JP2005312442A

JP2005312442A - マイクロビーズの精製方法

Info

Publication number: JP2005312442A
Application number: JP2005103344A
Authority: JP
Inventors: Sachiko Okamoto; 幸子岡本; Junichi Mineno; 純一峰野; Kiyozou Asada; 起代蔵浅田; Ikunoshin Kato; 郁之進加藤
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 2004-03-31
Filing date: 2005-03-31
Publication date: 2005-11-10

Abstract

【課題】マイクロビーズアレイ作製時に、セルソーターなどの機器を使用することなく、標的核酸が結合したマイクロビーズを簡便に選別する手段および該手段に用いるマイクロビーズを提供すること。
【解決手段】固定化すべき標的核酸を少なくとも２種類の標識物質によって標識することにより、標的核酸が結合したマイクロビーズを、セルソーターを使用せずに選別する方法。すなわち、固定化すべき標的核酸を少なくとも２種類の標識、例えば検出可能な標識物質と固相に結合しうる標識物質、例えば蛍光物質とビオチンにより標識し、固相に結合しうる標識物質を用いてマイクロビーズを選別する方法。固定化すべき標的核酸が少なくとも２種類の標識物質によって標識された、標的核酸が結合したマイクロビーズ。
【選択図】なし

Description

本発明は、マイクロビーズアレイ技術において、２種類の標識核酸を用いた精製法、および該方法によって調製されたマイクロビーズアレイに関する。

ＤＮＡマイクロビーズアレイ技術の詳細について、ブレナーらが報告している（例えば、特許文献１、特許文献２、非特許文献１および非特許文献２）。上記ＤＮＡマイクロビーズアレイ技術においては、タグベクターにクローニングされた核酸（以下、標的核酸と称す）をＰＣＲ（ポリメラーゼチェインリアクション）にて増幅してタグを１本鎖化した上で、ビーズ上に結合したアンチタグとの間のハイブリダイゼーションによって１個のマイクロビーズには単一の標的核酸が対応づけられる。次いで、標的核酸がハイブリダイゼーションによって結合したマイクロビーズを、セルソーターを用いて選別する。

非特許文献１でブレナーらは以下のように順次、上記の酵素反応と化学反応を行っている。Ａ：ビオチン標識したアンチセンス側（タグ側）プライマーと、ＦＡＭ標識したセンス側（標的核酸側）プライマーを用いたＰＣＲによる、タグベクターにクローニングされた標的ＤＮＡの増幅、Ｂ：制限酵素ＰａｃＩによる増幅産物の切断、Ｃ：ストレプトアビジン担体による増幅産物の精製、Ｄ：ｄＧＴＰ存在下でのＴ４ＤＮＡポリメラーゼによるタグ部分の１本鎖化、Ｅ：マイクロイビーズと増幅産物とのハイブリダイゼーション、Ｆ：洗浄、Ｇ：セルソーターによる、蛍光標識ビーズの選別。

以上のように、上記ブレナーらの方法によれば、１６，７００，０００個のマイクロビーズに１６０，０００種類のタグ結合ｃＤＮＡをハイブリした後の精製工程にて、ハイブリダイズしたマイクロビーズを選別するのに、セルソーターを必要とする。また、ハイブリダイズしたマイクロビーズは全体の約０．９６％であり、９９．０４％のハイブリダイズしていないビーズは個数として１６，５４０，０００個であるため、高速のセルソーターを必要とし、実際の工程では１６，７００，０００個のマイクロビーズを１ユニットとして１８ユニット、３００，６００，０００個のマイクロビーズから選別するため、高速のセルソーターを用いても選別に長時間を要するため、簡便に選別する方法が望まれていた。

特開平１１−５０７５２８号公報特開２０００−５１５００６号公報ＢｒｅｎｎｅｒＳ．他１２名Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ２０００年ｖｏｌ．９７、ｐ１６６５−１６７０ＢｒｅｎｎｅｒＳ．他２３名ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２０００年ｖｏｌ．１８、ｐ６３０−６３４

本発明の課題は、ＤＮＡマイクロビーズアレイ作製時に、標的核酸が結合したマイクロビーズを簡便に選別する手段を提供することにある。

本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、上記過程において固定化すべき標的核酸を少なくとも２種類の標識物質によって標識することにより、標的核酸が結合したマイクロビーズを、セルソーターを使用せずに選別できることを見出して本発明を完成させた。すなわち、センス側のプライマーを２種類の標識、例えば検出可能な標識物質と固相に結合しうる標識物質、例えばＦＡＭとビオチンで標識したものを使用し、アンチセンス側は標識しないプライマーを用いて、タグベクターにクローニングされた標的核酸を増幅する。

すなわち、本発明の第１の発明は、標的とする核酸を固定化したマイクロビーズの精製方法であって、少なくとも２種類の標識物質で標識された核酸をマイクロビーズに共有結合を介して固定化する工程、ここで、前記標識の少なくとも１つは検出可能な標識物質であり、さらに別の標識は、前記マイクロビーズとは異なる固相に結合しうる標識物質であり、
前記核酸固定化マイクロビーズを前記マイクロビーズとは異なる固相に結合させる工程を含むことを特徴とする核酸固定化マイクロビーズの精製方法に関する。

本発明の第１の発明においては、上記の少なくとも２種類の標識物質が同一核酸上に配置されていてもよく、上記の検出可能な標識物質は、蛍光物質、化学発光物質、酵素、放射性同位体からなる群より選択される標識物質が例示される。また、前記マイクロビーズとは異なる固相に結合しうる標識物質は、ビオチン、アビジン、ハプテンからなる群から選択される標識物質が例示される。

本発明の第２の発明は、本発明の第１の発明の核酸固定化マイクロビーズの精製方法のためのキットに関する。

本発明の第３の発明は、１つのマイクロビーズに同一の標的とする核酸が固定化されたマイクロビーズであって、当該核酸は少なくとも２種類の標識物質で標識されており、ここで、前記標識の少なくとも１つは検出可能な標識物質であり、さらに別の標識は、前記マイクロビーズとは異なる固相に結合しうる標識物質であることを特徴とする核酸固定化マイクロビーズアレイに関する。

本発明の第３の発明において、上記の少なくとも２種類の標識物質が同一核酸上に配置されていてもよく、上記の検出可能な標識物質は、蛍光物質、化学発光物質、酵素、放射性同位体からなる群より選択される標識物質が例示される。さらに、前記マイクロビーズとは異なる固相に結合しうる標識物質は、ビオチン、アビジン、抗原、抗体、ハプテンからなる群から選択される標識物質が例示される。

本発明の第４の発明は、本発明の第３の発明のの核酸固定化マイクロビーズアレイを調製するためのキットに関する。

本発明により、ＤＮＡマイクロビーズアレイ作製時に、標的核酸が結合したマイクロビーズを簡便に選別することができる。

本明細書で使用する用語の定義と説明は以下の通りである。特に定義するもの以外は分子生物学、分子遺伝学等の当業者の間で一般的に理解されている意味で用語を用いている。

「ＤＮＡマイクロビーズアレイ技術」とは特許文献１、特許文献２、非特許文献１および非特許文献２に開示された技術およびこれを応用して遺伝子発現や遺伝子構造を解析する技術及びそれと実質的に同等な技術を意味する。即ち、マイクロビーズに結合したアンチタグ配列と標的核酸に結合したタグ配列との間のハイブリダイゼーションによって、特定の標的核酸を特定のマイクロビーズ上に配置し、標的核酸が固定されたマイクロビーズのライブラリーを作製する技術である。この時、１個のマイクロビーズ上には同一の標的核酸が固定される。

「メガクローン」とは、タグと呼ぶオリゴヌクレオチドを結合した核酸と、タグに相補的なオリゴヌクレオチドであるアンチタグを結合したマイクロビーズとを、タグとアンチタグの間のハイブリダイゼーションにより結合させる技術である。その結果、マイクロビーズ上に固定化されたＤＮＡのライブラリーを作製することができ、１個のマイクロビーズには１種類の（同一の）核酸が結合している。

「タグライブラリー」とはＤＮＡマイクロビーズアレイ技術においてマイクロビーズに結合させる核酸のライブラリーを意味する。タグライブラリーの各クローンはマイクロビーズに結合させる核酸とタグ配列を同一分子内に含む核酸であり、これらのクローンの集合がタグライブラリーである。

「タグ」とはＤＮＡマイクロビーズアレイ技術においてマイクロビーズに結合させる核酸と共有結合により結合しているオリゴヌクレオチドであり、各マイクロビーズに同一の核酸を配置するために使用する。タグのレパートリーはタグライブラリーのクローン数よりも十分に大きいことが必要である。

「１本鎖タグ」とは、特許文献１で開示されているオリゴヌクレオチドタグを意味する。

「アンチタグ」とは１本鎖タグに完全に相補的なオリゴヌクレオチドを意味する。ＤＮＡマイクロビーズアレイ技術において、アンチタグはマイクロビーズと共有結合により結合したオリゴヌクレオチドであり、前記のタグと相補的な配列を持つ。１個のマイクロビーズには単一配列のアンチタグが結合しており、アンチタグのレパートリーはタグのレパートリーと実質的に同じ大きさである。１本鎖タグとアンチタグがアニールして２本鎖になったものをタグまたは２本鎖タグと呼ぶ。

「タグ配列」とは、上記１本鎖タグあるいはアンチタグとして用いられるオリゴヌクレオチドの配列のことを意味し、その構造に特に限定はないが、例えば３〜６塩基のオリゴヌクレオチドからなるサブユニットを複数個含むものが挙げられる。特に限定はされないが、例えばアンチタグ配列の一例は、非特許文献１に記載されているものが好適に使用できる。即ち、ＴＴＡＣ、ＡＡＴＣ、ＴＡＣＴ、ＡＴＣＡ、ＡＣＡＴ、ＴＣＴＡ、ＣＴＴＴ及びＣＡＡＡのいずれかから選択されるワード（ｗｏｒｄ、特許文献１におけるサブユニットに相当する）が８個連結した３２塩基からなるオリゴヌクレオチドで、８^８＝約１７００万種類の配列からなる。また、上記１本鎖タグは、このアンチタグに相補的な３２塩基のオリゴヌクレオチドであり、アンチタグと同様に約１７００万種類の配列からなる。さらに上記１本鎖タグのいずれかと、それと完全に相補的な配列を有するアンチタグがアニールしたものが２本鎖タグであり、３２塩基対の２本鎖オリゴヌクレオチドである。これも同様に約１７００万種類の配列からなる。

１本鎖タグ、アンチタグ、タグ及び２本鎖タグは他の分子と共有結合していないオリゴヌクレオチドであってもよいし、他のＤＮＡ、マイクロビーズ、蛍光物質、その他の分子と共有結合したものであってもよい。また、塩基の一部または全部が修飾塩基、特に限定はされないが例えば５−メチルシトシン、７−デアザグアニン、６−メチルアデニンで置換されていてもよい。

「標的とする核酸」（以下標的核酸と称する場合もある）とは、マイクロビーズに結合させようとする核酸およびマイクロビーズに結合した核酸配列を意味し、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびこれらの誘導体であってもよい。また、標的核酸の領域に特に制限はなく、遺伝子の全領域でもよいし、５’側または３’側の断片のみでもかまわない。本明細書において標的核酸配列は、その由来に限定はない。例えば、動物、植物、真核微生物、原核微生物、ウイルス等が挙げられる。さらに、標的核酸の調製方法に特に限定はなく、例えばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、これらからＰＣＲにより増幅した核酸配列、これらの制限酵素断片、これらの核酸をベクター、例えばプラスミドベクターまたはバクテリオファージベクター、にクローン化した核酸、クローン化した核酸の混合物、およびこれらのクローン化した核酸から制限酵素消化等によりベクター部分を除去したもの、およびこれらを物理的または化学的に処理したもののいずれもが好適に使用できる。すなわち、本発明に使用するマイクロビーズアレイに固定化できるものであれば、天然由来の核酸配列あるいは人工的に調製した核酸配列のいずれもが標的核酸として好適に使用できる。

「メガソート」とはマイクロビーズ上の核酸に対し、異なる色素、例えばＣｙ５とＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎなどでラベルした２種のプローブを、マイクロビーズに競合ハイブリダイズさせ、発現変動する遺伝子をフローサイトメーターなどにより、分離する技術である。

「ＭＰＳＳ法」とは特許文献２および非特許文献２に開示された技術を意味する。すなわち、マイクロビーズアレイ技術により作製した、核酸が結合したマイクロビーズをフローセルに２次元的に充填し、タイプＩＩｓ制限酵素による消化、それにより生成した突出末端へのアダプターの連結、連結されたアダプターの蛍光プローブによる塩基配列の識別をフローセル中で行う技術である。

本明細書において「マイクロビーズアレイ」とは、マイクロビーズアレイ技術によって作製した、標的核酸が共有結合により固定されたマイクロビーズの集合体のことを意味する。当該集合体の形態としては、特に限定はされないが例えば、ＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣＨＢ−８０６５）で発現している実質的にすべてのｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡの制限酵素断片を固定したマイクロビーズの集合体が挙げられる。

本明細書において「固定化すべき核酸」とは、２本鎖の標的核酸に１本鎖タグが共有結合したもののことを言う。本発明の方法において、固定化すべき核酸の密度は、５μｍのマイクロビーズを用いる場合、マイクロビーズ１個あたり好ましくは１０^３〜１０^６分子、さらに好ましくは１０^４〜１０^５分子である。

本明細書において、「検出可能な標識物質」とは、検出手段により検出可能な標識物質である。例えば、蛍光物質、化学発光物質、酵素、放射性同位体、ビオチン、アビジン、抗原、ハプテンなどが例示される。

本明細書において、「固相に結合しうる標識物質」とは、物理的に選別可能な標識物質である。特に限定はされないが例えば、ビオチン、アビジン、抗原、ジゴキシゲニン等のハプテンが好適に使用できる。

以下、本発明を詳細に説明する。
（１）目的遺伝子の塩基配列の一部または全部を含む核酸を調製する工程
標的核酸を調製するために、例えば、ゲノム或いは、ポリＡＲＮＡや全ＲＮＡから合成した核酸を調製する。核酸配列の領域に特に制限はなく、遺伝子の全領域でもよいし、５’側または３’側の断片のみでもかまわない。また、核酸配列は、その由来に限定はなく、例えば、動物、植物、真核微生物、原核微生物、ウイルス等であってもよい。さらに、核酸の調製方法に特に限定はなく、例えばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、これらからＰＣＲにより増幅した核酸、これらの制限酵素断片、これらの核酸をベクター、例えばプラスミドベクターまたはバクテリオファージベクターにクローン化した核酸、クローン化した核酸の混合物、およびこれらのクローン化した核酸から制限酵素消化等によりベクター部分を除去したもの、およびこれらを物理的または化学的に処理したもののいずれもが好適に使用できる。すなわち、本発明に使用するマイクロビーズアレイに固定化できるものであれば、天然由来の核酸配列あるいは人工的に調製した核酸のいずれもが標的核酸として好適に使用できる。核酸の調製法に限定はなく、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＰＣＲ産物、これらの制限酵素断片、これらを物理的または化学的に処理したもののいずれもが好適に使用できる。

（２）核酸をタグベクターに連結し、タグライブラリーを作製する工程
（１）で作製された核酸を、タグ配列を有するベクター（以下、タグベクターと称す。）に連結する。タグベクターに含まれるタグ配列としては、特許文献１に開示されたものが使用でき、その中でも、非特許文献１に述べられたものが特に好適に使用できる。また、タグベクターは薬剤耐性等の選択マーカーを含んでいることが望ましい。特に限定はされないが、例えば大腸菌を宿主として使用する場合、マーカーとしてはアンピシリン耐性、クロラムフェニコール耐性、カナマイシン耐性、ストレプトマイシン耐性等の薬剤耐性遺伝子が使用できる。

核酸が連結されたタグベクターを適当な宿主、例えば、大腸菌ベクターの場合は大腸菌に導入する。核酸の宿主への導入は公知の方法によって行うことができ、特に限定はないが、大腸菌を宿主として形質転換を行う場合にはエレクトロポレーション法やコンピテントセルを用いた方法が使用できる。タグベクターのマーカー遺伝子に対応する選択圧のもと、形質転換体を培養し、その細胞から断片化核酸とタグベクターが連結された核酸の混合物であるタグライブラリーを調製する。タグライブラリー調製においては、公知の方法で核酸の調製を実施すればよく、例えば、タグベクターがプラスミドベクターである場合には例えばアルカリ−ＳＤＳ法や市販のキットが使用できる。

（３）タグライブラリーから上記核酸にタグ配列が結合した固定化すべき核酸を調製し、マイクロビーズに結合させる工程
本発明の方法においては、固定化すべき核酸の標的核酸側を複数の種類、特に２種類の標識物質により標識することを特徴とする。核酸の標識方法としては既にいろいろな方法が知られている。例えば、その末端にアミノ基やチオール基を導入し、その官能基を利用して蛍光色素を結合する系が一般的である。あるいは、ＰＣＲでの増幅時に蛍光色素やアイソトープを取り込ませる方法等、様々な方法がある。
標識物質は、検出可能であれば何でもよい。特に限定はされないが例えば、蛍光物質（蛍光基）である標識物質として、ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ＲＯＸ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、ＴｅｘａｓＲｅｄ、Ｃｙ３、Ｃｙ５などが好適に使用できる。また、蛍光物質以外の標識物質としては、化学発光物質、酵素、放射性同位体、ビオチン、アビジン、抗体、ジゴキシゲニン等のハプテンなどより選択される。

本発明の方法においては、検出可能な標識物質と固相に結合しうる標識物質を選択することができる。特に限定はされないが、例えば、ＦＡＭとビオチンを好適に使用することができる。さらに、固定化すべき核酸がそれぞれの標識物質により標識された固定化すべき核酸の混合物であってもよく、１分子の固定化すべき核酸に複数の標識物質が標識されていても良い。

タグライブラリーから固定化すべき核酸を調製する方法は、特に限定はされないが、制限酵素による切断、核酸増幅反応が挙げられる。特に、ＰＣＲなどの核酸増幅反応により、標的核酸断片とタグを含む標的核酸をタグライブラリーから調製する方法が好適に使用できる。この場合、核酸増幅反応に使用するプライマーのうち標的核酸側のプライマーは、検出可能な標識物質と固相に結合しうる標識物質で標識されたプライマーの混合物を用いてもよく、１つのプライマーが検出可能な標識物質と固相に結合しうる標識物質で標識されたプライマーを用いてもよい。そして、タグ側のプライマーは標識しないものを用いる。検出可能な標識物質と固相に結合しうる標識物質の混合比は、０．１：１〜５０：１が望ましい。さらに好ましくは、１：１〜２０：１が望ましい。検出可能な標識物質は、下記（４）のモニタリングで用いる事が出来るものであれば特に特に限定されない。固相に結合しうる標識物質は、下記（５）の分離に使用できるようなものであれば特に限定ない。

本発明の方法において、標識する部位は、固定化すべき核酸に標識されるものであればどこでも良い。特に限定はされないが、例えば、固定化すべき核酸をタグライブラリーよりＰＣＲ増幅する際に使用するプライマーの５’末端に標識物質を導入する方法が好適に使用できる。また、ＰＣＲ増幅の際に標識された核酸を取り込ませてもよいし、増幅産物を化学的に修飾することにより標識してもよい。さらに、標識物質は、核酸の塩基部分に導入されていてもよく、糖部分に導入されていてもよい。

この核酸のタグ部分を例えば次の方法により１本鎖化する。非特許文献１のタグはＡ、Ｔ、Ｇ塩基からなり、タグの相補鎖はＴ、Ａ、Ｃからなる。前記核酸について、必要に応じてタグとタグ側の末端の間を切断する制限酵素で消化、末端断片を除去したのち、ｄＧＴＰ存在下でＴ４ＤＮＡポリメラーゼを作用させることによりタグ部分だけを１本鎖化できる。

こうして得られた１本鎖タグつき標的核酸断片を、アンチタグが結合したマイクロビーズ（以下、マイクロビーズと称す。）に結合させる。マイクロビーズの材質には特に限定はなく、使用目的によって異なるが、例えばガラス、低架橋ポリスチレン、高架橋ポリスチレン、グリシダルメタクリレート、磁性体等が挙げられる。また、マイクロビーズのサイズにも特に限定はなく、使用目的によって異なるが、例えば直径が１μｍ〜１００μｍであればよい。

マイクロビーズは、例えば特許文献１と非特許文献１に記載された方法で調製することができる。１本鎖タグつき標的核酸（固定化すべき核酸）とマイクロビーズを混合し、インキュベーションする。インキュベーション液の組成、温度等の条件は、マイクロビーズ上のアンチタグと断片化標的核酸に結合した１本鎖タグが特異的にハイブリダイズする条件であれば特に限定はないが、非特許文献１に記載の条件、すなわち５００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸Ｎａ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、３％デキストラン硫酸中で７２℃、３日間ハイブリダイズさせる条件が好適に使用できる。ここで、「特異的にハイブリダイズする」とは、互いに相補的なタグとアンチタグはハイブリダイズするが、非相補的な配列を含むタグとアンチタグはハイブリダイズしないか、あるいは低頻度にしかハイブリダイズしないことを意味する。

（４）マイクロビーズを洗浄し、１本鎖タグつき標的核酸がハイブリダイゼーションにより結合したマイクロビーズを選別する工程
上記（３）の工程にて、７２℃、３日間ハイブリダイズさせたマイクロビーズを洗浄する。たとえば、（３）の工程にて１本鎖タグつき標的核酸（固定化すべき核酸）に蛍光標識物質により標識しておけば、ハイブリダイズさせたマイクロビーズをフローサイトメーターにて認識する事ができ、洗浄度合い、収率をモニタリングすることが可能である。非特異的にハイブリダイズした１本鎖タグつき標的核酸断片が、洗浄にてマイクロビーズから離脱した事を確認した後、共有結合反応によって標的核酸断片に結合した一本鎖タグとアンチタグとの間に共有結合を形成させ、マイクロビーズに固定する。共有結合反応には、特に限定はないが、例えばＴ４ＤＮＡリガーゼおよび大腸菌ＤＮＡリガーゼなどのＤＮＡリガーゼが好適に使用できる。ＤＮＡリガーゼによる反応に先立って、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ存在下、ＤＮＡポリメラーゼを作用させるとＤＮＡリガーゼ反応の効率が向上する場合があるので、必要に応じてこの反応を行ってもよい。使用するＤＮＡポリメラーゼに特に限定はないが、例えばＴ４ＤＮＡポリメラーゼが好適に使用できる。上記ＤＮＡリガーゼによる連結反応などの共有結合反応、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応、およびこれらの反応に伴う酵素の失活処理、洗浄処理の各工程で、検出可能な標識物質を指標として、処理工程の確認、反応効率の検証を行うことが可能である。

（５）標的核酸が特異的に結合したマイクロビーズを分取する工程
標的核酸には、検出可能な標識物質と固相に結合しうる標識物質の標識が施されているが、固相に結合しうる標識物質を用いて、洗浄が終了したマイクロビーズを分取する。固相に結合しうる標識物質は、マイクロビーズ以外の固相と、直接又は間接的に結合可能なものであればよく、それぞれの結合は限定はなく、共有結合、水素結合、イオン結合、静電気的結合、分子間相互作用などが例示される。特に限定されないが、例えばビオチンを使用する場合は、担体としてアビジンが結合した固相、例えばマグネティックビーズが好適に使用できる。担体に結合させた、標的核酸が特異的に結合したマイクロビーズを洗浄した後、担体から標的核酸が特異的に結合したマイクロビーズを遊離させる。遊離させる方法は特に限定されないが、標的核酸内の制限酵素認識部位を利用し、制限酵素にて切り出す方法が好適に使用できる。担体と結合する標識物質によりマイクロビーズを分取することにより、セルソーターなどの機器を使用することなく、迅速かつ簡便に標的核酸が特異的に結合したマイクロビーズを調製することが可能である。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
また、本明細書に記載の操作のうち、プラスミドＤＮＡの調製、制限酵素消化などの基本的な操作にてついてはサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル第３版（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎＧ −ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ−）、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎＧＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）、２００１年に記載の方法によった。さらに、以下に示す大腸菌を用いたプラスミドの構築には、特に記載のない限り大腸菌ＴＯＰ１０を宿主として使用した。また、形質転換された大腸菌は３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地（トリプトン１％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）、あるいは上記培地に１．５％の寒天を加え固化させたＬＢ−クロラムフェニコールプレートを用いて３７℃で好気的に培養した。

実施例１試料の調製
ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣＨＢ−８０６５）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）ＲＰＭＩ１６４０培地中で５％ＣＯ_２存在下、３７℃で７日間培養した。細胞を回収し、トリゾル試薬（ギブコ社製）により全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡから、オリゴテックスｓｕｐｅｒ（タカラバイオ社製）によりポリＡＲＮＡを精製した。

実施例２タグライブラリー作製
米国公開公報第２００４／０００２１０４号記載のタグベクターｐＭＢＳ１をＢａｍＨＩおよびＢｂｓＩ〔いずれもニューイングランドバイオラブ（ＮＥＢ）社製〕により消化したあと、ウシ小腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ、タカラバイオ社製）により脱リン酸処理を行った。

細胞由来、ポリＡＲＮＡ１μｇを鋳型とし、配列表の配列番号１と２と３で示される３種類のビオチン化プライマーの等量混合物を用いて５’−メチル化−ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを基質としてＭ−ＭＬＶＲＴａｓｅ（タカラバイオ社製）で逆転写反応を行った。続いて５’−メチル化−ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを基質としてＲＮａｓｅＨ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡｌｉｇａｓｅ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＩ（いずれもタカラバイオ社製）にて２ｎｄｓｔｒａｎｄ合成を行い、合成した二本鎖ｃＤＮＡを、精製した。この二本鎖ｃＤＮＡをＤｐｎＩＩ（ＮＥＢ社製）にて消化し、内部にＭｍｅＩ部位を持つアダプターＤＮＡをＴ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ（タカラバイオ社製）により連結した。なお、アダプターＤＮＡは、配列表の配列番号４で示されるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドの等量混合物をアニールさせたものである。

このＤＮＡを１．５ｍｇのダイナビーズＭ−２８０ストレプトアビジン（磁性ストレプトアビジンビーズ、ダイナル社製）に結合させ、ＭＰＣ（ダイナル社製）に静置した後、上清を除去した。１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭＥＤＴＡによりストレプトアビジンビーズの洗浄を行った後、ＭｍｅＩ（ＮＥＢ社製）にて消化して、ストレプトアビジンビーズより切り出した。ストレプトアビジンビーズから切り出したＤＮＡ溶液をｓｈｒｉｍｐａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＵＳＢ社製）にて反応させ、ｓｈｒｉｍｐａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅを失活させた後精製した。このＤＮＡ断片に内部にＳｆａＮＩ部位を持つアダプターＤＮＡをＴ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ（タカラバイオ社製）により連結した。なお、アダプターＤＮＡは、配列表の配列番号６で示されるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号７から２２で示される１６種類のオリゴヌクレオチドをアニールさせたものである。

その後、Ｔ７Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ（ＮＥＢ社製）にて反応し、Ｔ７Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅを失活させた。このＤＮＡを鋳型とし、配列表の配列番号２３で示されるＦＡＭ標識オリゴヌクレオチドと、配列表の配列番号２４で示されたＦＡＭ標識オリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、ＰｆｕＴｕｒｂｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を使用し、５’−メチル化−ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを基質として行った。このＰＣＲ産物をフェノール処理、クロロホルム処理、エタノール沈殿によってＤＮＡを精製した。

精製したＰＣＲ産物をＤｐｎＩＩ（ＮＥＢ社製）とＳｆａＮＩ（ＮＥＢ社製）の両酵素にて消化を行い、ＤＮＡを精製した。このＤＮＡのアクリルアミドゲルによる電気泳動を行い、標的核酸断片である３２〜３３塩基のバンドを切り出し、ゲルよりＤＮＡ断片の抽出を行った。

本発明の方法で得られたｃＤＮＡ断片と前述の直鎖化したｐＭＢＳ１とを、Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ（タカラバイオ社製）にて連結し、得られた組換えプラスミドを用いたエレクトロポレーションにより大腸菌ＴＯＰ１０を形質転換した。形質転換体の一部をＬＢ−クロラムフェニコールプレートに接種し、生じたコロニー数から独立したクローン数を算出するとともに、残りの形質転換体をＬＢ−クロラムフェニコール含有ＬＢ培地に接種し、クローン数６４万相当の培養物からＱＩＡＧＥＮＰｌａｓｍｉｄＭｉｄｉＫｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドＤＮＡを精製し、タグライブラリーを得た。

実施例３マイクロビーズの調製
上記実施例２のタグライブラリーを鋳型にしてＰＣＲを行った。ＰＣＲは５’−メチル化−ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを基質とし、ｐｒｉｍｅｒには配列表の配列番号２５で示されるオリゴヌクレオチドと、配列番号２６で示されるＦＡＭ標識オリゴヌクレオチドと配列表の配列番号２６で示されるビオチン化オリゴヌクレオチドを９：１の比率で混合したものを用い、ＥｘＴａｑＨｏｔＳｔａｒｔＶｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ社製）にて反応した。ＰＣＲ産物を精製した後、制限酵素ＰａｃＩ（ＮＥＢ社製）による消化を行い、さらに、ｄＧＴＰ存在下でＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ社製）を作用させ、タグ部分の１本鎖化を行った後、ＤＮＡを精製した。

１本鎖タグつき標的ＤＮＡ断片と、アンチタグが結合したマイクロビーズ７．２×１０^７個を混合し、５００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、３％デキストラン硫酸中で６９℃、３日間ハイブリダイズさせた。反応は２本分行った。マイクロビーズを１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、２本分のマイクロビーズを１本にまとめた。

洗浄後のマイクロビーズにＴ４ＤＮＡリガーゼを作用させることによって標的ＤＮＡ断片とアンチタグの間に共有結合を形成させた。その後、６００μｇダイナビーズＭ−２８０ストレプトアビジン（磁性ストレプトアビジンビーズ、ダイナル社製）に結合させ、ＭＰＣ（ダイナル社製）に静置した後、上清を除去した。１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０１ｍｌにて再懸濁し、ＭＰＣ（ダイナル社製）に静置した後、上清を除去するという洗浄操作を繰り返し、１本鎖タグつき標的ＤＮＡ断片の載ったマイクロビーズのみを分離した。

分離したマイクロビーズをＤｐｎＩＩで消化し、ダイナビーズＭ−２８０ストレプトアビジン（磁性ストレプトアビジンビーズ、ダイナル社製）より切り出した。さらにｄＧＴＰ存在下ＫｌｅｎｏｗＦｒａｇｍｅｎｔをマイクロビーズに作用させたあと、アダプターＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。なお、アダプターＤＮＡは、配列表の配列番号２７で示されるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号２８で示されるオリゴヌクレオチドをアニールさせたものである。

実施例４従来法でのマイクロビーズの調製
実施例２で調製したタグライブラリーを鋳型にしてＰＣＲを行った。ＰＣＲは５’−メチル化−ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを基質として配列表の配列番号２５で示されるオリゴヌクレオチドと、配列番号２６で示されるＦＡＭ標識オリゴヌクレオチドをｐｒｉｍｅｒとして用い、ＥｘＴａｑＨｏｔＳｔａｒｔＶｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ社製）にて反応した。ＰＣＲ産物を精製した後、制限酵素ＰａｃＩ（ニューイングランドバイオラブズ〔ＮＥＢ〕社製）による消化を行い、さらに、ｄＧＴＰ存在下でＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ社製）を作用させ、タグ部分の１本鎖化を行った後、ＤＮＡを精製した。

次いで、ＭｏＦｌｏサイトメーター（ダコサイトメーション社製）を用いてＦＡＭによる蛍光強度が上位４％であるマイクロビーズをソーティングした（第１回目のソーティング）。

ソーティングしたマイクロビーズをＤｐｎＩＩで消化し、ｄＧＴＰ存在ＫｌｅｎｏｗＦｒａｇｍｅｎｔをマイクロビーズに作用させたあと、アダプターＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。なお、アダプターＤＮＡは、配列表の配列番号２７で示されるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号２８で示されるオリゴヌクレオチドをアニールさせたものである。最後に、ＭｏＦｌｏサイトメーターを用いてＦＡＭの蛍光を持つマイクロビーズをソーティングした（２回目のソーティング）。

実施例５ＭＰＳＳ解析
実施例３および実施例４で調製したマイクロビーズを、特許文献２および非特許文献２に開示された技術を用いて、マイクロビーズ上に固定化された標的ＤＮＡの配列を読み取り、同じ配列をまとめて個数を算出した。次に、算出した個数を合計し、個々の配列の個数を合計個数で割り算して１００万を掛け、１００万個あたりの個々の配列の個数を算出した。実施例３および実施例４で調製したマイクロビーズそれぞれで、１００万個あたりの個々の配列の個数を算出し、比較した。図１に比較した結果の図を示す。この図において、Ｘ軸は実施例４で調製した従来法によるマイクロビーズ、Ｙ軸は実施例３で調製した本発明によるマイクロビーズから得られた配列の個数をそれぞれ示すスキャッターブロットである。

この結果、両者を比較した際の相関係数Ｒ^２が０．９８となり、非常に高い相関を示した。また、実施例４の従来法では、上記ブレナーらの方法の作業単位である３００，６００，０００個のビーズを用いた場合、１本鎖タグつき標的ＤＮＡ断片とアンチタグが結合したマイクロビーズのハイブリダイゼーション後の洗浄工程以後の作業に５日間を費やし、さらにビーズ数に比例して作業日数は増加するのに対して、実施例３の本発明では、同作業をビーズ数にかかわらず２日で行う事ができ、大幅な作業時間短縮を達成できた。

以上より、本発明にて、従来法と比較して、ソーティングを行う事なく短時間で簡便にマイクロビーズを調製することができ、従来法と同等の結果を得られることが実証された。

本発明により、ＤＮＡマイクロビーズアレイ作製時に、標的ＤＮＡが結合したマイクロビーズを簡便に選別する方法が提供される。

マイクロビーズから得られた配列の個数をそれぞれ示すスキャッターブロットを示す図である。

SEQ ID NO:1; Synthetic primer for reverse transcription
SEQ ID NO:2; Synthetic primer for reverse transcription
SEQ ID NO:3; Synthetic primer for reverse transcription
SEQ ID NO:4; Synthetic oligonucleotide for adaptor DNA
SEQ ID NO:5; Synthetic oligonucleotide for adaptor DNA
SEQ ID NO:6; Synthetic oligonucleotide for adaptor DNA
SEQ ID NO:7; Synthetic oligonucleotide for adaptor DNA
SEQ ID NO:8; Synthetic oligonucleotide for adaptor DNA
SEQ ID NO:9; Synthetic oligonucleotide for adaptor DNA
SEQ ID NO:10; Synthetic oligonucleotide for adaptor DNA
SEQ ID NO:11; Synthetic oligonucleotide for adaptor DNA
SEQ ID NO:12; Synthetic oligonucleotide for adaptor DNA
SEQ ID NO:13; Synthetic oligonucleotide for adaptor DNA
SEQ ID NO:14; Synthetic oligonucleotide for adaptor DNA
SEQ ID NO:15; Synthetic oligonucleotide for adaptor DNA
SEQ ID NO:16; Synthetic oligonucleotide for adaptor DNA
SEQ ID NO:17; Synthetic oligonucleotide for adaptor DNA
SEQ ID NO:18; Synthetic oligonucleotide for adaptor DNA
SEQ ID NO:19; Synthetic oligonucleotide for adaptor DNA
SEQ ID NO:20; Synthetic oligonucleotide for adaptor DNA
SEQ ID NO:21; Synthetic oligonucleotide for adaptor DNA
SEQ ID NO:22; Synthetic oligonucleotide for adaptor DNA
SEQ ID NO:23; Synthetic primer to amplify cDNA fragments
SEQ ID NO:24; Synthetic primer to amplify cDNA fragments
SEQ ID NO:25; Synthetic primer to amplify cDNA fragments
SEQ ID NO:26; Synthetic primer to amplify cDNA fragments
SEQ ID NO:27; Synthetic oligonucleotide for adaptor DNA
SEQ ID NO:28; Synthetic oligonucleotide for adaptor DNA

Claims

標的とする核酸を固定化したマイクロビーズの精製方法であって、少なくとも２種類の標識物質で標識された核酸をマイクロビーズに共有結合を介して固定化する工程、ここで、前記標識の少なくとも１つは検出可能な標識物質であり、さらに別の標識は、前記マイクロビーズとは異なる固相に結合しうる標識物質であり、
前記核酸固定化マイクロビーズを前記マイクロビーズとは異なる固相に結合させる工程を含むことを特徴とする核酸固定化マイクロビーズの精製方法。
少なくとも２種類の標識物質が同一核酸上に配置されていることを特徴とする請求項１記載の方法。
検出可能な標識物質が、蛍光物質、化学発光物質、酵素、放射性同位体からなる群より選択される標識物質であることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
前記マイクロビーズとは異なる固相に結合しうる標識物質が、ビオチン、アビジン、抗原、抗体、ハプテンからなる群から選択される標識物質であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸固定化マイクロビーズの精製方法のためのキット。
１つのマイクロビーズに同一の標的とする核酸が固定化されたマイクロビーズであって、当該核酸は少なくとも２種類の標識物質で標識されており、ここで、前記標識の少なくとも１つは検出可能な標識物質であり、さらに別の標識は、前記マイクロビーズとは異なる固相に結合しうる標識物質であることを特徴とする核酸固定化マイクロビーズアレイ。
少なくとも２種類の標識物質が同一核酸上に配置されていることを特徴とする請求項６記載のアレイ。
検出可能な標識物質が、蛍光物質、化学発光物質、酵素、放射性同位体からなる群より選択される標識物質であることを特徴とする請求項６又は７記載のアレイ。
前記マイクロビーズとは異なる固相に結合しうる標識物質が、ビオチン、アビジン、抗原、抗体、ハプテンからなる群から選択される標識物質であることを特徴とする請求項６〜８のいずれか１項に記載のアレイ。
請求項６〜１０記載のいずれか１項に記載の核酸固定化マイクロビーズアレイを調製するためのキット。