JPH0889300A - 核酸検出法 - Google Patents
核酸検出法Info
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- JPH0889300A JPH0889300A JP23263794A JP23263794A JPH0889300A JP H0889300 A JPH0889300 A JP H0889300A JP 23263794 A JP23263794 A JP 23263794A JP 23263794 A JP23263794 A JP 23263794A JP H0889300 A JPH0889300 A JP H0889300A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 遺伝子増幅を行なっていない微量核酸でも検
出できるサンドイッチハイブリダイゼーション法の提
供。 【構成】 被検出核酸と相補的な１００ｂｐ以上の単位
プローブが少なくとも１０個以上同一方向に直列に連結
された反復プローブを補獲用プローブに用いる。
出できるサンドイッチハイブリダイゼーション法の提
供。 【構成】 被検出核酸と相補的な１００ｂｐ以上の単位
プローブが少なくとも１０個以上同一方向に直列に連結
された反復プローブを補獲用プローブに用いる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は核酸の検出法に関するも
のであり、とくに病原体ウイルス、細菌等の核酸検出に
関するものである。
のであり、とくに病原体ウイルス、細菌等の核酸検出に
関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ある特定の塩基配列を有する核酸を特異
的に検出する方法として、ハイブリダイゼーション技術
が広く用いられるようになった。特に細菌、ウイルスの
検出、遺伝病の診断等医療上の分野におけるこの技術の
有用性は、分子生物学や遺伝子工学の発展に伴ってます
ます高くなっている。しかし、従来より用いられてきた
ドットハイブリダイゼーション法は定量性に乏しく、バ
ックグラウンドが高いため臨床上十分な感度が得られな
い等の問題点がある。
的に検出する方法として、ハイブリダイゼーション技術
が広く用いられるようになった。特に細菌、ウイルスの
検出、遺伝病の診断等医療上の分野におけるこの技術の
有用性は、分子生物学や遺伝子工学の発展に伴ってます
ます高くなっている。しかし、従来より用いられてきた
ドットハイブリダイゼーション法は定量性に乏しく、バ
ックグラウンドが高いため臨床上十分な感度が得られな
い等の問題点がある。
【０００３】また、近年開発されたＰＣＲ法〔特開昭６
１−２７４６９７号公報〕は特定の遺伝子を１０万倍以
上に増幅させることのできる画期的な方法であり、基礎
医学の分野においては広く用いられている。しかし特殊
な増幅装置が必要なこと、使用に当たっては増幅された
ＤＮＡの検体への汚染に細心の注意が必要であり、また
定量性に乏しい等問題点も多く、いまだ臨床の現場まで
普及するに到っていない。
１−２７４６９７号公報〕は特定の遺伝子を１０万倍以
上に増幅させることのできる画期的な方法であり、基礎
医学の分野においては広く用いられている。しかし特殊
な増幅装置が必要なこと、使用に当たっては増幅された
ＤＮＡの検体への汚染に細心の注意が必要であり、また
定量性に乏しい等問題点も多く、いまだ臨床の現場まで
普及するに到っていない。
【０００４】ところでハイブリダイゼーションによって
核酸を定量的かつ高感度に検出する試みとして、Virtan
enらはサンドイッチハイブリイダイゼーション法を報告
している〔Virtanen et al., Lancet,i,p.381-383,(19
83)〕。サンドイッチハイブリダイゼーション法は検出
しようとする核酸（以下、被検出核酸と呼ぶ）に相補的
な核酸断片を少なくとも２つ用いる。一方の核酸断片は
固相に結合させて捕獲用プローブとして用い、他方は予
め標識しておいて標識プローブとして用いて、これらの
プローブと可溶化した試料中の核酸をハイブリダイズさ
せる。試料中に両プローブと相補的な核酸が存在すると
標識プローブは固相上に固定され、標識を検出すること
により被検出核酸の量を知ることができる。この方法は
定量性に優れているのみならず、反応時間が短く粗製の
検体にも適用できるためドットハイブリダイゼーション
法に比べ優れている。
核酸を定量的かつ高感度に検出する試みとして、Virtan
enらはサンドイッチハイブリイダイゼーション法を報告
している〔Virtanen et al., Lancet,i,p.381-383,(19
83)〕。サンドイッチハイブリダイゼーション法は検出
しようとする核酸（以下、被検出核酸と呼ぶ）に相補的
な核酸断片を少なくとも２つ用いる。一方の核酸断片は
固相に結合させて捕獲用プローブとして用い、他方は予
め標識しておいて標識プローブとして用いて、これらの
プローブと可溶化した試料中の核酸をハイブリダイズさ
せる。試料中に両プローブと相補的な核酸が存在すると
標識プローブは固相上に固定され、標識を検出すること
により被検出核酸の量を知ることができる。この方法は
定量性に優れているのみならず、反応時間が短く粗製の
検体にも適用できるためドットハイブリダイゼーション
法に比べ優れている。
【０００５】サンドイッチハイブリダイゼーション法は
現在までにより高感度に、そしてより迅速に測定するた
めの種々の改良が行われている。例えば、Rankiら〔Ran
ki et al.,Gene,vol.21,p.77-85,(1983)〕らはプローブ
に一本鎖ＤＮＡを用いることによりアデノウイルス２型
のＤＮＡを鼻腔吸引分泌物より５×１０6の感度で測定
している。この方法によると、二本鎖ＤＮＡをプローブ
として被検出核酸とハイブリダイゼーションを行わせる
際に問題となるプローブの＋鎖−鎖同志の再形成による
ハイブリダイゼーション効率の低下が防止できる。
現在までにより高感度に、そしてより迅速に測定するた
めの種々の改良が行われている。例えば、Rankiら〔Ran
ki et al.,Gene,vol.21,p.77-85,(1983)〕らはプローブ
に一本鎖ＤＮＡを用いることによりアデノウイルス２型
のＤＮＡを鼻腔吸引分泌物より５×１０6の感度で測定
している。この方法によると、二本鎖ＤＮＡをプローブ
として被検出核酸とハイブリダイゼーションを行わせる
際に問題となるプローブの＋鎖−鎖同志の再形成による
ハイブリダイゼーション効率の低下が防止できる。
【０００６】さらにParkkinenらは捕獲プローブ３種、
標識プローブ２種とペアープローブの数を増やすことに
よってパピローマウイルスを子宮頸部のスクラッピング
検体より105の感度で測定している〔Parkkinen et al.,
J.Med.Viro.,vol.20(3),p.279,(1986)〕。
標識プローブ２種とペアープローブの数を増やすことに
よってパピローマウイルスを子宮頸部のスクラッピング
検体より105の感度で測定している〔Parkkinen et al.,
J.Med.Viro.,vol.20(3),p.279,(1986)〕。
【０００７】またカイロン社のグループは分枝型のプロ
ーブに大量の標識を導入しこれを発光法により検出する
ことにより、Ｃ型肝炎ウイルスを３×１０4の感度で測
定している〔特開平５−５０３４２２号公報〕。
ーブに大量の標識を導入しこれを発光法により検出する
ことにより、Ｃ型肝炎ウイルスを３×１０4の感度で測
定している〔特開平５−５０３４２２号公報〕。
【０００８】しかし、これらの改良法でも測定対象によ
っては感度不足であることが多く、より高い感度が得ら
れる方法が求められていた。
っては感度不足であることが多く、より高い感度が得ら
れる方法が求められていた。
【０００９】ところで、標識されたＰＣＲ産物を捕獲す
るためのプローブとして、被検出核酸と特異的にハイブ
リダイズ可能な核酸（単位プローブ）が同一方向に直列
に連結された構造を持つ反復構造プローブとその作製法
が知られている〔特開平５−１９２１９８号公報〕。該
公報には２０ｂｐの単位プローブが記載されている。上
記の反復構造プローブを遺伝子増幅を行っていない試料
中の微量の核酸の検出に応用することも考えられるが、
該プローブは以下の点で問題がある。即ち、微量の核酸
の検出においては、試料中の核酸とプローブとのサンド
イッチハイブリダイゼーションの後、強い条件（低塩濃
度、高温度）で系内を一度洗浄し、非特異的に固相へ吸
着した標識プローブを除去する必要がある。しかし単位
プローブの長さが１００ｂｐ以下では、Tm値（融解温
度）が低いために強い条件で洗浄すると、特異的に形成
された核酸ハイブリッドも解離してしまうため結果的に
測定感度が低下する。よって該公報記載の２０ｂｐの単
位プローブからなる反復構造プローブは高感度を要求さ
れる微量の核酸の検出には適さない。
るためのプローブとして、被検出核酸と特異的にハイブ
リダイズ可能な核酸（単位プローブ）が同一方向に直列
に連結された構造を持つ反復構造プローブとその作製法
が知られている〔特開平５−１９２１９８号公報〕。該
公報には２０ｂｐの単位プローブが記載されている。上
記の反復構造プローブを遺伝子増幅を行っていない試料
中の微量の核酸の検出に応用することも考えられるが、
該プローブは以下の点で問題がある。即ち、微量の核酸
の検出においては、試料中の核酸とプローブとのサンド
イッチハイブリダイゼーションの後、強い条件（低塩濃
度、高温度）で系内を一度洗浄し、非特異的に固相へ吸
着した標識プローブを除去する必要がある。しかし単位
プローブの長さが１００ｂｐ以下では、Tm値（融解温
度）が低いために強い条件で洗浄すると、特異的に形成
された核酸ハイブリッドも解離してしまうため結果的に
測定感度が低下する。よって該公報記載の２０ｂｐの単
位プローブからなる反復構造プローブは高感度を要求さ
れる微量の核酸の検出には適さない。
【００１０】即ち少なくとも１００ｂｐ以上の長さを有
する単位プローブでしかもそれが１０〜２００個は直列
に連結された反復構造の核酸を用いる必要があると考え
られる。
する単位プローブでしかもそれが１０〜２００個は直列
に連結された反復構造の核酸を用いる必要があると考え
られる。
【００１１】しかし、前記公報（特開平５−１９２１９
８号公報）に記載の方法は、合成ＤＮＡを単位核酸とし
て反復構造プローブをプラスミド上に構築するものであ
り、この方法ではより合成の困難な１００ｂｐを越える
ＰＣＲ産物や制限酵素断片が複数個連結された反復構造
プローブを作製することができない。
８号公報）に記載の方法は、合成ＤＮＡを単位核酸とし
て反復構造プローブをプラスミド上に構築するものであ
り、この方法ではより合成の困難な１００ｂｐを越える
ＰＣＲ産物や制限酵素断片が複数個連結された反復構造
プローブを作製することができない。
【００１２】具体的には、次の３点の理由が挙げられ
る。
る。
【００１３】１ 多数のプローブが挿入された大きなプ
ラスミドを選択しなければならない。
ラスミドを選択しなければならない。
【００１４】２ 同一の配列を有するプローブが複数個
プラスミド上に挿入されるため相同組み換えによる欠失
が極めて起こりやすい。
プラスミド上に挿入されるため相同組み換えによる欠失
が極めて起こりやすい。
【００１５】３ 単位プローブが両向きに挿入されると
パリンドロームが形成され、プラスミドの複製が阻害さ
れるので、単位プローブは全て同じ向きに挿入されなけ
ればならない。
パリンドロームが形成され、プラスミドの複製が阻害さ
れるので、単位プローブは全て同じ向きに挿入されなけ
ればならない。
【００１６】上記問題点を解決する手段として、斎藤ら
はヒト主要組織適合複合体の効率的な生産を目的として
該タンパク質の遺伝子のα鎖・β鎖ｃＤＮＡ発現単位が
それぞれ交互に８個ずつ計１６個直列に連結された構造
を持つ４８ｋｂｐのコスミドを、コスミドベクターとin
vitroパッケージングを組み合わせて用いる方法により
作製している(Ikeda.H.,Saito,I.,Gene,71:19-27,198
8)。
はヒト主要組織適合複合体の効率的な生産を目的として
該タンパク質の遺伝子のα鎖・β鎖ｃＤＮＡ発現単位が
それぞれ交互に８個ずつ計１６個直列に連結された構造
を持つ４８ｋｂｐのコスミドを、コスミドベクターとin
vitroパッケージングを組み合わせて用いる方法により
作製している(Ikeda.H.,Saito,I.,Gene,71:19-27,198
8)。
【００１７】斉藤らは、多数の単位プローブが挿入され
た大きなプラスミドを、λファ−ジのin vitro パッケ
ージングキットを用いて、選択的にコスミドとして分離
している。ＤＮＡ調製時にもパッケージングを行いｒｅ
ｃＡマイナスの大腸菌に感染させ、これをアンピシリン
を含む培地で培養することにより相同組み換えによる欠
失を防いでいる。
た大きなプラスミドを、λファ−ジのin vitro パッケ
ージングキットを用いて、選択的にコスミドとして分離
している。ＤＮＡ調製時にもパッケージングを行いｒｅ
ｃＡマイナスの大腸菌に感染させ、これをアンピシリン
を含む培地で培養することにより相同組み換えによる欠
失を防いでいる。
【００１８】またインサートを全て同一方向に挿入する
ために、インサートの両突出端を相補的ではあるがパリ
ンドロームではない構造をとるようにしてhead-to-hea
d、tail-to-tailの結合を防止し、斉藤らはこの方法で
２５個までの直列反復構造を持つコスミドが分離可能で
あることを示した。しかし、今だ２６個以上の同一核酸
断片をコスミド上にクローニングする方法は知られてい
ない。
ために、インサートの両突出端を相補的ではあるがパリ
ンドロームではない構造をとるようにしてhead-to-hea
d、tail-to-tailの結合を防止し、斉藤らはこの方法で
２５個までの直列反復構造を持つコスミドが分離可能で
あることを示した。しかし、今だ２６個以上の同一核酸
断片をコスミド上にクローニングする方法は知られてい
ない。
【００１９】
【発明の解決すべき課題】本発明の目的は、遺伝子増幅
を行っていないような微量の核酸でも検出することので
きるサンドイッチハイブリダイゼーション法による核酸
検出法を提供することにある。
を行っていないような微量の核酸でも検出することので
きるサンドイッチハイブリダイゼーション法による核酸
検出法を提供することにある。
【００２０】また、本発明の他の目的は上記の核酸の検
出に用いられる捕獲用核酸プローブ及びそれを含むコス
ミドの提供にある。勿論これらは新規な物質であるから
これらの製造方法を提供することも本発明の他の目的で
ある。
出に用いられる捕獲用核酸プローブ及びそれを含むコス
ミドの提供にある。勿論これらは新規な物質であるから
これらの製造方法を提供することも本発明の他の目的で
ある。
【００２１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記のよう
な微量の核酸でも検出できるようなサンドイッチハイブ
リダイゼーション法の感度を上昇させる方法を鋭意検討
した。
な微量の核酸でも検出できるようなサンドイッチハイブ
リダイゼーション法の感度を上昇させる方法を鋭意検討
した。
【００２２】その結果、捕獲用プローブには被検出核酸
と相補的な１００ｂｐ以上の核酸（単位プローブ）が少
なくとも１０個以上同一方向に直列に連結された反復プ
ローブを用いることによって、迅速かつ簡便にしかも高
感度に核酸を検出することができることを見出した。
と相補的な１００ｂｐ以上の核酸（単位プローブ）が少
なくとも１０個以上同一方向に直列に連結された反復プ
ローブを用いることによって、迅速かつ簡便にしかも高
感度に核酸を検出することができることを見出した。
【００２３】また、本発明者らは、反復プローブをコス
ミドベクターにクローニングして得るに際して、単位プ
ローブの連結を２段階に分けて行なうことにより、従来
たかだか３０個程度であった単位プローブの連結数を飛
躍的に向上させる方法を開発した。
ミドベクターにクローニングして得るに際して、単位プ
ローブの連結を２段階に分けて行なうことにより、従来
たかだか３０個程度であった単位プローブの連結数を飛
躍的に向上させる方法を開発した。
【００２４】本発明は、上記知見に基づき完成したもの
である。
である。
【００２５】すなわち本発明は、被検出核酸と特異的に
ハイブリダイズ可能な１００ｂｐ以上の単位プローブを
１０個以上直列に同一方向に連結し、全長が３０ｋｂｐ
以下であることを特徴とするサンドイッチハイブリダイ
ゼーション法捕獲用核酸プローブを提供するものであ
り、更に本発明は、（Ａ）〜（Ｅ）の工程からなる核酸
検出法、 （Ａ）被検出核酸と特異的にハイブリダイズ可能な単位
プローブが１０から１６０個同一方向に直列に連結し、
全長が３０ｋｂｐ以下である反復プローブを固相へ固定
化する工程。（Ｂ）上記（Ａ）で固定化した反復プロー
ブを一本鎖核酸とし、＋鎖若しくは−鎖を分離して固定
化一本鎖反復プローブを作製する工程。 （Ｃ）固定化一本鎖反復プローブと被検出核酸を含む試
料と標識プローブとを混合してハイブリダイゼーション
する工程。 （Ｄ）固相を６０℃以上７０℃以下の温度で洗浄する工
程。 （Ｅ）標識プローブの標識を用いて被検出核酸を検出す
る工程。を提供するものである。
ハイブリダイズ可能な１００ｂｐ以上の単位プローブを
１０個以上直列に同一方向に連結し、全長が３０ｋｂｐ
以下であることを特徴とするサンドイッチハイブリダイ
ゼーション法捕獲用核酸プローブを提供するものであ
り、更に本発明は、（Ａ）〜（Ｅ）の工程からなる核酸
検出法、 （Ａ）被検出核酸と特異的にハイブリダイズ可能な単位
プローブが１０から１６０個同一方向に直列に連結し、
全長が３０ｋｂｐ以下である反復プローブを固相へ固定
化する工程。（Ｂ）上記（Ａ）で固定化した反復プロー
ブを一本鎖核酸とし、＋鎖若しくは−鎖を分離して固定
化一本鎖反復プローブを作製する工程。 （Ｃ）固定化一本鎖反復プローブと被検出核酸を含む試
料と標識プローブとを混合してハイブリダイゼーション
する工程。 （Ｄ）固相を６０℃以上７０℃以下の温度で洗浄する工
程。 （Ｅ）標識プローブの標識を用いて被検出核酸を検出す
る工程。を提供するものである。
【００２６】本発明によって検出される核酸には、試料
中に存在する核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡであり、例え
ば、臨床試料中の病原体ウイルスや細菌の核酸、または
食品中の細菌の核酸等が考えられる。
中に存在する核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡであり、例え
ば、臨床試料中の病原体ウイルスや細菌の核酸、または
食品中の細菌の核酸等が考えられる。
【００２７】上記の病原ウイルスには、例えばＢ型肝炎
ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、成人Ｔ細胞白血病ウイル
ス、パピローマウイルス、サイトメガロウイルス、ポリ
オーマウイルス、ロタウイルス、ヘルペスウイルス等が
例示できる。
ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、成人Ｔ細胞白血病ウイル
ス、パピローマウイルス、サイトメガロウイルス、ポリ
オーマウイルス、ロタウイルス、ヘルペスウイルス等が
例示できる。
【００２８】また、上記細菌としては、例えば抗酸菌、
連鎖球菌、ブドウ球菌、病原性大腸菌、カンピロバクダ
ー、コレラ菌、赤痢菌、サルモネラ菌、エルジニヤ菌等
が例示できる。
連鎖球菌、ブドウ球菌、病原性大腸菌、カンピロバクダ
ー、コレラ菌、赤痢菌、サルモネラ菌、エルジニヤ菌等
が例示できる。
【００２９】本発明において、反復プローブとは、被検
出核酸と特異的にハイブリダイズ可能な核酸（単位プロ
ーブ）が同一方向に直列に連結された構造を持つプロー
ブである。この反復プローブは核酸検出のためのハイブ
リダイゼーションにおける捕獲用プローブとして用いら
れる。
出核酸と特異的にハイブリダイズ可能な核酸（単位プロ
ーブ）が同一方向に直列に連結された構造を持つプロー
ブである。この反復プローブは核酸検出のためのハイブ
リダイゼーションにおける捕獲用プローブとして用いら
れる。
【００３０】反復プローブを用いて、サンドイッチハイ
ブリダイゼーションを高い感度で行うに際しては、非特
異反応の影響を低下させるために、高い温度かつ低い塩
濃度の溶液でハイブリダイゼーション後の系内を洗浄す
る。これを可能とするために単位プローブの長さは１０
０ｂｐ以上が好ましい。
ブリダイゼーションを高い感度で行うに際しては、非特
異反応の影響を低下させるために、高い温度かつ低い塩
濃度の溶液でハイブリダイゼーション後の系内を洗浄す
る。これを可能とするために単位プローブの長さは１０
０ｂｐ以上が好ましい。
【００３１】そして単位プローブの反復数は、十分な核
酸の検出感度を得るために１０以上であることが好まし
い。
酸の検出感度を得るために１０以上であることが好まし
い。
【００３２】さらにまたプローブの物理的切断を回避す
るために反復プローブ全体の長さは３０ｋｂｐを越えな
いことが好ましい。
るために反復プローブ全体の長さは３０ｋｂｐを越えな
いことが好ましい。
【００３３】これらの点から、より好ましくは、単位プ
ローブの反復数が１０から８０個、単位プローブの長さ
が１００から１０００ｂｐ、全長が５から３０ｋｂｐの
反復プローブを用いればよいことになる。更に好ましい
条件を提示すれば、単位プローブの反復数が２０から８
０個、単位プローブの長さが１５０から５００ｂｐ、全
長が５から３０ｋｂｐの反復プローブ、であり、最も好
ましい条件ならば、単位プローブの長さが２５０ｂｐか
ら５００ｂｐ、反復数が約３０である。しかし、もちろ
ん最適条件は用いる単位プローブによって若干異なるこ
とがある。
ローブの反復数が１０から８０個、単位プローブの長さ
が１００から１０００ｂｐ、全長が５から３０ｋｂｐの
反復プローブを用いればよいことになる。更に好ましい
条件を提示すれば、単位プローブの反復数が２０から８
０個、単位プローブの長さが１５０から５００ｂｐ、全
長が５から３０ｋｂｐの反復プローブ、であり、最も好
ましい条件ならば、単位プローブの長さが２５０ｂｐか
ら５００ｂｐ、反復数が約３０である。しかし、もちろ
ん最適条件は用いる単位プローブによって若干異なるこ
とがある。
【００３４】本発明の反復プローブを作製するためには
コスミドベクターとin vitroパッケージングを組み合わ
せて用いる従来の技術例えば斉藤らの方法(Ikeda.H.,Sa
ito,I.,Gene,71:19-27,1988)によることが出来ると考え
られるかも知れない。
コスミドベクターとin vitroパッケージングを組み合わ
せて用いる従来の技術例えば斉藤らの方法(Ikeda.H.,Sa
ito,I.,Gene,71:19-27,1988)によることが出来ると考え
られるかも知れない。
【００３５】しかし、斉藤らの方法を従来通り適用した
ところ、ライゲーション反応の限界のため３０個以上の
単位プローブが連結されたクローンを得ることが出来な
かった。そこで発明者らは、より多数の連結数を有する
クローンを得るため、単位プローブの連結を２段階に分
けて行う方法を考案したのである。
ところ、ライゲーション反応の限界のため３０個以上の
単位プローブが連結されたクローンを得ることが出来な
かった。そこで発明者らは、より多数の連結数を有する
クローンを得るため、単位プローブの連結を２段階に分
けて行う方法を考案したのである。
【００３６】すなわち、まずカセットシャロミドベクタ
ーを作製する。
ーを作製する。
【００３７】このカセットシャロミドベクターは、最低
１組の同一の特定の制限酵素切断点をクローニング部位
の両側に有し、スペーサーの長さにより種々の全長をも
つコスミドベクターであり、該制限酵素切断点は以下の
ような特徴を有している。
１組の同一の特定の制限酵素切断点をクローニング部位
の両側に有し、スペーサーの長さにより種々の全長をも
つコスミドベクターであり、該制限酵素切断点は以下の
ような特徴を有している。
【００３８】即ち、それは不完全なパリンドローム配列
を認識する制限酵素（以下、不完全パリンドローム認識
酵素と呼ぶことがある）により切断され、切断によりパ
リンドローム構造の突出末端を生じない。上記制限酵素
としてはBglI、BspMI、BstXI、SfiI、AvaI等が例示され
る。
を認識する制限酵素（以下、不完全パリンドローム認識
酵素と呼ぶことがある）により切断され、切断によりパ
リンドローム構造の突出末端を生じない。上記制限酵素
としてはBglI、BspMI、BstXI、SfiI、AvaI等が例示され
る。
【００３９】次に被検出核酸と特異的にハイブリダイズ
可能な単位プローブをＰＣＲにより調製する。上記単位
プローブはまた被検出核酸がクローニングされたプラス
ミドを制限酵素を用いて切断することによっても調製で
きる。
可能な単位プローブをＰＣＲにより調製する。上記単位
プローブはまた被検出核酸がクローニングされたプラス
ミドを制限酵素を用いて切断することによっても調製で
きる。
【００４０】１段階目の連結反応として、カセットシャ
ロミドのクローニング部位へ１〜１０個の単位プローブ
をクローニングし、単位プローブが直列に１〜１０個連
結した一次反復プローブを作製する。
ロミドのクローニング部位へ１〜１０個の単位プローブ
をクローニングし、単位プローブが直列に１〜１０個連
結した一次反復プローブを作製する。
【００４１】具体的には、単位プローブが１〜１０個ク
ローニングされた際に全長が３９〜５１ｋｂｐとなるの
全長のカセットシャロミドベクターの１組の同一の制限
酵素切断点の間に存在するクローニング部位を切断して
生じたＤＮＡ断片と、単位プローブとを１：３０のモル
比で混合してＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。連
結させた核酸をλファージへin vitroパッケージング
し、大腸菌へ形質導入する。形質導入した大腸菌を液体
培養して得られた組換え体よりプラスミドを調製する。
カセットシャロミドをベクター＋インサート部分とスペ
ーサー＋ＣＯＳ部分に切断分離する制限酵素（例えばＳ
ａｌΙ）を用いて、得られたプラスミドを切断して電気
泳動する。電気泳動したゲルより１〜１０個の単位プロ
ーブとベクターが連結した長さに相当するバンドを切り
出し、核酸断片を抽出する。得られた核酸断片をＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて環状とし、環状化した核酸を大腸
菌を形質転換し、単位プローブが１〜１０個クローニン
グされた一次反復プローブプラスミドを得る。
ローニングされた際に全長が３９〜５１ｋｂｐとなるの
全長のカセットシャロミドベクターの１組の同一の制限
酵素切断点の間に存在するクローニング部位を切断して
生じたＤＮＡ断片と、単位プローブとを１：３０のモル
比で混合してＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。連
結させた核酸をλファージへin vitroパッケージング
し、大腸菌へ形質導入する。形質導入した大腸菌を液体
培養して得られた組換え体よりプラスミドを調製する。
カセットシャロミドをベクター＋インサート部分とスペ
ーサー＋ＣＯＳ部分に切断分離する制限酵素（例えばＳ
ａｌΙ）を用いて、得られたプラスミドを切断して電気
泳動する。電気泳動したゲルより１〜１０個の単位プロ
ーブとベクターが連結した長さに相当するバンドを切り
出し、核酸断片を抽出する。得られた核酸断片をＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて環状とし、環状化した核酸を大腸
菌を形質転換し、単位プローブが１〜１０個クローニン
グされた一次反復プローブプラスミドを得る。
【００４２】得られた一次反復プローブプラスミドを、
プローブがクローニングされた部位の両側に切断部位の
存在する不完全パリンドローム認識酵素を用いて切断す
ることにより、相補的であるがパリンドローム構造では
ない突出端を両端に有する一次反復プローブが単離され
る。
プローブがクローニングされた部位の両側に切断部位の
存在する不完全パリンドローム認識酵素を用いて切断す
ることにより、相補的であるがパリンドローム構造では
ない突出端を両端に有する一次反復プローブが単離され
る。
【００４３】２段階目の連結反応として、カセットシャ
ロミドベクターを一次反復プローブを単離した時と同じ
不完全パリンドローム認識酵素で切断してカセットシャ
ロミドベクター断片を得る。１段階目の連結反応で得ら
れた一次反復プローブと上記シャロミドベクター断片を
T4ＤＮＡリガーゼを用いて連結させる。連結させた核酸
をλファージへin vitroパッケージングし、目的とする
プラスミド（１０〜１６０個単位プローブが直列に結合
した断片を有する）を得る。
ロミドベクターを一次反復プローブを単離した時と同じ
不完全パリンドローム認識酵素で切断してカセットシャ
ロミドベクター断片を得る。１段階目の連結反応で得ら
れた一次反復プローブと上記シャロミドベクター断片を
T4ＤＮＡリガーゼを用いて連結させる。連結させた核酸
をλファージへin vitroパッケージングし、目的とする
プラスミド（１０〜１６０個単位プローブが直列に結合
した断片を有する）を得る。
【００４４】一次反復プローブの連結数はライゲーショ
ン時のコスミドベクター断片と一次反復核酸プローブの
混合比と用いられるカセットシャロミドの全長（すなわ
ちスペサーの長さ）によって調製される。λファージへ
のin vitroパッケージングのためには核酸のＣＯＳ部位
とＣＯＳ部位の間隔が３９〜５１ｋｂｐであることが必
須である。従って用いるべきカセットシャロミドの全長
は、４５ｋｂｐ−（単位プローブの長さ×最終目標連結
数）±６ｋｂｐとなる。またカセットシャロミドと１次
反復プローブのモル比は１：最終目標連結数／一次反復
プローブの単位プローブ連結数×２〜４が最も良い。
ン時のコスミドベクター断片と一次反復核酸プローブの
混合比と用いられるカセットシャロミドの全長（すなわ
ちスペサーの長さ）によって調製される。λファージへ
のin vitroパッケージングのためには核酸のＣＯＳ部位
とＣＯＳ部位の間隔が３９〜５１ｋｂｐであることが必
須である。従って用いるべきカセットシャロミドの全長
は、４５ｋｂｐ−（単位プローブの長さ×最終目標連結
数）±６ｋｂｐとなる。またカセットシャロミドと１次
反復プローブのモル比は１：最終目標連結数／一次反復
プローブの単位プローブ連結数×２〜４が最も良い。
【００４５】核酸の分析は（Ａ）〜（Ｅ）の工程に従っ
て以下のようにして行なう。 （Ａ） まず反復プローブを固相に固定化する。即ち単
位プローブを１０から１６０個連結した反復プローブを
含むコスミドを制限酵素で切断して単離する。反復プロ
ーブの＋鎖或いは−鎖のどちらか一方の末端に特定の化
合物に強い親和性を有する基で修飾された核酸アナログ
を取り込ませる。末端が修飾された反復プローブ断片を
核酸アナログの修飾基に親和性を有する化合物を固定し
た固相へ固定化する。
て以下のようにして行なう。 （Ａ） まず反復プローブを固相に固定化する。即ち単
位プローブを１０から１６０個連結した反復プローブを
含むコスミドを制限酵素で切断して単離する。反復プロ
ーブの＋鎖或いは−鎖のどちらか一方の末端に特定の化
合物に強い親和性を有する基で修飾された核酸アナログ
を取り込ませる。末端が修飾された反復プローブ断片を
核酸アナログの修飾基に親和性を有する化合物を固定し
た固相へ固定化する。
【００４６】実際には反復プローブの片側を5'突出型の
制限酵素で切断し、ＤＮＡポリメラーゼ（Klenow断片）
の５’→３’ポリメラーゼ活性を利用して特定の化合物
と共有結合し得る基で修飾された核酸アナログを非突出
型の3'末端に取り込ませる。核酸アナログの修飾基と共
有結合し得る官能基を有する化合物を予め固相に結合さ
せておき、この固相上の化合物と核酸アナログの修飾基
とを結合させることにより反復プローブを固相へ固定化
する。その後、反復プローブのもう一方の側を制限酵素
で切断し、ベクター部分と分離することにより、反復プ
ローブを固相に固定化することができる。
制限酵素で切断し、ＤＮＡポリメラーゼ（Klenow断片）
の５’→３’ポリメラーゼ活性を利用して特定の化合物
と共有結合し得る基で修飾された核酸アナログを非突出
型の3'末端に取り込ませる。核酸アナログの修飾基と共
有結合し得る官能基を有する化合物を予め固相に結合さ
せておき、この固相上の化合物と核酸アナログの修飾基
とを結合させることにより反復プローブを固相へ固定化
する。その後、反復プローブのもう一方の側を制限酵素
で切断し、ベクター部分と分離することにより、反復プ
ローブを固相に固定化することができる。
【００４７】核酸アナログの修飾基としては、ビオチン
等の様に特定の官能基を有する化合物共有結合し得るも
のやアミノ基等の官能基を用いることができる。ビオチ
ンはアビジンと強い親和性を有し、アミノ基であればト
シル基や活性エステルと強い親和性を有する。よって反
復プローブに取り込ませる核酸アナログとしてはBiotin
-16-dUTP、Amino-7-dUTP等を用いることができる。
等の様に特定の官能基を有する化合物共有結合し得るも
のやアミノ基等の官能基を用いることができる。ビオチ
ンはアビジンと強い親和性を有し、アミノ基であればト
シル基や活性エステルと強い親和性を有する。よって反
復プローブに取り込ませる核酸アナログとしてはBiotin
-16-dUTP、Amino-7-dUTP等を用いることができる。
【００４８】反復プローブを固相へ固定化する方法とし
て、固相上のチオール基等の官能基とマレイミドエステ
ル等の架橋剤を用いることもできる。
て、固相上のチオール基等の官能基とマレイミドエステ
ル等の架橋剤を用いることもできる。
【００４９】固定化に用いる固相としては、核酸アナロ
グの修飾基に強い親和性を有する官能基を有する化合物
を導入可能なもの、もしくは反復プローブに導入された
架橋剤に対する親和性を有する化合物を固定可能なもの
であれば、材質・形状を問わない。その様な固相の例と
しては、具体的にはポリスチレン、ポリエチレン、ガラ
ス等のチューブ、マイクロウエルプレート、ビーズ、微
粒子等が挙げられる。 （Ｂ） 次に固定化された反復プローブを一本鎖ＤＮＡ
にする。即ち上記（Ａ）で固定化された２本鎖反復プロ
ーブの一方の未修飾の鎖を分離して、固定化一本鎖反復
プローブを作製する。
グの修飾基に強い親和性を有する官能基を有する化合物
を導入可能なもの、もしくは反復プローブに導入された
架橋剤に対する親和性を有する化合物を固定可能なもの
であれば、材質・形状を問わない。その様な固相の例と
しては、具体的にはポリスチレン、ポリエチレン、ガラ
ス等のチューブ、マイクロウエルプレート、ビーズ、微
粒子等が挙げられる。 （Ｂ） 次に固定化された反復プローブを一本鎖ＤＮＡ
にする。即ち上記（Ａ）で固定化された２本鎖反復プロ
ーブの一方の未修飾の鎖を分離して、固定化一本鎖反復
プローブを作製する。
【００５０】具体的には固定化された反復プローブを一
本鎖にするために、０．１５Ｎの水酸化ナトリウム溶液
中で固定化された反復プローブを処理してアルカリ変性
させ、固定化された２本鎖反復プローブを一本鎖へ解離
させ、遊離した一本鎖ＤＮＡのうち未修飾の鎖を洗浄除
去する。 （Ｃ）固定化一本鎖反復プローブと被検出核酸を含む試
料と標識プローブとを混合してハイブリダイゼーション
を行なう。
本鎖にするために、０．１５Ｎの水酸化ナトリウム溶液
中で固定化された反復プローブを処理してアルカリ変性
させ、固定化された２本鎖反復プローブを一本鎖へ解離
させ、遊離した一本鎖ＤＮＡのうち未修飾の鎖を洗浄除
去する。 （Ｃ）固定化一本鎖反復プローブと被検出核酸を含む試
料と標識プローブとを混合してハイブリダイゼーション
を行なう。
【００５１】本発明において標識プローブとは、被検出
核酸と特異的にハイブリダイズ可能であり、しかも反復
プローブと異なる配列を有する核酸が標識物質で標識さ
れたものを意味する。
核酸と特異的にハイブリダイズ可能であり、しかも反復
プローブと異なる配列を有する核酸が標識物質で標識さ
れたものを意味する。
【００５２】標識プローブに使用される核酸としては、
例えば被検出核酸をテンプレートとしてＰＣＲをおこな
って得られるＰＣＲ産物、標識プローブに使用される核
酸がクローニングされているプラスミドを任意の制限酵
素を用いて切断して得られるＤＮＡ断片を使用すること
ができる。
例えば被検出核酸をテンプレートとしてＰＣＲをおこな
って得られるＰＣＲ産物、標識プローブに使用される核
酸がクローニングされているプラスミドを任意の制限酵
素を用いて切断して得られるＤＮＡ断片を使用すること
ができる。
【００５３】また被検出核酸の一部をＭ１３ファ−ジの
オリジンを有するプラスミドpUC118等にクローニングし
て増幅し、増幅された組換えＤＮＡより被検出核酸の一
部をコードする一本鎖ＤＮＡを調製して標識に用いるこ
とにより、結果的に核酸検出の感度が向上する。
オリジンを有するプラスミドpUC118等にクローニングし
て増幅し、増幅された組換えＤＮＡより被検出核酸の一
部をコードする一本鎖ＤＮＡを調製して標識に用いるこ
とにより、結果的に核酸検出の感度が向上する。
【００５４】ＤＮＡ断片の標識は、分離された核酸或い
は標識プローブに使用される核酸がクローニングされて
いるプラスミド全体を標識すること等により行われる。
は標識プローブに使用される核酸がクローニングされて
いるプラスミド全体を標識すること等により行われる。
【００５５】標識に用いる標識物質としては非放射性物
質が好ましく、ローダミン、FITC等の蛍光物質、アクリ
ジン等の発光物質が挙げられる。また、標識物質に対し
特異的に反応する物質であれば標識物質は直接検出され
るものでなくとも良い。その様なものの例として例えば
ビオチン標識に対するアビジンもしはストレプトアビジ
ン、ジゴキシン等のハプテンに対する抗ジゴキシン抗体
等が挙げられる。
質が好ましく、ローダミン、FITC等の蛍光物質、アクリ
ジン等の発光物質が挙げられる。また、標識物質に対し
特異的に反応する物質であれば標識物質は直接検出され
るものでなくとも良い。その様なものの例として例えば
ビオチン標識に対するアビジンもしはストレプトアビジ
ン、ジゴキシン等のハプテンに対する抗ジゴキシン抗体
等が挙げられる。
【００５６】２本鎖プローブへ標識を導入する方法とし
ては、Biotinー16ーdUTPやDigoxin-11-dUTP等の標識核酸
アナログをランダムプライマー法、ニックトランスレー
ション法等を用いることができる。またＰＣＲ法で作製
した核酸を標識するならば、ＰＣＲ反応時に反応溶液へ
Biotinー16ーdUTPやDigoxin-11-dUTP等の標識核酸アナロ
グを加えることにより標識できる。
ては、Biotinー16ーdUTPやDigoxin-11-dUTP等の標識核酸
アナログをランダムプライマー法、ニックトランスレー
ション法等を用いることができる。またＰＣＲ法で作製
した核酸を標識するならば、ＰＣＲ反応時に反応溶液へ
Biotinー16ーdUTPやDigoxin-11-dUTP等の標識核酸アナロ
グを加えることにより標識できる。
【００５７】ハイブリダイゼーション反応は通常のフィ
ルターを用いるドットハイブリダイゼーションと同様の
条件で行うことができる［Molecular Cloning 2nd Edit
ion(Cold Spring Harbar Laboratory Press，1989)］。
ハイブリダイゼーション反応時の反応液量、反応時間に
ついては、核酸濃度、用いる固相の種類および核酸プロ
ーブに応じて選択すればよい。反応液は６×ＳＳＣ等通
常のハイブリダイゼーションに用いる溶液を利用でき
る。 （Ｄ） ハイブリダイゼーション後、未反応のおよび非
特異的に固相へ吸着している標識プローブを除去するた
め、固相を０．１×ＳＳＣ，０．２％ＳＤＳ溶液等の溶
液を用いて洗浄する。反応および洗浄時の温度は用いる
固定化反復プローブを構成する単位プローブの長さとＧ
Ｃ含量（％）で異なるが、低くとも６０℃、高くとも７
０℃である。 実際は次式より計算されるＴｍ値から２
０℃引いた温度を選択する。
ルターを用いるドットハイブリダイゼーションと同様の
条件で行うことができる［Molecular Cloning 2nd Edit
ion(Cold Spring Harbar Laboratory Press，1989)］。
ハイブリダイゼーション反応時の反応液量、反応時間に
ついては、核酸濃度、用いる固相の種類および核酸プロ
ーブに応じて選択すればよい。反応液は６×ＳＳＣ等通
常のハイブリダイゼーションに用いる溶液を利用でき
る。 （Ｄ） ハイブリダイゼーション後、未反応のおよび非
特異的に固相へ吸着している標識プローブを除去するた
め、固相を０．１×ＳＳＣ，０．２％ＳＤＳ溶液等の溶
液を用いて洗浄する。反応および洗浄時の温度は用いる
固定化反復プローブを構成する単位プローブの長さとＧ
Ｃ含量（％）で異なるが、低くとも６０℃、高くとも７
０℃である。 実際は次式より計算されるＴｍ値から２
０℃引いた温度を選択する。
【００５８】 Tm=81.6+16.6(Log10［Na+］)+ 0.41(%G+C)-(600/L) （ただし、%G+CはGC含量を表し、Lは単位プローブの長
さを表す。） 上の式によれば、例えばＧＣ含量５０％、プローブ長１
００ｂｐならば６４℃、２００ｂｐならば６８℃と算出
される。 （Ｅ）固相上の核酸ハイブリッド中に存在する標識プロ
ーブの標識を用いて測定対象の核酸を検出する。
さを表す。） 上の式によれば、例えばＧＣ含量５０％、プローブ長１
００ｂｐならば６４℃、２００ｂｐならば６８℃と算出
される。 （Ｅ）固相上の核酸ハイブリッド中に存在する標識プロ
ーブの標識を用いて測定対象の核酸を検出する。
【００５９】標識を検出する方法としては、蛍光物質で
あれば蛍光光度計、発光物質であれば発光光度計を用い
てその強度を測定する。ビオチン標識は酵素等の直接検
出可能な物質で標識したアビジンまたはストレプトアビ
ジン、ハプテン標識は同じく標識した抗体を用いること
によって検出される。
あれば蛍光光度計、発光物質であれば発光光度計を用い
てその強度を測定する。ビオチン標識は酵素等の直接検
出可能な物質で標識したアビジンまたはストレプトアビ
ジン、ハプテン標識は同じく標識した抗体を用いること
によって検出される。
【００６０】
【実施例】本発明を以下のサイトメガロウイルス検出系
の例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに
限定されるものではない。
の例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに
限定されるものではない。
【００６１】以下の実施例における遺伝子工学的手法は
Molecular Cloning 2nd Edition (Cold spring Harbar
Laboratory Press，1989)に従っておこなった。ＰＣＲ
はＰＣＲ Tecnology(Stockton Press,1989)に従って行
った。また、オリゴヌクレオチドの合成はミリポア社の
オリゴヌクレオチド自動合成器Cyclon Plus ＤＮＡシン
セサイザーを用いて合成した。
Molecular Cloning 2nd Edition (Cold spring Harbar
Laboratory Press，1989)に従っておこなった。ＰＣＲ
はＰＣＲ Tecnology(Stockton Press,1989)に従って行
った。また、オリゴヌクレオチドの合成はミリポア社の
オリゴヌクレオチド自動合成器Cyclon Plus ＤＮＡシン
セサイザーを用いて合成した。
【００６２】実施例１反復ＤＮＡ作製用ベクターpXFW，cdXFWの調製 図１に示したスキームに従って、配列番号１に示す５'
末端をリン酸化した合成ＤＮＡ,ＸＦＷリンカーを、Cha
romid9-42(42kbp)、charomid9-36(36kbp)、charomid9-2
8およびcharomido9-20(20kbp)（株式会社日本ジーンよ
り購入）のAsp718（ベーリンガー・マンハイム社製）切
断部位に挿入しシャロミドベクターcd9-42XFW、cd9-36X
FW、cd9-28XFWおよびcd9-20XFWを得た。図２に示したス
キームに従って、cd9-42XFWをSalΙで完全切断し、再び
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた後、得られたＤ
ＮＡを用いて大腸菌DH5を形質転換させ、cd9-42XFWより
全スペーサーとCOS部位を除去したpXFWを得た。同様にc
d9-42XFWから、NruΙを用いスペーサーのみを除去したc
d9-4XFWを得た。
末端をリン酸化した合成ＤＮＡ,ＸＦＷリンカーを、Cha
romid9-42(42kbp)、charomid9-36(36kbp)、charomid9-2
8およびcharomido9-20(20kbp)（株式会社日本ジーンよ
り購入）のAsp718（ベーリンガー・マンハイム社製）切
断部位に挿入しシャロミドベクターcd9-42XFW、cd9-36X
FW、cd9-28XFWおよびcd9-20XFWを得た。図２に示したス
キームに従って、cd9-42XFWをSalΙで完全切断し、再び
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた後、得られたＤ
ＮＡを用いて大腸菌DH5を形質転換させ、cd9-42XFWより
全スペーサーとCOS部位を除去したpXFWを得た。同様にc
d9-42XFWから、NruΙを用いスペーサーのみを除去したc
d9-4XFWを得た。
【００６３】実施例２化学合成による単位プローブの調製 配列番号２から５に示す配列のＤＮＡを合成した。配列
番号２と３に記載のＤＮＡ、および配列番号４と５に記
載のＤＮＡを混合し９８℃で１０分間加熱した後、徐々
に冷却しアニールさせた。次にＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼを用いて５’末端をリン酸化し、２２ｂｐおよび
５３ｂｐの化学合成単位プローブＡ及びＢを得た。プロ
ーブＡおよびＢはサイトメガロウイルスＤＮＡのEcoRΙ
断片Ｄ遺伝子(S.A.Spector,J.Arua,D.H.Spector,R.McMi
llian:J.Infect.Dis.,150,121,1984))由来の配列であ
り、プローブＡはプローブＢの配列を含んでいる。
番号２と３に記載のＤＮＡ、および配列番号４と５に記
載のＤＮＡを混合し９８℃で１０分間加熱した後、徐々
に冷却しアニールさせた。次にＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼを用いて５’末端をリン酸化し、２２ｂｐおよび
５３ｂｐの化学合成単位プローブＡ及びＢを得た。プロ
ーブＡおよびＢはサイトメガロウイルスＤＮＡのEcoRΙ
断片Ｄ遺伝子(S.A.Spector,J.Arua,D.H.Spector,R.McMi
llian:J.Infect.Dis.,150,121,1984))由来の配列であ
り、プローブＡはプローブＢの配列を含んでいる。
【００６４】実施例３ＰＣＲによる単位プローブの調製 配列番号８から１７に示したオリゴヌクレオチドについ
て、配列番号が８と９、１０と１１、１２と１３、１４
と１５、１６と１７に記載のＤＮＡをプライマーに、テ
ンプレートにヒトサイトメガロウイルスATCC VR538, st
rain AD169)(American Type culture collection)のＤ
ＮＡを用いてＰＣＲを行いサイトメガロウイルスＤＮＡ
のEcoRΙ断片D遺伝子由来の１１８ｂｐ、１６４ｂｐ、
２６７ｂｐ、５２１ｂｐおよび９７６ｂｐのＤＮＡ
Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧをそれぞれ得た。各プライマー
においては、Ｃは先に合成したプローブＢの、ＤはＣ
の、ＥはＤの、ＦはＥの、ＧはＦの配列を含むように、
また各プローブのＧＣ含量が５８〜６２％となるように
設計した。
て、配列番号が８と９、１０と１１、１２と１３、１４
と１５、１６と１７に記載のＤＮＡをプライマーに、テ
ンプレートにヒトサイトメガロウイルスATCC VR538, st
rain AD169)(American Type culture collection)のＤ
ＮＡを用いてＰＣＲを行いサイトメガロウイルスＤＮＡ
のEcoRΙ断片D遺伝子由来の１１８ｂｐ、１６４ｂｐ、
２６７ｂｐ、５２１ｂｐおよび９７６ｂｐのＤＮＡ
Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧをそれぞれ得た。各プライマー
においては、Ｃは先に合成したプローブＢの、ＤはＣ
の、ＥはＤの、ＦはＥの、ＧはＦの配列を含むように、
また各プローブのＧＣ含量が５８〜６２％となるように
設計した。
【００６５】実施例４２２ｂｐまたは５３ｂｐの化学合成単位プローブが３０
個直列に挿入されたプラスミドの調製 化学合成単位プローブが３０個直列に挿入されたプラス
ミドの調製はKawaiらの方法（Analytical,Biochem,209,
63-69,1993）の方法にほぼ従って行った。すなわち実施
例２で作製した２２ｂｐ及び５３ｂｐの合成単位プロー
ブＡ及びＢを各々をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合さ
せた後、Klenow断片を用いて末端を平滑化し、６％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動にかけ、プローブＡおよび
Ｂが各々１０個結合した生成物に相当する２２０及び５
３０ｂｐのバンドを分離しＤＮＡを抽出した。得られた
たＤＮＡをpXFWのSwaΙ部位へ挿入しpXFW10×A及びpXFW
10×Bを作製した。
個直列に挿入されたプラスミドの調製 化学合成単位プローブが３０個直列に挿入されたプラス
ミドの調製はKawaiらの方法（Analytical,Biochem,209,
63-69,1993）の方法にほぼ従って行った。すなわち実施
例２で作製した２２ｂｐ及び５３ｂｐの合成単位プロー
ブＡ及びＢを各々をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合さ
せた後、Klenow断片を用いて末端を平滑化し、６％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動にかけ、プローブＡおよび
Ｂが各々１０個結合した生成物に相当する２２０及び５
３０ｂｐのバンドを分離しＤＮＡを抽出した。得られた
たＤＮＡをpXFWのSwaΙ部位へ挿入しpXFW10×A及びpXFW
10×Bを作製した。
【００６６】次にpXFW10×A及びpXFW10×BをSfiΙを用
いて切断し、単位プローブＡまたはＢが直列に１０個連
結した断片を調製した。さらにこの断片と、pXFWをSfi
Ιで切断し５’端をアルカリホスファターゼを用いて脱
リン酸したベクターを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用
いて結合させた。この結合させたＤＮＡを用いて大腸菌
DH5を形質転換させ、単位プローブＡまたはＢが各々３
０個直列に連結した断片を含むプラスミドpXFW30×A、p
XFW30×Bを得た。
いて切断し、単位プローブＡまたはＢが直列に１０個連
結した断片を調製した。さらにこの断片と、pXFWをSfi
Ιで切断し５’端をアルカリホスファターゼを用いて脱
リン酸したベクターを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用
いて結合させた。この結合させたＤＮＡを用いて大腸菌
DH5を形質転換させ、単位プローブＡまたはＢが各々３
０個直列に連結した断片を含むプラスミドpXFW30×A、p
XFW30×Bを得た。
【００６７】実施例５ＰＣＲで調製した１１８、１６４、２６７、５２１また
は９７６ｂｐの単位プローブが１個もしくは５個直列に
挿入されたプラスミドの調製 実施例３でＰＣＲを用いて調製したＤＮＡプローブＣ、
Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧを制限酵素PmeΙで切断した後、電
気泳動を行い各々１１７ｂｐ、２６５ｂｐ、５１９ｂｐ
および９７２ｂｐに相当するバンドをゲルより切り出
し、各断片を抽出した。得られた断片をcd9-42XFWをSwa
Iで切断したベクターとモル比30:1で混合し、総ＤＮＡ
濃度が０．２μｇ／μｌとなるようにエタノール沈殿に
て濃縮した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ
た。結合させたＤＮＡを再びSwaΙで消化し、ベクター
が自己結合したもの、およびベクターどうしが結合した
ものを切断した後に、GIGAPACK Π GOLD（STRATAGENE社
製）を用いてin vitro パッケージングし、大腸菌DH5へ
感染させた。感染させた大腸菌を、アンピシリンを含む
平板培地によるクローンの単離おこなわず、直接アンピ
シリンを含む培地を用い液体培養した。得られた大腸菌
よりコスミドを調製し、SalΙで切断した後、電気泳動
を行い、シャロミドベクターのスペーサーおよびcos部
位が除去され、かつ各プローブが1個ないしは５個挿入
された画分に相当する移動度のバンドからＤＮＡを抽出
した。抽出したＤＮＡを再びＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て環状ＤＮＡとした後、これを用いて形質転換させた大
腸菌DH5をアンピシリ耐性マーカーにより選択し、単位
プローブＣ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧが１個または５個挿入
されたプラスミドpXFW1×E、pXFW5×C、pXFW5×D、pXFW
5×E、pXFW5×FおよびpXFW5×Gを有するクローンを単離
した。上記操作のスキームを図３に示した。
は９７６ｂｐの単位プローブが１個もしくは５個直列に
挿入されたプラスミドの調製 実施例３でＰＣＲを用いて調製したＤＮＡプローブＣ、
Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧを制限酵素PmeΙで切断した後、電
気泳動を行い各々１１７ｂｐ、２６５ｂｐ、５１９ｂｐ
および９７２ｂｐに相当するバンドをゲルより切り出
し、各断片を抽出した。得られた断片をcd9-42XFWをSwa
Iで切断したベクターとモル比30:1で混合し、総ＤＮＡ
濃度が０．２μｇ／μｌとなるようにエタノール沈殿に
て濃縮した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ
た。結合させたＤＮＡを再びSwaΙで消化し、ベクター
が自己結合したもの、およびベクターどうしが結合した
ものを切断した後に、GIGAPACK Π GOLD（STRATAGENE社
製）を用いてin vitro パッケージングし、大腸菌DH5へ
感染させた。感染させた大腸菌を、アンピシリンを含む
平板培地によるクローンの単離おこなわず、直接アンピ
シリンを含む培地を用い液体培養した。得られた大腸菌
よりコスミドを調製し、SalΙで切断した後、電気泳動
を行い、シャロミドベクターのスペーサーおよびcos部
位が除去され、かつ各プローブが1個ないしは５個挿入
された画分に相当する移動度のバンドからＤＮＡを抽出
した。抽出したＤＮＡを再びＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て環状ＤＮＡとした後、これを用いて形質転換させた大
腸菌DH5をアンピシリ耐性マーカーにより選択し、単位
プローブＣ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧが１個または５個挿入
されたプラスミドpXFW1×E、pXFW5×C、pXFW5×D、pXFW
5×E、pXFW5×FおよびpXFW5×Gを有するクローンを単離
した。上記操作のスキームを図３に示した。
【００６８】実施例６ＰＣＲで調製した１１８、１６４、２６７、５２１また
は９７６ｂｐの単位プローブが３０個直列に挿入された
コスミドの調製 実施例５で作製したプラスミドpXFW5×C、pXFW5×D、pX
FW5×E、pXFW5×Fおよび pXFW5×GをSfiΙで切断し、
各々の単位プローブが５個直列に連結された画分を電気
泳動により分離し、ゲルから抽出した。得られたプロー
ブＣ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧが５個連結したＤＮＡと、実
施例２で作製したシャロミドベクターcd9-36XFW、cd9-2
8XFWもしくはcd9-20XFWをSwaΙで切断したＤＮＡをモル
比４０：１でプローブＣ、Ｄ、Ｅはシャロミドベクター
cd9-36XFWと、Ｆはcd9-28XFWと、Ｇはd9-20XFWと混合
し、総ＤＮＡ濃度が０．２μｇ／μｌとなるようにエタ
ノール沈殿にて濃縮した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用い
て結合させた。結合させたＤＮＡをGIGAPACK Π GOLDを
用いてin vitro パッケージングし、大腸菌DH5に感染さ
せ、形質導入されたクローンをアンピシリン耐性マーカ
ーにより選択した。得られたクローンよりコスミドを調
製し、これを各コスミドのSfiΙ部位の両脇に存在するX
hoΙ部位で切断し、電気泳動により挿入断片の長さを確
認した。
は９７６ｂｐの単位プローブが３０個直列に挿入された
コスミドの調製 実施例５で作製したプラスミドpXFW5×C、pXFW5×D、pX
FW5×E、pXFW5×Fおよび pXFW5×GをSfiΙで切断し、
各々の単位プローブが５個直列に連結された画分を電気
泳動により分離し、ゲルから抽出した。得られたプロー
ブＣ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧが５個連結したＤＮＡと、実
施例２で作製したシャロミドベクターcd9-36XFW、cd9-2
8XFWもしくはcd9-20XFWをSwaΙで切断したＤＮＡをモル
比４０：１でプローブＣ、Ｄ、Ｅはシャロミドベクター
cd9-36XFWと、Ｆはcd9-28XFWと、Ｇはd9-20XFWと混合
し、総ＤＮＡ濃度が０．２μｇ／μｌとなるようにエタ
ノール沈殿にて濃縮した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用い
て結合させた。結合させたＤＮＡをGIGAPACK Π GOLDを
用いてin vitro パッケージングし、大腸菌DH5に感染さ
せ、形質導入されたクローンをアンピシリン耐性マーカ
ーにより選択した。得られたクローンよりコスミドを調
製し、これを各コスミドのSfiΙ部位の両脇に存在するX
hoΙ部位で切断し、電気泳動により挿入断片の長さを確
認した。
【００６９】目的とする３０個各プローブが直列に連結
して挿入されたクローンを選択し、コスミドcd9-36XFW3
0×C、cd9-36XFW30×D、cd9-36XFW30×E、cd9-28XFW30
×Fおよび cd9-20XFW30×Gを得た。これらはまとめて
図４に示した。
して挿入されたクローンを選択し、コスミドcd9-36XFW3
0×C、cd9-36XFW30×D、cd9-36XFW30×E、cd9-28XFW30
×Fおよび cd9-20XFW30×Gを得た。これらはまとめて
図４に示した。
【００７０】実施例７ＰＣＲで調製した２６７ｂｐの単位プローブが１０〜１
６０個直列に挿入されたコスミドの調製 実施例５で作製したプラスミドpXFW5×EをSfiΙで切断
し、単位プローブＥが５個直列に連結されたＤＮＡを抽
出した。得られたＤＮＡと、実施例２で作製したシャロ
ミドベクターcd9-4XFWをモル比８０：１で混合し、総Ｄ
ＮＡ濃度が０．２μｇ／μｌとなるように濃縮した後、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。結合させたＤ
ＮＡを、GIGAPACK Π GOLDを用いてin vitro パッケー
ジングし、大腸菌DH5に感染させ、形質導入されたクロ
ーンをアンピシリン耐性マーカーにより選択した。得ら
れたクローンからコスミドを調製し、これをXhoΙおよ
びBamHΙで切断した。０．３５％のアガロースゲルを用
いた電気泳動においてBamHΙで４８ｋｂｐ、XhoΙで
４．５Ｋｂｐと４３．５ｋｂｐのバンドを示す図５のｍ
＝１、ｎ＝１６０の構造を有するクローンを選び出し、
単位プローブＥが１６０個直列に連結して挿入されてい
るコスミドcdXFW160×Eを得た。
６０個直列に挿入されたコスミドの調製 実施例５で作製したプラスミドpXFW5×EをSfiΙで切断
し、単位プローブＥが５個直列に連結されたＤＮＡを抽
出した。得られたＤＮＡと、実施例２で作製したシャロ
ミドベクターcd9-4XFWをモル比８０：１で混合し、総Ｄ
ＮＡ濃度が０．２μｇ／μｌとなるように濃縮した後、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。結合させたＤ
ＮＡを、GIGAPACK Π GOLDを用いてin vitro パッケー
ジングし、大腸菌DH5に感染させ、形質導入されたクロ
ーンをアンピシリン耐性マーカーにより選択した。得ら
れたクローンからコスミドを調製し、これをXhoΙおよ
びBamHΙで切断した。０．３５％のアガロースゲルを用
いた電気泳動においてBamHΙで４８ｋｂｐ、XhoΙで
４．５Ｋｂｐと４３．５ｋｂｐのバンドを示す図５のｍ
＝１、ｎ＝１６０の構造を有するクローンを選び出し、
単位プローブＥが１６０個直列に連結して挿入されてい
るコスミドcdXFW160×Eを得た。
【００７１】同時に、単位プローブＥが５個直列に連結
されたＤＮＡ断片をシャロミドベクターcd9-4XFWに結合
させたＤＮＡをin vitroパッケージングし、大腸菌DH5
に感染させた後、形質導入されたクローンを含む細胞液
を直接アンピシリンを含む培地を用で液体培養し、大腸
菌よりコスミドを調製した。得られたコスミドをBamHΙ
で切断し０．３５％のアガロースゲルで電気泳動を行っ
た。直接液体培養して得られるコスミドは、全体の大き
さは４０〜５０ｋｂｐと均一であるがプラスミド中に含
まれるＣＯＳ部位の数（コスミドベクターの数）とＣＯ
Ｓ部位からＣＯＳ部位の間に挿入されたプローブの数は
不均一である。従って、ベクターを一か所のみ切断する
BamH1Ιの切断パターンは４．５Ｋｂｐ（ベクターのサ
イズ）＋ｎ×５×０．２７ｋｂｐのラダー状となる。そ
こで単位プローブが１０〜８０個挿入されたコスミドを
作製するために先の式においてｎ＝２，４，６，９，１
６に相当する長さのバンドをゲルから分離し、ＤＮＡを
抽出し再びＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて環状ＤＮＡとし
た後、これを用いて形質転換させた大腸菌DH5に１．５
ｍｌ培養し、単位プローブＤが１０、２０、３０、４
５、８０個挿入されたコスミドを調製した。これらのコ
スミドを再びBamH1で切断し、ＤＮＡを０．２μｇ／μ
ｌまで濃縮した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合さ
せた。結合させたＤＮＡをGIGAPACK Π GOLDを用いてin
vitro パッケージングし、大腸菌DH5へ感染させ図５に
示すコスミド2×cdXFW80×E、3×cdXFW45×E、4×cdXFW
30×E、6×cdXFW20×E、8×cdXFW10×Eを有するクロー
ンを単離した。
されたＤＮＡ断片をシャロミドベクターcd9-4XFWに結合
させたＤＮＡをin vitroパッケージングし、大腸菌DH5
に感染させた後、形質導入されたクローンを含む細胞液
を直接アンピシリンを含む培地を用で液体培養し、大腸
菌よりコスミドを調製した。得られたコスミドをBamHΙ
で切断し０．３５％のアガロースゲルで電気泳動を行っ
た。直接液体培養して得られるコスミドは、全体の大き
さは４０〜５０ｋｂｐと均一であるがプラスミド中に含
まれるＣＯＳ部位の数（コスミドベクターの数）とＣＯ
Ｓ部位からＣＯＳ部位の間に挿入されたプローブの数は
不均一である。従って、ベクターを一か所のみ切断する
BamH1Ιの切断パターンは４．５Ｋｂｐ（ベクターのサ
イズ）＋ｎ×５×０．２７ｋｂｐのラダー状となる。そ
こで単位プローブが１０〜８０個挿入されたコスミドを
作製するために先の式においてｎ＝２，４，６，９，１
６に相当する長さのバンドをゲルから分離し、ＤＮＡを
抽出し再びＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて環状ＤＮＡとし
た後、これを用いて形質転換させた大腸菌DH5に１．５
ｍｌ培養し、単位プローブＤが１０、２０、３０、４
５、８０個挿入されたコスミドを調製した。これらのコ
スミドを再びBamH1で切断し、ＤＮＡを０．２μｇ／μ
ｌまで濃縮した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合さ
せた。結合させたＤＮＡをGIGAPACK Π GOLDを用いてin
vitro パッケージングし、大腸菌DH5へ感染させ図５に
示すコスミド2×cdXFW80×E、3×cdXFW45×E、4×cdXFW
30×E、6×cdXFW20×E、8×cdXFW10×Eを有するクロー
ンを単離した。
【００７２】実施例８捕獲用プローブの３’末端へのアミノ基導 入 制限酵素を用いてプラスミドから切断、分離して得られ
たプローブ３’末端へのアミノ基の導入はJ.Huetらの方
法（Methode in Enzymology vol.218 p508）の変法で行
った。すなわちpXFW30×A、pXFW30×B、pXFW1×E、pXFW
5×E、cd9-36XFW30×C、cd9-36XFW30×D、cd9-36XFW30
×E、cd9-28XFW30×F、cd9-28XFW30×G、cdXFW160×E、
2×cdXFW80×E、3×cdXFW45×E、4×cdXFW30×E、6×cd
XFW20×E、および8×cdXFW10×EをScaΙとBamHΙを用い
プローブ部分とベクター部分に切断した後、dGTPおよび
N6-(6-Aminohexyl)dATP（BRL社）を反応液に加え、DNA
PolymeraseΙKlenow FragmentによりBamHΙ切断点の
３’末端へアミノ基を導入した。引き続きXbaΙを用い
て、ベクターに導入されたアミノ基の末端から６ｂｐの
部位で切断し、SephadexG50（ファルマシアバイオテッ
ク株式会社）カラムによりベクター部分からアミノ基を
除去した（図６参照）。
たプローブ３’末端へのアミノ基の導入はJ.Huetらの方
法（Methode in Enzymology vol.218 p508）の変法で行
った。すなわちpXFW30×A、pXFW30×B、pXFW1×E、pXFW
5×E、cd9-36XFW30×C、cd9-36XFW30×D、cd9-36XFW30
×E、cd9-28XFW30×F、cd9-28XFW30×G、cdXFW160×E、
2×cdXFW80×E、3×cdXFW45×E、4×cdXFW30×E、6×cd
XFW20×E、および8×cdXFW10×EをScaΙとBamHΙを用い
プローブ部分とベクター部分に切断した後、dGTPおよび
N6-(6-Aminohexyl)dATP（BRL社）を反応液に加え、DNA
PolymeraseΙKlenow FragmentによりBamHΙ切断点の
３’末端へアミノ基を導入した。引き続きXbaΙを用い
て、ベクターに導入されたアミノ基の末端から６ｂｐの
部位で切断し、SephadexG50（ファルマシアバイオテッ
ク株式会社）カラムによりベクター部分からアミノ基を
除去した（図６参照）。
【００７３】実施例９捕獲用プローブの磁性微粒子の固定 活性化トシル基を有する磁性微粒子(DYNABEADS M-280 T
osyl Activated ダイナル社)２５ｍｇをＴＮＥ（１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．
１５Ｍ 塩化ナトリウム)で３回洗浄した後、実施例８
において３’末端にアミノ基を導入したプローブの１５
０ｐｍｏｌ／ｍｌ溶液（０．２Ｍホウ酸緩衝液 ｐＨ
９．５）２ｍｌに懸濁した後、８時間静かに振盪しトシ
ル基とアミノ基を反応させ、プローブを微粒子へ固定さ
せた。次に微粒子を０．２Ｎの水酸化ナトリウム溶液で
２回洗浄することでプローブを一本鎖にした。
osyl Activated ダイナル社)２５ｍｇをＴＮＥ（１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．
１５Ｍ 塩化ナトリウム)で３回洗浄した後、実施例８
において３’末端にアミノ基を導入したプローブの１５
０ｐｍｏｌ／ｍｌ溶液（０．２Ｍホウ酸緩衝液 ｐＨ
９．５）２ｍｌに懸濁した後、８時間静かに振盪しトシ
ル基とアミノ基を反応させ、プローブを微粒子へ固定さ
せた。次に微粒子を０．２Ｎの水酸化ナトリウム溶液で
２回洗浄することでプローブを一本鎖にした。
【００７４】実施例１０標識一本鎖ＤＮＡプローブの調製 配列番号６または７に示す合成オリゴヌクレオチドＰ１
（配列番号６）およびＰ２（配列番号７）をプライマー
に、ヒトサイトメガロウイルス(ATCC VR538 strain AD-
169)のＤＮＡをテンプレートに用いＰＣＲを行い、サイ
トメガロウイルスＤＮＡのEcoRΙ断片Ｄ遺伝子由来の２
７８ｂｐのＤＮＡを得た。このＤＮＡを含む一本鎖ＤＮ
Ａを得るために、ＰＣＲ産物をklenow断片により両端を
平滑末端にした後、pBluescript Π KS+（ストラタジ
ーン社製）のHincΠサイトへ挿入し得られたクローンの
中からセンス鎖の一本鎖ＤＮＡが得られるクローンを選
択しファジミドpCMV1を得た。pCMV1を用いて大腸菌NM55
3を形質転換した後、ヘルパーファージVCS-M13を感染さ
せ一本鎖ＤＮＡを調製した。得られた一本鎖ＤＮＡはフ
ォトビオチンを用いてFosterらの方法(Nucleic Acid Re
s.,13(3),745,1985)に従ってビオチン標識した。
（配列番号６）およびＰ２（配列番号７）をプライマー
に、ヒトサイトメガロウイルス(ATCC VR538 strain AD-
169)のＤＮＡをテンプレートに用いＰＣＲを行い、サイ
トメガロウイルスＤＮＡのEcoRΙ断片Ｄ遺伝子由来の２
７８ｂｐのＤＮＡを得た。このＤＮＡを含む一本鎖ＤＮ
Ａを得るために、ＰＣＲ産物をklenow断片により両端を
平滑末端にした後、pBluescript Π KS+（ストラタジ
ーン社製）のHincΠサイトへ挿入し得られたクローンの
中からセンス鎖の一本鎖ＤＮＡが得られるクローンを選
択しファジミドpCMV1を得た。pCMV1を用いて大腸菌NM55
3を形質転換した後、ヘルパーファージVCS-M13を感染さ
せ一本鎖ＤＮＡを調製した。得られた一本鎖ＤＮＡはフ
ォトビオチンを用いてFosterらの方法(Nucleic Acid Re
s.,13(3),745,1985)に従ってビオチン標識した。
【００７５】実施例１１捕獲用プローブ固定化磁性微粒子のプレハイブリダイゼ
ーション さらにプローブを固定化した磁性微粒子をプレハイブリ
ダイゼーションするために、ＴＮＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ ｐＨ８．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１５Ｍ 塩化
ナトリウム)で一回洗浄後０．１％ＢＳＡおよび０．０
５％ニシン精子ＤＮＡを加えたＴＮＥに１ｍｇ／ｍｌの
濃度となるようにプローブを固定化した磁性微粒子を懸
濁し１６時間静かに振盪した。
ーション さらにプローブを固定化した磁性微粒子をプレハイブリ
ダイゼーションするために、ＴＮＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ ｐＨ８．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１５Ｍ 塩化
ナトリウム)で一回洗浄後０．１％ＢＳＡおよび０．０
５％ニシン精子ＤＮＡを加えたＴＮＥに１ｍｇ／ｍｌの
濃度となるようにプローブを固定化した磁性微粒子を懸
濁し１６時間静かに振盪した。
【００７６】実施例１２固定化反復プローブを用いたサンドイッチハイブリダイ
ゼーション法によるサイトメガロウイルスＤＮＡ測定用
検量線の作成 単位プローブＥが３０個直列に連結した反復プローブ固
定化磁性微粒子と、既知濃度のサイトメガロウイルスＤ
ＮＡの溶液を用い次のようにしてサイトメガロウイルス
ＤＮＡ測定用検量線を作成した。 １）単位プローブＤが３０個連結した捕獲用プローブを
固定化した磁性微粒子の懸濁液（１００μｇ／ｍｌ）１
００μｌに、ビオチン標識一本鎖ＤＮＡプローブ１００
μｌ、１０5〜１０10個／ｍｌサイトメガロウイルスＤ
ＮＡEcoRΙ断片Ｄがクローニングされたプラスミドの溶
液１０μｌ及び６×ＳＳＣ（０．２％ ＳＤＳ、０．０
５％ ニシン精子ＤＮＡを含む）８００μｌをポリスチ
レン製の試験管へ加え、混合し６８℃、４時間保温しハ
イブリダイゼーションさせた。 ２）磁石で磁性微粒子を試験管の壁に凝集させた後に、
反応溶液を吸引除去し０．１×ＳＳＣ（０．２％ＳＤＳ
を含む）を用いて６８℃で３回洗浄した。 ３）洗浄後１μｇ／ｍｌのアルカリフォスファターゼ−
ストレプトアビジン（ベーリンガーマンハイム株式会
社）、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０（０．１％ＢＳ
Ａ，０．２Ｍ塩化ナトリウム、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、
０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含む)溶液５００μｌに磁
性微粒子を懸濁させ１０分間室温放置した。 ４）反応液を除去した後、 ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ
８．０（０．２Ｍ 塩化ナトリウム、２ｍＭ ＭｇＣｌ
2、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む)で３回洗浄し
た。 ５）次にアルカリフォスファターゼの発光基質であるLu
mi-Phos 530(LUMIGEN社)を200μl加え３７℃１０分間保
温した後、発光強度をルミネッセンスリーダー（アロカ
株式会社BLR-201）を用いて測定した。結果を図７に示
す。
ゼーション法によるサイトメガロウイルスＤＮＡ測定用
検量線の作成 単位プローブＥが３０個直列に連結した反復プローブ固
定化磁性微粒子と、既知濃度のサイトメガロウイルスＤ
ＮＡの溶液を用い次のようにしてサイトメガロウイルス
ＤＮＡ測定用検量線を作成した。 １）単位プローブＤが３０個連結した捕獲用プローブを
固定化した磁性微粒子の懸濁液（１００μｇ／ｍｌ）１
００μｌに、ビオチン標識一本鎖ＤＮＡプローブ１００
μｌ、１０5〜１０10個／ｍｌサイトメガロウイルスＤ
ＮＡEcoRΙ断片Ｄがクローニングされたプラスミドの溶
液１０μｌ及び６×ＳＳＣ（０．２％ ＳＤＳ、０．０
５％ ニシン精子ＤＮＡを含む）８００μｌをポリスチ
レン製の試験管へ加え、混合し６８℃、４時間保温しハ
イブリダイゼーションさせた。 ２）磁石で磁性微粒子を試験管の壁に凝集させた後に、
反応溶液を吸引除去し０．１×ＳＳＣ（０．２％ＳＤＳ
を含む）を用いて６８℃で３回洗浄した。 ３）洗浄後１μｇ／ｍｌのアルカリフォスファターゼ−
ストレプトアビジン（ベーリンガーマンハイム株式会
社）、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０（０．１％ＢＳ
Ａ，０．２Ｍ塩化ナトリウム、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、
０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含む)溶液５００μｌに磁
性微粒子を懸濁させ１０分間室温放置した。 ４）反応液を除去した後、 ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ
８．０（０．２Ｍ 塩化ナトリウム、２ｍＭ ＭｇＣｌ
2、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む)で３回洗浄し
た。 ５）次にアルカリフォスファターゼの発光基質であるLu
mi-Phos 530(LUMIGEN社)を200μl加え３７℃１０分間保
温した後、発光強度をルミネッセンスリーダー（アロカ
株式会社BLR-201）を用いて測定した。結果を図７に示
す。
【００７７】実施例１３反復プローブの反復数の効果 単位プローブＤが１、５，１０，２０，３０，４５，８
０または１６０個直列に連結した反復プローブ固定化磁
性微粒子を用いて、プローブ反復の効果を検討するた
め、実施例１２と同様にして１０5分子／試験管サイト
メガロウイルスＤＮＡの検出を行った。
０または１６０個直列に連結した反復プローブ固定化磁
性微粒子を用いて、プローブ反復の効果を検討するた
め、実施例１２と同様にして１０5分子／試験管サイト
メガロウイルスＤＮＡの検出を行った。
【００７８】その結果、図８に示すように発光強度は単
位プローブ連結数３０〜４５で最大を示し、単一のプロ
ーブと比べ約１５倍であった。
位プローブ連結数３０〜４５で最大を示し、単一のプロ
ーブと比べ約１５倍であった。
【００７９】実施例１４反復プローブを構成する単位プローブの長さが感検出度
に与える影響 実施例９で調製し実施例１１においてプレハイブリダイ
ゼーションをおこなった、２２、５３、１１８、１６
４、２６７、５２１、９７６ｂｐの単位プローブＡ、
Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇが３０個直列に連結した直列反
復プローブ固定化磁性微粒子を用い、０〜１０8個／試
験管のサイトメガロウイルスＤＮＡ断片を実施例１２と
同様に測定し、検量線を作製し感度を求め図９に示し
た。反応及び洗浄時の温度は、表１に示すように使用す
る固定化直列反復プローブを構成する単位プローブのＴ
ｍ値−２０℃とした。他の条件は実施例１２と同様であ
る。感度をウイルスＤＮＡ量０の時の発光強度の平均＋
３ＳＤの値から読まれるＤＮＡ断片数と定義すると各プ
ローブを用いたときの感度は表１の様に算出された。５
００ｂｐまでは単位プローブの長さが長くなるに従いＤ
ＮＡ濃度０における発光強度が低下し感度が上昇した。
２６７ｂｐのプローブＤを２２ｂｐのプローブＡと比較
すると約５０倍高感度であった。これは単位プローブが
長くなるとＴｍが高くなり、より高い温度でハイブリダ
イゼーションと洗浄を行うことができるため非特異的な
ハイブリダイズや標識プローブの吸着が減少するためと
考えられる。一方、単位プローブの長さが９７６ｂｐと
なると発光量が低下している。これは単位プローブの長
さが約１ｋｂｐ、連結数が３０個となるとその反復プロ
ーブの全長は３０ｋｂｐを越え、反応中にプローブの切
断が起こるためと考えられた。
に与える影響 実施例９で調製し実施例１１においてプレハイブリダイ
ゼーションをおこなった、２２、５３、１１８、１６
４、２６７、５２１、９７６ｂｐの単位プローブＡ、
Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇが３０個直列に連結した直列反
復プローブ固定化磁性微粒子を用い、０〜１０8個／試
験管のサイトメガロウイルスＤＮＡ断片を実施例１２と
同様に測定し、検量線を作製し感度を求め図９に示し
た。反応及び洗浄時の温度は、表１に示すように使用す
る固定化直列反復プローブを構成する単位プローブのＴ
ｍ値−２０℃とした。他の条件は実施例１２と同様であ
る。感度をウイルスＤＮＡ量０の時の発光強度の平均＋
３ＳＤの値から読まれるＤＮＡ断片数と定義すると各プ
ローブを用いたときの感度は表１の様に算出された。５
００ｂｐまでは単位プローブの長さが長くなるに従いＤ
ＮＡ濃度０における発光強度が低下し感度が上昇した。
２６７ｂｐのプローブＤを２２ｂｐのプローブＡと比較
すると約５０倍高感度であった。これは単位プローブが
長くなるとＴｍが高くなり、より高い温度でハイブリダ
イゼーションと洗浄を行うことができるため非特異的な
ハイブリダイズや標識プローブの吸着が減少するためと
考えられる。一方、単位プローブの長さが９７６ｂｐと
なると発光量が低下している。これは単位プローブの長
さが約１ｋｂｐ、連結数が３０個となるとその反復プロ
ーブの全長は３０ｋｂｐを越え、反応中にプローブの切
断が起こるためと考えられた。
【００８０】
【表１】 実施例１５ハイブリダイゼーションおよび洗浄温度の検出感度への
影響 ハイブリダイゼーション及び洗浄時の温度を一律３５℃
もしくは６８℃に固定し、他の条件は実施例１２と全く
同様にしてサイトメガロウイルスＤＮＡの測定を行っ
た。結果は表２と図１０及び図１１に示した。６８℃で
反応と洗浄を行うと５０ｂｐ以下の長さのプローブでは
大きく感度が低下した。また３５℃では全ての長さのプ
ローブで感度に大きな差が認められず、しかも１００ｂ
ｐ以上の長さのプローブを用いた場合でも、感度は６８
℃の場合の約１／２０であった。すなわち高い感度を得
るためには高温でハイブリダイゼーションと洗浄を行う
必要があり、そのためには反復プローブを構成する単位
プローブの長さは少なくとも１００ｂｐ以上必要であっ
た。３５℃の場合のグラフが図１１である。
影響 ハイブリダイゼーション及び洗浄時の温度を一律３５℃
もしくは６８℃に固定し、他の条件は実施例１２と全く
同様にしてサイトメガロウイルスＤＮＡの測定を行っ
た。結果は表２と図１０及び図１１に示した。６８℃で
反応と洗浄を行うと５０ｂｐ以下の長さのプローブでは
大きく感度が低下した。また３５℃では全ての長さのプ
ローブで感度に大きな差が認められず、しかも１００ｂ
ｐ以上の長さのプローブを用いた場合でも、感度は６８
℃の場合の約１／２０であった。すなわち高い感度を得
るためには高温でハイブリダイゼーションと洗浄を行う
必要があり、そのためには反復プローブを構成する単位
プローブの長さは少なくとも１００ｂｐ以上必要であっ
た。３５℃の場合のグラフが図１１である。
【００８１】
【表２】 実施例１６培養法との比較 一般にサイトメガロウイルスの検出法として行われてい
る、短期間培養細胞を用いて試料中のサイトメガロウイ
ルスを培養し、出現する初期核蛋白を蛍光免疫組織染色
法にて検出するシェルバイアル法(Curt A.Gleaves,Thom
as F.Smith,Elizabeth A.Shuster,and Gray R Pearson
:J.Clin.Micro.,21,217-221)と、本法の一致率を確認
した。健常人及びサイトメガロウイルス感染を疑われる
患者の尿、計３１検体をシェルバイアル法と本法とでウ
イルスの検出を試みた。シェルバイアル法はCurtらの方
法に従い、また本法による測定は次の様にして行った。
H.Specterらの方法(Clin. Chem. 31/9,1514-1520,1985)
に従い尿からＤＮＡを抽出した。すなわち尿１０ｍｌを
３００００×ｇ、１ｈｒ遠心し、ペレットを得る。ペレ
ットを１０ｍＭのＥＤＴＡに再懸濁しＳＤＳ、Ｐｒｏｔ
ｅｎａｓｅＫ、ＲＮａｓｅ処理した後フェノールクロロ
ホルム抽出を行い、エタノール沈殿させる。沈殿したＤ
ＮＡをトリス塩酸−ＥＤＴＡ緩衝液１００μｌに溶解さ
せ、これを試料として実施例１２に示した方法に従って
測定を行った、結果を表３に示す。
る、短期間培養細胞を用いて試料中のサイトメガロウイ
ルスを培養し、出現する初期核蛋白を蛍光免疫組織染色
法にて検出するシェルバイアル法(Curt A.Gleaves,Thom
as F.Smith,Elizabeth A.Shuster,and Gray R Pearson
:J.Clin.Micro.,21,217-221)と、本法の一致率を確認
した。健常人及びサイトメガロウイルス感染を疑われる
患者の尿、計３１検体をシェルバイアル法と本法とでウ
イルスの検出を試みた。シェルバイアル法はCurtらの方
法に従い、また本法による測定は次の様にして行った。
H.Specterらの方法(Clin. Chem. 31/9,1514-1520,1985)
に従い尿からＤＮＡを抽出した。すなわち尿１０ｍｌを
３００００×ｇ、１ｈｒ遠心し、ペレットを得る。ペレ
ットを１０ｍＭのＥＤＴＡに再懸濁しＳＤＳ、Ｐｒｏｔ
ｅｎａｓｅＫ、ＲＮａｓｅ処理した後フェノールクロロ
ホルム抽出を行い、エタノール沈殿させる。沈殿したＤ
ＮＡをトリス塩酸−ＥＤＴＡ緩衝液１００μｌに溶解さ
せ、これを試料として実施例１２に示した方法に従って
測定を行った、結果を表３に示す。
【００８２】一致率は９０．３％と高率であった。本法
は核酸の抽出から結果が得られるまで約６時間である、
従来のシェルバイヤル法と比べ迅速かつ簡便であり有用
な方法であることが示された。
は核酸の抽出から結果が得られるまで約６時間である、
従来のシェルバイヤル法と比べ迅速かつ簡便であり有用
な方法であることが示された。
【００８３】
【表３】
【００８４】
【発明の効果】本発明の反復プローブを用いた核酸の検
出法はより高い温度でハイブリダイゼーション後の系内
を洗浄操作ができるため、従来の方法に比して感度がよ
り高く、従って試料中に存在するごく微量の核酸を感度
よく、定量的に測定できる。そのため、病原体ウィルス
あるいは細菌の検出に有効である。
出法はより高い温度でハイブリダイゼーション後の系内
を洗浄操作ができるため、従来の方法に比して感度がよ
り高く、従って試料中に存在するごく微量の核酸を感度
よく、定量的に測定できる。そのため、病原体ウィルス
あるいは細菌の検出に有効である。
【００８５】
配列番号：１ 配列の長さ： 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTACTCGAGGGCCACCGAGGCCATTTAAATGGCCACCGAGGCCTCGA AGCTCCCGGTGGCTCCGGTAAATTTACCGGTGGCTCCGGAGCTCATG
【００８６】配列番号：２ 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCGAAATGGG ACCCAGTACG GA 22
【００８７】配列番号：３ 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCTGGCTTTA CCCTGGGTCA TG 22
【００８８】配列番号：４ 配列の長さ：53 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CACGGCTTTC AGCACGTGCC CCGAAATGGG ACCCAGTACG GATATCATTT CGG 53
【００８９】配列番号：５ 配列の長さ：53 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GCCGTGCCGA AAGTCGTGCA CGGGGCTTTA CCCTGGGTCA TGCCTATAGT AAA 53
【００９０】配列番号：６ 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AAAATAGAGG CGCCCCAG 18
【００９１】配列番号：７ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CACTGCCTTA CTTTGTACGC 20
【００９２】配列番号：８ 配列の長さ：34 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGGTTTAAAC GCGTATCGCC GCGACTAAAC ACGG 34
【００９３】配列番号：９ 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGGTTTAAAC TACACCCGTA CGCGCAGGCA GCATG 35
【００９４】配列番号：１０ 配列の長さ：34 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGGTTTAAAC TCTGCAGGAG TCGCGTCTCG TGCG 34
【００９５】配列番号：１１ 配列の長さ：34 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGGTTTAAAC CCGCTCAGTC GCCTACACCC GTAC 34
【００９６】配列番号：１２ 配列の長さ：34 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGGTTTAAAC GTGGATACCC GTCTGCAGGA GTCG 34
【００９７】配列番号：１３ 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGGTTTAAAC ATAATCCGCG GTTGTCTCTG TGTAG 35
【００９８】配列番号：１４ 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGGTTTAAAC ACCGACACGT CCTCCACCTC GCTGC 35
【００９９】配列番号：１５ 配列の長さ：34 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGGTTTAAAC GACACTAGGC GTCCGCGCCA TACG 34
【０１００】配列番号：１６ 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGGTTTAAAC AATCACAGCG TCAGCTACGG GCAGG 35
【０１０１】配列番号：１７ 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGGTTTAAAC TCGTCAAAGC ATACGCTGAA TCGGG 35
【図１】cd9-42XFW、cd9-36XFW、cd9-28XFWおよびcd9-2
0XFWの調製を表す図
0XFWの調製を表す図
【図２】cd9-4XFW、pXFWの調製を表す図である
【図３】pXFW5×単位プローブの調製を表す図である
【図４】cdXFW30×単位プローブの調製を表す図である
【図５】m×cdXFWn×単位プローブＤの構造を表す図で
ある
ある
【図６】反復核酸構造プローブ３’端へのアミノ基導入
を表す図である
を表す図である
【図７】検量線を表す図である
【図８】単位プローブ反復数の効果を表す図である
【図９】単位プローブ長の影響を表す図である
【図１０】反応洗浄温度６８℃の影響を表す図である
【図１１】反応洗浄温度３５℃の影響を表す図である
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 斎藤 泉 東京都港区白金台４−６−１ 東京大学医 科学研究所内
Claims (10)
- 【請求項１】 被検出核酸と特異的にハイブリダイズ可
能な１００ｂｐ以上の単位プローブを１０個以上直列に
同一方向に連結し、全長が３０ｋｂｐ以下であることを
特徴とするサンドイッチハイブリダイゼーション法捕獲
用核酸プローブ。 - 【請求項２】 連結数が１０個以上８０個以下であるこ
とを特徴とする請求項１に記載の核酸プローブ。 - 【請求項３】 単位核酸が１００ｂｐ以上１０００ｂｐ
以下であることを特徴とする請求項１に記載の核酸プロ
ーブ。 - 【請求項４】 全長が５−３０ｋｂｐであることを特徴
とする請求項１に記載の核酸プローブ。 - 【請求項５】 単位核酸は１５０ｂｐ以上５００ｂｐ以
下であり、単位核酸の連結数は少なくとも２０であるこ
とを特徴とする請求項１に記載の核酸プローブ。 - 【請求項６】（Ａ）〜（Ｅ）の工程からなる核酸検出
法。 （Ａ）被検出核酸と特異的にハイブリダイズ可能な単位
プローブが１０から１６０個同一方向に直列に連結し、
全長が３０ｋｂｐ以下である反復プローブを固相へ固定
化する工程。 （Ｂ）上記（Ａ）で固定化した反復プローブを一本鎖核
酸とし、＋鎖若しくは−鎖を分離して固定化一本鎖反復
プローブを作製する工程。 （Ｃ）固定化一本鎖反復プローブと被検出核酸を含む試
料と標識プローブとを混合してハイブリダイゼーション
する工程。 （Ｄ）固相を６０℃以上７０℃以下の温度で洗浄する工
程。 （Ｅ）標識プローブの標識を用いて被検出核酸を検出す
る工程。 - 【請求項７】連結数が１０個以上８０個以下である反復
プローブを用いる請求項６記載の核酸検出法。 - 【請求項８】単位核酸が１００ｂｐ以上１０００ｂｐ以
下である反復プローブを用いる請求項６記載の核酸検出
法。 - 【請求項９】全長が５−３０ｋｂｐである反復プローブ
を用いる請求項６記載の核酸検出法。 - 【請求項１０】単位核酸が１５０ｂｐ以上５００ｂｐ以
下であり、単位核酸の連結数は少なくとも２０である反
復プローブを用いる請求項６記載の核酸検出法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23263794A JPH0889300A (ja) | 1994-09-28 | 1994-09-28 | 核酸検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23263794A JPH0889300A (ja) | 1994-09-28 | 1994-09-28 | 核酸検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0889300A true JPH0889300A (ja) | 1996-04-09 |
Family
ID=16942427
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23263794A Pending JPH0889300A (ja) | 1994-09-28 | 1994-09-28 | 核酸検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0889300A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20140131960A (ko) * | 2012-02-27 | 2014-11-14 | 도레이 카부시키가이샤 | 핵산의 검출 방법 |
-
1994
- 1994-09-28 JP JP23263794A patent/JPH0889300A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20140131960A (ko) * | 2012-02-27 | 2014-11-14 | 도레이 카부시키가이샤 | 핵산의 검출 방법 |
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