JP2017051143A - 機能性ペプチドをコードするdnaの探索方法及び機能性ペプチドの調製方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】機能性ペプチドをコードするDNA、又は前記DNAを含有するサブライブラリを、原料DNAライブラリから選択する方法。(a)〜(e)の工程を含む機能淘汰方法を実施する。
(a)複数のウェルを有するマイクロアレイ1のウェルに原料DNAライブラリを含有する溶液を分配し、
(b)前記マイクロアレイ1から、マイクロアレイ1と同じ溶液を分配したレプリカであるマイクロアレイ2を調製し、
(c)前記マイクロアレイ1中のDNAを鋳型としてペプチドを合成し、
(d)合成したペプチドの機能を検定し、機能性ペプチドを含むウェルを特定し、
(e)機能性ペプチドを含むウェルと特定されたウェルに相当するマイクロアレイ2のウェルに含まれる溶液を、機能性ペプチドをコードする1種類のDNAを含有する溶液、又は機能性ペプチドをコードする少なくとも1種類のDNAを含むDNAサブライブラリを含有する溶液として回収する。
【選択図】なし
Description
[1]
所望の機能を有するペプチド(以下、機能性ペプチドと呼ぶ)をコードするDNA、又は前記DNAを含有するサブライブラリを、原料DNAライブラリから選択する方法であって、
以下の(a)〜(e)の工程を含む機能淘汰方法を実施する、方法。
(a)複数のウェルを有するマイクロアレイ1の少なくとも一部のウェルに前記原料DNAライブラリを含有する溶液を分配し、
(b)前記溶液を分配したマイクロアレイ1から、マイクロアレイ1と実質的に同じ溶液を分配したレプリカであるマイクロアレイ2を調製し、
(c)前記マイクロアレイ1中のDNAを鋳型としてペプチドを合成し、
(d)合成したペプチドの機能を検定し、機能性ペプチドを含むウェルを特定し、
(e)機能性ペプチドを含むウェルと特定されたウェルに相当するマイクロアレイ2のウェルに含まれる溶液を、機能性ペプチドをコードする1種類のDNAを含有する溶液として回収する、又は機能性ペプチドをコードする少なくとも1種類のDNAを含むDNAサブライブラリを含有する溶液として回収する、ことを含む、方法。
[2]
前記マイクロアレイ1と実質的に同じ溶液を分配したマイクロアレイ2の調製は、
マイクロアレイ1と同一のウェル配列を有するマイクロアレイ2を、マイクロアレイ1とマイクロアレイ2の各ウェルが対向する状態で、マイクロアレイ1のウェルから前記溶液をマイクロアレイ2のウェルに移送し、
その状態を維持しつつ、マイクロアレイ2のウェルから前記溶液をマイクロアレイ1のウェルに返送し、次いで、
前記溶液返送後のマイクロアレイ2のウェルにPCR反応溶液を添加し、
PCR法により前記溶液返送後のマイクロアレイ2のウェル内壁に残存するDNAを増幅して、マイクロアレイ1のレプリカとしてのマイクロアレイ2を得る、ことを含む、[1]に記載の方法。
[3]
マイクロアレイ1及び2は、ウェルの内容積が0.1〜2μLの範囲であり、マイクロアレイ1からマイクロアレイ2への溶液の移送及びマイクロアレイ2からマイクロアレイ1への溶液の返送は、マイクロアレイ1及びマイクロアレイ2をウェルが向かい合わせになるように配置して遠心力を付加することで行う、[2]に記載の方法。
[4]
マイクロアレイ1及び2は、2.5cm平方(=6.25cm2)当たり少なくとも1024個のウェルを有する[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5]
マイクロアレイ1及び2は、ポリカーボネート製であり、かつウェルの内壁の少なくとも一部はBSAの被覆層を有する、[1]〜[4]のいずれかに記載の方法。
[6]
前記(a)〜(e)の工程を少なくとも2回繰返して行い、機能性ペプチドをコードするDNAを得る、[1]〜[5]のいずれかに記載の方法。
[7]
2回目以降の(a)の工程での原料DNAライブラリは、先行する機能淘汰方法の(e)の工程で回収される、機能性ペプチドをコードする少なくとも1種類のDNAを含むDNAサブライブラリを含有する溶液として回収されるサブライブラリである、[6]に記載の方法。
[8]
(b)の工程で得られるマイクロアレイ2の少なくとも一部のウェルに含まれるDNAの種類が1種類または0種類となるまで、機能淘汰方法を繰り返す、[6]又は[7]のいずれかに記載の方法。
[9]
前記原料DNAライブラリは、親和性淘汰方法により得られたDNAライブラリである[1]〜[8]のいずれかに記載の製造方法。
[10]
親和性淘汰方法により得られたDNAライブラリのポピュレーションが10の4乗〜10の7乗であり、
1回目の機能淘汰方法により得られたDNAライブラリのポピュレーションが10の1乗〜10の4乗であり、
2回目の機能淘汰方法により得られたDNAライブラリのポピュレーションが10の0乗〜10の1乗である、
である[9]に記載の方法。
[11]
1回目又は2回目の機能淘汰方法により得られるDNAライブラリのポピュレーションが10の1乗〜10の3乗の範囲となるように、親和性淘汰方法により得られるDNAライブラリのポピュレーションを調整する、[10]に記載の方法。
[12]
[1]〜[11]のいずれかに記載の方法の(e)の工程において、機能性ペプチドをコードする1種類のDNAを含有する溶液として回収された溶液から、ペプチドを合成する、機能性ペプチドの調製方法。
[13]
[1]〜[11]のいずれかに記載の方法の(e)の工程において、機能性ペプチドをコードする少なくとも1種類のDNAを含むDNAサブライブラリを含有する溶液として回収された溶液から、ペプチドを合成する、機能性ペプチドの調製方法。
[14]
前記所望の機能は、酵素活性制御機能又は生理活性制御機能である、[1]〜[13]のいずれかに記載の方法。
本発明の方法は、所望の機能を有するペプチド(機能性ペプチド)をコードするDNA、又は前記DNAを含有するサブライブラリを、原料DNAライブラリから選択する方法であって、以下の(a)〜(e)の工程を含む機能淘汰方法を実施する、方法に関する。
(a)複数のウェルを有するマイクロアレイ1の少なくとも一部のウェルに前記原料DNAライブラリを含有する溶液を分配し、
(b)前記溶液を分配したマイクロアレイ1から、マイクロアレイ1と実質的に同じ溶液を分配したレプリカであるマイクロアレイ2を調製し、
(c)前記マイクロアレイ1中のDNAを鋳型としてペプチドを合成し、
(d)合成したペプチドの機能を検定し、機能性ペプチドを含むウェルを特定し、
(e)機能性ペプチドを含むウェルと特定されたウェルに相当するマイクロアレイ2のウェルに含まれる溶液を、機能性ペプチドをコードする1種類のDNAを含有する溶液として回収する、又は機能性ペプチドをコードする少なくとも1種類のDNAを含むDNAサブライブラリを含有する溶液として回収する。
前記原料DNAライブラリを含有する溶液を、複数のウェルを有するマイクロアレイ1の少なくとも一部のウェルに分配する。
機能性ペプチドが有する所望の機能としては、酵素活性制御機能及び生理活性制御機能を挙げることができる。生理活性制御機能を有するペプチドは、例えば、ガン細胞をアポトーシスに導くシグナルペプチドや免疫系細胞(T細胞やマクロファージなど)を増殖させるサイトカイン的作用を有するペプチドがある。あるいは、未分化神経細胞を分化誘導するペプチドなども挙げることができる。
機能性ペプチドをコードするDNAを含むことが期待されるDNAのライブラリは、天然に存在するDNAのライブラリであることも、人工のペプチドをコードするDNAのライブラリであることもできる。天然に存在するDNAのライブラリとしては、例えば、フグゲノムDNA(非遺伝子配列領域が少ない)の超音波破砕DNA断片やヒト細胞mRNA由来cDNAなどを挙げることができる。但し、これらに限定される意図ではない。また、人工のペプチドをコードするDNAのライブラリとしては、特開2007-332085号公報、特開2007-49911号公報、特開2009-149549号公報等に記載の方法で調製されるDNAのライブラリを挙げることができる。
但し、これらに限定される意図ではない。
前記溶液を分配したマイクロアレイ1から、マイクロアレイ1と実質的に同じ溶液を分配したレプリカであるマイクロアレイ2を調製する。レプリカの調製は例えば、以下の方法で行うことができる。
(2)その状態を維持しつつ、マイクロアレイ2のウェルから前記溶液をマイクロアレイ1のウェルに返送し、次いで、
(3)前記溶液返送後のマイクロアレイ2のウェルにPCR反応溶液を添加し、
(4)PCR法により前記溶液返送後のマイクロアレイ2のウェル内壁に残存するDNAを増幅して、マイクロアレイ1のレプリカとしてのマイクロアレイ2を得る、ことを含む、方法。
レプリカ調製後のマイクロアレイ1中のDNAを鋳型としてペプチドを合成する。DNAを鋳型とするペプチド合成は、公知の方法で行うことができる。例えば、無細胞タンパク質合成方法を利用できる。
工程(c)で合成したペプチドの機能を検定する。検定すべき機能は、所望の機能ペプチドに応じて適宜選択できる。機能性ペプチドが有する所望の機能が酵素活性制御機能である場合、ペプチドの機能検定は、例えば、以下のように実施できる。酵素活性を測定する場合、それが基質(タンパク質、核酸、糖など)を分解するタイプならば、その基質を予めフルオロジャニック[切断前は光らないが、切断後は蛍光性になる基質]なものにしてMMVのウエル中で酵素反応させたとき蛍光の有無で判定することができる[文献:Kitamura et al., J. Pept. Science, 2012]
機能性ペプチドの作用が細胞内に存在する特定のタンパク質をリン酸化すること(その結果、様々な二次的、三次的応答が生じる)である場合、そのリン酸化したタンパク質をELISA法で検出することができる。
具体的には、ペプチドによる刺激を受けた細胞をウエル中で破壊してタンパク質全体を抽出し、別のMMVウエル中に準備した特定タンパク質に対する固定化抗体に結合させる。その状態で二次抗体を作用させて、HRP(Horse radish peroxidase;西洋ワサビペルオキシダーゼ)により発色反応を行うような通常のELISA検出を行うことができる。
機能性ペプチドを含むウェルと特定されたウェルに相当するマイクロアレイ2のウェルに含まれる溶液を、機能性ペプチドをコードする1種類のDNAを含有する溶液として回収する。
工程(a)においてDNA分子種のポピュレーションが103個である原料DNAライブラリを含有する溶液を用い、かつウェルの数が103個であるマイクロアレイを用いて、機能淘汰方法を実施した場合、機能性ペプチドを含有する溶液がいずれかのウェルにおいて得られると想定され、機能性ペプチドをコードする1種類のDNAを含有する溶液をウェルから回収することができる。
1回目の工程(a)においてDNA分子種のポピュレーションが106個である原料DNAライブラリを含有する溶液を用い、かつウェルの数が103個であるマイクロアレイを用いて機能淘汰方法を実施する場合、DNA分子種のポピュレーションが103個であるサブライブラリがいずれかのウェルにおいて得られると想定され、機能性ペプチドをコードする少なくとも1種類のDNAを含有する溶液をウェルから回収することができる。
2回目の工程(a)においてDNA分子種のポピュレーションが103個である原料DNAライブラリを含有する溶液(サブライブラリを含有する溶液)を用い、かつウェルの数が103個であるマイクロアレイを用いて、機能淘汰方法を実施した場合、機能性ペプチドを含有する溶液がいずれかのウェルにおいて得られると想定され、機能性ペプチドをコードする1種類のDNAを含有する溶液をウェルから回収することができる。
親和性淘汰方法により得られたDNAライブラリのポピュレーションが10の4乗〜10の7乗であり、
1回目の機能淘汰方法により得られたDNAライブラリのポピュレーションが10の1乗〜10の4乗であり、
2回目の機能淘汰方法により得られたDNAライブラリのポピュレーションが10の0乗〜10の1乗である、
ことができる。
本発明は、上記本発明の方法の(e)の工程において、機能性ペプチドをコードする1種類のDNAを含有する溶液として回収された溶液から、ペプチドを合成することを含む、機能性ペプチドの調製方法を包含する。
機能性ペプチドをコードする1種類のDNAを含有する溶液からのペプチド合成は、工程(c)におけると同様に、公知の方法で実施できる。
本発明は、上記本発明の方法の(e)の工程において、機能性ペプチドをコードする少なくとも1種類のDNAを含むDNAサブライブラリを含有する溶液として回収された溶液から、ペプチドを合成することを含む、機能性ペプチドの調製方法も包含する。この場合、回収される溶液は、機能性ペプチドをコードする1種類のみのDNAを含有する溶液ではない場合がある。しかし、DNAサブライブラリにおける各ウェルに格納されたDNA分子種のポピュレーションは、低くすることができ、例えば、回収されたDNAサブライブラリのポピュレーションが1種を超え、103種未満、例えば、102種以下、あるいは10種以下の場合、1つのウェルに含まれるDNAの中で、機能性ペプチドをコードするDNAは、1種以下である可能性が高い。このような場合、回収されたサブライブラリを再度、機能淘汰方法に供することなく、ペプチド合成に供することができ、それにより、効率的に機能ペプチドを得ることもできる。
1-1 MMVについて
マイクロアレイMMV(Microarray with Manageable Volumes)は、一辺2.5cm四方に1024個の0.5μlのウェルが整列されたものである(図2A)。このMMVは、1ウェルが0.5 μlである。そのため扱う試料が微量で済むという特性を有する。多数のウェルを並列に反応させることができ、二枚のMMVを重ね合わせることで、溶液をピペットフリーに一斉輸送できる(図2B)。
参考文献
1) Kinoshita, Y. et al. Novel concept microarray enabling PCR and multistep reactions through pipette-free aperture-to-aperture parallel transfer. BMCBiotech, 10:71-86 (2010)
2) Sharma H, et al. Establishment of a reborn MMV-microarray technology: realization of microbiome analysis and other hitherto inaccessible technologies BMC Biotechnology 14: 78-90 (2014).
3) 特開2013−195370号公報
参考文献
4) Hongo, et al. A radioisotope-nondependent high-sensitivity method for measuring the activity of glioblastoma-related O6-methylguanine DNA methyltransferase. doi:10.1016/j.ab.2014.08.012 (2014)
MGMTのメチル転移活性を阻害するペプチドを得るべく、以下のような機能淘汰系を開発した(図5)。まずDNAライブラリをウェルあたり103分子程度になるようにMMV上に撒き(MMV-1)、レプリカ法によりMMV上でのDNAの要素位置情報を複製し、保存する(MMV-1')。次にMMV-1内で無細胞転写・翻訳系を用いてペプチドを発現させ、精製することでペプチドがMMV中に存在する状態を作成する(MMV-2)。これに別のMMV-3を対合してMGMTを移送し、両者を反応させる。その後同様に基質、制限酵素Pst Iを反応させて蛍光を検出する。図5のように、ペプチドがMGMTを阻害した場合、基質は消光したままで、逆に阻害しなかった場合、制限酵素Pst Iによって基質が切断され蛍光が生じる。蛍光強度の低いウェルに対応するレプリカ中からDNAを回収・配列決定することで、目的のペプチドの配列を同定できる。
機能による淘汰法
1-1 用いたDNAコンストラクト
MMVでの機能淘汰においてはcDNAディスプレイで用いたものとは異なる翻訳試薬を用いる。つまり、DNAコンストラクト内に、ペプチドやタグをコードする配列の前後に専用の配列を組み込んである。そのDNAコンストラクトを図6及び配列表の配列番号6に示す。
多段階的に試薬を添加する目的で、フルボリューム(0.5μl/well)よりも容量の小さい、ハーフボリュームMMVチップ(約0.25μl/well)及び追加溶液添加用MMVチップ(約0.04μl/well)を用いた。
1. PDMS CAT及びPDMSを1:9の体積比で良く混合する。
2. (1)のPDMS混合液とシクロヘキサンを4:5になるよう混合する。
3. これをコーティングと同様の操作でMMVウェル内へと充填する。
4. 余分な溶液を入念にふき取り一晩放置する。
5. さらに105℃乾熱棚で1時間焼き固める。
分子の反応容器への吸着を抑える目的でMMVチップ表面へのBSAコーティングをした。
手順
1. MMVチップのウェル存在領域の外側にウレタンフレームを貼りつける。
2. フレーム内を1%BSA溶液で満たし、MMVチップをプラスチックケース内に収納した状態でBSAがMMVウェル内に落とし込まれる方向に遠心力がかかるように3600 rpm、1 min遠心する。
3. その状態で、37℃で3 hインキュベーションし、余分なBSA溶液を吸い取った後、最初と反対方向へ遠心力をかけ、ウェル内部のBSA溶液を排出する。
4. 残留した液滴は自然乾燥させる。
特に記述がない限り、遠心操作はスイング型遠心機(Tomy, MX-150)を用い(3600 rpm, 1 min)の条件とする。
・MMV中でのDNA増幅
1. 以下の溶液を調製する。
3. 1で調製した溶液をフレームのついたMMV(A)に注ぐ。
4. MMV(A)を遠心する。
5. MMV(A)の表面にシリコンテープを貼り付ける。(蒸発防止のため)
6. MMV(A)を以下の条件でPCRを行う。
1. 増幅したDNAの入ったMMV(A)を遠心する。
2. MMV(A)のシリコンテープを剥がし、スペーサーを装着する。
3. 新しくMMV(B)を用意する。
4. MMV(A)をMMV(B)の上に重ね、遠心で移送する。
5. MMV(A)とMMV(B)を上下反対にし、遠心する。[MMV(A)はレプリカ]
6. ハーフボリュームMMV(C)にPCR溶液を入れ、遠心する。
7. MMV(B)の上にMMV(C)を重ね、遠心する。
8. MMV(B)にシリコンテープを貼り付ける。
9. MMV(B)を以下の条件でPCRする。
1. MMV(B)のシリコンテープを剥がし、スペーサーを装着する。
2. クリーンベンチ内でMMV(B)中の溶液の重さが半分になるまで蒸発させる。
3. ハーフボリュームMMV(C)を用意する。
4. MMV(C)に以下の溶液を入れ、遠心する。
6. MMV(B)にシリコンテープを貼り付ける。
7. 37℃、4時間の条件でインキュベーションする。
1. MMV(D)にフレームをつけた上でStreptavidin beads suspension 700μLの溶液を入れ、遠心して、ウエルに入れる。
2. MMV(D)の底に磁石を装着する。
3. MMV(D)のウェルを下向きにし、遠心して上澄み溶液を捨てる。(1500 rpm, 1 min)
4. MMV(B)のシリコンテープを剥がす。
5. MMV(B)をMMV(D)の上に重ね、遠心で移送する。
6. MMV(D)にシリコンテープを貼り付ける。
7. 1時間、室温でMMVの表裏を磁石で交互に重ね、ウェル中のビーズを動かし、混合させる。
8. 3,4と同様に、磁石で磁気ビーズを引き付けながら遠心で上澄み溶液を捨てる。
1. MMV(D)にスペーサーを貼り付ける。
2. ウレタンフレームを装着し、洗浄バッファー(1 M NaCl, 0.1% Triton-Xを含んだPBS)を遠心で移送する。
3. MMV(D)にシリコンテープを貼り付ける。
4. MMV(D)の表裏を磁石で交互に重ねることで、ウェル中のビーズを動かし、溶液を混合させる。
5. MMV(D)のウェルを下向きにし、磁石で磁気ビーズを引き付けながら遠心して上澄み溶液を捨てる。(1500 rpm, 1 min)
6. 1〜5までを3回繰り返す。
基質の準備
1. 以下の条件で試薬を混合する。
所望の機能を有するペプチド(以下、機能性ペプチドと呼ぶ)をコードするDNA、又は前記DNAを含有するサブライブラリを、原料DNAライブラリから選択する方法であって、
以下の(a)〜(e)の工程を含む機能淘汰方法を実施する、方法。
(a)複数のウェルを有するマイクロアレイ1の少なくとも一部のウェルに前記原料DNAライブラリを含有する溶液を分配し、
(b)前記溶液を分配したマイクロアレイ1から、マイクロアレイ1と実質的に同じ溶液を分配したレプリカであるマイクロアレイ2を調製し、
(c)前記マイクロアレイ1中のDNAを鋳型としてペプチドを合成し、
(d)合成したペプチドの機能を検定し、機能性ペプチドを含むウェルを特定し、
(e)機能性ペプチドを含むウェルと特定されたウェルに相当するマイクロアレイ2のウェルに含まれる溶液を、機能性ペプチドをコードする1種類のDNAを含有する溶液として回収する、又は機能性ペプチドをコードする少なくとも1種類のDNAを含むDNAサブライブラリを含有する溶液として回収する、ことを含む、方法。
1. 以下の条件で試薬を混合する。
3. MMV(E)にMGMT mixを600μl入れ、遠心する。
4. MMV(E)をMMV(D)の上に重ね、遠心する。
5. MMV(D)にシリコンテープを貼り付ける。
6. 10分間、37℃でインキュベーションする。
7. 新しくハーフボリュームMMV(F)を用意する。
8. MMV(F)にPst I mixを750μl入れ、遠心する。
9. MMV(F)をMMV(D)の上に重ね、遠心する。
10. 15分間、37℃でインキュベーションする。
11. 新しくMMV(G)を用意する。
12. MMV(G)をMMV(D)の下に重ね、MMV(D)に磁石を置き、磁気ビーズを引き付け遠心する。(1500 rpm, 1 min)
13. MMV(G)には基質を含む上澄み、MMV(D)にはビーズが残る。
14. MMV(G)をイメージャー(FITC filter)で測定する。
(1) 試験管内翻訳産物による簡便活性評価
本項目では機能淘汰によって得られたペプチド配列を化学合成する前に、得られたペプチド配列の活性を簡便な方法(Kitamura, et al. Rapid In Vitro Synthesis of Pico-mole Quantities of Peptides. Chem. Lett. 37, (12) :1250-1251 (2008))で測定した。ここでは淘汰された6種類の配列と、比較用に阻害活性を示さないと考えられる配列を評価した。
1. 以下の条件で試薬を混合する。
1. 以下の条件で溶液を調製する。
4. 1.5 mlチューブを用意する。
5. クローンごとで1.5 mlチューブに以下の条件で溶液を調製する。
7. 6.の1.5 mlチューブにDynabeads MyOne Streptavidin C1を10μL加える。
8. 25℃、1時間振とうしながらインキュベートする。
9. 1.5 mlチューブを磁石に近づけながら、上澄みを除去する。
10. 1×Reaction buffer 100μLを加え、1分間静置。
11. 1.5 mlチューブを磁石に近づけながら、上澄みを除去。
12. 10〜11を3回繰り返し、不純物を除去する。
13. 新しい1.5 mlチューブを2本追加で用意し、1つはペプチドの入っていない状態のMGMTの活性を測定するコントロールA、もう1つを基質のバックグラウンドを測定するためのコントロールBとして使用する。
14. MGMTストック溶液(20 pmol/μL)をReaction bufferで5 pmol/μLに希釈する。
15. 12の工程が完了したチューブと13のAのチューブに14のMGMT 溶液を1μL、2×Reaction bufferを2μL、Milli Qを1μL加える。
16. 37℃、10分間、振とうさせながらインキュベーションする。
17. 16の工程が完了したチューブと13のBのチューブにReaction mixを8μL加える。13BのチューブのみMilli Qを4μL追加する。
18. 37℃、15分間、振とうさせながらインキュベーションする。
19. チューブを磁石に近づけながら、上澄みを384穴プレートの各ウェルに、気泡が混入しないように注意深く移す。
20. プレートリーダーで蛍光強度を測定する。
2. 以下の組成で必要に応じて試薬を混合する。
4. インキュベーションの終わった産物3.にReaction mixを8μL加える。
5. 15分間、37℃でインキュベーションする。
6. インキュベーションが終わった溶液を、384穴プレートの対応するウェルへ、気泡が混入しないよう注意深く移す。
7. プレートリーダーにて、蛍光強度を測定する。
(1)MMVを用いた機能による淘汰
機能による淘汰実験後に検出用のMMVをイメージャーでスキャンした結果を図7に示す。MMVの各ウェルで蛍光強度の差異が見られ、ペプチドによってMGMTの活性が阻害されたウェル(=蛍光強度が低い)と、そうでないウェル(=蛍光強度が高い)が散らばっていることが分かる。目的のペプチドは蛍光強度が低いウェルに存在する可能性が高いため、図7中のP1〜P5に対応するレプリカ中のDNAを回収し、配列決定を行った。また、実験の信頼性を裏付けるためネガティブコントロールとして、蛍光強度の高いウェルで(図7中N1〜N5)に対しても同様に配列決定を行った。
機能による淘汰後の配列決定の結果を図8(A:ポジティブ、B:ネガティブ)に示す。
ウェルあたり4〜9種類の配列を得た。親和性淘汰によって、ライブラリを106分子種にまで絞り込んだと考え、機能淘汰(R2)段階では1ウェルあたり103種類の分子が1コピーずつ入るようにMMVに撒いた。しかし、実際には親和性淘汰の段階で想定以上にライブラリが絞り込まれた(〜106分子種以下)ため、MMV中の複数のウェルに同一の分子が現れたと考えられる。
そこで、MMVでの機能淘汰をこの1ラウンドで完了させ、得られたクローンを個別に活性評価する段階への移行を決定した。
1.淘汰されたペプチドの簡便な活性評価
機能淘汰によって得られた配列の内、コピー数が多い順にポジティブから4つ(候補配列)、ネガティブから3つ(比較用配列)を試験管内翻訳し、簡便な活性評価をした結果を図9に示す。候補配列4種類はすべてMGMT阻害活性を持ち、一方で、比較用配列はいずれも阻害活性を示さなかった。蛍光測定でポジティブな配列とネガティブな配列が、本実験においてそれぞれ期待通りの活性であったことから、先のMMV上での機能淘汰実験が予定通り進行し、さらに蛍光強度によるスクリーニング判定が適切であったことを示している。この結果を受け、強い活性を示しコピー数の多かった配列2種類(GIHIPPIT、KCPSSYYG)を化学合成し、定量的なMGMT阻害活性測定を行うこととした。
MGMT-Inh1とMGMT-Inh2の定量的な活性評価結果を図10に示す。結果を元に両ペプチドのIC50を求めたところ、Inh1が8.3μM、Inh2が60.7μMとなった。
また、比較のために既存のMGMT活性阻害剤として知られている、O6-BGについても阻害活性測定を行った。図11に示す。こちらについてもIC50を求めると303 nMとなった。この値は文献値(400 nM1, 300-620 nM 2 3 4,)と近い値となっており、本実験で得られたIC50の有効性が確かめられた。
2. U. Muhlhausen, et al. Synthesis of 131I-labeled glucose-conjugated inhibitors of O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) and comparison with nonconjugated inhibitors as potential tools for in vivo MGMT imaging J. Med. Chem., 49, 263-272 (2006)
3. J. Reinhard, et al. Monosaccharide-linked inhibitors of O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT): synthesis, molecular modeling, and structure-activity relationships J. Med. Chem., 44, 4050-4061 (2001)
4. J. Reinhard, et al. Inactivation of O6-methylguanine-DNA methyltransferase by glucose-conjugated inhibitors Int. J. Cancer, 93, 373-379 (2001)
配列番号2: MGMT-Qプローブ配列
配列番号3: GMT-affinity1ペプチド配列
配列番号4: MGMT-Inh1ペプチド配列
配列番号5: MGMT-Inh2ペプチド配列
配列番号6: pureflex用コンストラクト完成系
配列番号7: T7-SBR-GGGSプライマー配列
配列番号8:Stop-reverse1プライマー配列
Claims (14)
- 所望の機能を有するペプチド(以下、機能性ペプチドと呼ぶ)をコードするDNA、又は前記DNAを含有するサブライブラリを、原料DNAライブラリから選択する方法であって、
以下の(a)〜(e)の工程を含む機能淘汰方法を実施する、方法。
(a)複数のウェルを有するマイクロアレイ1の少なくとも一部のウェルに前記原料DNAライブラリを含有する溶液を分配し、
(b)前記溶液を分配したマイクロアレイ1から、マイクロアレイ1と実質的に同じ溶液を分配したレプリカであるマイクロアレイ2を調製し、
(c)前記マイクロアレイ1中のDNAを鋳型としてペプチドを合成し、
(d)合成したペプチドの機能を検定し、機能性ペプチドを含むウェルを特定し、
(e)機能性ペプチドを含むウェルと特定されたウェルに相当するマイクロアレイ2のウェルに含まれる溶液を、機能性ペプチドをコードする1種類のDNAを含有する溶液として回収する、又は機能性ペプチドをコードする少なくとも1種類のDNAを含むDNAサブライブラリを含有する溶液として回収する、ことを含む、方法。 - 前記マイクロアレイ1と実質的に同じ溶液を分配したマイクロアレイ2の調製は、
マイクロアレイ1と同一のウェル配列を有するマイクロアレイ2を、マイクロアレイ1とマイクロアレイ2の各ウェルが対向する状態で、マイクロアレイ1のウェルから前記溶液をマイクロアレイ2のウェルに移送し、
その状態を維持しつつ、マイクロアレイ2のウェルから前記溶液をマイクロアレイ1のウェルに返送し、次いで、
前記溶液返送後のマイクロアレイ2のウェルにPCR反応溶液を添加し、
PCR法により前記溶液返送後のマイクロアレイ2のウェル内壁に残存するDNAを増幅して、マイクロアレイ1のレプリカとしてのマイクロアレイ2を得る、ことを含む、請求項1に記載の方法。 - マイクロアレイ1及び2は、ウェルの内容積が0.1〜2μLの範囲であり、マイクロアレイ1からマイクロアレイ2への溶液の移送及びマイクロアレイ2からマイクロアレイ1への溶液の返送は、マイクロアレイ1及びマイクロアレイ2をウェルが向かい合わせになるように配置して遠心力を付加することで行う、請求項2に記載の方法。
- マイクロアレイ1及び2は、2.5cm平方(=6.25cm2)当たり少なくとも1024個のウェルを有する請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- マイクロアレイ1及び2は、ポリカーボネート製であり、かつウェルの内壁の少なくとも一部はBSAの被覆層を有する、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 前記(a)〜(e)の工程を少なくとも2回繰返して行い、機能性ペプチドをコードするDNAを得る、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 2回目以降の(a)の工程での原料DNAライブラリは、先行する機能淘汰方法の(e)の工程で回収される、機能性ペプチドをコードする少なくとも1種類のDNAを含むDNAサブライブラリを含有する溶液として回収されるサブライブラリである、請求項6に記載の方法。
- (b)の工程で得られるマイクロアレイ2の少なくとも一部のウェルに含まれるDNAの種類が1種類または0種類となるまで、機能淘汰方法を繰り返す、請求項6又は7のいずれかに記載の方法。
- 前記原料DNAライブラリは、親和性淘汰方法により得られたDNAライブラリである請求項1〜8のいずれかに記載の製造方法。
- 親和性淘汰方法により得られたDNAライブラリのポピュレーションが10の4乗〜10の7乗であり、
1回目の機能淘汰方法により得られたDNAライブラリのポピュレーションが10の1乗〜10の4乗であり、
2回目の機能淘汰方法により得られたDNAライブラリのポピュレーションが10の0乗〜10の1乗である、
である請求項9に記載の方法。 - 1回目又は2回目の機能淘汰方法により得られるDNAライブラリのポピュレーションが10の1乗〜10の3乗の範囲となるように、親和性淘汰方法により得られるDNAライブラリのポピュレーションを調整する、請求項10に記載の方法。
- 請求項1〜11のいずれかに記載の方法の(e)の工程において、機能性ペプチドをコードする1種類のDNAを含有する溶液として回収された溶液から、ペプチドを合成する、機能性ペプチドの調製方法。
- 請求項1〜11のいずれかに記載の方法の(e)の工程において、機能性ペプチドをコードする少なくとも1種類のDNAを含むDNAサブライブラリを含有する溶液として回収された溶液から、ペプチドを合成する、機能性ペプチドの調製方法。
- 前記所望の機能は、酵素活性制御機能又は生理活性制御機能である、請求項1〜13のいずれかに記載の方法。
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