JP5146785B2 - 酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸誘導体 - Google Patents
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Description
(式(1)中、Aは、グルタミン(Gln)残基を有する置換基、Bは水素原子またはヒドロキシル基を表す。)
(式(2)中、A1およびA2のうち少なくとも1つは、グルタミン(Gln)残基を有する置換基で残りは水素原子を表し、Bは水素原子またはヒドロキシル基を表す。)
(式(3)中、Aは、グルタミン(Gln)残基を有する置換基、Bは水素原子またはヒドロキシル基を表す。)
(式(4)中、Aは、グルタミン(Gln)残基を有する置換基、Bは水素原子またはヒドロキシル基を表す。)
(式(5)中、XおよびYは、それぞれ独立して2価の連結基を表し、Zは、置換基を表し、Bは水素原子またはヒドロキシル基を表す。)
本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体は、グルタミン(Gln)残基を有する。グルタミン(Gln)残基を有するヌクレオシド三リン酸誘導体としては、グルタミン(Gln)残基を有する、ウリジン三リン酸(uridine triphosphate:UTP)誘導体、アデノシン三リン酸(adenosine triphosphate:ATP)誘導体、グアノシン三リン酸(guanosine triphosphate:GTP)誘導体、シチジン三リン酸(cytidine triphosphate:CTP)誘導体、デオキシウリジン三リン酸(deoxyuridine triphosphate:dUTP)誘導体、デオキシアデノシン三リン酸(deoxyadenosine triphosphate:dATP)誘導体、デオキシグアノシン三リン酸(deoxyguanosine triphosphate:dGTP)誘導体、デオキシシチジン三リン酸(deoxycytidine triphosphate:dCTP)誘導体などが挙げられる。本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体において、グルタミン(Gln)残基は、例えば、ウラシル、アデニン、グアニン、シトシンの部分に直接または置換基を介して結合されている。
(式(1)中、Aは、グルタミン(Gln)残基を有する置換基、Bは水素原子またはヒドロキシル基を表す。)
(式(2)中、A1およびA2のうち少なくとも1つは、グルタミン(Gln)残基を有する置換基で残りは水素原子を表し、Bは水素原子またはヒドロキシル基を表す。)
(式(3)中、Aは、グルタミン(Gln)残基を有する置換基、Bは水素原子またはヒドロキシル基を表す。)
(式(4)中、Aは、グルタミン(Gln)残基を有する置換基、Bは水素原子またはヒドロキシル基を表す。)
(式(5)中、XおよびYは、それぞれ独立して2価の連結基を表し、Zは、置換基を表し、Bは水素原子またはヒドロキシル基を表す。)
本実施形態に係るTGase基質マルチラベル化核酸は、構成単位として、例えば式(1)〜(5)で示されるTGase基質ラベル化ヌクレオシド三リン酸誘導体を調製したのち、このTGase基質ラベル化ヌクレオシド三リン酸誘導体が複数個導入されているTGase基質マルチラベル化核酸であり、核酸部分が、検出対象である標的核酸の標的分子特異的配列の全部または一部に相補的な配列を有するものである。
本実施形態に係るマルチラベル化核酸プローブは、上記核酸プローブにおける構成単位であるヌクレオシド三リン酸誘導体のグルタミン(Gln)残基のうち少なくとも2つに、リシン(Lys)残基または第一級アミンを有し標識部分を含む標識化合物が結合されて構成されたものである。マルチラベル化核酸プローブは、例えば、MTGなどのTGaseを用いて、MTG認識GlnなどのTGase認識Glnが複数箇所に導入された核酸プローブZ−QG RNAに、TGase認識Lysを導入した標識酵素などを結合させることによって、RNAと標識酵素などの標識部分が1:nであるマルチラベル化核酸プローブを創製することができる(図2)。
(1)TGaseの由来を変える。
(2)TGaseの基質特異性を変える。
NK14−PfuAPとは、MKHKGGGSGGGSGSの配列を有するアミノ酸14残基からなる付加配列を遺伝子工学的にPfuAPのN末端に、精製用タグをC末端に導入したものである。PfuAPの発現ベクターは香川大学櫻庭春彦教授より委譲頂いた。PCRによりPfuAPをコードする領域を増幅する際、それぞれのタグが導入されるようにタンパク質発現用ベクターpET22に組換え、大腸菌BL21株を形質転換した。アンピシリンを含むLB培地にて前培養、本培養を経て、得られた形質転換体を遠心分離により収菌し、25mM TBSで2回洗浄した。得られた菌体を凍結・融解させた後、超音波処理により細胞を粉砕し、遠心分離により可溶性画分を回収した。超高熱菌由来のPfuAPは高温条件下でも安定であるので、得られた無細胞抽出液を80℃で30分処理し、他のタンパク質を沈殿させることによって粗精製を行った。粗精製後、遠心分離・フィルター濾過によって上澄みを回収し、His−tagカラムによって精製した。精製後、限外濾過による濃縮を行い、PD−10カラムを用いて溶媒を10mM Tris−HCl(pH8.0)へと置換し、実験に供するまで凍結保存した。
・対象となる標識酵素は、TGaseが認識可能なLys残基または第一級アミンを有する酵素、TGaseが認識可能なLys残基または第一級アミンを導入することができるあらゆる酵素を包含する。また、インテインのような大きなタンパク質性タグを必要としない。
・酵素の修飾部位は、C末端に限定されない。TGase活性なLys残基が存在するか、そのようなLys残基を有するタグを導入することができる部位であれば、修飾可能である。
・C末端、N末端に加え、loop領域のようなタンパク質構造中の揺らぎの大きな部位も修飾対象となりうる。
・結合する核酸の塩基配列および長さには、特に制限がない。
本実施形態に係る標的核酸の検出方法は、構成単位として例えば上記式(1)〜(5)で示されるヌクレオシド三リン酸誘導体が複数個導入されている核酸である核酸プローブにおけるグルタミン(Gln)残基のうち少なくとも2つに、リシン(Lys)残基または第一級アミンを有する標識酵素などの標識化合物が結合されて構成されているマルチラベル化核酸プローブであって、標識部分が容易に検出可能な性質を有し、かつ核酸部分が標的核酸に特異的に結合可能な塩基配列を有するものであるマルチラベル化核酸プローブを準備し、マルチラベル化核酸プローブと対象物中に存在する標的核酸とを核酸部分により特異的に結合させ、結合しているマルチラベル化核酸プローブを、酵素部分などの標識部分により検出する工程を含む。
(a)基材表面に固定化された核酸、
(b)固定化された固定化核酸の全部または一部に相補的な配列(固定化核酸相補的配列)、および標的核酸に特異的に結合可能な配列(標的核酸特異的配列)を有するアプタマ核酸、
(c)構成単位として上記式(1)で示されるヌクレオチド誘導体が複数個導入されている核酸である核酸プローブにおけるグルタミン(Gln)残基のうち少なくとも2つに、リシン(Lys)残基または第一級アミンを有する標識酵素などの標識化合物が結合されて構成されているマルチラベル化核酸プローブであって、標識部分が容易に検出可能な性質を有し、及び/又は核酸部分がアプタマ核酸の標的核酸特異的配列の全部または一部に相補的な配列を有するものであるマルチラベル化核酸プローブ、
を準備し、
(A)固定化核酸に、アプタマ核酸を供し、固定化核酸とアプタマ核酸の固定化核酸相補的配列を有する部分とをハイブリダイズさせることにより、アプタマ核酸を固定化し、
(B)固定化された固定化アプタマ核酸に、標的核酸を含む標的分子を含む可能性のある試料を供し、標的分子が存在する場合には標的核酸とアプタマ核酸の標的核酸分子特異的配列を有する部分とを結合させ、かつ上記マルチラベル化核酸プローブを供し、標的分子が存在しない場合にはマルチラベル化核酸プローブの核酸部分とアプタマ核酸とをハイブリダイズさせることにより、タンパク質を固定化し、
(C)固定化された酵素部分の有無またはその量を酵素の性質に基づいて検出することにより、試料中の標的分子を検出する工程を含む。
<Z−QG−UTPの合成・精製>
Z−QG−UTPの合成スキームは、図3に示す通りである。
<センス鎖RNA、アンチセンス鎖RNAの調製>
RNA polymeraseにより転写を行うことによって、センス鎖RNA、アンチセンス鎖RNAを調製した。標的核酸(ターゲット)としては、マウス中にて発現パターンが既知であるSonic hedgehog(SHH)というタンパク質をコードするmRNA(shh)をモデルとした。そこでまず、SHHをコードした遺伝子を含むプラスミドをテンプレートとしてPCRを行い、長さ約1000bpのDNA断片を得た。この際、上流にはT3プロモータ、下流にはT7プロモータが含まれるようにプライマー設計を施した。次に得られたPCR産物を基に、T3 polymerase(センス鎖(S) 調製用)を用いてRNA合成を行い、T3 polymeraseで転写反応を行ってセンス鎖配列を調製した(配列番号:24)。同様にT7 polymerase(アンチセンス鎖(AS) 調製用)を用いてRNA合成を行い、T7 polymeraseにで転写反応を行ってアンチセンス鎖配列を合成した(配列番号:25)。条件は以下の表3に示す。反応は37℃で2時間行い、得られたセンス鎖RNA、アンチセンス鎖はエタノール沈殿によって回収し、TEバッファー20μLで縣濁した。RNase inhibitorとDTTを添加し、RNaseによる分解を抑えた。
転写反応後、Nano DropにてRNA濃度を測定した。その結果、センス鎖は1019ng/μL、アンチセンス鎖は815ng/μLであった。
Alkphos Direct(商標、GEヘルスケアバイオサイエンス社製)のキットに付随する試薬にて標識プローブを調製した。まず、上述したアンチセンス鎖RNAを滅菌水を用いて10ng/μLに希釈したもの60μL(総量600ng)を99.9℃で熱変性後、急冷した。キットに添付されているReaction buffer 60μL、Labeling reagent 12μL、Cross−linker溶液60μLの順に熱変性後のRNAに添加し、37℃で30分間インキュベートし、標識プローブを作製した。
まず、ターゲットとなるセンス鎖RNA、アンチセンス鎖RNAを1pg/μL〜50ng/μlの6段階の濃度に滅菌水を用いて希釈したものを、それぞれ1μLずつプラスのチャージを持つメンブレン(Hybond N+、GEヘルスケアバイオサイエンス社製)にアプライした。その後、80℃で2時間ベーキングした。
上記検出用メンブレンの作製で作製したメンブレンをキットに添付されているハイブリダイゼーションバッファーに移し、55℃で15分間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、上述した標準プローブを濃度が50ng/mLとなるように添加して55℃で一晩(14時間〜16時間程度)ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション後、メンブレンをWashIバッファー(表4)に移し、55℃で振とうしながら15分洗浄した。この操作を2回繰り返した。その後、WashIIバッファー(表5)にて洗浄した。この操作を2回繰り返した。
NTMTxバッファー(表6)で室温(実験した日は18〜22℃程度)、5分間洗浄したメンブレンをStaining溶液(375μg/mL NBT+188μg/mL BCIP in NTMTx)に移し、室温で2時間、遮光下で発色させた。なお、NBTとは、Nitro blue tetrazolium chlorideの略称であり、BCIPは、5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, toluidine saltのことである。
<TGase基質マルチラベル化核酸の調製>
上記実験1のセンス鎖RNA、アンチセンス鎖RNAの調製に加え、表7、表8に準じてTGase基質マルチラベル化核酸もT7 polymeraseを用いて同様に調製した。調製後、DNaseIで処理し、エタノール沈殿でRNAを濃縮・精製してTEバッファー20μLにて縣濁した。また、RNase inhibitorとDTTも添加し、新規酵素マルチラベル化核酸プローブを作製した。
転写反応後、Nano DropにてRNA濃度を測定した。以下に測定結果を示す。なお、表8中の○数字を以下括弧数字で表示する。
(1)Z−QG−UTP 0%:410ng/μL
(2)Z−QG−UTP 20%:424ng/μL
(3)Z−QG−UTP 40%:378ng/μL
(4)Z−QG−UTP 60%:368ng/μL
(5)Z−QG−UTP 80%:311ng/μL
(6)Z−QG−UTP 100%:256ng/μL
Z−QG−UTPを異なる割合で取り込んだTGase基質マルチラベル化核酸を99.9℃で5分間熱変性後、急冷した。熱変性した核酸を用いて表9の条件となるように反応溶液を調製し、4℃で6時間反応させて酵素マルチラベル化プローブを作製した(配列番号:23)。
検出は発色時の温度を室温(実験した日は18〜22℃程度)と50℃に設定し、それ以外の操作は実験1の発色法による検出操作に準じて行った。その結果、酵素マルチラベル化核酸プローブを用いてAlkphos Directのプロトコールに準じて検出した結果を図8に示した。室温で発色反応を行った場合には、Z−QG−UTPの割合が20〜40%のプローブでは10ng/μLまで、Z−QG−UTPの割合が60〜100%のプローブでは1ng/μLのドットまで検出することができた。また、50℃で発色反応を行った場合では、Z−QG−UTPの割合が20%では10ng/μL、40〜60%では1ng/μL、80〜100%では100pg/μLのドットまで検出できた。
[PfuAPマルチラベル化RNAプローブの調製および機能評価]
細胞組織内での遺伝子発現パターンが既知であるソニックヘッジホッグ遺伝子(shh)をターゲットのmRNAとする。まず、PCRによってshhをコードするDNA断片(約1000bp)を得た。この際、遺伝子の上流側にはT3プロモーター、下流側にはT7プロモーターが含まれるようプライマー設計を施した。次に、得られたPCR産物を基にT7Polymeraseを用いて転写反応を行った(表10)。この際、UTPの代わりに、実験1で合成したZ−QG−UTPを様々な割合(0〜100%)にて加えることで、導入率の異なるZ−QG RNAを調製した。得られたZ−QG RNAはエタノール沈殿によって回収し、アガロースゲル電気泳動およびマイクロチップ型電気泳道装置(Bio−Rad,Experion)により評価した。
遺伝子工学的手法により、N末端にMTGが認識するKを含んだペプチドタグ(MKHK(GGGS)2GS)を導入したNK14−PfuAPが、MTGによってZ−QG RNAと結合するか検討するために、まず、様々な割合のZ−QG−UTPを用いて調製したZ−QG RNAを、99.9℃まで加熱した後、急冷することによって、変性処理を行った。続いて、100mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝液中にて、各種Z−QG RNA50μg/mL、NK14−PfuAP 0.4mg/mL、MTG5.0U/mL、RNase inhibtor 1.0U/μLの条件下にて、6時間反応を行った。コントロールとして、MTG未添加の場合にも同様の操作を行い、反応はアガロースゲル電気泳動によって評価した。
shh S(ターゲット)をメンブレン上に固定化し、PfuAPマルチラベル化核酸プローブ(shh アンチセンス、AS)を用いて検出を試みた。まず、未標識shh S(T3 Polymeraseにより調製)の希釈系列(50ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1mg/μL)を調製し、メンブレンに1μLずつスポットし、オーブンにて固定した(80℃、2時間)。その後、表11に示す操作を行い、PfuAPマルチラベル化プローブを用いてshh Sの検出を行った。コントロールとして、shh AS鎖を同様にして固定化したメンブレンを調製し、これを用いて行った。尚、溶液の組成は表12に記す。
UTPとZ−QG−UTPの割合を変化させてRNAを調製した際の結果を、図9の(A)、(B)に示す。結果より、いずれの条件においてもRNAの合成に成功していることから、合成したZ−QG−UTPは、比較的良好な基質として、T7 Polymeraseに認識されることが分かる。また、Z−QG−UTPの割合増加とともに高分子量側へとシフトしていることから、Z−QG−UTPの濃度を変化させることによって、Z−QG RNAへのZ−QG−UTP導入量が調節可能である。
それぞれ導入量の異なる、Z−QG RNAに対して、MTGを用いてPfuAPラベル化を行った際の結果を図10に示す。Lane2はMTG未添加時、Lane3はMTG添加時の結果である。20%〜100%の条件では、MTG添加時において高分子量側へのシフトが見られるが、Z−QG−UTPが0%の際には確認されないために、導入したZ−QG特異的にZ−QG−UTPがラベル化されたことが分かる。また、Z−QG導入量の増加とともに高分子量側へのシフトも大きくなっていることからZ−QG−UTPの割合を変化させることによって、プローブのPfuAPのラベル化量が制御可能である。
調製したPfuAPマルチラベル化RNAプローブの核酸プローブとしての機能について検討するためにドットブロットを行った(図11)。AS(アンチセンス)鎖をメンブレンに固定化した際にはスポットが確認されないことから、塩基配列特異的な検出ができている。20〜100%導入プローブにおいて1ng/μLのセンス鎖の検出が可能であった。以上のことから、転写反応時のZ−QG−UTP濃度を変化させることによって、得られる修飾RNA中のZ−QG導入量、その後のMTGによるPfuAPラベル化量が制御可能なことが示された。なお、実施例1とは異なり、Z−QG導入量増加に伴う検出感度向上は確認されなかった。この理由としては、上記表11,12に示す様に、ハイブリダイズ条件および洗浄条件が、Alkphos Direct条件に比べるとかなり厳しい条件であることが挙げられる。図10に示すようにいずれの場合においても、PfuAPラベル化した際のバンドはブロード化しており、PfuAPが均一に導入されているとは言えない。そのためPfuAPの導入数が少ないプローブ、あるいは未修飾のプローブの方がより強固にターゲット(AS鎖)とハイブリダイズするため、いずれの場合においても同等の感度となったのではないかと推察される。また、PfuAPの導入に伴うプローブの二本鎖形成能低下の可能性も、その一因として挙げられる。
本発明における核酸プローブにラベル化されたPfuAPは、室温よりも高温条件でより高い触媒活性を発現する。そこで、表11の酵素発色条件時の反応温度を、室温から50℃に上げた場合の検出感度を評価した。酵素ラベル化核酸プローブとしての性能を評価するため、まず、Alkphos Directキットにより得られる酵素標識核酸プローブと、本発明のPfuAPラベル化核酸プローブの性能比較を、ISH条件において検討した。実験は、酵素標識核酸プローブをキットにより調製する以外は、上述同様の操作によりドットブロットを行った。その結果、1ng/μLのセンス鎖の検出が可能であった(図12)。このことから、今回新たに調製されたPfuAPマルチラベル化核酸プローブは、ISH条件下において、市販のAlkphos Directにより調製されたプローブと同等の検出感度を有するプローブとして利用できることが示唆された。そこでは、最終的に核酸を検出するステップ、すなわち、酵素(アルカリホスファターゼ)部位による発色反応における温度を室温で行っていた。一方、本発明の核酸プローブにラベル化されたPfuAPは、室温よりも高温条件でより高い触媒活性を発現する。そこで、表10の酵素発色条件時の反応温度を、室温から50℃に上げた場合の検出感度を評価した。その結果、図13に示すように、検出限界はZ−QG導入割合により異なり、Z−QG80%、100%で100pg/μLから1ng/μL、Z−QG60%においては10pg/μLの核酸を検出することが可能であり、上述した実験1のAlkphos Directプローブを用いた場合(1ng/μL)より、少なくとも2桁程度、検出感度の向上が可能なことが明らかとなった。
<aminoallyl−UTPの吸光係数算出(@290nm)>
aminoallyl−UTPをTE Buffer(pH8.0)に溶解した後、0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mMとなるように調製し、吸収スペクトル測定を行った(図14)。スペクトルより290nmの吸光度を算出し検量線を作成した(図15)。尚、図14のスペクトルは、スペクトルチャートの吸収感度の一番高いのが0.1mMであり、以下順に0.08mM、0.06mM、0.04mM、0.02mM、0mMと吸収感度が下がっている。
HPLCによる精製後、凍結乾燥によって溶媒を除去し、滅菌水(2mL)に溶解した。その後、Speed vacを用いて濃縮した(この際、析出物が見られたため、未反応のZ−QGが析出していると考えられる。濃縮に伴いaminoallyl−UTPと同形のスペクトルは増加したため、Z−QG−UTPの析出ではないと考える)。濃縮後、上清を回収し、TE bufferによって10倍希釈した後、Nano Drop(光路長:1mm)を用いて吸光度測定を行った所、吸収度ABS=1.061であった。したがって、希釈前のZ−QG−UTP濃度Cは次式により算出される。
1.061=6860[M−1cm−1]×0.1[cm]×C/10
したがって、C=約15.5[mM]である。
[Z−QG DNAを用いたPfuAPマルチラベル化DNAプローブの調製とドットブロットによる検出感度の評価]
Z−QG DNAを用いたPfuAPマルチラベル化DNAプローブの調製とドットブロットによる検出感度の評価を行った。
まず、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)4mL中にて、100mM N,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、100mM N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、50mM Z−QGを、室温(調製した日は18〜22℃程度)で20時間反応させることによって、NHS化Z−QG(50mM)を調製した。一方、50mM 5−(3−aminoallyl)−dUTP(以下、aminoallyl−dUTPと略記、SIGMA社製)を含む10mM Tris−HCl(pH7.5)溶液(Ambion製)16μLと200mM ホウ酸緩衝液(pH8.8)40μL、滅菌水16μLとを混合し、10mM aminoallyl−dUTP溶液を80μL調製した。この溶液に対して、上記で調製したNHS化Z−QG溶液を80μL添加し、25℃で一晩反応させた。反応終了後、サンプルをMilli−Qで10倍希釈し、HPLC(日本分光製、高速液体クロマトグラフ・ポンプ:TRI ROTAR−V型、バリアブル・ループ・インジェクタ:VL−613型、紫外可視分光検出器:UVIDEC−100−IV型)によって、表13に示す条件で精製を行った。生成物の同定はMALDI TOF−MS(BRUKER DALTONICS製、autoflex III)によって行った。結果を図17に示す。この際、3−ヒドロキシピコリン酸(3−HPA)をマトリックスとして使用した。
まず、マウス由来のSonic hedgehog(SHH)をコードする遺伝子中の約300bp(配列番号:27)をPCR増幅するプライマーを設計した(表14、配列番号:28,29)。PCRのテンプレートにはマウス由来のShhをコードする遺伝子の全配列(約990bp)を組み込んだプラスミドDNAを用い、DNA polymeraseとしてKOD−Fx(TOYOBO社製)を使用して反応液を調製した(表15、表16)。PCR条件は94℃×2分を1サイクル、94℃×20秒、52℃×20秒、72℃×15秒を30サイクルとした。PCR後、アガロース電気泳動で増幅断片を確認した。得られた増幅断片は、MinElute PCR Purification kit(QIAGEN社製)で精製し、Nano DropにてZ−QG DNAの濃度を測定した。
遺伝子工学的にMTGが認識可能なリジン残基(K)を含むペプチドダグを導入したNK14−PfuAPがMTGによってZ−QG DNAに結合するかを、Z−QGの導入量が異なるZ−QG DNAを用いて検討した。まず、100mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝液中にて、各種Z−QG DNA 15ng/μL、NK14−PfuAP 0.4mg/mL、MTG 5.0Unit/mLの条件下で4℃、6時間反応させた。MTG未添加の場合も同様に検討した。PfuAPのラベル化の確認はアガロース電気泳動で行った。
Z−QG−dUTP 50%、100%の条件で調製したZ−QG DNAとNK14−PfuAPをMTGにて結合し、PfuAPマルチラベル化DNAプローブを調製した。まず、各種Z−QG DNAを90℃で5分間熱処理してDNAを一本鎖に変性させた後、100mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝液中にて、各種Z−QG DNA 25ng/μL、NK14−PfuAP 0.4mg/mL、MTG 5.0Unit/mLの条件下で4℃、6時間反応させた(MTG反応前熱処理プローブ)。DNAプローブは熱処理で一本鎖にすることがプローブの検出能に大きく影響することから、熱処理していないZ−QG DNAについても同様の条件でPfuAPのラベル化を行い、その後、90℃で5分間熱処理を施したプローブも調製した(MTG反応後熱処理プローブ)。DNAプローブのPfuAPラベル化の確認はアガロース電気泳動で行った。
それぞれ調製したPfuAPマルチラベル化プローブの検出感度の評価をドットブロットで行った。なお、ハイブリダイゼーション時の各種組成およびプロトコールは、市販の検出キットAlkphos Direct(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)に準拠した。ターゲットDNAとして、プローブ配列を含む990bpのShhのDNA断片(配列番号:30、プライマー配列は表17参照(配列番号:31))、およびプローブ配列と同じ300bpのShhのDNA断片を用いた。また、ネガティブコントロールとして、PfuAPをコードする遺伝子約1.7kbのDNA断片(配列番号:32、プライマー配列は表18参照(配列番号:33,34))を用いた。
[Z−QG DNAを用いたPfuAPマルチラベル化DNAプローブのISHプロトコールに準じたRNA検出]
実施例3では、検出対象核酸はDNAであった。本実施例4では、検出対象核酸をRNAとした場合の、PfuAPマルチラベル化DNAプローブの核酸プローブとしての機能について評価した。
実施例3と同様にして、PCRによるZ−QG DNAの調製を行った。
Z−QG−dUTP 50%、100%の条件で調製したZ−QG DNAとNK14−PfuAPをMTGにて結合し、PfuAPマルチラベル化DNAプローブを調製した。まず、各種Z−QG DNAを90℃で5分間熱処理してDNAを一本鎖に変性させた後、100mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝液中にて、各種Z−QG DNA 25ng/μL、NK14−PfuAP 0.4mg/mL、MTG 5.0Unit/mLの条件下で4℃、6時間反応させた。DNAプローブのPfuAPラベル化の確認はアガロース電気泳動で行った。
実施例3と同様にして、PCRによってプローブ配列を含む990bpのShhのDNA断片(配列番号:30)を得た。この際、Shh遺伝子の下流側にT7プロモーターが含まれるようプライマー設計(配列番号:31、表17参照)を施した。次に、得られたPCR産物を基にT7 Polymeraseを用いて転写反応を行った(表22)。転写反応後、ゲル濾過カラム(Mini Quick Spin Columns、Roche社製)で未反応のNTP等を精製したものをターゲットRNAとして用いた。
実施例2と同様にして、常温菌であるEscherichia coli由来のAP(BAP)を用いてマルチラベル化したマルチラベル化核酸プローブについても、プローブ能評価を行った。
実施例2と同様にして、RNAの変性処理を行った後に、続いて、100mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝液中にて、各種Z−QG RNA 50μg/mL、NK14−BAP 0.4mg/mL、MTG 5.0U/mL、RNase inhibtor 1.0U/μLの条件下にて、6時間反応を行った。コントロールとして、MTG未添加の場合にも同様の操作を行い、反応はアガロースゲル電気泳動によって評価した。
実施例2と同様にして、ドットブロットによりプローブ能について評価した。
<Alexa Fluor 555マルチラベル化RNAの調製>
蛍光色素として、一級アミン誘導化されたAlexa Fluor(登録商標) 555 cadaverine(invitrogen社製)が、MTGによってZ−QG RNAと結合するかについて検討した。まず、Z−QG−UTP使用率100%の条件で調製したZ−QG RNAを、99.0℃まで加熱した後、急冷することによって、変性処理を行った。続いて、100mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝液中にて、Z−QG RNA 50μg/mL、Alexa Fluor 555 cadaverine 20μM、MTG 5.0units/mL、RNase inhibitor 1.0U/μLの条件下にて、6時間反応を行った。コントロールとして、MTG未添加の場合およびZ−QGを導入していない未修飾RNAに対しても同様の操作を行い、反応はアガロースゲル電気泳動によって評価した。
shh S(ターゲット)をメンブレン上に固定化し、Alexa Fluor 555マルチラベル化核酸プローブを用いて検出を試みた。まず、500ng/μLの未標識shh Sを調製し、メンブレンに1μL添加し、乾燥させた後、再度1μL添加し(計1,000ng)、オーブンにて固定化した(80℃、2時間)。その後、表25に示す操作を行い、蛍光イメージャ(BIO−RAD製、Molecular Imager FX Pro、532nm excitation、555nm long pass)を用いて、Alexa Fluor 555マルチラベル化核酸プローブによるshh Sの検出を行った。コントロールとして、shh AS鎖を同様にして固定化したメンブレンに対しても同様の操作を行った。なお、溶液の組成は表26に示す。
Claims (2)
- 下記式(5)で示されることを特徴とする酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸。
(式(5)中、XおよびYは、それぞれ独立して、エテニレン基、−(C2H4O)n−または−(C3H6O)n−(ここで、n=2,4,8,12,24)基で置換されていてもよい、炭素数1〜48のアルキレン基または炭素数2〜48のアルケニレン基であり、Zは、ジニトロフェニル基またはL−3,4−ジヒドロキシフェニル基で置換されていてもよい、炭素数1〜48のアルキル基、炭素数1〜48のアルコキシ基、炭素数6〜48のアリール基、炭素数6〜48のアリールオキシ基、炭素数7〜48のアリールアルキル基または炭素数7〜48のアリールアルキルオキシ基であり、Bは水素原子を表す。また、Y,Zは独立してLys以外のアミノ酸により少なくとも一方が置換されていてもよい。) - 請求項1に記載の酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸であって、
前記Xはエテニレン基、Yはメチレン基であり、Zはベンジルオキシ基であることを特徴とする酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸。
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