JP2001518787A

JP2001518787A - 核酸ハイブリッド形成検知システムおよびその調製法と応用

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Publication number: JP2001518787A
Application number: JP54246798A
Authority: JP
Inventors: ロベールテウール; シルヴィソベゴ; エルヴェバザン
Original assignee: シスバイオインターナショナル
Priority date: 1997-04-09
Filing date: 1998-04-09
Publication date: 2001-10-16
Also published as: US6210932B1; FR2762013B1; FR2762013A1; WO1998045475A1; EP0973947A1

Abstract

(57)【要約】この発明は、一本鎖ポリヌクレオチドからなる付着ドメインＡ；少なくとも１つの停止シントンからなる中間ドメインＢ；および二本鎖ポリヌクレオチドからなり検出手段を構成する標識されたヌクレオチドを少なくとも１つ組み込む視覚化ドメインＣとからなるプローブを使用する核酸検出に関する。このプローブの使用は核酸ターゲット配列でハイブリッドしたシグナルを増幅させる。

Description

【発明の詳細な説明】核酸ハイブリッド形成検知システムおよびその調製法と応用この発明は、特に診断に用いることができる、ハイブリッド形成による核酸の検知手段に関する。試料中のRNAあるいはDNA配列（ターゲット配列）を同定する技術は、ターゲット配列に標識プローブをハイブリッドさせて、ハイブリッドされなかったプローブを除去してから形成された二重らせんを検知することを含む。これらの技術は、特にウィルス性の疾患あるいは感染症の診断、医学あるいは遺伝学の研究、クローンの同定、転写遺伝子の分析等に普通用いられる。２つの種類のプローブ、即ち、いわゆる長いプローブ（一般に100塩基より大きい）と大きさが10から30塩基の長さの短いプローブが用いられる。医療診断に普通用いられるプローブは、標識に直接付着するかあるいはリガンドに結合することによって標識に結合された合成オリゴヌクレオチドである。この後者の場合、検知は、このリガンドに固定された標識によって行われる。放射性あるいは非放射性の標識を用いることができる。数多くの標識技術が、例えば、SAMBROOKら［Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989 )］によって記載されている。放射性標識の場合、これらの方法には、例えば、酵素ポリヌクレオチドキナーゼを用いて合成オリゴヌクレオチド５’をγ³²P-AT Pで標識付けること、または、ニックトランスラーションによる標識付けと同時に放射性dCTPあるいはdATPを組み込むことがある。特に、合成オリゴヌクレオチドに化学的に組む込むことができる非放射性標識の例としてビオチンをあげることができる（PCT出願第WO 89/12462号）。UTPのビオチニル化された類似物もまた、ニックトランスレーションによって二本鎖の DNAに組み込むことができる。一般に、ビオチンは、蛍光性分子、酵素あるいは他の検知可能な化合物を付着するための支持体としてそれ自体用いられるアビジンに結合することによって検知される。他の非放射性標識システムでは、ハプテン（ジニトロフェニル基、ジゴキシゲニン）がビオチンの代わりになり、特異的な標識抗体がシステム中で指標として用いられる。分子ハイブリッド形成アッセイの感度は、分子生物学における診断試験を適用する際に制限となることがよくある重要な要因である。アッセイの感度は、ハイブリッドされたプローブを視覚化するために用いられる標識付けに直接依存する。アッセイの感度を上げる方法の１つは、いわゆる「多重標識（polylabelled）」プローブを得るためにプローブに組み込まれる標識の数を増やすことによってシグナルを増幅することである。この目標を考慮して、例えば、ビオチニル化されたヌクレオチドのようなヌクレオチド類似物を3'末端に追加することによって一本鎖DNA鎖を延ばすことができる酵素ターミナルトランスフェラーゼを用いることが提案された。この方法の主な欠点は、酵素が一本鎖DNA鎖の末端に追加するヌクレオチドの数が一定していないことである。この結果、長さの様々な生成物が混合して生じ、そのため標識付けが再現困難になり、標準化するのが難しく従って医療診断には適さない異型のプローブが生成される。 COLLINS（EP出願第204 510号）は、ホモポリマー（ポリA）の尾部をプローブに追加することによってプローブを延ばすために酵素ターミナルトランスフェラーゼを用いる変更を提案している。このとき、標識は、検知可能な分子が組み込まれたホモポリマー（ポリT）からなる。しかしながら、この方法は、酵素の作用をコントロールできないことから生じる欠点を完全には排除しない。また、SEGEVの名義のEP出願第292 128号および第450 594号にそれぞれ記載されているように、分枝されるか、あるいは、末端にハイブリッドするポリヌクレオチド「ブリッジ」によって互いに結合された多重標識オリゴヌクレオチドプローブを用いてシグナルを増幅することが提案された。米国特許第4,882,269号は、第１のプローブのいくつかの部位に多重標識第２プローブがハイブリッドするシステムを記載している。 EP出願第0 317 077号およびPCT出願第WO 92/02526号もまた、第２プローブが櫛形の多重標識ポリヌクレオチド構成物からなるシステムを記載している。これらのシステムには、数多くの異なるオリゴヌクレオチドを合成し、最終構成物を形成するためにハイブリッド形成および／または結紮（ligate）工程を実行する必要がある欠点がある。また、均一の性質を持つ最終生成物を得るのは難しく、それら生成物を精製するのは厄介なことである。特に、いくつかの異なるターゲット配列を検知する必要がある場合、これらの配列の各々について、新しいプローブを合成するか、または、一方で検知すべきターゲット配列とハイブリッドし、他方でプローブにハイブリッドするオリゴヌクレオチドであるアダプターを用いるかする必要がある。この発明の目的は、上記の欠点がなく、特にいくつかの核酸配列を同時に検知するときに簡単に獲得、精製、使用される、ハイブリッド形成シグナルを増幅するシステムを提案することである。この目標を考慮して、発明者らは、特定の構造の核酸分子を検知標識プローブとして用いる考えを持った。この分子は、以前には、固体の支持体に付着させ、例えばプローブを使用する標準的な方法によって検知することを意図した、ターゲット配列の増幅生成物として用いられただけであった。このような核酸分子は、NEWTONら[Nucleic Acid Res.,21,pp.1155-1162,(1993 )]およびIMPERIAL CHEMICAL INDUSTRIES PLC.名義のEP出願第416 817号に記載されている。それらは、二本鎖ドメイン（ターゲット配列のコピーである）の形で存在し、そのドメインは、分子の固体支持体への付着を可能にするか、尾部に相補的な標識プローブを用いて分子の視覚化を可能にする一本鎖尾部を少なくともその末端の１つに備える。二本鎖ドメインは、停止シントンからなる領域によって一本鎖尾部から分離されている。これらの核酸分子は、ターゲット配列にハイブリッドできるヌクレオチド配列とポリヌクレオチド尾部とからなるプライマーを用いるターゲット配列のポリメラーゼ連鎖増幅（PCR増幅）によって得られ、ヌクレオチド配列とポリヌクレオチド尾部は停止シントンによって分離されている。「シントン」とは、合成ポリヌクレオチドに組み込むことができる分子（ヌクレオチド類似体あるいは他の分子）である。「停止シントン」とは、ポリヌクレオチドのコピーあるいは伸長反応中にポリメラーゼが鋳型鎖上のシントンに遭遇したとき、ポリメラーゼを停止させる特性をさらに有するシントンである。停止シントンを含むプライマーがポリメラーゼ連鎖増幅反応においてターゲット配列を増幅させるのに用いられたとき、停止シントンを越えて位置するポリヌクレオチド尾部はコピーされず、したがって、最終増幅生成物は、一本鎖の尾部を備えたターゲット配列の二本鎖コピーの形態で存在する。この発明は、上記のように、次の構造：一本鎖領域／停止シントン／二本鎖領域を有する核酸分子の、ターゲット配列を検知するプローブとしての使用に関する。より正確には、この発明は、ターゲット配列を− 一本鎖ポリヌクレオチドからなる付着ドメインＡと； − 少なくとも１つの停止シントンからなる中間ドメインＢと； − 少なくとも１つの標識ヌクレオチドが組み込まれる二本鎖ポリヌクレオチドからなり、検知手段を構成する視覚化ドメインＣと；からなる核酸分子からなる少なくとも１つの検知プローブと、前記核酸プローブのＡドメインがターゲット配列とハイブリッドするのを可能にする条件下で接触させ、形成されたハイブリッドが前記核酸プローブのＣドメインによって検知されることを特徴とする、少なくとも１つのターゲット核酸配列を検知する方法に関する。この発明による方法の実行に用いることができる検知プローブの概略を図１に示す。有利には、検知プローブの付着ドメインＡの大きさは、長さが８から40ヌクレオチド、好ましくは15から25ヌクレオチドの間にある。Ｂドメインは、１つ以上の同一のあるいは異なる停止シントンからなっていてもよい。停止シントンとして用いることができるシントンは、例えば、アルカンジオール類や、あるいは、例えばWILKら[Nucleic Acids Res.,18,pp.2065-2068, (1990)]、KUBAREVAら[Nucleic Acids Res.,20,pp4533-4538,(1992)]、あるいは上記したようにNEWTONらの刊行物およびEP出願第416 817号によって記載されたもの等の他のいかなる化合物から選択される。Ｃドメインに組み込まれる検知手段は、検知プローブの視覚化を可能にする増幅シグナルを構成する。一般的には、この発明の文脈の中で用いることができる検知手段は、それ自体公知で核酸プローブが視覚化できる標識付けのために従来用いられた標識である。検知手段は、特に、ポリメラーゼによってオリゴヌクレオチド鎖に組み込むことができ、例えば放射性標識付けや蛍光分子による標識付けの場合のように直接的に、あるいは、例えば標識分子（アビジンや抗体のように）の付着によって明らかになるリガンド（ビオチンやヘプタン等）の場合のように間接的に検知されるように標識付けできるヌクレオチドあるいはヌクレオチド類似物である。検知手段はまた、引き続き視覚化シグナルを発する分子を生成するために変更を加えることを意図された標識前駆体の形態でポリヌクレオチド鎖中に導入することができる。有利には、検知プローブの二本鎖のＣドメインを構成するモノマーの少なくとも１／50、好ましくは少なくとも1／10、非常に好ましくは少なくとも1／5が上に定義したような標識ヌクレオチドあるいはヌクレオチド類似物である。これらの標識モノマーは、Ｃドメインの鎖の片方だけに組み込まれてもよいが、より実質的な標識付けとより強いシグナルを得るために、二本鎖の各々に標識モノマーを組み込むほうが一般に好ましいだろう。検知プローブによって生じるシグナルのレベルは、二本鎖Ｃドメインの大きさにも依存する。有利には、この大きさは、0.1から50kb、好ましくは１から10kb の間にある。一方、二本鎖Ｃドメインの配列は、このポリヌクレオチドに組み込まれた標識ヌクレオチドの結果として検知プローブの視覚化を可能にするのがこのポリペプチドの唯一の機能である限り、本質的に重要ではない。この発明による方法を実行するために、検知プローブのＡドメインは、ターゲット配列に直接ハイブリッドできる；この場合、Ａドメインは、その配列が検知すべきターゲット配列に対し相補的であるように選択される。所望であれば、アダプターの使用もできる。しかしながら、大抵の場合、いくつかのターゲット配列を検知することが望ましくても、これは必要ないであろう。その理由は、下記から分かるように、Ａドメインの配列が互いに異なる検知プローブを同時に準備するのが大変簡単であるからである。従って、この発明の方法は、いくつかのターゲット配列を同時に検知するのに特に適している。上記で指摘したように、Ａドメインの配列が互いに異なるいくつかの検知プローブを同時に用いることが可能である；適当な場合、これらのプローブは、Ｂドメインの性質（即ち、停止シントンの数および／または性質）においても互いに異なってもよい。さらに、Ｃドメインの配列および／または、有利には、このドメインに組み込まれるヌクレオチドの標識性においても互いに異なってもよい。これによって、例えば、各ターゲット配列に特定の視覚化シグナルを割り当てることが可能になる。検知対象のターゲット配列は、固体支持体に付着されてもよい。有利には、この固体支持体は多数の電極からなる。例えば、マトリックスに配置されている極小電極であって、電極のうち少なくとも２つはそれぞれ異なるターゲット配列を持つ。ターゲット配列は、例えば、PCT出願第WO/94/22889号に記載の方法を用いてこれらの電極に付着される。この発明によってターゲット配列を検知するために用いることができる検知プローブは、酵素合成によって、少なくとも１つのヌクレオチドかあるいは１つの標識ヌクレオチド類似物を含む適切な反応混合物の中で、少なくとも１つの停止シントンを含む少なくとも１つのプライマーを伸長するポリメラーゼを用いて簡単に得ることができる。この発明はまた、この発明によって検知ターゲット配列を検知するために用いることができる検知プローブと、その調製方法にも関する。この発明による検知プローブの調製方法は、5'から3'に：上記に定義したようなＡドメインとＢドメイン、および、重合を開始するために鋳型鎖とハイブリッド可能な配列からなるＸドメインとからなるプライマーP'を、ポリメラーゼを用いて鋳型鎖の存在下適切な反応混合物の中で伸長することによってＣドメインの鎖の少なくとも１つが合成される少なくとも１つのステップからなり、反応混合物のヌクレオチドトリフォスフェートの少なくとも１つの全部あるいは一部がその標識誘導体の１つによって置き換えられることを特徴とする。プライマーP'の構造の概略を図２に示す。これらの条件下、ポリメラーゼは、標識ヌクレオチド誘導体を対応するヌクレオチドの全体あるいは一部に代えて、新しく合成したプライマー伸長生成物に組み込む。この方法で、Ｃドメインを実質的な程度まで標識付けすることができる。例えば、フラグメントの大きさが10kb（もしこのフラグメントが二本鎖であれば、20 ,000ヌクレオチドである）である理論的な場合において、もしチミジントリフォスフェートの３分の１が標識類似物によって置き換えられ、増幅すべき配列において４つの塩基が同じ割合で存在していると仮定すれば、800以上の標識モノマーが組み込まれた／挿入されたフラグメントが得られる。この発明の方法による１つの好ましい実施態様によれば、ポリメラーゼ伸長は、P'プライマーの伸長生成物とハイブリッド可能な配列を含む第２のプライマー P"の存在下で起こる。プライマーP"は、プライマーP'の伸長生成物中に存在する停止シントンにポリメラーゼが遭遇するまで伸長される；プライマーP"の伸長生成物は、P'プライマーのＸドメインにハイブリッドでき、次の伸長ステップの鋳型として用いることができる。反応は連続させることができ、これらのステップは、所望の量のこの発明による検知プローブが得られるまで、ポリメラーゼ連鎖増幅方法の従来手法に従って繰り返すことができる。この目的のために、この発明による方法は、公知のポリメラーゼ連鎖増幅（PC R）方法の通常の条件で行うことが可能である。例えば、上記のように、NEWTON らの刊行物あるいはEP出願第416 817号に記載のものと同じ種類のポリメラーゼ連鎖増幅方法を用いることが可能である。これらの方法によって得られた核酸分子と全体構造（一本鎖領域／停止シントン／二本鎖領域）において類似であるが、この発明の検知プローブは、増幅から生じる二本鎖部分に標識オリゴヌクレオチドが存在することがこれらの分子と異なる。この発明による検知プローブを得るために、二本鎖Ｃドメインを得るのに用いられる鋳型は、これらのプローブを用いて検知しようとするターゲット配列から特に完全に独立しているという事実から、下記の「中性の配列」と名づけられるいかなる配列のものであってもよい。反応収率を上げるために、特に、ポリメラーゼ連鎖増幅反応が実行されているとき、Ａ塩基およびＴ塩基に富む配列を選択するのが好ましい。その理由は、この種類の配列がＧやＣに富む配列より効率的に増幅するからである。プライマーP'の5'Aドメインは、中性の配列の伸長に干渉しないものを選ぶべきである；特に、この配列と安定的にハイブリッドするべきではない（これは、配列相同性を分析するソフトウェアを用いて事前に簡単に調べることができる）。このドメインは、同じP'プライマーのＸドメインあるいはP"プライマーのいずれの領域ともいかなる配列相補性をも呈してはならない。それぞれの鋳型上のP"プライマーおよびP'プライマーのＸ部分の位置は、Ｃドメインの大きさを決定する。この大きさは、非常に大きいことも有り得る。従って、当業者に公知の様々な技術によって、長さ数十キロベースの伸長フラグメントを簡単によい収率で得ることが可能である［BARNES,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,pp.2216-2220(1994);CHENGら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91,pp.5695-5699(199 4)］。 P"プライマーは、少なくとも、重合を開始するために前記鋳型鎖とハイブリッド可能な配列からなる；しかしながら、上記に定義したようなＡドメインとＢドメインをさらに含むことができ、従って、P'プライマーと同じ構造を持つことができる。この場合、P'およびP"プライマーのＡおよびＢドメインは、同一であってもよいし、異なっていてもよい。この発明による検知プローブの調製方法を実行する状況の中に、Ｃドメインと初期の鋳型として用いられる「中性の配列」との間の相同性の程度が重要でない限りDNAポリメラーゼの忠実度に関る問題は起こらない。重要なのは、Ｃドメインの長さとそこに取り込むことができる標識の数だけである。この発明による検知プローブの調整方法の好ましい実施態様によれば、中性の配列とハイブリッドするＸドメインの配列に関して互いに同一で、Ａドメインの配列と適切な場合はＢドメインの性質において互いに異なる一連のP'プライマーが同一の反応混合物において用いられる。これによって、いくつかの異なるターゲット配列を検知するための複数のプローブを同時に調整することが可能になる。Ｃドメインのレベルにおいても互いに異なるプローブを同時に調製することが望まれるならば、反応混合物は、いくつかの「中性の配列」とその配列それぞれに適切なP'プライマーシリーズとP"プライマーシリーズを含むことができる。この発明はまた、少なくとも１つの上記で定義したようなP'プライマーと、前記プライマーを伸長するための鋳型として用いることができるポリヌクレオチドと、標識ヌクレオチドトリフォスフェートからなることを特徴とする、この発明による検知プローブを調製するためのキットに関する。有利には、前記キットは、P"プライマーをさらに含む。それ自体公知の数多くの精製方法が、この発明による検知プローブを得るために用いられる酵素反応の最後にこの発明による検知プローブを精製するために用いることができる。これらの方法は、組み込まれなかったプライマーとヌクレオチドトリフォスフェートおよび残存する酵素を除去する。必要とされるフラグメントは高収率で回収される。これらの方法は、酵素反応の生成物に直接、あるいは、電気泳動ゲル上の移動に次いで単離された後の生成物に適用することができる。得られた増幅生成物の質は、アガロースゲル電気泳動によって簡単に調べることができる。選択された増幅条件が良ければ、たった１つのバンドがゲル上に見られる。精製された生成物の量は、UV分光測定法あるいは組み込まれた標識を分析することによって測定できる。この発明の方法の使用によって、簡単にかつ再生可能に、均一な性質を有し、従来の方法を用いる秤量、精製が簡単で、非常に高い比活性を有する標識検知プローブを生じる。その活性は、ニックトランスレーションで通常得られる標識プローブより高い。さらに、この発明による検知プローブは、次の利点を有する： − 非常に迅速で、オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成動態とほほ同じハイブリッド形成動態を有する；オリゴヌクレオチドの場合同様、この動態は、とりわけ、媒体中の濃度と結びつき、ターゲット配列に関連する。このことから、この発明による検知プローブのハイブリッド形成特異性に必要なハイブリッド形成条件および洗浄条件を簡単に決めることができる。 − 認識ドメインＣは、二本鎖形態であるので、このドメインのターゲツト配列とのクロスハイブリッド形成の危険性はなく、従っていかなるバックグラウンドノイズの問題はない。 − この認識ドメインに組み込まれ視覚化に用いられる分子は、リガンドとそれらの結合に干渉する可能性があるいかなる立体障害もないように、十分間隔がおかれる。この発明は、この発明による検知プローブを獲得および使用する例を述べた下記の明細書の残りの部分を参照することによってより完全に理解されるであろう。しかしながら、これらの例は、この発明の主題を説明するものとしてのみ記載されるものであって、この発明に限定を設けるものではないことが理解されなければならない。実施例１：停止シントンを含有するプライマー使用する異なる核酸配列の増幅A ）ヒトDNAの1010塩基対フラグメントの増幅 −P'プライマー：このプライマーのＢドメインは２つの連続的な停止シントンを含有している。これらシントンの各々は、以下の構造； −O−CH₂−(CH₂)₄−CH₂−O−PO₂H− の6-ヘキシルホスフェート単位からなる。 -P"プライマー：増幅条件は、修飾されていないプライマー、すなわちＡおよびＢドメインを含有していないプライマーを使用してまず第一に決定された。増幅は３つのＡ、ＢおよびＣドメインを含有する修飾されたP'プライマーを使用して次いで繰り返された。増幅は10pmolの各プライマー、2.5単位のTaqポリメラーゼ（シスバイオインターナショナル（CIS BIO INTERNATIONAL））、５μlの10×緩衝液（100mM Tris／HCl、pH９；500mM KCl；15mM MgCl₂；１％ Triton×100；２mgのBSA／ml 、シスバイオインターナショナル）および0.75μlの各ヌクレオチドトリフォスフェート（20mM溶液、ベーリンガー-マンハイム（BOEHRINGER MANNHEIM））の存在下に0.1μlのヒトゲノムDNA(クローンテック(CLONTECH))上に行う。94℃で５分間の最初の変性の後、以下の順序を35サイクル行う:９4℃で１分30秒間、60℃ で１分30秒間、70℃１分30秒間、／AGAROSEゲル上に泳動した後、視覚化する。期待された長さの単一バンドが得られる。修飾したプライマーを使用したときと修飾していないプライマーを使用したときの収率と特異性が等しい。 B）ファージλDNAの6023塩基対と10709塩基対フラグメントの増幅 −P'プライマー：このプライマーのＢドメインは上記Ａ)で記載のものと同一である２連続的な停止シントンを含有する。 −P"プライマー：でなければプライマーJ₁₅（停止）₂λ₁は、λ₆₅₂₈プライマーで使用したときは602 3bpフラグメント、およびλ₁₁₂₁₄プライマーで使用したときは10709bpフラグメントを増幅する。 XL PCR（パーキンエルマー（PERKIN ELMER））キットを、製造者により推奨されているホット-スタート手法であるプロトコルに従い使用する。反応媒体のより低い相は、製造者の指示に従い薄壁の500μlチューブ（パーキンエルマー）内で調製する。1.1mMの最終的なMg(OAc)₂濃度となるように4 0pmolのプライマーを使用する。より低い相はワックス（パーキンエルマー）で覆われる；より上の相を次いで加える。増幅を１ngのファージλDNA上に行う。増幅は以下のプロトコルに従って起こる： − 94℃1分間； − 94℃15秒間／68℃5分間の10サイクル； − 94℃15秒間／68℃5分間の20サイクル、サイクル毎に15秒の増大を伴う； − 72℃10分間の最終的な伸長。増幅生成物は0.8％アガロースゲル上で電気泳動および臭化エチジウムで染色した後に確認する。期待された長さの唯一のバンドが見られる。 C）ファージλ DNAの20874塩基対フラグメントの増幅 −P'プライマー：このプライマーのＢドメインはＡ)に記載のものと同一である２連続的な停止シントンを含有する。 −P"プライマー：増幅をプライマーλ₂およびK₂₀（停止）₂λ₁を使用して１ngのファージλ DNA上に行う。試薬は上記Ｂ中と同じである。増幅条件は以下のとおりである： − 94℃1分間； − 94℃1分間／68℃10分間の18サイクル； − 94℃1分間／68℃10分間の15サイクル、サイクル毎に15秒の増大を伴う； − 72℃10分間。増幅は0.6％アガロースゲル上で電気泳動した後に確認する。期待されたサイズの唯一のバンドが見られる。 K₂₀（停止）₂λ₁プライマーのＡドメインに相補的なオリゴヌクレオチドは、Ａドメインは実際に以下の増幅において一本鎖の形態であることを立証するために使用される；この相補的なオリゴヌクレオチドは配列：を有し、γ³²P−ATPの存在下にポリヌクレオチドキナーゼを使用して5'をラベルする。37℃で10分間、1×PBSおよび0.25M NaCl緩衝液中の５μlの増幅生成物存在下、溶液中でハイブリッドする。ハイブリッド形成生成物を0.6％のアガロースゲル上で電気泳動することにより分離する。ゲルを乾燥させ、ついで一晩オートラジオグラフィーさせる。オートラジオグラフにより、放射能が非ハイブリッドされたラベルされたオリゴヌクレオチドの領域内のゲルの底と同様に、増幅バンドの領域内のゲルの頂上に位置することが示される。 20.8kbバンドの領域にある放射能の存在により、ラベルされたオリゴヌクレオチドが実際に一本鎖の相補的フラグメント上にハイブリッドされたことが示される。これらの実施例はP'タイプのプライマーを使用して非常に長いフラグメントを得ることが容易に可能であり、一本鎖部分が増幅反応の後にこの形態で残存していることを立証している。実施例２：ターゲット核酸の検知；この発明に従う検知プローブを有する単一の増幅の証明ターゲット：ターゲットは、試験管内での転写により得られた、長さが30塩基のRNA であり、その配列は以下の：である。各工程で10倍に薄めた溶液を調製する。薄めていない溶液を溶液１と見なす。方法：ターゲットをマイクロサポートに取り付けられている捕捉プローブおよびビオチンでどちらも標識されたオリゴヌクレオチド（G4）を使用し、それにより通常のタイプの検知プローブ［そのプローブは比較のために使用する］を構成して、サンドウイッチハイブリッド形成により検知するか、またはこの発明に従い検知プローブを使用して検知する。オリゴヌクレオチドG4は、その配列が以下の：であり、その5'末端が出願第PCT WO/89/12462号に記載の方法を使用してビオチンで標識されているか、またはその3'末端に付加的な配列（配列I₁₅）を備える。その配列I₁₅：は、特にオリゴヌクレオチド（cI₁₅-cJ₁₅）とハイブリッドする。その一部はI₁₅ と相補的であり、その一部は配列J₁₅と相補的である。全体の構造G4 I₁₅＋cI₁₅c J₁₅はアダプターの役割を果たす。この発明に従うハイブリッド形成検知プローブの製造この発明に従う検知プローブはプライマーJ₁₅(停止)₂H₁₂₁₇₀およびH₁₃₁ ₈₀ を使用するヒトDNAフラグメントのPCR増幅により得られる（実施例１Ａ参照）。反応媒体は1×Taq緩衝液（シスバイオインターナショナル）中の0.1μgのヒト DNAを、2.5UのTaq DNAポリメラーゼ（シスバイオインターナショナル）と６pmol の各プライマーと共に含有する。ヌクレオチドトリホスフェートの濃度は300nM であり、dTTPのそれを除けば240nMである。増幅媒体はそのうえ60nmolのビオ−1 6−dUTP（ベーリンガー-マンハイム、フランス）を含有する。増幅条件は、以下の：94℃5分間、次いで94℃1分30秒間、60℃1分30秒間および70℃1分間の35サイクルならびに70℃5分間の最終的伸長である。これは約1/5のチミジンがビオチニル化されたウリジンに置き換えられた1010塩基対二本鎖のフラグメントとなる。増幅は1％アガロースゲル上で確認する。期待されたサイズの単（MICROSPIN^TMS400、ファルマシア（PHARMACIA））カラム上で精製する。チップ上でのハイブリッド形成チップは、わきの長さが50μmの48の四角の電極を含有している。捕獲プローブGcは、以下の配列：を有し、対照として使用した異なる配列の２つのオリゴヌクレオチド(T1およびT 2)は、各々出願第PCT WO/94/22889号に記載の方法に従いピロールと共重合する方法によりそれらの5'末端によって電極に取り付ける。ハイブリッド形成は45℃で１時間、1×PBS、0.5M NaCl、10mM ETDA、超音波処理されたヘーリング精子DNA／mlの100μgを含有する2.5×DENHARDT緩衝液中で起こる。ハイブリッド形成溶液をマイクロチューブ中でアッセイされるRNA の存在下に80℃で３分間加熱し、次いでチップを配置したハイブリッド形成sac 内に移す。ビオチニル化されたG4オリゴヌクレオチドでの検知ターゲットRNAは1μlの試験されるRNA溶液と15pmolのビオチン標識されたG4オリゴヌクレオチドを含有する20μlの１×緩衝液中のチップ上にハイブリッドされる。その後0.5M NaClと0.05％のTween20を含有する１×PBA緩衝液で３回ゆすぎを行う。そのチップを次いでPBS／NaCl／Tween中の５ng／μlのストレプタビジン-フィトコエリトリン溶液中で10分間保温し、その後洗浄緩衝液でゆすぐ。チップをスライドの上に載せ、カバーグラスの下にし、PBS／NaCl／Twe en緩衝液の１滴中においた。シグナルを１秒間に500〜550nmで照射した後にCCD カメラと連結した顕微鏡で記録する。この発明に従った検知プローブでの検知：これは２工程で起こる。 a）アダプターを使用するハイブリツド形成：試験されるRNA（１μl）をまず第一に25pmolのI₁₅G₄オリゴヌクレオチドと25pmolのcI₁₅cJ₁₅オリゴヌクレオチドを使用してチツプ上にハイブリッドする。チップを２×５分間0.1N NaOH溶液中で処理し、蒸留水ですすぐ。 b）検知プローブを使用するハイブリッド形成： PBS／NaCl／Tween緩衝液中ですばやくゆすいだ後、チップをこの発明に従い精製された検知プローブの10μlと２×ハイブリッド形成緩衝液の10μlとを含有する第２のハイブリッド形成sac内へ移す。ゆすぎ、ストレプタビジン-フィトコエリトリンでの視覚化、およびシグナルの記録を上述のように行う。シグナルは１秒の照射の後で記録する。結果各電極上のシグナルは任意蛍光単位（AFUs）で計量される。シグナルの範囲は0〜250AFUsの直線である。捕捉プローブGcを有する電極について得られた結果（AFUsで表現された）は以下の表Ｉに示す。 T1およびT2オリゴヌクレオチドを有する対照電極は4〜10AFUsのシグナルを与え（結果は表中に示さず）、それはバックグラウンドノイズに相当する。使用した条件下で、250AFUsのシグナルは、飽和している読み取りシステムに相当する。単一のビオチンで標識されたG4オリゴヌクレオチドで得られたシグナルは、希釈がすすむにつれて非常にすばやく減少し、一方この発明に従った検知プローブを使用すると、より強いシグナルが得られ、加えて試験の感度が著しく増大する。バックグラウンドノイズは、この発明に従った検知プローブの存在下またはビオチニル化されたG4オリゴヌクレオチドからなる通常のプローブの存在下でも同じである。実施例５：マイクロプレートの視覚化のためのこの発明に従った検知プローブの使用この発明に従いジゴキシゲニン（digoxigenin）で標識された検知プローブは実施例１Ａ）に記載したプロトコールを使用して、一方dTTTPsの1/5をジゴキシゲニン11−2'−デオキシウリジン−5'−トリホスフェート（ベーリンガー -マンハイム）で置き換えて製造する。このプローブを使用して、一方、比較のためオリゴヌクレオチドG4 DIG (ジゴキシゲニンで5'末端を標識されHPLCで精製されたG4 オリゴヌクレオチド)を使用して試験を行う。ターゲットは先の実施例と同様、RNAからなる。10倍段階的に希釈したターゲットを製造する。このターゲットをストレプタビジン−被覆したマイクロプレート（ラボシステム（LABSYSTEM））にビオチン標識されたGc捕捉プローブを使用して取り付ける。G4 DIG でのハイブリッド形成ターゲットRNAを、30pmolのG4 DIGおよび40pmolのビオチニル化されたG c捕捉プローブを含有するPBS／NaCl緩衝液の50μl中で保温する。その溶液を80 ℃で３分間加熱し、次いでウエル内に移す。プレートを42℃で１時間保温する。 PBS／NaCl／Tween緩衝液で３回洗浄した後、プレートをパーオキシダーゼ-標識されたアンチ-DIG抗体（ベーリンガー-マンハイム３％BSAを含有するPBS／NaC l中で1/2000に希釈された75U／ml保存溶液）と共に37℃で１時間保温する。この発明に従った検知プローブを使用するハイブリッド形成これは２工程で起こる：ａ）アダプターを使用するハイブリッド形成：試験されるRNAをまず第一に40pmolのGc−ビオチンプローブ、40pmolのI₁₅ G₄および40pmolのcI₁₅cJ₁₅を含有するPBS／NaCl／Tween緩衝液の50μl中でハイブリッドさせる。その溶液を80℃で３分間変性させ、次いでマイクロプレートのウエル中に移す。保温を42℃で１時間行う。PBS／NaCl／Tweenで３回洗浄を行い、次の工程で検知プローブと共に保温する。ｂ）検知プローブを使用してハイブリツドする：ジゴキシゲニン標識された検知プローブの精製溶液と３％のBSAの5μl を含有するPBS／NaClの50μlを各ウエルに加える。マイクロプレートを42℃で１時間保温する。３回洗浄した後、プレートを37℃で１時間、1/4000-希釈されたアンチ-DIG抗体と共に保温する。視覚化：３回洗浄した後、ウエルを暗所で50μlのパーオキシダーゼ基質（0.02 ％のH₂Oを含有するクエン酸塩−リン酸塩緩衝液、pH5.5、中のＯ−フェニレンジアミン）の存在下に保温する。反応を、増幅システムの場合10分後、対照の場合 30分後に、50μlの1Mシュウ酸で停止させる。吸光度は492nmで読む。吸光度単位で現わされたその結果は以下の表II中に編集する。NT：試験せず先の実施例でのように、この発明に従った検知プローブを使用するときバックグラウンドノイズを減じた後、シグナルにおいて非常に顕著な増大と、試験の感度において非常に顕著な増大が認められる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年４月２１日（１９９９．４．２１）【補正内容】法。６. Ａドメインの大きさが長さ８から４０ヌクレオチドの間であり、Ｃドメインを構成するヌクレオチドの少なくとも1/50が標識ヌクレオチドであることを特徴とする請求項１に記載されたハイブリッド形成検知プローブ。７ . Ｃドメインの大きさが０.１から５０ｋｂの間であることを特徴とする請求項６の検知プローブ。８ . ５’から３’に：上記に定義したＡドメインとＢドメイン、および、重合を開始するために鋳型鎖とハイブリッド可能な配列からなるＸドメインとからなるプライマーP'を、ポリメラーゼを用いて鋳型鎖の存在下、適当な反応混合物の中で伸長することによって前記Ｃドメインの鎖の少なくとも１つが合成される少なくとも１つの工程からなり、反応混合物のヌクレオチドトリフォスフェートの少なくとも１つの全部あるいは一部が標識誘導体の１つによって置き換えられることを特徴とする、請求項６または７の検知プローブを調製する方法。９ . ポリメラーゼ伸長が、P'プライマーの伸長生成物とハイブリッド可能な配列を含む第２のプライマーP"の存在下起こることを特徴とする請求項８の方法。１０. 反応混合物が、Ａドメインの配列において互いに異なり、Ｘドメインの配列に関して互いに同じであるいくつかのP'プライマーを含むことを特徴とする請求項８または９の方法。１１. 少なくとも１つのP'プライマーと、前記プライマーを伸長させるための鋳型として用いることができるポリヌクレオチドと、標識ヌクレオチドトリフォスフェートからなる、請求項８から１０のいずれか一つの方法を実行するためのキット。１２. 少なくとも１つのP"プライマーをさらに含むことを特徴とする請求項１１のキット。

Claims

【特許請求の範囲】１. ターゲット配列を、 − 一本鎖ポリヌクレオチドからなる付着ドメインＡと、 − 少なくとも１つの停止シントンからなる中間ドメインＢと、 − 少なくとも１つの標識ヌクレオチドを組み込んだ二本鎖ポリヌクレオチドからなり、検知手段を構成する視覚化ドメインＣとからなる核酸分子からなる少なくとも１つの検知プローブと、前記核酸プローブのＡドメインがターゲット配列とハイブリッドすることを可能にする条件下で接触させ、形成されたハイブリッドが前記核酸プローブのＣドメインによって検知されることを特徴とする、少なくとも１つのターゲット核酸配列を検知する方法。２. Ａドメインの配列において互いに異なるいくつかの検知プローブがいくつかのターゲット配列を同時に検知するために同時に用いられることを特徴とする請求項１の方法。３. 前記検知プローブがＣドメインの配列および／またはこのドメインに組み込まれる標識ヌクレオチドの性質においても互いに異なることを特徴とする請求項２の方法。４. ターゲット配列が固体支持体に付着していることを特徴とする請求項１から３のいずれか一つの方法。５. 前記固体支持体が多数の電極からなり、そのうち少なくとも２つがそれぞれ異なるターゲット配列を持つことを特徴とする請求項４の方法。６. Ａドメインの大きさが長さ８から４０ヌクレオチドの間であることを特徴とする請求項１に記載されたハイブリッド形成検知プローブ。７. Ｃドメインを構成するヌクレオチドの少なくとも1/50が標識ヌクレオチドであることを特徴とする請求項６の検知プローブ。８. Ｃドメインの大きさが０.１から５０ｋｂの間であることを特徴とする請求項６または７の検知プローブ。９. ５’から３’に：上記に定義したＡドメインとＢドメイン、および、重合を開始するために鋳型鎖とハイブリッド可能な配列からなるＸドメインとからなるプライマーP'を、ポリメラーゼを用いて鋳型鎖の存在下、適当な反応混合物の中で伸長することによって前記Ｃドメインの鎖の少なくとも１つが合成される少なくとも１つの工程からなり、反応混合物のヌクレオチドトリフォスフェートの少なくとも１つの全部あるいは一部が標識誘導体の１つによって置き換えられることを特徴とする、請求項６から８のいずれか一つの検知プローブを調製する方法。１０. ポリメラーゼ伸長が、P'プライマーの伸長生成物とハイブリッド可能な配列を含む第２のプライマーP"の存在下起こることを特徴とする請求項９の方法。１１. 反応混合物が、Ａドメインの配列において互いに異なり、Ｘドメインの配列に関して互いに同じであるいくつかのP'プライマーを含むことを特徴とする請求項９または１０の方法。１２. 少なくとも１つのP'プライマーと、前記プライマーを伸長させるための鋳型として用いることができるポリヌクレオチドと、標識ヌクレオチドトリフォスフェートからなる、請求項９から１１のいずれか一つの方法を実行するためのキット。１３. 少なくとも１つのP"プライマーをさらに含むことを特徴とする請求項１２のキット。