ES2911684T3 - Diseño de novo de proteínas alostéricas - Google Patents

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Abstract

Método de preparación y aislamiento de proteínas de unión a ADN alostéricas que se unen a un efector alostérico acompañante que induce un cambio de conformación que comprende: diseñar computacionalmente in silico proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas que presentan un bolsillo de unión para un efector alostérico acompañante, proporcionar unas secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas, introducir las secuencias de ácido nucleico en células hospedadoras bacterianas y expresar las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas, determinar si las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas se unen al ADN e inhiben la expresión de un gen utilizando una selección negativa para identificar una primera pluralidad de células hospedadoras bacterianas en la que las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas se han unido al ADN e inhiben la expresión del gen, y determinar si las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas en la primera pluralidad de células hospedadoras bacterianas se unen al efector alostérico acompañante utilizando un cribado positivo para identificar una segunda pluralidad de células hospedadoras bacterianas en la que las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas se han unido al efector alostérico acompañante, en el que el cribado positivo incluye detectar un marcador detectable que se expresa en la primera pluralidad de células bacterianas cuando las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas se han unido al efector alostérico acompañante para expresar el gen.

Description

DESCRIPCIÓN
Diseño de novo de proteínas alostéricas
Campo
La presente invención se refiere a métodos para diseñar proteínas alostéricas nuevas.
Antecedentes
En el diseño racional de proteínas, se utiliza un conocimiento detallado de la estructura y función de una proteína de interés para diseñar por ingeniería genética una forma mutante de la proteína. Sin embargo, los métodos de mutagénesis racionales generalmente no son satisfactorios debido al hecho de que interacciones complejas y no intuitivas determinan a menudo la estructura y función de las proteínas. Por lo tanto, es deseable desarrollar métodos y composiciones nuevos para el diseño por ingeniería genética de proteínas.
Sumario
En la presente memoria se proporcionan métodos y composiciones para diseñar proteínas alostéricas que responden a una molécula pequeña diana o efector alostérico uniéndose a la molécula pequeña diana o efector alostérico y experimentando un cambio conformacional posterior. En ciertos aspectos, los métodos y las composiciones descritos en la presente memoria pueden utilizarse para diseñar proteínas sensoras útiles para modificar por ingeniería genética rutas de biosíntesis que son útiles, por ejemplo, para la producción de moléculas basada en fermentación. En otros aspectos, los métodos y las composiciones descritos en la presente memoria pueden utilizarse para diseñar sistemas de expresión génica inducibles y ortogonales para su utilización en cultivos de células de mamífero, lo que es un avance significativo con respecto a métodos tales como el sistema Tet-On utilizado actualmente por los expertos en la materia. En todavía otros aspectos, los métodos y las composiciones descritos en la presente memoria pueden utilizarse asimismo para diseñar sistemas de expresión génica inducibles útiles, por ejemplo, para fermentación a gran escala, lo que es un avance significativo con respecto a métodos tales como los sistemas basados en IPTG utilizados actualmente por los expertos en la materia.
La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos expuestos en la presente memoria son proporcionados únicamente a título informativo.
En la presente memoria se proporciona un método de preparación y aislamiento de proteínas de unión a ADN alostéricas que se unen a un efector alostérico acompañante que induce un cambio de conformación en las proteínas de unión a ADN alostéricas.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “proteína alostérica” se refiere a una proteína que se une a una molécula efectora y experimenta un cambio conformacional, provocando un aumento o una disminución en una o más actividades de la proteína. Una proteína alostérica de la presente invención puede ser un sensor y/o parte de un sistema de expresión génica inducible (por ejemplo, un sistema de expresión génica ortogonal). (Ver Liang et al. (2013) Biotech. and Bioeng. 110:1419 para una revisión). Los expertos en la materia conocen bien las proteínas alostéricas e incluyen factores de transcripción, ribointerruptores, proteínas de señalización de dos componentes, receptores de hormonas nucleares y similares.
Tal como se utiliza en la presente memoria, una “molécula efectora” se refiere a una molécula, por ejemplo, una molécula pequeña, que se une selectivamente a una proteína alostérica y regula su actividad biológica. De esta manera, las moléculas efectoras actúan como ligandos aumentando o disminuyendo una o más de las actividades incluyendo, pero sin limitarse a, actividad enzimática, expresión génica, señalización celular y similares. En ciertos aspectos, una molécula efectora aumenta la actividad de una proteína alostérica, es decir, la molécula efectora funciona como “activador alostérico”. En otros aspectos, una molécula efectora disminuye la actividad de una proteína alostérica, es decir, la molécula efectora funciona como “inhibidor alostérico”.
Según la invención, se diseñan computacionalmente in silico proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas que presentan un bolsillo de unión para un efector alostérico acompañante deseado. Se proporcionan secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas, y posteriormente se introducen en células hospedadoras bacterianas y que expresan las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas.
Según la invención, se determina si las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas se unen al ADN e inhiben la expresión de un gen utilizando selección negativa para identificar una primera pluralidad de microorganismos (por ejemplo, células hospedadoras bacterianas (por ejemplo, Escherichia coli o Bacillus subtilis)) donde las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas se han unido al ADN e inhiben la expresión del gen. Si las proteínas de unión a ADN se unen al ADN e inhiben la expresión de un gen, los microorganismos (por ejemplo, células hospedadoras bacterianas) sobrevivirán. Las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas que no se unen al ADN activan la expresión del gen haciendo que las células hospedadoras bacterianas que portan esa proteína de unión a ADN alostérica mueran.
Se determina además si las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas en la primera pluralidad de células hospedadoras bacterianas se unen al efector alostérico acompañante deseado utilizando selección positiva para identificar una segunda pluralidad de células hospedadoras bacterianas donde las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas se han unido al efector alostérico acompañante. Las proteínas de unión a ADN candidatas agrupadas de la primera pluralidad de células hospedadoras bacterianas se someterá a ensayo para detectar la activación por la molécula efectora alostérica deseada mediante selección positiva. En la selección positiva, solo las células hospedadoras bacterianas que portan proteínas de unión a ADN candidatas que responden a la molécula efectora alostérica deseada sobrevivirán.
Opcionalmente, el genoma del microorganismo se modifica genéticamente para incluir ADN que codifica un antídoto para una toxina. Cuando se expresa, la proteína alostérica regula la producción del antídoto dentro del microorganismo. Dependiendo de la naturaleza de la proteína alostérica, puede regular la producción de antídoto mediante represión en ausencia del efector alostérico, activación en presencia del efector alostérico, oclusión del sitio de unión al ribosoma en ausencia de efector alostérico, etc. Si el microorganismo se coloca en un entorno de la toxina y no se produce antídoto o se produce insuficiente, el microorganismo morirá. El efector alostérico deseado puede proporcionarse de manera exógena.
El microorganismo se coloca opcionalmente en un entorno de una toxina complementaria al antídoto. De esta manera, el antídoto se denomina en la presente memoria “selector” en la medida en que ese antídoto se produce por la célula en respuesta al nivel de efector alostérico presente y en una cantidad suficiente para impedir que la célula muera. El nivel de antídoto, que es proporcional al nivel de efector alostérico, selecciona cepas que contienen proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas para su modificación y optimización adicionales.
En ciertos aspectos de la invención, la selección negativa incluye poner en contacto las células hospedadoras bacterianas con una toxina que es tóxica para las células que expresan el gen.
En otros aspectos de la invención, la selección negativa incluye poner en contacto las células hospedadoras bacterianas con una toxina que es tóxica para las células donde las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas no se han unido al ADN para inhibir la expresión del gen.
En ciertos ejemplos, la selección positiva incluye poner en contacto la primera pluralidad de células hospedadoras bacterianas con una toxina y el efector alostérico acompañante, en donde la toxina es tóxica para las células donde no se expresa el gen.
En ciertos ejemplos, la selección positiva incluye poner en contacto la primera pluralidad de células hospedadoras bacterianas con una toxina y dianas efectoras alostéricas, en donde la toxina es tóxica para las células donde el efector alostérico acompañante no se ha unido a las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas de una manera que libere las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas del ADN.
Según la invención, la selección positiva incluye detectar un marcador detectable que se expresa en la primera pluralidad de células bacterianas cuando las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas se han unido al ADN para expresar el gen.
En ciertos aspectos de la invención, el marcador detectable es una proteína fluorescente (por ejemplo, proteína fluorescente verde (GFP)) que puede detectarse, por ejemplo, mediante clasificación de células activadas por fluorescencia.
En ciertos aspectos de la invención, la proteína de unión a ADN alostérica regula la expresión de un indicador fluorescente (tal como GFP), de manera que el indicador fluorescente se expresa cuando la proteína de unión a ADN alostérica se activa por la molécula efectora alostérica.
En ciertos aspectos de la invención, la primera pluralidad de células tras la selección negativa se somete a un cribado adicional por medio de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). En ciertos aspectos de la invención, el cribado positivo comprende evaluar la activación de proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas hacia el efector alostérico deseado, en el que solo las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas que notifican activación por la expresión del indicador fluorescente se clasifican y se recogen por medio de FACS.
En ciertos aspectos de la invención, la selección positiva comprende además detectar un marcador detectable que se expresa en la primera pluralidad de células bacterianas cuando el efector alostérico acompañante no se ha unido a las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas de una manera que libere las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas del ADN.
En un aspecto de la invención, se proporciona un método de preparación y aislamiento de proteínas de unión a ADN alostéricas que se unen a un efector alostérico acompañante que induce un cambio de conformación en las proteínas de unión a ADN alostéricas. El método incluye diseñar computacionalmente in silico proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas que presentan un bolsillo de unión para un efector alostérico acompañante y que proporcionan secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas. El método incluye además introducir las secuencias de ácido nucleico en células hospedadoras de Escherichia coli y expresar las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas.
El método incluye determinar si las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas se unen al ADN e inhiben la expresión de un gen utilizando selección negativa para identificar una primera pluralidad de células hospedadoras de Escherichia coli donde las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas se han unido al ADN e inhiben la expresión del gen.
El método incluye asimismo determinar si las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas en la primera pluralidad de células hospedadoras de Escherichia coli se unen al efector alostérico acompañante utilizando selección positiva (es decir, cribado positivo) para identificar una segunda pluralidad de células hospedadoras de Escherichia coli donde las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas se han unido al efector alostérico acompañante. El cribado positivo incluye detectar un marcador detectable que se expresa en la primera pluralidad de células bacterianas cuando las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas se han unido al efector alostérico acompañante para expresar el gen.
En ciertos aspectos de la invención, las secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas se crean a partir de subsecuencias de ácido nucleico unidas a un sustrato, y se ligan para formar las secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas.
En otros aspectos de la invención, la selección negativa incluye poner en contacto las células hospedadoras bacterianas con una toxina que es tóxica para las células que expresan el gen. En un ejemplo particular, la selección positiva incluye poner en contacto la primera pluralidad de células hospedadoras bacterianas con una toxina y el efector alostérico acompañante, en donde la toxina es tóxica para las células donde no se expresa el gen.
En ciertas formas de realización ejemplificativas, se proporciona un método de preparación y aislamiento de proteínas de unión a ADN alostéricas que se unen a un efector alostérico acompañante que induce un cambio de conformación en las proteínas de unión a ADN alostéricas. El método incluye diseñar computacionalmente in silico proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas que presentan un bolsillo de unión para un efector alostérico acompañante, proporcionar secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas creadas a partir de subsecuencias de ácido nucleico unidas a un sustrato e introducir las secuencias de ácido nucleico en microorganismos y expresar las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas.
El método incluye asimismo determinar si las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas se unen al ADN e inhiben la expresión de un gen utilizando selección negativa para identificar una primera pluralidad de microorganismos donde las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas se han unido al ADN e inhiben la expresión del gen.
El método incluye además determinar si las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas en la primera pluralidad de microorganismos se unen al efector alostérico acompañante utilizando selección positiva (es decir, cribado positivo) para identificar una segunda pluralidad de microorganismos donde las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas se han unido al efector alostérico acompañante. El cribado positivo incluye detectar un marcador detectable que se expresa en la primera pluralidad de células bacterianas cuando las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas se han unido al efector alostérico acompañante para expresar el gen.
En ciertos aspectos de la invención, el sustrato es una micromatriz. En otros aspectos de la invención, una pluralidad de subsecuencias del sustrato se amplifica a partir de secuencias en la micromatriz y se combina para formar las secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas.
En ciertos aspectos de la invención, las secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas se generan al azar (por ejemplo, mediante PCR propensa a errores o PCR combinatoria).
En ciertos aspectos de la invención, las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas se fusionan a un gen antitoxina que requiere que el marco de lectura de la proteína permanezca intacto para su función. Las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas en las que el marco de lectura no está intacto no permiten la expresión de la proteína antitoxina, y las células hospedadoras que las portan pueden eliminarse exponiendo las células a la toxina.
Breve descripción de los dibujos
El expediente de patente o solicitud contiene dibujos realizados a color. La oficina proporcionará copias de esta publicación de patente o solicitud de patente con los dibujos a color previa solicitud y pago de la tasa necesaria.
Lo anterior y otras características y ventajas de la presente invención se pondrán más claramente de manifiesto a partir de la siguiente descripción detallada de formas de realización ilustrativas consideradas junto con los dibujos adjuntos en los que:
La figura 1 representa esquemáticamente un método ejemplificativo para el diseño de novo de proteínas alostéricas. El método combina etapas in silico, in vitro e in vivo para diseñar por ingeniería genética proteínas alostéricas nuevas que presentan alta afinidad de unión y alosterismo.
La figura 2 representa esquemáticamente un método de construcción de una biblioteca de rediseño de sensores según determinadas formas de realización de la invención.
Descripción detallada
Las formas de realización de la presente invención proporcionan métodos nuevos para el diseño por ingeniería genética de proteínas. Aunque no se encuentran comprendidas dentro del alcance de la invención, asimismo se proporcionan composiciones en la presente memoria. Un método proporcionado en la presente memoria combina las etapas de diseñar computacionalmente secuencias de proteínas candidatas, sintetizar secuencias de ácido nucleico que codifican las secuencias de proteínas candidatas y utilizar un sistema de selección mediante el cual se realizan cada una de una etapa de selección negativa y una etapa de selección positiva para identificar proteínas candidatas.
Según la invención, se modifica genéticamente un microorganismo para que incluya uno o más ácidos nucleicos exógenos que codifican una proteína alostérica. La secuencia de la proteína alostérica puede identificarse basándose en una búsqueda en la bibliografía publicada. Por ejemplo, se describen completamente rutas de biosíntesis para los efectores y las proteínas alostéricas en las siguientes referencias: cdaR (Monterrubio et al.
2000 J. Bacteriol. 182(9):2672-4), tetR (Lutz y Bujard Nucleic Acids Res. 199725(6): 1203-10), alkS (Canosa et al. Mol. Micriobiol. 2000 35(4):791-9), ttgR (Teran, et al. Antimicrob. Agents Chemother. 47(10):3067-72 (2003)), ribointerruptor btuB (Nahvi, et al. Nucleic Acids Res. 32:143-150 (2004)); ácido glucárico (Moon, et al. Appl. Env. Microbiol. 75:589-595 (2009)), naringenina (Santos, et al. Metabolic Engineering. 13:392-400 (2011)), alcanos (Steen, et al. 463:559-562 (2009)), cobalamina (Raux, et al. Cell Mol. Life Sci. 57:1880-1893. (2000)), ácido mucónico (Niu, et al. Biotechnol Prog. 18:201-211. (2002)). En la tabla 1 se proporciona un listado no exhaustivo de genes sensores adecuados para su utilización según ciertos aspectos de la invención. Los métodos descritos en la presente memoria pueden utilizarse para insertar los ácidos nucleicos en el genoma del microorganismo que son responsables de la producción de proteínas alostéricas.
Tabla 1.
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En ciertas formas de realización ejemplificativas, se proporcionan métodos de selección negativa de un microorganismo que expresa una proteína alostérica mutante que no experimenta un cambio conformacional alostérico y/o que experimenta un cambio conformacional alostérico incorrecto tras la unión al efector. En otras formas de realización ejemplificativas, se proporcionan métodos de selección positiva de un microorganismo que expresa una proteína alostérica mutante que experimenta un cambio conformacional alostérico y/o se une a una molécula efectora.
Según ciertos aspectos de la invención, se modifica genéticamente un microorganismo para que incluya uno o más ácidos nucleicos exógenos que codifican un antídoto para una toxina. Los expertos en la materia conocen pares de antídoto y toxina e incluyen, pero no se limitan a, SDS : tolC, colicina : tolC (selección negativa), kanamicina : kanamicina nucleotidiltransferasa, cloranfenicol : cloranfenicol acil tranferasa, ampicilina : beta lactamasa, tetraciclina : bomba de flujo de salida de tetraciclina tetA, cloruro de níquel: bomba de flujo de salida de tetraciclina tetA (selección negativa), ácido 5-fluoroorótico: URA3 (selección negativa). El microorganismo transformado está destinado a expresar el antídoto en condiciones adecuadas.
Los genes para la producción de cualquier antídoto particular los conocen los expertos en la materia. Por ejemplo, los genes para los antídotos anteriores se describen completamente en tetA (Postle et al. Nucleic Acid Research 1984 12(12)4849-4863), tolC (Fralick J. Bacteriol. 1996 178(19)5803-5805), cloranfenicol acetil tranfersasa (Shaw et al. J. Bacteriol. 1970 104(3): 1095-1105). Pueden utilizarse métodos descritos en la presente memoria para insertar los ácidos nucleicos en el genoma del microorganismo que son responsables de la producción de proteínas de unión a ADN.
Según un aspecto, el microorganismo recombinante transformado expresa la proteína alostérica que regula la producción del antídoto. Cuando se expresa, la proteína alostérica impide que la célula exprese el gen del antídoto, o bien bloqueando la expresión (es decir, un represor) o bien no logrando activar la expresión (es decir, activador), del antídoto a menos que a la proteína alostérica se una el efector alostérico diana, lo que conduce a la expresión del antídoto cambiando la función de la proteína alostérica. Son posibles varios mecanismos de regulación. Para un factor de transcripción alostérico que es un represor, la proteína represora bloquea la transcripción del gen del antídoto uniéndose a una región de ADN 5' con respecto al gen del antídoto a menos que el efector alostérico deseado se una al represor. Para un factor de transcripción alostérico que es un activador, el activador recluta ARN polimerasa a una región de ADN 5' con respecto al gen del antídoto solo cuando el efector alostérico deseado se une al activador. Para una proteína alostérica atenuante, la proteína alostérica se codifica en la región no traducida en 5' de un represor que regula la transcripción del gen del antídoto, y atenúa la traducción de este represor cuando se une al efector alostérico diana. (Ver USSN 61/781.373, presentado el 14 de marzo de 2013).
Según otro aspecto, la proteína alostérica incluye casos en los que el dominio de unión al efector y el dominio de unión al ADN no están en la misma cadena polipeptídica, por ejemplo, un sistema de dos componentes o receptores de hormonas nucleares. Tras la unión al efector, el dominio de unión al efector transmite la señal a través de una o más proteínas intermediarias, dando como resultado la regulación de la transcripción en un locus definido.
Según un aspecto adicional, el efector alostérico transformado, proporcionado de manera exógena, se une a la proteína alostérica de una manera que promueve la producción del antídoto. Según un aspecto, la producción del antídoto es proporcional a la cantidad de efector alostérico unido a la proteína alostérica. En ausencia del efector alostérico, la proteína alostérica impide la producción de antídoto.
Según la invención, se utilizan una o más proteínas alostéricas para controlar la expresión de uno o más marcadores detectables en un microorganismo. En ciertos aspectos, se utilizan uno o más marcadores detectables junto con la selección con toxinas. En otros aspectos, se utilizan uno o más marcadores detectables como técnica de detección independiente. En ciertos aspectos, una proteína alostérica y/o efector alostérico controla la expresión de un marcador (por ejemplo, un marcador detectable) o de un resto (por ejemplo, una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico) que puede estar marcado de manera detectable.
Los ejemplos de marcadores detectables incluyen diversos restos radioactivos, enzimas, grupos prostéticos, marcadores fluorescentes, marcadores luminiscentes, marcadores bioluminiscentes, partículas de metal, pares de unión proteína-proteína, pares de unión proteína-anticuerpo y similares. Están disponibles comercialmente marcadores detectables de una variedad de fuentes.
En ciertos aspectos de la invención, se proporcionan proteínas detectables y/o etiquetas proteicas. Los ejemplos de proteínas fluorescentes detectables incluyen, pero no se limitan a, proteína fluorescente amarilla (YFP), proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente cian (CFP), umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilaminafluoresceína, cloruro de dansilo, ficoeritrina y similares. Los ejemplos de proteínas bioluminiscentes detectables incluyen, pero no se limitan a, luciferasa (por ejemplo, bacteriana, de luciérnaga, escarabajo click y similares), luciferina, aecuorina y similares. Los ejemplos de sistemas de enzimas detectables incluyen, pero no se limitan a, galactosidasas, glucorinidasas, fosfatasas, peroxidasas, colinesterasas y similares.
Asimismo puede utilizarse biotina, o un derivado de la misma, como marcador detectable, y posteriormente unirse a un derivado de avidina/estreptavidina marcado de manera detectable (por ejemplo, estreptavidina conjugada con ficoeritrina), o un anticuerpo antibiotina marcado de manera detectable. Puede expresarse digoxigenina posteriormente unida a un anticuerpo antidigoxigenina marcado de manera detectable (por ejemplo, antidigoxigenina con fluoresceína). En general, puede incorporarse cualquier miembro de un par de conjugados en un olidonucleótido de detección siempre que pueda unirse una pareja de conjugado marcado de manera detectable para permitir la detección. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término anticuerpo se refiere a una molécula de anticuerpo de cualquier clase, o cualquier subfragmento del mismo, tal como un Fab.
Otros marcadores adecuados para la detección incluyen una o más etiquetas proteicas. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “etiqueta proteica” se refiere a una secuencia de polipéptido heteróloga unida a una polimerasa de la invención. Las etiquetas proteicas incluyen, pero no se limitan a, etiqueta Avi (GLNDIFEAQKIEWHE) (SEC ID N°:1), etiqueta calmodulina (KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL) (SEC ID N°:2), etiqueta FLAG (DYKDDDDK) (SEC ID N°:3), etiqueta HA (YPYDVPDYA) (SEC ID N°:4), etiqueta His (HHHHHH) (SEC ID N°:5), etiqueta Myc (EQKLISEEDL) (SEC ID N°:6), etiqueta S (KETAAAKFERQHMDS) (SEC ID N°:7), etiqueta SBP (MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP) (SEC ID N°:8), Softag 1 (SLAELLNAGLGGS) (SEC ID N°:9), Softag 3 (TQDPSRVG) (SEC ID N°:17), etiqueta V5 (GKPIPNPLLGLDST) (SEC ID N°:10), etiqueta Xpress (DLYDDDDK) (SEC ID N°:11), Isopeptag (TDKDMTITFTNKKDAE) (SEC ID N°:12), SpyTag (AHIVMVDAYKPTK) (SEC ID N°: 13), etiqueta estreptactina (Strep-tag II: WSHPQFEK) (SEC ID N°: 14) y similares.
El/los método(s) de detección utilizado(s) dependerá(n) de las etiquetas detectables particulares utilizadas en el microorganismo. En ciertas formas de realización ejemplificativas, pueden seleccionarse y/o examinarse microorganismos utilizando un microscopio, un espectrofotómetro, un luminómetro de tubo o luminómetro de placa, película de rayos X, campos magnéticos, un centelleador, un aparato de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), un aparato microfluídico, un aparato a base de perlas o similares.
En ciertas formas de realización ejemplificativas, se expresan una o más secuencias de ácido nucleico que codifican las secuencias de proteínas candidatas en una célula hospedadora utilizando técnicas convencionales de biología molecular. En la técnica se conocen bien técnicas de clonación molecular y de ADN recombinante convencionales utilizadas en la presente memoria y se describen en Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed.; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y., (1989) y por Silhavy, T.J., Bennan, M.L. y Enquist, L.W., Experiments with Gene Fusions; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y., (1984); y por Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley-Interscience (1987). Se describen métodos útiles adicionales en manuales que incluyen Advanced Bacterial Genetics (Davis, Roth y Botstein, Cold Spring Harbor Laboratory, 1980), Experiments with Gene Fusions (Silhavy, Berman y Enquist, Cold Spring Harbor Laboratory, 1984), Experiments in Molecular Genetics (Miller, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972) Experimental Techniques in Bacterial Genetics (Maloy, en Jones y Bartlett, 1990), y A Short Course in Bacterial Genetics (Miller, Cold Spring Harbor Laboratory 1992).
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “ácido nucleico” pretende incluir moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos del ADN o ARN generados utilizando análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “aminoácido” incluye compuestos orgánicos que contienen tanto un grupo amino básico como un grupo carboxilo ácido. Se incluyen dentro de este término aminoácidos naturales (por ejemplo, L-aminoácidos), aminoácidos modificados e inusuales (por ejemplo, D-aminoácidos y □­ aminoácidos), así como aminoácidos que es conocido que aparecen biológicamente en forma libre o combinada pero que habitualmente no aparecen en proteínas. Los aminoácidos que aparecen en proteínas naturales incluyen alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, tirosina, triptófano, prolina y valina. Los aminoácidos no proteicos naturales incluyen ácido arginosuccínico, citrulina, ácido cisteinasulfínico, 3,4-dihidroxifenilalanina, homocisteína, homoserina, ornitina, 3-monoyodotirosina, 3,5-diyodotirosina, 3,5,5,-triyodotironina y 3,3',5,5'-tetrayodotironina. Los aminoácidos modificados o inusuales incluyen D-aminoácidos, hidroxilisina, 4-hidroxiprolina, aminoácidos protegidos con N-Cbz, ácido 2,4-diaminobutírico, homoarginina, norleucina, ácido N-metilaminobutírico, naftilalanina, fenilglicina, alfa-fenilprolina, terc-leucina, 4-aminociclohexilalanina, N-metilnorleucina, 3,4-deshidroprolina, N,N-dimetilaminoglicina, N-metilaminoglicina, ácido 4-aminopiperidin-4-carboxílico, ácido 6-aminocaproico, ácido trans-4-(aminometil)-ciclohexanocarboxílico, ácido 2-,3- y 4-(aminometil)-benzoico, ácido 1-aminociclopentanocarboxílico, ácido 1-aminociclopropanocarboxílico y ácido 2-bencil-5-aminopentanoico.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “péptido” incluye compuestos que consisten en dos o más aminoácidos que están unidos por medio de un enlace peptídico. Los péptidos pueden presentar un peso molecular de menos de 10.000 Dalton, menos de 5.000 Dalton o menos de 2.500 Dalton. El término “péptido” asimismo incluye compuestos que contienen componentes tanto peptídicos como no peptídicos, tales como residuos pseudopeptídicos o peptidomiméticos u otros componentes distintos de aminoácidos. Tales compuestos que contienen componentes tanto peptídicos como no peptídicos asimismo pueden denominarse “análogo peptídico”.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “proteína” incluye compuestos que consisten en aminoácidos dispuestos en una cadena lineal y unidos entre sí por enlaces peptídicos entre los grupos carboxilo y amino de residuos de aminoácidos adyacentes.
Pueden modificarse genéticamente microorganismos para eliminar genes o incorporar genes mediante métodos conocidos por los expertos en la materia. Son comunes vectores y plásmidos útiles para la transformación de una variedad de células hospedadoras y están disponibles comercialmente de empresas tales como Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA), Stratagene (La Jolla, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) y Addgene (Cambridge, MA).
Ciertos aspectos de los métodos de la invención se refieren a vectores, tales como, por ejemplo, vectores de expresión. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “vector” se refiere a una secuencia de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un “plásmido”, que se refiere a un bucle de ADN de bicatenario circular en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. A título de ejemplo, pero no de limitación, un vector de la invención puede ser un vector de una sola copia o de múltiples copias, incluyendo, pero sin limitarse a, un BAC (cromosoma artificial bacteriano), un fósmido, un cósmido, un plásmido, un plásmido suicida, un vector lanzadera, un vector P1, un episoma, YAC (cromosoma artificial de levaduras), un bacteriófago o genoma viral, o cualquier otro vector adecuado. Las células hospedadoras pueden ser cualquier célula, incluyendo células procariotas o eucariotas, en las que el vector es capaz de replicarse.
Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedadora en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que presentan un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamíferos). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamíferos no episómicos) se integran en el genoma de una célula hospedadora tras su introducción en la célula hospedadora y, de ese modo, se replican junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están operativamente unidos. Tales vectores se denominan en la presente memoria “vectores de expresión”. En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante están a menudo en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, “plásmido” y “vector” pueden utilizarse indistintamente. Sin embargo, la invención pretende incluir tales otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados de replicación defectuosa), que desempeñan funciones equivalentes.
En ciertas formas de realización ejemplificativas, un ácido nucleico exógeno descrito en la presente memoria se expresa en células bacterianas utilizando un vector de expresión bacteriano como, por ejemplo, un fósmido. Un fósmido es un vector de clonación que se basa en el plásmido F bacteriano. La bacteria hospedadora solo contendrá normalmente una molécula de fósmido, aunque puede incluirse un ori de alto número de copias de manera que pueda obtenerse un mayor número de copias (por ejemplo, pCC1FOS™, pCC2FOS™). Bibliotecas de fósmidos son particularmente útiles para construir bibliotecas estables a partir de genomas complejos. Están disponibles comercialmente fósmidos y kits de producción de bibliotecas de fosmidos (EPICENTRE® Biotechnologies, Madison, WI). Para otros sistemas de expresión adecuados para células tanto procariotas como eucariotas, véanse los capítulos 16 y 17 de Sambrook, J., Fritsh, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.
En ciertas formas de realización ejemplificativas, los vectores de expresión recombinantes comprenden una secuencia de ácido nucleico en una forma adecuada para la expresión de la secuencia de ácido nucleico en una célula hospedadora, lo que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas basándose en las células hospedadoras que van a utilizarse para la expresión, que están operativamente unidas a la secuencia de ácido nucleico que va a expresarse. Dentro de un vector de expresión recombinante, “operativamente unido” pretende significar que la secuencia de ácido nucleico foránea que codifica una pluralidad de secuencias de ácido ribonucleico descritas en la presente memoria está unida a la(s) secuencia(s) reguladora(s) de una manera que permite la expresión de la secuencia de ácido nucleico. El término “secuencia reguladora” pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Los expertos en la materia apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora que va a transformarse, el nivel de expresión de proteína deseado, y similares.
Otro aspecto de los métodos de la invención se refiere a células hospedadoras en las que se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Los términos “célula hospedadora” y “célula hospedadora recombinante” se utilizan indistintamente en la presente memoria. Se entiende que tales términos se refieren no solo a la célula sujeto particular, sino asimismo a la progenie o posible progenie de una célula de este tipo. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a o bien mutación, o bien influencias ambientales, tal progenie, de hecho, puede no ser idéntica a la célula original, pero está todavía incluida dentro del alcance del término tal como se utiliza en la presente memoria.
Las células según la presente divulgación incluyen cualquier célula en la que pueden introducirse ácidos nucleicos foráneos y expresarse tal como se describe en la presente memoria. Debe apreciarse que los conceptos básicos de la presente divulgación descrita en la presente memoria no están limitados por el tipo de célula. Las células según la presente divulgación incluyen células eucariotas, células procariotas, células animales, células vegetales, células de insectos, células fúngicas, células de arqueas, células eubacterianas, un virión, un virosoma, una partícula similar a un virus, un microbio parásito, una proteína infecciosa y similares. Las células incluyen células eucariotas tales como células de levaduras, células vegetales y células animales. Las células particulares incluyen células bacterianas. Los expertos en la materia conocen otras células adecuadas.
Pueden introducirse ácidos nucleicos foráneos (es decir, aquellos que no forman parte de la composición de ácidos nucleicos natural de una célula) en una célula utilizando cualquier método conocido por los expertos en la materia para tal introducción. Tales métodos incluyen transfección, transducción, infección (por ejemplo, transducción viral), inyección, microinyección, pistola génica, nucleofección, bombardeo de nanopartículas, transformación, conjugación, mediante aplicación del ácido nucleico en un gel, aceite o crema, mediante electroporación, utilizando reactivos de transfección basados en lípidos o mediante cualquier otro método de transfección adecuado. Un experto en la materia entenderá y adaptará fácilmente tales métodos utilizando fuentes bibliográficas fácilmente identificables.
Tal como se utilizan en la presente memoria, los términos “transformación” y “transfección” pretenden referirse a una variedad de técnicas reconocidas en la técnica para introducir ácido nucleico foráneo en una célula hospedadora, incluyendo coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección (por ejemplo, utilizando reactivos comercialmente disponibles tales como, por ejemplo, LIPOFECTIN® (Invitrogen Corp., San Diego, CA), LIPOFECTAMINE® (Invitrogen), FUGENE® (Roche Applied Science, Basilea, Suiza), JETPEI™ (Polyplus-transfection Inc., Nueva York, NY), EFFECTENE® (Qiagen, Valencia, CA), DREAMFECT™ (OZ Biosciences, Francia) y similares) o electroporación (por ejemplo, electroporación in vivo). Pueden encontrarse métodos adecuados para transformar o transfectar células hospedadoras en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), y otros manuales de laboratorio.
Normalmente, el vector o plásmido contiene secuencias que dirigen la transcripción y traducción de un gen o genes relevantes, un marcador seleccionable y secuencias que permiten la replicación autónoma o integración cromosómica. Los vectores adecuados comprenden una región 5' del gen que alberga controles de iniciación de la transcripción y una región 3' del fragmento de ADN que controla la terminación de la transcripción. Ambas regiones de control pueden derivarse de genes homólogos a la célula hospedadora transformada, aunque ha de entenderse que tales regiones de control pueden derivarse asimismo de genes que no son nativos para la especie seleccionada como huésped de producción.
Los promotores o regiones de control de la iniciación, que son útiles para dirigir la expresión de las regiones codificantes de la ruta relevante en la célula hospedadora deseada son numerosos y familiares para los expertos en la materia. Prácticamente cualquier promotor capaz de dirigir estos elementos genéticos es adecuado para su utilización en los métodos de la presente invención incluyendo, pero sin limitarse a, lac, ara, tet, trp, IPl, IPr, T7, tac y trc (útiles para la expresión en Escherichia coli y Pseudomonas); los promotores amy, apr, npr y diversos promotores de fagos útiles para la expresión en Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis; nisA (útil para expresión en bacterias Gram-positivas, Eichenbaum et al. Appl. Environ. Microbiol. 64(8):2763-2769 (1998)); y el promotor P11 sintético (útil para la expresión en Lactobacillus plantarum, Rud et al., Microbiology 152:1011 -1019 (2006)). Asimismo pueden derivarse regiones de control de la terminación de diversos genes nativos para los hospedadores preferidos.
Ciertos vectores son capaces de replicarse en una amplia gama de bacterias huésped y pueden transferirse mediante conjugación. Está disponible la secuencia completa y anotada de pRK404 y tres vectores relacionados: pRK437, pRK442 y pRK442(H). Se ha demostrado que estos derivados son herramientas valiosas para la manipulación genética en bacterias Gram-negativas (Scott et al., Plasmid 50(1):74-79 (2003)). Varios derivados de plásmido del plásmido Inc P4 RSF1010 de amplia gama de huéspedes están asimismo disponibles con promotores que pueden funcionar en una gama de bacterias Gram-negativas. Los plásmidos pAYC36 y pAYC37 presentan promotores activos junto con sitios de clonación múltiple para permitir la expresión de genes heterólogos en bacterias Gram-negativas.
Asimismo están ampliamente disponibles herramientas de reemplazo de genes cromosómicos. Por ejemplo, una variante termosensible del replicón de amplia gama de huéspedes pWV101 se ha modificado para construir un plásmido pVE6002 que puede utilizarse para crear reemplazo de genes en una gama de bacterias Gram-positivas (Maguin et al., J. Bacteriol. 174(17):5633-5638 (1992)). Adicionalmente, están disponibles transposomas in vitro para crear mutaciones al azar en una variedad de genomas a partir de fuentes comerciales tales como EPICENTRE® (Madison, WI).
Son comunes vectores útiles para la transformación de E. coli y están comercialmente disponibles. Por ejemplo, los genes deseados pueden aislarse de diversas fuentes, clonarse sobre un vector pUC19 modificado y transformarse en células hospedadoras de E. coli. Alternativamente, los genes que codifican una ruta de biosíntesis deseada pueden dividirse en múltiples operones, clonarse en vectores de expresión y transformarse en diversas cepas de E. coli.
El género Lactobacillus pertenece a la familia Lactobacillales y muchos plásmidos y vectores utilizados en la transformación de Bacillus subtilis y Streptococcus pueden utilizarse para Lactobacillus. Los ejemplos no limitativos de vectores adecuados incluyen pAM^1 y derivados del mismo (Renault et al., Gene 183:175-182 (1996); y O'Sullivan et al., Gene 137:227-231 (1993)); pMBB1 y pHW800, un derivado de pMBB1 (Wyckoff et al. Appl. Environ. Microbiol. 62:1481-1486 (1996)); pMG1, un plásmido conjugativo (Tanimoto et al., J. Bacteriol. 184:5800-5804 (2002)); pNZ9520 (Kleerebezem et al., Appl. Environ. Microbiol. 63:4581-4584 (1997)); pAM401 (Fujimoto et al., Appl. Environ. Microbiol. 67:1262-1267 (2001)); y pAT392 (Arthur et al., Antimicrob. Agents Chemother.
38:1899-1903 (1994)). Se han notificado asimismo varios plásmidos de Lactobacillus plantarum (van Kranenburg R, Golic N, Bongers R, Leer R J, de Vos W M, Siezen R J, Kleerebezem M. Appl. Environ. Microbiol. Marzo de 2005; 71(3): 1223-1230), que pueden utilizarse para la transformación.
Pueden obtenerse promotores o regiones de control de la iniciación, que son útiles para dirigir la expresión de las regiones codificantes de la ruta relevante en la célula hospedadora de Lactobacillus deseada, de Lactobacillus u otras bacterias del ácido láctico, u otros organismos Gram-positivos. Un ejemplo no limitativo es el promotor nisA de Lactococcus. Asimismo pueden derivarse regiones de control de la terminación de diversos genes nativos para los huéspedes preferidos o bacterias relacionadas.
Los diversos genes para una ruta de biosíntesis deseada u otra deseada pueden ensamblarse en cualquier vector adecuado, tal como los descritos anteriormente. Los codones pueden optimizarse para la expresión basándose en el índice de codones deducido a partir de las secuencias del genoma de la cepa huésped, tal como para Lactobacillus plantarum o Lactobacillus arizonensis. Los plásmidos pueden introducirse en la célula hospedadora utilizando métodos conocidos en la técnica, tales como electroporación, tal como se describe en una cualquiera de las siguientes referencias: Cruz-Rodz et al. (Molecular Genetics and Genomics 224:1252-154 (1990)), Bringel y Hubert (Appl. Microbiol. Biotechnol. 33: 664-670 (1990)) y Teresa Alegre, Rodriguez y Mesas (f Em S Microbiology Letters 241:73-77 (2004)). Asimismo pueden introducirse plásmidos en Lactobacillus plantatrum mediante conjugación (Shrago, Chassy y Dobrogosz Appl. Environ. Micro. 52: 574-576 (1986)). Los genes de la ruta de biosíntesis deseada asimismo pueden integrarse en el cromosoma de Lactobacillus utilizando vectores de integración (Hols et al. Appl. Environ. Micro. 60:1401-1403 (1990); Jang et al. Micro. Lett. 24:191-195 (2003)).
Los microorganismos que pueden servir como células hospedadoras y que pueden modificarse genéticamente para producir microorganismos recombinantes tal como se describe en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, bacterias Gram-positivas, bacterias Gram-negativas, bacterias acidorresistentes y similares.
Tal como se utilizan en la presente memoria, las bacterias Gram-positivas incluyen, pero no se limitan a, Actinomedurae, Actinomyces israelii, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes, Nocardia, Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epiderm, Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae y similares.
Tal como se utilizan en la presente memoria, las bacterias Gram-negativas incluyen, pero no se limitan a, Afipia felis, Bacteriodes, Bartonella bacilliformis, Bortadella pertussis, Borrelia burgdorferi, Borrelia recurrentis, Brucella, Calymmatobacterium granulomatis, Campylobacter, Escherichia coli, Francisella tularensis, Gardnerella vaginalis, Haemophilius aegyptius, Haemophilius ducreyi, Haemophilius influenziae, Heliobacter pylori, Legionella pneumophila, Leptospira interrogans, Neisseria meningitidia, Porphyromonas gingivalis, Providencia sturti, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteridis, Salmonella typhi, Serratia marcescens, Shigella boydii, Streptobacillus moniliformis, Streptococcus pyogenes, Treponema pallidum, Vibrio cholerae, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis y similares.
Tal como se utilizan en la presente memoria, las bacterias acidorresistentes incluyen, pero no se limitan a, Myobacterium avium, Myobacterium leprae, Myobacterium tuberculosis y similares.
Tal como se utilizan en la presente memoria, otras bacterias que no se encuentran en las otras tres categorías incluyen, pero no se limitan a, Bartonella henseiae, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Coxiella burnetii, Mycoplasma pneumoniae, Rickettsia akari, Rickettsia prowazekii, Rickettsia rickettsii, Rickettsia tsutsugamushi, Rickettsia typhi, Ureaplasma urealyticum, Diplococcus pneumoniae, Ehrlichia chafensis, Enterococcus faecium, Meningococci y similares.
En ciertos aspectos, los microorganismos que pueden servir como células hospedadoras y que pueden modificarse genéticamente para producir microorganismos recombinantes tal como se describe en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, los géneros Clostridium, Escherichia, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Saccharomyces y Enterococcus. Los microorganismos particularmente adecuados incluyen Escherichia coli, Bacillus subtilis y Saccharomyces cerevisiae.
Según ciertos aspectos de los métodos de la invención, se proporcionan fagos y su material genético. Tal como se utilizan en la presente memoria, los términos “fago” y “bacteriófago” se utilizan indistintamente. Los fagos pueden distinguirse entre sí basándose en su composición genética y/o su morfología de virión. Algunos fagos presentan genomas de ADN bicatenario, incluyendo fagos de las familias corticoviridae, lipothrixviridae, plasmaviridae, myrovridae, siphoviridae, sulfolobus shibate, podoviridae, tectiviridae y fuselloviridae. Otros fagos presentan genomas de ADN monocatenario, incluyendo fagos de las familias microviridae e inoviridae. Otros fagos presentan genomas de ARN, incluyendo fagos de las familias leviviridae y cystoviridae. Los bacteriófagos ejemplificativos incluyen, pero no se limitan a, Wphi, Mu, T1, T2, T3, T4, T5, T6, T7, P1, P2, P4, P22, fd, phi6, phi29, phiC31, phi80, phiX174, SP01, M13, MS2, PM2, SSV-1, L5, PRD1, Qbeta, lambda, UC-1, HK97, HK022 y similares.
Según ciertas formas de realización ejemplificativas, se proporcionan micromatrices que presentan ácidos nucleicos unidos a las mismas que codifican una o una pluralidad de las proteínas alostéricas descritas en la presente memoria. Tal como se utiliza en la presente memoria, “micromatriz” se refiere en una forma de realización a un tipo de producto de ensayo múltiple que comprende un soporte de fase sólida que presenta una superficie sustancialmente plana sobre la que hay una matriz de regiones o sitios no solapantes espacialmente definidos que contienen cada uno una sonda de hibridación inmovilizada. “Sustancialmente plana” significa que las características o los objetos de interés, tales como sitios de sondas, sobre una superficie pueden ocupar un volumen que se extiende por debajo o por encima de una superficie y cuyas dimensiones son pequeñas en relación con las dimensiones de la superficie. Por ejemplo, perlas dispuestas en la cara de un haz de fibra óptica crean una superficie sustancialmente plana de sitios de sondas, u oligonucleótidos dispuestos o sintetizados sobre un sustrato plano poroso crean una superficie sustancialmente plana. Los sitios espacialmente definidos pueden ser, adicionalmente, “accesibles” porque su ubicación y la identidad de la sonda inmovilizada en esa ubicación se conocen o pueden determinarse. Las sondas inmovilizadas sobre micromatrices incluyen ácidos nucleicos, tales como códigos de barras de oligonucleótidos, que se generan en o a partir de una reacción de ensayo. Normalmente, los oligonucleótidos o polinucleótidos sobre micromatrices son monocatenarios y están unidos covalentemente al soporte de fase sólida, habitualmente por un extremo 5' o un extremo 3'. La densidad de regiones no solapantes que contienen ácidos nucleicos en una micromatriz es normalmente mayor de 100 por cm2, y más preferentemente, mayor de 1000 por cm2. La tecnología de micromatrices referente a sondas de ácido nucleico se revisa en las siguientes referencias ejemplificativas: Schena, Editor, Microarrays: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 2000); Southern, Current Opin. Chem. Biol., 2: 404-410 (1998); Nature Genetics Supplement, 2l:1 -60 (1999); y Fodor et al., patentes US n° 5.424.186; 5.445.934; y 5.744.305. Una micromatriz puede comprender matrices de microperlas, u otras micropartículas, solas o dispuestas sobre una superficie plana o en pocillos u otras configuraciones físicas que pueden utilizarse para separar las perlas. Tales micromatrices pueden formarse de una variedad de modos, tal como se da a conocer en las siguientes referencias ejemplificativas: Brenner et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18:630; Tulley et al., patente US n° 6.133.043; Stuelpnagel et al., patente US n° 6.396.995; Chee et al., patente US n° 6.544.732; y similares. En un formato, se forman micromatrices disponiendo al azar microperlas que presentan oligonucleótidos unidos sobre una superficie seguido por la determinación de qué microperla porta qué oligonucleótido por un procedimiento de decodificación, por ejemplo, tal como dan a conocer Gunderson et al., publicación de patente US n° 2003/0096239.
“Micromatrices” o “matrices” pueden referirse asimismo a un conjunto heterogéneo de moléculas de ácido nucleico que se distribuye sobre una estructura de soporte. Los ácidos nucleicos pueden unirse de manera covalente o no covalente al soporte. Preferentemente, las moléculas de ácido nucleico están espaciadas a una distancia entre sí suficiente para permitir la identificación de características diferenciadas de la matriz. Los ácidos nucleicos en la matriz pueden ser no solapantes o parcialmente solapantes. Se describen métodos de transferencia de un conjunto de ácidos nucleicos a medios de soporte en la patente US n° 6.432.360. Se dan a conocer métodos basados en perlas útiles para los métodos descritos en la presente memoria en el documento PCT US05/04373.
“Amplificar” incluye la producción de copias de una molécula de ácido nucleico de la matriz o una molécula de ácido nucleico unida a una perla por medio de rondas repetidas de síntesis enzimática con cebador. La amplificación “in situ” indicó que la amplificación tiene lugar con la molécula de ácido nucleico molde situada sobre un soporte o una perla, en vez de en disolución. Se describen métodos de amplificación in situ en la patente US n° 6.432.360.
“Soporte” puede referirse a una estructura sobre la que se colocan moléculas de ácido nucleico de una matriz de ácido nucleico. El soporte puede ser sólido o semisólido o un gel. “Semisólido” se refiere a una estructura comprimible con tanto un componente sólido como uno líquido, en la que el líquido ocupa poros, espacios u otros intersticios entre los elementos sólidos de la estructura. Pueden seleccionarse soportes semisólidos de poliacrilamida, celulosa, poliamida (nailon) y agarosa reticulada, dextrano y polietilenglicol.
“Patrón aleatorio” o “al azar” se refiere una distribución no ordenada y no cartesiana (en otras palabras, no dispuesta en puntos predeterminados a lo largo de los ejes x o y de una cuadrícula o en “posiciones de reloj”, grados o radios definidos desde el centro de un patrón radial) de moléculas de ácido nucleico sobre un soporte, que no se logra a través de un diseño deliberado (o programa mediante el cual puede lograrse tal diseño) o mediante colocación de características de ácidos nucleicos individuales. Una matriz de “patrón aleatorio” o “al azar” de ácidos nucleicos puede lograrse mediante goteo, pulverización, colocación en placas o dispersión de una disolución, emulsión, aerosol, vapor o preparación seca que comprende un conjunto de moléculas de ácido nucleico sobre un soporte y permitiendo que las moléculas de ácido nucleico se asienten sobre el soporte sin intervención de ninguna manera para dirigirlas a sitios específicos sobre el mismo. Las matrices de la invención pueden ser de patrón aleatorio o al azar.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “unir” se refiere a tanto interacciones covalentes como interacciones no covalentes. Una interacción covalente es una unión química entre dos átomos o radicales formada al compartir un par de electrones (es decir, un enlace sencillo), dos pares de electrones (es decir, un doble enlace) o tres pares de electrones (es decir, un triple enlace). Las interacciones covalentes se conocen asimismo en la técnica como interacciones de pares de electrones o enlaces de pares de electrones. Las interacciones no covalentes incluyen, pero no se limitan a, interacciones de van der Waals, enlaces de hidrógeno, enlaces químicos débiles (es decir, por medio de fuerzas no covalentes de corto alcance), interacciones hidrófobas, enlaces iónicos y similares. Puede encontrarse una revisión de interacciones no covalentes en Alberts et al., en Molecular Biology of the Cell, 3a edición, Garland Publishing, 1994.
En ciertos aspectos de los métodos de la invención, se proporcionan métodos y composiciones para “acoplar” una o más secuencias de ácido nucleico entre sí para que codifiquen una proteína alostérica. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “acoplar” se refiere a la unión de una pluralidad de secuencias de ácido nucleico, por ejemplo, por medio de una reacción de amplificación tal como PCR cruzada con código de barras o una reacción de extensión.
En ciertos aspectos, se proporcionan métodos de amplificación de secuencias de ácido nucleico. Los métodos ejemplificativos para amplificar ácidos nucleicos incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (ver, por ejemplo, Mullis et al. (1986) Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 51 Pt 1:263 y Cleary et al. (2004) Nature Methods 1:241; y las patentes US n° 4.683.195 y 4.683.202), PCR de anclaje, PCR rAc E, reacción en cadena de ligación (LCR) (véase, por ejemplo, Landegran et al. (1988) Science 241:1077-1080; y Nakazawa et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:360-364), replicación de secuencia autosostenida (Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1874), sistema de amplificación transcripcional (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:1173), Q-Beta replicasa (Lizardi et al. (1988) BioTechnology 6:1197), PCR recursiva (Jaffe et al. (2000) J. Biol. Chem.
275:2619; y Williams et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:7790), los métodos de amplificación descritos en las patentes US n° 6.391.544, 6.365.375, 6.294.323, 6.261.797, 6.124.090 y 5.612.199, amplificación isotérmica (por ejemplo, amplificación por círculo rodante (RCA), amplificación por círculo rodante hiperramificado (HRCA), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), amplificación dependiente de helicasa (HDA), PWGA) o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos utilizando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia, reacciones en cadena de la polimerasa y/o ligasa, ciclado térmico (PCR) o isotérmicamente (por ejemplo, RCA, hRCA, SDA, HDA, PWGA (página web: biohelix.com/technology.asp)).
PCR se refiere a una reacción para la amplificación in vitro de secuencias de ADN específicas mediante la extensión simultánea por cebadores de hebras complementarias de ADN. En otras palabras, la PCR es una reacción para preparar múltiples copias o réplicas de un ácido nucleico diana flanqueado por sitios de unión a cebadores, comprendiendo tal reacción una o más repeticiones de las siguientes etapas: (i) desnaturalizar el ácido nucleico diana, (ii) aparear cebadores a los sitios de unión a cebadores y (iii) extender los cebadores mediante un ácido nucleico polimerasa en presencia de nucleósidos trifosfatos. Habitualmente, la reacción se cicla a través de diferentes temperaturas optimizadas para cada etapa en un instrumento de ciclador térmico. Las temperaturas, las duraciones en cada etapa y las velocidades de cambio entre las etapas en particular dependen de muchos factores bien conocidos por los expertos ordinarios en la materia, por ejemplo, ejemplificados por las referencias: McPherson et al., editores, PCR: A Practical Approach y PCR2: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991 y 1995, respectivamente). Por ejemplo, en una PCR convencional que utiliza Taq ADN polimerasa, un ácido nucleico diana bicatenario puede desnaturalizarse a una temperatura mayor de 90°C, los cebadores aparearse a una temperatura en el intervalo de 50-75°C y los cebadores extenderse a una temperatura en el intervalo de 72-78°C.
El término “PCR” comprende unas formas derivadas de la reacción, incluyendo pero sin limitarse a, RT-PCR, PCR en tiempo real, PCR anidada, PCR cuantitativa, PCR multiplexada, y similares. Los volúmenes de reacción oscilan entre unos pocos cientos de nanolitros, por ejemplo, 200 nl, y unos pocos cientos de microlitros, por ejemplo, 200 microlitros. “PCR de transcripción inversa”, o “RT-PCR”, significa una PCR que va precedida por una reacción de transcripción inversa que convierte un ARN diana en un ADN monocatenario complementario, que luego se amplifica, por ejemplo, Tecott et al., patente US n° 5.168.038. “PCR en tiempo real” significa una PCR para la que la cantidad de producto de reacción, es decir, amplicón, se monitoriza a medida que avanza la reacción. Hay muchas formas de PCR en tiempo real que difieren principalmente en las químicas de detección utilizadas para monitorizar el producto de reacción, por ejemplo, Gelfand et al., patente US n° 5.210.015 (“Taqman”); Wittwer et al., patentes US n° 6.174.670 y 6.569.627 (tintes intercalantes); Tyagi et al., patente US n° 5.925.517 (balizas moleculares). Se revisan químicas de detección para PCR en tiempo real en Mackay et al., Nucleic Acids Research, 30:1292-1305 (2002). “PCR anidada” significa una PCR en dos fases en la que el amplicón de una primera PCR se convierte en la muestra para una segunda PCR utilizando un nuevo conjunto de cebadores, al menos uno de los cuales se une a una ubicación interior del primer amplicón. Tal como se utilizan en la presente memoria, “cebadores iniciales” en referencia a una reacción de amplificación anidada significan los cebadores utilizados para generar un primer amplicón, y “cebadores secundarios” significan el uno o más cebadores utilizados para generar un segundo amplicón, o anidado. “PCR multiplexada” significa una PCR en la que múltiples secuencias diana (o una única secuencia diana y una o más secuencias de referencia) se procesan simultáneamente en la misma mezcla de reacción, por ejemplo, Bernard et al. (1999) Anal. Biochem., 273:221-228 (PCR en tiempo real de dos colores). Habitualmente, se utilizan conjuntos de cebadores distintos para cada secuencia que está amplificándose. “PCR cuantitativa” significa una PCR diseñada para medir la abundancia de una o más secuencias diana específicas en una muestra o espécimen. La PCR cuantitativa incluye tanto la cuantificación absoluta como la cuantificación relativa de tales secuencias diana. Los expertos habituales en la materia conocen bien técnicas para PCR cuantitativa, tal como se ejemplifica en las siguientes referencias: Freeman et al., Biotechniques, 26:112-126 (1999); Becker-Andre et al., Nucleic Acids Research, 17:9437-9447 (1989); Zimmerman et al., Biotechniques, 21:268-279 (1996); Diviacco et al., Gene, 122:3013-3020 (1992); Becker-Andre et al., Nucleic Acids Research, 17:9437-9446 (1989); y similares.
Ejemplo I
Diseño computacional de proteínas
En determinadas formas de realización de la invención, se combina el diseño de proteínas basado en la estructura con software de última generación (por ejemplo, software Rosetta) para diseñar interacciones de molécula pequeña-proteína. El bolsillo de unión de una proteína alostérica se diseña para seleccionar como diana una molécula pequeña. Se generan miles de diseños de proteínas filtrados in silico que pueden unirse potencialmente a moléculas pequeñas.
Ejemplo II
Síntesis de ADN basada en chip y ensamblaje de diseños
En determinadas formas de realización, las proteínas alostéricas diseñadas en el ejemplo I se codifican por ADN inmovilizado sobre un sustrato (por ejemplo, sobre chips de ADN). En ciertos aspectos, se codifican múltiples dianas de molécula pequeña (por ejemplo, proteínas de unión de molécula pequeña, por ejemplo, proteínas alostéricas) sobre un único chip. Para una proteína alostérica dada, las correspondientes secuencias de ADN que codifican la proteína se amplifican y se purifican selectivamente. En ciertos aspectos, cada secuencia de ADN sobre el chip presenta aproximadamente 100 bases de longitud. Las secuencias de ADN amplificadas se acoplan para ensamblar una secuencia que codifica una proteína alostérica. Se desarrolló una técnica de ensamblaje jerárquico para construir bibliotecas de diseño completas que codifican múltiples proteínas alostéricas. Se describen métodos de ensamblaje jerárquico en el documento USSN 12/533.141, presentado el 31 de julio de 2009.
Ensamblaje
Los diseños que surgen de las predicciones de unión computacionales u otros métodos se ensamblan utilizando una estrategia de ensamblaje multiplexado. Se amplifican fragmentos de biblioteca a partir de los oligonucleótidos generados, por ejemplo, mediante impresión sobre un microchip, síntesis capilar convencional, a partir de la secuencia de tipo natural o a partir de versiones previas de la biblioteca. Se eliminan secuencias de amplificación, por ejemplo, mediante endonucleasas de restricción de tipo IIs. Se ensamblan fragmentos para proporcionar fragmentos de subgenes o genes completos en una reacción multiplexada utilizando ligasa u otros medios. Los fragmentos de subgenes se ensamblan para dar diseños de longitud completa y combinaciones de los mismos de manera múltiple, utilizando, por ejemplo, PCR de solapamiento, ligación u otros métodos adecuados conocidos por los expertos en la materia. Se insertan genes completos en un plásmido de expresión por ejemplo, mediante ligación, ensamblaje de Gibson u otros métodos adecuados conocidos por los expertos en la materia en una reacción múltiple. Las bibliotecas de plásmidos de expresión se transforman en una cepa que permite una alta eficiencia de clonación, o directamente en una cepa competente para los sitios de unión y/o activación de las proteínas sensoras. Se identifican proteínas sensoras funcionales utilizando selección, cribado o una combinación de los mismos.
Ejemplo III
Sistema de selección genética
Se desarrolló un nuevo sistema de selección genética para identificar los mejores diseños de proteínas alostéricas. Los sistemas de selección típicos conocidos por otros en la técnica en el momento de la presentación optimizan una única función deseada. En cambio, las formas de realización de la presente invención optimizan dos funciones: 1) afinidad de unión de la molécula pequeña diana por la proteína alostérica; y 2) conservación del alosterismo en la proteína alostérica. En ciertos aspectos, el sistema de selección de la invención utiliza un marcador selectivo doble, que se activa opcionalmente en dos fases. En la primera etapa de selección, las proteínas diseñadas que no son alostéricas se eliminan mediante selección negativa. En la segunda etapa de selección, las proteínas diseñadas que no se eliminaron en la primera fase de selección se evalúan para determinar su unión a una molécula pequeña diana mediante selección positiva. El sistema de selección de la presente invención permite evaluar casi mil millones de diseños de proteínas. Los diseños de proteínas que sobreviven a ambas fases de selección se someten a ensayo individualmente para determinar su actividad.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Método de preparación y aislamiento de proteínas de unión a ADN alostéricas que se unen a un efector alostérico acompañante que induce un cambio de conformación que comprende:
diseñar computacionalmente in silico proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas que presentan un bolsillo de unión para un efector alostérico acompañante,
proporcionar unas secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas,
introducir las secuencias de ácido nucleico en células hospedadoras bacterianas y expresar las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas,
determinar si las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas se unen al ADN e inhiben la expresión de un gen utilizando una selección negativa para identificar una primera pluralidad de células hospedadoras bacterianas en la que las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas se han unido al ADN e inhiben la expresión del gen, y
determinar si las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas en la primera pluralidad de células hospedadoras bacterianas se unen al efector alostérico acompañante utilizando un cribado positivo para identificar una segunda pluralidad de células hospedadoras bacterianas en la que las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas se han unido al efector alostérico acompañante, en el que el cribado positivo incluye detectar un marcador detectable que se expresa en la primera pluralidad de células bacterianas cuando las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas se han unido al efector alostérico acompañante para expresar el gen.
2. Método según la reivindicación 1, en el que la selección negativa incluye poner en contacto las células hospedadoras bacterianas con una toxina que es tóxica para las células que expresan el gen o poner en contacto las células hospedadoras bacterianas con una toxina que es tóxica para las células en las que las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas no se han unido al ADN para inhibir la expresión del gen.
3. Método según la reivindicación 1, en el que el marcador detectable es una proteína fluorescente, y opcionalmente en el que la proteína fluorescente se detecta mediante clasificación de células activadas por fluorescencia.
4. Método según la reivindicación 1, en el que el cribado positivo comprende además detectar un marcador detectable que se expresa en la primera pluralidad de células bacterianas cuando el efector alostérico acompañante no se ha unido a las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas de una manera que libere las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas del ADN.
5. Método según la reivindicación 1, en el que las proteínas de unión a ADN son sensores químicos, y/o en el que las células hospedadoras bacterianas son Escherichia coli o Bacillus subtilis.
6. Método de preparación y aislamiento de proteínas de unión a ADN alostéricas que se unen a un efector alostérico acompañante que induce un cambio de conformación que comprende:
diseñar computacionalmente in silico proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas que presentan un bolsillo de unión para un efector alostérico acompañante,
proporcionar secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas,
introducir las secuencias de ácido nucleico en células hospedadoras de Saccharomyces cerevisiae y expresar las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas,
determinar si las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas se unen al ADN e inhiben la expresión de un gen utilizando una selección negativa para identificar una primera pluralidad de células hospedadoras de Saccharomyces cerevisiae en la que las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas se han unido al ADN e inhiben la expresión del gen, y
determinar si las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas en la primera pluralidad de células hospedadoras de Saccharomyces cerevisiae se unen al efector alostérico acompañante utilizando un cribado positivo para identificar una segunda pluralidad de células hospedadoras de Saccharomyces cerevisiae en la que las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas se han unido al efector alostérico acompañante, en el que el cribado positivo incluye detectar un marcador detectable que se expresa en la primera pluralidad de células bacterianas cuando las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas se han unido al efector alostérico acompañante para expresar el gen.
7. Método según la reivindicación 6, en el que se crean unas secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas a partir de subsecuencias de ácido nucleico unidas a un sustrato, y se ligan para formar las secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas.
8. Método según la reivindicación 6, en el que la selección negativa incluye poner en contacto las células hospedadoras bacterianas con una toxina que es tóxica para las células que expresan el gen.
9. Método de preparación y aislamiento de proteínas de unión a ADN alostéricas que se unen a un efector alostérico acompañante que induce un cambio de conformación que comprende:
diseñar computacionalmente in silico proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas que presentan un bolsillo de unión para un efector alostérico acompañante,
proporcionar secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas creadas a partir de subsecuencias de ácido nucleico unidas a un sustrato,
introducir las secuencias de ácido nucleico en microorganismos y expresar las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas,
determinar si las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas se unen al ADN e inhiben la expresión de un gen utilizando una selección negativa para identificar una primera pluralidad de microorganismos en la que las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas se han unido al ADN e inhiben la expresión del gen, y
determinar si las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas en la primera pluralidad de microorganismos se unen al efector alostérico acompañante utilizando un cribado positivo para identificar una segunda pluralidad de microorganismos en la que las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas se han unido al efector alostérico acompañante, en el que el cribado positivo incluye detectar un marcador detectable que se expresa en la primera pluralidad de células bacterianas cuando las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas se han unido al efector alostérico acompañante para expresar el gen.
10. Método según la reivindicación 9, en el que las secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas se generan de manera aleatoria.
11. Método según la reivindicación 10, en el que las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas se generan mediante PCR propensa a errores o PCR combinatoria, en el que las proteínas de unión a ADN alostéricas candidatas se fusionan a un gen antitoxina que requiere que el marco de lectura de proteína permanezca intacto para su función, en el que una proteína de unión a ADN alostérica candidata que está fuera del marco o truncada no permite la expresión de una proteína antitoxina específica contra una toxina, y opcionalmente en el que una célula hospedadora que expresa una proteína de unión a ADN alostérica candidata fuera del marco o truncada se elimina exponiendo la célula hospedadora a la toxina.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106232827A (zh) 2014-02-21 2016-12-14 哈佛学院董事及会员团体 变构蛋白的从头设计
WO2018035158A1 (en) 2016-08-15 2018-02-22 Enevolv, Inc. Cell-free sensor systems
US20210177921A1 (en) * 2017-11-16 2021-06-17 Virogin Biotech Canada Ltd Targeting moiety-decorated oncolytic viruses
WO2019161243A1 (en) * 2018-02-15 2019-08-22 Enevolv, Inc. Sensor systems

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5168038A (en) 1988-06-17 1992-12-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University In situ transcription in cells and tissues
ATE142272T1 (de) 1989-01-19 1996-09-15 Behringwerke Ag Nukleinsäure-amplifikation unter verwendung eines einzelprimers
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5424186A (en) 1989-06-07 1995-06-13 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US5612199A (en) 1991-10-11 1997-03-18 Behringwerke Ag Method for producing a polynucleotide for use in single primer amplification
EP0804561B1 (en) * 1993-02-12 2009-12-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Regulated transcription of targeted genes and other biological events
US6294323B1 (en) 1993-04-14 2001-09-25 Behringwerke Ag Self initiating single primer amplification of nucleic acids
US5925517A (en) 1993-11-12 1999-07-20 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
US5744367A (en) 1994-11-10 1998-04-28 Igen International, Inc. Magnetic particle based electrochemiluminescent detection apparatus and method
US6261797B1 (en) 1996-01-29 2001-07-17 Stratagene Primer-mediated polynucleotide synthesis and manipulation techniques
ES2243393T3 (es) 1996-06-04 2005-12-01 University Of Utah Research Foundation Monitorizacion de la hibridacion durante la pcr.
EP1028970A1 (en) 1997-10-10 2000-08-23 President And Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
DE19813317A1 (de) 1998-03-26 1999-09-30 Roche Diagnostics Gmbh Verbessertes Verfahren zur Primer Extension Präamplifikations-PCR
US6391544B1 (en) 1998-05-15 2002-05-21 Abbott Laboratories Method for using unequal primer concentrations for generating nucleic acid amplification products
DE19831420A1 (de) * 1998-07-14 2000-01-20 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Expressionssysteme enthaltend chimäre Promotoren mit Bindungsstellen für rekombinante Transkriptionsfaktoren
US6544732B1 (en) 1999-05-20 2003-04-08 Illumina, Inc. Encoding and decoding of array sensors utilizing nanocrystals
AU779835B2 (en) 1999-05-20 2005-02-10 Illumina, Inc. Method and apparatus for retaining and presenting at least one microsphere array to solutions and/or to optical imaging systems
EP1290154A2 (en) * 2000-03-01 2003-03-12 Amgen Inc. The identification and use of effectors and allosteric molecules for the alteration of gene expression
JP2004511753A (ja) * 2000-05-04 2004-04-15 イエール　ユニバーシティー タンパク質活性のスクリーニング用タンパク質チップ
US20030096239A1 (en) 2000-08-25 2003-05-22 Kevin Gunderson Probes and decoder oligonucleotides
EP1325341A2 (en) * 2000-10-12 2003-07-09 Icos Corporation Modulation of ligand binding/enzymatic activity of alpha beta proteins
US20030049799A1 (en) * 2000-10-23 2003-03-13 Schwartz John Jacob Engineered stimulus-responsive switches
US7476500B1 (en) * 2001-03-19 2009-01-13 President And Fellows Of Harvard College In vivo selection system for enzyme activity
US20090263851A1 (en) 2001-03-19 2009-10-22 Liu David R In vivo selection system for enzyme activity
AU2002257076A1 (en) 2001-03-19 2002-10-03 President And Fellows Of Harvard College Nucleic acid shuffling
CA2508631A1 (en) * 2002-12-09 2004-06-24 Toolgen, Inc. Regulatory zinc finger proteins
CN1827763B (zh) * 2005-10-21 2010-04-14 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 筛选蛋白质解离肽的双启动子酵母随机肽库的构建方法
CA2667974A1 (en) * 2006-07-05 2008-01-10 The Scripps Research Institute Chimeric zinc finger recombinases optimized for catalysis by directed evolution
ZA200903238B (en) * 2006-12-14 2010-07-28 Dow Agrosciences Llc Optimized non-canonical zinc finger proteins
BRPI0807952A2 (pt) 2007-02-20 2014-06-10 Anaptysbio Inc Sistemas de hipermutação somática
WO2009052476A2 (en) * 2007-10-19 2009-04-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize stress-responsive nac transcription factors and promoter and methods of use
EP2270043A1 (en) * 2009-07-03 2011-01-05 Sanofi-Aventis Extracellular allosteric inhibitor binding domain from a tyrosine kinase receptor
CN106232827A (zh) * 2014-02-21 2016-12-14 哈佛学院董事及会员团体 变构蛋白的从头设计

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