JP3109810B2 - 単一プライマーを用いる核酸の増幅 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 （１） 発明の分野 核酸ハイブリダイゼーションは、核酸の同一性の検討
に、また存在の確立に使用されてきた。ハイブリダイゼ
ーションは相補性塩基の対合に基づくものである。相補
性の一本鎖核酸を一緒にインキュベートすると、相補性
塩基配列は対合し、二本鎖のハイブリツド分子を形成す
る。一本鎖デオキシリボ核酸（ssDNA）またはリボ核酸
（RNA）が相補性の核酸配列と水素結合構造を形成する
能力は、分子生物学の研究において分析手段として利用
されてきた。高い比活性をもつ放射性ヌクレオシド三リ
ン酸の利用、またT4キナーゼによるDNAの³²P標識は、生
物学的に興味ある様々な核酸配列の同定、単離および特
性の解明を可能にしてきた。核酸ハイブリダイゼーショ
ンは、独特の核酸配列に関連する病的状態の診断に威力
を発揮する可能性がある。これらの独特の核酸配列は、
挿入、欠失、点突然変異、または細菌、かび、真菌およ
びウイルスの感染による外因性DNAもしくはRNAの獲得に
由来するDNAの遺伝的または環境的変化によって生じる
ものである。核酸ハイブリダイゼーションはこれまで、
主として、学問的および工業的な分子生物学実験室で行
われてきた。疾患関連DNAまたはRNAの患者体液中濃度は
多くの場合きわめて低く、十分な感受性のある核酸ハイ
ブリダイゼーション分析法がなかったことから、臨床医
学における診断手段としての核酸ハイブリダイゼーショ
ンの応用は限られている。

特定の核酸配列の最近の検出方法は、一般に、固体支
持体たとえばニトロセルロースろ紙、セルロースろ紙、
ジアゾ化ろ紙、またはナイロン膜上へ標的核酸の固定化
を包含するものである。標的核酸が支持体上に固定され
たのち、支持体を適当に標識したプローブ核酸と約２〜
48時間接触させる。上記時間の経過後、固体支持体を制
御された温度で数回洗浄して、ハイブリダイズしなかっ
たプローブを除去する。支持体をついで乾燥し、ハイブ
リダイズした物質をオートラジオグラフィーまたは分光
測光法によって検出する。

きわめて低い濃度を検出しなければならない場合に
は、この現在の方法は時間がかかり、労力を要し、また
放射標識ほど容易には検出できない非同位元素標識の使
用は多くの場合適当ではない。したがって、核酸配列の
検出に単純な、迅速な、非同位元素の、均一もしくは不
均一法の使用を可能にする感受性を高めた方法の開発が
望まれていた。

最近、DNAの特異的セグメントを酵素的に増幅する、
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法として知られた方法が
報告された。このin vitro増幅操作は、変性、オリゴヌ
クレオチドプライマーアニーリングおよび好熱性ポリメ
ラーゼによるプライマー伸張にサイクルを反復し、プラ
イマーに隣接する領域のコピーを指数的に増加させるこ
とを基づくものである。DNAの対立鎖にアニーリングし
たPCRプライマーは、一つのプライマーのポリメラーゼ
触媒伸張生成物が他のプライマーの鋳型鎖として働くよ
うに配置され、オリゴヌクレオチドプライマーの５′末
端間の距離によって決定される長さを有する不連続フラ
グメントの蓄積を招くことになる。

（２） 従来技術の説明 核酸配列の増幅、検出および／またはクローニングの
方法は、米国特許第4,683,195号および第4,683,202号に
開示されている。ポリメラーゼ連鎖反応による配列重合
化は、Saikiら（Science,230:1350〜1354、1986）によ
って記載されている。オリゴヌクレオチドの製造方法
は、ヨーロッパ特許出願第0194545A2号に記載されてい
る。ベルギー特許出願BE904402号にはDNA検出プローブ
を製造するための鋳型が開示されている。真核酸細胞内
での遺伝子増幅は米国特許第4,656,134号に開示されて
いる。

Langerら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:6633〜6637、
1981）は、ビオチン標識ポリヌクレオチドの酵素的合成
およびこれらの物質の新規な核酸親和性プローブとして
の使用を開示している。ビオチン標識ハイブリダイゼー
ションプローブを用いる、培養細胞およびパラフィン包
埋組織片中のウィルスゲノムの検出はBrigatiら（Virol
ogy,126:32〜50、1983）によって論じられている。米国
特許第4,486,539号には、一工程サンドイッチハイブリ
ダイゼーション試験による微生物の核酸の検出が開示さ
れている。DNAの検出に基づく感度の高い悪性疾患の試
験法が米国特許第4,490,472号に記載されている。米国
特許第4,480,040号には、診断すべきウイロイドまたは
ウイルスの核酸と相補性の放射性標識DNAを使用する植
物ウイロイド疾患およびウイルスの高感度かつ迅速な診
断法が示されている。ヨーロッパ特許出願83 106 11
2.2号（1982年６月23日米国特許出願391,440号に基づく
優先権主張）には、改良された標識ヌクレオチドおよび
ポリヌクレオチド、ならびにその製造、使用および検出
方法が教示されている。細胞DNAの検出および定量のた
めの方法および組成物は、米国特許第4,423,153号に開
示されている。診断微生物における特異的DNAプローブ
は米国特許第4,358,535号に論じられている。多形性の
制限部位および核酸配列の検出方法はヨーロッパ特許出
願0164 054A1号に記載されている。米国特許第4,663,2
83号には二本鎖DNAの変換方法が記載されている。

転写シクエンシングによるゲノムの増幅はStofletら
（Science,239:491,1988）によって論じられている。熱
安定性DNAポリメラーゼによるプライマーに向けられた
酵素的なDNAの増幅はSaikiら（Science,239:487、198
8）に記載されている。米国特許第特許第4,724,202号に
は、核酸ハイブリダイゼーションの検出のためのハイブ
リダイズ不能核酸の使用が開示されている。Bugawanら
は、出生前診断および法医学的なHLA分類のため、酵素
的に増幅させたDNAを分析する非放射性オリゴヌクレオ
チドプローブの利用を報告している。

均一な、反復した増幅核酸配列の検出、単離について
は米国特許第4,675,283号に開示されている。それ自体
にまたは他の核酸に反復ハイブリダイズして増幅された
実体を形成する能力をもつ一本鎖自己ハイブリダイゼー
ション核酸プローブは、米国特許出願第888,058号（198
6年７月22日出願）に記載されている。米国特許出願第
4,683,195号および第4,683,202号には、試薬複合体から
の置換RNA一本鎖ポリヌクレオチドの消化および別個の
相補性核酸鎖の２種のオリゴヌクレオチドプライマー処
理での核酸配列の増幅による均一系ポリヌクレオチド置
換アッセイが開示されている。ヨーロッパ特許出願0200
362号には、核酸配列の増幅、検出またはクローニング
方法で、疾患の診断およびトランスホーメーションベク
ターの製造に有用な方法が記載されている。細胞質ドッ
トハイブリダイゼーションによる多数の小サンプル中の
相対的核酸レベルの簡単な分析方法が米国特許第4,677,
054号に記載されている。チオヌクレオチド含有プロー
ブで核酸配列を検出するためのハイブリダイゼーション
方法は米国特許第4,647,529号に記載されている。

DNAをセルロースに共有結合させるための簡単で効率
的な酵素的方法、ならびにハイブリダイゼーション制限
分析およびDNAプローブのin vitro合成へのその応用
は、Nucl.Acids Res.,14:9171〜9191、1986に記載され
ている。一本鎖オリゴヌクレオチドのEco R I制限エン
ドヌクレアーゼによる切断はNucl.Acids Res.,15:709〜
716、1987に記載されている。

組換えRNAハイブリダイゼーションプローブの指数的
増幅はLizardiら（Bio/Technology,６:1197〜1202、198
8）によって報告されている。Fahrlanderらは、DNAプロ
ーブシグナルの増幅：クリスマスツリー・アプローチに
ついて論じている（Bio/Technology,６:1165〜1168、19
88）。

標的配列に架橋可能なプローブを用いる核酸ハイブリ
ダイゼーションアッセイは、米国特許第4,599,303号に
記載されている。この方法は、二官能性の架橋分子が共
有結合で導入された特異的一本鎖リボ核酸またはデオキ
シリボ核酸分子の製造を包含する。導入は、架橋分子が
プローブの標的である細菌、ウイルスまたは哺乳動物染
色体の核酸との第二の反応を受け、共有結合の架橋を形
成する能力を維持するように行われる。架橋後、非架橋
プローブを、共有結合による架橋プローブ−標的複合体
から、一本鎖プローブと二本鎖共有結合プローブ−標的
複合体を区別する数種の操作のひとつを用いて分離す
る。

遺伝的異常疾患の診断のため、診断および隣接プロー
ブを用いるハイブリダイゼーションによる、とくに自動
操作での、核酸中の標的配列の検出は、ヨーロッパ特許
出願０ 185 494 A2号に記載されている。この方法で
は、サンプルを、標的配列の診断部分と相補性のプロー
ブ（診断プローブ）および診断部分と隣接したヌクレオ
チド配列と相補性のプローブ（隣接プローブ）と、診断
プローブが標的配列を含むサンプル核酸にのみ結合した
ままでいる条件下にハイブリダイズさせる。次に診断プ
ローブと隣接プローブを共有結合させて標的配列と相補
性の標的プローブを生成させ、結合しないプローブを除
去する。好ましい様式においては、プローブの一方を標
識して、標的配列の存在または不存在が、サンプル核酸
標的プローブ二重らせん構造の融解、解離した標的プロ
ーブの溶出および標識についての試験によって調べられ
る。

上述の方法には、少なくとも、隣接配列を要するとい
う欠点がある。この方法を実施するためには、診断配列
と隣接配列を同定し、これらの配列と相補性の診断プロ
ーブと隣接プローブを作成しなければならない。診断配
列および隣接配列が正確に同定されていないと、診断プ
ローブおよび隣接プローブのハイブリダイゼーションが
十分ではなく、アッセイの特異性および感度が失われま
た低下することになる。

発明の要約 ここに開示される発明は、単一のポリヌクレオチドプ
ライマーを使用して、一本鎖ポリヌクレオチドの多数の
コピーを生成する方法およびそのための試薬に関する。
結果として、公知の方法に比べ、試薬およびアッセイ工
程の数が減少する。

本発明の一態様においては、（ａ）ヌクレオシド三リ
ン酸および鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼの
存在下に、一本鎖ポリヌクレオチドに沿って、少なくと
もその３′末端には上記一本鎖ポリヌクレオチドの３′
末端における第二の隣接配列とハイブリダイゼーション
可能な少なくとも10塩基配列を有するポリヌクレオチド
プライマーの延長を形成させ、この場合上記第二の隣接
配列は上記一本鎖ポリヌクレオチドの５′末端における
少なくとも10塩基の第一の隣接配列と部分的にまたは完
全に相補性であり、（ｂ）延長されたポリヌクレオチド
プライマーと一本鎖ポリヌクレオチドを解離させ、
（ｃ）工程（ａ）を反復することからなる方法によっ
て、一本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも１個のコピー
を生成させる。

本発明の他の態様は、ポリヌクレオチド配列の多数の
コピーを生成させる方法に関する。この方法は、（ｉ）
上記ポリヌクレオチド配列を有し、各末端には部分的に
または完全に相補性の第一および第二の隣接配列が隣接
している一本鎖ポリヌクレオチド、（ii）その３′末端
における少なくとも10塩基部分は上記第一および第二隣
接配列の構成要素すなわち上記一本鎖ポリヌクレオチド
の３′末端にハイブリダイゼーション可能なポリヌクレ
オチドプライマー、（iii）ヌクレオシド三リン酸、お
よび（iv）鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼの
混合物を準備するものである。この混合物を、完全にま
たは部分的に、順次または同時に、（ｉ）一本鎖ポリヌ
クレオチドをそれとハイブリダイズした相補性配列があ
ればそれから解離させ、（ii）一本鎖ポリヌクレオチド
の３′末端における隣接配列とポリヌクレオチドプライ
マーをハイブリダイズさせ、（iii）ポリヌクレオチド
プライマーを一本鎖ポリヌクレオチドに沿って延長させ
て第一の延長されたポリヌクレオチドプライマーを与
え、（iv）第一の延長されたポリヌクレオチドプライマ
ーと一本鎖ポリヌクレオチドを解離させ、（ｖ）第一の
延長されたポリヌクレオチドプライマーをポリヌクレオ
チドプライマーとハイブリダイズさせ、（vi）このポリ
ヌクレオチドプライマーを第一の延長されたポリヌクレ
オチドプライマーに沿って延長させて第二の延長された
ポリヌクレオチドプライマーを与え、（vii）第二の延
長されたポリヌクレオチドプライマーを第一の延長され
たポリヌクレオチドプライマーから解離させ、（viii）
上記工程（ｖ）〜（vii）を反復させる条件下に、イン
キュベートする。

他の態様は、互いに部分的にまたは完全に相補性の一
対の隣接配列を有する異なる構成要素によって各末端が
隣接されている配列のポリヌクレオチド内でポリヌクレ
オチド配列の多数のコピーを生成させる方法に関する。
この方法では、（ａ）ポリヌクレオチドを、そのポリヌ
クレオチド配列の３′末端における一対の隣接配列の構
成要素の少なくとも部分と少なくとも部分的に相補性で
ハイブリダイゼーション可能な終結配列を少なくともそ
の３′末端に有する単一のポリヌクレオチドプライマ
ー、ヌクレオシド三リン酸、および鋳型依存性ポリヌク
レオチドポリメラーゼと混合する。この混合物を、完全
にまたは部分的に、順次または同時に、（ｉ）ポリヌク
レオチド配列をそれとハイブリダイゼーション可能な配
列から解離させて一本鎖ポリヌクレオチドを与え、（i
i）一本鎖ポリヌクレオチドの３′末端における隣接配
列とポリヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさ
せ、（iii）ポリヌクレオチドプライマーを一本鎖ポリ
ヌクレオチドに沿って延長させて延長されたポリヌクレ
オチドプライマーを与え、（iv）第一の延長されたポリ
ヌクレオチドプライマーと一本鎖ポリヌクレオチドプラ
イマーを解離させ、（ｖ）第一の延長されたポリヌクレ
オチドプライマーとポリヌクレオチドプライマーとハイ
ブリダイズさせ、（vi）ポリヌクレオチドプライマーを
第一の延長されたポリヌクレオチドプライマーに沿って
延長させて第二の延長されたポリヌクレオチドプライマ
ーを与え、（vii）第二の延長されたプライマーを第一
の延長されたポリヌクレオチドプライマーから解離さ
せ、（viii）上記工程（５）〜（７）を反復させる条件
下にインキュベートする。

上述の方法は、ポリヌクレオチド分析対象の含有が疑
われるサンプル中のポリヌクレオチド分析の存在の決定
を容易にするのに応用できる。標的ポリヌクレオチド配
列はDNAでもRNAでもよい。

本発明のこの特徴における一態様においては、この方
法は（ａ）分析対象の存在の結果として、相補性の第一
および第二隣接配列によって隣接された一本鎖ポリヌク
レオチドを形成させ、（ｂ）この一本鎖ポリヌクレオチ
ドおよび隣接配列の多数のコピーを形成させ、（ｃ）一
本鎖ポリヌクレオチドを検出することからなる。特異的
な核酸またはポリヌクレオチドを検出するための任意の
方法が使用できる。一本鎖ポリヌクレオチドの多数のコ
ピーは、たとえば上述の方法のいずれかで製造できる。

上記一態様における方法の工程（ａ）として、（ｉ）
ヌクレオシド三リン酸および鋳型依存性ポリヌクレオチ
ドポリメラーゼの存在下に第一の一本鎖ポリヌクレオチ
ドに沿って上記分析対象またはそのフラグメントの延長
を形成させ（延長されたポリヌクレオチド分析対象）、
二本鎖ポリヌクレオチド１をつくり、（ii）一本鎖の延
長されたポリヌクレオチド分析対象を上記ポリヌクレオ
チド１から解離させ、（iii）ヌクレオシド三リン酸お
よび鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼの存在下
に上記一本鎖ポリヌクレオチド分析対象に沿って、少な
くともその３′末端は上記一本鎖の延長されたポリヌク
レオチド分析対象の少なくとも１部とハイブリダイゼー
ション可能な少なくとも10塩基の配列を有する第一のポ
リヌクレオチドプライマーの延長を形成させ、二本鎖ポ
リヌクレオチド２をつくり、（iv）上記ポリヌクレオチ
ド２から一本鎖の延長された第一のポリヌクレオチドプ
ライマーを解離させ、（ｖ）ヌクレオシド三リン酸およ
び鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼの存在下に
第二のポリヌクレオチドプライマーに沿って上記一本鎖
の延長された第一のポリヌクレオチドプライマーの延長
を形成させ、この場合、少なくとも上記第二のポリヌク
レオチドプライマーの３′末端は上記一本鎖の延長され
た第一のポリヌクレオチドプライマーの少なくとも１部
とハイブリダイゼーション可能な少なくとも10塩基の配
列を有し、二本鎖ポリヌクレオチド３をつくり、この場
合、一本鎖の２回延長された第一のポリヌクレオチドプ
ライマーの３′末端および５′末端は各々少なくとも部
分的に相補性の10塩基の配列を有し、そして（vi）上記
ポリヌクレオチド３から上記一本鎖の２回延長された第
一のポリヌクレオチドプライマーを解離させ；そして 同方法の工程（ｂ）として、（ｉ）ヌクレオシド三リ
ン酸および鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼの
存在下に上記一本鎖の２回延長された第一のポリヌクレ
オチドプライマーに沿って上記第一のポリヌクレオチド
プライマーの延長を形成させ、二本鎖ポリヌクレオチド
４をつくり、（ii）ポリヌクレオチド４から一本鎖の延
長された第一のポリヌクレオチドプライマーを解離さ
せ、そして（iii）工程（ｉ）を反復させる各工程から
なる方法をあげることができる。より詳細には例２を参
照。

ポリヌクレオチド分析対象の含有が疑われるサンプル
中の上記分析対象の存在を決定する特定の一方法におい
ては、それぞれ少なくとも15個の塩基を有し少なくとも
80％の相補性を示す第一および第二隣接配列によって隣
接された一本鎖ポリヌクレオチドを、上記分析対象の存
在の結果として形成させる。ヌクレオシド三リン酸およ
び鋳型依存性ポリメラーゼの存在下に、少なくともその
３′末端で一本鎖ポリヌクレオチドの３′末端における
第二の配列とハイブリダイゼーション可能なポリヌクレ
オチドプライマーの延長を形成させる。一本鎖ポリヌク
レオチドと同一および／または相補性の配列を含有する
延長されたポリヌクレオチドプライマーを検出すると、
その存在はポリヌクレオチド分析対象の存在を指示す
る。

本発明の他の特徴は、分析対象の含有が疑われるサン
プルを第一および第二のポリヌクレオチドプローブと接
触させる分析方法に関する。第一のプローブは、分析対
象の一方の鎖の第一の部分に相補性の３′末端における
配列と第一の隣接配列からなる。第二のプローブは、分
析対象の同じ鎖の第二の部分に相補性の５′末端におけ
る配列と第二の隣接配列からなる。接触は、第一および
第二のプローブが分析対象と結合する条件下に実施され
る。条件は、第一および第二のポリヌクレオチドプロー
ブに結合した場合にのみ、互いに連結するように設定さ
れる。ヌクレオシド三リン酸および鋳型依存性ポリヌク
レオチドポリメラーゼの存在下に、少なくともその３′
末端は隣接配列とハイブリダイゼーション可能なポリヌ
クレオチドプライマーの延長が形成される。第一のプロ
ーブと相補性の配列を含有する延長されたポリヌクレオ
チドプライマーを検出すると、その存在は分析対象の存
在を指示する。

本発明の他の特徴は、ポリヌクレオチド分析対象の含
有が疑われるサンプル中の上記分析対象の存在を検出す
る方法に関する。この方法は、（ａ）ポリヌクレオチド
プローブの第三および第四配列を連結させ、この場合、
第三の配列は遊離３′末端を、第四の配列は遊離５′末
端を有し、それぞれが分析対象の別個の部分にハイブリ
ダイゼーション可能でまた、上記分析対象の存在下にの
み連結可能であるかもしくは連結可能になることがで
き、さらに上記ポリヌクレオチドプローブは第一および
第二の隣接配列からなり、この第一配列は第三の配列の
５′であり、第二配列は第一配列の５′であり、第四の
配列は第二配列の５′であり、（ｂ）ヌクレオシド三リ
ン酸および鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼの
存在下、少なくともその３′末端でポリヌクレオチドプ
ローブの第二隣接配列とハイブリダイゼーション可能な
ポリヌクレオチドプライマーの延長を形成させ、分析対
象の別個の部分に相補性の、連結した第三もしくは第四
配列の少なくとも部分と同一および／もしくは相補性の
配列を検出する各工程からなる。

本発明による他の分析方法は、分析対象の含有が疑わ
れるサンプルを第一および第二のポリヌクレオチドプロ
ーブと接触させるものである。第一のプローブは（ｉ）
第二のプローブ中の第二の隣接配列と部分的または完全
に相補性の第一の隣接配列、および（ii）第二のプロー
ブと部分的または完全に相補性の部分以外の分析対象の
部分に相補性の配列からなる。第一および第二のプロー
ブは、分析対象に結合した場合にのみ、互いに連結可能
であるかまたは連結可能になることができる。この方法
はさらに、ヌクレオシド三リン酸と鋳型依存性ポリヌク
レオシドポリメラーゼの存在下に、他のプローブの３′
末端に連結しているプローブの隣接配列と少なくともそ
の部分がハイブリダイゼーション可能なポリヌクレオチ
ドプライマーの延長を形成させるものである。ついで、
延長されたポリヌクレオチドプライマーおよび／または
連結した第一および第二ポリヌクレオチドプローブが検
出される。

特異的態様の説明 本発明は、一本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも１個
のコピー、好ましくは多数のコピーの生成を可能にす
る。一本鎖ポリヌクレオチドはメジウム中に存在してい
てもよいし、またポリヌクレオチド分析対象の含有が疑
われるサンプル中にその分析対象の存在によって形成さ
れてもよい。一本鎖ポリヌクレオチドの多数のコピーの
生成に際しては、以下の成分、すなわち（ｉ）一本鎖ポ
リヌクレオチド、（ii）一本鎖ポリヌクレオチドの３′
末端に接続する第二の隣接配列とハイブリダイゼーショ
ン可能な少なくとも10塩基好ましくは15塩基配列を少な
くともその３′末端に有するポリヌクレオチドプライマ
ー、（iii）ヌクレオシド三リン酸、および（iv）鋳型
依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼを準備する。一本
鎖ポリヌクレオチド配列に接続する第二の隣接配列は通
常、一本鎖ポリヌクレオチドの５′末端に接続する少な
くとも10塩基、好ましくは15塩基の第一の隣接配列と少
なくとも65％の相補性を有する。一本鎖ポリヌクレオチ
ドおよび第一の隣接配列に沿ってプライマーを延長させ
たのち、延長されたポリヌクレオチド配列を一本鎖ポリ
ヌクレオチド配列から解離させる。所望の数のコピーが
得られるまで、延長と解離を反復する。

本発明のひとつの特徴は、一本鎖ポリヌクレオチドの
形成をひき起こし、多数のコピーを生成させるための上
述の方法を行うことによって、ポリヌクレオチド分析対
象を定量することである。この方法では、一本鎖ポリヌ
クレオチドは、分析対象の配列または分析対象と相補性
の配列とは異なる第一および第二のポリヌクレオチド隣
接配列によって隣接される。分析対象の存在は、第二の
隣接配列の５′末端もしくはその先にある配列に結合し
た第一の隣接配列の３′末端もしくはその先にある配列
を検出することによって定量される。

本発明の特異的態様の説明をさらに続ける前に、多数
の用語について定義する。

ポリヌクレオチド分析対象−約20〜500,000もしくは
それ以上のヌクレオチド、通常は約100〜200,000のヌク
レオチド、多くの場合500〜15,000ヌクレオチドを有す
る重合ヌクレオチドである、測定すべき化合物または組
成物。ポリヌクレオチド分析対象は、精製または非精製
型の任意の起原の核酸、たとえばDNA（dsDNAおよびssDN
A）およびRNA、ｔ−RNA、ｍ−RNA、ｒ−RNA、ミトコン
ドリアDNAおよびRNA、葉緑体DNAおよびRNA、DNA−RNAハ
イブリッドまたはそれらの混合物、遺伝子、染色体、プ
ラスミド、微生物たとえば細菌、酵母、ウイルス、ウイ
ロイド、かび、菌類、植物、動物ヒトのような生物材料
のゲノムおよびそれらのフラグメント等を包含する。ポ
リヌクレオチド分析対象は、本技術分野でよく知られた
操作により、様々な生物材料から得ることができる。こ
のような生物材料の例の一部を以下の第Ｉ表に示すが、
これは例示の目的であって本発明を限定するものではな
い。

第Ｉ表 包含される興味ある微生物 コリネバクテリウム Corynebacterium diphtheria 肺炎球菌 Diplococcus pneumoniae ストレプトコッカス Streptococcus pyrogenes Streptococcus salivarus ブドウ球菌 Staphylococcus aureus Staphylococcus albus ナイセリア Neisseria meningitidis Neisseria gonorrhea 腸内細菌 Escherichia coli Aerobacter aerogenes 大腸菌群 Klebsiella pneumoniae Salmonella typhosa Salmonella choleraesuis サルモネラ属 Salmonella typhimurium Shigella dysenteria Shigella schmitzii Shigella arabinotarda シゲラ属 Shigella flexneri Shigella boydii Shigella sonnei 他の腸内細菌 Proteus vulgaris Proteus mirabilis プロテウス種 Proteus morgani Pseudomonas aeruginosa Alcaligenes faecalis Vibrio cholerae 好血菌群 Hemophilus influenza,H.ducryi Hemophilus hemophilus Hemophilus aegypticus Hemophilus parainfluenza Bordetella pertussis パスツレラ Pasteurella pestis Pasteurella tulareusis ブルセラ Brucella melitensis Brucella subtilis Brucella megaterium Brucella cereus 嫌気性胞芽形成桿菌 Clostridium botulinum Clostridium tetani Clostridium perfringens Clostridium novyi Clostridium septicum Clostridium histolyticum Clostridium tertium Clostridium bifermentans Clostridium sporogenes マイコバクテリウム Mycobacterium tuberculosis hominis Mycobacterium bovis Mycobacterium avium Mycobacterium leprae Mycobacterium paratuberculosis 放線菌（かび様細菌） Actinomyces Isaeli Actinomyces bovis Actinomyces naeslundii Nocardia asteroides Nocardia brasiliensis スピロヘータ Treponema pallidum Spirillum minus Treponema pertenue Streptobacillus monoiliformis Treponema carateum Borrelia recurrentis Leptospira icterohemorrhagiae Leptospira canicola トリパノゾーマ マイコプラズマ Mycoplasma pneumoniae 他の病原体 Lysteria monocytogenes Erysipelothrix rhusiopathiae Streptobacillus moniliformis Donvania granulomatis Bartonella bacilliformis リケッチア（細菌様寄生体） Rickettsia prowazekii Rickettsia mooseri Rickettsia rickettsia Rickettsia conori Rickettsia australis Rickettsia sibiricus Rickettsia akari Rickettsia tsutsugamushi Rickettsia burnetti Rickettsia quintana クラミジア（分類不能寄生体、細菌／ウイルス） Chlamydia agents（名称不確定） かび Cryptococcus neoformans Blastomyces dermatidis Hisoplasma capsulatum Coccidioides immitis Paracoccidioides brasiliensis Candida albicans Aspergillus fumigatus Mucor corymbifer（Absidia corymbifera） Rhizopus oryzae Rhizopus arrhizua Phycomycetes Rhizopus nigricans Sporotrichum schenkii Flonsecaea pedrosoi Fonsecae compact Cladosporium carrionii Phialophora verrucosa Aspergillus nidulans Madurella mycetomi Madurella grisea Allescheria boydii Phialophora jeanselmei Microsporum gypseum Trichophyton mentagrophytes Karatinomyces adjelloi Micro sporum canis Trichophyton rubrum Microsporum adouini ウイルス アデノウイルス ヘルペスウイルス 単純ヘルペス 水痘 帯状疱疹 Ｂウイルス サイトメガロウイルス ボックスウイルス 痘瘡 ワクシニア 牛痘 パラワクシニア 伝染性軟属種 ピコルナウイルス ポリオウイルス コクサッキーウイルス エコーウイルス ライノウイルス ミクソウイルス インフルエンザ（A,BおよびＣ） パラインフルエンザ（１〜４） おたふくかぜウイルス ニューカッスル病ウイルス はしかウイルス 牛疫ウイルス イヌジステンパーウイルス RSウイルス 風疹ウイルス アルボウイルス 東部マウス脳炎ウイルス 西部マウス脳炎ウイルス インドビスウイルス チクングニヤウイルス セムリキ森林熱ウイルス マヤロウイルス セントルイス脳炎ウイルス カリフォルニア脳炎ウイルス コロラドダニ熱ウイルス 黄熱病ウイルス デング熱ウイルス レオウイルス レトロウイルス ヒト免疫不全ウイルス（HIV） ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ＆II（HTLV） 肝炎 Ａ型肝炎ウイルス Ｂ型肝炎ウイルス 非Ａ非Ｂ肝炎ウイルス 腫瘍ウイルス ラウシャー白血病ウイルス グロスウイルス マロニー白血病ウイルス ヒトパピローマウイルス ポリヌクレオチド分析対象は、必要に応じて処理し、
たとえば剪断、または制限エンドヌクレアーゼもしくは
他の部位特異性化学切断法処理によって分析対象を切断
し、標的ポリヌクレオチド配列を含有するフラグメント
を得ることができる。

本発明の目的においては、ポリヌクレオチド分析対
象、またはポリヌクレオチド分析対象から得られた切断
フラグメントは通常、少なくとも部分的に変性している
か一本鎖であり、または変性させるか一本鎖にするため
に処理される。このような処理は本技術分野においては
よく知られていて、たとえば熱またはアルカリ処理があ
る。たとえば、二本鎖DNAを90〜100℃に約１〜10分間加
熱すると変性物質を得ることができる。

標的ポリヌクレオチド配列−同定すべきヌクレオチド
の配列。その同一性は、この標的配列の少なくとも部分
と相補性でハイブリダイゼーション可能なポリヌクレオ
チドプローブの製造ができるのに十分な程度わかってい
る。標的ポリヌクレオチド配列は通常、約12〜1,000も
しくはそれ以上のヌクレオチド、好ましくは20〜100の
ヌクレオチドを含有する。標的ポリヌクレオチド配列
は、多くの場合、ポリヌクレオチド分析対象の部分であ
る。標的ポリヌクレオチド配列は、一般に、大分子の分
画であるが、また実質的にその全分子であってもよい。
標的ポリヌクレオチド配列のサンプル中における存在が
サンプル中のポリヌクレオチド分析対象の存在の確実な
インジケーターとなるような、標的ポリヌクレオチド配
列中の最小限のヌクレオチド数を選択する。大ざっぱに
いって、配列の長さは通常、約1.6log Lヌクレオチド以
上とする。この場合、Ｌはサンプルの生物起原のゲノム
における塩基対の数である。標的配列中のヌクレオチド
の最大数は、ポリヌクレオチド分析対象の長さ、および
剪断、内因性ヌクレアーゼまたは標的配列の切断に用い
られる試薬によるその切れ易さによって決定される。

一本鎖ポリヌクレオチド−天然または合成のヌクレオ
チド配列で、天然に存在するか予め形成されるか、また
は分析対象の存在の結果としてプローブから形成され
る。通常、標的ポリヌクレオチド配列の少なくとも部分
と同一または相補性の配列を少なくとも含有し、またそ
の相補性配列した結合した場合にはリプレッサー、制限
酵素等のような受容体に対する特異的結合部位である配
列１個もしくは２個以上を含んでいてもよい。一本鎖ポ
リヌクレオチドは、少なくとも50％相補性の塩基配列、
通常は少なくとも65％相補性の塩基配列、多くの場合少
なくとも80％相補性の塩基配列を有する第一の隣接配列
および第二の隣接配列によって隣接されている。第一お
よび第二隣接配列はそれぞれ一本鎖ポリヌクレオチドの
３′末端および５′末端に結合していて、それぞれ少な
くとも10個好ましくは少なくとも15個のヌクレオチド、
デオキヌクレオチドおよび／またはそれらの誘導体から
構成されている。

一本鎖ポリヌクレオチドはそれに結合した隣接配列と
ともに通常、30〜3,000のヌクレオチド、好ましくは50
〜500のヌクレオチドを含有する。一本鎖ポリヌクレオ
チドはRNAでもDNAでもよく、また合成オリゴヌクレオチ
ドであってもよい。第一および第二配列によって隣接さ
れた一本鎖ポリヌクレオチドが相補性の鎖とハイブリダ
イズすると、多くの場合、逆方向反復配列が形成され
る。

ポリヌクレオチドプライマー−一本鎖ポリヌクレオチ
ドの３′末端における第二隣接配列とハイブリダイゼー
ション可能な配列をその３′末端に含有するポリヌクレ
オチド。第二隣接配列とハイブリダイゼーション可能な
ヌクレオチドプライマー中のヌクレオチド数は、ポリヌ
クレオチドプライマーをハイブリダイズさせるために用
いられる緊縮条件が過剰のランダムな非特異的ハイブリ
ダイゼーションを防止するように選択されるべきであ
る。ポリヌクレオチドプライマー中のヌクレオチドの数
は、少なくとも第二隣接配列中の数と同程度、すなわ
ち、少なくとも10ヌクレオチド、好ましくは少なくとも
15ヌクレオチド、一般には約10〜2,000好ましくは20〜1
00ヌクレオチドである。

特異的結合ペアの構成要素（sbp構成要素）−表面上
または空洞内に他分子と特異的に結合する領域を有し、
他分子の特定の空間的および極性的機構と相補性である
と定義される２つの異なる分子の一方。特異的結合ペア
の構成要素は、リガンドと受容体（アンチリガンド）と
も呼ばれる。これらは、抗原−抗体のような免疫学的ペ
アの構成要素、また、オペレーター−リプレッサー、ヌ
クレアーゼ−ヌクレオチドビオチン−アビジン、ホルモ
ン−ホルモン受容体、核酸二重鎖、IgG−プロテイン
Ａ、DNA−DNA、DNA−RNA等である。

リガンド−天然に受容体が存在するかまたは受容体を
製造できる任意の化合物。

受容体（抗リガンド）−分子の特定の空間的および極
性機構を認識できる任意の化合物または組成物、たとえ
ばエピトープまたは抗原決定部位。受容体の例として
は、天然の受容体、たとえばサイロキシン結合グロブリ
ン、抗体、酵素、Fabフラグメント、レクチン、核酸、
リブレッサー、保護酵素、プロテインＡ、補体成分C1
q、DNA結合タンパク質またはリガンド等がある。

小有機分子−分子量1500未満、好ましくは100〜100
0、さらに好ましくは300〜600の化合物、たとえばビチ
オン、フルオレセイン、ローダミンおよび他の染料、テ
トラサイクリンおよび他のタンパク質結合分子、ならび
にハプテン等である。小有機分子はヌクレオチド配列の
標識または支持体への結合のための手段を与えることが
できる。

支持体または表面−多孔性または非多孔性の水不溶性
物質。支持体は親水性であるかまたは親水性とすること
が可能で、無機粉末たとえばシリカ、硫酸マグネシウム
およびアルミナ、天然重合材料とくにセルロース性材料
およびセルロースから誘導される材料たとえば紙を含め
た繊維たとえばろ紙、クロマトグラフィー用紙等、合成
または改良天然重合体たとえばニトロセルロース、セル
ロースアセテート、ポリ（塩化ビニル）、ポリアクリル
アミド、架橋デキストラン、アガロース、ポリアクリレ
ート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチ
ルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ
（エチレンテトラフタレート）、ナイロン、ポリ（ビニ
ルブチレート）等、それ自体でまたは他の材料と抱合し
て用いられる材料、Bioglassとして入手可能なガラス、
セラミック、金属等が包含される。天然または合成集合
体たとえばリポソーム、リン脂質小胞および細胞も使用
できる。

支持体または表面へのsbp構成要素の結合は、文献で
一般に利用されているよく知られた技術で達成できる
（たとえば、“Immobilized Enzyme,"Ichiro Chibata,H
alsted Press,New York,1978およびCuatrecasas:J.Bio
l.Chem.,245:3059、1970参照）。表面は、多数の形状の
ひとつ、たとえばストリップ、ロッド、ビーズを含む粒
子等とすることができる。

表面は通常、多官能性であるかもしくは多官能性化が
可能であるか、またはオリゴヌクレオチドもしくはsbp
構成要素を特異的もしくは非特異的な共有結合もしくは
非共有結合的相互作用を介して結合させることができ
る。広範囲の官能基が存在し、また導入できる。官能基
には、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、
エチレン基、ヒドロキシル基、メルカプト基等が包含さ
れる。広範囲の化合物を粒子に連結する様式はよく知ら
れていて、文献に詳細に例示されている（たとえばCaut
recasas:J.Biol.Chem.,245:3059、1970参照）。オリゴ
ヌクレオチドまたはsbp構成要素に対する連結基の長さ
は、連結される化合物の性質、連結される化合物と粒子
間の距離の配列のハイブリダイゼーションへの影響等に
よって、広範囲に変動させることができる。オリゴヌク
レオチドまたはsbp構成要素は主として粒子の外表面に
結合する。

表面として使用される粒子は、直接、または常法によ
って粒子に結合させた蛍光性化合物もしくは蛍光体によ
って蛍光性とすることができる。蛍光体は通常、粒子中
に溶解するかまたは粒子に共有結合もしくは非共有結合
で結合させ、多くの場合、粒子全体に均一に結合させ
る。蛍光性付与ラテックス粒子は米国特許第3,853,987
号に教示されている。

標識またはレポーター基−プローブに抱合または結合
して、直接検出できるかまたは特異的結合反応を介して
検出可能なシグナルを生成できるシグナル生成系の構成
要素。標識には、増幅もしくは連結のための鋳型を与え
るかまたはリプレッサータンパク質に対するようなリガ
ンドして作用できるポリヌクレオチドプライマーまたは
特異的ポリヌクレオチド配列が包含される。好ましく
は、ポリヌクレオチドプローブのひとつが標識をもつか
または標識をもたせることが可能である。一般に、検出
可能な任意の標識が使用できる。標識は同位元素でも非
同位元素でもよく、通常は非同位元素であり、触媒、染
料、蛍光分子、化学発光体、補酵素、酵素、基質、放射
性基、ラテックスもしくは炭素粒子のような粒子、金属
ゾル、クリスタライト、リポソーム、細胞等で、さらに
染料、触媒もしくは他の検出可能基等で標識できる。標
識はシグナル生成系の構成要素であり、単独でまたはシ
グナル生成系の他の構成要素とともに検出可能なシグナ
ルを発生できる。標識はヌクレオチド配列に直接結合し
てもよく、ヌクレオチド配合に結合するsbp構成要素と
相補性のsbp構成要素と結合することによってヌクレオ
チド配列に結合可能になる。

シグナル生成系−シグナル生成系は１個または２個以
上の成分を有し、少なくとも１個の成分は標識またはレ
ポーター基である。シグナル生成系は、サンプル中のポ
リヌクレオチド分析対象の存在または量に関連するシグ
ナルを発生する。シグナル生成系は測定可能なシグナル
の生成に必要なすべての試薬を包含する。標識がヌクレ
オチド配列と抱合しない場合は、標識は通常、ヌクレオ
チド配列に結合するヌクレオチド配列の部分であるsbp
構成要素と相補性のsbp構成要素に結合する。シグナル
生成系の他の成分はデベロッパー溶液中に含有させるこ
とができ、基質、エンハンサー、アクティベーター、化
学発光化合物、補因子、インヒビター、スカベンジャ
ー、金属イオン、シグナル発生物質の結合に必要な特異
的結合物質等が包含される。シグナル生成システムの他
の成分は、補酵素、酵素産生物と反応する物質、他の酵
素および触媒等とすることができる。シグナル生成系は
外部手段、電磁線の使用、望ましくは肉眼的検査によっ
て検出可能なシグナルを提供する。

シグナル生成系は少なくとも１種の触媒、通常は酵素
と、少なくとも１種の基質を包含し、また２種もしくは
それ以上の触媒および複数個の基質を包含していてもよ
く、１種の酵素の基質が他の酵素の生成物である酵素の
組合せを包含することができる。シグナル生成系の機能
は、サンプル中のポリヌクレオチド分析対象の量に関連
する検出可能なシグナルを提供する生成物を生成するこ
とである。

シグナル生成系に有用な多数の酵素および補酵素が、
米国特許第4,275,149号第19〜23欄および米国特許第4,3
18,980号第10〜14欄に示されている。これらの開示は参
考として本明細書に導入する。多数の酵素の組合せが米
国特許第4,275,149号第23〜28欄に掲げられている。こ
れらの組合せは本発明に使用することができる。この開
示を参考として本明細書に導入する。

過酸化水素の産生に関与する酵素および染料前駆体を
染料へ酸化するための過酸化水素の使用はとくに興味が
ある。特定の組合せには、糖オキシダーゼたとえばグル
コースおよびガラクトースオキシダーゼ、異項環オキシ
ダーゼたとえばウリカーゼおよびキサンチンオキシダー
ゼと、過酸化水素を染料前駆体の酸化に使用する酵素、
すなわちペルオキシダーゼたとえば西洋ワサビペルオキ
シダーゼ、ラクトペルオキシダーゼまたはミクロペルオ
キシダーゼとの組合せが包含される。その他の酵素の組
合せは、参考として導入した文献中に見出される。単一
の酵素を標識として使用する場合、使用できる他の酵素
にはヒドロラーゼ、トランスフェラーゼおよびオキシド
レダクターゼがあり、ヒドロラーゼとしてはアルカリホ
スファターゼおよびβ−ガラクトシダーゼを挙げること
ができる。また、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシ
フェラーゼのようなルシフェラーゼも使用できる。

使用できる補酵素の例には、NAD［Ｈ］、NADP
［Ｈ］、ピリドキサールリン酸、FAD［Ｈ］、FMN［Ｈ］
等があり、通常、補酵素は環化反応に関与する（とくに
米国特許第4,318,980号参照）。

酵素反応の生成物は通常、染料または蛍光体である。
蛍光体の多数の例が米国特許第4,275,149号第30および3
1欄に示されている。この開示を参考として本明細書に
導入する。

シグナル生成システムには、直径少なくとも約50nmで
約50ミクロン未満、通常は少なくとも約100nmで約25ミ
クロン未満、好ましくは約0.2〜５ミクロンの不溶性粒
子である１種または２種以上の粒子を包含できる。粒子
は有機または無機の、多孔性または非多孔性の、好まし
くは水と密度がほぼ等しい。一般に約0.7〜約1.5g/mlの
密度をもつ粒子であり、透明、半透明または不透明の材
料で構成される。

有機粒子は通常、付加または縮合重合体のいずれかの
重合体で、検定メジウム中に容易に分散される。粒子の
表面は、直接または間接的にオリゴヌクレオチドまたは
sbp構成要素が結合するように吸着性であるかまたは官
能性化が可能である。粒子の性質については前述した。

興味のある蛍光体は一般的に、350nm以上、通常は400
nm以上、好ましくは450nm以上の波長の光を放出する。
望ましくは、蛍光体は、高い量子効率、大きなストーク
スシフトを有し、それらの接合および使用条件下で化学
的に安定である。蛍光体の語は、電磁線照射または化学
的活性化による活性化で光を放出する物質であり、蛍光
およびリン光物質、シンチレーターならびに化学発光物
質を包含することを意図するものである。

興味ある蛍光体は、ある種の主要官能性を有する様々
のカテゴリーに分類される。これらの主要官能性には、
１−および２−アミノナフタレン、p,p−ジアミノスチ
ルベン、ピレン、四級フェナンスリジン塩、９−アミノ
アクリジン、p,p′−ジアミノスチルベンイミン、アン
トラセン、オキサカルボキシアニン、メロシアニン、３
−アミノエクイレニン、ペリレン、ビス−ベンズオキサ
ゾール、ビス−ｐ−オキサゾリルベンゼン、1,2−ベン
ゾフェナジン、レチナール、ビス−３−アミノピリジニ
ウム塩、ヘレブリゲニン、テトラサイクリン、ステロフ
ェノール、ベンズイミダゾリルフェニルアミン、２−オ
キソ−３−クロメン、インドール、キサンテン、７−ヒ
ドロキシクマリン、4,5−ベンズイミダゾール、フェノ
キサジン、サリチレート、ストロファンチジン、ポルフ
ィリン、トリアリールメタン、フラビンならびに希土類
キレートオキシドおよび塩が包含される。蛍光体の例は
米国特許第4,318,707号第７および８欄に説明されてい
る。この開示は参考として本明細書に導入する。

さらに、エネルギー吸収または消光粒子を使用するこ
とができる。これは、少なくとも直径約50nmの固体不溶
性粒子で、プローブのポリヌクレオチド分析対象とのハ
イブリダイゼーションまたは特異的結合ペアの構成要素
間の特異的結合から生じた距離内では蛍光粒子の蛍光の
消光が可能である。消光粒子は蛍光粒子と同種または異
種であるが、通常は異種である。通常、消光粒子は、粒
子の表面から測定して約50Å以上、好ましくは約500Å
以上、さらに好ましくは約2000Å以上の距離で実質的な
消光を与えるものである。

光放出を修飾するためには多くの異なる種類の粒子が
使用できる。炭素粒子、たとえば木炭末、油煙、グラフ
ァイト、コロイド状炭素等はとくに興味がある。炭素粒
子のほかに金属ゾル、とくに貴金属、金、銀および白金
が使用できる。他の金属誘導粒子には、金属スルファイ
ドたとえば鉛、銀もしくは銅スルファイド、または金属
酸化物たとえば鉄もしくは銅酸化物が包含される。

検出可能なシグナルとして別の光源には化学発光源が
ある。化学発光源は、化学反応によって電子的に励起さ
れ、検出可能なシグナルとして働く光を放出するかまた
は蛍光受容体にエネルギーを付与する化合物が関与する
ものである。

様々な化合物群が様々な条件下に化学発光を与えるこ
とが明らかにされている。一群の化合物として、2,3−
ジヒドロ−1,4−フタラジンジオンがある。最も一般的
な化合物は、上記化合物の５−アミノ類縁体のルミノー
ルである。この群の他の化合物としては、５−アミノ−
6,7,8−トリメトキシ−およびジメチルアミノ−［Ca］
−ベンズ類縁体がある。これらの化合物は、アルカリ性
過酸化水素または次亜塩素酸カルシウムと塩基によって
発光させることができる。他の化合物群は、2,4,5−ト
リフェニルイミダゾールであり、母体化合物は一般名ロ
ーフィンと呼ばれる化合物である。化学発光類縁体はｐ
−ジメチルアミノ−およびｐ−メトキシ置換基を包含す
る。化学発光はまた、オキシレート、通常オキザリル、
活性エステルたとえばｐ−ニトロフェニルおよび過酸化
物たとえば過酸化水素により、塩基性条件下に得られ
る。また、ルシフェリンをルシフェラーゼまたはルシゲ
ニンと組合せて使用することができる。

補助材料−様々な補助材料が、本発明による検定には
しばしば用いられる。たとえば緩衝剤が通常、検定メジ
ウム中に添加され、また検定メジウムおよび検定成分に
対する安定剤が用いられる。これらの添加物に加えて、
しばしば、アルブミンのようなタンパク質、ホルムアミ
ドのような有機溶媒、四級アンモニウム塩、デキストラ
ン硫酸のようなポリカチオン、界面活性剤とくに非イオ
ン界面活性剤、結合エンハンサーたとえばポリアルキレ
ングリコール等が包含される。

ヌクレオシド三リン酸−５′三リン酸置換基を有する
ヌクレオシド、好ましくはデオキシヌクレオシド三リン
酸。ヌクレオシドは、プリンまたはピリミジン誘導体の
いずれかの窒素塩基のペントース糖誘導体で、窒素塩基
はペントース糖の１′−炭素原子に共有結合している。
プリン塩基には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、イ
ノシンおよびそれらの誘導体、類縁体がある。ピリミジ
ン塩基には、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル
（Ｕ）、ならびにそれらの誘導体および類縁体がある。

誘導体および類縁体とは、非誘導ヌクレオシド三リン
酸と同様に認識され、重合されるその誘導体および類縁
体をいう。このような誘導体または類縁体の例として
は、レポータ基によって修飾された誘導体、ビオチン
化、アミン修飾、放射標識、アルキル化等を受けた誘導
体、またチオリン酸、ホスファイト、環原子の修飾誘導
体が包含されるが、これらは単に例示したものであっ
て、本発明を限定するものではない。レポーター基は、
フルオレセインのような蛍光基、レミノールのような化
学発光基、遅延蛍光によって検出できるＮ−（ヒドロキ
シエチル）エチレンジアミン三酢酸のようなテルビウム
キレート剤等であってもよい。

ポリヌクレオチドポリメラーゼ−一本鎖ポリヌクレオ
チドを含むDNAまたはRNA鋳型に沿って、それらと相補性
の、ポリヌクレオチドプライマーの延長を形成させるた
めの触媒、通常は酵素。ポリヌクレオチドポリメラーゼ
は鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼであり、ポ
リヌクレオチドプライマーの３′末端を延長するための
構築ブロックとしてヌクレオシド三リン酸を使用して、
一本鎖ポリヌクレオチドと相補性の配列を与える。通
常、触媒は酵素であり、たとえばRNAポリメラーゼ、好
ましくはDNAポリメラーゼであり、任意の起原たとえば
細胞、細菌たとえば大腸菌、植物、動物、ウイルス、好
熱菌等に由来する原核生物DNAポリメラーゼ（Ｉ、IIま
たはIII）、T4DNAポリメラーゼ、T7DNAポリメラーゼ、
クレノウフラグメント、逆転写酵素、RNAレプリカーゼ
等である。

完全または部分的に順次一本発明に用いられるサンプ
ルおよび各種試薬は、同時以外の方法で混合され、１種
または２種以上の試薬が残りの１種または２種以上の試
薬の混合され、部分混合物を形成する。各部分混合物は
ついで本方法の１または２以上の工程に付される。すな
わち、それぞれの部分混合物は１または２以上の所望の
結果が達成される条件下にインキュベートすることがで
きる。

ハイブリダイゼーション（ハイブリダイズ）および結
合−ヌクレオチド配列に関してはこれらの語は本明細書
では同等に用いられている。２個のヌクレオチドが互い
にハイブリダイズする能力は、２個のヌクレオチド配列
の相補性の程度に基づくものであり、合致した相補性ヌ
クレオチド対の分画に基づくものである。与えられた配
列中に、他の配列と相補性のヌクレオチドが多いほど、
両者のハイブリダイゼーションの程度は大きくなる。ハ
イブリダイゼーションの度合はまた、粘度条件または温
度、溶媒比、塩濃等を含む緊縮度にも依存する。

第一のポリヌクレオチドプローブ−その３′末端に、
その配列の少なくとも部分、好ましくは全配列が、標的
ポリヌクレオチド分析対象の部分と、標的ポリヌクレオ
チド分析対象のある領域と部分的に相補性、通常は完全
に相補性であるがためにハイブリダイゼーション可能で
あるポリヌクレオチド配列（３′標的結合配列）を有す
る化合物であり、したがって第一のポリヌクレオチドプ
ローブは標的ポリヌクレオチド分析対象の上述の領域に
結合することになる。第一のポリヌクレオチドプローブ
はまた、第二のポリヌクレオチドプローブの第二の隣接
配列と少なくとも50％、通常は少なくとも65％相補性の
第一の隣接配列からなる。第一のポリヌクレオチドプロ
ーブは、標的ポリヌクレオチド結合配列と第一の隣接配
列の間に位置し、標的ポリヌクレオチド結合配列の末梢
に第一の隣接配列と結合する付加的配列を含有していて
もよい。

第一のポリヌクレオチドプローブの主要な選択基準
は：（ｉ）３′末端標的結合配列は信頼できるものでな
ければならない。すなわち、標的ヌクレオチド配列の少
なくとも部分とほぼまたは正確に相補性で、安定かつ特
異的な結合を与えるのに十分な長さをもたなければなら
ない。（ii）３′末端は、遊離３′−ヒドロキシル基を
形成するかまたは形成できるものでなければならない。
最小の第一隣接配列は、通常、少なくとも10、好ましく
は少なくとも15のヌクレオシド長を有する。３′末端標
的結合配列と第一の隣接配列の間に通常位置する付加的
配列は、２種の基の間の距離を増大させ、すなわち増幅
時のDNA合成を増大させ、増幅生成物の検出を可能にす
る受容体結合部位を与えるように選択される。一般的
に、第一のポリヌクレオチドプローブは約30〜5,000ヌ
クレオチド長を、多くの場合、40〜1,000ヌクレオチド
長を有する。第一および第二ポリヌクレオチドプローブ
のハイブリダイゼーション部分を合わせた長さは少なく
とも約20ヌクレオチド、好ましくは約40〜2,000ヌクレ
オチドである。生物学的に合成された未知配列のランダ
ムフラグメントを使用できるが、核酸は一本鎖で、標的
ヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド分析対象と相
補性であることが条件になる。

第二のポリヌクレオチドプローブ−第二のポリヌクレ
オチドプローブは、その５′末端に、少なくともその部
分好ましくはそのすべてが、第一のポリヌクレオチドプ
ローブがハイブリダイズする領域以外の領域で標的ポリ
ヌクレオチド分析対象とハイブリダイゼーション可能な
配列（５′−標的結合配列）を有する。第二のポリヌク
レオチドプローブは、第一のポリヌクレオチドプローブ
の第一の隣接配列と少なくとも50％、通常は少なくとも
65％相補性で、第二の隣接配列と命名される配列を有す
る。すなわち、第一および第二のポリヌクレオチドプロ
ーブは、それぞれ、他の配列と少なくとも部分的に相補
性のポリヌクレオチド配列を有する。第二のポリヌクレ
オチドプローブは、標的ポリヌクレオチド結合配列と第
二の隣接配列の間に位置し、標的ポリヌクレオチド結合
配列の末梢に第二の隣接配列と結合する付加的な受容体
結合またはスペーサー配列を含有していてもよい。

第一および第二ポリヌクレオチドプローブに相補性の
標的ポリヌクレオチド分析対象の２個の領域は通常、分
析対象の実質的な分画で２個の領域が確実に連結される
ように、互いに十分な近位に存在する。２個の領域は、
０〜50ヌクレオチド、好ましくは０〜１ヌクレオチドの
範囲内にある。これらの領域が２個以上のヌクレオチド
で分離されている場合には、多くの場合、第一のプロー
ブが標的に結合したならばヌクレオチドポリメラーゼと
ヌクレオシド三リン酸によって延長され、プローブ間の
距離を短縮することが望ましい。

非連続−ハイブリダイズした第一のポリヌクレオチド
プローブの５′末端と第二のポリヌクレオチドプローブ
の３′末端の間の標的ポリヌクレオチド配列に少なくと
も１個のヌクレオチドが存在すれば、プローブは標的ヌ
クレオチド配列の非連続部分にハイブリダイズするとい
う。

連続−第一のプローブおよび第二のプローブのヌクレ
オチド配列が標的ポリヌクレオチド分析対象とハイブリ
ダイズしたとき、第一のプローブ配列の５′末端と第二
のプローブ配列の３′末端の間にヌクレオチドがない場
合、プローブは連続性であるという。

コピー−一本鎖ポリヌクレオチド配列と相補性の配列
から分化されるような一本鎖ポリヌクレオチドの直接コ
ピーである配列を意味する。本発明では、一本鎖ポリヌ
クレオチドの相補性配列が最初、ポリヌクレオチドプラ
イマーの延長の結果として生成され、一本鎖ポリヌクレ
オチドの直接コピーである配列は上述の相補性配列から
ついで得られる。

共有結合的付着−第一のポリヌクレオチドプローブと
第二のポリヌクレオチドプローブの間に化学結合を形成
すること。

化学結合は、プローブが標的ポリヌクレオチド分析対
象に結合した場合、通常０または１ヌクレオチド分離し
ている場合、プローブが連続であっても非連続でも、形
成することができる。共有結合的付着は酵素的に、たと
えばリガーゼを用いて達成できる。プローブの連結に先
立って、標的ポリヌクレオチド分析対象とハイブリダイ
ズした他のプローブの方向に延長可能な３′末端をもつ
プローブは処理して、他のプローブと連続または事実上
連続とすることができる。たとえば、酵素的リゲーショ
ンまたは化学的カップリングが起こり得る場合、プロー
ブは事実上連続である。一般的には、両プローブが１〜
３ヌクレオチドの範囲内で離れているとき、事実上連続
である。鎖の延長はたとえば、ポリヌクレオチドポリメ
ラーゼとヌクレオシド三リン酸の添加または一方のプロ
ーブに、ハイブリダイズしたプローブ間の標的ポリヌク
レオチド分析対象の非連続領域と相補性のヌクレオチド
配列を連結することによって達成できる。共有結合的付
着は、プローブのリン酸残基間に化学結合を形成させる
ことによって化学的にも達成できる。

プローブの延長手段−プローブが標的ポリヌクレオチ
ド配列と結合した場合、プローブを連結するためには、
多くの場合、プローブを連続にすることが望ましい。上
に説明したように、他のプローブの方向に延長できる
３′末端を有するプローブは、標的ポリヌクレオチド分
析対象にハイブリダイズしたプローブをポリヌクレオチ
ドポリメラーゼおよびヌクレオシド三リン酸と、プロー
ブが延長される条件下に混合することによって延長でき
る。別法として、プローブ間の標的ポリヌクレオチド分
析対象の非連続部分と相補性のヌクレオチド配列をプロ
ーブの一方に連結することもできる。

本発明の一態様は、一本鎖ヌクレオチドまたはそれと
相補性の配列の少なくとも１個のコピーを生成させる方
法に関する。この方法は、ヌクレオシシド三リン酸およ
び鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼの存在下
に、一本鎖ポリヌクレオチドの３′末端において第一の
隣接配列とハイブリダイゼーション可能な配列を有する
ポリヌクレオチドプライマーの延長を形成させ、この場
合、第一の隣接配列は一本鎖ポリヌクレオチドの第二の
隣接配列と少なくとも部分的に相補性であり、延長され
たポリヌクレオチドプライマーと一本鎖ポリヌクレオチ
ドを解離させることからなる。上述の工程を反復して、
適当なコピーを生成させる。

一般的には、液体メジウム中に、（ｉ）内部的にハイ
ブリダイゼーション可能な第一および第二隣接配列で各
末端が隣接されたポリヌクレオチド配列を有する一本鎖
ポリヌクレオチド、（ii）その３′末端の少なくとも10
塩基部分は、一本鎖ポリヌクレオチドの３′末端におけ
る第一および第二の隣接配列の構成要素と相補性である
ポリヌクレオチドプライマー、（iii）ヌクレオシド三
リン酸、および（iv）鋳型依存性ポリヌクレオチドポリ
メラーゼからなる混合物を準備する。この混合物を、
（ｉ）内部でハイブリダイズした第一および第二の隣接
配列があればこれを解離させ、（ii）ポリヌクレオチド
プライマーを、一本鎖ポリヌクレオチドに隣接するその
相補性配列とハイブリダイズさせ、（iii）ポリヌクレ
オチドプライマーを一本鎖ポリヌクレオチドに沿って延
長させて第一の延長されたポリヌクレオチドプライマー
を与え、（iv）第一の延長されたポリヌクレオチドプラ
イマーと一本鎖ポリヌクレオチドを解離させ、（ｖ）第
一の延長されたポリヌクレオチドプライマーをポリヌク
レオチドプライマーとハイブリダイズさせ、（vi）ポリ
ヌクレオチドプライマーを第一の延長されたポリヌクレ
オチドプライマーに沿って延長させて第二の延長された
ポリヌクレオチドプライマーを与え、（vii）第二の延
長されたポリヌクレオチドプライマーを第一の延長され
たポリヌクレオチドプライマーから解離させ、そして
（viii）上記工程（ｖ）〜（vii）を反復させる条件下
にインキュベートする。

本発明の一態様を反応式１に例示するが、これは例示
の目的であって、本発明を限定するものではない。

分子Ｉはたとえば、相補性配列1aおよび1bで逆方向反
復配列を有する二本鎖DNAである。このDNAを一本鎖にす
ると分子IIとなることができる。また分子IIは1aおよび
1b配列を有するRNAであってもよい。ポリヌクレオチド
プライマー1cを分子IIとハイブリダイズすると分子III
が生成する。プライマー1cは配列1aと実質的に同一また
は類似のポリヌクレオチド配列を有する。DNAポリメラ
ーゼとヌクレオシド三リン酸の存在下に、プライマー1c
は分子IIに沿って延長して分子IVを生成する。分子IVを
解離させると一本鎖IV aおよびIV bを生じる。分子IV a
は未変化の分子IIであって相補性の配列1aおよび1bを有
し、分子IV bは相補性の配列1cと1dを有する。明らかな
ように、1cは1aに相当し、1dは1bに相当する。ポリヌク
レオチドプライマー1cはIV aの領域1bおよびIV bの領域
1dにハイブリダイズして分子V a（III）およびV bをそ
れぞれ生成する。プライマー1cをV aおよびV bに沿って
上述の条件下に延長させると、それぞれ分子VI a（IV）
およびVI bを生成する。分子VI aおよびVI bは一本鎖ポ
リヌクレオチドに解離することができ、これがついでプ
ライマー1cとハイブリダイズして鎖の延長が反復され
る。この方法で、分子IIの配列1aおよび1bの間の配列を
含む最初の一本鎖ポリヌクレオチドの多数のコピーおよ
びそれと相補性の配列が得られる。

この方法の実施に際しては、水性メジウムが使用され
る。他の極性共溶媒も使用できる。通常は、炭素原子１
〜６個、より通常には炭素原子１〜４個を有する酸素含
有有機溶媒、たとえばアルコール、エーテル等が用いら
れる。これらの共溶媒は通常、約70重量％未満、より通
常には約30重量％未満、添加される。

メジウムのpHは通常約4.5〜9.5の範囲、より通常には
約5.5〜8.5の範囲、好ましくは約６〜８の範囲である。
pHおよび温度は、各場合に応じて選択され、変動され
て、同時にまたは順次、一本鎖ポリヌクレオチド配列中
に内部でハイブリダイズした配列があればその解離、一
本鎖ポリヌクレオチドとポリヌクレオチドプライマーの
ハイブリダイゼーション、プライマーの延長、延長した
プライマーの解離、延長したプライマーとプライマーの
ハイブリダイゼーション、ハイブリダイズしたプライマ
ーの延長、延長したプライマーの解離が行われる。場合
によっては、上記工程を順次または同時に実施している
かの問題はあいまいになってくる。所望のpHを達成し、
定量時そのpHを維持するためには、様々な緩衝剤が使用
できる。緩衝剤の例としては、ホウ酸塩、リン酸塩、炭
酸塩、Tris、バルビタール等を挙げることができる。使
用する特定の緩衝剤に関して本発明には制限はないが、
個々の方法ではある緩衝剤が他の緩衝剤より好ましいと
いうことはあり得る。

この方法の実施に際しては、通常、穏和な温度が使用
される。この方法の実施中には一定の温度を用いること
が望ましいが、しばしばメジウムは２〜３種の温度の間
を循環させることが必要な場合もある。一定の場合に
は、温度は一本鎖ポリヌクレオチドと延長されたポリヌ
クレオチドプライマーの複合体の融解温度付近とする。
この方法の温度は、一般的には約10〜100℃の範囲、よ
り通常には約20〜95℃、好ましくは35〜70℃の範囲であ
る。しかしながら、上記工程が順次または同時に行われ
るかによって、温度は変動させることができる。たとえ
ば、延長工程では、約20〜40℃の比較的低温が用いら
れ、一方、変性およびハイブリダイゼーションは、約50
〜95℃の温度で実施できる。

本発明の方法を実施するための時間は、一般的には、
一本鎖ポリヌクレオチドのコピーまたはそれと相補性の
配列の所望数が得られるのに十分な時間である。一方、
これは、増幅を行う目的、たとえばポリヌクレオチド分
析対象のアッセイに依存する。一般的には、この方法の
実施に要する時間は１サイクルあたり約１〜10分で、サ
イクルは１回から200回もしくはそれ以上、通常は１〜8
0回、多くの場合20〜80回行われる。便宜上、所要時間
およびサイクル数は通常、最小限とすることが望まし
い。一般に、与えられた程度の増幅を達成するための時
間は、たとえば、ポリヌクレオチドポリメラーゼを飽和
させるのに十分なヌクレオシド三リン酸の濃度の選択、
またはポリヌクレオチドポリメラーゼおよびポリヌクレ
オチドプライマーの濃度の増加によって短縮できる。

コピーされる一本鎖ポリヌクレオチドの量は、サンプ
ル中１または２分子という僅かな量でもよいが、一般的
にはサンプル中約10²〜10¹⁰、さらに通常では約10³〜10
⁸分子の範囲である。ポリヌクレオチドプライマーの量
は、少なくとも所望のコピー数と同程度で、通常、サン
プルが10〜1,000μの場合、サンプル中10^-15〜10^-9モ
ルである。通常、プライマーは少なくとも10^-12M、好ま
しくは少なくとも10^-10M、さらに好ましくは少なくとも
約10^-8M存在させる。ポリヌクレオチドプライマーの濃
度は過剰にすることが好ましく、一本鎖ポリヌクレオチ
ドの濃度の、好ましくは少なくとも100倍とする。

各試薬の最終濃度は、標的配列のコピー数が最適にな
るように、通常、経験的に決定される。

デオキシヌクレオシド三リン酸のメジウム中濃度は広
範囲に変動させることができ、これらの試薬の過剰量存
在させるのが好ましい。デオキシヌクレオシド三リン酸
は通常、10^-6〜10^-2M、好ましくは10^-5〜10^-3M存在させ
る。

鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼの濃度は通
常、経験的に決定される。好ましくは、さらに濃度を高
めても増幅に要する時間が５倍まで、好ましくは２倍ま
でしか短縮しないようになる濃度が用いられる。一次的
な制限因子は一般的には試薬の経費である。

各試薬を混合して混合物を形成させるときの混合順序
は様々である。一般的には、第一および第二の隣接配列
をもつ一本鎖ポリヌクレオチドがそれ自体サンプル中の
標的ポリヌクレオチド配列であるか、またはサンプル中
のポリヌクレオチド分析対象の存在の関数として形成さ
れる。これを、予め調製したポリヌクレオチドプライマ
ー、ヌクレオシド三リン酸および鋳型依存性ポリヌクレ
オチドポリメラーゼの混合物と混合する。しかしなが
ら、上述の同時添加、ならびに他の段階的または特定の
順序での添加も使用できる。

試薬の濃度および添加順序、ならびに方法の条件は、
一般的に、一本鎖ポリヌクレオチド配列のコピー数およ
びこのようなコピーが形成される速度を最大にしようと
いう希望によって支配される。一般に、一本鎖ポリヌク
レオチド配列のコピー数は少なくともファクター10²、
好ましくはファクター10⁴、さらに好ましくはファクタ
ー10⁶もしくはそれ以上で増加することが望ましい。

本発明はサンプル中のポリヌクレオチド分析対象の定
量または検出にとくに応用されるものである。一般的
に、本発明の方法は、分析対象の存在の結果として、第
一および第二のポリヌクレオチド隣接配列によって隣接
された一本鎖ポリヌクレオチド形成させるものである。
このようにして形成した一本鎖ポリヌクレオチドの直接
または間接的検出により分析対象の存在が示される。

一本鎖ポリヌクレオチドはサンプルを第一および第二
のポリヌクレオチドプローブと接触させることによって
形成できる。第一のプローブは、その３′末端における
分析対象の一本の鎖の第一部分と相補性の配列、および
第一の隣接配列から構成される。第二のプローブは分析
対象の同じ鎖の第二部分と相補性の５′末端における配
列、および第二の隣接配列から構成される。第一および
第二隣接配列は互いに少なくとも50〜65％の相補性を有
し、多くの場合80〜100％の相補性を有する。接触は、
第一および第二のプローブが分析対象と結合する条件下
に行われる。ついで、第一および第二ポリヌクレオチド
プローブが、上記分析対象に結合した場合にのみ、互い
に連結する条件を与える。

各種試薬を混合して混合物を形成させるための混合順
序は様々であるが、同時にまたは完全にもしくは一部を
順次行うことができる。一般的には分析対象配列を含有
するサンプルが得られる。これを、予め調製した第一お
よび第二ポリヌクレオチドプローブ、ヌクレオシド三リ
ン酸ならびにポリヌクレオチドポリメラーゼの混合物と
混合し、ついでリガーゼを添加する。しかしながら、上
述の同時添加、ならびに他の段階的もしくは他の順序に
よる添加も使用できる。試薬の濃度および添加順序なら
びに方法の条件は、一般的には、すべての標的ポリヌク
レオチド配列と第一および第二ポリヌクレオチドプロー
ブのハイブリダイゼーションならびにハイブリダイズし
た第一および第二のポリヌクレオチドプローブの共有結
合的付着を至適化する希望によって決定される。

第一および第二プローブが標的ポリヌクレオチド配列
とハイブリダイズした場合のこれらのプローブを共有結
合的に付着させるための手段には、第一のプローブの鎖
延長により第一および第二ポリヌクレオチドプローブを
連続性とする方法がある。第一のプローブを延長させる
一手段には、液体メジウムにポリヌクレオチドポリメラ
ーゼとデオキシヌクレオシド三リン酸を添加し、第一お
よび第二のプローブが分析対象とハイブリダイズした場
合、第一のプローブの３′末端の鎖延長が形成して、第
二のポリヌクレオチドプローブと連続性とするものであ
る。

第一および第二のポリヌクレオチドプローブが分析対
象配列とハイブリダイズして、両ポリヌクレオチドプロ
ーブが連続性になる場合、第一および第二プローブは共
有結合的に付着する。第一および第二ポリヌクレオチド
プローブの共有結合的付着を達成する一方法には酵素を
用いる手段がある。好ましくは、分析対象配列とハイブ
リダイズした第一および第二ポリヌクレオチドプローブ
を含有するメジウムを、一つのプローブの５′末端と他
のプローブの３′末端との間のリン酸ジエステル結合の
形成を触媒するリガーゼで処理する。

ポリヌクレオチド３′−ヒドロキシル基の反応を触媒
できる任意の酵素が使用される。このような酵素の例と
してはたとえば任意の起源のポリヌクレオチドリガー
ゼ、たとえばE.coli細菌リガーゼ、T4ファージDNAリガ
ーゼ、哺乳動物DNAリガーゼ等を挙げることができる
が、これらは単に例示したものであって、本発明を限定
するものではない。この場合のpH、温度、溶媒および時
間については本発明の方法について上述したのとほぼ同
様である。

第一および第二のポリヌクレオチドプローブが分析対
象の非連続部分にハイブリダイズした場合の両プローブ
の共有結合を達成するための他の手段には、第一および
第二ヌクレオチドプローブの間に存在する分析対象配列
の非連続部分と十分に相補性なヌクレオチド配列の使用
がある。この記載の目的におけるこのようなヌクレオチ
ド配列は、介在リンカー配列とも呼ばれる。リンカー配
列は、たとえば第一および第二ポリヌクレオチドプロー
ブの製造について上述したような公知の方法によって製
造することができる。このリンカー配列は、第一および
第二ポリヌクレオチドプローブの間の分析対象配列とハ
イブリダイズすることができる。ついでこのリンカー配
列を、第一および第二ポリヌクレオチドプローブの両者
に、上述したような酵素的手段で連結させることができ
る。第一および第二のポリヌクレオチドプローブの配列
が分析対象に結合した場合、両プローブ間の連続関係を
作るためには、リンカー配列とポリメラーゼの混合物を
使用することも可能である。

第一および第二のポリヌクレオチドプローブがポリヌ
クレオチド分析対象とハイブリダイズした場合、両プロ
ーブを連結させたのち、ハイブリダイズしたポリヌクレ
オチドを解離させる。各プローブは他方の隣接配列とハ
イブリダイゼーション可能な隣接配列を含有するので、
一本鎖ポリヌクレオチドもこれらの配列を含有する。つ
いで、連結したプローブから生じる一本鎖ポリヌクレオ
チドの多数のコピーが製造される。ひとつのアプローチ
では、一本鎖ポリヌクレオチドの多数のコピーは、単一
ポリヌクレオチドプライマーを用い、上述の操作によっ
て得られる。他のアプローチでは、一本鎖ポリヌクレオ
チドの多数のコピーは、米国特許第4,683,195号および
第4,683,202号に記載された二重プライマー法を用いて
得ることもできる。これらの開示は参考として本明細書
に導入する。さらに他のアプローチでは、増幅は米国特
許出願第076,807号（1987年７月23日出願）に記載され
たようにして達成することもできる（対応ヨーロッパ特
許出願第88306717.5号参照）。これらの開示は参考とし
て本明細書に導入する。多数のコピーを形成させる他の
方法が、分析対象の検出のために本発明で使用できるこ
とは、本技術分野の熟練者には自明のとおりである。

第二の隣接配列に連結した第一の隣接配列の検出また
は一本鎖ポリヌクレオチドもしくはその相補性配列の検
出は、サンプル中のそのポリヌクレオチドの存在を指示
するものである。

ポリヌクレオチド分析対象の定量の例を反応式２に例
示する。これは例示の目的のものであって、本発明を限
定するものではない。

ポリヌクレオチド分析対象はVIIで示されていて、標
的分析対象の部分には２種のポリヌクレオチドプローブ
がハイブリダイズしている。プローブはそれぞれ、互い
に少なくとも部分的に相補性の配列2aおよび2bを含有す
る。分子VIIを処理して、プローブを連結可能にし、プ
ローブを連結させる。これは上述のようにして達成する
ことができ、反応式２中には分子VIIIとして示されてい
る。VIIIを解離させると分子IXを生成し、これは２個の
少なくとも部分的に相補性の配列、2aおよび2bを有す
る。反応式から明らかなように、分子IXは反応式１の分
子IIと類似し、ポリヌクレオチドプライマー2cと混合す
るとこれが分子IXの配列2bとハイブリダイズして、分子
Ｘを与える。上述のように、プライマー2cの鎖延長で分
子XIが生成する。XIを解離させたのち、プライマー2cと
ハイブリダイズさせ、鎖延長を行うと分子IXの多数のコ
ピーまたはそれと相補性の配列を生成する。一本鎖ポリ
ヌクレオチドは、一本鎖として検出するかまたはその相
補性の鎖とハイブリダイズさせる。連結したプローブの
存在はサンプル中のポリヌクレオチド分析対象の存在を
指示する。

本発明の方法をポリヌクレオチド分析対象の検出に応
用して行うに際しては、水性メジウムを使用し、多くの
場合これにはさらに上述したような他の極性溶媒を含有
させてもよい。pH、温度、時間および試薬の濃度は、一
本鎖ポリヌクレオチドの多数のコピーの形成について上
述したのと同じである。

メジウムのpHは通常約4.5〜9.5の範囲、より通常には
約5.5〜8.5の範囲、好ましくは約６〜８の範囲である。

この方法の温度は、一般に約20〜90℃、より通常には
約30〜70℃、好ましくは37〜50℃の範囲である。

一般的に、この方法を実施するのに要する時間は約５
〜200分である。、便宜上、所要時間は通常、最小限に
することが望ましい。

標的ポリヌクレオチド分析対象の濃度はサンプル中１
分子のような低濃度でもよく、サンプル中少なくとも10
^-21Mが好ましいが、一般的には約10^-14M〜10^-19M、より
通常には約10^-16〜10^-19Mの範囲で変動する。第一およ
び第二のポリヌクレオチドプローブならびにデオキシヌ
クレオシド三リン酸のメジウム中濃度は広範囲に変動さ
せることができる。これらの試薬は、期待される標的分
析対象の量に対して大モル過剰に存在させるのが好まし
い。デオキシヌクレオシド三リン酸は通常10^-6〜10
^-2M、好ましくは10^-5〜10^-3M存在させる。第二のポリヌ
クレオチドプローブならびに第一のポリヌクレオチドプ
ローブは、通常少なくとも10^-12M、好ましくは10^-10M、
さらに好ましくは少なくとも約10^-8M存在させる。

メジウム中のポリメラーゼおよび補因子の濃度も実質
的に変動させることができる。これらの試薬は10^-12M程
度の低濃度存在させることもできるが、第一および第二
のヌクレオチドプローブの濃度と少なくとも同濃度また
はそれ以上の濃度存在させることができる。

各種試薬の濃度は一般的には、ポリヌクレオチド分析
対象の問題の濃度範囲によって決定されるが、それぞれ
の試薬の最終濃度は、興味ある範囲に亘っての検定の感
度を至適にするように経験的に決定される。他の試薬の
検定液中の濃度は一般に、増幅方法について上述したの
と同じ原理に従って決定されることになる。主として考
慮すべき事項は、ポリヌクレオチド分析対象配列に関連
する一本鎖ポリヌクレオチドの十分な数のコピーが、容
易に検出され、ポリヌクレオチド分析対象の正確な定量
結果を与えるように生成することである。

メジウムを上述の条件下に同時にまたは順次インキュ
ベートしたのち、存在する一本鎖ポリヌクレオチドまた
は第一および第二プローブの連結した標的結合配列が検
出される。連結した配列の存在は、サンプル中のポリヌ
クレオチド分析対象の存在を指示する。連結した配列は
多くの方法で検出することができる。

本発明の方法では、ポリヌクレオチドプライマーの分
子の一部をビオチンのようなリガンド（Ｂ）で標識し、
ポリヌクレオチドプライマーの分子の他の部分はたとえ
ばフルオレセインのような検出可能（Ｆ）標識で標識す
ることができる。

リガンドは、小有機分子、ポリヌクレオチド配列、タ
ンパク質等であってもよい。増幅を行うと、二重鎖の混
合物が得られる（反応式３参照）。一部は両末端にリガ
ンドを有し、一部は両末端に検出可能標識を有し、一部
は一端にリガンドを他端に検出可能標識を有する。生成
物の比は、２種の標識の異なるプライマーの比を変動さ
せることによって改変できる。二重鎖は、その分子を、
リガンドに対する受容体が結合している表面に結合させ
ることによって検出できる。第一および第二隣接配列を
もつ一本鎖ポリヌクレオチドより短い、２種のプライマ
ー標識を含有する二重鎖は、これらの短い二重鎖のみを
解離させるのに十分な緊縮条件を用いることにより、結
合を防止することができる。非結合物質を除去したの
ち、支持体について検出可能な標識の存在を検査する。
その存在は、サンプル中のポリヌクレオチド分析対象の
存在を指示する。

他のアプローチにおいては、内部的にハイブリダイゼ
ーション可能な配列を選択できる。ハイブリダイズした
配列に結合できる合成または天然の受容体が存在するか
らである。これらの配列は通常、それらを標的ポリヌク
レオチド結合配列とポリヌクレオチドプローブまたは一
本鎖ポリヌクレオチドの隣接配列との間に包含させるこ
とによって導入される。別法として、これらはポリヌク
レオチドプライマー分子の部分の５′末端に標識として
導入こともできる。テトラサイクリンレプレッサーはこ
のような受容体である。このタンパク質はテトラサイク
リンオペレーターに結合し、ハイブリダイズした配列
は、このオペレーターの一部または全部からなるように
選択できる。レプレッサーは固体支持体に結合させ、増
幅反応溶液から増幅生成物を吸着および濃縮するのに使
用される。ついで結合した生成物は、アクリジニウオレ
ンジのような染料で染色することにより、吸着体の物性
たとえば電気的性質、光学的性質、音波調節等の変化に
より、またポリヌクレオチドプライマー分子の他の部分
に結合した標識の存在を検出することにより検出でき
る。

他のオペレーター−レプレッサー対、たとえば、DNA
二重鎖の捕捉のためのリガンドおよび受容体として用い
られてきたlacレプレッサーおよびオペレーター、なら
びにトリプトファンレプレッサーおよびオペレーターを
使用することもできる。

他のアプローチでは、ポリヌクレオチドプライマー分
子の部分にブロモデオキシウリジンを導入し、ブロモデ
オキシウリジンに対する抗体を使用することができる。
結合した配列の検出は、任意の上述の方法で実施でき
る。

一本鎖ポリヌクレオチドの検出のための好ましいアプ
ローチでは、ポリヌクレオチドを同時にまたは順次、加
熱または変性溶媒および溶質の使用によって変性し、た
とえば上述の方法のひとつで支持体に結合させる。次に
支持体を、核酸配列および標識または受容体結合部位か
らなるプローブと接触させる。核酸配列は、連結した一
本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも部分と相補性である
か、またはその相補性配列である。ついで、一本鎖ポリ
ヌクレオチドの存在は、支持体上における標識または受
容体結合部位の存在によって指示される。

他の検定フォーマット（反応式４に示したような）に
おいては、内部ハイブリダイゼーション可能配列3aおよ
び3bを含有する一本鎖ポリヌクレオチドが標識として用
いられる。この方法では、任意の手段たとえばDNAサン
ドイッチの形成を、標識核酸鎖の表面への結合の発生に
使用することができる。サンドイッチ法では、標的分析
対象に結合できる２種のプローブが用いられる。これら
のプローブの一方は固体表面に、たとえば、ビオチン−
アビジンのようなリガンド−受容体結合の使用により、
結合しているかまたは結合させることができる。他のプ
ローブは標識として一本鎖ポリヌクレオチドをもってい
る。（ｉ）２種のプローブを標的ポリヌクレオチド配列
とハイブリダイズさせ、（ii）プローブの一方がまだ結
合していない場合は、表面にその複合体を結合させ、
（iii）表面を洗浄したのち、一本鎖ポリヌクレオチド
に本発明の増幅過程を行わせ、一本鎖ポリヌクレオチド
の検出法として上述した方法を含めた特異的ポリヌクレ
オチドの任意の検出方法で生成物を検出する。

二本鎖核酸配列を特異的に検出するための任意の標準
方法が使用できる。

核酸を検出する一方法は核酸プローブを使用するもの
である。この方法は一般に、ニトロセルロースろ紙、セ
ルロースろ紙、ジアゾ化ろ紙またはナイロン膜のような
固体支持体上への標的核酸の固定化を包含する。標的核
酸を支持体上に固定したのち、支持体を適当に標識した
プローブ核酸と約10分〜48時間接触させる。上記時間を
経過したのち、固体支持体を数回洗浄して、非結合プロ
ーブを除去し、ハイブリダイズした物質をオートラジオ
グラフィーまたは分光法によって検出する。

プローブを使用する一方法は、米国特許出願第773,38
6号（1985年９月６日出願）に記載されている。この開
示を参考として本明細書に導入する（対応ヨーロッパ特
許出願86306860.7号も参照）。この方法は検定メジウム
中に、サンプルならびに核酸フラグメントと相補性の第
一および第二のポリヌクレオチド試薬を混合するもので
ある。第一および第二試薬はそれぞれ、核酸フラグメン
トの異なる領域とハイブリダイズする。第一の試薬は第
一の試薬を非共有結合的に重合可能にする手段を含有す
る。第二の試薬は第二の試薬を検出可能にする手段を含
有する。サンプルならびに第一および第二の試薬を検定
メジウム中、第一の試薬が重合し、サンプル中にDNAフ
ラグメントが存在する場合のみ重合した第一の試薬に第
二の試薬が結合すうような条件下に混合する。ついで測
定は、第二の試薬が重合した第一の試薬に結合したか否
かについて行われる。

サンプルを含有する検定混合物中で、一本鎖ポリヌク
レオチドを他の成分から分離するためには、第一もしく
は第二ポリヌクレオチドプローブまたは一本鎖ポリヌク
レオチドがその配列を固定化するため手段をもつかまた
はもつことが可能であることが望ましく、また環境によ
っては実際にそれが好ましい。一般に、固定化のための
この手段は支持体である。問題の配列は、それを本発明
の方法に使用するのに先立って、支持体に結合させる処
理を行うことができる。ヌクレオチド配合を固体支持体
に結合させる方法は多数知られている（たとえばT.Gold
kornら:Nucl.Acids Res.,14:9171〜9191,1986およびそ
の引用文献参照）。一般的には、ヌクレオチド配列を支
持体に結合させる操作は、その配列中の一部のヌクレオ
チドを、その配列の支持体への結合が可能になるような
化学的修飾に付すものである。支持体とヌクレオチド配
列の間の結合は共有結合であることが好ましく、ヌクレ
オチドと支持体の間には連結基を含むことがさらに好ま
しい。たとえば、支持体はマレイミド基が導入されるよ
うに処理することができ、ヌクレオチド配列はチオール
基を導入するように処理することができる。チオール基
はマレイミド基の活性化オレフィンと反応性であり、こ
の方式でヌクレオチド配列は支持体に共有結合させるこ
とができる。他の連結基の例には、ジアゾベンジルオキ
シメチル基で誘導体化されたセルロース（Noyes,B.E.＆
Start,G.R.,Cell,５:301,1975およびAlwine,J.C.ら:Pr
co.Natl.Acad.Sci.USA,74:5350,1977）およびｏ−アミ
ノフェニルチオエーテルで誘導化されたセルロース（Se
ed,B.:Nucl.Acids Res.,10:1799,1982）がある。

ヌクレオチド配列が最初から支持体に結合していない
場合には、２種の配列の一方を、本発明の方法の実施時
のある時点で、好ましくは第一および第二の標的ポリヌ
クレオチド結合配列がポリヌクレオチド分析対象の存在
の結果として共有結合的に付着したか否かを決定する前
に支持体に結合させることが望ましい。したがって、支
持体およびヌクレオチド配列の一方は、支持体とヌクレ
オチド配列の間の連鎖を与えることができる反応基を含
有しなければならない。反応基の性質は、本発明の方法
と適合性のあるものでなければならない。

このようなシステムのひとつは上述のような、支持体
がマレイミド基をヌクレオチド配列がチオール基を含有
するシステムである。他の態様においては、ヌクレオチ
ド配列および支持体が、ビオチン−アビジン等のような
相補性の特異的結合ペアの構成要素を含有する。すなわ
ち、本発明の方法は溶液中で行い、適当な時点で支持体
を導入し、相補性sbp構成要素を結合させる。支持体を
洗浄して非結合物質を除去したのち、さらに反応または
定量を進めることができる。

このようなシステムの他の例には、レプレッサーオペ
レーター相互作用がある。この場合、ヌクレオチド配列
の一方を、固体表面上に固定化した特異的レプレッサー
またはモジュレータータンパク質とのその配列特異的な
相互作用によって、固体表面上に捕捉させる。捕捉相の
この態様の利点は、オペレーターDNAのレプレッサーか
らの放出が複合体のインデューサー分子による処理で達
成できる場合があることである。たとえば、テトラサイ
クリンレプレッサーを固体表面上に固定化し、溶液を表
面に接触させた場合に、ヌクレオチド配列の一方または
他方に存在するオペレーター配列を特異的に捕捉し、保
持させる。次に表面を洗浄して非特異的結合を除去し、
最終的には、表面に結合したレプレッサー−オペレータ
ー複合体をインデューサー分子（この場合はテトラサイ
クリンまたはその活性類縁体のひとつ）と接触させてオ
ペレーター含有ヌクレオチドを表面から遊離させる。

インデューサー分子は、天然の分子と構造的に同一で
あり、生物学的／調節レプレッサー−オペレーター複合
体の解離を生じるという意味において「天然のインデュ
ーサー」であってもよく、また、類似のもしくは増強さ
れた結合および複合体解離活性をもつ、天然インデュー
サーの合成類縁体であってもよい。上述の例には、テト
ラサイクリンレプレッサー−オペレーター相互作用およ
びテトラサイクリンによるその解離がある（Hillen,W.
ら:J.Mol.Biol.,169:707〜721,1983およびKlock,G.ら:
J.Bact.,161:326〜332,1985）。

ヌクレオチド配列が支持体に共有結合によって付着し
ている場合には、たとえば、その配列を増幅またはクロ
ーニングするために、その配列を支持体から除くことが
望ましいことがある。この場合には、ヌクレオチド配列
と支持体の間に切断可能な基を導入することが望まし
い。このような切断可能な基の例には、ピロリン酸結
合、ジスルフィド結合、および制限酵素切断部位があ
る。

第一および第二のポリヌクレオチドプローブがポリヌ
クレオチド分析対象とハイブリダイズした場合には両プ
ローブが共有結合で付着し、一本鎖ポリヌクレオチド与
えるように準備、一本鎖ポリヌクレオチドが存在すれば
これを増幅したのち、共有結合で付着した第一および第
二標的ポリヌクレオチド結合配列を定量する。共有結合
での付着の存在は、サンプル中のポリヌクレオチド分析
対象の存在を指示する。上述のように、この定量には支
持体に結合した、または結合できるヌクレオチド配列が
関与する。支持体をメジウムから分離し、非結合物質を
含まないように洗浄し、ついでたとえば標識またはレポ
ーター基の存在の検出によって、連結した第一および第
二標的ポリヌクレオチド結合配列を調べる。一般的に
は、この検査は、サンプル中の標的ヌクレオチド配列の
存在に関連したシグナルを生成させるために、支持体を
シグナル生成系の残りの構成要素と接触させるものであ
る。

本発明の方法の使用により、支持体は、共有結合によ
る付着がなくハイブリダイゼーションを行う場合よりも
通常、もっと強力な条件下に洗浄することが可能にな
る。多くの場合、この洗浄条件では支持体に結合した二
重鎖が完全に解離してしまう。これらの条件には、カオ
トロピック剤たとえば尿素の単独またはホルムアミドの
ような他の変性剤との組み合せを含有し、室温または加
温下に用いられる溶液が包含する。しかしながら、第一
および第二ポリヌクレオチドプローブ間の共有結合によ
る付着、ならびにプローブの一方の表面への結合は影響
されない。生成した支持体結合標識物質の検出は、サン
プル中の標的ヌクレオチド配列の存在を支持する。

シグナルの検出は使用したシグナル生成系の性質に依
存する。標識またはレポーター基が酵素であれば、シグ
ナル生成系にはさらに付加的構成要素として酵素基質等
が包含される。酵素反応の生成物は、好ましくは化学発
光体、蛍光体もしくは非蛍光染料、分光測光法で検出で
きる生成物、または他の分光法もしくは電気計測法によ
って検出できる生成物である。標識が蛍光分子である場
合には、メジウムを放射して蛍光を測定する。標識が放
射性基の場合には、メジウムを計数して放射性カウント
を測定する。

分析対象の含有が疑われるサンプル中のポリヌクレオ
チド分析対象の存在を検出するための方法の他の態様に
は、ポリヌクレオチドプローブの第三および第四配列の
連結を含む方法がある。この場合、第三および第四の配
列は分析対象の別個の部分にハイブリダイゼーション可
能で、分析対象の存在時においてのみ連結可能または連
結可能とすることができる。第三および第四の配列が連
結すると、このようにして形成した一本鎖ポリヌクレオ
チドは環状ポリヌクレオチド鎖中に導入することができ
る。ポリヌクレオチドプローブはさらに、少なくとも部
分的に相補性の第一および第二の配列を有する。

ポリヌクレオチドプライマーの延長は、ヌクレオシド
三リン酸および鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラー
ゼの存在下に形成される。少なくともポリヌクレオチド
プライマーの３′末端は、ポリヌクレオチドプローブの
第一または第二の配列とハイブリダイズできる。次に、
延長されたポリヌクレオチドプライマーならびに／また
は分析対象の別個の部分と相補性の、連結した第三もし
くは第四配列の少なくとも部分と同一および／もしくは
相補性の配列が検出される。上述したいずれかの存在は
サンプル中のポリヌクレオチド分析対象の存在を指示す
る。

本発明におけるポリヌクレオチドプライマー、第一お
よび第二のポリヌクレオチドプローブ、または一本鎖ポ
リヌクレオチド配列の製造には様々な技術を使用するこ
とができる。それらは、生合成でも化学合成によっても
得ることができる。短い配列（約100ヌクレオチドま
で）の場合は、生合成に比較して化学合成の方が経済的
である。経済性に加えて、化学合成は、合成工程で低分
子量化合物および／または修飾塩基の導入に便利であ
る。さらに、化学合成は、標的ポリヌクレオチド結合配
列の長さおよび領域の選択にきわめて融通性がある。ポ
リヌクレオチドプライマーは標準的方法、たとえば市販
の自動核酸シンセサイザーを用いる方法で製造できる。
適当に修飾したガラスまたは樹脂上でのDNAの化学合成
では、表面に共有結合で付着したDNAを生じる。これは
洗浄およびサンプル処理に有利である。長い配列の場合
には、分子生物学で用いられる標準的な複製方法、たと
えば市販のRNA製造キット（たとえばPromegaより）およ
びJ.Messig（Methods Enzymol.,101;20〜78,1983）記載
の一本鎖DNAのためのM13を使用することができる。

オリゴヌクレオチド合成の他の方法には、リン酸トリ
エステルおよびリン酸ジエステル法（Narangら:Meth.En
zymol.,68:90,1979）および支持体上での合成（Beaucag
eら:Tetrahedron Lett.,22:1859〜1862,1981）ならびに
リン酸アミデート法（Caruthers.M.H.ら:Methods in En
zymology,Vol.1,pp287〜314,1988）および“Synthesis
and Applications of DNA and RNA",S.A.Narang編,Acad
emic Press,New York,1987およびその引用文献の他の記
載が包含される。

一本鎖ポリヌクレオチドまたは第一および第二ポリヌ
クレオチドプローブは酵素連結によって製造できる。２
種の適当な相補性オリゴヌクレオチドは標準的な自動化
技術で合成できる。ついでこれらを他のポリヌクレオチ
ド配列に酵素的に、たとえばT4リガーゼによって連結さ
せ一本鎖ポリヌクレオチドを製造するか、またはそれぞ
れを個個に、ポリヌクレオチド分析対象の部分にハイブ
リダイズできる別個のポリヌクレオチド配列に連結させ
る。ついで所望の生成物を、たとえば、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィー
（HPLC）によって単離できる。

ある場合には、一本鎖ポリヌクレオチドまたは第二ポ
リヌクレオチドプローブの３′末端を、鋳型依存性DNA
との反応を防止するようにまたは結合配列を付加して修
飾する。３′末端はたとえば、ジデオキシヌクレオチド
またはリボヌクレオチドの連結によって修飾し、ついで
生成したジアルデヒドをボロハイドライドおよび大きな
アミンたとえばアミノデキストランとともに還元アミノ
化に付すことができる。

ポリヌクレオチドプライマーは、標準的な自動化技術
で製造できる。

便宜上、本発明に用いられる試薬は、本方法に用いら
れる試薬の限定量を組み合わせて包装したキットとして
提供することができる。サンプル中のポリヌクレオチド
分析対象の検定においては、本方法に有用なキットは、
他の試薬と、標識できるもしくはそのひとつが支持体に
結合できる、またはその配列を標識するかもしくは支持
体に結合させることができるようにする基を提供できる
ポリヌクレオチドプライマーならびに第一および第二の
ポリヌクレオチドプローブを、組合せて包装したもので
ある。上述のキットには、その包装配合物中にさらに、
デオキシヌクレオシド三リン酸たとえばデオキシアデニ
ン三リン酸（dATP）、デオキシグアノシン三リン酸（dG
TP）、デオキシシチジン三リン酸（dCTP）およびデオキ
シチミジン三リン酸（dTTP）おようなヌクレオシド三リ
ン酸を包含させることができる。キットにはさらに、ポ
リヌクレオシドポリメラー、ならびにまた、第一および
第二の配列を共有結合で付着させる手段たとえばリガー
ゼ、およびシグナル生成系の構成要素を包含させること
ができる。

キット中での各種試薬の相対量は、本方法の実施時に
進行させる必要がある反応を実質的に至適にする、また
さらに本検定の感度を実質的に至適するような試薬濃度
を提供するため、広範囲に変動させることができる。適
当な環境下では、キット中の１種または２種以上の試薬
は、賦形剤を含んだ乾燥粉末、通常は凍結乾燥粉末とし
て、これを溶解すると本発明による方法または検定の実
施に適当な濃度の試薬溶液が得られる形で提供すること
ができる。各試薬は、それらの反応性と所望の貯蔵寿命
を考慮して、別個の容器中に包装することもできるし、
また一部の試薬をひとつの容器中に混合することもでき
る。

例 本発明をさらに、以下の例示的実施例によって説明す
る。

例１ 隣接第一および第二相補性配列をもつ一本鎖ポリヌクレ
オチド（オリゴマー１）の単一プライマーポリヌクレオ
チド増幅 オリゴデオキシリボヌクレオチド配列1,2,3,4,5,6,7,
8および9: をリン酸アミダイト法で合成し、変性ポリアクリルアミ
ドゲル上で精製した。100マーオリゴマー１の27の５′
終末塩基および27の３′終末塩基は自己相補性であり、
したがってこの分子は「ヘアピン」またはステムールー
プ構造を形成する。オリゴマー２および４はそれぞれ、
オリゴマー１の５′の50塩基および３′の50個の塩基で
ある。オリゴマー５はオリゴマー１および４の３′末端
25塩基と相補性である。オリゴマー６（７）はオリゴマ
ー１の中央23（22）塩基にハイブリダイズするが、オリ
ゴマー７は一塩基欠失がある（チミジン残基）。オリゴ
マー８および９は相補性である。オリゴマー８はオリゴ
マー１の塩基50から74までと同一である。

ポリヌクレオチドプライマーとしてオリゴマー５を用
いるオリゴマー１のDNA増幅のプロトコールを記述す
る。このプロトコールの変法は以後の例に述べる。１ピ
コモル（1pmole）のオリゴマー１と60pmolのオリゴマー
５を、50mM Tris−HCl（pH8.4、25℃）、50mM KCl、
2.5mM MgCl₂、0.2mg/mlゼラチンの緩衝液中、各dNTP10
ナノモル（mmole）と混合する。最終容量50μに対し
てTaqポリメラーゼ酵素５単位を加える。94℃（１
分）、37℃（２分）および72℃（３分）のサイクリング
を、プログラム可能な熱サイクラー（Ericomp,Inc.）を
用い、３つの温度を通して多数サイクル実施する。これ
らの反応液の一部を様々な段階で採取し、Gene Screen
Plus ナイロン膜（Du Pont）上、製造業者の推薦プロ
トコールを用いてドット−ブロットする。

乾燥した膜を、0.75M NaCl、0.15M Tris−HCl（pH
8.0）、10mM EDTA、５×デンハルト溶液（1g Ficoll,
1gポリビニルピロリドン、1gBSAを総容量1000mlの水中
に含む）、20mMリン酸ナトリウム、250mg/ml剪断変性ウ
シ胸腺DNAおよび0.5％SDS中、65℃で３時間プレハイブ
リダイズする。増幅オリゴマー１の形成を検定するため
には、³²P5′末端標識オリゴデオキシヌクレオチドプロ
ーブ（約10⁷DPM、100〜1000Ci/m mole）を新たなプレハ
イブリダイゼーション溶液とともに加え、一夜穏かに60
℃で攪拌しながら一夜ハイブリダイズする。ハイブリダ
イズした膜は、通常、0.3M NaCl、0.06M Tris−HCl
（pH8.0）、4mM EDTAおよび0.5％SDSの緩衝液中、60℃
で30分間、１回緩衝液を交換して洗浄する。洗浄した膜
をKodak Ｘ−Omat ARフィルムに、様々な時間の長
さ、場合によっては単一の強化スクリーン（DuPont Cro
nex Lightning−Plus）を用いて露出する。

第１図は、60pmoleのポリヌクレオチドプライマー、
オリゴマー５の存在下における1pmoleのオリゴマー１の
増幅の結果を示す。この場合のプローブはオリゴマー５
で、標準（レーンA,1〜10）は様々な量のオリゴマー１
である。オリゴマー５を増幅反応から除くと検出可能な
ハイブリダイゼーションは起こらない。オリゴマー１を
加えないと、少量のオリゴマー５の増幅が検出される。

このブロットを室温で10分間、0.4N NaOH中において
洗浄し、1M Tris−HCl（pH7.5）、0.3M NaCl、4mM E
DTA中で中和することによって放射性プローブを取除い
た。膜をついで５′−³²P標識オリゴマー９にハイブリ
ダイズした（第２図参照）。この場合、増幅はオリゴマ
ー１および５の両者を含む反応中に検出され、１または
５の一方を別個に含む反応中には検出されない。

例２ Neisseria gonorrhoeaeからのクローン化 DNAの単一プライマーポリヌクレオチド増幅 オリゴヌクレオチド配列1,2,3,4,5: オリゴマー１はN.gonorroeae（N.g.）ゲノムクローンか
らの二本鎖Rsa I制限フラグメントの一本鎖である。全
クローン化DNA挿入体はN.g.124株（米国、アトランタ、
C.D.C（センター フォー ディジーズ コントロー
ル）から得た）に由来する７キロベース（Kb）Sau 3A
I制限フラグメントである。この7KbフラグメントをProm
ega BiotechからのBamH I線状化ベクターpGEM 3Zf
（＋）に挿入した。

オリゴマー１の３′末端20塩基はオリゴマー２の塩基
番号80〜99にハイブリダイズする（反応式5,A）。これ
が、Taqポリメラーゼによって触媒されて、オリゴマー
１の３′末端からオリゴマー２を鋳型としたDNA重合の
ための開始基質を形成する。この重合の185塩基長生成
物は、熱変性によって一本鎖にした場合、その３′末端
20塩基でオリゴマー４と塩基対を形成する（反応式5,
B）。これはTaqポリメラーゼに対する基質で、プライム
された185塩基鋳型上で重合し、185塩基の相補鎖生成物
を形成する。

上述の重合の変性生成物は３′末端に20個の塩基を有
し、これはオリゴマー３にヌクレオチド62〜81でハイブ
リダイズし、したがって、Taqポリメラーゼがオリゴマ
ー３鋳型上に61塩基を延長する基質である。生成物を熱
変性すると、反応式５における246塩基長のポリヌクレ
オチド６が生成する。

ポリヌクレオチド６は、５′および３′末端における
相補性配列の20塩基対のステムで、ステム−ループ構造
を形成する。したがって、６の補体もステム−ループ構
造を形成する。６とその補体の両者はその各３′末端
で、プライマー、オリゴマー４にハイブリダイズし、Ta
qポリメラーゼに対する基質を与え、その際、例１に記
載した型の単一プライマーポリヌクレオチド増幅が可能
になる。要約すると、オリゴマー１の存在が、プライム
された鋳型のポリメラーゼ延長と熱変性の交替によって
オリゴマー２および３と相補性の配列の連結を可能に
し、ポリヌクレオチド６を形成する。

以下の実験はこの方法の例である。以下の成分を含有
する５種の検定を実施した。

10倍（10×）緩衝液は、0.1M Tris−HCl、pH8.4（25
℃）、0.5M KCl、60mM MgCl₂、2mg/mlゼラチンであ
る。検定の最終容量は100μとした。Taqポリメラーゼ
を除く全成分はエッベンドルフ管添加し、50μの鉱油
で覆って95℃に３分間加熱した。管を徐々に、30分を要
して50℃未満に冷却した。次に５単位のTaqポリメラー
ゼを加えて、熱サイクリングをEricomp熱ブロック中で
開始した。すなわち、94℃30秒、50℃30秒、72℃２分
で、この３温度基準（１サイクル）を反復した。５種の
検定の10μのサンプルを20,40およびサイクルで採取
し、凍結した。

凍結サンプル５μを解凍し、Genescreen Plus ナ
イロン膜（DuPont）上、製造業者の推薦プロトコールを
用い、ドットブロッティングによって分析した。ブロッ
トを例１に記載したと同様に処理した。³²P−キナーゼ
標識プローブオリゴマー５（100〜1000Ci/mmole、約10⁷
dpm）を用いてドットブロットにハイブリダイズした。
オリゴマー５は標的オリゴマー１の塩基38〜62と同一で
ある。

第３図のブロットは、60温度サイクルまでに、標的DN
A含有検定液はすべて、プローブにハイブリダイゼーシ
ョン可能なDNA25fmole/5μ以上を示した。ドットブロ
ット5Eにおいては、５×10^-18moleのハイブリダイゼー
ション可能配列が＞25×10^-15moleのハイブリダイゼー
ション可能配列に増幅したこと、すなわち約５×10³倍
の増幅を示している。

【図面の簡単な説明】

第１図は、単一プライマーポリヌクレオチド増幅生成物
への³²Pオリゴマー５のドットブロットハイブリダイゼ
ーションを示す。 Ａ列、レーン１〜10はオリゴマー^＃1,1.8,0.9,0.454,0.
18,0.09,0.045,0.018,0.009,0.0045,0.0018n moleの標
準、Ａ列、レーン11は剪断、変性ウシ胸腺DNA1μｇの陰
性対照、Ｂ列、レーン７〜11は、60pmoleのオリゴマー
５を含有するがオリゴマー１は含まない増幅反応での1
0,20,30,40および50温度サイクル時のサンプル５μの
結果である。オリゴマー５、プローブに、50サイクルか
ら生成物のハイブリダイゼーションを認める。Ｃ列レー
ン１〜５は、オリゴマー１のみ（1pmole）を含有する1
0,20,30,40および50サイクル時のサンプル５μの結果
である。検出可能な増幅生成物は認められない。Ｃ列、
レーン７〜11はオリゴマー１および５の両者を含有する
場合の10,20,30,40および50サイクル時のサンプル５μ
についての結果である。2,000倍を越える増幅が認め
られる（1pmoleが＞1.8nmoleに）。 第２図は、単一プライマーポリヌクレオチド増幅生成物
への³²Pオリゴマー９のドットブロットハイブリダイゼ
ーションを示す。 第１図におけるブロットをハイブリダイズした³²Pオリ
ゴマー５から取除き、³²Pオリゴマー９プローブにハイ
ブリダイズした。結果は第１図の場合とほぼ同様である
が、Ｂ列レーン７〜11におけるハイブリダイゼーション
はこのプローブでは検出できない。 第３図は検定１〜５の増幅生成物への³²Pオリゴマー５
のドットブロットハイブリダイゼーションを示す。 Ａ列、レーン１〜4:25,2.5,0.25および0.025fmoleのN.g
onorrhoeaeゲノムクローンの標準;C列、レーン１〜5:検
定１〜５それぞれの20温度サイクル時の５μサンプ
ル;D列、レーン１〜5:検定１〜５それぞれの40温度サイ
クル時の５μサンプル、Ｅ列、レーン１〜5:検定１〜
５それぞれの60温度サイクル時の５μサンプルの結果
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 トーマス シー．グッドマン アメリカ合衆国カリフォルニア州 マウ ンティン ビュー，ウイットニイ ドラ イブ 2435 (72)発明者 リンダ エム．ウェスタン アメリカ合衆国カリフォルニア州 マウ ンティン ビュー，ナンバー18，ライト アベニュー 1725 (72)発明者 マーチン ベッカー アメリカ合衆国カリフォルニア州 パロ アルト，グリアー ロード 3481 (72)発明者 エドウィン エフ．フルマン アメリカ合衆国カリフォルニア州 アサ ートン，セルビイ レーン 135 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (22)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】一本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも１個
   のコピーを生成させるにあたり、 （ａ）ヌクレオシド三リン酸および鋳型依存性ポリヌク
   レオチドポリメラーゼの存在下に一本鎖ポリヌクレオチ
   ドに沿って、少なくともその３′末端には上記一本鎖ポ
   リヌクレオチドの３′末端に連結した第二の隣接配列と
   ハイブリダイゼーション可能な少なくとも10塩基配列を
   有するポリヌクレオチドプライマーの延長を形成させ、
   この場合上記第二の隣接配列は上記一本鎖ポリヌクレオ
   チドの５′末端の連結した少なくとも10塩基の第一の隣
   接配列と少なくとも部分的に相補性であり、 （ｂ）上述の延長されたポリヌクレオチドプライマーと
   上記一本鎖ポリヌクレオチドを解離させ、 （ｃ）工程（ａ）を反復することを特徴とする方法。
2. 【請求項２】ポリヌクレオチドプライマーの３′末端の
   最後の10個のヌクレオチドは第二の隣接配列と同じ配列
   である請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】工程（ａ）の反復後に形成された生成物は
   逆方向反復配列を含有する請求項１または２のいずれか
   一つに記載の方法。
4. 【請求項４】ポリヌクレオチドプライマーのハイブリダ
   イゼーション可能配列の長さは15〜100ヌクレオチドで
   ある請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
5. 【請求項５】鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼ
   はDNAポリメラーゼであり、ヌクレオシド三リン酸はdAT
   P、dGTP、dCTPおよびdTTPである請求項１〜４のいずれ
   か一つに記載の方法。
6. 【請求項６】ポリヌクレオチド配列の多数のコピーを生
   成させるにあたり、 （ａ）（ｉ）上記ポリヌクレオチド配列を有し、各末端
   には少なくとも部分的に相補性の第一および第二の隣接
   配列が隣接している一本鎖ポリヌクレオチド、（ii）そ
   の３′末端における少なくとも10塩基部分は上記第一お
   よび第二隣接配列の構成要素すなわち上記一本鎖ポリヌ
   クレオチドの３′末端とハイブリダイゼーション可能で
   あるポリヌクレオチドプライマー、（iii）ヌクレオシ
   ド三リン酸、（iv）鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメ
   ラーゼの配合物を準備し、 （ｂ）上記配合物を完全にまたは部分的に、順次または
   同時に（ｉ）上記一本鎖ポリヌクレオチドを相補性配列
   から解離させ、（ii）この一本鎖ポリヌクレオチドの
   ３′末端における隣接配列をポリヌクレオチドプライマ
   ーとハイブリダイズさせ、（iii）このポリヌクレオチ
   ドプライマーを一本鎖ポリヌクレオチドに沿って延長さ
   せて第一の延長されたポリヌクレオチドプライマーを与
   え、（iv）第一の延長されたポリヌクレオチドプライマ
   ーと一本鎖ポリヌクレオチドを解離させ、（ｖ）第一の
   延長されたポリヌクレオチドプライマーを上記ポリヌク
   レオチドプライマーとハイブリダイズさせ、（vi）この
   ポリヌクレオチドプライマーを第一の延長されたポリヌ
   クレオチドプライマーに沿って延長させて第二の延長さ
   れたポリヌクレオチドプライマーを与え、（vii）第二
   の延長されたポリヌクレオチドプライマーを第一の延長
   されたポリヌクレオチドプライマーから解離させ、（vi
   ii）上記工程（ｖ）〜（vii）を反復させる条件下にイ
   ンキュベートする請求項１〜５のいずれか一つの記載の
   方法。
7. 【請求項７】第一および第二の配列は相補性である請求
   項６記載の方法。
8. 【請求項８】ポリヌクレオチド分析対象の含有が疑われ
   るサンプル中の上記分析対象の存在を決定するにあた
   り、 （ａ）上記サンプルを、上記分析対象に沿ってヌクレオ
   シド三リン酸および鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメ
   ラーゼの存在下で、第一および第二のポリヌクレオチド
   プローブと接触させ、この場合、第一のプローブはその
   ３′末端に、上記分析対象の一本鎖の第一の部位に相補
   的な配列および第一の隣接配列を含み、第二のプローブ
   はその５′末端に、上記分析対象の同じ鎖の第一の部位
   の上流にある第二の部位に相補的な配列および第二の隣
   接配列を含み、第一および第二の隣接配列はお互いに少
   なくとも50〜65％の相補性であり、第一および第二のプ
   ローブが上記分析対象と結合する条件下であることを特
   徴とし、ついで 第一および第二のポリヌクレオチドプローブを、上記分
   析対象に結合したときのみ、お互いにライゲートするた
   めの条件を提供し、 一本鎖ポリヌクレオチドを解離することによって、上記
   分析対象の存在の結果として、相補性の第一および第二
   の隣接配列によって隣接された一本鎖ポリヌクレオチド
   を形成させ、 （ｂ）上記一本鎖ポリヌクレオチドおよび上記隣接配列
   の多数のコピーを形成させ、 （ｃ）上記一本鎖ポリヌクレオチドを検出する各工程か
   らなる方法。
9. 【請求項９】第一および第二隣接配列は、少なくとも10
   塩基の相補性配列である請求項８記載の方法。
10. 【請求項１０】ポリヌクレオチド分析対象の含有が疑わ
    れるサンプル中の上記分析対象の存在を決定するにあた
    り、 （ａ）上記サンプルを、上記分析対象に沿ったヌクレオ
    シド三リン酸および鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメ
    ラーゼの存在下で、第一および第二のポリヌクレオチド
    プローブと接触させ、この場合、第一のプローブはその
    ３′末端に、上記分析対象の一本鎖の第一の部位に相補
    的な配列および第一の隣接配列を含み、第二のプローブ
    はその５′末端に、上記分析対象の同じ鎖の第一の部位
    の上流にある第二の部位に相補的な配列および第二の隣
    接配列を含み、第一および第二の隣接配列はそれぞれ少
    なくとも15個の塩基を有し、お互いに少なくとも80％の
    相補性であり、第一および第二のプローブが上記分析対
    象と結合する条件下であることを特徴とし、ついで 第一および第二のポリヌクレオチドプローブを、上記分
    析対象に結合したときのみ、お互いにライゲートするた
    めの条件を提供し、 一本鎖ポリヌクレオチドを解離することによって、上記
    分析対象の存在の結果として、それぞれ少なくとも15個
    の塩基を有し少なくと80％相補性の第一および第二隣接
    配列によって隣接された一本鎖ポリヌクレオチドを形成
    させ、 （ｂ）ヌクレオシド三リン酸および鋳型依存性ポリヌク
    レオチドポリメラーゼの存在下に、少なくともその３′
    末端で上記一本鎖ポリヌクレオチド配列の３′末端にお
    ける隣接配列とハイブリダイゼーション可能なポリヌク
    レオチドプライマーの延長を形成させ、 この場合、工程（ａ）および（ｂ）は完全にまたは部分
    的に、順次または同時に行うものとし、ついで、 （ｃ）上記ポリヌクレオチド配列と同一および／または
    相補性の配列を含有する延長されたポリヌクレオチドプ
    ライマーを検出する各工程からなる請求項８または９の
    いずれか一つの方法。
11. 【請求項１１】ポリヌクレオチドプライマーの一部は第
    一のレポーター基で標識され、また一部は第二のレポー
    ター基で標識されている請求項10記載の方法。
12. 【請求項１２】ポリヌクレオチド分析対象の含有が疑わ
    れるサンプル中の上記分析対象の存在を決定するにあた
    り、 （ａ）上記サンプルを、上記分析対象の一方の鎖の第一
    の部分に対しその３′末端で相補性の標的ポリヌクレオ
    チド結合配列と第一の隣接配列からなる第一のポリヌク
    レオチドプローブおよび上記分析対象の同じ鎖の第二の
    部分に対しその５′末端で相補性の標的ポリヌクレオチ
    ド結合配列と第二の隣接配列からなる第二のポリヌクレ
    オチドプローブであって、上記第一および第二隣接配列
    は少なくとも65％の相補性を有する両プローブと、第一
    および第二のプローブが上記分析対象と結合する条件下
    に接触させ、 （ｂ）上記第一および第二のポリヌクレオチドプローブ
    が上記分析対象に結合した場合にのみ互いに連結するよ
    うな条件を与え、 （ｃ）ヌクレオシド三リン酸および鋳型依存性ポリヌク
    レオチドメラーゼの存在下に、少なくともその３′末端
    は上記第二の隣接配列とハイブリダイゼーション可能な
    ポリヌクレオチドプライマーの延長を形成させ、 （ｄ）上記第一のプローブと相補性の配列を含有する延
    長されたポリヌクレオチドプライマーを検出することか
    らなる請求項８〜11のいずれか一つに記載の方法。
13. 【請求項１３】ポリヌクレオチドプライマーは、蛍光
    体、化学発光体、触媒、補酵素、放射性物質、増幅可能
    なポリヌクレオチド配列および小有機分子からなる群よ
    り選ばれるレポーター基で標識されている請求項12記載
    の方法。
14. 【請求項１４】第一および第二のポリヌクレオチドプロ
    ーブは分析対象とハイブリダイズした場合少なくともヌ
    クレオチド１個離れていて、第一および第二のポリヌク
    レオチドプローブの連結条件には、 （ａ）ハイブリダイズ部分を連続的にするためのヌクレ
    オシド三リン酸およびポリヌクレオチドポリメラーゼの
    添加、および （ｂ）上記ハイブリダイズ部分を連結されるためのリガ
    ーゼの添加を包含する請求項12または13のいずれか一つ
    に記載の方法。
15. 【請求項１５】ポリヌクレオチド分析対象の含有が疑わ
    れるサンプル中の上記分析対象の存在を検出するにあた
    り、 （ａ）ポリヌクレオチドプローブの第三および第四配列
    を連結させ、この場合、上記第三の配列は遊離３′末端
    を、上記第四の配列は遊離５′末端を有し、それぞれが
    上記分析対象の別個の部分にハイブリダイゼーション可
    能でまた上記分析対象の存在下にのみ連結可能であるか
    もしくは連結可能になることができ、さらに上記ポリヌ
    クレオチドプローブは少なくとも部分的に相補性の第一
    および第二隣接配列からなり、この第一配列は上記第三
    配列の５′であり、第二配列は第一配列の５′であり、
    第四配列は第二配列の５′であり、 （ｂ）ヌクレオシド三リン酸および鋳型依存性ポリヌク
    レオチドポリメラーゼの存在下、少なくともその３′末
    端で上記ポリヌクレオチドプローブの第一の隣接配列と
    ハイブリダイゼーション可能なポリヌクレオチドプライ
    マーの延長を形させ、 この場合、工程（ａ）と（ｂ）は完全にまたは部分的
    に、順次または同時に実施し、 延長したポリヌクレオチドプライマーおよび／または上
    記分析対象の上記別個の部分に相補性の連結した第三も
    しくは第四配列の少なくとも部分と同一および／もしく
    はそれと相補性の配列を検出する各工程からなる請求項
    ８記載の方法。
16. 【請求項１６】プローブはオペレーター配列を含有する
    請求項15記載の方法。
17. 【請求項１７】ポリヌクレオチド分析対象の含有が疑わ
    れるサンプル中の上記分析対象の存在を検出するにあた
    り、 （ａ）検定メジウム中でサンプルを第一および第二ポリ
    ヌクレオチドプローブと混合し、この場合、第一のプロ
    ーブは第二のプローブ中の第二の隣接配列と少なくとも
    部分的に相補性で、その３′末端において上記分析対象
    の一方の鎖の第一部分とハイブリダイゼーション可能な
    配列と結合する第一の隣接配列からなり、一方、第二の
    隣接配列は上記分析対象の同一の鎖の第二部分とハイブ
    リダイゼーション可能な配列とその５′末端において結
    合していて、 （ｂ）上記検定メジウムを、第一および第二のプローブ
    が分析対象と結合する条件下にインキュベートし、この
    場合、第一および第二のプローブは上記分析対象と結合
    した場合にのみ互いに連結可能であるかまたは連結可能
    になることができ、 （ｃ）第一および第二のプローブを、両者がそうしない
    と連結可能でない場合は必要に応じて第一および第二の
    プローブを連結可能にしたのち連結させ、 （ｄ）上記検定メジウムを、第二のプローブ中の第二の
    隣接配列と相補性の３′末端配列を有するポリヌクレオ
    チドプライマーと混合し、 （ｅ）この検定メジウムを、完全にまたは部分的に、順
    次または同時に（ｉ）連結した第一および第二プローブ
    の内部ハイブリダイゼーションがあればこれを解離さ
    せ、（ii）上記ポリヌクレオチドプライマーを連結した
    第一および第二プローブとハイブリダイズさせ、（ii
    i）このポリヌクレオチドプライマーを連結した第一お
    よび第二プローブに沿って延長させ、（iv）延長させた
    ポリヌクレオチドプライマーと連結した第一および第二
    のプローブのハイブリダイゼーションを解離させ、
    （ｖ）延長されたポリヌクレオチドプライマーを上記ポ
    リヌクレオチドプライマーとハイブリダイズさせ、（v
    i）このポリヌクレオチドプライマーを上記延長された
    ポリヌクレオチドプライマーに沿って延長させ、 （vii）延長されたプライマーのハイブリダイゼーショ
    ンを解離させ、そして（viii）上記工程（ｖ）〜（vi
    i）を反復させる条件下にインキュベートし、 この場合、工程（ａ）〜（ｄ）は完全にまたは部分的
    に、順次または同時に実施したのち工程（ｅ）を行い、
    ついで （ｆ）上記延長されたプライマーを検出する請求項８記
    載の方法。
18. 【請求項１８】ポリヌクレオチドプライマーの別個の分
    子は、表面に結合できるようになる基で標識されている
    請求項17記載の方法。
19. 【請求項１９】ポリヌクレオチドプライマーの連結した
    第一および第二プローブに沿った延長ではオベレーター
    の少なくとも一部が形成され、検出には （ａ）固体支持体に結合したリプレッサーの添加および （ｂ）第一のポリヌクレオチドプローブ中の配列と同一
    または相補性である、上記固体支持体に結合した配列の
    検出が包含される請求項17または18のいずれか一つに記
    載の方法。
20. 【請求項２０】ポリヌクレオチド分析対象の含有が疑わ
    れるサンプル中の上記分析対象の存在を決定するにあた
    り、 （ａ）上記サンプルを第一および第二のポリヌクレオチ
    ドプローブと接触させ、この場合、第一のプローブは
    （ｉ）第二のプローブ中の第二の隣接配列と相補性の第
    一の隣接配列および（ii）第二のプローブと相補性の部
    分以外の上記分析対象の部分と相補性の配列からなり、
    接触は上記第一および第二のプローブが上記分析対象に
    結合する条件下に行い、第一および第二のプローブは上
    記分析対象に結合した場合にのみ互いに連結可能である
    かまたは連結可能になることができ、 （ｂ）ヌクレオシド三リン酸および鋳型依存性ポリヌク
    レオチドポリメラーゼの存在下、少なくともその部分が
    上記第一または第二のプローブとハイブリダイズするポ
    リヌクレオチドプライマーの延長を形成させ、 この場合、工程（ａ）および（ｂ）は完全にまたは部分
    的に、順次または同時に実施し、ついで 上記延長されたポリヌクレオチドプライマーおよび／ま
    たは連結した第一および第二のポリヌクレオチドプロー
    ブを検出する請求項８記載の方法。
21. 【請求項２１】ポリヌクレオチド分析対象の定量に使用
    するキットであって、 上記ポリヌクレオチド分析対象の第一の部分にハイブリ
    ダイゼーション可能な第一のヌクレオチド配列をその
    ３′末端に有する第一のポリヌクレオチドプローブ、 上記ポリヌクレオチド分析対象の同じ鎖の上記第一のポ
    リヌクレオチドプローブの上記第一のヌクレオチド配列
    によって認識される部分以外の上記第一の部分の上流に
    位置する第二の部分にハイブリダイゼーション可能な第
    二のヌクレオチド配列をその５′末端に有する第二のポ
    リヌクレオチドプローブ、 上記第一および第二のポリヌクレオチドプローブが上記
    ポリヌクレオチド分析対象とハイブリダイズした場合こ
    の第一および第二のポリヌクレオチド配列を共有結合さ
    せる手段、ならびに 上記第二のポリヌクレオチドプローブとハイブリダイゼ
    ーション可能で上記の共有結合したプローブに沿って上
    記第一のポリヌクレオチドプローブの方向に延長される
    ポリヌクレオチドプライマー を組合せて包装した上記キット。
22. 【請求項２２】ポリヌクレオチド分析対象の含有が疑わ
    れるサンプル中の上記分析対象の存在を決定する請求項
    ８記載の方法において、請求項８の工程（ａ）として、 （ｉ）ヌクレオシド三リン酸および鋳型依存性ポリヌク
    レオチドポリメラーゼの存在下の第一の本鎖ポリヌクレ
    オチドに沿って上記分析対象またはそのフラグメントの
    延長を形成させ（延長されたポリヌクレオチド分析対
    象）、二本鎖ポリヌクレオチド１をつくり、 （ii）一本鎖の延長されたポリヌクレオチド分析対象を
    上記ポリヌクレオチド１から解離させ、 （iii）ヌクレオシド三リン酸および鋳型依存性ポリヌ
    クレオチドポリメラーゼの存在下に上記一本鎖の延長さ
    れたポリヌクレオチド分析対象に沿って、少なくともそ
    の３′末端に上記一本鎖の延長されたポリヌクレオチド
    分析対象の少なくとも１部とハイブリダイゼーション可
    能な少なくとも10塩基の配列を有する第一のポリヌクレ
    オチドプライマーの延長を形成させ、二本鎖ポリヌクレ
    オチド２をつくり、 （iv）上記ポリヌクレオチド２から一本鎖の延長された
    第一のポリヌクレオチドプライマーを解離させ、 （ｖ）ヌクレオシド三リン酸および鋳型依存性ポリヌク
    レオチドポリメラーゼの存在下に第二のポリヌクレオチ
    ドプライマーに沿って上記一本鎖の延長された第一のポ
    リヌクレオチドプライマーの延長を形成させ、この場
    合、少なくとも上記第二のポリヌクレオチドプライマー
    の３′末端は上記一本鎖の延長された第一のポリヌクレ
    オチドプライマーの少なくとも１部のハイブリダイゼー
    ション可能な少なくとも10塩基の配列を有し、二本鎖ポ
    リヌクレオチド３をつくり、この場合、一本鎖の２回延
    長された第一のポリヌクレオチドプライマーの３′末端
    および５′末端は各々少なくとも部分的に相補性の10塩
    基の配列を有し、そして （vi）上記ポリヌクレオチド３から上記一本鎖の２回延
    長された第一のポリヌクレオチドプライマーを解離さ
    せ：そして 請求項８の工程（ｂ）として、 （ｉ）ヌクレオシド三リン酸および鋳型依存性ポリヌク
    レオチドポリメラーゼの存在下に上記一本鎖の２回延長
    された第一のポリヌクレオチドプライマーに沿って上記
    第一のポリヌクレオチドプライマーの延長を形成させ、
    二本鎖ポリヌクレオチド４をつくり、 （ii）ポリヌクレオチド４から一本鎖の延長された第一
    のポリヌクレオチドプライマーを解離させ、そして （iii）工程（ｉ）を反復させる各工程からなる請求項
    ８記載の方法。