JP2002537780A - Ｓｎｐ検出 - Google Patents
Ｓｎｐ検出Info
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- JP2002537780A JP2002537780A JP2000601417A JP2000601417A JP2002537780A JP 2002537780 A JP2002537780 A JP 2002537780A JP 2000601417 A JP2000601417 A JP 2000601417A JP 2000601417 A JP2000601417 A JP 2000601417A JP 2002537780 A JP2002537780 A JP 2002537780A
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- snp
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- polynucleotide
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、標的ポリヌクレオチドの集団中に存在する複数の一塩基多型（ＳＮＰｓ）を、ＳＮＰプローブ、捕獲ポリヌクレオチド、及び場合によっては補助ポリヌクレオチドを用いて同時に検出する方法、組成物及びシステムを提供する。対応するＳＮＰ領域に対するＳＮＰプローブの相対的親和性が、プローブの融解温度を規格化する試薬で、及び／又はＳＮＰプローブ、ＳＮＰ領域、捕獲ポリヌクレオチド及び／又は補助ポリヌクレオチドの間の相互作用を、例えば副溝結合剤を通して、位置的に容易にすることによって増強できる。プローブは可能なかぎり全てが同じ長さのポリヌクレオチドの縮退した集合であり得、捕獲ポリヌクレオチドは一般に対応する個々のエレメントにて高密度に固定化され、アレイ化される。
Description
【０００１】 （序） （発明の分野） 本発明は、遺伝分析（遺伝子型タイピング）の分野におけるものである。
【０００２】 （背景） 核酸配列の変異を検出する能力は、医学遺伝学の分野において非常に重要なも
のである：遺伝的変異の検出は、とりわけ、遺伝病の分子生物学的根拠を決定し
、遺伝的なカウンセリングのためのキャリアー及び出生前診断を提供し、および
医薬を個人別化することを促進するために、遺伝学的研究における多型を同定す
ることにおいて重要である。ＤＮＡレベルでの遺伝的変異の検出と分析は、核型
分類、制限断片長多型（ＲＦＬＰｓ）もしくは可変核酸型多型（ＶＮＴＲｓ）、
さらに近年では一塩基多型分析（ＳＮＰｓ）分析により行われてきた。例えば、
Lai E.等, Genomics 1998, 15;54(1):31-8; Gu Z等,Hum Mutat. 1998;12(4):221
-5; Taillon-Miller P等, Genome Res. 1998;8(7):748-54; Weiss KM., Genome
Res. 1998; 8(7):691-7; Zhao LP等, Am J Hum Genet. 1998;63(1):225-40.を参
照のこと。
のである：遺伝的変異の検出は、とりわけ、遺伝病の分子生物学的根拠を決定し
、遺伝的なカウンセリングのためのキャリアー及び出生前診断を提供し、および
医薬を個人別化することを促進するために、遺伝学的研究における多型を同定す
ることにおいて重要である。ＤＮＡレベルでの遺伝的変異の検出と分析は、核型
分類、制限断片長多型（ＲＦＬＰｓ）もしくは可変核酸型多型（ＶＮＴＲｓ）、
さらに近年では一塩基多型分析（ＳＮＰｓ）分析により行われてきた。例えば、
Lai E.等, Genomics 1998, 15;54(1):31-8; Gu Z等,Hum Mutat. 1998;12(4):221
-5; Taillon-Miller P等, Genome Res. 1998;8(7):748-54; Weiss KM., Genome
Res. 1998; 8(7):691-7; Zhao LP等, Am J Hum Genet. 1998;63(1):225-40.を参
照のこと。
【０００３】 非常に広範な技術がＳＮＰの検出及び解析のために開発されてきた。例えば、
Sapolsky 等(1999) 米国特許第5,858,659号；Shuber(1997) 米国特許第5,633,13
4号; Dahlberg(1998) 米国特許第5,719,028号；Murigneux (1998) 国際公開番号
98/30717；Shuber(1997) 国際公開番号97/10366；Murphy 等 (1998) 国際公開番
号98/44157；Lander 等 (1998) 国際公開番号98/20165；Goelet 等 (1995) 国
際公開番号95/12607及びCronin 等 (1998) 国際公開番号98/30883を参照のこと
。さらに、リガーゼ法は、Barany 等 (1997) 国際公開番号97/31256 及びChen等
, Genome Res. 1998;8(5):549-56を；マススペクトロスコピー法は、Monforte(1
998) 国際公開番号98/12355,Turano等 (1998) 国際公開番号98/14616 及びRoss
等 (1997) Anal Chem. 15,4197-202を；ＰＣＲ法は、Hauser 等 (1998) Plant J
.16,117-25を；エクソヌクレアーゼ法は、Mundy米国特許第4,656,127号を；ジデ
オキシヌクレオチド法は、Cohen 等 国際公開番号91/02087を；ジェネティック
ビット分析もしくはＧＢＡ（登録商標）は、Goelet 等 国際公開番号92/15712を
；オリゴヌクレオチドライゲーション分析もしくはＯＬＡは、Landegren 等 (19
88) Science 241:1077-1080及びNickerson 等(1990) Proc.Nalt.Acad.Sci. (U.S
.A.) 87:8923-8927を；及びプライマー先導核酸取込法は、Prezant等(1992) Hum
. Mutat. 1:159-164; Ugozzoli等(1992) GATA 9:107-112;Nyreen等(1993) Anal.
Biochem. 208:171-175を参照のこと。
Sapolsky 等(1999) 米国特許第5,858,659号；Shuber(1997) 米国特許第5,633,13
4号; Dahlberg(1998) 米国特許第5,719,028号；Murigneux (1998) 国際公開番号
98/30717；Shuber(1997) 国際公開番号97/10366；Murphy 等 (1998) 国際公開番
号98/44157；Lander 等 (1998) 国際公開番号98/20165；Goelet 等 (1995) 国
際公開番号95/12607及びCronin 等 (1998) 国際公開番号98/30883を参照のこと
。さらに、リガーゼ法は、Barany 等 (1997) 国際公開番号97/31256 及びChen等
, Genome Res. 1998;8(5):549-56を；マススペクトロスコピー法は、Monforte(1
998) 国際公開番号98/12355,Turano等 (1998) 国際公開番号98/14616 及びRoss
等 (1997) Anal Chem. 15,4197-202を；ＰＣＲ法は、Hauser 等 (1998) Plant J
.16,117-25を；エクソヌクレアーゼ法は、Mundy米国特許第4,656,127号を；ジデ
オキシヌクレオチド法は、Cohen 等 国際公開番号91/02087を；ジェネティック
ビット分析もしくはＧＢＡ（登録商標）は、Goelet 等 国際公開番号92/15712を
；オリゴヌクレオチドライゲーション分析もしくはＯＬＡは、Landegren 等 (19
88) Science 241:1077-1080及びNickerson 等(1990) Proc.Nalt.Acad.Sci. (U.S
.A.) 87:8923-8927を；及びプライマー先導核酸取込法は、Prezant等(1992) Hum
. Mutat. 1:159-164; Ugozzoli等(1992) GATA 9:107-112;Nyreen等(1993) Anal.
Biochem. 208:171-175を参照のこと。
【０００４】 （発明の概要） 本発明は、標的ポリヌクレオチド集団において、同時に複数のＳＮＰｓを検出
するための方法、組成物及びシステムを提供する。一般に、その方法は、（ａ）
標的ポリヌクレオチド、捕獲ポリヌクレオチド及びＳＮＰプローブを、各々の標
的ポリヌクレオチドが、異なった捕獲領域と異なったＳＮＰ領域で対応する異な
るＳＮＰを含み、捕獲ポリヌクレオチドが、対応する基質上の個々のエレメント
部位において固定化及びアレイ化され、さらに各々の捕獲ポリヌクレオチドが対
応する異なる捕獲領域に特異的にハイブリダイズする配列を含み、各々のＳＮＰ
プローブが対応するＳＮＰ領域に相補的な配列を含み、標的ポリヌクレオチドが
、各々の標的ポリヌクレオチドが基質の対応する個々のエレメント部位に固定化
されるように捕獲ポリヌクレオチドに対してハイブリダイズすることで固定化さ
れ、さらに対応するＳＮＰ領域に対する各々のＳＮＰプローブの相対的親和性が
、対応するＳＮＰ領域に対してＳＮＰプローブの選択的なハイブリダイズ化をも
たらすのに充分であり、それによって、各々のＳＮＰプローブが対応するＳＮＰ
領域にハイブリダイズする条件下で、混合し、（ｂ）基質上における各々のＳＮ
Ｐプローブの存在を検出する工程を含み、与えられたＳＮＰプローブの与えられ
たエレメントにおける存在が、対応する標的ポリヌクレオチドにおける対応する
ＳＮＰの存在を示す。
するための方法、組成物及びシステムを提供する。一般に、その方法は、（ａ）
標的ポリヌクレオチド、捕獲ポリヌクレオチド及びＳＮＰプローブを、各々の標
的ポリヌクレオチドが、異なった捕獲領域と異なったＳＮＰ領域で対応する異な
るＳＮＰを含み、捕獲ポリヌクレオチドが、対応する基質上の個々のエレメント
部位において固定化及びアレイ化され、さらに各々の捕獲ポリヌクレオチドが対
応する異なる捕獲領域に特異的にハイブリダイズする配列を含み、各々のＳＮＰ
プローブが対応するＳＮＰ領域に相補的な配列を含み、標的ポリヌクレオチドが
、各々の標的ポリヌクレオチドが基質の対応する個々のエレメント部位に固定化
されるように捕獲ポリヌクレオチドに対してハイブリダイズすることで固定化さ
れ、さらに対応するＳＮＰ領域に対する各々のＳＮＰプローブの相対的親和性が
、対応するＳＮＰ領域に対してＳＮＰプローブの選択的なハイブリダイズ化をも
たらすのに充分であり、それによって、各々のＳＮＰプローブが対応するＳＮＰ
領域にハイブリダイズする条件下で、混合し、（ｂ）基質上における各々のＳＮ
Ｐプローブの存在を検出する工程を含み、与えられたＳＮＰプローブの与えられ
たエレメントにおける存在が、対応する標的ポリヌクレオチドにおける対応する
ＳＮＰの存在を示す。
【０００５】 特定の実施態様では、各々のＳＮＰプローブの対応するＳＮＰ領域に対する相
対的親和性が、対応するＳＮＰ領域に対するＳＮＰプローブの選択的ハイブリダ
イズ化を亢進するのに充分な程度増強しており、その親和性により、各々のＳＮ
Ｐプローブが対応するＳＮＰ領域にハイブリダイズ化し、さらに（ｂ）基質上に
おける各々のＳＮＰプローブの存在を検出し、与えられたＳＮＰプローブの与え
られたエレメント部位における存在が、対応する標的ポリヌクレオチドにおける
対応するＳＮＰの存在を示す。
対的親和性が、対応するＳＮＰ領域に対するＳＮＰプローブの選択的ハイブリダ
イズ化を亢進するのに充分な程度増強しており、その親和性により、各々のＳＮ
Ｐプローブが対応するＳＮＰ領域にハイブリダイズ化し、さらに（ｂ）基質上に
おける各々のＳＮＰプローブの存在を検出し、与えられたＳＮＰプローブの与え
られたエレメント部位における存在が、対応する標的ポリヌクレオチドにおける
対応するＳＮＰの存在を示す。
【０００６】 特定の実施態様では、ＳＮＰプローブはアッセイ用プローブの部分集合であり
、対応するＳＮＰ領域に対する各々のＳＮＰプローブの相対的親和性は、（ａ）
混合工程において、アッセイプローブの融解温度を規格化する試薬を含ませる工
程を含む方法と（ｂ）対応する標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズ化された
補助プローブもしくは捕獲ポリヌクレオチドと、例えばＳＮＰプローブ、捕獲ポ
リヌクレオチド及び補助プローブの少なくとも一つに拘束される副溝結合剤を通
じて相互作用するＳＮＰプローブの少なくとも一方により、少なくとも部分的に
増強される。
、対応するＳＮＰ領域に対する各々のＳＮＰプローブの相対的親和性は、（ａ）
混合工程において、アッセイプローブの融解温度を規格化する試薬を含ませる工
程を含む方法と（ｂ）対応する標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズ化された
補助プローブもしくは捕獲ポリヌクレオチドと、例えばＳＮＰプローブ、捕獲ポ
リヌクレオチド及び補助プローブの少なくとも一つに拘束される副溝結合剤を通
じて相互作用するＳＮＰプローブの少なくとも一方により、少なくとも部分的に
増強される。
【０００７】 一般的な方法の他の実施態様では、アッセイ用プローブは、一組の縮退した可
能な限り同サイズのポリヌクレオチドを含んでいる；標的ポリヌクレオチドは試
料ポリヌクレオチドの部分集合であり、試料ポリヌクレオチドは断片化ゲノムＤ
ＮＡを含んでいる；捕獲ポリヌクレオチドは固定化ポリヌクレオチドの部分集合
であり、固定化ポリヌクレオチドはｃＤＮＡライブラリーを分離しアレイ化した
ものである；捕獲ポリヌクレオチドは、高密度で対応する個々のエレメント部位
において固定化されアレイ化されている；及び／又は各々のＳＮＰプローブは標
識を含んでいる。 対象とされる組成物は、ここに開示された方法に適した薬剤の集合及び／又は
混合物を包含し、対象とされるシステム（系）は、ここに開示の方法に適したキ
ット及び／又は装置をさらに含んでも良い。
能な限り同サイズのポリヌクレオチドを含んでいる；標的ポリヌクレオチドは試
料ポリヌクレオチドの部分集合であり、試料ポリヌクレオチドは断片化ゲノムＤ
ＮＡを含んでいる；捕獲ポリヌクレオチドは固定化ポリヌクレオチドの部分集合
であり、固定化ポリヌクレオチドはｃＤＮＡライブラリーを分離しアレイ化した
ものである；捕獲ポリヌクレオチドは、高密度で対応する個々のエレメント部位
において固定化されアレイ化されている；及び／又は各々のＳＮＰプローブは標
識を含んでいる。 対象とされる組成物は、ここに開示された方法に適した薬剤の集合及び／又は
混合物を包含し、対象とされるシステム（系）は、ここに開示の方法に適したキ
ット及び／又は装置をさらに含んでも良い。
【０００８】 （本発明の特定の実施態様の詳細な説明） 以下に示す特定の実施態様と実施例の次の説明は例示のために提供されるもの
で、発明の限定をもたらすものではない。 禁忌を示すか又は他に注記しない限り、この明細書全てにおいて、「ａ」及び
「ａｎ」という用語は「一」もしくは「それ以上」を意味し、「又は」という用
語は「及び／又は」を意味する。
で、発明の限定をもたらすものではない。 禁忌を示すか又は他に注記しない限り、この明細書全てにおいて、「ａ」及び
「ａｎ」という用語は「一」もしくは「それ以上」を意味し、「又は」という用
語は「及び／又は」を意味する。
【０００９】 一般的方法の最初の工程には、標的ポリヌクレオチド、捕獲ポリヌクレオチド
及びＳＮＰプローブを混合し、又はその混合物を形成することが含まれる。これ
らの成分は各々ポリヌクレオチド配列、即ち核酸のポリマー又はその類似体を含
んでいる。ポリヌクレオチドの長さと配列は、そのタイプと適用に依存して変動
する。例えば、標的ポリヌクレオチドは、しばしばキロベースにも達するが、一
方、プローブポリヌクレオチドは長さが数ヌクレオチドにしかすぎない場合もあ
る。ポリヌクレオチドの塩基は通常Ａ、Ｔ（もしくはＵ）、ＣもしくはＧである
が、さらに、あるいは代わりに、二重及び／又は三重鎖ポリヌクレオチド中の相
補な塩基もしくは機能的等価物と対結合をする前記塩基の機能的な等価物を含ん
でも良い。そのような機能的等価物は当該技術分野において周知なものであり、
１,２ジアミノプリン、イノシン、メチル化核酸塩基などである。同様に、糖、
分子骨格及びヌクレオチド間結合が通常天然の成分（例えば、ホスホジエステル
結合を通じて連結されているリボースもしくはデオキシリボース糖）であるが、
さらに、あるいは代わりに、同様のもしくは類似の機能を示すその機能的等価物
を含んでもよい。そのような等価物は当該技術分野において周知であり、ペプチ
ド核酸（ＰＮＡｓ）、ホスホロチオアート、２'Ｏ-アルキル糖のような糖の修飾
物、デアザ-修飾物、チオグアニンを含むような塩基類似物などを包含する。本
方法において用いられる、長さ、ストランデドネス、ＧＣ含量、二次構造など、
その他のポリヌクレオチドの変量は、各々のポリヌクレオチドに対し以下に記述
し例示されるようなアッセイ条件下において至適な実施を行うために、容易に選
択される。
及びＳＮＰプローブを混合し、又はその混合物を形成することが含まれる。これ
らの成分は各々ポリヌクレオチド配列、即ち核酸のポリマー又はその類似体を含
んでいる。ポリヌクレオチドの長さと配列は、そのタイプと適用に依存して変動
する。例えば、標的ポリヌクレオチドは、しばしばキロベースにも達するが、一
方、プローブポリヌクレオチドは長さが数ヌクレオチドにしかすぎない場合もあ
る。ポリヌクレオチドの塩基は通常Ａ、Ｔ（もしくはＵ）、ＣもしくはＧである
が、さらに、あるいは代わりに、二重及び／又は三重鎖ポリヌクレオチド中の相
補な塩基もしくは機能的等価物と対結合をする前記塩基の機能的な等価物を含ん
でも良い。そのような機能的等価物は当該技術分野において周知なものであり、
１,２ジアミノプリン、イノシン、メチル化核酸塩基などである。同様に、糖、
分子骨格及びヌクレオチド間結合が通常天然の成分（例えば、ホスホジエステル
結合を通じて連結されているリボースもしくはデオキシリボース糖）であるが、
さらに、あるいは代わりに、同様のもしくは類似の機能を示すその機能的等価物
を含んでもよい。そのような等価物は当該技術分野において周知であり、ペプチ
ド核酸（ＰＮＡｓ）、ホスホロチオアート、２'Ｏ-アルキル糖のような糖の修飾
物、デアザ-修飾物、チオグアニンを含むような塩基類似物などを包含する。本
方法において用いられる、長さ、ストランデドネス、ＧＣ含量、二次構造など、
その他のポリヌクレオチドの変量は、各々のポリヌクレオチドに対し以下に記述
し例示されるようなアッセイ条件下において至適な実施を行うために、容易に選
択される。
【００１０】 本方法における標的ポリヌクレオチドは、各々異なる捕獲領域と対応するＳＮ
Ｐを含む異なるＳＮＰ領域を含む。機能的には、これらは捕獲ポリヌクレオチド
及びＳＮＰプローブとそれぞれハイブリダイズする領域である。捕獲及びＳＮＰ
領域は、全体もしくは一部分重なりあい、ＳＮＰプローブによる捕獲領域-捕獲
ポリヌクレオチドハイブリダイズへの侵入（例えば、三重鎖へリックス形成）を
必要とするかもしれないし、もしくは非重なり状態（即ち、位置的に異なる）で
あるかもしれない。通常、標的ポリヌクレオチド（本方法において実際にはＳＮ
Ｐプローブの結合のために固定化されアッセイされる分子）は試料ポリヌクレオ
チドの部分集合である。試料ポリヌクレオチドは、ゲノム断片化ＤＮＡ、ランダ
ム増幅されたゲノムＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ，ＲＮＡ、ｃＤＮＡ
などを含む十分に確立された技術を使うことでＳＮＰ解析のために求められた原
料から誘導され得る。特定の実施態様では、試料ポリヌクレオチドはヒト組織か
らの断片化ゲノムＤＮＡを含む。例えば、ＤＮＡは、：（ｉ）全血から得られた
白血球；（ｉｉ）拭き取りもしくは細胞採取用ブラシもしくは口内洗浄方法（Le
nch, N. 等 The Lancet 1:1356-8 (Jun. 18, 1988,) ）を用いることで得た口内
細胞；（ｉｉｉ）ブラッシング、拭き取り、もしくは洗浄（Burk, R. D. 及びC.
Spitzer Am J Obstet Gynecol. 162:652-4(1990)）を用いることで得た頚膣細
胞；（ｉｖ）尿中より得た上皮細胞（Gasparini, P. 等 N. Engl. J. Med 320:8
09(1989)）もしくは毛根（Higuchi, R 等 Nature 332:543-6(1988)）；（v）羊
水、臍帯血、絨毛膜細胞、頸管分泌物もしくは母性血から得た胎児性細胞（Bian
chi, D. W.等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3279-83(1990)）；（ｖｉ）胎児
の組織診により得た胚性細胞などから得ることができる。一旦得られれば、試料
ポリヌクレオチドは当該技術分野において周知の技術を用いることでハイブリダ
イズ化に用いるために調製することができる。例えば、広く多様な確立したポリ
ヌクレオチド増幅法を、ハイブリダイズ化に利用可能なポリヌクレオチドの数を
増加させ、それによりここで開示される方法において得られる最終的なシグナル
を増加させるために用いてもよい。
Ｐを含む異なるＳＮＰ領域を含む。機能的には、これらは捕獲ポリヌクレオチド
及びＳＮＰプローブとそれぞれハイブリダイズする領域である。捕獲及びＳＮＰ
領域は、全体もしくは一部分重なりあい、ＳＮＰプローブによる捕獲領域-捕獲
ポリヌクレオチドハイブリダイズへの侵入（例えば、三重鎖へリックス形成）を
必要とするかもしれないし、もしくは非重なり状態（即ち、位置的に異なる）で
あるかもしれない。通常、標的ポリヌクレオチド（本方法において実際にはＳＮ
Ｐプローブの結合のために固定化されアッセイされる分子）は試料ポリヌクレオ
チドの部分集合である。試料ポリヌクレオチドは、ゲノム断片化ＤＮＡ、ランダ
ム増幅されたゲノムＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ，ＲＮＡ、ｃＤＮＡ
などを含む十分に確立された技術を使うことでＳＮＰ解析のために求められた原
料から誘導され得る。特定の実施態様では、試料ポリヌクレオチドはヒト組織か
らの断片化ゲノムＤＮＡを含む。例えば、ＤＮＡは、：（ｉ）全血から得られた
白血球；（ｉｉ）拭き取りもしくは細胞採取用ブラシもしくは口内洗浄方法（Le
nch, N. 等 The Lancet 1:1356-8 (Jun. 18, 1988,) ）を用いることで得た口内
細胞；（ｉｉｉ）ブラッシング、拭き取り、もしくは洗浄（Burk, R. D. 及びC.
Spitzer Am J Obstet Gynecol. 162:652-4(1990)）を用いることで得た頚膣細
胞；（ｉｖ）尿中より得た上皮細胞（Gasparini, P. 等 N. Engl. J. Med 320:8
09(1989)）もしくは毛根（Higuchi, R 等 Nature 332:543-6(1988)）；（v）羊
水、臍帯血、絨毛膜細胞、頸管分泌物もしくは母性血から得た胎児性細胞（Bian
chi, D. W.等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3279-83(1990)）；（ｖｉ）胎児
の組織診により得た胚性細胞などから得ることができる。一旦得られれば、試料
ポリヌクレオチドは当該技術分野において周知の技術を用いることでハイブリダ
イズ化に用いるために調製することができる。例えば、広く多様な確立したポリ
ヌクレオチド増幅法を、ハイブリダイズ化に利用可能なポリヌクレオチドの数を
増加させ、それによりここで開示される方法において得られる最終的なシグナル
を増加させるために用いてもよい。
【００１１】 本発明の捕獲ポリヌクレオチドは、ある配列長を含み、混合工程の条件下にお
いて、その捕獲領域と特異的にハイブリダイズするのに充分な程度の対応する異
なる捕獲領域に対する相補性を含む。通常、捕獲ポリヌクレオチド（標的ポリヌ
クレオチドを保持する分子）は固定化されたポリヌクレオチドの部分集合である
。固定化されたポリヌクレオチドは、十分に確立された技術を用いて、増幅され
た及び／又はクローン化されたＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ等、広範な原料に由来し得
る。特定の実施態様では、機能的な部分集合、好適には既に決定されている機能
的な部分集合のみをハイブリダイズ化により保持することで、固定化したポリヌ
クレオチドは、試料ポリヌクレオチドの複雑さを減少させるのに効果を示す。例
えば、分離され、アレイ化されたｃＤＮＡライブラリーは、断片化ゲノムＤＮＡ
試料ポリヌクレオチドの部分集合を選択するため（複雑さを減少させるため）に
固定化ポリヌクレオチドとして使用しても良い。そのようなハイブリダイズ化（
ハイブリダイズ化は液体中もしくは固相中で起こりえる）の前、行っている最中
、もしくは行った後、捕獲ポリヌクレオチドは、対応する分離した基質上の非重
複エレメントの位置に固定化及びアレイ化され、その結果各々のエレメントが異
なる捕獲ポリヌクレオチドを包含する。ガラス、シリコン、プラスティック、ナ
イロン膜などの基質の分離したエレメントの位置にポリヌクレオチドをアレイ化
するために、直接沈着法、例えば米国特許第5,807,522号；米国特許第5,770,151
号など；写真リトグラフ法、例えば米国特許第5,861,242号；5,858,659号；5,85
6,174号； 5,856,101；5,837,832号など；流路法、例えば米国特許第5,384,261
号；ディップ-ペンナノリトグラフィー法、例えばPiner等, Science Jan 29 199
9:661-663 など；など、広く多様な材料及び方法が、当該技術分野において周知
である。好適実施態様において、捕獲ポリヌクレオチドは高密度に通常は1ｃｍ
平方あたり少なくとも100、好適には少なくとも1000、より好適には少なくとも1
0,000、最も好適には少なくとも100,000の密度で、対応する分離したエレメント
の位置にアレイ化されている。
いて、その捕獲領域と特異的にハイブリダイズするのに充分な程度の対応する異
なる捕獲領域に対する相補性を含む。通常、捕獲ポリヌクレオチド（標的ポリヌ
クレオチドを保持する分子）は固定化されたポリヌクレオチドの部分集合である
。固定化されたポリヌクレオチドは、十分に確立された技術を用いて、増幅され
た及び／又はクローン化されたＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ等、広範な原料に由来し得
る。特定の実施態様では、機能的な部分集合、好適には既に決定されている機能
的な部分集合のみをハイブリダイズ化により保持することで、固定化したポリヌ
クレオチドは、試料ポリヌクレオチドの複雑さを減少させるのに効果を示す。例
えば、分離され、アレイ化されたｃＤＮＡライブラリーは、断片化ゲノムＤＮＡ
試料ポリヌクレオチドの部分集合を選択するため（複雑さを減少させるため）に
固定化ポリヌクレオチドとして使用しても良い。そのようなハイブリダイズ化（
ハイブリダイズ化は液体中もしくは固相中で起こりえる）の前、行っている最中
、もしくは行った後、捕獲ポリヌクレオチドは、対応する分離した基質上の非重
複エレメントの位置に固定化及びアレイ化され、その結果各々のエレメントが異
なる捕獲ポリヌクレオチドを包含する。ガラス、シリコン、プラスティック、ナ
イロン膜などの基質の分離したエレメントの位置にポリヌクレオチドをアレイ化
するために、直接沈着法、例えば米国特許第5,807,522号；米国特許第5,770,151
号など；写真リトグラフ法、例えば米国特許第5,861,242号；5,858,659号；5,85
6,174号； 5,856,101；5,837,832号など；流路法、例えば米国特許第5,384,261
号；ディップ-ペンナノリトグラフィー法、例えばPiner等, Science Jan 29 199
9:661-663 など；など、広く多様な材料及び方法が、当該技術分野において周知
である。好適実施態様において、捕獲ポリヌクレオチドは高密度に通常は1ｃｍ
平方あたり少なくとも100、好適には少なくとも1000、より好適には少なくとも1
0,000、最も好適には少なくとも100,000の密度で、対応する分離したエレメント
の位置にアレイ化されている。
【００１２】 本発明におけるＳＮＰプローブは、混合過程における条件下でそのＳＮＰ領域
と特異的にハイブリダイズ化するような対応のＳＮＰ領域に対する充分な相補性
配列により構成されるポリヌクレオチドである。通常、ＳＮＰプローブ（標的ポ
リヌクレオチドにハイブリダイズ化することにより保持される分子）はアッセイ
プローブの部分集合であり、それらは典型的には対立遺伝子特異的に構築されて
おり、一又はそれ以上の対立遺伝子多様性形態の存在下において、標的対立遺伝
子と選択的にハイブリダイズ化し二成分のシグナルを提示する。各々のプローブ
の多様性部位は通常異なる対立遺伝子に共通の領域から両側において隣接してい
る。
と特異的にハイブリダイズ化するような対応のＳＮＰ領域に対する充分な相補性
配列により構成されるポリヌクレオチドである。通常、ＳＮＰプローブ（標的ポ
リヌクレオチドにハイブリダイズ化することにより保持される分子）はアッセイ
プローブの部分集合であり、それらは典型的には対立遺伝子特異的に構築されて
おり、一又はそれ以上の対立遺伝子多様性形態の存在下において、標的対立遺伝
子と選択的にハイブリダイズ化し二成分のシグナルを提示する。各々のプローブ
の多様性部位は通常異なる対立遺伝子に共通の領域から両側において隣接してい
る。
【００１３】 プローブは、当該技術分野において周知の方法に従って直接もしくは間接的に
検出可能なマーカーで標識することができ、それらの方法には放射活性末端標識
法（例えば、32Ｐもしくは35Ｓ）、好適には、マススペクトロスコピー標識、蛍
光もしくは酵素の直接又は間接結合による非同位体法を含み、もしくは免疫化学
的に検出可能にするような核酸断片の様々な化学的修飾、もしくは他の親和性反
応によっても標識可能である。蛍光色素標識においては、本方法は典型的には最
大励起に近い波長の入力光を使用し、最大発放射波長に近い波長（多くの場合、
プラス、マイナス約10ナノメーターが望ましい）を検出する。レーザー光を用い
ることで、励起は最大励起波長からかけ離れたところで生じ得る。特定の実施態
様において、本発明はエネルギー伝達色素の倍数を利用する。例えば、供与体と
受容体成分は同じ分子（例えば、ＳＮＰプローブ）もしくは異なる分子（例えば
、捕獲、標的及びＳＮＰプローブもしくは捕獲又は標的ポリヌクレオチド上の一
つの受容体及び二つの異なるＳＮＰプローブ上の二つの異なる受容体）に結合さ
れ得る。例示的に、最大吸収及び放射波長と共に蛍光標識及び供与／受容体の組
を表１及び２に示す。
検出可能なマーカーで標識することができ、それらの方法には放射活性末端標識
法（例えば、32Ｐもしくは35Ｓ）、好適には、マススペクトロスコピー標識、蛍
光もしくは酵素の直接又は間接結合による非同位体法を含み、もしくは免疫化学
的に検出可能にするような核酸断片の様々な化学的修飾、もしくは他の親和性反
応によっても標識可能である。蛍光色素標識においては、本方法は典型的には最
大励起に近い波長の入力光を使用し、最大発放射波長に近い波長（多くの場合、
プラス、マイナス約10ナノメーターが望ましい）を検出する。レーザー光を用い
ることで、励起は最大励起波長からかけ離れたところで生じ得る。特定の実施態
様において、本発明はエネルギー伝達色素の倍数を利用する。例えば、供与体と
受容体成分は同じ分子（例えば、ＳＮＰプローブ）もしくは異なる分子（例えば
、捕獲、標的及びＳＮＰプローブもしくは捕獲又は標的ポリヌクレオチド上の一
つの受容体及び二つの異なるＳＮＰプローブ上の二つの異なる受容体）に結合さ
れ得る。例示的に、最大吸収及び放射波長と共に蛍光標識及び供与／受容体の組
を表１及び２に示す。
【００１４】 表1. 代表的な蛍光標識と最大吸収及び最大放射波長 色素 最大吸収波長（ｎｍ） 最大放射波長（ｎｍ） Ｃｙ２ ４８９ ５０６ Ｃｙ３ ５５０ ５７０ Ｃｙ３.５ ５８１ ５９６ Ｃｙ５ ６４９ ６７０ Ｃｙ７ ７４３ ７６７ フルオレセイン ４９４ ５２０ テトラメチルローダミン ５４０ ５６５ （混合異性体） リサミンローダミンＢ ５６８ ５８３ カルボキシローダミン６Ｇ ５２４ ５５２ （混合異性体） カルボキシ-Ｘ-ローダミン ５６８ ５９５ テキサスレッド ５８７ ６０２ 表２. 代表的な蛍光標識の供与／受容体の組と最大吸収及び最大放射波長 色素１ 吸収 放射 色素２ 吸収 放射 Ｃｙ３ ５５０ ５７０ Ｃｙ５ ６４９ ６７０ フルオレセイン ４９４ ５２０ リサミン ５６８ ５８３ カルボキシロー ５２４ ５５２ テキサスレッド ５８７ ６０２ ダミン６Ｇ
【００１５】 単一のアレイエレメントに対する単一反応において複数のＳＮＰｓもしくは２
以上の対立遺伝子をもつＳＮＰを検出するためには、複数の差動的に検出可能な
標識を用意することが有用である。例えば、ある位置において同時に異なるｎ（
例えば４）個の対立遺伝子をプローブ化するのに、ｎ（例えば４）個の差動的に
検出可能な標識（例えば、Ｃｙ２，Ｃｙ３，Ｃｙ５及びＣｙ７）を活用する、又
は、ｍ個の対立遺伝子を持つ標的に対するｎ個の異なるＳＮＰｓを同時にプロー
ブ化するためには、各々ｎｘｍの差動的に検出可能な標識を活用する（例えば、
それぞれ２つの対立遺伝子を持つ２つのＳＮＰｓに対して、本実施態様は４つの
差動的に検出可能は標識を活用し、例えば、１のＳＮＰにはＣｙ２/Ｃｙ７を割
り当て、他方のＳＮＰにはＣｙ３/Ｃｙ５を割り当てる）。類似の方法が、同一
のアレイスポットに対し複数の試料の混合物における同一のＳＮＰを同時にプロ
ーブ化するために用いられる。
以上の対立遺伝子をもつＳＮＰを検出するためには、複数の差動的に検出可能な
標識を用意することが有用である。例えば、ある位置において同時に異なるｎ（
例えば４）個の対立遺伝子をプローブ化するのに、ｎ（例えば４）個の差動的に
検出可能な標識（例えば、Ｃｙ２，Ｃｙ３，Ｃｙ５及びＣｙ７）を活用する、又
は、ｍ個の対立遺伝子を持つ標的に対するｎ個の異なるＳＮＰｓを同時にプロー
ブ化するためには、各々ｎｘｍの差動的に検出可能な標識を活用する（例えば、
それぞれ２つの対立遺伝子を持つ２つのＳＮＰｓに対して、本実施態様は４つの
差動的に検出可能は標識を活用し、例えば、１のＳＮＰにはＣｙ２/Ｃｙ７を割
り当て、他方のＳＮＰにはＣｙ３/Ｃｙ５を割り当てる）。類似の方法が、同一
のアレイスポットに対し複数の試料の混合物における同一のＳＮＰを同時にプロ
ーブ化するために用いられる。
【００１６】 いくつかのプローブ変数は、シグナル強度及び特異性を最適化するために変調
してもよい。同一のハイブリダイズ反応において複数の変異を検出するためにま
とめて利用されるプローブは、好適にはおよそ同じ長さ（即ち、おおよそ同じ塩
基対数）であり、自動合成機を用いて容易に合成される長さであるが、プローブ
の長さはシグナル及び対立遺伝子の識別のために最適化されることができる。低
いシグナルを発生させるプローブは長くすることが可能であり、一方弱い識別力
を示すプローブは短くすることができる。まとめて利用される特定のプローブの
至適濃度は、経験的に決定することができる。もし、産出されるシグナルが低す
ぎる場合、適度なシグナル強度が得られ、一方バックグラウンドのノイズが最小
になるまで濃度を倍加させる。例えば、嚢胞性繊維症膜貫通制御遺伝子をプロー
ブ化するためにまとめて使用されるプローブ各々の至適濃度は、当初０．０３ｐ
ｍｏｌの濃度で検査された。シグナルを至適化するための他の変数には、プロー
ブのバックボーン及びヌクレオチドの変更及び各々のＳＮＰプローブ対に対する
異なる状態を解決するための温度ランピングなどが含まれる。
してもよい。同一のハイブリダイズ反応において複数の変異を検出するためにま
とめて利用されるプローブは、好適にはおよそ同じ長さ（即ち、おおよそ同じ塩
基対数）であり、自動合成機を用いて容易に合成される長さであるが、プローブ
の長さはシグナル及び対立遺伝子の識別のために最適化されることができる。低
いシグナルを発生させるプローブは長くすることが可能であり、一方弱い識別力
を示すプローブは短くすることができる。まとめて利用される特定のプローブの
至適濃度は、経験的に決定することができる。もし、産出されるシグナルが低す
ぎる場合、適度なシグナル強度が得られ、一方バックグラウンドのノイズが最小
になるまで濃度を倍加させる。例えば、嚢胞性繊維症膜貫通制御遺伝子をプロー
ブ化するためにまとめて使用されるプローブ各々の至適濃度は、当初０．０３ｐ
ｍｏｌの濃度で検査された。シグナルを至適化するための他の変数には、プロー
ブのバックボーン及びヌクレオチドの変更及び各々のＳＮＰプローブ対に対する
異なる状態を解決するための温度ランピングなどが含まれる。
【００１７】 特定の実施態様において、アッセイ用のプローブは決められた配列領域を網羅
する全ての可能な限りのポリヌクレオチドの縮退した集団を含み、例えば、全て
の可能な限り同じサイズにされたポリヌクレオチド、例えば、長さ５ヌクレオチ
ドのものなどである。本質的に、この構成は普遍的検出因子セットを提供する。
例えば、特定の位置、３'末端から３番目の位置にアデニンヌクレオチドを有す
るような集団の部分集団は第一の標識で標識化され、チミジンヌクレオチドを持
つものは第二の標識で標識化され、クアニン(quanine)ヌクレオチドを持つもの
は第三の標識で標識化され、シチジンヌクレオチドを持つものは第四の標識で標
識化される。収集した標識縮退ＳＮＰプローブを用いると、特異的な標的ポリヌ
クレオチド配列及び特異的捕獲プローブにより形成されるハイブリダイズ体に結
合されている標識の種類に基づいて、正確なヌクレオチドタイプもしくはヌクレ
オチドタイプの組み合わせが、特異的な単一位置において決定することができる
。
する全ての可能な限りのポリヌクレオチドの縮退した集団を含み、例えば、全て
の可能な限り同じサイズにされたポリヌクレオチド、例えば、長さ５ヌクレオチ
ドのものなどである。本質的に、この構成は普遍的検出因子セットを提供する。
例えば、特定の位置、３'末端から３番目の位置にアデニンヌクレオチドを有す
るような集団の部分集団は第一の標識で標識化され、チミジンヌクレオチドを持
つものは第二の標識で標識化され、クアニン(quanine)ヌクレオチドを持つもの
は第三の標識で標識化され、シチジンヌクレオチドを持つものは第四の標識で標
識化される。収集した標識縮退ＳＮＰプローブを用いると、特異的な標的ポリヌ
クレオチド配列及び特異的捕獲プローブにより形成されるハイブリダイズ体に結
合されている標識の種類に基づいて、正確なヌクレオチドタイプもしくはヌクレ
オチドタイプの組み合わせが、特異的な単一位置において決定することができる
。
【００１８】 本方法の混合工程には、対応するＳＮＰ領域に対するＳＮＰプローブの選択的
ハイブリダイズ化を提供するのに充分な程度、対応するＳＮＰ領域に対する各々
のＳＮＰプローブの相対的親和性を増加させること、もしくは、非相当のＳＮＰ
領域に対するＳＮＰプローブの相対的親和性又は標的ＳＮＰ領域に対する一また
はそれ以上のミスマッチなプローブの相対的親和性を減少させることが含まれる
。全体として、相対的親和性の増加は、通常標的ＳＮＰに対して結合した一又は
それ以上のミスマッチプローブ（例えば、一塩基ミスマッチプローブ）の結合力
に対する完全にマッチしたプローブの標的ＳＮＰに対する結合力の比率の増加と
して測定され、一般に少なくとも、２倍の増加、好ましくは少なくとも５倍の増
加、より好ましくは少なくとも１０倍の増加を示す。
ハイブリダイズ化を提供するのに充分な程度、対応するＳＮＰ領域に対する各々
のＳＮＰプローブの相対的親和性を増加させること、もしくは、非相当のＳＮＰ
領域に対するＳＮＰプローブの相対的親和性又は標的ＳＮＰ領域に対する一また
はそれ以上のミスマッチなプローブの相対的親和性を減少させることが含まれる
。全体として、相対的親和性の増加は、通常標的ＳＮＰに対して結合した一又は
それ以上のミスマッチプローブ（例えば、一塩基ミスマッチプローブ）の結合力
に対する完全にマッチしたプローブの標的ＳＮＰに対する結合力の比率の増加と
して測定され、一般に少なくとも、２倍の増加、好ましくは少なくとも５倍の増
加、より好ましくは少なくとも１０倍の増加を示す。
【００１９】 非常に多様な方法もしくはアッセイ条件が、対応するＳＮＰ領域に対する各々
のＳＮＰプローブの相対的親和性を増加させるために使用され得る。ある特定の
実施態様において、対応するＳＮＰ領域に対する各々のＳＮＰプローブの相対的
親和性は、アッセイ用プローブと形成されたハイブリダイズ体の融解温度を規格
化する試薬、特に、対応するＳＮＰ領域と対応するＳＮＰ領域以外の顕著には他
のＳＮＰ領域、さらに顕著には対応するＳＮＰ領域の選択的対立遺伝子のＳＮＰ
領域との間の識別性を提供するのに充分なＳＮＰプローブと標的ＳＮＰ領域との
間に形成されるハイブリダイズ体の融解温度を規格化する試薬を、混合工程にお
いて包ませる工程を含む方法により、少なくとも部分的に増加する。ＳＮＰプロ
ーブ対を使用する時、本実施態様はミスマッチプローブ結合量に対するマッチプ
ローブの結合量の検出される比率の分布を制限する。洗浄剤（例えば、ドデシル
硫酸ナトリウム、ツイーン）、変性剤（例えば、グアニジン、第四級アンモニウ
ム塩）、ポリカチオン（例えば、ポリリシン、スペルミン）、副溝結合剤（例え
ば、ジスタマイシン、ＣＣ-１０６５、Kutyavin等, 1998, 米国特許番号5,801,1
55号を参照のこと）などを含む広く多様な適切な規格化試薬、及びその使用につ
いては、本明細書に記述され及び／又は当該技術分野において周知である。効果
的な濃度及び適切なアッセイ条件は経験的に容易に決定できる（例えば、以下の
実施例を参照のこと）。特定の実施態様では、変性剤はテトラメチルアンモニウ
ムクロライド、テトラエチルアンモニウムクロライド、テトラメチルアンモニウ
ムフルオリド、もしくはテトラエチルアンモニウムフルオリドのような第四級ア
ンモニウム塩である。規格化は分散係数（ＣＶ）もしくは標準偏差の縮減で、少
なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、さらに好ましくは少なくとも６
０％、最も好ましくは少なくとも８０％の減少のような、任意の簡便な方法によ
って確認される。一塩基ミスマッチに対する完全マッチの場合のシグナル比の増
加は、より弱い緊縮性のＣＶが必要であることを示す。例えば、マッチに対する
ミスマッチ比が５：１の場合、２０％もしくはそれ以下のＣＶｓが好適であり、
より好適には１０％もしくはそれ以下である一方、マッチに対するミスマッチ比
が５０：１である場合、５０％もしくはそれ以下のＣＶｓが好適である。
のＳＮＰプローブの相対的親和性を増加させるために使用され得る。ある特定の
実施態様において、対応するＳＮＰ領域に対する各々のＳＮＰプローブの相対的
親和性は、アッセイ用プローブと形成されたハイブリダイズ体の融解温度を規格
化する試薬、特に、対応するＳＮＰ領域と対応するＳＮＰ領域以外の顕著には他
のＳＮＰ領域、さらに顕著には対応するＳＮＰ領域の選択的対立遺伝子のＳＮＰ
領域との間の識別性を提供するのに充分なＳＮＰプローブと標的ＳＮＰ領域との
間に形成されるハイブリダイズ体の融解温度を規格化する試薬を、混合工程にお
いて包ませる工程を含む方法により、少なくとも部分的に増加する。ＳＮＰプロ
ーブ対を使用する時、本実施態様はミスマッチプローブ結合量に対するマッチプ
ローブの結合量の検出される比率の分布を制限する。洗浄剤（例えば、ドデシル
硫酸ナトリウム、ツイーン）、変性剤（例えば、グアニジン、第四級アンモニウ
ム塩）、ポリカチオン（例えば、ポリリシン、スペルミン）、副溝結合剤（例え
ば、ジスタマイシン、ＣＣ-１０６５、Kutyavin等, 1998, 米国特許番号5,801,1
55号を参照のこと）などを含む広く多様な適切な規格化試薬、及びその使用につ
いては、本明細書に記述され及び／又は当該技術分野において周知である。効果
的な濃度及び適切なアッセイ条件は経験的に容易に決定できる（例えば、以下の
実施例を参照のこと）。特定の実施態様では、変性剤はテトラメチルアンモニウ
ムクロライド、テトラエチルアンモニウムクロライド、テトラメチルアンモニウ
ムフルオリド、もしくはテトラエチルアンモニウムフルオリドのような第四級ア
ンモニウム塩である。規格化は分散係数（ＣＶ）もしくは標準偏差の縮減で、少
なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、さらに好ましくは少なくとも６
０％、最も好ましくは少なくとも８０％の減少のような、任意の簡便な方法によ
って確認される。一塩基ミスマッチに対する完全マッチの場合のシグナル比の増
加は、より弱い緊縮性のＣＶが必要であることを示す。例えば、マッチに対する
ミスマッチ比が５：１の場合、２０％もしくはそれ以下のＣＶｓが好適であり、
より好適には１０％もしくはそれ以下である一方、マッチに対するミスマッチ比
が５０：１である場合、５０％もしくはそれ以下のＣＶｓが好適である。
【００２０】 他の特定の実施態様では、対応するＳＮＰ領域に対する各々のＳＮＰプローブ
の相対的親和性は、対応する標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズ化された捕
獲ポリヌクレオチドもしくは補助ポリヌクレオチドと相互作用するＳＮＰプロー
ブによって少なくとも部分的に増強される。換言すれば、ＳＮＰプローブ、捕獲
ポリヌクレオチド、及び／又は補助ポリヌクレオチドは、ＳＮＰプローブが標的
ポリヌクレオチドと捕獲ポリヌクレオチド及び／又は補助ポリヌクレオチドとの
ハイブリダイズ化により形成される単一の高特異的協同的なドメインでのみ優先
的に結合するような一又は複数の協同的相互作用を形成するように構築されてい
る。補助プローブは標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズ化し、直接又は間接
的に対応するＳＮＰ領域に対する対応するＳＮＰの相対的親和性を増強させるよ
うな如何なるポリヌクレオチドであってもよい。それ故、その様な直接もしくは
間接的相互作用を提供するＳＮＰ領域に充分近接してハイブリダイズ化する。広
く多様な直接及び間接的な協同的相互作用は分子結合親和性及び／又は安定性を
増強することが当該技術分野において周知であり、電荷-電荷相互作用、疎水的
相互作用、リング及び／又はパイ-結合（ring and/or pi-bond）スタッキング、
ハイブリダイゼーション、三鎖螺旋構造、立体的協同作用、副溝もしくは主溝結
合相互作用などが包含される。特定の実施態様において、副溝結合部位は、特異
的標的ポリヌクレオチドと捕獲ポリヌクレオチドとのハイブリダイズ化によって
形成された副溝に副溝結合剤を会合せしめるような構造でＳＮＰプローブの末端
に接着されている。好適には、単一の完全マッチＳＮＰプローブのみが協同的ド
メインに結合し得るようなハイブリダイズ化条件が利用される。特定の実施態様
において、副溝結合剤（ＭＧＢ）は（例えば、分子リンカーを通じて）ＳＮＰプ
ローブ、捕獲ポリヌクレオチド及び補助プローブの少なくとも一つに拘束されて
おり、それによってＭＧＢは捕獲-標的及び／又は標的-プローブ（例えば、ＳＮ
Ｐプローブ）間のハイブリダイズ体と相互作用し及び安定化させる。適切な副溝
結合剤にはネトロプシン、ジスタマイシン及びＣＣ-１０６５が含まれる。さら
に、副溝結合剤は異なるプローブ配列間の融解温度を均等化せしめる。
の相対的親和性は、対応する標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズ化された捕
獲ポリヌクレオチドもしくは補助ポリヌクレオチドと相互作用するＳＮＰプロー
ブによって少なくとも部分的に増強される。換言すれば、ＳＮＰプローブ、捕獲
ポリヌクレオチド、及び／又は補助ポリヌクレオチドは、ＳＮＰプローブが標的
ポリヌクレオチドと捕獲ポリヌクレオチド及び／又は補助ポリヌクレオチドとの
ハイブリダイズ化により形成される単一の高特異的協同的なドメインでのみ優先
的に結合するような一又は複数の協同的相互作用を形成するように構築されてい
る。補助プローブは標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズ化し、直接又は間接
的に対応するＳＮＰ領域に対する対応するＳＮＰの相対的親和性を増強させるよ
うな如何なるポリヌクレオチドであってもよい。それ故、その様な直接もしくは
間接的相互作用を提供するＳＮＰ領域に充分近接してハイブリダイズ化する。広
く多様な直接及び間接的な協同的相互作用は分子結合親和性及び／又は安定性を
増強することが当該技術分野において周知であり、電荷-電荷相互作用、疎水的
相互作用、リング及び／又はパイ-結合（ring and/or pi-bond）スタッキング、
ハイブリダイゼーション、三鎖螺旋構造、立体的協同作用、副溝もしくは主溝結
合相互作用などが包含される。特定の実施態様において、副溝結合部位は、特異
的標的ポリヌクレオチドと捕獲ポリヌクレオチドとのハイブリダイズ化によって
形成された副溝に副溝結合剤を会合せしめるような構造でＳＮＰプローブの末端
に接着されている。好適には、単一の完全マッチＳＮＰプローブのみが協同的ド
メインに結合し得るようなハイブリダイズ化条件が利用される。特定の実施態様
において、副溝結合剤（ＭＧＢ）は（例えば、分子リンカーを通じて）ＳＮＰプ
ローブ、捕獲ポリヌクレオチド及び補助プローブの少なくとも一つに拘束されて
おり、それによってＭＧＢは捕獲-標的及び／又は標的-プローブ（例えば、ＳＮ
Ｐプローブ）間のハイブリダイズ体と相互作用し及び安定化させる。適切な副溝
結合剤にはネトロプシン、ジスタマイシン及びＣＣ-１０６５が含まれる。さら
に、副溝結合剤は異なるプローブ配列間の融解温度を均等化せしめる。
【００２１】 特定の実施態様において、対応するＳＮＰ領域に対する各々のＳＮＰプローブ
の相対的親和性は対応する標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズ化された捕獲
ポリヌクレオチド又は補助プローブと相互作用ＳＮＰプローブにより、及びアッ
セイ用のプローブの融解温度を規格化する試薬を混合工程で含ませる工程を含む
方法により、少なくとも部分的に増強される。
の相対的親和性は対応する標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズ化された捕獲
ポリヌクレオチド又は補助プローブと相互作用ＳＮＰプローブにより、及びアッ
セイ用のプローブの融解温度を規格化する試薬を混合工程で含ませる工程を含む
方法により、少なくとも部分的に増強される。
【００２２】 特定の実施態様において、ＳＮＰプローブのハイブリダイゼーションに引き続
き、本方法では、固定化試料ポリヌクレオチドと選択的にハイブリダイズしない
ようなアッセイプローブを基質から実質的に分離するような、一又は複数回の洗
浄もしくは希釈の工程を用いている。ノイズ比に対するシグナルを増加させるた
めに、ハイブリダイゼーション及び洗浄は緊縮性の条件下で実行されるべきであ
る。換言すれば、ハイブリダイゼーション反応が行われる温度は用いられるプロ
ーブに可能なかぎり高温であるべきである。特定のプローブプールに対する至適
な緊縮性は経験的に決定される。例として、嚢胞性線維症膜透過制御遺伝子をプ
ローブするために用いられる１７塩基対のプローブの場合、ハイブリダイゼーシ
ョンは５２℃にて実行された。さらに、突然変異特異的なプローブにハイブリダ
イズしたもののノイズ比に対するシグナルは、コールド（即ち非標識の）、正常
な（即ち野生型の）プローブ標識もしくはその一部を好適にはプローブの濃度の
約１から１００倍の範囲の濃度でのハイブリダイゼーション反応に含むことによ
り増強させることができる。
き、本方法では、固定化試料ポリヌクレオチドと選択的にハイブリダイズしない
ようなアッセイプローブを基質から実質的に分離するような、一又は複数回の洗
浄もしくは希釈の工程を用いている。ノイズ比に対するシグナルを増加させるた
めに、ハイブリダイゼーション及び洗浄は緊縮性の条件下で実行されるべきであ
る。換言すれば、ハイブリダイゼーション反応が行われる温度は用いられるプロ
ーブに可能なかぎり高温であるべきである。特定のプローブプールに対する至適
な緊縮性は経験的に決定される。例として、嚢胞性線維症膜透過制御遺伝子をプ
ローブするために用いられる１７塩基対のプローブの場合、ハイブリダイゼーシ
ョンは５２℃にて実行された。さらに、突然変異特異的なプローブにハイブリダ
イズしたもののノイズ比に対するシグナルは、コールド（即ち非標識の）、正常
な（即ち野生型の）プローブ標識もしくはその一部を好適にはプローブの濃度の
約１から１００倍の範囲の濃度でのハイブリダイゼーション反応に含むことによ
り増強させることができる。
【００２３】 最終的には、基質上に各々のＳＮＰプローブが存在するか存在しないかは、用
いた特定の標識に対して適切な従来の方法により検出される。例えば、もしＳＮ
Ｐプローブがフルオレセイン色素で標識されているならば、ハイブリダイゼーシ
ョンは標準的な蛍光定量法により検出される。
いた特定の標識に対して適切な従来の方法により検出される。例えば、もしＳＮ
Ｐプローブがフルオレセイン色素で標識されているならば、ハイブリダイゼーシ
ョンは標準的な蛍光定量法により検出される。
【００２４】 本方法は一つの遺伝子内の複数の突然変異に対する多数の試料に、同時かつ容
易に適用される。さらに、本方法は単一のハイブリダイゼーションアッセイによ
って、異なる疾病の兆候（例えば、嚢胞性線維症、鎌形赤血球貧血、β-タラセ
ミア、テイ・サックス病、ゴーシェ症候群及びある種の遺伝子、例えばｐ５３遺
伝子の突然変異に由来する癌）を持つ複数の別の個人を同時に分析するのに用い
ることができる。
易に適用される。さらに、本方法は単一のハイブリダイゼーションアッセイによ
って、異なる疾病の兆候（例えば、嚢胞性線維症、鎌形赤血球貧血、β-タラセ
ミア、テイ・サックス病、ゴーシェ症候群及びある種の遺伝子、例えばｐ５３遺
伝子の突然変異に由来する癌）を持つ複数の別の個人を同時に分析するのに用い
ることができる。
【００２５】 （実施例） 実施例１．サンドイッチアッセイ サンドイッチアッセイは、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）遺伝子の８５８
番目の多様性部位において生じていることが知られているＡ塩基からＧ塩基への
置換を同定するために設計された。５９-ｍｅｒ捕獲ポリヌクレオチドがヌクレ
オチド７８７から８４５の領域を正方向にカバーするように合成された。このポ
リヌクレオチド及び他のポリヌクレオチドはOperon Technologies Inc.によって
合成された。捕獲ポリヌクレオチドはガラス表面への接着を促進するように５'
末端にアミンの修飾を有していた。二つの１５塩基のＳＮＰプローブは８５８番
目の多様性部位を包囲するヌクレオチド８５１から８６５の領域をカバーするよ
うに合成された。二つのプローブはこの領域の二つの既知の正方向配列と配列が
同一であった。８５８番目の部位にヌクレオチドＧを持つＳＮＰプローブはシア
ニン色素であるＣｙ３によって標識されており、一方ヌクレオチドＡを持つＳＮ
ＰプローブはＣｙ５で標識された。最後に、８５８の部位にＣを含む８０７から
８６５の領域の逆方向であるような５９-ｍｅｒの標的ポリヌクレオチドが合成
された。 第二のサンドイッチアッセイは、ＡｐｏＥ遺伝子の４４８番目の部位において
生じていることが知られているＴ塩基からＣ塩基への置換を同定するために設計
された。この場合、捕獲ポリヌクレオチドはヌクレオチド３７７から４４５の領
域の正方向に対するものであった。ＳＮＰプローブはヌクレオチド４４１から４
５５の領域の正方向のもので、４４８にＴを含むＣｙ３標識プローブとＣを含む
Ｃｙ５プローブであった。試料の５９-ｍｅｒは４４８の部位にＡを含む３９７
から４５５の領域に対する逆方向のものであった。
番目の多様性部位において生じていることが知られているＡ塩基からＧ塩基への
置換を同定するために設計された。５９-ｍｅｒ捕獲ポリヌクレオチドがヌクレ
オチド７８７から８４５の領域を正方向にカバーするように合成された。このポ
リヌクレオチド及び他のポリヌクレオチドはOperon Technologies Inc.によって
合成された。捕獲ポリヌクレオチドはガラス表面への接着を促進するように５'
末端にアミンの修飾を有していた。二つの１５塩基のＳＮＰプローブは８５８番
目の多様性部位を包囲するヌクレオチド８５１から８６５の領域をカバーするよ
うに合成された。二つのプローブはこの領域の二つの既知の正方向配列と配列が
同一であった。８５８番目の部位にヌクレオチドＧを持つＳＮＰプローブはシア
ニン色素であるＣｙ３によって標識されており、一方ヌクレオチドＡを持つＳＮ
ＰプローブはＣｙ５で標識された。最後に、８５８の部位にＣを含む８０７から
８６５の領域の逆方向であるような５９-ｍｅｒの標的ポリヌクレオチドが合成
された。 第二のサンドイッチアッセイは、ＡｐｏＥ遺伝子の４４８番目の部位において
生じていることが知られているＴ塩基からＣ塩基への置換を同定するために設計
された。この場合、捕獲ポリヌクレオチドはヌクレオチド３７７から４４５の領
域の正方向に対するものであった。ＳＮＰプローブはヌクレオチド４４１から４
５５の領域の正方向のもので、４４８にＴを含むＣｙ３標識プローブとＣを含む
Ｃｙ５プローブであった。試料の５９-ｍｅｒは４４８の部位にＡを含む３９７
から４５５の領域に対する逆方向のものであった。
【００２６】 捕獲ポリヌクレオチドは、高速ロボティックス（M. Schena 等, Science 1995
, 270, 467-470；D. Shalon等, Genome Res. 1996, 6, 639-645; D. Shalon, 博
士学位論文, Stanford Uiverseity, 1996）を用いて３ＸＳＳＣ中、５０マイク
ロモーラーの濃度でマイクロドロップ形式にてガラススライド上に沈着させた。
ガラスはシリル化試薬によりコートされ、捕獲プローブのアミン修飾体が結合す
るように誘導体化された。アレイは洗浄前に一晩静置した。非結合物質は以下の
工程により表面から洗浄された：０．２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中
で１分間洗浄、続いて水で１分間洗浄。その後、表面はカゼインブロック（1,00
0ml１ｘＰＢＳ緩衝液あたり２ｇのカゼイン）によって６０℃３０分間被覆され
た。そして、スライドガラスは再度洗浄された：０．２％ＳＤＳ中で１分間洗浄
後続いて1分間水にて洗浄。その結果、アレイはハイブリダイズ化用に準備され
た。その後、アレイは４４８及び８５８の両領域の５９-ｍｅｒの試料と二つの
異なるシアニン色素で標識されたプローブ組とでハイブリダイズ化された。試料
及びＳＮＰプローブは５ｘＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中、５００ピコモーラーの濃
度であった。全量９マイクロリッターが２２ｘ２２ｍｍガラスカバースリップ（
Corning Glassworks）下で４５℃、１６時間ハイブリダイズ化された。アレイは
その後３７℃で洗浄されたが、最初に１ｘＳＳＣ、０．１%ＳＤＳにて１０分間
、続いて０．１xＳＳＣにて１０分間行った。共焦点蛍光スキャナー（D. Shalon
, 博士学位論文, Stanford Uiverseity, 1996）は、Ｃｙ３蛍光色素には５４２
ｎｍで、Ｃｙ５蛍光色素には６４３ｎｍで励起することで、アレイを画像化する
のに用いた。 ＳＮＰプローブの特異的なハイブリダイゼーションは４４８及び８５８の両サ
イトで見られた。いずれの場合においても、Ｃｙ３のシグナル強度はＣｙ５のシ
グナル強度よりも強く、この結果は予想されたハイブリダイゼーションが達成さ
れたことを示し、試料は８５８にＣを４４８にＡを含んでいたことを確認するも
のである。この実施例は、アレイを基礎にしたサンドイッチアッセイによるアプ
ローチが、配列多様性の同時検出に用いることが可能であることを例証している
。
, 270, 467-470；D. Shalon等, Genome Res. 1996, 6, 639-645; D. Shalon, 博
士学位論文, Stanford Uiverseity, 1996）を用いて３ＸＳＳＣ中、５０マイク
ロモーラーの濃度でマイクロドロップ形式にてガラススライド上に沈着させた。
ガラスはシリル化試薬によりコートされ、捕獲プローブのアミン修飾体が結合す
るように誘導体化された。アレイは洗浄前に一晩静置した。非結合物質は以下の
工程により表面から洗浄された：０．２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中
で１分間洗浄、続いて水で１分間洗浄。その後、表面はカゼインブロック（1,00
0ml１ｘＰＢＳ緩衝液あたり２ｇのカゼイン）によって６０℃３０分間被覆され
た。そして、スライドガラスは再度洗浄された：０．２％ＳＤＳ中で１分間洗浄
後続いて1分間水にて洗浄。その結果、アレイはハイブリダイズ化用に準備され
た。その後、アレイは４４８及び８５８の両領域の５９-ｍｅｒの試料と二つの
異なるシアニン色素で標識されたプローブ組とでハイブリダイズ化された。試料
及びＳＮＰプローブは５ｘＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中、５００ピコモーラーの濃
度であった。全量９マイクロリッターが２２ｘ２２ｍｍガラスカバースリップ（
Corning Glassworks）下で４５℃、１６時間ハイブリダイズ化された。アレイは
その後３７℃で洗浄されたが、最初に１ｘＳＳＣ、０．１%ＳＤＳにて１０分間
、続いて０．１xＳＳＣにて１０分間行った。共焦点蛍光スキャナー（D. Shalon
, 博士学位論文, Stanford Uiverseity, 1996）は、Ｃｙ３蛍光色素には５４２
ｎｍで、Ｃｙ５蛍光色素には６４３ｎｍで励起することで、アレイを画像化する
のに用いた。 ＳＮＰプローブの特異的なハイブリダイゼーションは４４８及び８５８の両サ
イトで見られた。いずれの場合においても、Ｃｙ３のシグナル強度はＣｙ５のシ
グナル強度よりも強く、この結果は予想されたハイブリダイゼーションが達成さ
れたことを示し、試料は８５８にＣを４４８にＡを含んでいたことを確認するも
のである。この実施例は、アレイを基礎にしたサンドイッチアッセイによるアプ
ローチが、配列多様性の同時検出に用いることが可能であることを例証している
。
【００２７】 実施例２．多-遺伝子サンドイッチアッセイ サンドイッチアッセイは捕獲ポリヌクレオチド、対象の試料、及び対象のＳＮ
Ｐに対する検出プローブにより構成される。検出は各々の遺伝子毎、もしくは多
重的な方法にて行うことが可能である。各々の遺伝子に対して、５９-ｍｅｒの
捕獲ポリヌクレオチドは対象のＳＮＰサイトの５'末端領域を包囲するように設
計された。この捕獲ポリヌクレオチドは正方向であり、おおよそＳＮＰ部位の８
塩基対前で終結させた。捕獲ポリヌクレオチドはガラス表面への接着を促進する
ためにその５'末端にアミン修飾を有していた。各々の遺伝子に対して、長さ１
４から１８ヌクレオチドの範囲の二つのＳＮＰ検出プローブが合成された。これ
らのプローブは、多様性部位の既知の正方向配列上に対応して、一塩基が異なり
、その多様性部位はこれらのポリヌクレオチドの中心に位置していた。これらの
ＳＮＰプローブは捕獲プローブと隣接していた。各々のプローブ組は、５'末端
においてそれぞれＣｙ３及びＣｙ５蛍光色素にて末端標識された。全ての遺伝子
に対するプローブ組は可能なかぎり５６℃に近い融解温度を有するように設計さ
れた。 最後に、アッセイ用の試料は、おおよ３００塩基対長の二重鎖ＰＣＲ断片から
なるものであった。これらのＰＣＲ断片は、ホモ接合性の対立遺伝子Ａ、ホモ接
合性の対立遺伝子Ｂ、もしくは対象のＳＮＰ部位におけるそれぞれのヘテロ接合
性対立遺伝子であるＤＮＡ試料からの遺伝子から遺伝子特異的なプライマーを用
いることにより生成された。同様に、これらのＤＮＡ試料は、プライマー伸長前
増幅（ＰＥＲ）ＰＣＲによってゲノムＤＮＡ（L. Zhang 等, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 1992, 89, 5847-5851；K. Xu 等, Hum. Reprod, 1993, 8, 2206-221
0）から生成された。ＰＣＲ増幅断片は使用前にカラムにて精製した。
Ｐに対する検出プローブにより構成される。検出は各々の遺伝子毎、もしくは多
重的な方法にて行うことが可能である。各々の遺伝子に対して、５９-ｍｅｒの
捕獲ポリヌクレオチドは対象のＳＮＰサイトの５'末端領域を包囲するように設
計された。この捕獲ポリヌクレオチドは正方向であり、おおよそＳＮＰ部位の８
塩基対前で終結させた。捕獲ポリヌクレオチドはガラス表面への接着を促進する
ためにその５'末端にアミン修飾を有していた。各々の遺伝子に対して、長さ１
４から１８ヌクレオチドの範囲の二つのＳＮＰ検出プローブが合成された。これ
らのプローブは、多様性部位の既知の正方向配列上に対応して、一塩基が異なり
、その多様性部位はこれらのポリヌクレオチドの中心に位置していた。これらの
ＳＮＰプローブは捕獲プローブと隣接していた。各々のプローブ組は、５'末端
においてそれぞれＣｙ３及びＣｙ５蛍光色素にて末端標識された。全ての遺伝子
に対するプローブ組は可能なかぎり５６℃に近い融解温度を有するように設計さ
れた。 最後に、アッセイ用の試料は、おおよ３００塩基対長の二重鎖ＰＣＲ断片から
なるものであった。これらのＰＣＲ断片は、ホモ接合性の対立遺伝子Ａ、ホモ接
合性の対立遺伝子Ｂ、もしくは対象のＳＮＰ部位におけるそれぞれのヘテロ接合
性対立遺伝子であるＤＮＡ試料からの遺伝子から遺伝子特異的なプライマーを用
いることにより生成された。同様に、これらのＤＮＡ試料は、プライマー伸長前
増幅（ＰＥＲ）ＰＣＲによってゲノムＤＮＡ（L. Zhang 等, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 1992, 89, 5847-5851；K. Xu 等, Hum. Reprod, 1993, 8, 2206-221
0）から生成された。ＰＣＲ増幅断片は使用前にカラムにて精製した。
【００２８】 捕獲ポリヌクレオチドは、高速ロボティックス（M. Schena 等, Science 1995
, 270, 467-470；D. Shalon等, Genome Res. 1996, 6, 639-645; D. Shalon, 博
士学位論文, Stanford Uiverseity, 1996）を用いて３ＸＳＳＣ中、５０マイク
ロモーラーの濃度でマイクロドロップ形式にて沈着させた。コーティングしたス
ライドガラスは、インサイト製薬のPaul Lee氏のご厚意により贈与頂いた。非結
合物質は以下の工程により表面から洗浄された；０．２%ＳＤＳ中で１分間洗浄
、続いて水で１分間洗浄。その後、表面はカゼインブロック（1,000mLの１ｘＰ
ＢＳ緩衝液あたり２ｇのカゼイン）によって６０℃３０分間被覆された。そして
、スライドガラスは再度洗浄された：０．２％ＳＤＳ中で１分間洗浄後続いて1
分間Ｈ２Ｏにて洗浄。その結果、アレイはハイブリダイズ化用に準備された。 ハイブリダイゼーション試料は、各々５００ピコモーラーの濃度の１０のＳＮ
Ｐプローブ組及び５ｘＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ、ｐＨ９中最終濃度１ｎｇ／μｌ
の対象となるＰＣＲ試料により構成された。これらの試料はハイブリダイズ化前
にＰＣＲ断片を変性させるために９０℃で５分間熱処理され、その後に１分間氷
上に急速に冷却した。全量９マイクロリッターが２２ｘ２２ｍｍガラスカバース
リップ下で３７℃、１６時間ハイブリダイズ化された。アレイはその後２５℃で
洗浄されるが、最初に１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにて１０分間、続いて０．１
xＳＳＣにて１０分間行った。共焦点蛍光スキャナーは、Ｃｙ３蛍光色素には５
４２ｎｍで、Ｃｙ５蛍光色素には６４３ｎｍで励起することで、アレイを画像化
するのに用いた。特異的シグナル及びその結果としてＳＮＰプローブのハイブリ
ダイゼーションが各々の遺伝子に対して確認できる。ホモ接合の野生型、ホモ接
合の変異型及びそれぞれのヘテロ接合体試料を識別することは可能である。この
実施例は、アレイを基礎にしたサンドイッチアッセイによるアプローチは、配列
多様性の同時検出に用いることが可能であることを例証している。
, 270, 467-470；D. Shalon等, Genome Res. 1996, 6, 639-645; D. Shalon, 博
士学位論文, Stanford Uiverseity, 1996）を用いて３ＸＳＳＣ中、５０マイク
ロモーラーの濃度でマイクロドロップ形式にて沈着させた。コーティングしたス
ライドガラスは、インサイト製薬のPaul Lee氏のご厚意により贈与頂いた。非結
合物質は以下の工程により表面から洗浄された；０．２%ＳＤＳ中で１分間洗浄
、続いて水で１分間洗浄。その後、表面はカゼインブロック（1,000mLの１ｘＰ
ＢＳ緩衝液あたり２ｇのカゼイン）によって６０℃３０分間被覆された。そして
、スライドガラスは再度洗浄された：０．２％ＳＤＳ中で１分間洗浄後続いて1
分間Ｈ２Ｏにて洗浄。その結果、アレイはハイブリダイズ化用に準備された。 ハイブリダイゼーション試料は、各々５００ピコモーラーの濃度の１０のＳＮ
Ｐプローブ組及び５ｘＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ、ｐＨ９中最終濃度１ｎｇ／μｌ
の対象となるＰＣＲ試料により構成された。これらの試料はハイブリダイズ化前
にＰＣＲ断片を変性させるために９０℃で５分間熱処理され、その後に１分間氷
上に急速に冷却した。全量９マイクロリッターが２２ｘ２２ｍｍガラスカバース
リップ下で３７℃、１６時間ハイブリダイズ化された。アレイはその後２５℃で
洗浄されるが、最初に１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにて１０分間、続いて０．１
xＳＳＣにて１０分間行った。共焦点蛍光スキャナーは、Ｃｙ３蛍光色素には５
４２ｎｍで、Ｃｙ５蛍光色素には６４３ｎｍで励起することで、アレイを画像化
するのに用いた。特異的シグナル及びその結果としてＳＮＰプローブのハイブリ
ダイゼーションが各々の遺伝子に対して確認できる。ホモ接合の野生型、ホモ接
合の変異型及びそれぞれのヘテロ接合体試料を識別することは可能である。この
実施例は、アレイを基礎にしたサンドイッチアッセイによるアプローチは、配列
多様性の同時検出に用いることが可能であることを例証している。
【００２９】 実施例３．副溝結合剤サンドイッチアッセイ サンドイッチアッセイは、ＡｐｏＥ遺伝子の８５８番目の部位において生じて
いることが知られているＡ塩基からＧ塩基への置換を同定するために設計された
。５９-ｍｅｒ捕獲ポリヌクレオチドはヌクレオチド７８７から８４５の領域を
正方向にカバーするように合成された。捕獲ポリヌクレオチドはガラス表面への
接着を促進するように５'末端にアミンの修飾を有していた。二つの１１塩基の
ＳＮＰプローブは８５８番目の多様性部位を包囲するヌクレオチド８５５から８
６５の領域をカバーするように合成された。二つのプローブはこの領域における
既知の正方向配列に対して配列が同一である。８５８番目の部位にヌクレオチド
Ｇを持つＳＮＰプローブは、合成中に５'末端にてシアニン色素であるＣｙ３に
よって標識されており、一方ヌクレオチドＡを持つＳＮＰプローブはＣｙ５で標
識された。さらに、副溝結合剤である１,２-ジヒドロ(３Ｈ)-ピロロ[3,2-e]イン
ドール-７-カルボキシレート（ＣＤＰＩ３）がオリゴヌクレオチドの３'末端に
結合された。同様の標識ＳＮＰプローブの合成については、実施例４にて詳説し
てある。最後に、８５８の部位にＣを含む８０７から８６５の領域の逆方向であ
るような５９-ｍｅｒの標的ポリヌクレオチドが合成された。
いることが知られているＡ塩基からＧ塩基への置換を同定するために設計された
。５９-ｍｅｒ捕獲ポリヌクレオチドはヌクレオチド７８７から８４５の領域を
正方向にカバーするように合成された。捕獲ポリヌクレオチドはガラス表面への
接着を促進するように５'末端にアミンの修飾を有していた。二つの１１塩基の
ＳＮＰプローブは８５８番目の多様性部位を包囲するヌクレオチド８５５から８
６５の領域をカバーするように合成された。二つのプローブはこの領域における
既知の正方向配列に対して配列が同一である。８５８番目の部位にヌクレオチド
Ｇを持つＳＮＰプローブは、合成中に５'末端にてシアニン色素であるＣｙ３に
よって標識されており、一方ヌクレオチドＡを持つＳＮＰプローブはＣｙ５で標
識された。さらに、副溝結合剤である１,２-ジヒドロ(３Ｈ)-ピロロ[3,2-e]イン
ドール-７-カルボキシレート（ＣＤＰＩ３）がオリゴヌクレオチドの３'末端に
結合された。同様の標識ＳＮＰプローブの合成については、実施例４にて詳説し
てある。最後に、８５８の部位にＣを含む８０７から８６５の領域の逆方向であ
るような５９-ｍｅｒの標的ポリヌクレオチドが合成された。
【００３０】 捕獲ポリヌクレオチドは、高速ロボティックス（M. Schena 等, Science 1995
, 270, 467-470；D. Shalon等, Genome Res. 1996, 6, 639-645; D. Shalon, 博
士学位論文, Stanford Uiverseity, 1996）を用いて３ＸＳＳＣ中、５０マイク
ロモーラーの濃度でマイクロドロップ形式にて沈着させた。コーティングしたス
ライドガラスは、インサイト製薬のPaul Lee氏のご厚意により贈与頂いた。非結
合物質は以下の工程により表面から洗浄された；０．２％ＳＤＳ中で１分間洗浄
、続いて水で１分間洗浄を２回。その後、表面はカゼインブロック（1,000mLの
１ｘＰＢＳ緩衝液あたり２ｇのカゼイン）によって６０℃３０分間被覆された。
そして、スライドガラスは再度洗浄された：０．２％ＳＤＳ中で１分間洗浄後続
いて1分間Ｈ２Ｏにて２回洗浄。その結果、アレイはハイブリダイズ化用に準備
された。 その後、アレイは５９-ｍｅｒの試料とＣｙ標識されたプローブ組とでハイブ
リダイズ化された。試料及びＳＮＰプローブは５ｘＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中、
５００ピコモーラーの濃度であった。全量９マイクロリッターがガラスカバース
リップ下で４５℃、１６時間ハイブリダイズ化された。アレイはその後３７℃で
１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにて１０分間、続いて０．１ｘＳＳＣにて１０分間
洗浄した。共焦点蛍光スキャナーは、Ｃｙ３蛍光色素には５４２ｎｍで、Ｃｙ５
蛍光色素には６４３ｎｍで励起することで、アレイを画像化するのに用いた。 ＳＮＰプローブの特異的なハイブリダイゼーションは８５８のサイトで見られ
た。Ｃｙ３のシグナル強度はＣｙ５のシグナル強度よりも強く、この結果は予想
されたハイブリダイゼーションが達成されたことを示し、試料は８５８にＣを含
んでいたことを確認するものである。さらに、Ｃｙ３とＣｙ５とのシグナル比は
実施例１における１５ｍｅｒオリゴヌクレオチドプローブと比較して少なくとも
１０倍増強された。この実施例は、副溝結合剤を付したオリゴヌクレオチドはア
レイを基礎にしたサンドイッチアッセイによるアプローチの感度を増強させるた
めに利用することができることを例証している。
, 270, 467-470；D. Shalon等, Genome Res. 1996, 6, 639-645; D. Shalon, 博
士学位論文, Stanford Uiverseity, 1996）を用いて３ＸＳＳＣ中、５０マイク
ロモーラーの濃度でマイクロドロップ形式にて沈着させた。コーティングしたス
ライドガラスは、インサイト製薬のPaul Lee氏のご厚意により贈与頂いた。非結
合物質は以下の工程により表面から洗浄された；０．２％ＳＤＳ中で１分間洗浄
、続いて水で１分間洗浄を２回。その後、表面はカゼインブロック（1,000mLの
１ｘＰＢＳ緩衝液あたり２ｇのカゼイン）によって６０℃３０分間被覆された。
そして、スライドガラスは再度洗浄された：０．２％ＳＤＳ中で１分間洗浄後続
いて1分間Ｈ２Ｏにて２回洗浄。その結果、アレイはハイブリダイズ化用に準備
された。 その後、アレイは５９-ｍｅｒの試料とＣｙ標識されたプローブ組とでハイブ
リダイズ化された。試料及びＳＮＰプローブは５ｘＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中、
５００ピコモーラーの濃度であった。全量９マイクロリッターがガラスカバース
リップ下で４５℃、１６時間ハイブリダイズ化された。アレイはその後３７℃で
１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにて１０分間、続いて０．１ｘＳＳＣにて１０分間
洗浄した。共焦点蛍光スキャナーは、Ｃｙ３蛍光色素には５４２ｎｍで、Ｃｙ５
蛍光色素には６４３ｎｍで励起することで、アレイを画像化するのに用いた。 ＳＮＰプローブの特異的なハイブリダイゼーションは８５８のサイトで見られ
た。Ｃｙ３のシグナル強度はＣｙ５のシグナル強度よりも強く、この結果は予想
されたハイブリダイゼーションが達成されたことを示し、試料は８５８にＣを含
んでいたことを確認するものである。さらに、Ｃｙ３とＣｙ５とのシグナル比は
実施例１における１５ｍｅｒオリゴヌクレオチドプローブと比較して少なくとも
１０倍増強された。この実施例は、副溝結合剤を付したオリゴヌクレオチドはア
レイを基礎にしたサンドイッチアッセイによるアプローチの感度を増強させるた
めに利用することができることを例証している。
【００３１】 実施例４．普遍的検出因子セットによるＳＮＰ検出 オリゴヌクレオチドの普遍的検出因子の合成と使用を記述する。 当該組成物のセットは以下に示す一般構造を持つ： ３'-(ＭＧＢ)-ＮＮＸＮＮ-(Ｌａｂｅｌ)-５' ここで、 ＭＧＢ＝ＣＤＰＩ３のような副溝結合剤 Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＴの４塩基全ての等モル混合物 Ｘ＝特定された塩基、即ち、Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＴのいずれか；及び Ｌａｂｅｌ＝蛍光色素のようなＸの４塩基の一つと結合する独自に検出可能な
標識。本実施例において、４つの独自の蛍光色素が本検出因子セットを構成する
のに使用されている。例えば、アミノ基反応性であるシアニン色素（アマシャム
-ファルマシア）が使用される。従って、例えば、Ｃｙ２（緑色）はＸ＝Ａに対
して使用され；Ｃｙ３（オレンジ色）はＸ＝Ｇに対して使用され；Ｃｙ５（近赤
外色far red）はＸ＝Ｃに対して使用され；Ｃｙ７（近赤外色near infrared）は
Ｘ＝Ｔに対して使用される。 ＣＤＰＩ３の化学構造を以下に示す ここで、Ｒ＝この場合には、３'末端との接着のための適切なリンカー。 ＣＤＰＩ３-修飾ＣＰＧ（固相オリゴヌクレオチド合成のために調整された細
孔のガラス支持体）の調製はE. A. Lukhtanov 等によるBioconjugate Chemistry
, 1995,6, 418-426に記載されている。ヌクレオチド・ホスホアミダイト試薬は
グレンリサーチ（Sterling, VA, USA）から得られる。アミノ-修飾因子Ｃ６ホス
ホアミダイト試薬もグレンリサーチから得た。個々のホスホアミダイト試薬（Ａ
、Ｇ、Ｃ及びＴに対する）の各々はドライアセトニトリル中に、約５０ｍＭの濃
度になるように溶解する。ランダムカップリング工程（Ｎ）に対する混合物を調
製するために、各々の溶液から等容量を一つのバイアルにて混合する。全ての溶
液の移し換えは、当該技術分野において周知の無水状態の技術を用いることで実
施される。適切なホスホアミダイト溶液（個々の塩基もしくは４塩基全ての混合
物）は、エクスペダイト（登録商標）モデル８９０５核酸合成システム（パーセ
プティブ・バイオシステムズ、Framingham, MA, USA）を用いてＣＤＰＩ3-修飾
ＣＰＧ支持体に結合される。合成は製造メーカーによって提供される手法に従っ
て、３'末端から５'末端に向けて連続的に行われる。アミノ-修飾因子Ｃ６ホス
ホアミダイト試薬は、最後の合成サイクル（即ち、５'末端に）中に結合される
。４つの別個の合成が次のような方法で行われる：即ち、合成１：Ｘ＝Ａ；合成
２：Ｘ＝Ｇ；合成３：Ｘ＝Ｃ；合成４：Ｘ＝Ｔ。その後、アミノ-保護基（モノ
メトキシトリチル）は製造メーカーによって提供される酸脱トリチル化法を用い
て各々の合成カラムから除かれる。
標識。本実施例において、４つの独自の蛍光色素が本検出因子セットを構成する
のに使用されている。例えば、アミノ基反応性であるシアニン色素（アマシャム
-ファルマシア）が使用される。従って、例えば、Ｃｙ２（緑色）はＸ＝Ａに対
して使用され；Ｃｙ３（オレンジ色）はＸ＝Ｇに対して使用され；Ｃｙ５（近赤
外色far red）はＸ＝Ｃに対して使用され；Ｃｙ７（近赤外色near infrared）は
Ｘ＝Ｔに対して使用される。 ＣＤＰＩ３の化学構造を以下に示す ここで、Ｒ＝この場合には、３'末端との接着のための適切なリンカー。 ＣＤＰＩ３-修飾ＣＰＧ（固相オリゴヌクレオチド合成のために調整された細
孔のガラス支持体）の調製はE. A. Lukhtanov 等によるBioconjugate Chemistry
, 1995,6, 418-426に記載されている。ヌクレオチド・ホスホアミダイト試薬は
グレンリサーチ（Sterling, VA, USA）から得られる。アミノ-修飾因子Ｃ６ホス
ホアミダイト試薬もグレンリサーチから得た。個々のホスホアミダイト試薬（Ａ
、Ｇ、Ｃ及びＴに対する）の各々はドライアセトニトリル中に、約５０ｍＭの濃
度になるように溶解する。ランダムカップリング工程（Ｎ）に対する混合物を調
製するために、各々の溶液から等容量を一つのバイアルにて混合する。全ての溶
液の移し換えは、当該技術分野において周知の無水状態の技術を用いることで実
施される。適切なホスホアミダイト溶液（個々の塩基もしくは４塩基全ての混合
物）は、エクスペダイト（登録商標）モデル８９０５核酸合成システム（パーセ
プティブ・バイオシステムズ、Framingham, MA, USA）を用いてＣＤＰＩ3-修飾
ＣＰＧ支持体に結合される。合成は製造メーカーによって提供される手法に従っ
て、３'末端から５'末端に向けて連続的に行われる。アミノ-修飾因子Ｃ６ホス
ホアミダイト試薬は、最後の合成サイクル（即ち、５'末端に）中に結合される
。４つの別個の合成が次のような方法で行われる：即ち、合成１：Ｘ＝Ａ；合成
２：Ｘ＝Ｇ；合成３：Ｘ＝Ｃ；合成４：Ｘ＝Ｔ。その後、アミノ-保護基（モノ
メトキシトリチル）は製造メーカーによって提供される酸脱トリチル化法を用い
て各々の合成カラムから除かれる。
【００３２】 ４つのオリゴヌクレオチド合成の各々は、３０％の水酸化アンモニウム水によ
り５５℃、６から１２時間処理することで、ＣＰＧ支持体から脱保護化し切断さ
れる。上清を移し、スピードバック（登録商標）濃縮装置（サバント社）を用い
て乾燥させ、以下に示す配列の粗製オリゴヌクレオチド産物を得る； ３'-(ＭＧＢ)-ＮＮＸＮＮ-(Ｃ６-アミノリンカー)-５' ここで、 Ｘ＝Ａ、Ｇ、ＣもしくはＴ ４つのオリゴヌクレオチドの組成物の各々は、以下の通りそれぞれのシアニン
色素に結合される。ＮＨＳ活性化シアニン色素試薬（Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５も
しくはＣｙ７）は１０ｍＭ溶液になるように水を含まないジメチルスルホキシド
に溶解する。オリゴヌクレオチド組成物（合成１から４）は、５０μｌの０．１
ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液(pH8.0)に溶解させる。次に、２５μｌの適切なシアニン
色素溶液を加え、混合物を３７℃で２時間反応させる。その後、２５μｌのシア
ニン色素溶液をさらに添加し、３７℃でさらに２から１２時間反応を続ける。反
応しなかった色素は、ＰＤ−１０カートリッジを以下に示すように用いてサイズ
排除クロマトグラフィーにより除去する。最初に、カートリッジを５倍量の蒸留
、脱イオン水（ｄｄH２Ｏ）で平衡化する。次に、粗反応混合物を０．４ｍＬの
ｄｄH２Ｏで希釈し、カートリッジに添加する。カートリッジは１．０ｍｌのｄ
ｄH２Ｏで２回溶出する。最後に、カートリッジを３．０ｍｌのｄｄH２Ｏで溶出
し、溶出産物を回収し、スピードバック（登録商標）濃縮装置にて乾燥させる。
り５５℃、６から１２時間処理することで、ＣＰＧ支持体から脱保護化し切断さ
れる。上清を移し、スピードバック（登録商標）濃縮装置（サバント社）を用い
て乾燥させ、以下に示す配列の粗製オリゴヌクレオチド産物を得る； ３'-(ＭＧＢ)-ＮＮＸＮＮ-(Ｃ６-アミノリンカー)-５' ここで、 Ｘ＝Ａ、Ｇ、ＣもしくはＴ ４つのオリゴヌクレオチドの組成物の各々は、以下の通りそれぞれのシアニン
色素に結合される。ＮＨＳ活性化シアニン色素試薬（Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５も
しくはＣｙ７）は１０ｍＭ溶液になるように水を含まないジメチルスルホキシド
に溶解する。オリゴヌクレオチド組成物（合成１から４）は、５０μｌの０．１
ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液(pH8.0)に溶解させる。次に、２５μｌの適切なシアニン
色素溶液を加え、混合物を３７℃で２時間反応させる。その後、２５μｌのシア
ニン色素溶液をさらに添加し、３７℃でさらに２から１２時間反応を続ける。反
応しなかった色素は、ＰＤ−１０カートリッジを以下に示すように用いてサイズ
排除クロマトグラフィーにより除去する。最初に、カートリッジを５倍量の蒸留
、脱イオン水（ｄｄH２Ｏ）で平衡化する。次に、粗反応混合物を０．４ｍＬの
ｄｄH２Ｏで希釈し、カートリッジに添加する。カートリッジは１．０ｍｌのｄ
ｄH２Ｏで２回溶出する。最後に、カートリッジを３．０ｍｌのｄｄH２Ｏで溶出
し、溶出産物を回収し、スピードバック（登録商標）濃縮装置にて乾燥させる。
【００３３】 ついで、染料抱合オリゴヌクレオチドの粗組成物を、ダイオード−アレイＵＶ
ディテクターを装備したヒューレットパッカード・モデル１０９０装置（又は等
価物）を使用して逆相ＨＰＬＣによって個々に精製する。カラム＝ダイナマック
ス（Dynamax）-３００Ａ分析カラム（Ｃ-１８、４．６ｘ２５０mm、Rainin）（
又は等価物）。１０％アセトニトリル／０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（
ＴＥＡＡ）から５０％アセトニトリル／０．１ＭのＴＥＡＡまでの線形勾配を使
用して溶出を行う。２６０ｎｍとまた各染料に特徴的な可視波長にてピークをモ
ニターする。双方の波長に吸光を示すピークを収集し、蒸発乾固させて精製産物
を得る。 全てのＨＰＬＣ精製の終わりに、精製産物を適切なハイブリダイゼーション緩
衝液に溶解し、その濃度を２６０ｎｍにおける吸光度を測定することにより決定
する。ついで、４種の精製産物のそれぞれの等しい濃度を混合することによって
普遍的検出因子セットを構築して、最後の実施原液を得る。
ディテクターを装備したヒューレットパッカード・モデル１０９０装置（又は等
価物）を使用して逆相ＨＰＬＣによって個々に精製する。カラム＝ダイナマック
ス（Dynamax）-３００Ａ分析カラム（Ｃ-１８、４．６ｘ２５０mm、Rainin）（
又は等価物）。１０％アセトニトリル／０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（
ＴＥＡＡ）から５０％アセトニトリル／０．１ＭのＴＥＡＡまでの線形勾配を使
用して溶出を行う。２６０ｎｍとまた各染料に特徴的な可視波長にてピークをモ
ニターする。双方の波長に吸光を示すピークを収集し、蒸発乾固させて精製産物
を得る。 全てのＨＰＬＣ精製の終わりに、精製産物を適切なハイブリダイゼーション緩
衝液に溶解し、その濃度を２６０ｎｍにおける吸光度を測定することにより決定
する。ついで、４種の精製産物のそれぞれの等しい濃度を混合することによって
普遍的検出因子セットを構築して、最後の実施原液を得る。
【００３４】 普遍的検出因子セット法の概略は図３に示す。捕獲ポリヌクレオチドは、捕獲
ポリヌクレオチドと試料ポリヌクレオチドとの間に形成される二重鎖の末端が配
列多型から３塩基離れるように標的試料に相補的となるように合成される。異な
った捕獲ポリヌクレオチドのアレイが複数部位アッセイのために調製される。上
述の試料ポリヌクレオチドと普遍的検出因子セットはこのアレイの存在下にて混
合される。試料ポリヌクレオチドは捕獲ポリヌクレオチドのアレイの上に選別さ
れる。各試料は普遍的検出因子セット内に存在する単一分子種によって標識され
る。これは、副溝結合コンジュゲートとスタッキング相互作用のオーバラップに
よって確実にされる。ストリンジェントな条件は、捕獲ポリヌクレオチドの末端
とのスタッキング相互作用と、試料及び捕獲ポリヌクレオチドの副溝への副溝結
合剤のオーバーラップにより安定化される場合には、検出因子分子が試料にのみ
ハイブリダイズするように選択される。検出因子セット内の各分子は分子中の第
３番の塩基を独自に特定するように標識され、検出因子プローブの第３番の塩基
は試料及び捕獲ポリヌクレオチド間に形成された二重鎖の末端（アッセイ部位）
から試料の第３番の塩基にハイブリダイズするように制約されており、よってア
レイエレメントはアッセイ部位に従って標識される。試料ポリヌクレオチドの混
合物が、アッセイされた部位において異なるように存在している場合には、アッ
セイエレメントは差次的に検出可能な標識を持つ複数の検出因子プローブで標識
される。 標的ポリヌクレオチドが捕獲ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの
領域を越えて両方向に延びる場合には、普遍的検出因子セット内に含まれる同じ
又は異なる種が捕獲ポリヌクレオチドに直ぐに隣接する両方の領域にハイブリダ
イズすることができると理解される。この場合、普遍的検出因子セットから非Ｓ
ＮＰ含有領域への種のハイブリダイゼーションはデータ処理の間に捕捉されなけ
ればならない別個のシグナルを生じる。あるいは、これは、上記方法への次の変
形の何れかを使用して修正される。
ポリヌクレオチドと試料ポリヌクレオチドとの間に形成される二重鎖の末端が配
列多型から３塩基離れるように標的試料に相補的となるように合成される。異な
った捕獲ポリヌクレオチドのアレイが複数部位アッセイのために調製される。上
述の試料ポリヌクレオチドと普遍的検出因子セットはこのアレイの存在下にて混
合される。試料ポリヌクレオチドは捕獲ポリヌクレオチドのアレイの上に選別さ
れる。各試料は普遍的検出因子セット内に存在する単一分子種によって標識され
る。これは、副溝結合コンジュゲートとスタッキング相互作用のオーバラップに
よって確実にされる。ストリンジェントな条件は、捕獲ポリヌクレオチドの末端
とのスタッキング相互作用と、試料及び捕獲ポリヌクレオチドの副溝への副溝結
合剤のオーバーラップにより安定化される場合には、検出因子分子が試料にのみ
ハイブリダイズするように選択される。検出因子セット内の各分子は分子中の第
３番の塩基を独自に特定するように標識され、検出因子プローブの第３番の塩基
は試料及び捕獲ポリヌクレオチド間に形成された二重鎖の末端（アッセイ部位）
から試料の第３番の塩基にハイブリダイズするように制約されており、よってア
レイエレメントはアッセイ部位に従って標識される。試料ポリヌクレオチドの混
合物が、アッセイされた部位において異なるように存在している場合には、アッ
セイエレメントは差次的に検出可能な標識を持つ複数の検出因子プローブで標識
される。 標的ポリヌクレオチドが捕獲ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの
領域を越えて両方向に延びる場合には、普遍的検出因子セット内に含まれる同じ
又は異なる種が捕獲ポリヌクレオチドに直ぐに隣接する両方の領域にハイブリダ
イズすることができると理解される。この場合、普遍的検出因子セットから非Ｓ
ＮＰ含有領域への種のハイブリダイゼーションはデータ処理の間に捕捉されなけ
ればならない別個のシグナルを生じる。あるいは、これは、上記方法への次の変
形の何れかを使用して修正される。
【００３５】 変形Ａ。 標的のＳＮＰ-含有領域に向いている末端とは反対の末端内に２'-
Ｏ-メチルリボ核酸（約３−５）を含む修飾捕獲ポリヌクレオチドが用いられる
。２'-Ｏ-メチルヌクレオシドホスホアミダイトがグレンリサーチ（Sterling, V
A, USA）から購入される。これらを、２'-Ｏ-メチルヌクレオシドホスホアミダ
イトのカップリング周期が約１０分に増加させられる点を除いて、上述したよう
に自動核酸合成機を使用して捕獲ポリヌクレオチドに結合させる。２'-Ｏ-メチ
ルリボ核酸の存在は、ＭＧＢが捕獲ポリヌクレオチドと標的の間に形成されたハ
イブリダイズ体に結合することを妨げる。よって、普遍的検出因子セット内に含
まれる種はＳＮＰ含有領域以外の標的領域内に安定した二重鎖を形成することは
できない。 変形Ｂ。 捕獲ポリヌクレオチドと形成されるハイブリダイズ体がＳＮＰ含有
領域とは反対の末端が平滑末端化されるように標的を設計する。二つのＡｐｏＥ
多型部位８５８ＡないしＧ及び部位４４８ＴないしＣの場合には、アッセイは、
塩基７９６から８５５の試料と相補性である８５８遺伝子領域のまわりに産生さ
れる試料のための捕獲プローブで構築される。第二の捕獲プローブは塩基３８６
から４４５の試料に相補的である４４８遺伝子領域のまわりに産生される試料を
捕獲するように構築される。特異的遺伝子領域から産生される試料が普遍的検出
因子セットの存在下でアレイにハイブリダイズされる。Ａ、Ｇ又は両方を持つユ
ニバーサル検出因子のためのシグナルは試料がホモ接合性Ａか、ホモ接合性Ｇか
又はヘテロ接合性かに応じて８５８領域の捕獲部位に見られる。同様に、Ｔ、Ｃ
又は両方のためのユニバーサル検出因子のシグナルは４４８領域の捕獲部位に見
られる
Ｏ-メチルリボ核酸（約３−５）を含む修飾捕獲ポリヌクレオチドが用いられる
。２'-Ｏ-メチルヌクレオシドホスホアミダイトがグレンリサーチ（Sterling, V
A, USA）から購入される。これらを、２'-Ｏ-メチルヌクレオシドホスホアミダ
イトのカップリング周期が約１０分に増加させられる点を除いて、上述したよう
に自動核酸合成機を使用して捕獲ポリヌクレオチドに結合させる。２'-Ｏ-メチ
ルリボ核酸の存在は、ＭＧＢが捕獲ポリヌクレオチドと標的の間に形成されたハ
イブリダイズ体に結合することを妨げる。よって、普遍的検出因子セット内に含
まれる種はＳＮＰ含有領域以外の標的領域内に安定した二重鎖を形成することは
できない。 変形Ｂ。 捕獲ポリヌクレオチドと形成されるハイブリダイズ体がＳＮＰ含有
領域とは反対の末端が平滑末端化されるように標的を設計する。二つのＡｐｏＥ
多型部位８５８ＡないしＧ及び部位４４８ＴないしＣの場合には、アッセイは、
塩基７９６から８５５の試料と相補性である８５８遺伝子領域のまわりに産生さ
れる試料のための捕獲プローブで構築される。第二の捕獲プローブは塩基３８６
から４４５の試料に相補的である４４８遺伝子領域のまわりに産生される試料を
捕獲するように構築される。特異的遺伝子領域から産生される試料が普遍的検出
因子セットの存在下でアレイにハイブリダイズされる。Ａ、Ｇ又は両方を持つユ
ニバーサル検出因子のためのシグナルは試料がホモ接合性Ａか、ホモ接合性Ｇか
又はヘテロ接合性かに応じて８５８領域の捕獲部位に見られる。同様に、Ｔ、Ｃ
又は両方のためのユニバーサル検出因子のシグナルは４４８領域の捕獲部位に見
られる
【００３６】 実施例５ 拘束ＭＧＢを含む捕獲ポリヌクレオチドを用いるＳＮＰ検出 拘束ＭＧＢを含む捕獲ポリヌクレオチドの合成と使用を記載する。この組成物
は次の一般化された配列を有している： ３'-(ＭＧＢ)-(Ｒ)ｎ-(Ｄ)ｍ-(アミノリンカー)-５' ここで、 ＭＧＢ＝ＣＤＰＩ３のような副溝結合剤（実施例４を参照のこと）； Ｒ＝２'-Ｏ-メチル修飾リボ核酸； Ｄ＝２'-デオキシリボ核酸； ｎ＝２'-デオキシリボ核酸がまた存在せず、ＭＧＢの近傍内に位置する領域に
おいて捕獲ポリヌクレオチドとハイブリダイズしないならば、ＭＧＢが捕獲ポリ
ヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドの間に形成されたハイブリダイズ体と結合
相互作用を受けることができないような整数、好ましくは約５−１０。ここに記
載されたＭＧＢは標的ポリヌクレオチドと２'-Ｏ-メチル修飾リボ核酸を含む捕
獲ポリヌクレオチドのセグメントとの間に形成されたヘテロ二重鎖に結合しない
。しかし、上記二重鎖が捕獲ポリヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドとの間に
形成されたヘテロ二重鎖から短い距離だけ（すなわち、約０−３塩基）離れて位
置する条件下では、ＭＧＢは、標的ポリヌクレオチドと２'-デオキシリボ核酸を
含むＳＮＰプローブとの間に形成される二重鎖に結合可能であり；そして、 ｍ＝この発明の本体内において定義されたような、標的の固定化に必要である
捕獲ポリヌクレオチド内に含まれる更なる塩基の長さを定義する第二の整数。
は次の一般化された配列を有している： ３'-(ＭＧＢ)-(Ｒ)ｎ-(Ｄ)ｍ-(アミノリンカー)-５' ここで、 ＭＧＢ＝ＣＤＰＩ３のような副溝結合剤（実施例４を参照のこと）； Ｒ＝２'-Ｏ-メチル修飾リボ核酸； Ｄ＝２'-デオキシリボ核酸； ｎ＝２'-デオキシリボ核酸がまた存在せず、ＭＧＢの近傍内に位置する領域に
おいて捕獲ポリヌクレオチドとハイブリダイズしないならば、ＭＧＢが捕獲ポリ
ヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドの間に形成されたハイブリダイズ体と結合
相互作用を受けることができないような整数、好ましくは約５−１０。ここに記
載されたＭＧＢは標的ポリヌクレオチドと２'-Ｏ-メチル修飾リボ核酸を含む捕
獲ポリヌクレオチドのセグメントとの間に形成されたヘテロ二重鎖に結合しない
。しかし、上記二重鎖が捕獲ポリヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドとの間に
形成されたヘテロ二重鎖から短い距離だけ（すなわち、約０−３塩基）離れて位
置する条件下では、ＭＧＢは、標的ポリヌクレオチドと２'-デオキシリボ核酸を
含むＳＮＰプローブとの間に形成される二重鎖に結合可能であり；そして、 ｍ＝この発明の本体内において定義されたような、標的の固定化に必要である
捕獲ポリヌクレオチド内に含まれる更なる塩基の長さを定義する第二の整数。
【００３７】 ＣＤＰＩ３-修飾ＣＰＧは実施例４に記載されている。２'-デオキシリボ-及び
２'-Ｏ-メチルリボ核酸ホスホアミダイト試薬及びアミノ-修飾因子Ｃ６ホスホア
ミダイト試薬はグレンリサーチ（Sterling, VA, USA）から得られる。オリゴヌ
クレオチドの合成は、２'-Ｏ-メチルリボ核酸ホスホアミダイト試薬に対するカ
ップリング時間を約１０分に増大させること以外は、実施例４に記載されたよう
にして実施される。未精製のオリゴヌクレオチドの脱保護化は同様に実施例４に
記載されたようにして行われる。オリゴヌクレオチドの精製は、ダイオード−ア
レイＵＶディテクターを装備したヒューレットパッカード・モデル１０９０装置
（又は等価物）を使用して逆相ＨＰＬＣによって実施される。カラム＝ダイナマ
ックス（Dynamax）-３００Ａ分析カラム（Ｃ-１８、４．６ｘ２５０mm、Rainin
）（又は等価物）。１０％アセトニトリル／０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウ
ム（ＴＥＡＡ）から５０％アセトニトリル／０．１ＭのＴＥＡＡまでの線形勾配
を使用して溶出を行う。生成物のピークは、より短い失敗した配列と比較して、
より長い滞留時間で溶出すると仮定される。回収した生成物の純度はポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法によって実証される。バンドは塩基性青色染料（Basic
Blue）の水溶液（シグマ社）での染色によって可視化される。オリゴヌクレオチ
ド-ＭＧＢコンジュゲートの完全性はＭＧＢがない同じオリゴヌクレオチド配列
の試料との比較により、また当該分野でよく知られている方法を使用する塩基組
成分析によっても実証される。
２'-Ｏ-メチルリボ核酸ホスホアミダイト試薬及びアミノ-修飾因子Ｃ６ホスホア
ミダイト試薬はグレンリサーチ（Sterling, VA, USA）から得られる。オリゴヌ
クレオチドの合成は、２'-Ｏ-メチルリボ核酸ホスホアミダイト試薬に対するカ
ップリング時間を約１０分に増大させること以外は、実施例４に記載されたよう
にして実施される。未精製のオリゴヌクレオチドの脱保護化は同様に実施例４に
記載されたようにして行われる。オリゴヌクレオチドの精製は、ダイオード−ア
レイＵＶディテクターを装備したヒューレットパッカード・モデル１０９０装置
（又は等価物）を使用して逆相ＨＰＬＣによって実施される。カラム＝ダイナマ
ックス（Dynamax）-３００Ａ分析カラム（Ｃ-１８、４．６ｘ２５０mm、Rainin
）（又は等価物）。１０％アセトニトリル／０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウ
ム（ＴＥＡＡ）から５０％アセトニトリル／０．１ＭのＴＥＡＡまでの線形勾配
を使用して溶出を行う。生成物のピークは、より短い失敗した配列と比較して、
より長い滞留時間で溶出すると仮定される。回収した生成物の純度はポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法によって実証される。バンドは塩基性青色染料（Basic
Blue）の水溶液（シグマ社）での染色によって可視化される。オリゴヌクレオチ
ド-ＭＧＢコンジュゲートの完全性はＭＧＢがない同じオリゴヌクレオチド配列
の試料との比較により、また当該分野でよく知られている方法を使用する塩基組
成分析によっても実証される。
【００３８】 ＭＧＢを持つ捕獲プローブを使用する試料中の多型性の検出が対立遺伝子特異
的又は普遍的検出因子の何れかによってなされる。この方法によるＳＮＰ検出の
概略は図４に示される。対立遺伝子特異的検出因子の場合には、対立遺伝子特異
的ＳＮＰプローブが実施例１におけるように独特の標識によって調製される。試
料及びＳＮＰプローブがそのアレイとハイブリダイズされる。試料分子はその区
別される捕獲プローブ上に選択される。ついで、ＳＮＰプローブは捕獲プローブ
の末端に隣接してハイブリダイズするときにのみハイブリダイズし、それに繋が
れた副溝結合剤によって安定化されうる。 普遍的検出因子セットの場合には、短いランダムなオリゴの集合が、一塩基が
特定の部位に存在し、独特の標識に関係させられるようになされる。例えば、普
遍的検出因子セットのオリゴの第三の位置は適当な標識法によりＡ、Ｃ、Ｇ又は
Ｔとして独自に特定される。この場合の捕獲プローブは、アッセイ部位が捕獲ポ
リヌクレオチドと試料ポリヌクレオチドの間に形成された二重鎖の末端から３塩
基となるように試料をハイブリダイズするように設計される。試料及び普遍的検
出因子セットは捕獲プローブのアレイとハイブリダイズされる。また、試料は、
その捕獲領域に基づいてアレイ上へそれ自身を選別する。ついで、検出因子プロ
ーブは捕獲配列の末端から３番目の塩基の内容を同定する。
的又は普遍的検出因子の何れかによってなされる。この方法によるＳＮＰ検出の
概略は図４に示される。対立遺伝子特異的検出因子の場合には、対立遺伝子特異
的ＳＮＰプローブが実施例１におけるように独特の標識によって調製される。試
料及びＳＮＰプローブがそのアレイとハイブリダイズされる。試料分子はその区
別される捕獲プローブ上に選択される。ついで、ＳＮＰプローブは捕獲プローブ
の末端に隣接してハイブリダイズするときにのみハイブリダイズし、それに繋が
れた副溝結合剤によって安定化されうる。 普遍的検出因子セットの場合には、短いランダムなオリゴの集合が、一塩基が
特定の部位に存在し、独特の標識に関係させられるようになされる。例えば、普
遍的検出因子セットのオリゴの第三の位置は適当な標識法によりＡ、Ｃ、Ｇ又は
Ｔとして独自に特定される。この場合の捕獲プローブは、アッセイ部位が捕獲ポ
リヌクレオチドと試料ポリヌクレオチドの間に形成された二重鎖の末端から３塩
基となるように試料をハイブリダイズするように設計される。試料及び普遍的検
出因子セットは捕獲プローブのアレイとハイブリダイズされる。また、試料は、
その捕獲領域に基づいてアレイ上へそれ自身を選別する。ついで、検出因子プロ
ーブは捕獲配列の末端から３番目の塩基の内容を同定する。
【００３９】 この明細書において引用した全ての刊行物と特許出願は、その個々の刊行物又
は特許出願があたかも特にかつ個々に出典明示により取り込まれる旨が示されて
いるかのように、出典明示によりここに取り込まれる。上記発明は明確な理解を
図るために例示と実施例によってある程度の詳細さをもって説明したが、特許請
求の範囲の精神又は範囲から逸脱しない限りある種の変化と変更をそれに加える
ことができることはこの発明の教示に照らすと当業者には明らかであろう。
は特許出願があたかも特にかつ個々に出典明示により取り込まれる旨が示されて
いるかのように、出典明示によりここに取り込まれる。上記発明は明確な理解を
図るために例示と実施例によってある程度の詳細さをもって説明したが、特許請
求の範囲の精神又は範囲から逸脱しない限りある種の変化と変更をそれに加える
ことができることはこの発明の教示に照らすと当業者には明らかであろう。
【図１】 支持体結合捕獲ポリヌクレオチドと標識したＳＮＰ検出因子ポリ
ヌクレオチドを使用するＳＮＰ検出の概略を示す。
ヌクレオチドを使用するＳＮＰ検出の概略を示す。
【図２】 支持体結合捕獲ポリヌクレオチドとＭＧＢに拘束された標識ＳＮ
Ｐ検出因子ポリヌクレオチドを使用するＳＮＰ検出の概略を示す。
Ｐ検出因子ポリヌクレオチドを使用するＳＮＰ検出の概略を示す。
【図３】 支持体結合捕獲ポリヌクレオチドと普遍的検出因子セットを使用
するＳＮＰ検出の概略を示す。
するＳＮＰ検出の概略を示す。
【図４】 一端に２'-Ｏ-メチルリボ核酸の領域を含み、更にＭＧＢに拘束
されたキメラ支持体結合捕捉ポリヌクレオチドを使用するＳＮＰ検出の概略を示
す。
されたキメラ支持体結合捕捉ポリヌクレオチドを使用するＳＮＰ検出の概略を示
す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年７月９日（２００１．７．９）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 セリオールト，トーマス アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94555，フレモント，ダンバートン サー クル 6519，インサイト ファーマシュー ティカルズ，マイクロアレイ システムズ 内 (72)発明者 ベディライオン，トッド アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94555，フレモント，ダンバートン サー クル 6519，インサイト ファーマシュー ティカルズ，マイクロアレイ システムズ 内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA80 CA01 CA09 CA11 HA12 4B063 QA01 QA17 QA19 QQ42 QQ52 QR08 QR42 QR56 QR62 QR82 QS25 QS34 QS36 QX02
Claims (16)
- 【請求項１】 標的ポリヌクレオチドの集団中に存在する複数のＳＮＰｓを
同時に検出する方法であって、 （ａ）標的ポリヌクレオチド、捕獲ポリヌクレオチド、及びＳＮＰプローブを、 各々の標的ポリヌクレオチドが異なる捕獲領域、及び対応する異なるＳＮＰ
を含む異なるＳＮＰ領域を包含し 捕獲ポリヌクレオチドが、基質上の対応する個々のエレメント部位に固定化
され、アレイ化されていおり、各々の捕獲ポリヌクレオチドは対応する異なる捕
獲領域と特異的にハイブリダイズ化する配列を含み、 各々のＳＮＰプローブは対応する異なるＳＮＰ領域の相補的配列を含み、 標的ポリヌクレオチドが基質の対応する個々のエレメント部位に固定化する
ように捕獲ポリヌクレオチドとハイブリダイズ化することによって、標的ポリヌ
クレオチドが固定化され、 各々のＳＮＰプローブが対応するＳＮＰ領域に選択的にハイブリダイズ化す
るために、対応するＳＮＰ領域に対する各々のＳＮＰプローブの相対的親和性が
、対応するＳＮＰ領域に対するＳＮＰプローブの選択的ハイブリダイズ化をもた
らすのに充分であるような条件下にて、 標的ポリヌクレオチド、捕獲ポリヌクレオチド、及びＳＮＰプローブを混合す
る工程と； （ｂ）基質上に存在する各々のＳＮＰプローブを検出し、任意のエレメント部位
に任意のＳＮＰプローブが存在することが、対応する標的ポリヌクレオチド上に
対応するＳＮＰが存在していることを示す工程、 を含んでなる方法。 - 【請求項２】 ＳＮＰプローブがアッセイ用プローブの部分集合であり、ア
ッセイ用プローブが可能なかぎり全てが同じ長さの縮退した一組の集合を含む請
求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 標的ポリヌクレオチドが試料ポリヌクレオチドの部分集合で
あり、試料ポリヌクレオチドが断片化ゲノムＤＮＡを含む請求項１に記載の方法
。 - 【請求項４】 捕獲ポリヌクレオチドが固定化されたポリヌクレオチドの部
分集合であり、固定化ポリヌクレオチドが分離されアレイ化されたｃＤＮＡライ
ブラリーである請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 捕獲ポリヌクレオチドが対応する個々のエレメント部位に高
密度で固定化され、アレイ化されている請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 各々のＳＮＰプローブが標識を含む請求項１に記載の方法。
- 【請求項７】 ＳＮＰプローブがアッセイ用プローブの部分集合であり、対
応するＳＮＰ領域に対する各々のＳＮＰプローブの相対的親和性が、対応するＳ
ＮＰ領域とそれ以外のＳＮＰ領域との間の向上した識別性をもたらすために増強
される請求項１に記載の方法。 - 【請求項８】 ＳＮＰプローブがアッセイ用プローブの部分集合であり、対
応するＳＮＰ領域に対する各々のＳＮＰプローブの相対的親和性が、アッセイ用
プローブの融解温度を規格化する試薬を混合工程において含ませる工程を含む方
法により、少なくとも部分的に増強される請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 ＳＮＰプローブがアッセイ用プローブの部分集合であり、対
応するＳＮＰ領域に対する各々のＳＮＰプローブの相対的親和性が、対応する標
的ポリヌクレオチドとハイブリダイズ化されている補助プローブもしくは捕獲ポ
リヌクレオチドと相互作用するＳＮＰプローブにより、少なくとも部分的に増強
される請求項７に記載の方法。 - 【請求項１０】 ＳＮＰプローブがアッセイ用プローブの部分集合であり、
対応するＳＮＰ領域に対する各々のＳＮＰプローブの相対的親和性が、対応する
標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズ化されている補助プローブもしくは捕獲
ポリヌクレオチドとＳＮＰプローブ、捕獲ポリヌクレオチド及び補助プローブの
少なくとも一つに拘束される副溝結合剤を通じて相互作用するＳＮＰプローブに
より、少なくとも部分的に増強される請求項７に記載の方法。 - 【請求項１１】 ＳＮＰプローブがアッセイ用プローブの部分集合であり、
アッセイ用プローブが可能なかぎり全てが同じ長さである縮退した一組の集合を
含む請求項７に記載の方法。 - 【請求項１２】 標的ポリヌクレオチドが試料ポリヌクレオチドの部分集合
であり、試料ポリヌクレオチドが断片化ゲノムＤＮＡを含む請求項７に記載の方
法。 - 【請求項１３】 捕獲ポリヌクレオチドが固定化されたポリヌクレオチドの
部分集合であり、固定化ポリヌクレオチドが分離されアレイ化されたｃＤＮＡラ
イブラリーである請求項７に記載の方法。 - 【請求項１４】 捕獲ポリヌクレオチドが対応する個々のエレメント部位に
高密度で固定化され、アレイ化されている請求項７に記載の方法。 - 【請求項１５】 各々のＳＮＰプローブが標識を含む請求項７に記載の方法
。 - 【請求項１６】 標的ポリヌクレオチドの集団中に存在する複数のＳＮＰｓ
を同時に検出する方法であって、 （ａ）試料ポリヌクレオチドが、異なる捕獲領域及び対応する異なるＳＮＰを含
む異なるＳＮＰ領域を各々含む標的ポリヌクレオチドを含み、 固定化されたポリヌクレオチドが、基質上の対応する個々のエレメント部位に
おいて固定化されアレイ化されている捕獲ポリヌクレオチドを含み、各々の捕獲
ポリヌクレオチドが対応する異なる捕獲領域と特異的にハイブリダイズ化する配
列を含み、 アッセイ用プローブ対が、対応する異なるＳＮＰ領域に対して相補的な配列を
含む一次ＳＮＰプローブと、前記同一の対応するＳＮＰ領域と一塩基のミスマッ
チを有する配列を含む二次プローブを含んでなり、 標的ポリヌクレオチドが捕獲ポリヌクレオチドとハイブリダイズ化することに
より固定化され、それにより基質の対応する個々のエレメント部位に各々の標的
ポリヌクレオチドが固定化され、 対応するＳＮＰ領域に対する各々の一次ＳＮＰプローブの相対的親和性が、（
ａ）混合工程において、アッセイプローブの融解温度を規格化する試薬を含ませ
る工程を含む方法及び（ｂ）対応する標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズ化
された補助プローブもしくは捕獲ポリヌクレオチドと、一次ＳＮＰプローブと対
応するＳＮＰ領域との選択的なハイブリダイゼーションをもたらすのに充分に相
互作用し、それによって相当するＳＮＰ領域と各々の二次ＳＮＰプローブとのハ
イブリダイゼーションの程度に対する、相当するＳＮＰ領域と各々の一次ＳＮＰ
プローブとのハイブリダイゼーション程度との比率が当該条件において結果的に
少なくとも二倍となるようなＳＮＰプローブ、の少なくとも一方を用いることで
少なくとも部分的に増強される条件下にて、 試料ポリヌクレオチド、固定化ポリヌクレオチド、及び一次、二次アッセイ用
プローブ組の各々の集団を混合する工程と； （ｂ）基質上の各々のＳＮＰプローブの存在を検出し、それにより任意のエレメ
ント部位における任意のＳＮＰプローブの存在が対応する標的ポリヌクレオチド
上に対応するＳＮＰが存在することを示す工程、 を含んでなる方法。
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