JPH10262675A - オリゴヌクレオチド及び核酸の塩基配列解析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ハイブリダイゼーション法による核酸の塩基
配列解析の精度を高めた塩基配列解析法及びそれに用い
るオリゴヌクレオチドを提供する。 【解決手段】 特異的領域と、この特異的領域の両末端
の少なくとも一方に連結する１または２の非特異的領域
とを有するオリゴヌクレオチドであって、特異的領域
は、前記オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせよう
とする試料核酸中の標的配列に対して実質的に相補的な
特定の塩基配列を有し、非特異的領域は、少なくとも一
つのヌクレオチドからなり、非特異的領域の各ヌクレオ
チドはヒポキサンチン、５−ニトロインドールまたは３
−ニトロピロールを塩基として有し、各非特異的領域に
おけるヌクレオチドの少なくとも一つが５−ニトロイン
ドールまたは３−ニトロピロールを塩基として有する、
オリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーション用プロ
ーブとして用いる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、オリゴヌクレオチ
ド及び核酸の塩基配列解析法に関し、詳しくは、核酸の
塩基配列決定、感染症や遺伝病の診断、ゲノムマッピン
グ等の核酸の塩基配列解析に使用することができるハイ
ブリダイゼーション用プローブに好適に利用できる新規
な構造を有するオリゴヌクレオチド、及びそれを用いた
塩基配列解析法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ハイブリダイゼーションによる核酸の塩
基配列解析は、例えば塩基配列決定、感染症や遺伝病の
診断、ゲノムマッピング等において広く行われている。
また、ＳＢＨ（sequencing by hybridization）［Ｒ．
Ｄｒｍａｎａｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６
０，１６４９（１９９３）］、すなわちハイブリッド形
成による塩基配列決定法は、高速かつ低コストな方法と
して実用化が期待されている。

【０００３】これらの塩基配列解析においては、ハイブ
リダイゼーション（ハイブリッド形成）によって生じた
プローブと標的配列とのハイブリッドの中で、ミスマッ
チが存在するものと、ミスマッチがなく完全に相補的な
ものとを区別する技術が必要である。

【０００４】ハイブリダイゼーション反応は、反応溶液
のイオン強度、プローブ及びサンプルＤＮＡの塩基構
成、反応温度・時間等多くの要因によって支配される複
雑な反応であるが、短鎖長のオリゴヌクレオチドをプロ
ーブとする場合には、ミスマッチを有するハイブリッド
は完全に相補的なハイブリッドと比較して不安定なこと
から、これらの諸条件を適当に設定することによって、
完全に相補的なハイブリッドのみが検出できるような系
を構築することが理論的に可能であると考えられてい
る。

【０００５】しかしながら、従来、高感度のハイブリダ
イゼーションを得るためにＤＮＡの塩基を化学修飾する
手法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，９０，１１４６０（１９９３）］やミスマッチの判
別能を高めるためのハイブリダイゼーション条件として
ハイブリダイゼーション後の洗浄を低温で長時間行う方
法［ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９，
５２７（１９９０）］が提案されているが、十分な結果
が得られていない。

【０００６】特に、プローブの末端付近にミスマッチが
存在する場合のハイブリダイゼーションと、ミスマッチ
を含まないハイブリダイゼーションとを正確かつ高感度
に区別することは困難であり、これが塩基配列解析の実
用化の障壁となっている。

【０００７】この問題に関して、特開平８−７０９００
号公報では、一つの解決策が提案されている。すなわ
ち、特開平８−７０９００号公報には、特異的領域と、
この特異的領域の両末端の少なくとも一方に連結する１
又は２の非特異的領域とを有するオリゴヌクレオチドで
あって、特異的領域は、前記オリゴヌクレオチドをハイ
ブリダイズさせようとする試料核酸中の標的配列に対し
て実質的に相補的な特定の塩基配列を有し、非特異的領
域は、通常の核酸を構成する塩基のそれぞれと塩基対を
形成することができる他の塩基を有する少なくとも一つ
のヌクレオチド又はそのオリゴマーからなるオリゴヌク
レオチドをハイブリダイゼーション用プローブとして用
いることにより、高感度のハイブリダイゼーション結果
が得られるとともに、末端にミスマッチを有するハイブ
リッドを完全に相補的なハイブリッドと明確に区別し得
る塩基配列解析方法を提供することが開示されている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】ハイブリダイゼーショ
ン法による核酸の塩基配列解析の精度は一般に高ければ
高いほどよい。従って、本発明の目的は、この精度を一
層高めるために、高感度のハイブリダイゼーション結果
が得られるとともに、末端にミスマッチを有するハイブ
リッドを完全に相補的なハイブリッドと一層明確に区別
し得るオリゴヌクレオチド及び塩基配列解析法を提供す
ることにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、核酸の標的配列に
ハイブリダイズするべく特定の塩基配列を有する領域の
末端に、５−ニトロインドールまたは３−ニトロピロー
ルを塩基として含むヌクレオチドからなる領域が結合さ
れたオリゴヌクレオチドを用いれば、高感度のハイブリ
ダイゼーション結果が得られるとともに塩基対のミスマ
ッチが高感度で検出可能なことを見いだし、本発明を完
成するに至った。

【００１０】すなわち本発明は、特異的領域と、この特
異的領域の両末端の少なくとも一方に連結する１または
２の非特異的領域とを有するオリゴヌクレオチドであっ
て、特異的領域は、前記オリゴヌクレオチドをハイブリ
ダイズさせようとする試料核酸中の標的配列に対して実
質的に相補的な特定の塩基配列を有し、非特異的領域
は、少なくとも一つのヌクレオチドからなり、非特異的
領域の各ヌクレオチドはヒポキサンチン、５−ニトロイ
ンドールまたは３−ニトロピロールを塩基として有し、
各非特異的領域におけるヌクレオチドの少なくとも一つ
が５−ニトロインドールまたは３−ニトロピロールを塩
基として有する、オリゴヌクレオチドである。

【００１１】また本発明の方法は、上記オリゴヌクレオ
チドを試料核酸にハイブリダイズさせるステップと、そ
のハイブリダイゼーション強度またはハイブリダイゼー
ションの有無により、前記試料核酸中における前記オリ
ゴヌクレオチド中の特異的領域の塩基配列と相補的な配
列を有する標的配列の有無を判定するステップとを含
む、核酸の塩基配列解析法である。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下、本発明についてさらに詳細
に説明する。本明細書においていくつかの術語を用いる
が、ここで用いるときそれらの術語は次の意味を有す
る。

【００１３】「試料核酸」とは、塩基配列の解析を目的
として本発明のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさ
せる核酸を意味し、ＤＮＡであってもＲＮＡであっても
よい。「特異的領域」とは、ハイブリダイズしうる試料
核酸中の標的配列と塩基配列の相補性を有し、各塩基が
この標的配列と対合を形成しうる領域を意味する。

【００１４】本発明のオリゴヌクレオチドは、特異的領
域と、この特異的領域の両末端の少なくとも一方に連結
する１または２の非特異的領域とを有する。本発明のオ
リゴヌクレオチドは、オリゴデオキシリボヌクレオチド
であってもよく、またオリゴリボヌクレオチドであって
もよい。

【００１５】特異的領域は、試料核酸中の標的配列に対
して実質的に相補的な特定の塩基配列を有する。「実質
的に相補的」とは、標的配列に対して完全に相補的であ
る場合の他、少なくとも１塩基のミスマッチを存在する
場合を含むことを意味する。特異的領域の長さは、ハイ
ブリダイゼーションにおいてプローブとして機能しうる
長さであれば特に制限されるものでないが、通常６〜５
０、好ましくは６〜２０塩基程度の長さが適当である。
ハイブリダイゼーション領域ＤＮＡの塩基配列もまた特
に制限されるものでなく、塩基配列の解析対称となるサ
ンプルＤＮＡの塩基配列に応じてその配列を適宜決定す
ることができる。

【００１６】非特異的領域は、少なくとも一つのヌクレ
オチドからなる。その各ヌクレオチドはヒポキサンチ
ン、５−ニトロインドールまたは３−ニトロピロールを
塩基として有する。非特異的領域（特異的領域の両側に
ある場合には各非特異的領域）におけるヌクレオチドの
少なくとも一つは５−ニトロインドールまたは３−ニト
ロピロールを塩基として有する。

【００１７】５−ニトロインドールおよび３−ニトロピ
ロールは、通常の核酸を構成する塩基のいずれとも同等
に結合するユニバーサル塩基として知られている（Nucl
eicAcids Research, 1994, Vol.22, No.20, p.4039-404
3およびNucleic Acids Research, 1995, Vol.23, No.1
3, p.2361-2366）。ここで「通常の核酸を構成する塩
基」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡを構成するヌクレオチドに
含まれる塩基、すなわちＤＮＡにあってはアデニン
（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン
（Ｔ）の４種類の塩基を、ＲＮＡにあってはＡ、Ｇ、Ｃ
及びウラシル（Ｕ）を意味する。

【００１８】非特異的領域は、該非特異的領域内におけ
る特異的領域側に、すなわち、特異的領域に隣接する部
分に、ヒポキサンチンを塩基として有するヌクレオチド
を１つ以上含むことが好ましい。

【００１９】非特異的領域の長さは、少なくとも１、好
ましくは２〜２０、より好ましくは２〜８塩基とするこ
とができる。非特異的領域が特異的領域に連結する位置
もまた特に制限がなく、特異的領域の５’末端、３’末
端のいずれでもよい。さらに特異的領域の５’末端及び
３’末端の両方に非特異的領域が連結されていてもよ
い。これらの中では後者が好ましい。

【００２０】特異的領域の長さと非特異的領域の長さと
の比は、特異的領域の長さやＧＣ含量によっても異なる
が、通常、特異的領域の長さが非特異的領域の長さと等
しいか又はそれ以上であることが好ましい。

【００２１】本発明のオリゴヌクレオチドの合成法につ
いては特に限定されるものではなく、例えば、β−シア
ノエチルホスホアミダイト法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓＲｅｓ．１２ ４５３９（１９８４）］、リン酸ト
リエステル法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８１ ５９５６（１９８４）］、ホスホン
酸エステル法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
１４ ５３９９（１９８６）が挙げられる。特異的領域
と非特異的領域との連結は、それぞれ別個に合成した後
に行ってもよく、特異的領域を合成した後に非特異的領
域を１ヌクレオチドずつ順次付加することにより行って
もよい。また、特異的領域と非特異的領域を同時に合成
してもよい。

【００２２】本発明のオリゴヌクレオチドは、ハイブリ
ダイゼーション用のプローブとして利用する場合には、
不溶性担体に固定化された形態で使用してもよい。不溶
性担体としては、ニトロセルロース、またはナイロンか
らなるフィルター、ガラス板、多孔質ガラス、シリカゲ
ル、ラテックスなどが挙げられる。これらの不溶性担体
に本発明のオリゴヌクレオチドを固定化する方法は、特
に限定されるものではなく、例えば、アミノ修飾したオ
リゴヌクレオチドを用いる場合には、表面に高密度のカ
ルボキシル基を有するナイロンフィルター上にカルボキ
シル基を水溶性カルボジイミドによって活性化し、アミ
ド結合させる手法［Ｊ．Ｏｒｇ．２６２５２５（１９６
１）］や、ビオチン修飾したオリゴヌクレオチドの場合
にはアビジンを表面にコーティングした担体にビオチン
ーアビジン反応で結合させる方法［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ １１ ２２９１（１９７２）］、アミノ修飾し
たオリゴヌクレオチドをトレシル基を導入したシリカゲ
ルに固定化する方法［Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ９２０
３（１９８１）］が挙げられる。また、フィルター上で
固定化されたオリゴヌクレオチドを作製する方法とし
て、フォトリソグラフィーを応用した手法によって固相
上で多種類のＤＮＡを同時に合成する方法［Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，２５１７６７（１９９１）］やシールされたガラ
ス板上にＤＮＡ合成試薬を接触させることによる合成法
［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２ １３６
８（１９９４）］等も使用することができる。

【００２３】上記で詳述した本発明のオリゴヌクレオチ
ドは、核酸の塩基配列解析に利用することができる。す
なわち本発明の核酸の塩基配列解析法は、上記オリゴヌ
クレオチドを試料核酸にハイブリダイズさせるステップ
と、そのハイブリダイゼーション強度またはハイブリダ
イゼーションの有無により、前記試料核酸中における前
記オリゴヌクレオチド中の特異的領域の塩基配列と相補
的な配列を有する標的配列の有無を判定するステップと
を含む。本発明の方法により、ハイブリダイゼーション
感度を上昇させることが可能となるとともに、完全に相
補的なハイブリッドとミスマッチを有するハイブリッ
ド、特に従来法で区別が困難であった末端ミスマッチが
区別し易くなり、それによってハイブリダイゼーション
法によるＤＮＡ塩基配列解析が容易になる。

【００２４】次に、本発明のオリゴヌクレオチドを用い
たハイブリダイゼーションにおいて、ミスマッチが存在
する場合のハイブリダイゼーションと、ミスマッチを含
まないハイブリダイゼーションとを如何にして正確かつ
高感度に区別することができるかを説明する。図１は、
通常のオリゴヌクレオチドとこのオリゴヌクレオチドに
ほぼ相補的であるがミスマッチを含む試料核酸とのハイ
ブリッドを示す模式図である。一般的に、ミスマッチが
ハイブリッドの中央部に存在する場合にはハイブリダイ
ゼーションに重大な障害となるが、ハイブリッドの末端
付近にある場合には、中央部に存在する場合に比べて障
害は小さい。

【００２５】上記オリゴヌクレオチドと同一の配列の特
異的領域を有する本発明のオリゴヌクレオチドと上記試
料核酸とのハイブリッドを模式的に図２に示す。図２に
おいてＮは５−ニトロインドールおよび／または３−ニ
トロピロールを含むユニバーサル塩基を表す。この図に
示されるように、ユニバーサル塩基はいずれのヌクレオ
チドの塩基とも塩基対を形成することができるので、非
特異的領域の分だけハイブリッドの長さは延長される。
すなわち、通常のオリゴヌクレオチドではハイブリッド
の末端に存在していたミスマッチは、本発明のオリゴヌ
クレオチドではハイブリッドの中央部に位置することと
なる。また、ハイブリダイゼーション強度も高くなる。
したがって、ミスマッチを含まないハイブリダイゼーシ
ョンとミスマッチを含むハイブリダイゼーションを区別
することが容易になる。非特異的領域が特異的領域の
５’末端に連結されていれば、特異的領域の５’末端側
のミスマッチを検出しやすくなり、非特異的領域が特異
的領域の３’末端に連結されていれば、特異的領域の
３’末端側のミスマッチを検出しやすくなる。さらに、
非特異的領域が特異的領域の５’末端及び３’末端の両
方に連結されていれば、特異的領域の５’末端側及び
３’末端側のミスマッチの両方を検出することが容易と
なる。５−ニトロインドールおよび／または３−ニトロ
ピロールは上記の効果を特に顕著に奏するものである。

【００２６】本発明のオリゴヌクレオチドを用いたハイ
ブリダイゼーションの条件は、特に限定されるものでは
なく、試料核酸の種類や配列、及びオリゴヌクレオチド
の配列によって至適な条件は変化し得る。例えば、比較
的短鎖のオリゴヌクレオチドを用いた場合は、ハイブリ
ダイゼーション温度を低温にするなど条件を緩く設定す
ることが望ましい。また、ＤＮＡ塩基配列中にＧＣ残基
が多い場合は、ＡＴ残基が多い場合に比してハイブリッ
ドの安定性は強まるが、この現象を相殺するためにテト
ラメチルアンモニウムクロライド等のテトラアルキルア
ンモニウム塩を用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２，１５８５（１９８５）］
が効果的である。またハイブリダイゼーション溶液中に
界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（Sodium
Dodecylsulfate）、Ｎ-ラウロイルサルコシン酸ナトリ
ウム（Sodium N-Lauroylsarcosinate）等を添加する方
法もハイブリダイゼーション感度の向上に効果的である
（例えば、特開平８−７０９００実施例Ｃ参照）。

【００２７】核酸の塩基配列の解析をハイブリダイゼー
ションによって行う場合、試料核酸または本発明のオリ
ゴヌクレオチドのいずれかが標識されていることが好ま
しい。標識化の方法は特に限定されるものではなく、例
えば、ラジオアイソトープや蛍光色素を用いる手法等を
挙げることができる。ハイブリダイゼーションの結果
は、各種標識法に即した方法によって測定することがで
きる。

【００２８】本発明の塩基配列解析の応用例としては、
ハイブリダイゼーション法を用いたＤＮＡ塩基配列の決
定［Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１３ １３７８（１９９２）］
や感染症及び遺伝的疾患の診等、巨大ゲノムＤＮＡのマ
ッピング等に応用可能である。感染症の診断法として
は、例えば、被験者の血液等よりＤＮＡを抽出し、その
ＤＮＡに対して各種病原体固有の配列から本発明の方法
によりＤＮＡプローブを作製し、ハイブリダイゼーショ
ン反応を行い、病原体の存在を検出する方法が挙げられ
る。遺伝的疾患の診断法としては、遺伝病の原因遺伝子
に特異的な配列をもとに本発明の方法によりオリゴヌク
レオチドを作製し、被験者より得た染色体ＤＮＡとのハ
イブリダイゼーションを行い、その遺伝子中の変異の有
無を検出する。巨大ゲノムＤＮＡのマッピングはゲノム
ＤＮＡ解析プロジェクト等には必須の技術であるが、ゲ
ノムバンクに対して本発明の方法で作製した多数のＤＮ
Ａプローブとハイブリダイゼーションを行うことで各ク
ローンのゲノム上での配置が決定できる［第１６回日本
分子生物学会年会 講演要旨集 １３３４（１９９
３）］。

【００２９】ＤＮＡ塩基配列の決定は、従来、ＤＮＡを
化学的に分解する方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４ ５６０（１９７７）］やＤ
ＮＡ合成酵素による方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４５４６３（１９７７）］が用
いられているが、ハイブリダイゼーション法を用いたＤ
ＮＡ塩基配列の解析法（ＳＢＨ；Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｂｙ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）は、近年注目さ
れている手法である［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０１６４９
（１９９３）］。ＳＢＨ法は、適当なハイブリダイゼー
ション条件を設定することで、目的の長鎖ＤＮＡに対し
て、それと完全に相補的なオリゴＤＮＡプローブのみを
選択的にハイブリダイズさせ、特異的にハイブリダイズ
したオリゴＤＮＡプローブのデータを集積し解析するこ
とで、目的の長鎖ＤＮＡの塩基配列を決定する技術であ
る。

【００３０】

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明するが、これらの実施例により本発明は何等限
定されるものではない。

【００３１】

【実施例Ａ】５−ニトロインドールまたは３−ニトロピ
ロールのヌクレオシドを含むＤＮＡプローブを用いたミ
スマッチの判別 （Ａ）オリゴヌクレオチドの合成 パーセプティブ・バイオシステムズ（Perseptive Biosy
stems）社製のＤＮＡ合成機（装置名 Expedite 8909）
を用いて、表１に示す配列を有する本発明のオリゴヌク
レオチド、比較対象用オリゴヌクレオチド、及び試料Ｄ
ＮＡを合成した。固定化用オリゴヌクレオチドの5'末端
は、5'-アミノ修飾C6（グレンリサーチ社製）で修飾し
た。尚、以下のオリゴヌクレオチドNo.は配列表の配列
番号に相当する。

【００３２】

【表１】 表１ ──────────────────────────────────── オリコ゛ヌクレオチト゛ No. ヌクレオチド配列 備 考 ──────────────────────────────────── (1)（対照例１） 5'-XTAACTCGC-3' 比較例１，２用 (2)（比較例１） 5'-XCAACTCGC-3' 実施例１用 (3)（比較例２） 5'-XTAACCCGC-3' 実施例２用 (4)（対照例２） 5'-XIIIITAACTCGCIIII-3' 比較例３，４用 (5)（比較例３） 5'-XIIIICAACTCGCIIII-3' 実施例１用 (6)（比較例４） 5'-XIIIITAACCCGCIIII-3' 実施例２用 (7)（対照例３） 5'-XNiNiNiNiTAACTCGCNiNiNiNi-3' 実施例１，２用 (8)（実施例１） 5'-XNiNiNiNiCAACTCGCNiNiNiNi-3' (9)（実施例２） 5'-XNiNiNiNiTAACCCGCNiNiNiNi-3' (10)（対照例４） 5'-XNpNpNpNpTAACTCGCNpNpNpNp-3' 実施例３，４用 (11)（実施例３） 5'-XNpNpNpNpCAACTCGCNpNpNpNp-3' (12)（実施例４） 5'-XNpNpNpNpTAACCCGCNpNpNpNp-3' (13)（試料DNA１） 5'-CCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCC-3' ──────────────────────────────────── 上記配列中、Xは5'-アミノ修飾C6、Iはデオキシイノシ
ン、Niは5-ニトロインドールのデオキシリボヌクレオシ
ド、Npは3-ニトロピロールのデオキシリボヌクレオシド
を示す。

【００３３】上記オリゴヌクレオチド及び試料ＤＮＡの
合成は標準のプロトコール通りに行い、５’末端の保護
基であるトリチル基は除かないサイクルにて合成を終了
した。上記（１３）の試料ＤＮＡをPoros Oligo R3（Pe
rSeptive Biosystems社製）を用いて精製を行った。上
記（１）〜（１３）のオリゴヌクレオチド及び試料ＤＮ
Ａを濃縮乾固した後、（１）〜（１２）については０．
５Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．４）に、（１
３）についてはＴＥ緩衝液に懸濁し、２６０ｎｍの吸光
度測定により定量し、１ｎｍｏｌ／μｌに調整した。

【００３４】（Ｂ）オリゴヌクレオチドの固定化 オリゴヌクレオチドの固定化は、表面に高密度の陰イオ
ン性カルボキシル基を有するナイロン膜にアミノ修飾オ
リゴヌクレオチドのアミノ基をアミド結合させることに
より、以下の通り行った。

【００３５】バイオダインＣ（商標；ポール社製）膜を
０．１Ｎ ＨＣｌによりすすぎ、酸性化した後、２０％
ＥＤＣ（1-エチル-3-ジメチルアミノプロピルカルボジ
イミド塩酸塩）に室温１５〜３０分間浸した。脱イオン
水及び０．５Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．４）
で軽くすすいだ後、ドットブロット装置（Ｂｉｏ−Ｒａ
ｄ社製）にセットした。０．５Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ８．４）に懸濁されたアミノ修飾オリゴヌクレ
オチドを１５分間室温で膜と反応させた。ＴＢＳ（Ｔｒ
ｉｓ−緩衝食塩水）／０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０によ
りすすいだ膜を、０．１Ｎ ＮａＯＨにて１０分間処理
し、脱イオン水で軽くすすいだ後風乾した。

【００３６】（Ｃ）試料ＤＮＡの標識化 試料ＤＮＡの標識化は［γ−³²Ｐ］ＡＴＰによって、
５’末端を放射性ラベルした。反応は、ＤＮＡ５’末端
標識キット（ＭＥＧＡＬＡＢＥＬ^TM；宝酒造社製）によ
り行った。

【００３７】（Ｄ）ハイブリダイゼーション反応 前記のオリゴヌクレオチド固定化フィルターと、放射性
標識した試料ＤＮＡとを、５× ＳＳＣ（７５０ｍＭ塩
化ナトリウム・７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）／７％
Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム緩衝液中に
て、１０℃ ２時間ハイブリダイゼーションさせた。ハ
イブリダイゼーション反応後、２×ＳＳＣ／０．１％
ＳＤＳ緩衝液にて、１０℃、５分間の洗浄を３回行っ
た。風乾した後、オートラジオグラフィーにて、各ドッ
トの放射線量を測定し、ハイブリダイゼーション強度を
算出した。

【００３８】その結果を表２に示す。結果は対照とした
対照例１のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーショ
ン強度を１とする相対値で示した。

【００３９】

【表２】 表２ ──────────────────────────────────── オリコ゛ヌクレオチト゛ No. ヌクレオチド配列 ハイフ゛リタ゛イセ゛ーション強度 ──────────────────────────────────── (1) （対照例１） 5'-XTAACTCGC-3' １ (2) （比較例１） 5'-XCAACTCGC-3' １．２６ (3) （比較例２） 5'-XTAACCCGC-3' ０．９５ (4) （対照例２） 5'-XIIIITAACTCGCIIII-3' １９．７ (5) （比較例３） 5'-XIIIICAACTCGCIIII-3' １．１４ (6) （比較例４） 5'-XIIIITAACCCGCIIII-3' ０．０２ (7) （対照例３） 5'-XNiNiNiNiTAACTCGCNiNiNiNi-3' １３．１ (8) （実施例１） 5'-XNiNiNiNiCAACTCGCNiNiNiNi-3' ０．２１ (9) （実施例２） 5'-XNiNiNiNiTAACCCGCNiNiNiNi-3' ０．０９ (10)（対照例４） 5'-XNpNpNpNpTAACTCGCNpNpNpNp-3' １．９５ (11)（実施例３） 5'-XNpNpNpNpCAACTCGCNpNpNpNp-3' ０．０２ (12)（実施例４） 5'-XNpNpNpNpTAACCCGCNpNpNpNp-3' ０．０２ ──────────────────────────────────── Xは5'-アミノ修飾C6、Iはデオキシイノシン、Niは5-ニ
トロインドールのデオキシリボヌクレオシド、Npは3-ニ
トロピロールのデオキシリボヌクレオシドを示す。

【００４０】（Ｅ）ミスマッチ判別能の計算 ハイブリダイゼーション反応によって得られた結果よ
り、ミスマッチ判別能を算出した。ミスマッチ判別能と
は、下記のＤ値(Discrimination value)を指標とする概
念であり、ミスマッチの区別し易さをさす。

【００４１】

【数１】

【００４２】試料ＤＮＡと完全に相補的な配列のハイブ
リダイゼーション量とは、対照例の配列のハイブリダイ
ゼーション量を指し、ミスマッチを有する配列のハイブ
リダイゼーション量とは、その対照例に対応する比較例
あるいは実施例の配列のハイブリダイゼーション量を指
す。Ｄ値は、対照例の配列に対する比較例あるいは実施
例の配列のハイブリダイゼーション量の比である。即
ち、対照例の配列のＤ値は１であり、比較例及び実施例
に関してはＤ値が高ければその配列が対照例の配列と区
別し易い（ハイブリダイゼーション量が対照例に対して
小さい）ことを表す。

【００４３】表３に各配列のＤ値を示す。３’，５’両
末端にイノシンを導入したオリゴヌクレオチドに比較し
て、5-ニトロインドールまたは3-ニトロピロールのヌク
レオシドを導入したオリゴヌクレオチドの方がＤ値が顕
著に高い。従って、ミスマッチの判別能は、5-ニトロイ
ンドールまたは3-ニトロピロールのヌクレオシドを導入
したオリゴヌクレオチド、特に３’，５’両末端に5-ニ
トロインドールまたは3-ニトロピロールのヌクレオシド
を導入したオリゴヌクレオチドが優れていると判断され
る。

【００４４】

【表３】 表３ ミスマッチ判別能（Ｄ値） ──────────────────────────────────── オリコ゛ヌクレオチト゛ No. ヌクレオチド配列 Ｄ 値 ──────────────────────────────────── (2)（比較例１） 5'-XCAACTCGC-3' ０．７９ (3)（比較例２） 5'-XTAACCCGC-3' １７．２ (5)（比較例３） 5'-XIIIICAACTCGCIIII-3' １７．２ (6)（比較例４） 5'-XIIIITAACCCGCIIII-3' ４５ (8)（実施例１） 5'-XNiNiNiNiCAACTCGCNiNiNiNi-3' ６３ (9)（実施例２） 5'-XNiNiNiNiTAACCCGCNiNiNiNi-3' １３９ (11)（実施例３） 5'-XNpNpNpNpCAACTCGCNpNpNpNp-3' ９８ (12)（実施例４） 5'-XNpNpNpNpTAACCCGCNpNpNpNp-3' ９８ ──────────────────────────────────── Xは5'-アミノ修飾C6、Iはデオキシイノシン、Niは5-ニ
トロインドールのデオキシリボヌクレオシド、Npは3-ニ
トロピロールのデオキシリボヌクレオシドを示す。

【００４５】

【実施例Ｂ】イノシン及び５−ニトロインドールまたは
３−ニトロピロールのヌクレオシドを含むＤＮＡプロー
ブを用いたミスマッチの判別 （Ａ）オリゴヌクレオチドの合成 実施例Ａと同様にして、表４に示す配列を有する本発明
のオリゴヌクレオチド、比較対象用オリゴヌクレオチ
ド、及び試料ＤＮＡを合成した。尚、以下のオリゴヌク
レオチドNo.は配列表の配列番号に相当する。

【００４６】

【表４】 表４ ──────────────────────────────────── オリコ゛ヌクレオチト゛ No. ヌクレオチド配列 備 考 ──────────────────────────────────── (14)（対照例５） 5'-XIIIITAACTCGCCIIII-3' 比較例５用 (15)（比較例５） 5'-XIIIICAACTCGCCIIII-3' 実施例５〜10用 (16)（対照例６） 5'-XNiNiNiNiTAACTCGCCNiNiNiNi-3' 実施例５用 (17)（実施例５） 5'-XNiNiNiNiCAACTCGCCNiNiNiNi-3' (18)（対照例７） 5'-XNpNpNpNpTAACTCGCCNpNpNpNp-3' 実施例６用 (19)（実施例６） 5'-XNpNpNpNpCAACTCGCCNpNpNpNp-3' (20)（対照例８） 5'-XIINiNiTAACTCGCCNiNiII-3' 実施例７用 (21)（実施例７） 5'-XIINiNiCAACTCGCCNiNiII-3' (22)（対照例９） 5'-XNiNiIITAACTCGCCIINiNi-3' 実施例８用 (23)（実施例８） 5'-XNiNiIICAACTCGCCIINiNi-3' (24)（対照例10） 5'-XIINpNpTAACTCGCCNpNpII-3' 実施例９用 (25)（実施例９） 5'-XIINpNpCAACTCGCCNpNpII-3' (26)（対照例11） 5'-XNpNpIITAACTCGCCIINpNp-3' 実施例10用 (27)（実施例10） 5'-XNpNpIICAACTCGCCIINpNp-3' (13)（試料DNA１） 5'-CCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCC-3' ──────────────────────────────────── 上記配列中、Xは5'-アミノ修飾C6、Iはデオキシイノシ
ン、Niは5-ニトロインドールのデオキシリボヌクレオシ
ド、Npは3-ニトロピロールのデオキシリボヌクレオシド
を示す。

【００４７】上記オリゴヌクレオチド及び試料ＤＮＡの
合成は、実施例Ａに従った。

【００４８】（Ｂ）オリゴヌクレオチドの固定化 オリゴヌクレオチドの固定化は、実施例Ａに従った。

【００４９】（Ｃ）試料ＤＮＡの標識化 試料ＤＮＡの標識化は、実施例Ａに従った。

【００５０】（Ｄ）ハイブリダイゼーション反応 前記のオリゴヌクレオチド固定化フィルターと、放射性
標識した試料ＤＮＡとを、３Ｍ ＴＭＡＣ（塩化テトラ
メチルアンモニウム）／７％ Ｎ−ラウロイルサルコシ
ン酸ナトリウム／５０ｍＭ トリス塩酸塩 ｐＨ８．０
／２ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液中にて、３５℃で２時間プレ
ハイブリダイゼーションさせた後、３５℃で一晩ハイブ
リダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーション反応
後、５×ＳＳＰＥ（０．６Ｍ ＮａＣｌ、４ｍＭ リン
酸ナトリウム、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）／
７％ Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム緩衝液に
て、３５℃、５分間の洗浄を行った後、３Ｍ ＴＭＡＣ
（塩化テトラメチルアンモニウム）／７％ Ｎ−ラウロ
イルサルコシン酸ナトリウム／５０ｍＭ トリス塩酸塩
ｐＨ８．０／２ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液にて、３５℃、
１時間洗浄を行った。風乾した後、オートラジオグラフ
ィーにて、各ドットの放射線量を測定し、ハイブリダイ
ゼーション強度を算出した。

【００５１】その結果を表５に示す。結果は対照とした
対照例１のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーショ
ン強度を１とする相対値で示した。

【００５２】

【表５】 表５ ───────────────────────────────── オリコ゛ヌクレオチト゛ No. ヌクレオチド配列 ハイフ゛リタ゛イセ゛ーション強度 ───────────────────────────────── (14)（対照例５） 5'-XIIIITAACTCGCCIIII-3' １ (15)（比較例５） 5'-XIIIICAACTCGCCIIII-3' ０．０８０ (16)（対照例６） 5'-XNiNiNiNiTAACTCGCCNiNiNiNi-3' ０．０２３ (17)（実施例５） 5'-XNiNiNiNiCAACTCGCCNiNiNiNi-3' ０．００１ (18)（対照例７） 5'-XNpNpNpNpTAACTCGCCNpNpNpNp-3' ０．０２０ (19)（実施例６） 5'-XNpNpNpNpCAACTCGCCNpNpNpNp-3' ０．００１ (20)（対照例８） 5'-XIINiNiTAACTCGCCNiNiII-3' ０．４１９ (21)（実施例７） 5'-XIINiNiCAACTCGCCNiNiII-3' ０．０２６ (22)（対照例９） 5'-XNiNiIITAACTCGCCIINiNi-3' １．８４４ (23)（実施例８） 5'-XNiNiIICAACTCGCCIINiNi-3' ０．０２４ (24)（対照例10） 5'-XIINpNpTAACTCGCCNpNpII-3' ０．０３０ (25)（実施例９） 5'-XIINpNpCAACTCGCCNpNpII-3' ０．００１ (26)（対照例11） 5'-XNpNpIITAACTCGCCIINpNp-3' ０．５８０ (27)（実施例10） 5'-XNpNpIICAACTCGCCIINpNp-3' ０．００２ ───────────────────────────────── Xは5'-アミノ修飾C6、Iはデオキシイノシン、Niは5-ニ
トロインドールのデオキシリボヌクレオシド、Npは3-ニ
トロピロールのデオキシリボヌクレオシドを示す。

【００５３】（Ｅ）ミスマッチ判別能の計算 ハイブリダイゼーション反応によって得られた結果よ
り、ミスマッチ判別能を算出した。

【００５４】ミスマッチ判別能とは、実施例Ａの（Ｅ）
で説明したように、Ｄ値を指標とする概念であり、ミス
マッチの区別し易さをさす。表６に各配列のＤ値を示
す。３’，５’両末端に、5-ニトロインドールのヌクリ
オシド、3-ニトロピロールのヌクレオシド、または、こ
れらとイノシンの混合物を導入したオリゴヌクレオチド
の方が、イノシンのみを導入したオリゴヌクレオチドと
比較して顕著にＤ値が高く、特に、3-ニトロピロールの
ヌクレオシドとイノシンとの混合塩基からなる非特異的
領域を導入したオリゴヌクレオチドがＤ値が高く、ミス
マッチ判別能に優れていることが判明した。さらには、
イノシンを特異的領域側（内側）に、5-ニトロインドー
ルまたは3-ニトロピロールのヌクレオシドを外側（５’
および３’末端側）に配置したミスマッチの判別能は高
く、特に優れていることが判明した。

【００５５】

【表６】 表６ ミスマッチ判別能（Ｄ値） ──────────────────────────────────── オリコ゛ヌクレオチト゛ No. ヌクレオチド配列 Ｄ 値 ──────────────────────────────────── (15)（比較例５） 5'-XIIIICAACTCGCCIIII-3' １２．５ (18)（実施例５） 5'-XNiNiNiNiCAACTCGCCNiNiNiNi-3' ２３．０ (11)（実施例６） 5'-XNpNpNpNpCAACTCGCCNpNpNpNp-3' ２０．０ (14)（実施例７） 5'-XIINiNiCAACTCGCCNiNiII-3' １７．３ (17)（実施例８） 5'-XNiNiIICAACTCGCCIINiNi-3' ７６．８ (11)（実施例９） 5'-XIINpNpCAACTCGCCNpNpII-3' ３０．０ (11)（実施例10） 5'-XNpNpIICAACTCGCCIINpNp-3' ２９０ ──────────────────────────────────── Xは5'-アミノ修飾C6、Iはデオキシイノシン、Niは5-ニ
トロインドールのデオキシリボヌクレオシド、Npは3-ニ
トロピロールのデオキシリボヌクレオシドを示す。

【００５６】

【発明の効果】本発明によれば、ハイブリダイゼーショ
ン感度を上昇させることが可能となるとともに、完全に
相補的なハイブリッドとミスマッチを有するハイブリッ
ド、特にハイブリッドの末端部でのミスマッチが区別し
易くなり、それによってハイブリダイゼーション法によ
るＤＮＡ塩基配列解析が容易になる。

【００５７】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：8 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列 TAACTCGC 8

【００５８】配列番号：2 配列の長さ：8 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列 CAACTCGC 8

【００５９】配列番号：3 配列の長さ：8 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列 TAACCCGC 8

【００６０】配列番号：4 配列の長さ：16 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎはヒポキサンチンのヌクレオシドを表
す。 配列 NNNNTAACTC GCNNNN 16

【００６１】配列番号：5 配列の長さ：16 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎはヒポキサンチンのヌクレオシドを表
す。 配列 NNNNCAACTC GCNNNN 16

【００６２】配列番号：6 配列の長さ：16 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎはヒポキサンチンのヌクレオシドを表
す。 配列 NNNNTAACCC GCNNNN 16

【００６３】配列番号：7 配列の長さ：16 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎは５−ニトロインドールのヌクレオシ
ドを表す。 配列 NNNNTAACTC GCNNNN 16

【００６４】配列番号：8 配列の長さ：16 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎは５−ニトロインドールのヌクレオシ
ドを表す。 配列 NNNNCAACTC GCNNNN 16

【００６５】配列番号：9 配列の長さ：16 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎは５−ニトロインドールのヌクレオシ
ドを表す。 配列 NNNNTAACCC GCNNNN 16

【００６６】配列番号：10 配列の長さ：16 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎは３−ニトロピロールのヌクレオシド
を表す。 配列 NNNNTAACTC GCNNNN 16

【００６７】配列番号：11 配列の長さ：16 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎは３−ニトロピロールのヌクレオシド
を表す。 配列 NNNNCAACTC GCNNNN 16

【００６８】配列番号：12 配列の長さ：16 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎは３−ニトロピロールのヌクレオシド
を表す。 配列 NNNNTAACCC GCNNNN 16

【００６９】配列番号：13 配列の長さ：28 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列 CCAACGATCA AGGCGAGTTA CATGATCC 28

【００７０】配列番号：14 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎはヒポキサンチンのヌクレオシドを表
す。 配列 NNNNTAACTC GCCNNNN 17

【００７１】配列番号：15 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎはヒポキサンチンのヌクレオシドを表
す。 配列 NNNNCAACTC GCCNNNN 17

【００７２】配列番号：16 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎは５−ニトロインドールのヌクレオシ
ドを表す。 配列 NNNNTAACTC GCCNNNN 17

【００７３】配列番号：17 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎは５−ニトロインドールのヌクレオシ
ドを表す。 配列 NNNNCAACTC GCCNNNN 17

【００７４】配列番号：18 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎは３−ニトロピロールのヌクレオシド
を表す。 配列 NNNNTAACTC GCCNNNN 17

【００７５】配列番号：19 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎは３−ニトロピロールのヌクレオシド
を表す。 配列 NNNNCAACTC GCCNNNN 17

【００７６】配列番号：20 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：塩基番号１、２、１６及び１７のＮはヒ
ポキサンチンのヌクレオシド、塩基番号３、４、１４及
び１５のＮは５−ニトロインドールのヌクレオチドを表
す。 配列 NNNNTAACTC GCCNNNN 17

【００７７】配列番号：21 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：塩基番号１、２、１６及び１７のＮはヒ
ポキサンチンのヌクレオシド、塩基番号３、４、１４及
び１５のＮは５−ニトロインドールのヌクレオチドを表
す。 配列 NNNNCAACTC GCCNNNN 17

【００７８】配列番号：22 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：塩基番号１、２、１６及び１７のＮは５
−ニトロインドールのヌクレオシド、塩基番号３、４、
１４及び１５のＮはヒポキサンチンのヌクレオチドを表
す。 配列 NNNNTAACTC GCCNNNN 17

【００７９】配列番号：23 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：塩基番号１、２、１６及び１７のＮは５
−ニトロインドールのヌクレオシド、塩基番号３、４、
１４及び１５のＮはヒポキサンチンのヌクレオチドを表
す。 配列 NNNNCAACTC GCCNNNN 17

【００８０】配列番号：24 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：塩基番号１、２、１６及び１７のＮはヒ
ポキサンチンのヌクレオシド、塩基番号３、４、１４及
び１５のＮは３−ニトロピロールのヌクレオシドを表
す。 配列 NNNNTAACTC GCCNNNN 17

【００８１】配列番号：25 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：塩基番号１、２、１６及び１７のＮはヒ
ポキサンチンのヌクレオシド、塩基番号３、４、１４及
び１５のＮは３−ニトロピロールのヌクレオシドを表
す。 配列 NNNNCAACTC GCCNNNN 17

【００８２】配列番号：26 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：塩基番号１、２、１６及び１７のＮは３
−ニトロピロールのヌクレオシド、塩基番号３、４、１
４及び１５のＮはヒポキサンチンのヌクレオシドを表
す。 配列 NNNNTAACTC GCCNNNN 17

【００８３】配列番号：27 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：塩基番号１、２、１６及び１７のＮは３
−ニトロピロールのヌクレオシド、塩基番号３、４、１
４及び１５のＮはヒポキサンチンのヌクレオシドを表
す。 配列 NNNNCAACTC GCCNNNN 17

【図面の簡単な説明】

【図１】 通常のオリゴヌクレオチドと核酸とのハイブ
リッドを示す模式図。

【図２】 本発明のオリゴヌクレオチドと核酸とのハイ
ブリッドを示す模式図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央八丁目３番１号三 菱化学株式会社筑波研究所内

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 特異的領域と、この特異的領域の両末端
   の少なくとも一方に連結する１または２の非特異的領域
   とを有するオリゴヌクレオチドであって、特異的領域
   は、前記オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせよう
   とする試料核酸中の標的配列に対して実質的に相補的な
   特定の塩基配列を有し、非特異的領域は、少なくとも一
   つのヌクレオチドからなり、非特異的領域の各ヌクレオ
   チドはヒポキサンチン、５−ニトロインドールまたは３
   −ニトロピロールを塩基として有し、各非特異的領域に
   おけるヌクレオチドの少なくとも一つが５−ニトロイン
   ドールまたは３−ニトロピロールを塩基として有する、
   オリゴヌクレオチド。
2. 【請求項２】 前記非特異的領域が、特異的領域の５’
   末端及び／又は３’末端に連結している請求項１記載の
   オリゴヌクレオチド。
3. 【請求項３】 前記非特異的領域が、該非特異的領域内
   における特異的領域側に、ヒポキサンチンを塩基として
   有するヌクレオチドを１つ以上含む、請求項１または２
   記載のオリゴヌクレオチド。
4. 【請求項４】 特異的領域の長さが６〜５０塩基であ
   り、非特異的領域の長さが２〜２０塩基である請求項１
   〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
5. 【請求項５】 特異的領域の長さが非特異的領域の長さ
   と等しいか又はそれ以上である請求項１〜４のいずれか
   一項に記載のオリゴヌクレオチド。
6. 【請求項６】 不溶性担体に固定化された請求項１〜５
   のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
7. 【請求項７】 ５’末端側の領域で不溶性担体に固定化
   された請求項６記載のオリゴヌクレオチド。
8. 【請求項８】 請求項１〜７のいずれか一項に記載のオ
   リゴヌクレオチドを試料核酸にハイブリダイズさせるス
   テップと、そのハイブリダイゼーション強度またはハイ
   ブリダイゼーションの有無により、前記試料核酸中にお
   ける前記オリゴヌクレオチド中の特異的領域の塩基配列
   と相補的な配列を有する標的配列の有無を判定するステ
   ップとを含む、核酸の塩基配列解析法。