JP2001253899A - ペプチドライブラリーの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 分子内ジスルフィド結合を有するペプチドの
多数の変異体を効率的に合成するための新しい方法を確
立すること。 【解決手段】 ２以上の分子内ジスルフィド結合を有す
るペプチド及びその１以上の変異体から成るペプチドラ
イブラリーの製造方法であって、（１）変異部位に導入
されるアミノ酸として２以上のアミノ酸から成るアミノ
酸混合物を供給してペプチドの化学合成を行うことによ
って、ペプチドとその１以上の変異体を同時に化学合成
してペプチド混合物を調製する工程；（２）工程（１）
で調製されたペプチド混合物中のペプチドを溶液中で空
気酸化することによって分子内ジスルフィド結合を形成
させる工程；及び（３）分子内ジスルフィド結合を形成
したペプチド及びその１以上の変異体の混合物を分離す
る工程：を含む、ペプチドライブラリーの製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はペプチドライブラリ
ーの製造方法に関する。より詳細には、本発明はジスル
フィド結合を含むペプチドとその１以上の変異体から成
るペプチドライブラリーの製造方法、並びに当該ペプチ
ドライブラリーを用いた生理活性物質のスクリーニング
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】電位差感受性カルシウムチャンネルは多
くの生物学的プロセス（例えば、神経伝達物質の放出、
筋収縮など）を制御しており、電気生理学的性質に基づ
いてＬ型、Ｎ型、Ｐ／Ｑ型、Ｒ型またはＴ型カルシウム
チャンネルに分類される（Nooney, J.M., et al. (199
7) Trends Pharmacol. Sci. 18, 363-371）。その分子
構造の相違はα₁サブユニットの多様性に由来するが（B
irnbaumer, L., et al., (1994) Neuron 13, 505-50
6）、全カルシウム電流に対する各チャンネルの寄与
は、特異的ブロッカーを用いることによって薬理学的に
分析される。ω−コノトキシンは各種ブロッカーの中で
も最も有望なものの一つであり、特にＮ型およびＰ／Ｑ
型カルシウムチャンネルを効率的にブロックする（Oliv
era,B.M., et al. (1994) Annu.Rev.Biochem. 63, 823-
867）。ω−コノトキシンＧＶＩＡ及びω−コノトキシ
ンＭＶIIＡはＮ型チャンネルに結合し、ω−コノトキシ
ンＭＶIIＣはＰ／Ｑ型チャンネルに高親和性で結合し、
Ｎ型チャンネルに低親和性で結合する。Ｎ型及びＰ／Ｑ
型カルシウムチャンネルは、シナプス前部神経末端にお
ける神経伝達物質の放出を調節し、神経系で重要な役割
を担い、ω−コノトキシンを用いてこれらのチャンネル
を識別することは各チャンネルの生理活性を解明する上
で重要である。

【０００３】ω−コノトキシンＧＶＩＡ（Sevilla, P.,
et al. (1993) Biochem.Biophys.Res.Commun. 192, 12
38-1244; Davis, J.H., et al. (1993) Biochemistry 3
2, 7396-7405; Pallaghy, P.K., et al. (1993) J.Mol.
Biol. 234, 405-420;及びSkalicky, J.J., et al. (199
3) Protein Sci. 2, 1591-1603）、ＭＶIIＡ（Kohno,
T., et al. (1995) Biochemistry 34, 10256-10265; Ba
sus, V.J., et al. (1995) FEBS Lett. 370, 163-169;
及びNielsen, K.J., et al. (1996) J.Mol.Biol.263, 2
97-310）、及びＭＶIIＣ（Nemoto, N., et al (1995)
Biochem.Biophys.Res.Commun. 207, 695-700;及びFarr-
Jones, S., et al. (1995) J.Mol.Biol.248, 106-124）
の三次元構造を核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析により調べた
結果、これらのコノトキシンは同一の構造モチーフを有
することが判明した。Ａｌａの単独置換実験の結果か
ら、カルシウムチャンネルへの結合に重要な残基はＴｙ
ｒ１３とＬｙｓ２であると同定されたが（Sato, K., et
al (1993) Biochem.Biophys.Res.Commun. 194, 1292-1
296; Kim, J.-I, et al (1994) J.Biol.Chem. 269, 238
76-23878; Kim, J.-I, et al (1995) Biochem.Biophy
s.Res.Commun. 206, 449-454; Kim, J.-I, et al (199
5) Biochem.Biophys.Res.Commun. 214, 305-309; Nadas
di, L., et al. (1995) Biochemistry 34, 8076-8081;
及びLew, M.J., et al. (1997) J.Biol.Chem. 272, 120
14-12023）、チャンネル特異性を決定する残基は未だ明
らかにされていない。ＭＶIIＡと配列類似性が高いＭＶ
IIＣはＮ型チャンネルよりもＰ／Ｑ型チャンネルに効率
的に結合するという事実から、ＭＶIIＣはＮ型チャンネ
ルとＰ／Ｑ型チャンネルにおける孔形成領域の構造上の
相違を明らかにするためのツールとして使用できること
が示唆されている（Sato, K., et al (1997) FEBS Let
t. 414, 480-484; 及びNielsen, K.J., et al (1999)J.
Mol.Biol. 289, 1405-1421）。Ｎ型チャンネルとＰ／Ｑ
型チャンネルに対する選択性を決める残基を調べるため
には、ＭＶIIＣ変異体を多数作製して評価することが必
要である。

【０００４】ω−コノトキシンＭＶIIＣのようなジスル
フィド結合を含むペプチドを効率的に化学合成するため
には、システインの酸化条件を適切に選択することによ
り、正確な組み合わせのジスルフィド結合を有するペプ
チドを優先的に生成する必要がある。例えば、３つのジ
スルフィド結合を有するペプチドを合成する場合、６つ
のシステインの組み合わせは１５通り存在し、その中の
１つの組み合わせが優先的に形成される条件を選択する
必要がある。ジスルフィド結合を形成するための一般的
方法としては、酸化還元剤を共存させる等の適当な条件
を選択して空気酸化を行う方法が挙げられる。しかし、
最も効率的な条件を用いてもジスルフィド結合の組み合
わせに基づく異性体の生成を完全に回避することは困難
である。上述の通り、ジスルフィド結合を有するペプチ
ドの化学合成は困難であることから、ジスルフィド結合
を含むペプチドを化学合成する場合には、１回の化学合
成で１種類のペプチドのみを合成するのが一般的であ
る。

【０００５】また２種類以上のペプチドを同時に調製す
る方法としては、遺伝子組み換え技術による発現系を用
いる方法が知られている。しかし、ジスルフィド結合を
含むペプチドを発現させる場合には目的物が一つであっ
ても効率的な発現系の構築は困難であり、スクリーニン
グ系と組み合わせた２種類以上のペプチドの発現系の構
築はさらに困難であった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】分子内ジスルフィド結
合を有するペプチド、特には２つ以上の分子内ジスルフ
ィド結合を有するペプチドの中には有用な生理活性を有
するペプチドがある。例えば、上述したω−コノトキシ
ンＭＶIIＣのような選択的イオンチャンネルブロッカー
は多種多様なイオンチャンネルの作用や役割を解明する
上で必須と言える分子ツールであるばかりでなく、医薬
としての実用性も期待されている。イモ貝やクモなどの
毒腺から得られる天然の選択的イオンチャンネルブロッ
カーは、１０から６０程度のアミノ酸残基の中にジスル
フィド結合を複数含むペプチドであり、これらの構造活
性相関研究は選択性の解明や医薬のデザインなどにおい
て大きな意義を有している。構造活性相関関係の研究に
おいては天然物のアミノ酸残基を置換して多数の変異体
を合成することが必要であるが、前述した通り、分子内
ジスルフィド結合を含むペプチドの合成は１回の化学合
成で１種類のペプチドを合成するのが一般的である。多
数の変異体を１種類ずつ合成することはコストや時間な
どの観点から効率が悪く、有用な変異体を迅速に開発す
る妨げになっていた。そこで、分子内ジスルフィド結合
を有するペプチドの多数の変異体を効率的に合成するた
めの新しい方法を確立することが望まれていた。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意検討した結果、ペプチド自動合成機
を用いてペプチドを化学合成する際に、変異部位に導入
するためのアミノ酸として２種類以上の保護アミノ酸の
混合物が封入されたカートリッジを通常の１種類の保護
アミノ酸が封入されたカートリッジの代わりに用いるこ
とによって、保護基を有するペプチド前駆体の混合物を
同時に化学合成し、これらのペプチド前駆体を脱保護し
た後、好適な条件下で分子内ジスルフィド結合を形成す
ることによって、少なくとも２以上の分子内ジスルフィ
ド結合を有するペプチド及びその１以上の変異体から成
るペプチドライブラリーを簡便かつ効率的に製造できる
ことを見出し、本発明を完成するに至った。

【０００８】即ち、本発明によれば、２以上の分子内ジ
スルフィド結合を有するペプチド及びその１以上の変異
体から成るペプチドライブラリーの製造方法であって、
（１）変異部位に導入されるアミノ酸として２以上のア
ミノ酸から成るアミノ酸混合物を供給してペプチドの化
学合成を行うことによって、ペプチドとその１以上の変
異体を同時に化学合成してペプチド混合物を調製する工
程；（２）工程（１）で調製されたペプチド混合物中の
ペプチドを溶液中で空気酸化することによって分子内ジ
スルフィド結合を形成させる工程；及び（３）分子内ジ
スルフィド結合を形成したペプチド及びその１以上の変
異体の混合物を分離する工程：を含む、ペプチドライブ
ラリーの製造方法が提供される。

【０００９】好ましくは、変異部位のアミノ酸残基は、
分子内ジスルフィド結合を形成するシステイン残基以外
のアミノ酸である。好ましくは、変異部位に導入される
アミノ酸がシステイン以外のアミノ酸である。好ましく
は、分子内ジスルフィド結合を形成したペプチド及びそ
の１以上の変異体の混合物はゲル濾過クロマトグラフィ
ーによって分離される。好ましくは、ペプチドはω−コ
ノトキシンＭＶIIＣである。

【００１０】本発明の別の側面によれば、上記した本発
明の方法により製造されるペプチドライブラリーが提供
される。本発明のさらに別の側面によれば、本発明の方
法により製造されるペプチドライブラリー中の各ペプチ
ドの生物学的活性を対照ペプチドの生物学的活性と比較
し、対照ペプチドよりも有用な生物学的活性を示すペプ
チドを選択することを含む、変異ペプチドのスクリーニ
ング方法が提供される。本発明のさらに別の側面によれ
ば、本発明のスクリーニング方法により得られる変異ペ
プチドが提供される。

【００１１】本発明の一態様によれば、本発明の方法に
より製造したω−コノトキシンＭＶIIＣとその変異体か
ら成るペプチドライブラリー中の各ω−コノトキシンＭ
ＶIIＣ変異体の生理活性を野生型ω−コノトキシンＭＶ
IIＣの生理活性と比較し、Ｐ／Ｑ型カルシウムチャンネ
ルに対する阻害活性の選択性が野生型ω−コノトキシン
ＭＶIIＣの選択性よりも高い変異体を選択することを含
む、ω−コノトキシンＭＶIIＣの変異体のスクリーニン
グ方法、上記方法により得られるω−コノトキシンＭＶ
IIＣの変異体、並びに上記ω−コノトキシンＭＶIIＣ変
異体を含む、（Ｐ／Ｑ型）カルシウムチャンネルブロッ
カーが提供される。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明は、少なくとも２以上の分
子内ジスルフィド結合を有するペプチド及びその１以上
の変異体から成るペプチドライブラリーの製造方法に関
する。分子内ジスルフィド結合とは、一つのペプチド鎖
中の２つのシステイン残基により形成されるジスルフィ
ド結合を意味する。本発明で製造されるペプチドはこの
ような分子内ジスルフィド結合を少なくとも２以上有す
る。

【００１３】本明細書で言うペプチドとは、２個以上の
アミノ酸がペプチド結合によって結合したものを広く意
味し、オリゴペプチド又はポリペプチド等の全てを包含
し、その鎖長は特に制限されないが、ペプチド合成機で
化学合成できる程度の長さを有するものが好ましい。本
明細書で言うペプチドの変異体とは、あるペプチドのア
ミノ酸配列において１以上のアミノ酸が置換しているペ
プチド、あるいはあるペプチドに対して１以上のアミノ
酸がＮ末端又はＣ末端に付加されたペプチドを意味す
る。１以上のアミノ酸が置換している場合、置換される
部位の数は特に制限されず、１以上の部位のアミノ酸を
置換することができるが、置換される部位の数は合成後
変異体を分離するためには、現在の分離技術から一般的
には１から数個であり、好ましくは１から１０個、より
好ましくは１から５個である。１以上のアミノ酸が付加
される場合、付加されるアミノ酸残基の数は特に制限さ
れないが、一般的には１から数個であり、好ましくは１
から１０個、より好ましくは１から５個である。

【００１４】本明細書で言うペプチドライブラリーと
は、あるペプチド並びにその１以上の変異体から構成さ
れるペプチド混合物を意味する。ペプチドの変異体は上
述した通りのものであり、ペプチドライブラリー中のペ
プチド変異体の数は特に制限されない。ペプチド変異体
の数は、ペプチド化学合成の際にアミノ酸変異を導入す
る部位の数と、ある部位に変異として導入されるアミノ
酸の種類の数に依存する。

【００１５】ペプチド自動合成機を用いたペプチドの固
相合成法は当業者に周知である。合成すべきペプチドの
カルボキシル末端のアミノ酸残基を導入した不活性樹脂
を装置内の容器に入れ、そこにアミノ酸を１残基ずつ導
入し、ペプチド鎖を伸長させていく。α位のアミノ基の
保護基の除去、ペプチド結合の形成、過剰な試薬を除去
するための樹脂の洗浄などの一連の操作を一定のプログ
ラムに従って実行できるように構成されている。アミノ
酸の導入には、９−フルオレニルメトキシカルボニル
（Ｆｍｏｃ）化アミノ酸又はｔ−ブトキシカルボニルア
ミノ酸（Ｂｏｃアミノ酸）が主として用いられている。
ペプチド自動合成機を使って先ず樹脂上でペプチドを合
成し、次にこの樹脂を化学的に処理してペプチドを樹脂
から取り出し、これをさらに高速液体クロマトグラフィ
ーなどで精製することにより目的ペプチドを得ることが
できる。

【００１６】本発明の方法では、ペプチド自動合成機上
において複数の保護アミノ酸の混合物を封入したカート
リッジを通常のカートリッジの代わりに用いる以外は、
通常のペプチドの固相合成法と同様にして、保護基を有
するペプチド前駆体を合成することができ、また脱保護
も通常のペプチド合成の手法を用いて行うことができ
る。ペプチド前駆体の混合物を適当な溶液に溶解してジ
スルフィド結合の形成を同時に行った後、ゲル濾過によ
り目的物を含むモノマー画分を分離する。さらにイオン
交換クロマトグラフィーと逆相クロマトグラフィーの組
み合わせなどによって複数の目的物を分離かつ精製す
る。以上の方法は、ジスルフィド結合を含む多種多様な
ペプチドの合成に適用が可能である。

【００１７】保護基を有するペプチド前駆体の固相合成
はペプチド自動合成機上においてＦｍｏｃ法、Ｂｏｃ法
の何れを用いても通常の方法で行うことができる。以
下、Ｆｍｏｃ法による合成例についてより詳細に説明す
る。保護基の略称は次の通りである。 Ｂｏｃ：tert−ブチルオキシカルボニル基； ｔＢｕ：tert−ブチル基； Fmoc：９−フルオレニルメトキシカルボニル基； OtBu：tert−ブチルエステル基； Pmc：2,2,5,7,8−ペンタメチルクロマン−６−スルホニ
ル基； Trt：トリチル基

【００１８】目的物のＣ末端を考慮して、合成機の反応
容器に適当な樹脂を加える。例えば、Ｃ末端がアミド化
された目的物に対しては、４−（２’，４’−ジメトキ
シフェニル−Fmoc−アミノメチル）フェノキシアセトア
ミドエチル樹脂のようなアミド樹脂を用いる。以下、配
列に従い、Fmocアミノ酸（Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pmc)
-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys
(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmo
c-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc
-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、
Fmoc-Val-OHなど）のカートリッジをセットする。複数
の置換を導入する部位に対しては、Fmocアミノ酸の合計
が規定の等量になるようにカートリッジに詰める。修飾
アミノ酸や非天然型アミノ酸のFmoc体も同様に導入する
ことができる。通常の方法で合成機を作動させ、Fmoc法
の原理に従い、Ｎ末端の脱保護と縮合を繰り返して合成
されたペプチド樹脂の混合物を合成機から取り出して乾
燥する。

【００１９】樹脂からの切り出しと側鎖の脱保護もFmoc
法で合成された通常のペプチドと同様に行う。具体的に
は、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）：水：エタンジチオー
ル：チオアニソール：フェノール＝８．２５：０．５：
０．２５：０．５：０．７５（体積比）の割合で混合し
た溶液を氷冷下でペプチド樹脂に加える。溶液の量はペ
プチド樹脂０．５ｇに対して１０ｍｌ程度とし、室温に
戻しつつ３時間撹拌する。冷ジエチルエーテルを溶液の
約１０倍量加えてペプチドを沈殿させ、グラスフィルタ
ー上で濾過し、ジエチルエーテルで洗浄する。２Ｍ酢酸
などの適当な酸性水溶液でペプチドを抽出する。

【００２０】ペプチドの抽出液、あるいはこれを凍結乾
燥して得られた固体を再溶解して得られた溶液を適当な
弱アルカリ性緩衝液に加え、空気酸化によりジスルフィ
ド結合をペプチド混合物の状態において形成する。前駆
体混合物の濃度、緩衝液の組成、酸化還元剤の量比など
は天然物の合成などにおいて確立された条件を用いる。
例えば、ω−コノトキシンの場合、ペプチド中の３つの
ジスルフィド結合は一般に、酸化型および還元型グルタ
チオン存在下に溶液中で室温または４℃で一定の時間に
渡って空気酸化することにより形成することができる。

【００２１】またＰ／Ｑ型カルシウムチャンネルブロッ
カーであるω−コノトキシンＭＶIIＣの変異体の場合、
０．０５ｍＭのペプチドをグルタチオン酸化型１０等
量、還元型１００等量の共存下で１ｍＭのエチレンジア
ミン四酢酸を含む１．０Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．８〜８．０）中４℃で２〜４日間撹拌して空気酸
化を行い、ジスルフィド結合を形成させる。酢酸をｐＨ
が４．５以下になるように加えて反応を停止させ、ＴＦ
Ａを約０．１％加えておく。反応溶液量が少なく塩濃度
も低い場合は凍結乾燥によりペプチド混合物を固体とし
て得ることができるが、そうでない場合は溶液を濾過し
た後、中圧ポンプなどでペプチドをＯＤＳ（オクタデシ
ルシラン）カラムなどに吸着させ、アセトニトリルを含
む酸性水溶液で溶出させて濃縮する。

【００２２】精製の方法は混合物の一部を分析してクロ
マトグラム上における目的物の分離パターンを調べるこ
とにより決定できるが、目的物が多い場合は一般に異な
るクロマトグラフィーを組み合わせて用いることが必要
となる。ω−コノトキシンMVIIC変異体の混合物を例に
すると、先ずゲル濾過により分子内ジスルフィド結合を
形成したモノマーペプチドを分子間でジスルフィド結合
を形成したポリマーから分離する。続いてモノマーをＣ
Ｍ−セルロースを用いたイオン交換クロマトグラフィー
で複数の画分に分け、最後に各画分に含まれる目的物を
ＯＤＳカラムを用いた逆相クロマトグラフィーで単離精
製する。逆相クロマトグラフィーだけでは分離できない
複数の目的物もイオン交換クロマトグラフィーで予め分
離しておくことにより精製が可能となる場合が多い。

【００２３】目的物の同定は先ず質量分析を用いて行
う。分子量が近似の目的物が複数ある場合は、アミノ酸
残基特異的な酵素を用いて限定加水分解を行い、断片化
されたペプチドを分析する方法が効果的である。限定加
水分解による断片化は目的物が本来のペプチドと同じジ
スルフィド結合を有しているか否かを確認する上でも役
立つ。ジスルフィド結合の組み合わせが本来のペプチド
と異なる異性体はクロマトグラフィー上において溶出時
間に顕著な差を示すことが多く、目的物を暫定的に同定
する上での１つの指標となる。

【００２４】適正な分子内ジスルフィド結合を形成する
ための条件および適正な分子内ジスルフィド結合を有す
るペプチドの精製法が確立されているペプチドに関して
は、目的ペプチドを異性体から分離することは比較的容
易であり、複数の変異体を同時に化学合成することが可
能である。また、活性評価に用いるペプチドの量は比較
的少量でよい場合が多く、ペプチド自動合成機での反応
スケールから活性評価の対象となり得る目的ペプチドを
多数得ることも十分可能である。

【００２５】本発明はまた、上記した方法により製造さ
れるペプチドライブラリーをも提供する。本発明のペプ
チドライブラリーには、２以上の分子内ジスルフィド結
合を有するペプチドおよびその１以上の変異体から構成
される。このようなペプチドライブラリーは、有用な生
理活性物質の探索のために出発材料として有用である。
天然の生理活性ペプチドの中にはアミノ酸変異を導入す
ることによってさらに優れた生理活性を有するものも多
く存在する。そのような優れた生理活性を有する変異ペ
プチドを探索するためには、多数の変異ペプチドを合成
し、それらを所望の生理活性についてスクリーニングす
ることが必要である。本発明のペプチドライブラリーを
そのようなスクリーニングに供することによって、所望
の変異ペプチドを同定することが可能になる。

【００２６】従って、本発明はさらに、上記した方法に
より製造されるペプチドライブラリー中の各ペプチドの
生物学的活性を対照ペプチドの生物学的活性と比較し、
対照ペプチドよりも有用な生物学的活性を示すペプチド
を選択することを含む、変異ペプチドのスクリーニング
方法も提供する。本発明のスクリーニング法の実施に際
しては、ペプチドライブラリーから各ペプチドを予め分
離しておくことが好ましい。ペプチドの分離方法は特に
限定されず、逆相クロマトグラフィーやイオン交換クロ
マトグラフィーなど当分野で公知のペプチド分離技術を
用いて行うことができる。

【００２７】単離した各ペプチドの生物学的活性はそれ
ぞれの生物学的活性をアッセイするために確立されたア
ッセイ系で行う。例えば、あるタンパク質（標的タンパ
ク質）との結合活性や相互作用を調べる場合には、標的
タンパク質と変異ペプチドを接触させた後、その結合物
を検出することにより結合活性または相互作用を測定で
きる。あるいは、標的タンパク質（受容体）とそのリガ
ンドとその変異リガンドとを接触させて、標的タンパク
質への結合に関してリガンドと変異リガンドとを競合さ
せることにより当該変異リガンドと標的タンパク質との
結合活性または相互作用を検出することもできる。本発
明の一例として以下の実施例ではω−コノトキシンＭＶ
IIＣとその変異体から成るペプチドライブラリーを製造
し、各ω−コノトキシンＭＶIIＣ変異体の生理活性を野
生型ω−コノトキシンＭＶIIＣの生理活性と比較し、Ｐ
／Ｑ型カルシウムチャンネルに対する阻害活性の選択性
が野生型ω−コノトキシンＭＶIIＣの選択性よりも高い
変異体を探索した。

【００２８】本発明はまた、上記のようなスクリーニン
グ法により得られる変異ペプチドも提供するものであ
り、このような具体例としては、Ｐ／Ｑ型カルシウムチ
ャンネルに対する阻害活性の選択性が野生型ω−コノト
キシンＭＶIIＣの選択性よりも高いω−コノトキシンＭ
ＶIIＣの変異体が挙げられる。Ｐ／Ｑ型カルシウムチャ
ンネルに対する阻害活性の選択性が野生型ω−コノトキ
シンＭＶIIＣの選択性よりも高いω−コノトキシンＭＶ
IIＣの変異体は、Ｐ／Ｑ型カルシウムチャンネルに選択
的なカルシウムチャンネルブロッカーとして、Ｐ／Ｑ型
カルシウムチャンネルの生理活性を解明する上で有用で
ある。以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説
明する。以下の実施例に示す材料、試薬、割合、操作等
は、本発明の精神から逸脱しない限り適宜変更すること
ができる。しがたって、本発明の範囲は以下に示す具体
例に限定されるものではない。

【００２９】

【実施例】（Ａ）材料と方法 （Ａ−１）材料 ペプチド合成機で使用するＦｍｏｃ−アミノ酸、Ｆｍｏ
ｃ−アミド樹脂および他の試薬は、Perkin-Elmer Appli
ed Biosystems Japan（千葉、日本）から購入した。［
¹²⁵Ｉ］ＧＶＩＡ及び［¹²⁵Ｉ］ＭＶIIＣはＮＥＮ（ボス
トン，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入した。

【００３０】（Ａ−２）ペプチドの合成と精製 固相ペプチド合成は、Perkin-Elmer Applied Biosystem
s 433Aペプチド合成機を用いて行った。マトリックス・
アシスティッド・レーザー脱着／イオン化飛行時間質量
スペクトル（MALDI-TOF-MS）は、マトリックスとしてα
−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸を使用してPerSeptive
Biosystems Voyager Linear DE質量スペクトル測定器
において測定した。分析用ＨＰＬＣは、オクタデシルシ
ラン（ＯＤＳ）カラム（4.6×250mm）を用いてShimadzu
LC-6Aシステムで行った。分取用ＨＰＬＣはＯＤＳカラ
ム（20×250mm）を用いてShimadzu LC-8Aシステムで行
った。

【００３１】置換部位に導入すべき２種類以上のＦｍｏ
ｃ−アミノ酸は、その全量がプログラムに基づいて適正
な量となるように各々等モル量を通常のカートリッジ内
に装填した。合成および精製の他の工程はω−コノトキ
シンＭＶIIＣ変異体の製造に関して既報されている通り
に行った（Sato, K., et al., (1997) FEBS Lett. 414,
480-484）。簡単に言うと、先ずＦｍｏｃ固相合成の通
常のオペレーションにより組み立てω−コノトキシンＭ
ＶIIＣ変異体の直鎖状前駆体を脱保護し、空気酸化し
た。酸化したペプチドを中圧ポンプを用いてＯＤＳカラ
ムで濃縮し、モノマーペプチドを粗ペプチド混合物から
Sephadex G-50Fを用いたクロマトグラフィーにより単離
し、CM-セルロースCM-52上でのクロマトグラフィーによ
りフラクションに分離した。各変異体はＯＤＳカラムを
用いた分取用ＨＰＬＣにより各フラクションから最終的
に精製し、MALDI-TOF-MS測定により同定した。得られた
変異体のうち、変異体３４（表１中）をスペクトル分析
用に大量に再合成した。

【００３２】（Ａ−３）結合活性 ラット小脳Ｐ₂膜を既報の通りに調製し（Martin-Mouto
t, et al., (1995) FEBS Lett. 366, 21-25）、フィル
ター結合アッセイを既報の方法に改良を加えて行った。
ω−コノトキシンＧＶＩＡとの競合実験においては、変
異体および［¹²⁵Ｉ］ＧＶＩＡを、０．０４％ウシ血清
アルブミン（ＢＳＡ）を含有する２５ｍＭのTris-HEPES
緩衝液５０μｌ中においてＰ₂膜（１０μｇ）と一緒に
４℃で１．５時間インキュベートした。混合物を０．１
６Ｍ塩化コリン及び０．１％ＢＳＡを含有する氷冷した
０．８ｍＭのTris-HEPES緩衝液で希釈し、次いで同じ緩
衝液に浸したＧＦ／Ｃフィルター（Whatman）で減圧下
速やかに濾過した。フィルターを氷冷した緩衝液で２回
洗浄し、その放射活性をγ−カウンターで測定した。ω
−コノトキシンＭＶIIＣとの競合実験においては、変異
体および［¹²⁵Ｉ］ＭＶIIＣを、０．１％ＢＳＡを含有
するTris緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）（１５０ｍＭのＮ
ａＣｌ、２５ｍＭのTris-HCl、ｐＨ７．４に調整）５０
μｌ中においてＰ₂膜（１０μｇ）と一緒に４℃で１．
５時間インキュベートした。混合物を１．５ｍＭのＣａ
Ｃｌ₂、０．１％ＢＳＡおよび０．０５％Tween-20を含
有する氷冷したＴＢＳで希釈し、次いで０．０３％ポリ
エチレンイミンで予め処理したＧＦ／Ｃフィルターで減
圧下速やかに濾過した。フィルターを希釈に使用した氷
冷した緩衝液で２回洗浄した。両方のアッセイにおい
て、結合は３回測定し、非特異的結合は競合物質として
１μＭの未標識のＧＶＩＡ又はＭＶIIＣを使用すること
によって評価した。

【００３３】（Ａ−４）ＮＭＲ分析¹ Ｈ−ＮＭＲスペクトルはBruker DRX-500 スペクトル測
定器で５００ＭＨｚで作動させて２８８Ｋで測定した。
試料は、９０％Ｈ₂Ｏ／１０％Ｄ₂Ｏ中ｐＨ４で９ｍＭの
濃度で調製した。

【００３４】（Ｂ）結果 （Ｂ−１）ＭＶIIＣ変異体の合成と精製 置換すべき残基は、ω−コノトキシンＭＶIIＣの構造活
性相関関係に関するこれまでの研究に基づいて選択し
た。配列および置換は図１に示す（ＭＶIIＣのアミノ酸
配列は配列表１に示す）。ラン１においては、活性に必
須な３つの残基（Ｌｙｓ２、Ｍｅｔ１２、及びＴｙｒ１
３）を活性及び選択性の有意な変更を生じさせることが
予測される残基で置換した。ラン２においては、これま
での研究（Sato, K., et al., (1999) Peptide Science
1998 (Kondo, M., ed,), pp.29-32, Protein Research
Foundation, Osaka）で活性に重要な残基として同定さ
れなかった残基の代りに塩基性残基を導入した。ラン３
およびラン４の置換の組み合わせは、ラン２からの変異
体の分析で得られた結果に基づいて選択した。幾つかの
電荷を有する残基（即ち、Ｌｙｓ４、Ａｓｐ１４、及び
Ｌｙｓ２５）の置換をラン３およびラン４において導入
した。また、ＭＶIIＣのＮ末端はＮＭＲ分析で測定した
溶液構造において溶媒に露出しているという事実に基づ
いて、ラン５およびラン６ではＮ末端の伸長の効果を調
べるために変異体の構築を行った。

【００３５】保護された直鎖状前駆体の混合物を、通常
のＦｍｏｃ固相法で合成し、各ランにおける全前駆体を
ＨＰＬＣ及び質量分析で検出した。直鎖状前駆体の粗製
混合物を酸化によるジスルフィド結合形成に付してＭＶ
IIＣ変異体の混合物を得た。この混合物は、多種多様な
不純物（即ち、ポリマー、ジスルフィド結合異性体な
ど）を含有しているが、これは単一の変異体の通常の製
造でも見られる現象である。ポリマーはゲル濾過によっ
て除去し、モノマーをイオン交換クロマトグラフィーに
よって複数のグループに分離し、逆相ＨＰＬＣ及びMALD
I-TOF-MS測定により分析した。変異体のジスルフィド結
合の組み合わせに基づく異性体は質量分析によって区別
することはできないが、ＭＶIIＣと同一のジスルフィド
結合の組み合わせを有する変異体はＨＰＬＣプロフィー
ルの突出したピークに該当した。ラン１で得られた各フ
ラクションのイオン交換クロマトグラフィーのプロフィ
ール及びＨＰＬＣプロフィールを図２に示す。

【００３６】表１に記載した精製ペプチドは全て放射標
識したＭＶIIＣと１０^-7Ｍの濃度で競合したので、それ
らは異性体ではなくＭＶIIＣ変異体とみなした。これ
は、カルシウムチャンネルはω−コノトキシンを非常に
厳密な様式で認識し、異性体がチャンネルに特異的に結
合する可能性は低いためである。ジスルフィド結合の組
み合わせを決定して最終確認するべきであるが、ＭＶII
ＣよりＰ／Ｑ型カルシウムチャンネルに特異的なブロッ
カーを開発することが目的であったので、最も強力な変
異体についてのみ構造を調べた。

【００３７】単離した変異体と変異体の理論数の比率
は、ラン１〜６において各々１１／１２、１０／１６、
１０／１８、９／１６、２／３及び８／９であった。除
外された変異体のうち幾つかは単離するのに不十分な量
しか生成せず、また幾つかは上手く精製できなかった。
例えば、Ａｓｐ１４をＡｓｎで置換すると、正確な折り
畳みが妨げられるようであり、Ａｓｎ１４を含むはずの
幾つかの変異体はラン４において単離されなかった。ラ
ン３においては、全ての変異体が十分に形成されたよう
であるが、８種の変異体は不適切に精製されたことが分
かり、除外した。最終的には、６個のランでＭＶIIＣ及
び４７種の変異体を調製することができた（表１）。

【００３８】

【表１】

【００３９】ａ：慣用名は以下の通りである：Ｋ２Ｑは
［Gln²］-MVIICであり、Ｇ−ＭＶIIＣ及びＫＧ−ＭＶII
Ｃは各々グリシルＧ−ＭＶIIＣ及びリシル−グリシル−
ＭＶIIＣである。 ｂ：値はペプチド合成機での構築について計算した理論
値に対する精製ペプチドの重量比として計算する。 ｃ：１０^-7Ｍ又は１０^-8ＭのＭＶIIＣおよびその変異体
による［¹²⁵Ｉ］ＧＶＩＡ及び［¹²⁵Ｉ］ＭＶIIＣの結合
の置換率。値は平均±標準偏差を示す。

【００４０】（Ｂ−２）Ｎ型及びＰ／Ｑ型のカルシウム
チャンネルに対するＭＶIIＣ変異体の結合活性 Ｎ型及びＰ／Ｑ型のカルシウムチャンネルに対するＭＶ
IIＣ及び４７種の変異体の結合活性を、放射標識したＭ
ＶIIＣとの競合については１０^-8Ｍで、放射標識したＧ
ＶＩＡとの競合については１０^-7Ｍで評価した（表
１）。ラン１で得た変異体は両方のアッセイでＭＶIIＣ
より低い親和性を一般に示す一方、選択性に対する影響
は様々であった。例えば、Ｔｙｒ１３をＴｒｐで置換し
た場合には（変異体５）、ＧＶＩＡとの競合において親
和性はより低下し、Ｍｅｔ１２をＴｈｒで置換した場合
には（変異体３）、ＭＶIIＣとの競合の場合にのみ親和
性は低下した。ラン２からの変異体の場合、親和性は、
特にＭＶIIＣとの競合においては十分に維持され、Ｓｅ
ｒ１７又はＳｅｒ１９を塩基性残基に置換するとＰ／Ｑ
型カルシウムチャンネルに対する選択性が増加する傾向
にあった（変異体１４及び１５）。Ｓｅｒ１７又はＳｅ
ｒ１９の置換の効果をラン３でさらに調べ、Ｓｅｒ１９
を塩基性残基又は嵩高い残基で置換すると、Ｎ型カルシ
ウムチャンネルに対する親和性が減少することが判明し
た。Ｌｙｓ２５をＡｒｇで置換すると、Ｓｅｒ１９の置
換と組み合わせた場合、Ｐ／Ｑ型カルシウムチャンネル
に対する選択性の増加に有効であることも判明した。

【００４１】ラン５及び６においてＮ末端の伸長した場
合には一般に、Ｎ型およびＰ／Ｑ型の両方のカルシウム
チャンネルに対する親和性が減少したが、幾つかの変異
体はＭＶIIＣよりもＰ／Ｑ型カルシウムチャンネルに対
してより高い選択性を示した。Ｓｅｒ１７、Ｓｅｒ１９
及びＬｙｓ２５を各々Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＡｒｇで置換
した変異体３４は、Ｐ／Ｑ型カルシウムチャンネルに対
するＭＶIIＣの親和性と同様の親和性を保持する変異体
の中でＮ型カルシウムチャンネルに対する親和性が最も
低かったことから、変異体３４をＰ／Ｑ型カルシウムチ
ャンネル選択的ブロッカーの候補として選択した。変異
体３４の［¹²⁵Ｉ］ＧＶＩＡ及び［¹²⁵Ｉ］ＭＶIIＣ結合
関係の濃度阻害を変異体３の濃度阻害とともに図３に示
す。変異体３は、Ｐ／Ｑ型カルシウムチャンネルに対す
る親和性が減少し、Ｎ型カルシウムチャンネルに対する
親和性を保持する。

【００４２】（Ｂ−３）ＮＭＲ分析 変異体３４のＮＭＲ構造分析ではＮＨ化学シフトの分散
を示し、その一部は保存され、残りはＭＶIIＣのものか
ら偏差を示した（図４）。ＮＨ化学シフトが十分に保存
されている残基は主としてβ鎖に分布し、偏差は他の領
域の残基に見られた。

【００４３】（Ｃ）考察 ＭＶIIＣよりもＰ／Ｑ型カルシウムチャンネルに対する
選択性が高いＭＶIIＣ変異体を探索した結果、結合アッ
セイにおいてＰ／Ｑ型カルシウムチャンネルに対する親
和性を保持しつつＮ型カルシウムチャンネルに対する親
和性が減少した複数の変異体が得られた。Ｔｙｒ１３は
ＧＶＩＡ、ＭＶIIＡ及びＭＶIIＣの活性に最も重要な残
基であるが、ＭＶIIＣにおいてＴｙｒ１３をＴｒｐに置
換すると両カルシウムチャンネルに対する親和性は減少
した。しかし、Ｎ型カルシウムチャンネルに対する親和
性の減少の方が大きかったため、Ｐ／Ｑ型カルシウムチ
ャンネルに対する選択性が増加した。本実施例の結果か
ら、複数のアミノ酸置換によりペプチドの活性と選択性
に対して予期できない影響が生じることが判明した。例
えば、Ｌｙｓ２５をＡｒｇ２５で置換すると、Ｓｅｒ１
９のＡｒｇ１９による置換と組み合わせた場合にはＮ型
カルシウムチャンネルに対する親和性は減少したが、Ｓ
ｅｒ１７をＬｙｓで置換した場合にはほとんど影響しな
かった。

【００４４】本実施例では、コンビナトリアル法を使用
することによって、６回のランでＭＶIIＣと４７種類の
変異体を製造することができた。得られた各変異体の量
は個別に合成した場合の量より少なかったが、変異体の
同定と活性評価のためには十分な量であった。また、単
一の変異体を合成する場合と比較して、重合化や凝集が
進行する傾向は見られなかった。本実施例で実施したよ
うな数種類のペプチドを含むペプチド混合物のジスルフ
ィド結合を同時に形成する方法は、より高い親和性や選
択性を有するカルシウムチャンネルブロッカーなどのイ
オンチャンネルブロッカーを探索するために有用な方法
である。さらに、カルシウムチャンネルブロッカーなど
のイオンチャンネルブロッカー以外の機能性分子、例え
ば蛋白質／蛋白質相互作用を調節する分子の探索におい
ても応用可能である。

【００４５】

【発明の効果】本発明により、ジスルフィド結合を有す
るペプチドの多数の変異体を効率的に合成するための新
しい方法を確立することが可能になった。

【００４６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Mitsubishi Chemical Corporation <120> A process for preparing a peptide library <130> A01138MA <160> 1

【００４７】 <210> 1 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 1 Cys Lys Gly Lys Gly Ala Pro Cys Arg Lys Thr Met Tyr Asp Cys Cys 5 10 15 Ser Gly Ser Cys Gly Arg Arg Gly Lys Cys 20 25

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、MVIICの一次構造と、MVIICの置換又は
伸長部位の構造を示す。ジスルフィド結合の組み合わせ
は配列の上に示す。

【図２】図２のＡは、実施例１のラン１で得たモノマー
フラクションのイオン交換クロマトグラフィーを示す。
ペプチドは０．０１Ｍの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ
４．６）５００ｍｌと０．８Ｍの酢酸アンモニウム緩衝
液（ｐＨ６．５）５００ｍｌから形成した濃度勾配中で
ＣＭ−セルロースＣＭ−５２（１８×２００ｍｍ）から
溶出した。フラクションを５つのグループ（Ｆ１−Ｆ
５）に分けた。図２のＢは、各フラクションにおけるペ
プチドの逆相ＨＰＬＣプロフィールを示す。ペプチド
を、５〜２９％アセトニトリルと０．１％トリフルオロ
酢酸水溶液の直線勾配中で流速１ｍｌ／分で２４分間Ｏ
ＤＳカラム（４．６×２５０ｍｍ）から溶出した。ピー
クの上に記載した数字は表１に記載した変異体の番号に
対応する。

【図３】図３は、ラット小脳Ｐ₂膜への［¹²⁵Ｉ］ＧＶＩ
Ａ又は［¹²⁵Ｉ］ＭＶIIＣの結合に対する、代表的変異
体及びＭＶIIＣの濃度と阻害の関係を示すグラフであ
る。

【図４】図４は、変異体３４におけるＭＶIIＣ天然値か
らの化学シフトの偏差を示す。ＭＶIIＣにおけるβ鎖に
位置する残基は太線によって示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｆターム(参考） 2G045 BB05 BB20 BB41 BB46 BB50 BB51 CB17 DA36 FB06 FB08 4C084 AA17 CA62 DA35 ZC502 4H045 AA10 AA20 BA16 BA17 BA18 CA50 DA83 FA33 FA58 GA22 GA23

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ２以上の分子内ジスルフィド結合を有す
   るペプチド及びその１以上の変異体から成るペプチドラ
   イブラリーの製造方法であって、（１）変異部位に導入
   されるアミノ酸として２以上のアミノ酸から成るアミノ
   酸混合物を供給してペプチドの化学合成を行うことによ
   って、ペプチドとその１以上の変異体を同時に化学合成
   してペプチド混合物を調製する工程；（２）工程（１）
   で調製されたペプチド混合物中のペプチドを溶液中で空
   気酸化することによって分子内ジスルフィド結合を形成
   させる工程；及び（３）分子内ジスルフィド結合を形成
   したペプチド及びその１以上の変異体の混合物を分離す
   る工程：を含む、ペプチドライブラリーの製造方法。
2. 【請求項２】 変異部位のアミノ酸残基が、分子内ジス
   ルフィド結合を形成するシステイン残基以外のアミノ酸
   である、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 変異部位に導入されるアミノ酸がシステ
   イン以外のアミノ酸である、請求項１又は２に記載の方
   法。
4. 【請求項４】 分子内ジスルフィド結合を形成したペプ
   チド及びその１以上の変異体の混合物をゲル濾過クロマ
   トグラフィーによって分離する、請求項１から３の何れ
   か１項に記載の方法。
5. 【請求項５】 請求項１から４の何れか１項に記載の方
   法により製造されるペプチドライブラリー。
6. 【請求項６】 請求項１から４の何れか１項に記載の方
   法により製造されるペプチドライブラリー中の各ペプチ
   ドの生物学的活性を対照ペプチドの生物学的活性と比較
   し、対照ペプチドよりも有用な生物学的活性を示すペプ
   チドを選択することを含む、変異ペプチドのスクリーニ
   ング方法。
7. 【請求項７】 請求項６に記載のスクリーニング方法に
   より得られる変異ペプチド。
8. 【請求項８】 請求項１から４の何れかに記載の方法に
   より製造したω−コノトキシンＭＶIIＣとその変異体か
   ら成るペプチドライブラリー中の各ω−コノトキシンＭ
   ＶIIＣ変異体の生理活性を野生型ω−コノトキシンＭＶ
   IIＣの生理活性と比較し、Ｐ／Ｑ型カルシウムチャンネ
   ルに対する阻害活性の選択性が野生型ω−コノトキシン
   ＭＶIIＣの選択性よりも高い変異体を選択することを含
   む、ω−コノトキシンＭＶIIＣの変異体のスクリーニン
   グ方法。
9. 【請求項９】 請求項８に記載の方法により得られるω
   −コノトキシンＭＶIIＣの変異体。
10. 【請求項１０】 請求項９に記載のω−コノトキシンＭ
    ＶIIＣ変異体を含む、カルシウムチャンネルブロッカ
    ー。