JP2626980B2

JP2626980B2 - ポリヌクレオチド検出用プローブ

Info

Publication number: JP2626980B2
Application number: JP25620487A
Authority: JP
Inventors: 明男山根; 健一三好
Original assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1987-05-02
Filing date: 1987-10-13
Publication date: 1997-07-02
Anticipated expiration: 2012-07-02
Also published as: JPS6463398A

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の背景〕技術分野本発明は、新規なヌクレオチド検出用プローブに関す
る。より詳細には、本発明は、検出しようとするポリヌ
クレオチドの塩基配列に相補的な塩基配列のみを取換え
るだけで如何なる塩基配列をも高感度で検出し得る新規
プローブに関するものである。

先行技術遺伝子工学的手法の発展とともに核酸等のポリヌクレ
オチドの検出方法についても種々研究が進展している。
そのような方法の一つとして、プローブを使用するもの
がある。核酸等のポリヌクレオチド検出用プローブはそ
れ自身も一本鎖ポリヌクレオチドであって、その塩基配
列が検出対象ポリヌクレオチドの塩基配列（以下、標的
配列という）と相補的なものであると共に適当な標識を
持たせてあるものである。標識としては、放射性のもの
と非放射性のものとが知られている。しかし、従来より
提案されている放射性物質で標識化されたヌクレオチド
検出用プローブ（以下「放射性プローブ」ということも
ある。）は、放射性物質固有の問題〔被曝等による人体
への影響、放射性物質の安定性、特別な施設の必要性、
廃棄の問題等〕から、現在は非放射性物質で標識化され
たプローブへと移行しつつある。

このように非放射性物質で標識化されたプローブとし
ては、例えば以下のようなものがある。

ビオチン化ｄ−UTPを用いたニックトランスレーショ
ン法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80,4045−4049（198
3）〕用キット（BRL社より市販）、スルホン化DNA−抗
スルホン化DNA抗体を利用するDNA CHEMIPROBE^R（Orgeni
cs社）、酸素−DNA架橋法〔Nucleic Acids Research,1
2,3435−3444（1984）〕を利用するLabezyme−PODセッ
ト（和光純薬）、光反応によりビチオンを導入する方法
〔Nucleic Acids Research,13,745−761（1985）〕を利
用するPHOTOBIOTIN^R（BRESA社より販売）、水銀化DNAと
スルフヒドリル基の反応を利用する方法〔Nucleic Acid
s Research,13,745−761（1985）〕を応用したキット等
がある。

これらの非放射性物質で標識されたプローブ（以下
「非放射性プローブ」）はその調製が容易であり、製品
自体も安定性に優れている。しかしながら、放射性DNA
プローブと測定感度を比較すると１オーダー（10^-1＜
１）程度の差があるのがふつうである。

非放射性プローブの測定感度が低いのは、そのような
プローブは検出対象とハイブリダイズさせるべき部分に
標識物質が突出していて検出対象ポリヌクレオチドとの
緊密なハイブリダイゼーションが妨げられることにその
理由の少なくとも一部があると解される。

そこで、近年標的配列と相補的な構造遺伝子を含む一
次プローブと、上記一次プローブの標的配列と相補的な
構造遺伝子以外の部分と相補的な遺伝子構造を有する標
識化された二次プローブとの組合せからなるプローブが
開発され、上記問題点は改善された（特開昭60−208997
号公報）。

しかし、このプローブは、本発明者らの知る限りで
は、未だ問題を抱えている。すなわち、ファージベクタ
ーであるM13ベクターを用いて、下記の工程（ア）で調
製された一本鎖一次プローブ（M13ベクターの外側鎖由
来）と、工程（イ）で調製された未だ二本鎖の状態にあ
る二次プローブとの使用時にハイブリダイズさせるに当
り、二本鎖の状態にある二次プローブを変性させて、一
本鎖の状態とした後、この変性生成物のままで、すなわ
ち一次プローブとハイブリダイズしないM13ベクターの
外側鎖由来のフラグメントが共存する状態で、一次プロ
ーブとハイブリダイズさせるため、一次プローブと二次
プローブのハイブリダイゼーションが確実に起らないと
いう問題があった。

（ア）M13ベクターに標的配列と相補的な構造遺伝子を
組込み、それで大腸菌を形質転換し、形質転換体を培養
することによって形質転換体を得て、それから一次プロ
ーブ用の一本鎖ポリヌクレオチド部分を取得すること。

（イ）（ア）で使用したM13ベクターをそのままあるい
は任意の制限酵素で切断した後、二本鎖の状態でアトラ
ンダムに標的化して、二本鎖標識化ポリヌクレオチド部
分を取得すること。

〔発明の概要〕

要旨本発明は上記の問題に解決を与えることを目的とし、
検出対象ポリヌクレオチドとハイブリダイズする部分と
標識を導入する部分とを一本鎖調製用プラスミドを用い
て別々に合成することによってこの問題を解決しようと
するものである。

従って、本発明によるポリヌクレオチド検出用プロー
ブは、下記の工程Ｉ（（イ）〜（ホ））から得られる一
本鎖ポリヌクレオチドと工程II（（ヘ）〜（チ））から
得られる一本鎖ポリヌクレオチドが前者の一部が一本鎖
の状態で残るようにハイブリダイズすることによって形
成された、一本鎖ポリヌクレオチド部分を鎖中の一部に
有する二本鎖構造ポリヌクレオチドからなり、各鎖を下
記の事項III（（リ）〜（ヲ））のように構成したこ
と、を特徴とするものである。

工程Ｉ（イ）検出対象ポリヌクレオチドの塩基配列（以下、標
的配列という）と相補的な構造遺伝子を含む遺伝子を用
意すること。

（ロ）バクテリオファージIG（intergenic）領域をコー
ドする遺伝子であってその遺伝子以外の部分に標的配列
と相補的な構造遺伝子を含む遺伝子を結合させ得るも
の、を含み、かつ予定した宿主内で増殖可能な一本鎖DN
A調製用プラスミドを用意すること。

（ハ）標的配列と相補的な遺伝子を含む遺伝子と上記プ
ラスミドとを用いて、予定した宿主細胞内で増殖可能な
組換体DNAを調製すること。

（ニ）この組換体DNAを用いて宿主細胞の形質転換を行
なって、形質転換体を調製すること。

（ホ）この形質転換体をヘルパーファージで感作させ、
培養した後、目的とする一本鎖ポリヌクレオチドを回収
すること。

工程 II （ヘ）工程Ｉの（ロ）で用意したベクターのIG領域をコ
ードする遺伝子の塩基配列が逆向きに設定されているこ
と以外は同様な一本鎖DNA調製用プラスミドを用意する
こと。

（ト）上記プラスミドを用いて宿主細胞の形質転換を行
なって、形質転換体を調製すること。

（チ）この形質転換体をヘルパーファージで感作させ、
培養した後、目的とする一本鎖ポリヌクレオチドを回収
すること。

事項 III （リ）一本鎖ポリヌクレオチド部分の少なくとも一部
が、標的配列と相補的な塩基配列を有していて該検出対
象ポリヌクレオチドとハイブリダイズしうるようになっ
ていること。

（ヌ）二本鎖構造ポリヌクレオチド部分のポリヌクレオ
チド鎖が標識部分が有すること。

（ル）二本鎖構造ポリヌクレオチド部分の塩基配列は、
両鎖が少なくともハイブリダイズしうる程度に相補的な
ものであること。

（ヲ）二本鎖構造は、上記一本鎖ポリヌクレオチド部分
と検出対象ポリヌクレオチドとがハイブリダイズするこ
とによって実現されるポリヌクレオチドの検出に際し
て、このハイブリダイズの時点、それより前あるいはそ
れより後に形成させたものであること。

効果本発明によるプローブは、前記で定義したように、標
的配列と相補的な構造遺伝子を含む一本鎖ポリヌクレオ
チドと、この一本鎖ポリヌクレオチドの標的配列と相補
的な構造遺伝子以外の部分と相補的な遺伝子構造を有す
る一本鎖ポリヌクレオチドとを、それぞれ一本鎖調製プ
ラスミドで一本鎖の状態で調製したものであることによ
り、両鎖のハイブリダイゼーションを確実に行うことが
できる。

そして、本発明プローブは、標識を標的配列以外の部
分に設けたことによる利点を持つものであることはいう
までもない。すなわち、従来のプローブは、検出すべき
塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む塩基配列を標
識物質で標識物質で標識したものであるのに対し、本発
明のプローブのうち検出すべき塩基配列とハイブリダイ
ズさせるべき部分のポリヌクレオチド鎖の何ら修飾（標
識物質等）されていないので、ハイブリダイゼーション
の効率は非常に良い。また、従来は、ハイブリダイゼー
ションを行うに当り必ずプローブの標識化が必要であっ
たが、これに対して本発明のプローブによれば、標識帯
有部分を一旦つくっておけば、あとは検出したいと考え
る塩基配列に相補的な塩基配列部分を有するプローブ部
分を取換えるだけで如何なる配列であっても検出可能で
ある。すなわち標識化操作は一度でよいのである。

また、本発明のプローブは、検出しようとする塩基配
列とハイブリダイズする塩基配列部分以外の塩基配列部
分はその大部分が二本鎖構造となっているので、非特異
的なハイブリダイゼーションを防止することができる。

本発明の一つの実施例態様によれば、標識物質がポリ
ヌクレオチド鎖から離間しして設けられているので、そ
のような標識付きポリヌクレオチドは立体構造的に安定
となってプローブとしての検出感度が向上している。

〔発明の具体的説明〕

DNAプローブプローブの構成本発明によるプローブは、二本鎖ポリヌクレオチドで
あって、その鎖中の一部に一本鎖ポリヌクレオチド部分
を有するものからなるものである。

この一本鎖ポリヌクレオチド部分の少なくとも一部が
検出対象ポリヌクレオチドの塩基配列、すなわち、標的
配列、と相補的な塩基配列を有していて、その部分で検
出対象ポリヌクレオチドとハイブリダイズするようにな
っている。ここで「一本鎖ポリヌクレオチド部分の少な
くとも一部」ということは、この一本鎖ポリヌクレオチ
ド部分の全長が標的配列でなくてもよいことおよび（ま
たは）本発明プローブの二本鎖構造の鎖中には一本鎖ポ
リヌクレオチド部分が複数個存在してもその少なくとも
一つが標的配列を持つものであればよいこと、を意味す
るものである。この一本鎖ポリヌクレオチド部分はその
延長部分が二本構造ポリヌクレオチドの構成鎖となる訳
であるが、本発明ではこの鎖を一次プローブということ
とする。

本発明プローブの二本鎖構造は、上記のポリヌクレオ
チドともう一本のポリヌクレオチドとで構成される。こ
こで「二本鎖構造」ということは、両鎖が少なくともハ
イブリダイズしうる程度に相補的であることによって形
成される状態を意味するものであって、必ずしも二本鎖
構造部分の両鎖がこの全長にわたって完全に相補的であ
って相補塩基間の対合が生じている状態でなくてもよい
ことを意味する。本発明では、上記の一次プローブポリ
ヌクレオチドと共にこの二本鎖構造を形成するポリヌク
レオチド（一本鎖）を二次プローブということにする。
本発明の特徴の一つは、二本鎖部分の鎖の両方または一
方（好ましくは一方）、特にこの二次プローブ、に標識
物質を導入したことにある。

本発明によるプローブは、環状のものであっても鎖状
のものであってもよい。一つの具体例は、環状のもので
ある。本発明による製造法（詳細後記から）いって環状
構造のものが得られやすいが、直鎖状のものが必要なら
ば、適当な制限酵素で消化して環状のものを開環すれば
よい。

本発明によるプローブは、一次プローブと二次プロー
ブとからなる二本鎖構造を有するものであるが、この二
本鎖構造はこのプローブがプローブとして作用した時点
ですなわちこのプローブにその一本鎖ポリヌクレオチド
部分において検出対象ポリヌクレオチドがハイブリダイ
ズした時点で、形成されていればよい。換言すれば、本
発明によるプローブは、これをプローブとして使用する
時点で二本鎖構造となっている必要はない。従って、こ
の二本鎖構造は、一次プローブの一本鎖ポリヌクレオチ
ド部分と検出対象ポリヌクレオチドがハイブリダイズす
ることによって実現されるポリヌクレオチドの検出に際
して、このハイブリダイズの時点、その前あるいはその
後で形成されていればよい。すなわち、本発明のプロー
ブは、最初からこの二本鎖構造を持つものであってもよ
いし、検出対象ポリヌクレオチドに一次プローブと二次
プローブとをそれぞれ加えて二本鎖構造の形成と対象ポ
リヌクレオチドとのハイブリダイゼーションとを行なわ
せてもよいし、また検出対象ポリヌクレオチドに一次プ
ローブを加えてハイブリダイズさせた後、二次プローブ
を加えて二本鎖構造を形成させてもよい。

なお、本発明で「ポリヌクレオチド」というときの
「ポリ」は、ヌクレオチドの重合度が２程度以上である
ことを意味するものとする。

一次プローブ前記のように、一次プローブは、検出対象の塩基配
列、すなわち標的配列、と相補的な塩基配列をその一部
に有する一本鎖ポリヌクレオチドである。そして、この
一本鎖ポリヌクレオチドは、従来より核酸検出に使用さ
れていた、標的配列と相補的な配列（通常塩基数はその
塩基対）（bp）の数が10bp〜10,000bpであるのがふつう
であり、100bp〜3,000bpが特に好ましい。）と、二次プ
ローブ（後記）とハイブリダイズし得る程度の長さの塩
基配列（通常は10bp〜10,000pb）であり、50bp〜5000bp
がより好ましい。）とからなるものである。

このような一次プローブの調製は、前記の工程Ｉに従
って、例えば第１図のフローチャートに従って、行うこ
とができる。すなわち、まず常法に従って標的配列と相
補的な配列（プローブDNAということもある。）を一本
鎖調製用プラスミド、すなわち、バクテリオファージの
IG（intergenic）領域（複製に必要な塩基配列）をもつ
プラスミドであって、上記IG領域の方向を変えることよ
り（＋）あるいは（−）のDNA鎖を容易に調製すること
のできるプラスミド〔例えばpUCf1（第１図）：ファ
ルマシア社〕、に導入〔第１図（Ａ）〕したのち、常法
に従って所望の形質転換体を得る。ついで、この形質転
換体にヘルパーファージ（例えばM13K07:ファマルシア
社）を感染〔第１図（Ｂ）〕させて培養することによっ
て、一本鎖ポリヌクレオチドを大量に得る。これを常法
に従って単離・精製することにより、一次プローブを得
る〔第１図〕。なお、この一次プローブは環状であっ
ても鎖状であってもよいことは前記したところである。

ヘルパーファージの感作は、下記の通りに行なうこと
ができる。すなわち、形質転換体を、バクトトリプト
ン、イーストエキストラクトおよびNaCl等で調製された
pH7.4〜7.8の培地、例えばYTbroth、2XYTbroth（宝酒造
社製）、に植菌後、比較的早い時期、好ましくは培養後
約１時間後、にヘルパーファージを添加し、培養するこ
とにより、感染させることができる。

ヘルパーファージの添加量は、形質転換体と同量以上
であればよいが、好ましくは10〜20倍量がよい。

ヘルパーファージ添加後、約37℃で10〜20時間振うと
培養することにより、目的とする一本鎖DNAを培地中に
大量に生産させることができる。得られた一本鎖DNA
は、通常の手段により回収することができる。

なお、ヘルパーファージの感作とは、ヘルパーファー
ジが形質転換体内に入り、IG領域を有するプラスミドに
作用して、一本鎖DNAを複製させることをいう。「ヘル
パーファージ」および「IG領域」については、Beck,E.,
and Zink,B.,Gene,２,95（1981）を参照することができ
る。

二次プローブ（１）一般的説明このプローブは、一次プローブの標的配列と相補的な
塩基配列以外の塩基配列の部分と確実にハイブリダイズ
する程度に一次プローブの塩基配列と相補的な塩基配列
の部分を具備するものであることは前記したところであ
る。従って、一次プローブについて述べたように、一次
プローブに相補的な塩基配列は10bp〜10,000bp個程度で
あるのが好ましい。このように一次プローブの二次プロ
ーブとの相補的な塩基配列は、少なくとも10bp程度以上
あるのが好ましい。

上記二次プローブは、一次プローブの調製と同様、一
本鎖調製用プラスミドを用いて第１図のフローチャート
に従って行うことができるが、一次プローブの調製と異
るのは、標的配列と相補的な配列を導入してない状態
で、IG領域の方向を逆に設定した（f₁遺伝子を逆向に導
入した）プラスミドを用いるということである。

この二次プローブは、通常、構成塩基配列部分が少な
くとも１個の標識物質で修飾されているものである。こ
こで標識物質とは、ハイブリダイゼーション操作後にこ
の物質を検出し得るものであるならば、放射性、非放射
性を問わないが、取扱いの容易性、保存性、廃棄処理等
から、また本発明の効果を最もよく享有するものとし
て、非放射性の標識物質が好ましい。

（２）標識化二次プローブを非放射性物質で標識する方法として
は、前記したように、ビオチンを導入する方法〔ニック
トランスレーション:Proc.Natl.Acad.Sci.,80,4045−40
49（1983）、フォトビオチン;Nucleic Acids Res.,13,7
45−761（1985）〕、DNAをスルホン化する方法〔CHEMIP
ROBE^R:Orgenics社〕及びDNAを直接酵素標識する方法が
ある〔Nucleic Acids Res.,12,3435−3444（1984）〕。

また、標識物質としては、例えば、上記ビオチンのほ
かに、2,4−ジニトロフェニル基、フルオレセインおよ
びその誘導体〔フルオレセインイソチオシアネート（FI
TC）〕、ローダミンおよびその誘導体〔例えば、テトラ
メチルローダミンイソチオシネート（TRITC）、テキサ
スレッド等〕、４−フルオロ−７−ニトロベンゾフラン
（NBDF）およびダンシルなどの蛍光物質あるいは化学発
光物質などがある。

二次プローブに非放射性標識物質を導入する態様、換
言すれば、本発明にかかる「物」すなわちポリヌクレオ
チド検出用プローブにおける標識物質の存在形態、は任
意であるが、二次プローブのポリヌクレオチド鎖の塩基
部分に、しかもアミノ基含有塩基部分に該アミノ基の反
応性を利用して、導入する態様が好ましい。

ここで、「アミノ基の反応性を利用する」ということ
は、アミノ基上の水素原子を標識物質側の活性基（たと
えばカルボキシル基（酸無水物あるいは活性エステルの
形態が好ましい））との反応を利用して該アミノ基と標
識物質側の基とを結合させることおよびアミノ基と標識
物質側の基に持たせたアミノ基またはチオール基（−S
H）との間のトランス反応（アミノ基同志の場合はトラ
ンスアミネーション反応）によって該アミノ基（二次プ
ローブ側）と標識物質側の基とを結合させること、なら
びにその他の合目的的な態様、を包含するものである、
（「標識物質側の基」）の定義は後記）。

標識物質は、二次プローブポリヌクレオチド鎖の塩基
部分に直結されていても、介在員子を介して間接的に結
合されていてもよい。後者の方が、標識物質がポリヌク
レオチド鎖から離間して存在するので、そのような構造
の形成ないし標識物質の導入が効率的に行なえるばかり
でなく、プローブとしての検出感度が向上することから
好ましいといえる（前記）。

このような離間構造を形成させるには、それに必要な
介在員子の導入に関して二つの態様がありうる。すなわ
ち、一端に二次プローブポリヌクレオチド鎖のアミノ基
含有塩基部分のアミノ基と反応しうる（「反応」の定義
は前記した通りである）基を持ち、他端に標識物質と反
応しうる基を持つ鎖状化合物（「鎖状」といっても、そ
の長さはこれら両基が直結しているときのような長さを
包含する）を先ず該アミノ基との反応によって該塩基部
分に導入し、この「中間体」に導入された介在員子の該
他端に対して該基と標識物質との反応によって標識物質
を導入するという態様、ならびにこの介在員子に予め標
識物質を導入しておいて、それを二次プローブポリヌク
レオチド鎖のアミノ基含有塩基部分に導入するという態
様、である（前者の態様が好ましいようである）。前記
した「標識物質側の基」というのは、これらの両態様に
おいて前者の態様での介在員子および後者の態様での標
識物質付き介在員子のいずれかを意味するものである。

標識物質がポリヌクレオチド鎖の構成ヌクレオチドの
アミノ基含有塩基部分の該アミノ基に直結している場
合、すなわち、たとえば本発明ポリヌクレオチド検出用
プローブの標識部分がポリヌクレオチド鎖の構成ヌクレ
オチドのアミノ基含有塩基部分のピリミジン環またはプ
リン環に該アミノ基を介して結合している場合、の具体
例は、下式（１）の構造で表わすことができる。

Ｂ−Ｘ−Ｌ（１）ここで、Ｂは該塩基部分のピリミジン環またはプリン
環であり、Ｌは標識物質残基、たとえば標識物質がビオ
チンである場合はその−COOH部分の脱OH残基である。Ｘ
は−NH−または−Ｓ−であって、これらは該ピリミジン
環またはプリン環に結合していた該ヌクレオチド固有の
アミノ基またはこれを置換して存在するもの、である。
ここで、後者の「置換して存在するもの」ということ
は、標識物質側の化合物がアミノ基あるいチオール基
（−SH）を有する化合物であるときに、これらの基とヌ
クレオチド塩基部分のアミノ基とが交換反応を行なって
生成する標識物質由来の−NH−また−Ｓ−を意味する。
これらのうちでは、トランスアミネーションによって生
成する−NH−が好ましい。

標識物質がポリヌクレオチド鎖から離間して存在する
場合の具体例は、下式（２）で表わすことができる。

Ｂ−Ｘ−R_n−Ｘ′_ｍ−Ｌ（２）ここで、ＢおよびＬは式（１）の場合と同じである。
ＸおよびＸ′はそれぞれ独立に、式（２）のＸと同義で
ある。Ｒは、ＸおよびＸ′を結合する炭素数10までのア
ルキレン鎖である。ｎおよびｍは、それぞれ０または１
である。好ましいR_nはCH₂ _ａ（ａ＝０〜８）、Ｘ′
ｍは−NH−である。

式（２）の構造は、下式（２′）の二官能性化合物を
介在員子として、前記の二実施態様のいずれかに従って
形成させることができる。

Ｈ−Ｘ−R_n−Ｘ′_ｍ−Ｈ（２′）前記の二実施態様のうち好ましい前者の態様に従うと
きは、中間体として下式（２″）の化合物が生成するこ
とになる。

Ｂ−Ｘ−R_n−Ｘ′_ｍ−Ｈ（２″）（いずれも、記号の定義は前記の通り）前記したところから、好ましい二官能性化合物は、NH
₂CH₂ _nNH₂である。ｎは０〜８であるから、このジア
ミン化合物の具体例は、たとえば、NH₂−NH₂、エチレン
ジアミン、プロピレンジアミン、テトラメチレンジアミ
ンおよびヘキサメチレンジアミンである。

標識物質を直接または間接に結合すべきポリヌクレオ
チド鎖の塩基部分は合目的的な任意のものでありうる
が、これらを塩基名で呼べば通常はアデニン、ウラシ
ル、グアニンおよびシトシンである。前記の標識物質導
入法は、これらの塩基のピリミジン環またはプリン環に
存在するアミノ基の反応性に着目しているので、そのよ
うな反応が可能なのはアデニン、グアニンおよびシトシ
ンである。これらのうちで代表的なのは、シトシンであ
る。なお、ウラシルはピリミジン環の構成員として二級
アミノ基を持つが、その反応性に着目してそれと反応可
能な基を持つあるいは持たせた標識物質または介在員子
を使用して該塩基部分に標識物質を導入することもでき
る。

前記の「反応」を行なう方法は既に各種の文献によっ
て公知である。たとえば、核酸中のアミノ基と標識物質
のカルボキシル基またはアミノ基もしくはチオール基と
の相互のあるいはこれらと前記式（２′）の二官能性化
合物との反応については、酸無水物法（J.Immunol.Meth
ods,10,161（1976））、カルボジイミド法（J.Chim.End
crinol.Methods,44,91（1977））、活性エステル法（Bi
ochem.J.,32,1119（1938））、アシルハライド法（J.A
m.Chem.Soc.,86,1839（1964））、ジアゾ法、トリアジ
ン法（FEBS Lett.,16,39（1971））、ハロニトロベンゼ
ン法、ジイソシアネート法（米国特許第3,654,090号明
細書（1972））、イミドエステル法、グルタルアルデヒ
ド法（lmmunochemistry,6,53（1969））、過ヨウ素酸酸
化法（J.Histchem.Cytochem.,22,1084（1974））、マレ
イミド法（J.Biochem.,78,235（1975））、イソシアネ
ート法（J.Bio.Chem.,236,2477（1961））、または二価
性の架橋試薬（J.Biochem.,83,1493（1978）,Biochem.,
92,1413（1982）、特開昭59−164797号および特開昭58
−152847号公報参照）を用いる方法など、種々の方法が
知られている。なお、これらの文献には介在物質ないし
スペーサーの具体例も示されている。

（３）製造このような二次プローブの製造は、第１図のフローチ
ャート（Ｃ）〜（Ｆ）に従って行う方法（一本鎖調製用
ベクターを用いる方法）、ニックトランスレーションに
よる方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.,80,4045−4049（198
3）〕、RNAプローブを用いる方法〔Science,233,1294−
1299（1986）〕等によって行うことができる。これらの
うちで、一本鎖調製用ベクターを用いて二次プローブを
調製する方法の具体例は、下記の通りである。

一次プローブ調製に際して使用したベクターpUCf1と
は逆向きにf1遺伝子が組込まれたベクターpUCRf1（第１
図）にヘルパーファージ（例えば、M13K07:ファルマ
シア社）を感染させて一本鎖ポリヌクレオチドを得る
〔第１図（Ｃ）〕。直鎖のポリヌクレオチドが必要な場
合には、この一本鎖ポリヌクレオチド〔第１図〕に化
学合成した一本鎖ポリヌクレオチド（ここで「ポリ」と
は少なくとも２程度以上の重合度を意味することは前記
したところである）をアダプターとして加える〔第１図
（イ）または（ロ）〕ことにより、第１図の一本鎖
ポリヌクレオチドを所望の制限酵素切断部位で消化する
ことができる（第１図（Ｄ））。この場合に、アダプタ
ーを用いる代りに、予めシステム構造が形成できような
配列を導入しておけば、アダプターなしで切断すること
ができる〔M13mp7。Messing（1983）:Methods Enzyol.1
01,Part C 20〕。なお、f1部分は、必要に応じて削除し
ておいてもよい。ついで、第１図の一本鎖ポリヌクレ
オチドに標識物質を導入する。すなわち、たとえば、こ
の一本鎖ポリヌクレオチドを中性条件下にジアミンたと
えばヒドラジンと亜硫酸水素ナトリウムで処理してか
ら、必要に応じてリン酸緩衝液で処理すれば、ポリヌク
レオチドのシトシン残基をトランスアミネーション反応
によってアミノまたはアミノアルキルシトシンに変換さ
せることができる。次いで、これとビオチンの活性エス
テルとを反応させて、標識物質ビチオンを導入すること
ができる。また、ビチオン以外に蛍光試薬、フルオロジ
ニトロベンゼン等もこのような方法で上記ポリヌクレオ
チドに導入することができる。

プローブの利用／ハイブリダイゼーション上記のようにして調製された一次プローブ及び二次プ
ローブを用いて、所望の塩基配列を検出することができ
る。すなわち、例えば、ドットハイブリダイゼーション
法〔DNA,４,327−331（1985）〕、サザンハイブリダイ
ゼーション法〔Molecular Cloning、P382 Cold Spring
Harbor（1982）〕等の種々のハイブリダイゼーション法
に本発明プローブを用いて塩基配列を検出することがで
きる。

ドットハイブリダイゼーション法の例を述べれば、以
下の通りである。

まず、標的配列を含む塩基配列を常法に従って測定系
例えばニトロセルロース膜に固定化する。そして、この
系に本発明の一次プローブ及び二次プローブを同時に加
えるか若しくは予め一次プローブと二次プローブとをハ
イブリダイズさせておいたのちの系に加え、ついで常法
〔Nucleic Acids Research,13,1529−1540（1985）〕に
従ってハイブリダイゼーションを行う。

また、一次プローブと標的配列とを予めハイブリダイ
ズさせたのち、二次プローブをこの系に加えて、一次プ
ローブと二次プローブとのハイブリダイゼーションを行
ってもよい。このハイブリダイゼーションの結果、標的
配列、一次プローブおよび二次プローブの複合体が形成
されて、標的配列はこの反応系に固定化されることにな
る。

従って、ハイブリダイゼーションの結果、標的配列と
二次プローブとが対応するので、二次プローブの標識を
定量的または定性的に測定することによって、標的配列
を定性的または定量的に測定することができる。この場
合に標識物質の検出は、標識物質の特性に応じて適宜選
択すればよい。

例えば、ビオチンを検出する場合は、その方法は公知
であって、例えばストレプトアビジンとビオチン化酵素
の組合わせあるいは直接酵素標識したストレプトアビジ
ンを、標識化した酵素に応じた発色基質とを用いて行う
ことができる。ここで用いることができる酵素として
は、アルカリホスファターズ、ホースラディシュペルオ
キシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ等が繁用されてい
る。2,4−ジニトロフェニル（DNP）基を検出する場合も
その方法は公知であって、例えば、酵素標識したアンチ
−DNP抗体を用いて目的を達成することができる。

フルオレセインを検出する場合は、in situのハイブ
リダイゼーションでは蛍光顕微鏡で見ることができる
〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80,4045−4049（1983）〕。

実験例実施例１（１）一次プローブの調製一本鎖調製用のベクターpUCf1（ファルマシア社）
（第２図）をEcoR I消化したのち、65℃で15分間加熱
後、アルカリ性ホスファターゼ処理を行った。ついでフ
ェノール抽出及びエタノール沈殿によりこれを精製し
て、ベクター断片（第２図）とした。

次に、酵母のトリプトファン遺伝子を含むプラスミド
YRp7〔Gene,８,17−24（1979）〕（第２図）をEcoR I
消化したのち、アガロース電気泳動によりトリプトファ
ン遺伝子を含む小さい断片（第２図）を得た。

ついで、上記二つの断片（、）をDNAリガーゼ処
理して結合後、この断片を用いて、E.coli NM522（ファ
ルマシア社）を形質転換した。ここで得られた所望形質
転換体（pUCf1に酵母のトリプトファン遺伝子が１個挿
入されたもの）にファージM13K07を感染させ、ファルマ
シアのプロトコールに従って検出すべき塩基配列に相補
的な塩基配列を含む一本鎖DNA（以下、ssDNAということ
がある。）を得た（一次プローブ）。すなわち、一晩培
養したNM522形質転換体（250μ）をＬ−培地（10ml）
に接種し、菌体濃度が0.7OD（λ550nmでの吸光度）にな
るまで37℃で振とう培養する。これにヘルパーファージ
M13K0（ファルマシア社、５×10¹⁰pfu/ml、1ml）を加
え、37℃で１時間激しく振する。これをＬ−培地（250m
l）に加え、37℃で一晩激しく振盪する。遠心分離（800
0rpm、10分間、４℃）し、上清を得る。これに20％（w/
v）PEG6000および2.5MNaCl（50ml）を加えて、４℃で２
〜４時間放置する。遠心分離（10,000rpm、20分間、４
℃）して、ファージ粒子を集める。ファージ粒子を10mM
Tris・HCl、1mMEDTA、100mM NaCl（pH7.6、20ml）に懇
濁さ、フェノール処理を３回行う。2.5倍量のエタノー
ルを加えて、ssDNAを沈殿として得る。

（２）二次プローブの調製 pUCf1（第３図）をEcoR I及びHindIIIで消化したの
ち、常法に従って小さい断片を得た（第３図）。一
方、pUC18（第３図、ファルマシア社）をEccR I及びH
ind IIIで消化したのち、常法に従って大きい断片を得
た（第３図）。ついで、上記二つの断片（、）を
DNAリガーゼを用いて結合し、これを用いてE.coli NM52
2を形質転換した。そして、pUC18のEcoR I−Hind III切
断除去部位にf1遺伝子が挿入されたベクターpUCRf1を選
択したのち、上記と同様にして一本鎖DNAを調製した。

ついで、この一本鎖DNAに1.2当量のアダプターオリゴ
ヌクレオチドTTACGAATTCGAGC（EcoR I切断用）及びATGC
AAGCTTGGCA（Hind III切断用）を加え、EcoR IおよびHi
nd IIIで消化することにより、pUCRf1よりf1部分の遺伝
子を除去した。

このようにして得た一本鎖直線状DNA（100μｇ）に0.
25Mビラジン−0.25M亜硫酸水素ナトリウム水溶液（pH7.
0、2mMヒドロキノンを含む:250μ）を加えて、37℃で
２時間反応を行った。ついで、反応液のゲル過（Bio
−Gel^RA−50m、0.7×15cm、10mMトリス緩衝液、1mM EDT
A、pH7.5）により試薬を除去し、ついでエタノール沈殿
操作によりDNAを粉末として回収した。これに1Mリン酸
ナトリウム緩衝液（pH7.0、50μ）と10mMトリス緩衝
液及び1mM EDTA（pH7.5、50μ）を加えて、37℃で14
時間放置した。ついで、上記と同様にゲル過を行い、
リン酸ナトリウムを除去後、エタノール沈殿によってDN
Aを粉末として回収した。

ついで、これに1M炭酸水素ナトリウム水溶液（20μ
）、ビオチンコハク酸イミドエステルのジメチルホル
ムアミド（DMF）溶液（40μg/μ、50μ）およびH₂O
（180μ）を加えて、室温で２時間反応を行った。こ
の溶液をゲル過により精製して、ビオチンで標識化さ
れた一本鎖DNA（プローブＡ）を得た（二次プロー
ブ）。

また、同様にしてプローブＤも得た。さらに、上記で
得られたssDNAをラベザイム−POD（和光）を用いて標識
化して、プローブＤおよびＥを得た。プローブＡ〜Ｆ
は、下記の通りのものである。

A: pUCf1Tより得られたssDNAをNH₂NH₂−NaHSO₃法でシ
トシン残基をアミノシトシンに変換し、さらにビオチン
化したもの。

B: pUCf1より得られたssDNAをEcoR IおよびHind IIIア
ダプターを用いてEcoR IおよびHind IIIで切断し、Ａと
同様にしてビオチン化したもの。

C: ハイブリダイゼーションの際にＡとＢのプローブを
等量ずつ混ぜたもの。

D: pUCf1Tより得られたssDNAをラベザイム−POD（和
光）を用いて標識したもの。

E: pUCf1より得られたssDNAをＤと同様にして標識した
もの。

F: ハイブリダイゼーションの際ＤとＥのプローブを等
量ずつ混ぜたもの。

（３）サザンブロッティング標的DNAとしてプラスミドYRp7を用いた〔Gene ８,17
−24（1979）〕。このプラスミドは、酵母のトリプトフ
ァン遺伝子（EcoR I−EcoR Iフラグメント）およびpBR3
22由来の遺伝子を含んでいる。プラスミドYRp7をEcoR I
で切断し、Carrier DNA（Sheared herring sperm DNA、
10μｇ）と一緒に10ngを１％アガロース電気泳動にかけ
た。常法通り、サザンブロッティングによりDNAをニト
ロセルロースフィルターに移した。このニトロセルロー
スフィルターをハイブリダイゼーション用とした。

（４）ユニバーサルプローブを用いたハイブリダイゼー
ション実験（３）で得られたニトロセルロースフィルターを
用い、上記のそれぞれのプローブでハイブリダイゼーシ
ョンを行なった。ハイブリダイゼーションの条件は常法
に従い〔B.D.HamesおよびS.S.Higgins:Nucleic acid hy
bridisation.IRL（1985）〕、プローブはそれぞれ２μ
ｇずつ使用した。Ａ〜Ｃはハイブリダイゼーション後BR
L社のDNA Detection Systemを用いて発色を行い、Ｄ〜
Ｆはラベザイム−PODセット（和光）を用いて発色を行
った。そのときの結果は、第４図に示す通りであった。

同図は、プラスミドYRp7をEcoR Iで切断してアガロー
スゲル電気泳動を行ったあとのサザンブロットハイブリ
ダイゼーションの結果を示すものである。大きい方のフ
ラグメントはおよそ4360bpであって、pBR322のシークエ
ンスである。小さい方はおよそ1450bpであって、酵母の
トリプトファンの遺伝子である。

pUCf1Tより得られたssDNAは、pBR322に相補的な部分
と酵母のトリプトファン遺伝子に相補的な部分とを含ん
でいる。それゆえ、同図中において、pUCf1由来のssDNA
をプローブとすると両方のバンドにハイブリダイズする
ことがわかる。また、pUCRf1より得られたssDNAはpBR32
2に相補的な部分のみを含んでいて、大きい方のフラグ
メントのみとハイブリダイズすることがわかる（Ｂ）。
さらに、標識したpUCRf1由来のssDNAと未標識のssDNAと
を等量混ぜてハイブリダイゼーションを行なうと、両方
のバンドを検出することができた（Ｃ）。つまり、標識
したpUCRf1由来のssDNAと未標識のssDNAが二本鎖を形成
し、そのうちの二本鎖を形成しないトリプトファン遺伝
子の部分がニトロセルロースに固定されたトリプトファ
ン遺伝子とハイブリダイズしていることがわかる。本実
験では標識した方のssDNAを直線状としたものを用いた
が、その逆でもかまわないし、両方とも環状のままでも
よい。また、Ａ〜Ｃまでのプローブは NH₂NH₂−NaHSO₃法でビオチン化したものであるが、Ｄ〜
Ｆのようにラベザイム−POD^R等を使っても同様の結果が
得られた。

実施例２（１）一次プローブの調整−実施例１で得られたpUCf1
−Ｔ（ssDNA）を使用した。

（２）二次プローブの調製−実施例１で調製したpUCRf1
（ssDNA）を各種のアルキレンジアミンとのトランスア
ミネーション反応に付した後にビオチン化した。トラン
スアミネーションは、次の通り実施した。

一本鎖DNA（約50μｇ）に1Mアルキレンジアミン（NH₂
−（CH₂）_ｎ−NH₂。ｎは２から６まで）、1M亜硫酸水素
ナトリウム水溶液（pH6.5、1mg/mlヒドロキノンを含
む。400ml）を加えて42℃で１日から３日間反応させ
る。次で、反応液をゲル過し、試薬を除く。エタノー
ル沈澱作用により、DNAを粉末として回収する。これに
ついて、実施例１で示した方法でビオチン化を行った。

このようにした得たプローブは、次の通りである。

プローブG:pUCf1−Ｔ（ssDNA）をNH₂−（CH₂）_２−NH
₂でトランスアミネーション後、ビオチン化。

プローブH:pUCf1−Ｔ（ssDNA）をNH₂−（CH₂）_３−NH
₂でトランスアミネーション後、ビオチン化。

プローブI:pUCf1−Ｔ（ssDNA）をNH₂−（CH₂）_４−NH
₂でトランスアミネーション後、ビオチン化。

プローブJ:pUCf1（ssDNA）をNH₂−（CH₂）_６−NH₂で
トランスアミネーション後、ビオチン化。

プローブK:pUCRf1（ssDNA）をNH₂−（CH₂）_２−NH₂で
トランスアミネーション後、ビオチン化。

プローブL:pUCRf1（ssDNA）をNH₂−（CH₂）_３−NH₂で
トランスアミネーション後、ビオチン化。

プローブM:pUCRf1（ssDNA）をNH₂−（CH₂）_４−NH₂で
トランスアミネーション後、ビオチン化。

プローブN:pUCRf1（ssDNA）をNH₂−（CH₂）_６−NH₂で
トランスアミネーション後、ビオチン化。

（３）サザンブロッティング酵母DNA 50ngをEcoR Iにて切断後、0.8％アガロース
電気泳動で分離し、常法に従ってニトロセルロースフィ
ルターにブロッティングした。

（４）ハイブリダイゼーションプローブＧ、Ｈ、ＩおよびＪによるハイブリダイゼー
ションは、実施例１と同様に行った。ユニバーサルプロ
ーブによるハイブリダイゼーションは、次の通り実施し
た。フィルターを一次プローブ（pUCf1−Ｔ）でハイブ
リダイズした後、液をすて、二次プローブ（プローブ
Ｋ、Ｌ、ＭおよびＮ）を加えて、一次プローブのハイブ
リダイゼーションと同様の条件でハイブリダイズさせ
た。検出方法は実施例１と同様である。その結果は、次
の通りであった。プローブＧ、Ｈ、ＩおよひびＪによる
直接ハイブリダイゼーションにおいても、ユニバーサル
プローブ（プローブＫ、Ｌ、ＭおよびＮ）を使った場合
でも、1.45kbpの位置にtrp遺伝子由来のバンドを検出す
ることが出来た。

実施例３オリゴヌクレオチド（TTTCTTT）を各種のアルキレン
ジアミンとのトランスアミネーションに付した後、ビオ
チン化又はFITC化を行ない、HPLC分析にて反応効率が測
定した。

（１）トランスアミネーションオリゴヌクレオチド（TTTCTTT、0.10D）と実施例２と
同様の方法で１、３および７日間反応させ、反応後、試
薬をゲル過｛「セファデックスG50」（ファルマシア
社））20mM TEAB｝にて除去し、凍結乾燥した。

（２）標識化ビオチンにより標識化は実施例１に従って実施した。
FITCによる標識化は、次の通りに行った。オリゴヌクレ
オチド溶液（30μ）に1M NaHCO₃/Na₂CO₃ pH9.0溶液
（30μ）及びFITCのジメチルホルムアミド溶液（100
μg/ml、15μ）及び水（225μ）を加え、室温で５
時間反応させ、ゲル過（「セファデックスG50」、20m
M TEAB緩衝液）にて精製し、凍結乾燥した。

（３）HPLC分析カラムはμ−Bondapak C18（Waters社）を使用し、次
の条件で分析した。

Ａ液:50mM TEAA、pH7.2。Ｂ液:CH₃CN（50mM）:TEAA
（pH7.2）＝1:1。Ｂ液濃度:10％→35％（20min）流量2m
l/min オリゴヌクレオチドを上記条件で分析したところ、第
５図Ａに示したように１本のピークが得られた。次に、
オリゴヌクレオチドを４種のアルキレンジアミンとのト
ランスアミネーションに対したものを分析した結果、ヘ
キサメチレンジアミンでは、原料ピーク（peak I）とア
ノミ化オリゴヌクレオチドのピーク（peak II）がみら
れた。他のアルキレンジアミンではピークは１本である
（第５図Ｅおよび第５図Ｂ、Ｃ、Ｄ）。トランスアミネ
ーションに付した他のオリゴヌクレオチドをビオチン化
した後、HPLCにて分析すると、第６図に示した結果が得
られた。オリゴヌクレオチドをビオチン化しても分析パ
ターンは変らないが（第６図Ａ）、エチレンジアミン、
プロピレンジアミンおよびテトラメチレンジアミンとの
トランスアミネーション産物では、オリゴヌクレオチド
と同位置にみられたピークが減少し、ビオチン化オリゴ
ヌクレオチドによるピークがみられた（第６図Ｂ、Ｃ、
Ｄ）。ヘキサメチレンジアミンとのトランスアミネーシ
ョン産物をビオチン化した場合には、アミノ化オリゴヌ
クレオチドのピークが無くなり、ビオチン化オリゴヌク
レオチドのピークがみられ、アルキレンジアミンにより
アミノ化されたシトシンはビオチン活性エステルにより
修飾が可能であった。各ピークの面積比によりトランス
アミネーション反応の効率を比較すると、アルキレン基
の長さに比例してトランスアミネーションの速度は遅く
なることが解った。ビオチン活性エステルの代りにFITC
でアミノ化オリゴヌクレオチドを修飾したところ、FITC
化の効率は、ビオチン化と同程度で良好であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明に係る一次プローブ調製法の一具体例
のフローチャートである。第２図は、プラスミドpUCf1T調製のためのフローチャー
トである。第３図は、プラスミドpUCRf1調製のためのフローチャー
トである。第４図は、ハイブリダイゼーション後、発色操作を行っ
たときの結果を示す説明図である。第５図は、アルキレンジアミンとのトランスアミネーシ
ョンに付したオリゴヌクレオチドのHPLC分析結果を示し
たチャートである。いずれも、縦軸はピーク高さを、横
軸は溶出時間を、それぞれ示す。 A:オリゴヌクレオチドのHPLCチャート。 B:オリゴヌクレオチドとエチレンジアミンとのトランス
アミネーション産物のチャート。 C:オリゴヌクレオチドとプロピレンジアミンとのトラン
スアミネーション産物のチャート。 D:オリゴヌクレオチドとテトラメチレンジアミンとのト
ランスアミネーション産物のチャート。 E:オリゴヌクレオチドとヘキサメチレンジアミンとのト
ランスアミネーション産物のチャート。第６図は、アミノ化オリゴヌクレオチドをビオチン化し
た後のHPLCの分析チャートである。 F:オリゴヌクレオチドをビオチン化したもののチャー
ト。 G:エチレンジアミンでアミノ化したオリゴヌクレオチド
をビオチン化したもののチャート。 H:プロピレンジアミンでアミノ化したオリゴヌクレオチ
ドをビオチン化したもののチャート。 I:テトラメチレンジアミンでアミノ化したオリゴヌクレ
オチドをビオチン化したもののチャート。 J:ヘキサメチレンジアミンでアミノ化したオリゴヌクレ
オチドをビオチン化したもののチャート。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の工程Ｉ（（イ）〜（ホ））から得ら
れる一本鎖ポリヌクレオチドと工程II（（ヘ）〜
（チ））から得られる一本鎖ポリヌクレオチドが前者の
一部が一本鎖の状態で残るようにハイブリダイズするこ
とによって形成された、一本鎖ポリヌクレオチド部分の
鎖中の一部に有する二本鎖構造ポリヌクレオチドからな
り、各鎖を下記の事項III（（リ）〜（ヲ））のように
構成したことを特徴とする、ポリヌクレオチド検出用プ
ローブ。工程Ｉ（イ）検出対象ポリヌクレオチドの塩基配列（以下、標
的配列という）と相補的な構造遺伝子を含む遺伝子を用
意すること。（ロ）バクテリオファージIG（intergenic）領域をコー
ドする遺伝子であってその遺伝子以外の部分に標的配列
と相補的な構造遺伝子を含む遺伝子を結合させ得るも
の、を含み、かつ予定した宿主内で増殖可能な一本鎖DN
A調製用プラスミドを用意すること。（ハ）標的配列と相補的な遺伝子を含む遺伝子と上記プ
ラスミドとを用いて、予定した宿主細胞内で増殖可能な
組換体DNAを調製すること。（ニ）この組換体DNAを用いて宿主細胞の形質転換を行
なって、形質転換体を調製すること。（ホ）この形質転換体をヘルパーファージで感作させ、
培養した後、目的とする一本鎖ポリヌクレオチドを回収
すること。工程 II （ヘ）工程Ｉの（ロ）で用意したベクターのIG領域をコ
ードする遺伝子の塩基配列が逆向きに設定されているこ
と以外は同様な一本鎖DNA調製用プラスミド、を用意す
ること。（ト）上記プラスミドを用いて宿主細胞の形質転換を行
なって、形質転換体を調製すること。（チ）この形質転換体をヘルパーファージで感作させ、
培養した後、目的とする一本鎖ポリヌクレオチドを回収
すること。事項 III （リ）一本鎖ポリヌクレオチド部分の少なくとも一部
が、標的配列と相補的な塩基配列を有していて該検出対
象ポリヌクレオチドとハイブリダイズしうるようになっ
ていること。（ヌ）二本鎖構造ポリヌクレオチド部分のポリヌクレオ
チド鎖が標識部分を有すること。（ル）二本鎖構造ポリヌクレオチド部分の塩基配列は、
両鎖が少なくともハイブリダイズしうる程度に相補的な
ものであること。（ヲ）二本鎖構造は、上記一本鎖ポリヌクレオチド部分
と検出対象ポリヌクレオチドとがハイブリダイズするこ
とによって実現されるポリヌクレオチドの検出に際し
て、このハイブリダイズの時点、それより前あるいはそ
れより後に形成させたものであること。
【請求項２】標識が非放射性のものである、特許請求の
範囲第１項に記載のポリヌクレオチド検出用プローブ。
【請求項３】標識が二本鎖構造ポリヌクレオチド部分の
一方のポリヌクレオチド鎖にある、特許請求の範囲第１
〜２項のいずれか１項記載のポリヌクレオチド検出用プ
ローブ。
【請求項４】標識物質が、ポリヌクレオチド鎖の構成ヌ
クレオチドの塩基部分に設けられている、特許請求の範
囲第１〜３項のいずれか１項記載のポリヌクレオチド検
出用プローブ。
【請求項５】標識部分が、ポリヌクレオチド鎖の構成ヌ
クレオチドのアミノ基含有塩基部分のピリミジン環また
はプリン環に下式（１）の構造をもって結合されてい
る、特許請求の範囲第４項記載のポリヌクレオチド検出
用プローブ。Ｂ−Ｘ−Ｌ（１）（ここで、記号は、下記の意味を持つ。 B:塩基部分のピリミジン環またはプリン環。 L:標識物質残基。 X:−NH−または−Ｓ−。ただし、これらは、ピリミジン
環またはプリンに結合していた前記アミノ基に対応ない
しこれを置換して存在するものである。）
【請求項６】Ｘが−NH−である、特許請求の範囲第５項
記載のポリヌクレオチド検出用プローブ。
【請求項７】標識部分が、ポリヌクレオチド鎖の構成ヌ
クレオチドのアミノ基含有塩基部分のピリミジン環また
はプリン環に下式（２）の構造をもって結合されてい
る、特許請求の範囲第４項記載のポリヌクレオチド検出
用プローブ。Ｂ−Ｘ−R_n−Ｘ′_ｍ−Ｌ（２）（ここで、記号は下記の意味を持つ。 B:塩基部分のピリミジン環またはプリン環。 X:−NH−または−Ｓ−。ただし、これらはピリミジン環
またはプリン環に結合していた前記アミノ基に対応ない
しこれを置換して存在するものである。 R:炭素数10までのアルキレン鎖。 n:0または１。Ｘ′:Xと同一または異なる−NH−または−Ｓ−。 m:0または１。 L:標識物質残基。）
【請求項８】式（２）の構造が、下式（２′）の二官能
性化合物の一方の官能基Ｘ−Ｈとピリミジン環またはプ
リン環に結合しているアミノ基との交換反応によって下
式（２″）の中間体を形成させ、その後のこの中間体の
官能基Ｘ′−Ｈと標識物質供給源化合物との反応によっ
て形成させたものである、特許請求の範囲第７項記載の
ポリヌクレオチド検出用プローブ。Ｈ−Ｘ−R_n−Ｘ′_ｍ−Ｈ（２′）Ｂ−Ｘ−R_n−Ｘ′_ｍ−Ｈ（２″）（ここで、記号の定義は前記の通り）
【請求項９】Ｘが−NH−、R_nがCH₂ _ａ（ａは０〜
８）、Ｘ′_ｍが−NH−である、特許請求の範囲第７〜８
項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド検出用プロ
ーブ。
【請求項１０】Ｂがシトシンのピリミジン環である、特
許請求の範囲第４〜９項のいずれか１項記載のポリヌク
レオチド検出用プローブ。