による検出
では、実施例９のＨＣＰの方は４時間反応でウェルにと
どまる大きさの巨視的な自己集合体が形成された。比較
例９の対照の４パーツでは６６℃反応と同様、反応時間
に関わらずアガロースゲルの下部まで反応物が泳動さ
れ、巨視的な自己集合体が形成されていないことがわか
る。

【００８３】（実施例１０〜１１及び比較例１０〜１
１） １．目的 巨視的な自己集合体形成に関する反応温度と反応時間に
ついて検討した。

【００８４】２．方法 （１）巨視的な自己集合体の形成反応 実施例１０は実施例８（ＨＣＰ・６６℃）、実施例１１
は実施例９（ＨＣＰ・５６℃）、比較例１０は比較例８
（４パーツ・６６℃）、及び比較例１１は比較例９（４
パーツ・５６℃）と、それぞれ同様の手順及び条件によ
り巨視的な自己集合体の形成反応を行った。

【００８５】（２）臭化エチジウムの添加 実施例１〜４及び比較例１〜４と同様の手順及び条件に
より、巨視的な自己集合体の形成反応後の反応溶液に対
し、臭化エチジウムを添加した。

【００８６】（３）アガロースゲル上における観察 実施例５〜７及び比較例５〜７と同様の手順及び条件に
より、臭化エチジウム添加後の反応液に対し、アガロー
スゲル上における観察を行った。

【００８７】３．結果 図１３に実施例１０〜１１及び比較例１０〜１１の結果
を示す。図１３（ａ）に示すように、実施例１０のＨＣ
Ｐでは、６６℃の反応において、アガロースゲル上に粒
子状のものが目視により観察できた。これはＨＣＰが巨
視的な自己集合体を形成し、その巨視的な自己集合体に
臭化エチジウムがインターカレートして蛍光を発してい
るためである。また、巨視的な自己集合体は１〜２時間
の反応で確認でき、形成される巨視的な自己集合体の量
と大きさは反応時間に依存している。

【００８８】図１３（ｂ）に示すように、比較例１０の
対照の４パーツは反応時間に関わらず粒子状のものは観
察されない。また、プローブ濃度をあげてもぼんやりと
光る溶液全体の蛍光強度が強くなるだけで、いずれの反
応時間においても目視で確認できる粒子状の巨視的な自
己集合体は観察されなかった。

【００８９】一方、５６℃反応において、ＨＣＰ（実施
例１１）および対照（比較例１１）のいずれも臭化エチ
ジウムがインターカレートして光る粒子状の巨視的な自
己集合体が目視により確認できなかった［図１３（ｃ）
（ｄ）］。これにより、図１２に示された、実施例９の
０．５％アガロースゲル電気泳動でウェル付近までのび
ているバンドは、６６℃反応において確認できる巨視的
な自己集合体とは違うものが形成されていることがわか
る。

【００９０】よって、反応液を滴下したアガロースゲル
上において、反応時間に依存して量と大きさが増大する
巨視的な自己集合体の形成を目視により確認することが
できること、及び巨視的な自己集合体の形成には至適な
反応温度が関与していることがわかった。

【００９１】（実施例１２及び比較例１２） １．目的 巨視的な自己集合体の蛍光顕微鏡による検出を行った。

【００９２】２．方法 （１）反応液の調製 実施例８及び９と同様の手順及び条件により、反応液を
調製した。

【００９３】（２）巨視的な自己集合体の形成反応 上記反応溶液を９４℃にて３０秒間処理した後、６６℃
（実施例１２）で０（on ice）、１、２、４、１６、２
０時間、又は５６℃（比較例１２）で０（on ice）、
４、１６、２０時間反応させ、１５℃まで下げた。反応
溶液は４℃で保存した。

【００９４】（３）臭化エチジウムの添加 実施例１〜４及び比較例１〜４と同様の手順及び条件に
より、巨視的な自己集合体の形成反応後の反応溶液に対
し、臭化エチジウムを添加した。

【００９５】（４）蛍光顕微鏡による検出 蛍光顕微鏡の観察では、希釈した溶液中の巨視的な自己
集合体を集める目的で０．２ｍＬチューブをスピンダウ
ンした後、チューブの下部から５μＬをとりスライドガ
ラス上に滴下する。カバーグラスをかけて、２００倍率
で観察した。

【００９６】３．結果 図１４、図１５に実施例１２の結果を示し、図１６に比
較例１２の結果を示す。蛍光顕微鏡の観察では、ＨＣＰ
を用いた反応では、未反応の状態（０時間）では光る粒
子状の巨視的な自己集合体は観察されないが、実施例１
２の６６℃反応において、臭化エチジウムがインターカ
レートして光る粒子状の巨視的な自己集合体が確認さ
れ、反応時間に依存して巨視的な自己集合体の大きさが
増大することが目視により確認できた。一方、比較例１
２の５６℃反応においては長時間反応させても、小さい
粒子しか観察されず、６６℃反応において確認できる巨
視的な自己集合体とは違うものが形成されていることが
わかる。

【００９７】よって、蛍光顕微鏡の観察において、反応
時間に依存して大きさが増大する巨視的な自己集合体の
形成を目視により確認することができること、及び巨視
的な自己集合体の形成には至適な反応温度が関与してい
ることがわかった。

【００９８】（実施例１３及び比較例１３） １．目的 マイクロプレート内における巨視的な自己集合体の観察
を行った。

【００９９】２．方法 （１）反応液の調製 ［実施例１３］０．２ｍＬチューブに、１００ｐｍｏｌ
／μＬに調製したＨＣＰ−１及びＨＣＰ−２をそれぞれ
０．５μＬ、２０×ＳＳＣを１２μＬ加え、滅菌蒸留水
で２０μＬに調製した。すなわち、各反応液中の一対の
ＨＣＰの濃度は、２．５ｎｍｏｌ／ｍＬである。

【０１００】［比較例１３］対照の４パーツの場合は、
ＨＣＰと同じ量がチューブ内に含まれるように１００ｐ
ｍｏｌ／μＬに調製したパート１、パート２、パート３
及びパート４をそれぞれ０．５μＬ、２０×ＳＳＣを１
２μＬ加え、滅菌蒸留水で２０μＬとした。

【０１０１】（２）巨視的な自己集合体の形成反応 上記反応溶液を９４℃にて３０秒間処理した後、６６℃
で２０時間反応させ、１５℃まで下げた。反応溶液は４
℃で保存した。

【０１０２】（３）マイクロプレート内における観察 マイクロプレート内における検出においては、臭化エチ
ジウムを１／１０００希釈（１０μｇ／ｍＬ）または１
／１００００希釈（１μｇ／ｍＬ）し、９６ウェルマイ
クロプレート内に予め４０μＬを分注し、その中にＨＣ
Ｐ、もしくは対照の４パーツの反応溶液を６６℃で２０
時間反応した溶液を１０μＬ滴下した。（この時点で臭
化エチジウムは各々、１／１２５０希釈（８μｇ／ｍ
Ｌ）および１／１２５００希釈（０．８μｇ／ｍＬ）さ
れていることになる。）

【０１０３】そして、ただちにトランスイルミネーター
（ＵＶＰ社製）上で３０２ｎｍにて観察した。

【０１０４】３．結果 図１７に実施例１３及び比較例１３の結果を示す。実施
例１３のＨＣＰでは、臭化エチジウムが１／１２５０希
釈および１／１２５００希釈のいずれにおいてもマイク
ロプレートウェル内の溶液中に粒子状のものが観察でき
た。これはＨＣＰが巨視的な自己集合体を形成し、その
巨視的な自己集合体に臭化エチジウムがインターカレー
トして蛍光を発しているためである。

【０１０５】一方、比較例１３の対照の４パーツは粒子
状のものは観察されず、また、臭化エチジウムの濃度が
高い場合でもぼんやりと光る溶液全体の蛍光強度が強く
なるだけで、いずれの希釈濃度においても目視で確認で
きる粒子状の巨視的な自己集合体は観察されなかった。

【０１０６】よって、マイクロプレート内の液中におい
て、巨視的な自己集合体の形成を目視により確認できる
ことがわかった。

【０１０７】（実施例１４及び比較例１４〜１６） １．目的 紫外部吸収による巨視的な自己集合体検出を行った。

【０１０８】２．方法 （１）巨視的な自己集合体形成反応 実施例１４は実施例８（ＨＣＰ・６６℃）、比較例１４
は比較例８（４パーツ・６６℃）、比較例１５は実施例
９（ＨＣＰ・５６℃）、及び比較例１６は比較例９（４
パーツ・５６℃）と、それぞれ同様の手順及び条件によ
り巨視的な自己集合体の形成反応を行った。

【０１０９】（２）紫外部吸収による検出 紫外部吸収による検出においては、反応溶液を分光光度
計（ウルトラスペック３０００、ファルマシアバイオテ
ク製）で紫外部吸収により２６０ｎｍ付近のピークを測
定した。

【０１１０】３．結果 図１８に実施例１４及び比較例１４〜１６の結果を示
す。分光光度計による測定では、６６℃反応において、
実施例１４のＨＣＰの方は反応時間に依存して吸光度が
下がることが確認された。これは、塩基の積み重ねが規
則的な高次構造をとることにより、ＤＮＡ、またはオリ
ゴヌクレオチドの２６０ｎｍにおける紫外部の吸収帯の
強度が減ずる「ハイポクロミズム」という淡色効果の発
現によるものであり、規則的な高次構造の巨視的な自己
集合体が形成されていることがわかる。比較例１４の対
照の方は反応時間を延長しても吸光度に変化はなく、淡
色効果はみられない。

【０１１１】一方、５６℃反応においては、ＨＣＰ（比
較例１５）と対照（比較例１６）のいずれにおいても反
応時間による吸光度の変化はみられない。

【０１１２】

【発明の効果】以上述べた如く、本発明の巨視的な自己
集合体の検出方法により、特殊な機械や煩雑な操作を用
いずに、簡便にＰＡＬＳＡＲ法により形成された自己集
合体を目視により確認することができる。さらには、巨
視的な自己集合体形成の有無により、遺伝子検査におけ
る検出の有用性が考えられる。

【０１１３】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Sanko Junyaku Co., Ltd. <120> Process For Detecting Macroscopic Self-Assembled Oligonucleotides And Forming Thereof <130> 76160-P <160> 6 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: probe 1 <400> 1 ctgagacgct aactgcgttc gacaccctat caggcagtac gtcctcacag ttacagcgag 60 <210> 2 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: probe 2 <400> 2 gaacgcagtt agcgtctcag gtactgcctg atagggtgtc ctcgctgtaa ctgtgaggac 60 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: probe 3 <400> 3 ctgagacgct aactgcgttc gacaccctat 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: probe 4 <400> 4 caggcagtac gtcctcacag ttacagcgag 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: probe 5 <400> 5 gaacgcagtt agcgtctcag gtactgcctg 30 <210> 6 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: probe 6 <400> 6atagggtgtc ctcgctgtaa ctgtgaggac 30

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の一対のＨＣＰにより形成された巨視
的な自己集合体を目視により検出する方法を示した模式
図であり、お互いに相補的な部分がｎカ所（ｎ＝３）か
らなる一対のプローブ（ａ）の複数対を用いて、プロー
ブが互い違いに交差するようにハイブリダイゼーション
させることにより（ｂ）、オリゴヌクレオチドが自己集
合し、二本鎖の巨視的な自己集合体を形成させ（ｃ）、
濁度により、もしくは核酸と結合する色素を添加させ変
色により、目視で巨視的な自己集合体を検出することが
できることを示した図面である。

【図２】 ｎ＝４の場合の一対のＨＣＰの結合様態の一
例を示す模式図である。

【図３】 ｎ＝４の場合の一対のＤＮＡプローブが互い
違いにハイブリダイゼーションした場合にできる巨視的
な自己集合体の形成の一例を示す模式図である。

【図４】 ｎ＝５の場合の一対のＨＣＰの結合様態の一
例を示す模式図である。

【図５】 ｎ＝５の場合の一対のＤＮＡプローブが互い
違いにハイブリダイゼーションした場合にできる巨視的
な自己集合体の形成の一例を示す模式図である。

【図６】 相補的な部分がｎカ所の場合の一対のＤＮＡ
プローブの結合態様の一例を示す模式図である。

【図７】 スタッキング効果による巨視的な自己集合体
の形成の安定化の原理を示す模式図である。

【図８】 実施例及び比較例において用いたプローブに
よる巨視的な自己集合体の形成を示す図であり、（ａ）
はＨＣＰ、（ｂ）は４パーツの場合をそれぞれ示す。

【図９】 実施例１〜４及び比較例１〜４の結果を示す
写真であり、（ａ）は実施例１、（ｂ）は実施例２、
（ｃ）は実施例３、（ｄ）は実施例４、（ｅ）は比較例
１、（ｆ）は比較例２、（ｇ）は比較例３、及び（ｈ）
は比較例４の結果を示す写真である。

【図１０】 実施例５〜７及び比較例５〜７の結果を示
す写真であり、それぞれ（ａ）は実施例５、（ｂ）は実
施例６、（ｃ）は実施例７、（ｄ）は比較例５、（ｅ）
は比較例６、及び（ｆ）は比較例７の結果を示す写真で
ある。

【図１１】 実施例８及び比較例８の結果を示す写真で
ある。

【図１２】 実施例９及び比較例９の結果を示す写真で
ある。

【図１３】 実施例１０、１１、比較例１０及び１１の
結果を示す写真であり、（ａ）は実施例１０、（ｂ）は
比較例１０、（ｃ）は実施例１１及び（ｄ）は比較例１
１の結果を示す写真である。

【図１４】 実施例１２の結果を示す写真であり、
（ａ）は６６℃／０時間、（ｂ）は６６℃／０時間（可
視光）、（ｃ）は６６℃／１時間、（ｄ）は６６℃／２
時間、の場合の蛍光顕微鏡による巨視的な自己集合体の
検出の結果を示す写真である。

【図１５】 実施例１２の結果を示す写真であり、
（ｅ）は６６℃／４時間、（ｆ）は６６℃／４時間（可
視光）、（ｇ）は６６℃／１６時間、（ｈ）は６６℃／
２０時間、の場合の蛍光顕微鏡による巨視的な自己集合
体の検出の結果を示す写真である。

【図１６】 比較例１２の結果を示す写真である。

【図１７】 実施例１３及び比較例１３の結果を示す写
真である。

【図１８】 実施例１４及び比較例１４〜１６の結果を
示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 三塚 真理 千葉県柏市明原１−６−２−201 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA04 CA09 EA04 HA19 4B063 QA01 QA12 QA13 QQ43 QR32 QR55 QS34

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 お互いに相補的な部分がｎ（ｎ≧３）カ
   所の数から構成される一対のプローブの複数対を用い
   て、互い違いに交差するようにハイブリダイゼーション
   させることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、
   二本鎖の巨視的な自己集合体を形成させ、この巨視的な
   自己集合体を目視で検出することを特徴とする巨視的な
   自己集合体の検出方法。
2. 【請求項２】 前記形成された巨視的な自己集合体を、
   濁度により検出することを特徴とする請求項１記載の巨
   視的な自己集合体の検出方法。
3. 【請求項３】 前記形成された巨視的な自己集合体を、
   核酸と結合する色素を添加させ、変色により検出するこ
   とを特徴とする請求項１記載の巨視的な自己集合体の検
   出方法。
4. 【請求項４】 前記一対のプローブの構成は、１対１で
   ハイブリダイゼーションする時に必ずｎ（ｎ≧３）カ所
   の相補的な部分の中で、１カ所ずつが特異的にハイブリ
   ダイゼーションするように構成されることを特徴とする
   請求項１〜３のいずれか１項に記載の巨視的な自己集合
   体の検出方法。
5. 【請求項５】 前記プローブの相補的塩基配列領域の分
   岐点に、少なくとも１つのＧ（グアニン）またはＣ（シ
   トシン）を配置させ、プローブがハイブリダイズした際
   に少なくとも１つのＣ−Ｇ結合を相補的塩基配列領域の
   端部に形成させることを特徴とする請求項１〜４のいず
   れか１項に記載の巨視的な自己集合体の検出方法。
6. 【請求項６】 前記ハイブリダイゼーションの反応温度
   を、前記プローブのＴｍ値付近とすることを特徴とする
   請求項項１〜５のいずれか１項に記載の巨視的な自己集
   合体の検出方法。
7. 【請求項７】 前記ハイブリダイゼーションの反応温度
   を、前記プローブのＴｍ値に対し＋５℃〜−４０℃の範
   囲とすることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項
   に記載の巨視的な自己集合体の検出方法。
8. 【請求項８】 前記核酸と結合する色素が、蛍光を有す
   るインターカレーターであることを特徴とする請求項３
   〜７のいずれか１項に記載の巨視的な自己集合体の検出
   方法。
9. 【請求項９】 お互いに相補的な部分がｎ（ｎ≧３）カ
   所の数から構成される一対のプローブの複数対を用い
   て、プローブのＴｍ値付近の反応温度にて、互い違いに
   交差するようにハイブリダイゼーションさせることによ
   り、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の巨視的
   な自己集合体を形成させることを特徴とする巨視的な自
   己集合体の形成方法。
10. 【請求項１０】 お互いに相補的な部分がｎ（ｎ≧３）
    カ所の数から構成される一対のプローブの複数対を用い
    て、プローブのＴｍ値に対し＋５℃〜−４０℃の範囲の
    反応温度にて、互い違いに交差するようにハイブリダイ
    ゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自
    己集合し、二本鎖の巨視的な自己集合体を形成させるこ
    とを特徴とする巨視的な自己集合体の形成方法。
11. 【請求項１１】 前記巨視的な自己集合体が、濁度によ
    り、目視で検出可能であることを特徴とする請求項９又
    は１０記載の巨視的な自己集合体の形成方法。
12. 【請求項１２】 核酸と結合する色素を添加させ、変色
    により、目視で検出可能な巨視的な自己集合体を形成す
    ることを特徴とする請求項９又は１０記載の巨視的な自
    己集合体の形成方法。
13. 【請求項１３】 請求項９〜１２のいずれか１項に記載
    の方法で形成された巨視的な自己集合体。