JP3640988B2 - 標的ｒｎａを特異的に検出する方法及びｒｎａ検出用キット - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ハイブリダイゼーション法により標的ＲＮＡを特異的に検出する方法及びそれに使用するＲＮＡ検出用キットに関する。詳しくはリボゾームＲＮＡの検出方法、それを利用した細菌の検出方法、それに用いる検出用キットに関する。
【０００２】
【従来技術】
周知のように、２本鎖ＤＮＡは２つの相補的なポリヌクレオチド鎖からなっており、加熱処理やアルカリ処理によって容易に変性しそれぞれの１本鎖に解離する。この反応は可逆的で、適当な条件下におくと、グアニンとシトシン、及びアデニンとチミン（ウリジン）の２組の塩基が水素結合することによって再結合し安定な２本鎖ＤＮＡ複合体（ハイブリッド）が生じる（ハイブリダイゼーション）。この反応はかなり特異的で、２本の鎖がお互いに相補的な場合に起こる。また、ＤＮＡに限らず、ＲＮＡの場合も同様である。
核酸がハイブリッドを形成するためには、その２本の核酸が完全に相補的である必要はなく、ある程度相補的でない部分があっても、ハイブリッドを生じる。但し、そのようなハイブリッドは、温度やイオン強度といった変化に対して不安定である。この性質を利用して、何らかの形で標識した外来性のポリヌクレオチド鎖（プローブ）を導入することによって塩基配列が類似した、即ち相違する部分が極くわずかである核酸を識別することができる。
上述のように原理的には、結合の条件を厳密に規定することによって、１あるいは２塩基のみが相違するような類似した核酸を、ハイブリダイゼーション法により識別して検出することは可能である。この場合、通常ハイブリダイズする塩基配列が１０〜５０塩基程度の短いプローブが用いられる。しかしながら、これを行うためには細心の注意と熟練を必要とし、汎用性に問題がある。
【０００３】
これを解決するため、Andar Gunneberg らはα1-アンチトリプシン欠損症を対象として、競合ハイブリダイゼーション法を用いた１塩基置換の容易な検出法を考案した(Clinical Chemistry, Vol. 39, No. 10, 1993年, p2157-2162) 。α1-アンチトリプシン欠損症は遺伝子中の１塩基が他の塩基に置換(Glu-342 GAG→ Lys AAG) したことによって起こる遺伝病である。彼らはこの１塩基変異を、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション法(PCR法) で増幅したＤＮＡ断片を用い検出している。例えば変異した遺伝子の配列をもつ21塩基のＤＮＡを標識プローブとして用いると、非常に厳密なハイブリダイゼーション条件を設定した場合には変異した遺伝子のみが検出される。ここで、正常な配列のＤＮＡをコンペティター(Competitor)としてハイブリダイゼーション反応の前に加えておくと、より緩い条件でも変異した遺伝子のみの検出が可能になることを記載している。
しかしながら、彼らが対象としているのはＰＣＲ法で増幅した純粋なＤＮＡ断片である。ＲＮＡの場合、水素結合力が強く、その融解温度(Tm)は、ＤＮＡよりもかなり高い。従って、被検対象がＲＮＡの場合、彼らの方法をそのまま使用するというわけにはいかないであろう。また、彼らは、ハイブリダイゼーションの前にコンペティターを添加することでより優れた効果が得られたとしているが、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーションの場合、同様の方法を用いると対象とする核酸検出の感度が低下する傾向が見られる（これについては後述の実施例で説明する）。更に、検出の対象となるＲＮＡは純粋とは限らず、一般には非常に不純物が多く、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片のような純粋な系とはまた違った結果が出てくる可能性が高い。
【０００４】
本発明者は先に隣接する２つの核酸プローブを用いたＲＮＡの検出法を開発した（隣接ハイブリダイゼーション法、特願平６−０６１４６７号）。この方法は２種の核酸プローブのうち一方を担体に固定、もう一方を何等かの方法で標識し、特異的に検体ＲＮＡと結合した標識核酸を検出する方法で、非常に特異性が高く、また操作性にも優れており実用性が高い。ただ、ＲＮＡによっては更に工夫が必要になる場合がある。例えば、限定されるものではないが、サルモネラ菌のように非常に近縁菌が多い場合では、上記隣接ハイブリダイゼーション法をそのまま１つのプローブセットで実施した場合、サルモネラ菌のみを検出する系を作るのはかなり困難であることが予想される。解決策としては、1.ハイブリダイゼーションの条件をより厳密に設定する；2.複数のプローブセットを用いて結果の組み合わせにより判定する、といったことが考えられる。1.については、相当に高い熟練度を必要とする一方、2.の方法をとると、手間とコストが増えてしまうという問題がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、非常に相同性の高い配列を持つＲＮＡ、すなわち相違塩基数が非常に少ないＲＮＡが共存する試料において、特異的に且つ簡便に特定のＲＮＡを他のＲＮＡと識別して検出する方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ハイブリダイゼーション法によるＲＮＡの検出方法において、標的ＲＮＡに対する標識プローブに加えて、該標的ＲＮＡと相同性の高いＲＮＡに結合する核酸プローブ（以下、競合プローブという）をハイブリダイゼーションの際に添加することによって、標識プローブと上記相同性の高いＲＮＡとの結合を防ぐことができ、よって、相同性の高いＲＮＡ中から標的ＲＮＡを特異的に高感度で検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
従って本発明は、標的ＲＮＡ及び該標的ＲＮＡと相同性の高いＲＮＡを含む検体において標的ＲＮＡを特異的に検出する方法であって、標的ＲＮＡ上にある該相同性の高いＲＮＡに対する非相同部位を含む塩基配列の逆相補鎖核酸を標識プローブ、該相同性の高いＲＮＡ上にある標的ＲＮＡに対する非相同部位を含む塩基配列の逆相補鎖核酸を競合プローブとして、ハイブリダイゼーションを行い、標的ＲＮＡに結合した標識プローブの標識物質を検出することにより標的ＲＮＡの存在を検出することを特徴とする方法に関する。
標識プローブ及び競合プローブとなる核酸はＤＮＡでもＲＮＡでもよく、１０塩基以上、好ましくは１５〜５０塩基が適当である。両者の配列には一般に、１塩基あるいは２塩基ほどの相違が存在することになる。
【０００７】
本発明の方法において、ハイブリダイゼーションは常法に従って実施することができる。ハイブリダイゼーションの実施において標識プローブと競合プローブを同時に添加することが好ましい。また、本発明者らが先に開発した隣接ハイブリダイゼーション法、即ち標的ＲＮＡに対して２種の核酸プローブを用いるＲＮＡの検出方法と、本発明の方法を組み合わせて実施することができる。この隣接ハイブリダイゼーション法とは具体的に、標的ＲＮＡの塩基配列のうち、特異的な１０塩基以上の部分配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと、標的ＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存在する１０塩基以上の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを用意し、一方を捕捉プローブとして担体に固定し、他方を標識物質で標識して標識プローブとし、標的ＲＮＡを含む試料及び標識プローブを該担体に固定された捕捉プローブと接触させて標的ＲＮＡに捕捉プローブと標識プローブをハイブリダイズさせ、標的ＲＮＡに結合した標識プローブの標識物質を検出することにより標的ＲＮＡの存在を検出するものである。
従って本発明は具体的には、サルモネラ菌由来の標的ＲＮＡ及び該標的ＲＮＡと相同性の高いＲＮＡを含む検体において標的ＲＮＡを特異的に検出する方法であって、標的ＲＮＡ上にある該相同性の高いＲＮＡに対する非相同部位を含む塩基配列の逆相補鎖核酸を標識プローブとし、標的ＲＮＡ上にある該相同性の高いＲＮＡに対する非相同部位を含む塩基配列の近傍に存在する部分配列の逆相補鎖核酸を捕捉プローブとし、及び該相同性の高いＲＮＡ上にある標的ＲＮＡに対する非相同部位を含む塩基配列の逆相補鎖核酸を競合プローブとして、上記標識プローブとして下記配列番号２のＤＮＡを用い、上記捕捉プローブとして下記配列番号１のＤＮＡを用い、及び上記競合プローブとして下記配列番号３のＤＮＡを用いてハイブリダイゼーションを行い、標的ＲＮＡに結合した標識プローブの標識物質を検出することにより標的ＲＮＡの存在を検出することを特徴とする方法である。
配列番号１ CTTCAGCTCC ATGAGTAAAT CA
配列番号２ CTTCACCTAC GTGTCAGC
配列番号３ CTTCACCTAC ATATCAGC
【０００８】
上記隣接ハイブリダイゼーション法において、部分配列（Ｂ）は部分配列（Ａ）の近傍に存在することが必要であって、部分配列（Ａ）の５’側、３’側のどちらに存在してもよい。配列（Ｂ）の３’末端と配列（Ａ）の５’末端が、あるいは配列（Ｂ）の５’末端と配列（Ａ）の３’末端が完全に隣接していることが好ましい。配列（Ｂ）の３’末端配列と配列（Ａ）の５’末端配列、または配列（Ｂ）の５’末端配列と配列（Ａ）の３’末端配列が重複していてもよいが、その場合、それらの逆相補鎖核酸プローブがハイブリダイズする際に、その重複部分で標的ＲＮＡに対して競合が起こり感度が低下する確率が高まる。従って、そのような重複部分はできるだけ短い方がよく、５塩基未満が好ましく、全く重複がないこと、すなわち完全に隣接していることがより好ましい。一方、配列（Ａ）と配列（Ｂ）は重複も隣接もせず、即ち離れていてもよいが、それらの逆相補鎖核酸プローブがハイブリダイズした結果、標的ＲＮＡ上の配列（Ａ）と配列（Ｂ）の間に１本鎖部分が生じ、この部分に切断が生じやすくなり、感度が低下する確率が高まる。従って、配列（Ａ）と配列（Ｂ）が離れて存在する場合、配列（Ｂ）の３’末端と配列（Ａ）の５’末端、あるいは配列（Ｂ）の５’末端と配列（Ａ）の３’末端の距離は、できるだけ短い方がよく、５塩基以内が好ましく、離れていないこと、すなわち完全に隣接していることが最も好ましい。使用する核酸プローブは１０塩基以上、好ましくは１５〜５０塩基のものが適当である。
【０００９】
本発明の方法における標的ＲＮＡとしては、例えばリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）が挙げられる。ｒＲＮＡをターゲットとして生物種の同定試験に本発明の方法を使用することができ、さらにｒＲＮＡとして、例えば細菌由来のものが挙げられる。
本発明の方法は、標的ＲＮＡがサルモネラ菌由来のｒＲＮＡである場合にとりわけ有利であって、サルモネラ菌を近縁菌から識別して特異的に検出することができる。サルモネラの近縁菌として代表的に挙げられるものはシトロバクターである。サルモネラ菌を近縁菌であるシトロバクターから識別して特異的に検出する方法において、下記配列番号１、配列番号２及び配列番号３のＤＮＡをそれぞれ、捕捉プローブ、標識プローブ及び競合プローブとして用いることができる。
配列番号１ CTTCAGCTCC ATGAGTAAAT CA
配列番号２ CTTCACCTAC GTGTCAGC
配列番号３ CTTCACCTAC ATATCAGC
本発明のこの方法において、一般的には競合プローブを標識プローブの２〜４倍量使用することが好ましい。
本発明はまた、上記のサルモネラ菌を近縁菌から識別して特異的に検出する方法に使用するための下記成分を含むＲＮＡ検出用キットを提供する。
（イ）上記配列番号１のＤＮＡを固定化した担体；
（ロ）標識物質で標識された上記配列番号２のＤＮＡ；
（ハ）上記配列番号３のＤＮＡ；
（ニ）標識物質を検出するための試薬；及び
（ホ）ハイブリダイゼーション溶液
【００１０】
標識プローブの調製法は特定されるものではなく、標識物質としては、例えばジゴキシゲニン、ビオチン、臭化デオキシウリジン、フルオロエスセイン等が挙げられる。
捕捉プローブは適当な担体に固定すればよく、担体としては、例えば核酸との結合性が高い有機ポリマーを素材とするマイクロタイタープレートなどを用いることができる。捕捉プローブの固定法は特に限定されるものでないが、例えば、上記のプレートに捕捉プローブＤＮＡ又はＲＮＡ溶液を入れ、乾燥後、紫外線照射などにより固定する方法や、あるいはグルタルアルデヒド法などの共有結合法を用いてもよい。
次に標的ＲＮＡを含む試料、標識プローブ、競合プローブを該担体に固定された捕捉プローブと接触させてハイブリダイゼーションを行う。次いで標的ＲＮＡと結合した標識プローブの標識物質を検出することにより標的ＲＮＡを検出する。
【００１１】
標的ＲＮＡを含む試料の調製法は、特定されるものではないが、安全かつ簡便におこなるためには、例えば水酸化ナトリウム水溶液などで細胞を溶解した後、塩酸などで中和すればよい。
調製されたＲＮＡ溶液を、標識プローブ、競合プローブとともに捕捉プローブを固定した担体上に加え、一般に１５〜６０℃で３分〜１８時間程度ハイブリダイゼーションを行う。適切な溶液（洗浄液１）で洗浄し、標識化合物と結合する物質に酵素を結合させたものを加え一定時間反応させる。標識化合物と結合する物質は特定されるものではないが、例えば標識プローブがビオチンで標識されている場合にはビオチン結合西洋ワサビペルオキシダーゼとアビジンの混合物、また、ジゴキシゲニン(Dig) で標識されている場合には抗Dig 免疫グロブリンと西洋ワサビペルオキシダーゼの結合体を用いることができる。
適切な溶液（洗浄液２）で洗浄後、適当な酵素基質を加える。酵素基質は特定されるものではないが、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼを用いた場合には、テトラメチルベンジジンと過酸化水素を基質とすることによって青色の反応産物を得ることができる。勿論、蛍光基質や発光基質などを用いることもできる。
洗浄液１、２は特定されるものではないが、例えば0.05% 程度の界面活性剤を含む生理食塩水などを用いることができる。
【００１２】
本発明の方法の原理は一般的に下記のとおりである。
例えばＡ、Ｂという２種類のＲＮＡが検体中に存在し、両者の塩基配列は１あるいは２塩基しか相違しない。これらを識別するために、標識プローブにＡの逆相補鎖を用いて通常の条件で隣接ハイブリダイゼーション法を行なうと、Ｂも（値は低いものの）検出されてしまうケースが生じる。これは前述したように、温度、塩濃度あるいはホルムアミドなどの変性剤の濃度を厳密に設定することによって回避できるが、コントロールが難しく、実施者によってはＢが検出されてしまう。ここで、競合プローブとしてＢの逆相補鎖の核酸（即ち、標識プローブとは１あるいは２塩基異なる）を加えてハイブリダイゼーションさせると、Ｂと標識プローブよりも、Ｂと競合プローブとの結合力の方が強く、比較的穏和な条件下でもＢと標識プローブの結合性がなくなる、もしくは非常に弱くなり、その結果、Ｂが検出されなくなるということが期待される。
以下、本発明の方法を競合ハイブリダイゼーションともいう。
【００１３】
【発明の効果】
本発明の方法を用い、相違塩基数が非常に少ない核酸を識別することができる。その応用範囲は多岐にわたるが、中でも診断の分野に於いて特に有効である。限定されるものではないが、ｒＲＮＡをターゲットとした生物種の同定試験に本方法を用いれば、従来法では識別が難しかった近縁の菌種でも容易に識別が可能となる。また、１塩基置換・欠失などの突然変異や遺伝子疾患などの検出も可能であろう。
以下、参考例、比較例及び実施例を挙げて本発明を詳しく説明する。なお、実施例ではサルモネラ菌と近縁菌の識別を示しているが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１４】
参考例
〔サルモネラとシトロバクター 23S rRNA 遺伝子塩基配列の決定〕
サルモネラ・ティフィムリウム ＬＴ−２(S. Typhimurium LT-2) 及びシトロバクター・フロインジー IMAI(C.freundii IMAI)の培養液からＤＮＡを抽出し、下記配列番号１及び配列番号２で示されるＤＮＡを用いてポリメラーゼ・チェーン・リアクション反応（ＰＣＲ）を行い、得られた約２８００塩基のＤＮＡ断片を定法に従い大腸菌プラスミドｐＵＣ１１８にクローニングした。これを用い各菌種の２３Ｓ rＲＮＡの塩基配列を部分的に決定し、サルモネラとシトロバクターの異なる領域をいくつか見いだした。本参考例では２ヶ所について検討した結果を示す。その異なる領域について、下記に、サルモネラ・ティフィムリウムとシトロバクター・フロインジーの２３Ｓ rＲＮＡ部分塩基配列（大腸菌 23S rRNA 遺伝子の第1681番目から第1770番目に相当）を比較したデータを示す。
【００１５】
配列番号１ CTTCAGCTCC ATGAGTAAAT CA
（大腸菌 23S rRNA 遺伝子の第1726番目から第1747番目に相当するサルモネラ・ティフィムリウムの23S rRNA部分塩基配列の逆相補鎖ＤＮＡ)
配列番号２ CTTCACCTAC GTGTCAGC
（大腸菌 23S rRNA 遺伝子の第1708番目から第1725番目に相当するサルモネラ・ティフィムリウムの23S rRNA部分塩基配列の逆相補鎖ＤＮＡ)
配列番号３ CTTCACCTAC ATATCAGC
（大腸菌 23S rRNA 遺伝子の第1708番目から第1725番目に相当するシトロバクター・フロインジー23S rRNAの部分塩基配列の逆相補鎖ＤＮＡ)
【００１６】
比較例
〔燐接ハイブリダイゼーション法を用いたサルモネラ菌の検出〕
上記に示される部分領域に於いてはサルモネラ・ティフィムリウムとシトロバクター・フロインジーは３塩基異なっている。但し、違い方に偏りがあり、２つは近接して (TGACACGTA → TGATATGTA) 、3'側のもう１つの異なる塩基は30塩基以上離れている。このようなケースでは、3'側の相違は識別する目的では通常使えないと考えられるので、２塩基異なる場所の周辺領域からプローブの候補をいくつか選択し隣接ハイブリダイゼーション法を実施した。以下、配列番号１のＤＮＡを捕捉プローブとして、及び配列番号２で表されるＤＮＡを標識プローブとして用いた代表的な試験例を示す。なお、両ＤＮＡを含め、試験に用いた合成ＤＮＡは全てＤＮＡ合成装置(PCR−MATE モデル391 、ABＩ社、以下同じ) を用いて合成した。
配列番号１のＤＮＡ（捕捉プローブ）を0.02μg/μl になるように50mM リン酸ナトリウムバッファー,pH8.0に溶かし、これをマイクロタイタープレート（住友ベークライト製、MS-3608FA)の各ウェルに50μl 加え、80℃で乾燥させる。紫外線を120mJ/cm2 照射した後、30mMクエン酸ナトリウム／300mM 塩化ナトリウム(2xSSC) 200 μl で３、４回洗浄し乾燥させた。
標識プローブは配列番号２のＤＮＡを下記表１の組成の反応液でジゴキシゲニン (Dig)標識したものを用いた。
【００１７】
【表１】
【００１８】
標識後、1/10容の0.2M EDTA 、1/10容の4M LiCl 、３μg のグリコーゲン及び2.5 倍容のエタノールを加え -80℃、一晩放置した。遠心分離により沈殿を集め、70% エタノールで洗浄し乾燥させた後、100 μl の10mM Tris 塩酸,pH8/1mMエチレンジアミンテトラ酢酸４ナトリウム塩 (TE) に溶かした。
得られた標識プローブの一定量を下記表２に示すハイブリダイゼーションバッファーと混合した（標識プローブ液) 。
【００１９】
【表２】
ハイブリダイゼーションバッファー
【００２０】
サルモネラ及びシトロバクターからの被検ｒＲＮＡは以下のようにして調製した。
平板培地上のサルモネラ（S. Typhimurium LT-2 及び S. Enteritidis L-58) 及びシトロバクター (C.freundii ATCC8090)のコロニーを10mlのLB培地（下記表３）で37℃、一晩培養する。培養液を0.1ml とりLBに植菌し37℃で４時間培養する。培養液を0.9ml とり、0.1ml の1.8M 水酸化ナトリウムを加え混合する。室温で10分放置し、0.1ml の1.8M塩酸-0.2M リン酸ナトリウム緩衝液,pH7を加え中和する。
【００２１】
【表３】
LB培地（１リットル中)
【００２２】
ハイブリダイゼーションと検出は以下のようにして行なった。
溶菌液50μl と標識プローブ液50μl を捕捉プローブが固定されたマイクロタイタープレートに入れ、37℃、２時間静置した。 0.05% Tween20 を含む生理食塩水（洗浄液）で３回洗浄した後、ブロッキング溶液 (１% ブロッキング試薬, 20mM Tris-HCl,pH7.5/0.15M NaCl）で10,000倍に希釈した抗Dig ヒツジ抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP、ベーリンガーマンハイム社製）を加え30分放置後、洗浄液で３回洗浄し、発色基質液（Ａ液：0.12% 3,3',5,5',- テトラメチルベンジジン/0.1M 酢酸ナトリウム,pH5/30%ジメチルホルムアミド、Ｂ液：0.03% 過酸化水素/0.2% リン酸、使用時にＡ液とＢ液を１：１で混合)100μl を加え5-15分放置した。得られた青色液の吸光度を660nm の波長で測定した。下記表４にその結果を示す。
【００２３】
【表４】
表４に示されるように、この比較例のハイブリダイゼーション条件ではシトロバクターが明らかに検出されている。
【００２４】
実施例１
〔競合ハイブリダイゼーション法を用いたサルモネラ菌とシトロバクターの識別〕
ここでは隣接ハイブリダイゼーション法を採用し、用いた捕捉プローブ及び標識プローブは比較例に同じである。競合プローブとしては下記配列番号３で示されるＤＮＡを用いた。
配列番号３ CTTCACCTAC ATATCAGC
ハイブリダイゼーションは以下のようにして行なった。比較例の方法に従って調製した溶菌液50μl と標識プローブを含まないハイブリダイゼーションバッファー50μl を、捕捉プローブを固定したプレートに分注する。ここで30分のプレハイブリダイゼーションと90分のハイブリダイゼーションを37℃で行なった。実験条件を下記に示す。なお、標識プローブ及び競合プローブはそれぞれ30ng/ml 、120ng/mlになるように TE に溶解し、うち１μl を各反応液に添加した。
【００２５】
条件１
標識プローブをプレハイブリダイゼーションの際に添加する。
条件２
標識プローブ及び競合プローブをプレハイブリダイゼーションの際に添加する。
条件３
プレハイブリダイゼーションの際は未添加、ハイブリダイゼーションの際に標識プローブを加える。
条件４
プレハイブリダイゼーションの際は未添加、ハイブリダイゼーションの際に標識プローブ及び競合プローブを加える。
条件５
プレハイブリダイゼーションの際に競合プローブを加え、ハイブリダイゼーションの際に標識プローブを加える。
【００２６】
ハイブリダイゼーションの後は、比較例に記載された方法に従い検出（OD 660nm) を行なった。得られた結果を下記表５に示す。
【００２７】
【表５】
【００２８】
表５において、プレハイブリダイゼーションの際に競合プローブのみが存在する場合（条件５）明らかにサルモネラの感度の低下が観察される。これに対してシトロバクターの方は変化がみられない。この結果から考えて、競合プローブをハイブリダイゼーションの前に加えると、その一部が標的となるＲＮＡ、ここではサルモネラのｒＲＮＡと結合するために感度が低下するものと考えられる。また、条件１と条件３で差が見られないことから、この実施例で用いたシステム（隣接ハイブリダイゼーション法）ではプレハイブリダイゼーションは必要がないことが推測される。本発明の方法ではまた、標識プローブと競合プローブを同時に添加することが好ましいと考えられる。
Andar Gunneberg らのＰＣＲ法で増幅したＤＮＡ断片を対象とした競合ハイブリダイゼーションでは、ハイブリダイゼーションの前に競合プローブを添加することでより優れた効果が得られたという報告があるが、本実施例においては上述のようにプレハイブリダイゼーションの際に競合プローブのみが存在すると最終的にサルモネラの感度の低下が観察されることから、Andar Gunneberg がＰＣＲ法で増幅したＤＮＡ断片を対象とした競合ハイブリダイゼーションとは若干異なった原理で標識プローブと競合プローブが検体中のＲＮＡにハイブリダイズしているものと考えられる。
【００２９】
実施例２
本発明の方法における標識プローブと競合プローブの使用量比と検出値の関係を調べるため、上記実施例１の条件４を用いて、ハイブリダイゼーションの際に加える競合プローブの量を変化させて、実施例１と同様にハイブリダイゼーション及び検出（OD 660nm) を行った。なお、標識プローブの量は実施例１に同じで一定である。結果を下記表６に示す。
【００３０】
【表６】
【００３１】
表６の結果から、ハイブリダイゼーションの際に加える競合プローブの量が多いほどシトロバクターの検出値が低下する一方、サルモネラの感度は１：４まではほとんど変化しないことがわかる。但し、競合プローブが標識プローブの１０倍になるとサルモネラの感度が明らかに低下することが示されるので、競合プローブの使用量は標識プローブの２〜４倍量程度が適当であると思われる。
【００３２】
実施例３
以下の成分を含む、５００検体分のキットを作成した。
【００３３】
【配列表】
【００３４】
【００３５】
【産業上の利用分野】
本発明は、ハイブリダイゼーション法により標的ＲＮＡを特異的に検出する方法及びそれに使用するＲＮＡ検出用キットに関する。詳しくはリボゾームＲＮＡの検出方法、それを利用した細菌の検出方法、それに用いる検出用キットに関する。
【０００２】
【従来技術】
周知のように、２本鎖ＤＮＡは２つの相補的なポリヌクレオチド鎖からなっており、加熱処理やアルカリ処理によって容易に変性しそれぞれの１本鎖に解離する。この反応は可逆的で、適当な条件下におくと、グアニンとシトシン、及びアデニンとチミン（ウリジン）の２組の塩基が水素結合することによって再結合し安定な２本鎖ＤＮＡ複合体（ハイブリッド）が生じる（ハイブリダイゼーション）。この反応はかなり特異的で、２本の鎖がお互いに相補的な場合に起こる。また、ＤＮＡに限らず、ＲＮＡの場合も同様である。
核酸がハイブリッドを形成するためには、その２本の核酸が完全に相補的である必要はなく、ある程度相補的でない部分があっても、ハイブリッドを生じる。但し、そのようなハイブリッドは、温度やイオン強度といった変化に対して不安定である。この性質を利用して、何らかの形で標識した外来性のポリヌクレオチド鎖（プローブ）を導入することによって塩基配列が類似した、即ち相違する部分が極くわずかである核酸を識別することができる。
上述のように原理的には、結合の条件を厳密に規定することによって、１あるいは２塩基のみが相違するような類似した核酸を、ハイブリダイゼーション法により識別して検出することは可能である。この場合、通常ハイブリダイズする塩基配列が１０〜５０塩基程度の短いプローブが用いられる。しかしながら、これを行うためには細心の注意と熟練を必要とし、汎用性に問題がある。
【０００３】
これを解決するため、Andar Gunneberg らはα1-アンチトリプシン欠損症を対象として、競合ハイブリダイゼーション法を用いた１塩基置換の容易な検出法を考案した(Clinical Chemistry, Vol. 39, No. 10, 1993年, p2157-2162) 。α1-アンチトリプシン欠損症は遺伝子中の１塩基が他の塩基に置換(Glu-342 GAG→ Lys AAG) したことによって起こる遺伝病である。彼らはこの１塩基変異を、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション法(PCR法) で増幅したＤＮＡ断片を用い検出している。例えば変異した遺伝子の配列をもつ21塩基のＤＮＡを標識プローブとして用いると、非常に厳密なハイブリダイゼーション条件を設定した場合には変異した遺伝子のみが検出される。ここで、正常な配列のＤＮＡをコンペティター(Competitor)としてハイブリダイゼーション反応の前に加えておくと、より緩い条件でも変異した遺伝子のみの検出が可能になることを記載している。
しかしながら、彼らが対象としているのはＰＣＲ法で増幅した純粋なＤＮＡ断片である。ＲＮＡの場合、水素結合力が強く、その融解温度(Tm)は、ＤＮＡよりもかなり高い。従って、被検対象がＲＮＡの場合、彼らの方法をそのまま使用するというわけにはいかないであろう。また、彼らは、ハイブリダイゼーションの前にコンペティターを添加することでより優れた効果が得られたとしているが、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーションの場合、同様の方法を用いると対象とする核酸検出の感度が低下する傾向が見られる（これについては後述の実施例で説明する）。更に、検出の対象となるＲＮＡは純粋とは限らず、一般には非常に不純物が多く、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片のような純粋な系とはまた違った結果が出てくる可能性が高い。
【０００４】
本発明者は先に隣接する２つの核酸プローブを用いたＲＮＡの検出法を開発した（隣接ハイブリダイゼーション法、特願平６−０６１４６７号）。この方法は２種の核酸プローブのうち一方を担体に固定、もう一方を何等かの方法で標識し、特異的に検体ＲＮＡと結合した標識核酸を検出する方法で、非常に特異性が高く、また操作性にも優れており実用性が高い。ただ、ＲＮＡによっては更に工夫が必要になる場合がある。例えば、限定されるものではないが、サルモネラ菌のように非常に近縁菌が多い場合では、上記隣接ハイブリダイゼーション法をそのまま１つのプローブセットで実施した場合、サルモネラ菌のみを検出する系を作るのはかなり困難であることが予想される。解決策としては、1.ハイブリダイゼーションの条件をより厳密に設定する；2.複数のプローブセットを用いて結果の組み合わせにより判定する、といったことが考えられる。1.については、相当に高い熟練度を必要とする一方、2.の方法をとると、手間とコストが増えてしまうという問題がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、非常に相同性の高い配列を持つＲＮＡ、すなわち相違塩基数が非常に少ないＲＮＡが共存する試料において、特異的に且つ簡便に特定のＲＮＡを他のＲＮＡと識別して検出する方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ハイブリダイゼーション法によるＲＮＡの検出方法において、標的ＲＮＡに対する標識プローブに加えて、該標的ＲＮＡと相同性の高いＲＮＡに結合する核酸プローブ（以下、競合プローブという）をハイブリダイゼーションの際に添加することによって、標識プローブと上記相同性の高いＲＮＡとの結合を防ぐことができ、よって、相同性の高いＲＮＡ中から標的ＲＮＡを特異的に高感度で検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
従って本発明は、標的ＲＮＡ及び該標的ＲＮＡと相同性の高いＲＮＡを含む検体において標的ＲＮＡを特異的に検出する方法であって、標的ＲＮＡ上にある該相同性の高いＲＮＡに対する非相同部位を含む塩基配列の逆相補鎖核酸を標識プローブ、該相同性の高いＲＮＡ上にある標的ＲＮＡに対する非相同部位を含む塩基配列の逆相補鎖核酸を競合プローブとして、ハイブリダイゼーションを行い、標的ＲＮＡに結合した標識プローブの標識物質を検出することにより標的ＲＮＡの存在を検出することを特徴とする方法に関する。
標識プローブ及び競合プローブとなる核酸はＤＮＡでもＲＮＡでもよく、１０塩基以上、好ましくは１５〜５０塩基が適当である。両者の配列には一般に、１塩基あるいは２塩基ほどの相違が存在することになる。
【０００７】
本発明の方法において、ハイブリダイゼーションは常法に従って実施することができる。ハイブリダイゼーションの実施において標識プローブと競合プローブを同時に添加することが好ましい。また、本発明者らが先に開発した隣接ハイブリダイゼーション法、即ち標的ＲＮＡに対して２種の核酸プローブを用いるＲＮＡの検出方法と、本発明の方法を組み合わせて実施することができる。この隣接ハイブリダイゼーション法とは具体的に、標的ＲＮＡの塩基配列のうち、特異的な１０塩基以上の部分配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと、標的ＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存在する１０塩基以上の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを用意し、一方を捕捉プローブとして担体に固定し、他方を標識物質で標識して標識プローブとし、標的ＲＮＡを含む試料及び標識プローブを該担体に固定された捕捉プローブと接触させて標的ＲＮＡに捕捉プローブと標識プローブをハイブリダイズさせ、標的ＲＮＡに結合した標識プローブの標識物質を検出することにより標的ＲＮＡの存在を検出するものである。
従って本発明は具体的には、サルモネラ菌由来の標的ＲＮＡ及び該標的ＲＮＡと相同性の高いＲＮＡを含む検体において標的ＲＮＡを特異的に検出する方法であって、標的ＲＮＡ上にある該相同性の高いＲＮＡに対する非相同部位を含む塩基配列の逆相補鎖核酸を標識プローブとし、標的ＲＮＡ上にある該相同性の高いＲＮＡに対する非相同部位を含む塩基配列の近傍に存在する部分配列の逆相補鎖核酸を捕捉プローブとし、及び該相同性の高いＲＮＡ上にある標的ＲＮＡに対する非相同部位を含む塩基配列の逆相補鎖核酸を競合プローブとして、上記標識プローブとして下記配列番号２のＤＮＡを用い、上記捕捉プローブとして下記配列番号１のＤＮＡを用い、及び上記競合プローブとして下記配列番号３のＤＮＡを用いてハイブリダイゼーションを行い、標的ＲＮＡに結合した標識プローブの標識物質を検出することにより標的ＲＮＡの存在を検出することを特徴とする方法である。
配列番号１ CTTCAGCTCC ATGAGTAAAT CA
配列番号２ CTTCACCTAC GTGTCAGC
配列番号３ CTTCACCTAC ATATCAGC
【０００８】
上記隣接ハイブリダイゼーション法において、部分配列（Ｂ）は部分配列（Ａ）の近傍に存在することが必要であって、部分配列（Ａ）の５’側、３’側のどちらに存在してもよい。配列（Ｂ）の３’末端と配列（Ａ）の５’末端が、あるいは配列（Ｂ）の５’末端と配列（Ａ）の３’末端が完全に隣接していることが好ましい。配列（Ｂ）の３’末端配列と配列（Ａ）の５’末端配列、または配列（Ｂ）の５’末端配列と配列（Ａ）の３’末端配列が重複していてもよいが、その場合、それらの逆相補鎖核酸プローブがハイブリダイズする際に、その重複部分で標的ＲＮＡに対して競合が起こり感度が低下する確率が高まる。従って、そのような重複部分はできるだけ短い方がよく、５塩基未満が好ましく、全く重複がないこと、すなわち完全に隣接していることがより好ましい。一方、配列（Ａ）と配列（Ｂ）は重複も隣接もせず、即ち離れていてもよいが、それらの逆相補鎖核酸プローブがハイブリダイズした結果、標的ＲＮＡ上の配列（Ａ）と配列（Ｂ）の間に１本鎖部分が生じ、この部分に切断が生じやすくなり、感度が低下する確率が高まる。従って、配列（Ａ）と配列（Ｂ）が離れて存在する場合、配列（Ｂ）の３’末端と配列（Ａ）の５’末端、あるいは配列（Ｂ）の５’末端と配列（Ａ）の３’末端の距離は、できるだけ短い方がよく、５塩基以内が好ましく、離れていないこと、すなわち完全に隣接していることが最も好ましい。使用する核酸プローブは１０塩基以上、好ましくは１５〜５０塩基のものが適当である。
【０００９】
本発明の方法における標的ＲＮＡとしては、例えばリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）が挙げられる。ｒＲＮＡをターゲットとして生物種の同定試験に本発明の方法を使用することができ、さらにｒＲＮＡとして、例えば細菌由来のものが挙げられる。
本発明の方法は、標的ＲＮＡがサルモネラ菌由来のｒＲＮＡである場合にとりわけ有利であって、サルモネラ菌を近縁菌から識別して特異的に検出することができる。サルモネラの近縁菌として代表的に挙げられるものはシトロバクターである。サルモネラ菌を近縁菌であるシトロバクターから識別して特異的に検出する方法において、下記配列番号１、配列番号２及び配列番号３のＤＮＡをそれぞれ、捕捉プローブ、標識プローブ及び競合プローブとして用いることができる。
配列番号１ CTTCAGCTCC ATGAGTAAAT CA
配列番号２ CTTCACCTAC GTGTCAGC
配列番号３ CTTCACCTAC ATATCAGC
本発明のこの方法において、一般的には競合プローブを標識プローブの２〜４倍量使用することが好ましい。
本発明はまた、上記のサルモネラ菌を近縁菌から識別して特異的に検出する方法に使用するための下記成分を含むＲＮＡ検出用キットを提供する。
（イ）上記配列番号１のＤＮＡを固定化した担体；
（ロ）標識物質で標識された上記配列番号２のＤＮＡ；
（ハ）上記配列番号３のＤＮＡ；
（ニ）標識物質を検出するための試薬；及び
（ホ）ハイブリダイゼーション溶液
【００１０】
標識プローブの調製法は特定されるものではなく、標識物質としては、例えばジゴキシゲニン、ビオチン、臭化デオキシウリジン、フルオロエスセイン等が挙げられる。
捕捉プローブは適当な担体に固定すればよく、担体としては、例えば核酸との結合性が高い有機ポリマーを素材とするマイクロタイタープレートなどを用いることができる。捕捉プローブの固定法は特に限定されるものでないが、例えば、上記のプレートに捕捉プローブＤＮＡ又はＲＮＡ溶液を入れ、乾燥後、紫外線照射などにより固定する方法や、あるいはグルタルアルデヒド法などの共有結合法を用いてもよい。
次に標的ＲＮＡを含む試料、標識プローブ、競合プローブを該担体に固定された捕捉プローブと接触させてハイブリダイゼーションを行う。次いで標的ＲＮＡと結合した標識プローブの標識物質を検出することにより標的ＲＮＡを検出する。
【００１１】
標的ＲＮＡを含む試料の調製法は、特定されるものではないが、安全かつ簡便におこなるためには、例えば水酸化ナトリウム水溶液などで細胞を溶解した後、塩酸などで中和すればよい。
調製されたＲＮＡ溶液を、標識プローブ、競合プローブとともに捕捉プローブを固定した担体上に加え、一般に１５〜６０℃で３分〜１８時間程度ハイブリダイゼーションを行う。適切な溶液（洗浄液１）で洗浄し、標識化合物と結合する物質に酵素を結合させたものを加え一定時間反応させる。標識化合物と結合する物質は特定されるものではないが、例えば標識プローブがビオチンで標識されている場合にはビオチン結合西洋ワサビペルオキシダーゼとアビジンの混合物、また、ジゴキシゲニン(Dig) で標識されている場合には抗Dig 免疫グロブリンと西洋ワサビペルオキシダーゼの結合体を用いることができる。
適切な溶液（洗浄液２）で洗浄後、適当な酵素基質を加える。酵素基質は特定されるものではないが、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼを用いた場合には、テトラメチルベンジジンと過酸化水素を基質とすることによって青色の反応産物を得ることができる。勿論、蛍光基質や発光基質などを用いることもできる。
洗浄液１、２は特定されるものではないが、例えば0.05% 程度の界面活性剤を含む生理食塩水などを用いることができる。
【００１２】
本発明の方法の原理は一般的に下記のとおりである。
例えばＡ、Ｂという２種類のＲＮＡが検体中に存在し、両者の塩基配列は１あるいは２塩基しか相違しない。これらを識別するために、標識プローブにＡの逆相補鎖を用いて通常の条件で隣接ハイブリダイゼーション法を行なうと、Ｂも（値は低いものの）検出されてしまうケースが生じる。これは前述したように、温度、塩濃度あるいはホルムアミドなどの変性剤の濃度を厳密に設定することによって回避できるが、コントロールが難しく、実施者によってはＢが検出されてしまう。ここで、競合プローブとしてＢの逆相補鎖の核酸（即ち、標識プローブとは１あるいは２塩基異なる）を加えてハイブリダイゼーションさせると、Ｂと標識プローブよりも、Ｂと競合プローブとの結合力の方が強く、比較的穏和な条件下でもＢと標識プローブの結合性がなくなる、もしくは非常に弱くなり、その結果、Ｂが検出されなくなるということが期待される。
以下、本発明の方法を競合ハイブリダイゼーションともいう。
【００１３】
【発明の効果】
本発明の方法を用い、相違塩基数が非常に少ない核酸を識別することができる。その応用範囲は多岐にわたるが、中でも診断の分野に於いて特に有効である。限定されるものではないが、ｒＲＮＡをターゲットとした生物種の同定試験に本方法を用いれば、従来法では識別が難しかった近縁の菌種でも容易に識別が可能となる。また、１塩基置換・欠失などの突然変異や遺伝子疾患などの検出も可能であろう。
以下、参考例、比較例及び実施例を挙げて本発明を詳しく説明する。なお、実施例ではサルモネラ菌と近縁菌の識別を示しているが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１４】
参考例
〔サルモネラとシトロバクター 23S rRNA 遺伝子塩基配列の決定〕
サルモネラ・ティフィムリウム ＬＴ−２(S. Typhimurium LT-2) 及びシトロバクター・フロインジー IMAI(C.freundii IMAI)の培養液からＤＮＡを抽出し、下記配列番号１及び配列番号２で示されるＤＮＡを用いてポリメラーゼ・チェーン・リアクション反応（ＰＣＲ）を行い、得られた約２８００塩基のＤＮＡ断片を定法に従い大腸菌プラスミドｐＵＣ１１８にクローニングした。これを用い各菌種の２３Ｓ rＲＮＡの塩基配列を部分的に決定し、サルモネラとシトロバクターの異なる領域をいくつか見いだした。本参考例では２ヶ所について検討した結果を示す。その異なる領域について、下記に、サルモネラ・ティフィムリウムとシトロバクター・フロインジーの２３Ｓ rＲＮＡ部分塩基配列（大腸菌 23S rRNA 遺伝子の第1681番目から第1770番目に相当）を比較したデータを示す。
配列番号１ CTTCAGCTCC ATGAGTAAAT CA
（大腸菌 23S rRNA 遺伝子の第1726番目から第1747番目に相当するサルモネラ・ティフィムリウムの23S rRNA部分塩基配列の逆相補鎖ＤＮＡ)
配列番号２ CTTCACCTAC GTGTCAGC
（大腸菌 23S rRNA 遺伝子の第1708番目から第1725番目に相当するサルモネラ・ティフィムリウムの23S rRNA部分塩基配列の逆相補鎖ＤＮＡ)
配列番号３ CTTCACCTAC ATATCAGC
（大腸菌 23S rRNA 遺伝子の第1708番目から第1725番目に相当するシトロバクター・フロインジー23S rRNAの部分塩基配列の逆相補鎖ＤＮＡ)
【００１６】
比較例
〔燐接ハイブリダイゼーション法を用いたサルモネラ菌の検出〕
上記に示される部分領域に於いてはサルモネラ・ティフィムリウムとシトロバクター・フロインジーは３塩基異なっている。但し、違い方に偏りがあり、２つは近接して (TGACACGTA → TGATATGTA) 、3'側のもう１つの異なる塩基は30塩基以上離れている。このようなケースでは、3'側の相違は識別する目的では通常使えないと考えられるので、２塩基異なる場所の周辺領域からプローブの候補をいくつか選択し隣接ハイブリダイゼーション法を実施した。以下、配列番号１のＤＮＡを捕捉プローブとして、及び配列番号２で表されるＤＮＡを標識プローブとして用いた代表的な試験例を示す。なお、両ＤＮＡを含め、試験に用いた合成ＤＮＡは全てＤＮＡ合成装置(PCR−MATE モデル391 、ABＩ社、以下同じ) を用いて合成した。
配列番号１のＤＮＡ（捕捉プローブ）を0.02μg/μl になるように50mM リン酸ナトリウムバッファー,pH8.0に溶かし、これをマイクロタイタープレート（住友ベークライト製、MS-3608FA)の各ウェルに50μl 加え、80℃で乾燥させる。紫外線を120mJ/cm2 照射した後、30mMクエン酸ナトリウム／300mM 塩化ナトリウム(2xSSC) 200 μl で３、４回洗浄し乾燥させた。
標識プローブは配列番号２のＤＮＡを下記表１の組成の反応液でジゴキシゲニン (Dig)標識したものを用いた。
【００１７】
【表１】
標識後、1/10容の0.2M EDTA 、1/10容の4M LiCl 、３μg のグリコーゲン及び2.5 倍容のエタノールを加え -80℃、一晩放置した。遠心分離により沈殿を集め、70% エタノールで洗浄し乾燥させた後、100 μl の10mM Tris 塩酸,pH8/1mMエチレンジアミンテトラ酢酸４ナトリウム塩 (TE) に溶かした。
得られた標識プローブの一定量を下記表２に示すハイブリダイゼーションバッファーと混合した（標識プローブ液) 。
【００１９】
【表２】
ハイブリダイゼーションバッファー
サルモネラ及びシトロバクターからの被検ｒＲＮＡは以下のようにして調製した。
平板培地上のサルモネラ（S. Typhimurium LT-2 及び S. Enteritidis L-58) 及びシトロバクター (C.freundii ATCC8090)のコロニーを10mlのLB培地（下記表３）で37℃、一晩培養する。培養液を0.1ml とりLBに植菌し37℃で４時間培養する。培養液を0.9ml とり、0.1ml の1.8M 水酸化ナトリウムを加え混合する。室温で10分放置し、0.1ml の1.8M塩酸-0.2M リン酸ナトリウム緩衝液,pH7を加え中和する。
【００２１】
【表３】
LB培地（１リットル中)
ハイブリダイゼーションと検出は以下のようにして行なった。
溶菌液50μl と標識プローブ液50μl を捕捉プローブが固定されたマイクロタイタープレートに入れ、37℃、２時間静置した。 0.05% Tween20 を含む生理食塩水（洗浄液）で３回洗浄した後、ブロッキング溶液 (１% ブロッキング試薬, 20mM Tris-HCl,pH7.5/0.15M NaCl）で10,000倍に希釈した抗Dig ヒツジ抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP、ベーリンガーマンハイム社製）を加え30分放置後、洗浄液で３回洗浄し、発色基質液（Ａ液：0.12% 3,3',5,5',- テトラメチルベンジジン/0.1M 酢酸ナトリウム,pH5/30%ジメチルホルムアミド、Ｂ液：0.03% 過酸化水素/0.2% リン酸、使用時にＡ液とＢ液を１：１で混合)100μl を加え5-15分放置した。得られた青色液の吸光度を660nm の波長で測定した。下記表４にその結果を示す。
【００２３】
【表４】
【００２４】
実施例１
〔競合ハイブリダイゼーション法を用いたサルモネラ菌とシトロバクターの識別〕
ここでは隣接ハイブリダイゼーション法を採用し、用いた捕捉プローブ及び標識プローブは比較例に同じである。競合プローブとしては下記配列番号３で示されるＤＮＡを用いた。
配列番号３ CTTCACCTAC ATATCAGC
ハイブリダイゼーションは以下のようにして行なった。比較例の方法に従って調製した溶菌液50μl と標識プローブを含まないハイブリダイゼーションバッファー50μl を、捕捉プローブを固定したプレートに分注する。ここで30分のプレハイブリダイゼーションと90分のハイブリダイゼーションを37℃で行なった。実験条件を下記に示す。なお、標識プローブ及び競合プローブはそれぞれ30ng/ml 、120ng/mlになるように TE に溶解し、うち１μl を各反応液に添加した。
【００２５】
条件１
標識プローブをプレハイブリダイゼーションの際に添加する。
条件２
標識プローブ及び競合プローブをプレハイブリダイゼーションの際に添加する。
条件３
プレハイブリダイゼーションの際は未添加、ハイブリダイゼーションの際に標識プローブを加える。
条件４
プレハイブリダイゼーションの際は未添加、ハイブリダイゼーションの際に標識プローブ及び競合プローブを加える。
条件５
プレハイブリダイゼーションの際に競合プローブを加え、ハイブリダイゼーションの際に標識プローブを加える。
【００２６】
ハイブリダイゼーションの後は、比較例に記載された方法に従い検出（OD 660nm) を行なった。得られた結果を下記表５に示す。
【００２７】
【表５】
表５において、プレハイブリダイゼーションの際に競合プローブのみが存在する場合（条件５）明らかにサルモネラの感度の低下が観察される。これに対してシトロバクターの方は変化がみられない。この結果から考えて、競合プローブをハイブリダイゼーションの前に加えると、その一部が標的となるＲＮＡ、ここではサルモネラのｒＲＮＡと結合するために感度が低下するものと考えられる。また、条件１と条件３で差が見られないことから、この実施例で用いたシステム（隣接ハイブリダイゼーション法）ではプレハイブリダイゼーションは必要がないことが推測される。本発明の方法ではまた、標識プローブと競合プローブを同時に添加することが好ましいと考えられる。
Andar Gunneberg らのＰＣＲ法で増幅したＤＮＡ断片を対象とした競合ハイブリダイゼーションでは、ハイブリダイゼーションの前に競合プローブを添加することでより優れた効果が得られたという報告があるが、本実施例においては上述のようにプレハイブリダイゼーションの際に競合プローブのみが存在すると最終的にサルモネラの感度の低下が観察されることから、Andar Gunneberg がＰＣＲ法で増幅したＤＮＡ断片を対象とした競合ハイブリダイゼーションとは若干異なった原理で標識プローブと競合プローブが検体中のＲＮＡにハイブリダイズしているものと考えられる。
【００２９】
実施例２
本発明の方法における標識プローブと競合プローブの使用量比と検出値の関係を調べるため、上記実施例１の条件４を用いて、ハイブリダイゼーションの際に加える競合プローブの量を変化させて、実施例１と同様にハイブリダイゼーション及び検出（OD 660nm) を行った。なお、標識プローブの量は実施例１に同じで一定である。結果を下記表６に示す。
【００３０】
【表６】
表６の結果から、ハイブリダイゼーションの際に加える競合プローブの量が多いほどシトロバクターの検出値が低下する一方、サルモネラの感度は１：４まではほとんど変化しないことがわかる。但し、競合プローブが標識プローブの１０倍になるとサルモネラの感度が明らかに低下することが示されるので、競合プローブの使用量は標識プローブの２〜４倍量程度が適当であると思われる。
【００３２】
実施例３
以下の成分を含む、５００検体分のキットを作成した。
【配列表】
Claims (4)
- サルモネラ菌由来の標的ＲＮＡ及び該標的ＲＮＡと相同性の高いＲＮＡを含む検体において標的ＲＮＡを特異的に検出する方法であって、標的ＲＮＡ上にある該相同性の高いＲＮＡに対する非相同部位を含む塩基配列の逆相補鎖核酸を標識プローブとし、標的ＲＮＡ上にある該相同性の高いＲＮＡに対する非相同部位を含む塩基配列の近傍に存在する部分配列の逆相補鎖核酸を捕捉プローブとし、及び該相同性の高いＲＮＡ上にある標的ＲＮＡに対する非相同部位を含む塩基配列の逆相補鎖核酸を競合プローブとして、上記標識プローブとして下記配列番号２のＤＮＡを用い、上記捕捉プローブとして下記配列番号１のＤＮＡを用い、及び上記競合プローブとして下記配列番号３のＤＮＡを用いてハイブリダイゼーションを行い、標的ＲＮＡに結合した標識プローブの標識物質を検出することにより標的ＲＮＡの存在を検出することを特徴とする方法。
配列番号１ CTTCAGCTCC ATGAGTAAAT CA
配列番号２ CTTCACCTAC GTGTCAGC
配列番号３ CTTCACCTAC ATATCAGC - 標的ＲＮＡがリボゾームＲＮＡである請求項１に記載の方法。
- 競合プローブを標識プローブの２〜４倍量使用する請求項１又は２記載の方法。
- 下記の成分を含む請求項１または２に記載の方法に使用するためのＲＮＡ検出用キット。
（イ）下記配列番号１のＤＮＡを固定化した担体；
（ロ）標識物質で標識された下記配列番号２のＤＮＡ；
（ハ）下記配列番号３のＤＮＡ；
（ニ）標識物質を検出するための試薬；及び
（ホ）ハイブリダイゼーション溶液
配列番号１ CTTCAGCTCC ATGAGTAAAT CA
配列番号２ CTTCACCTAC GTGTCAGC
配列番号３ CTTCACCTAC ATATCAGC
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| JP25565394A JP3640988B2 (ja) | 1994-10-20 | 1994-10-20 | 標的ｒｎａを特異的に検出する方法及びｒｎａ検出用キット |
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