KR20190076022A - 결합 펩타이드 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 다른 펩타이드를 포함하는 표적 화합물에 높은 특이성 및 친화도로 결합하는 펩타이드에 관한 것이다.
Description
본 발명은 다른 펩타이드를 포함하는 표적 화합물에 높은 특이성 및 친화도로 결합하는 펩타이드 뿐만 아니라 비-자연 발생 아미노산을 포함하는 펩타이드의 분야에 관한 것이다.
항체는 생체 분자 인식을 포함한 다양한 방법에서 적용되고 있다. 이들은 매우 특이적이며 진단에서 및 치료제로서 사용된다. 항체는 항원을 이용한 면역화에 의해 생성될 수 있으며 면역계는 항원 상의 특정 부위, 소위 에피토프에 대한 항체의 생성에 대해 선호를 보인다. 항체에 대한 결합 상수는 10-10 - 10-5 M의 범위이며, 10-7 M을 중심으로 한다. 항체의 단점은 이들이 항원에 대한 다클론 반응으로서 수득되며 단클론 항체를 생성하는데 오랜 시간이 걸리는 과정이 일반적으로 필요하다는 것이다. 단백질의 발현은 번거롭고 종종 대규모 생산을 위해 수년간의 최적화를 요한다. 치료 항체의 경우 이들은 종종 자체 면역원이고 따라서 더욱이 치료에 사용될 수 있기 전에 매우 특정한 인간 또는 포유류 세포주에서만 종종 얻어지는 적절한 글리코실화를 포함하여 "인간화"될 필요가 있다.
본 발명은 표적 화합물에 높은 특이성 및 친화도로 결합할 수 있는 신규한 부류의 펩타이드를 제공한다. 본원에서는 이러한 부류의 펩타이드를 β-바디(β-body)라고 한다.
β-바디는 기존의 항체를 능가하는 몇 가지 큰 이점을 갖는다. 따라서, 구조가 알려진 임의의 단백질 표면에 결합하는 β-바디를 생성할 수 있다. 이것은 동일한 단백질을 상이한 방식으로 선택적으로 인식하는 매우 다양한 β-바디가 합성에 의해 수득될 수 있음을 의미한다. 최적화된 β-바디의 결합 표면적은 항체와 동일한 표면적을 쉽게 커버하며 측정된 결합 상수는 항체에 대한 것과 동일한 정도이다. 게다가 β-바디는 단백질 상의 특정 관심 위치, 예를 들어, 효소의 활성 부위, 단백질-단백질 상호작용을 위한 부위 또는 결합 포켓과 상호작용하도록 직접적으로 설계될 수 있다. 따라서, β-바디는 중화 항체의 대체물로서 유용하다. 본 발명의 β-바디는 전형적으로 작기 때문에, 일반적으로 면역원성일 가능성은 낮으며, 항체와는 달리 치료제로서 직접적으로 사용될 수 있다.
β-헤어핀이 기술되어 있다. 예를 들면 제US2012321697호, 제US2012309934호 및 제WO10047515호는 베타-헤어핀 영역 및 표적 결합을 위한 별도의 영역을 포함하는 이원 펩타이드(bipodal peptide)를 기술한다. 표적 결합 영역은 무작위 구조를 가지며 β-헤어핀의 일부가 아니다.
본 발명은 높은 특이성 및 친화도로 자체에 또는 표적 화합물에 결합할 수 있는 펩타이드를 제공한다. 펩타이드는 일반적으로 다음의 원리를 사용하여 전형적으로 설계된 β-헤어핀 및/또는 β-시트를 포함한다:
· β-헤어핀 또는 β-시트는 β-헤어핀 또는 β-시트 구조에 기여하는 아미노산 측쇄로 구성된 하나의 표면(표면 1)을 갖는다;
· β-헤어핀 또는 β-시트는 표적 화합물과 특이적으로 상호작용하는 아미노산 측쇄로 구성된 제2 표면(표면 2)을 갖는다.
전형적으로, 표면 1을 구성하는 아미노산과 표면 2를 구성하는 아미노산은 β-헤어핀 또는 β-시트를 구성하는 β-가닥 내의 교호적 위치에 위치한다.
따라서, 본 발명의 펩타이드는 β-헤어핀 또는 β-시트의 형태의 매우 안정한 3차원 구조를 포함한다. 표면 2를 구성하는 아미노산은 컴퓨터 보조 모델링의 사용에 의해 또는 펩타이드의 라이브러리 스크리닝에 의해 임의의 유용한 표적 화합물에 결합하도록 설계될 수 있다.
본 발명은 여기에 첨부된 청구항에 정의된다. 예를 들면, 본 발명은 "β-바디"로 지칭되는 화합물을 제공하며, 여기서 β-바디는 β-턴 펩타이드(β-turn peptide) 서열(들)에 의해 연결된 적어도 두 개의 β-가닥 펩타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 화합물이고, 여기서 상기 β-가닥 펩타이드 서열은 교호하는 정방향 및 역방향 β-가닥 펩타이드 서열의 역평행 배열(anti-parallel arrangement)로 조직화되며, 여기서
각각의 정방향 β-가닥 펩타이드 서열은 개별적으로 다음의 서열을 갖고
Xr(ZX)m
각각의 역방향 β-가닥 펩타이드 서열은 개별적으로 다음의 서열을 갖고
(XZ)nXr
여기서
각각의 Z는, 각 β-가닥 서열에서 최대 두 개의 Z가 Thr, 극성 β-분지화 아미노산, β-가닥 구조를 촉진시키는 비-단백질생성 α-분지화 아미노산 또는 가닥 브리징 아미노산 중의 하나가 아닌 아미노산일 수 있음을 제외하고는, 개별적으로 Thr, 극성 β-분지화 아미노산, β-가닥 구조를 촉진시키는 비-단백질생성 α-분지화 아미노산 또는 가닥 브리징 아미노산이고;
각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산, β-아미노산 또는 γ-아미노산이고;
각각의 m 및 n은 개별적으로 3 내지 12 범위의 정수이고;
각각의 r은 0 내지 5 범위의 정수이고;
각각의 β-턴 펩타이드 서열은 개별적으로 다음의 서열을 갖고;
Xq1BUXq2
여기서
각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산이고;
각각의 U는 개별적으로 화학식 
의 아미노산이고, 여기서 Ra 및 Rb는 개별적으로 -H 및 C1-6-알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, Ra 및 Rb는 결합하여 사이클릭 구조를 형성할 수 있으며;
B는 Pro, 치환된 Pro 및 피페콜산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
각각의 q은 개별적으로 0 내지 5 범위의 정수이고, 여기서 q1 - q2는 -4, -2, 0, 2 또는 4이다.
본 발명은
· 본 발명에 따르는 β-바디를 확인하는 방법,
· 본 발명의 β-바디를 사용하여 표적 화합물의 존재를 검출하는 방법,
· 본 발명의 β-바디를 사용하여 임상 상태를 진단하는 방법,
· 임상 상태를 치료하는 방법에서 사용하기 위한 β-바디,
· β-바디의 동형이량체 및 이형이량체
· 접합 모이어티(moiety)에 공유 결합된 β-바디를 포함하는 화합물을 추가로 제공한다.
도 1. 패널 A는 두 개의 β-바디, 리간드 3 및 리간드 4에 결합된 IL-2의 모델을 보여준다. 패널 B, C 및 D는 리간드 4 (패널 B)(신호 없음) 또는 리간드 4 및 IL2 (패널 C 및 D)(양성 신호)와 함께 배양된 리간드 3에 연결된 PEGA 비드를 보여준다.
도 2. 패널 A는 PEGA 수지 비드 상에 고정된 헥사펩타이드 HRMVRG에 결합된 히스태그 - EGFP - 스페이서 - KTGTQNLTGPGRTHTQTATEG (서열번호 3)를 함유하는 EGFP 융합 단백질의 모델을 보여준다. 패널 B 및 C는 EGFP 융합 단백질의 존재하에서 (패널 B) 또는 EGFP의 존재하에서 (패널 C) HRMVRG에 연결된 PEGA-비드를 보여준다. 패널 D는 실시예 5에 기술된 바와 같이 제조된 상기한 EGFP 융합 단백질의 정제 동안 수득된 샘플의 SDS-PAGE 분석을 보여준다. 1) EGFP 융합 단백질을 발현하는 세포의 세포 용해물, 2) 플로우-스루 용액(flow-through-solution), 3) Milli-Q 물을 갖는 세척물, 4) PBS 완충액을 갖는 용출물, 5) 단백질 표준물, 6) EGFP를 발현하는 세포의 세포 용해물, 7) 플로우 스루 용액. 예상되는 크기의 EGFP 융합 단백질은 "GFP-헤어핀"으로 나타내어지고 EGFP는 "GFP"로 나타내어진다.
도 3. 패널 A는 두 개의 β-바디, 리간드 1 및 리간드 2에 결합된 IL-1의 모델을 보여준다. 패널 B 및 C는 리간드 2 (패널 B)(신호 없음) 또는 리간드 2 및 IL1 (패널 C)(양성 신호)와 함께 배양된 리간드 1에 연결된 PEGA 비드를 보여준다. 리간드 1 및 2를 혼합하고 4h 동안 배양하였다 (t=0에서의 이미지). IL-1을 첨가하고(50 nM) 20 min 동안 배양하였다 (t=20에서의 이미지).
도 4. 패널 A는 두 개의 β-바디, 리간드 5 및 리간드 6에 결합된 IL-6의 모델을 보여준다. 패널 B, C 및 D는 리간드 6 (패널 B 및 C)(신호 없음) 또는 리간드 6 및 IL6 (패널 D)(양성 신호)와 함께 배양된 리간드 5에 연결된 PEGA 비드를 보여준다. 리간드 5 및 6을 혼합하고 4 h 동안 배양하였다 (t=0에서의 이미지). Il6을 첨가하고(20nM) 20 min 동안 배양하였다 (t=20에서의 이미지). 비드를 이미징 전에 pbs 완충액으로 세척하였다.
도 5. β-턴을 통해 서로 연결된 두 개의 β-시트 및/또는 β-헤어핀을 포함하는 β-바디의 도식적 표현.
각각의 β-시트 및/또는 β-헤어핀은 다음을 특징으로 한다:
· β-헤어핀 또는 β-시트 구조에 기여하는 아미노산 측쇄로 구성된 하나의 표면 (표면 1) (구조적 부위);
· 표적 화합물과 특이적으로 상호작용하는 아미노산 측쇄로 구성된 제2 표면 (표면 2) (인식 부위).
나타낸 β-바디에서, 표면 1을 구성하는 아미노산과 표면 2를 구성하는 아미노산은 β-헤어핀 또는 β-시트를 구성하는 β-가닥 내의 교호적 위치에 위치한다. 패널 A는 외향 배향으로 인식 잔기를 갖는 β-바디를 보여주고; 패널 B A는 내향 배향으로 인식 잔기를 갖는 β-바디를 보여준다.
도 6. (A) 비처리된 및 (B) 희석된 대장균(E.coli)으로부터의 용해물 중의 GFP에 결합하는 β-바디.
도 7. (A-1) 하나는 eGFP에 대한 공유 결합된 β-바디를 갖고 다른 하나는 인터류킨 1 (IL1)에 대한 공유 결합된 β-바디를 가지며 둘 다 eGFP 분자와 함께 배양된 두 개의 비드의 명시야 이미지. (A-2) 같은 이미지이지만 β-바디가 eGFP에 선택적으로 결합한다는 것을 보여주는 형광 현미경 하에서 기록된 이미지. (B-1) 하나는 eGFP에 대한 공유 결합된 β-바디를 갖고 다른 하나는 IL1에 대한 공유 결합된 β-바디를 가지며 둘 다 IL1 분자와 함께 배양된 두 개의 비드의 명시야 이미지. (B-2) 같은 이미지이지만 β-바디가 IL1에 선택적으로 결합한다는 것을 보여주는 형광 현미경 하에서 기록된 이미지.
도 8. NHAc로 변형된 비드는 β-바디 1-F*(A) 또는 2-F*(B)와 함께 배양된다. β-바디 1로 변형된 비드는 β-바디 1-F*(C) 또는 2-F*(D)와 함께 배양된다. β-바디 2로 변형된 비드는 β-바디 1-F*(E) 또는 2-F*(F)와 함께 배양된다.
도 2. 패널 A는 PEGA 수지 비드 상에 고정된 헥사펩타이드 HRMVRG에 결합된 히스태그 - EGFP - 스페이서 - KTGTQNLTGPGRTHTQTATEG (서열번호 3)를 함유하는 EGFP 융합 단백질의 모델을 보여준다. 패널 B 및 C는 EGFP 융합 단백질의 존재하에서 (패널 B) 또는 EGFP의 존재하에서 (패널 C) HRMVRG에 연결된 PEGA-비드를 보여준다. 패널 D는 실시예 5에 기술된 바와 같이 제조된 상기한 EGFP 융합 단백질의 정제 동안 수득된 샘플의 SDS-PAGE 분석을 보여준다. 1) EGFP 융합 단백질을 발현하는 세포의 세포 용해물, 2) 플로우-스루 용액(flow-through-solution), 3) Milli-Q 물을 갖는 세척물, 4) PBS 완충액을 갖는 용출물, 5) 단백질 표준물, 6) EGFP를 발현하는 세포의 세포 용해물, 7) 플로우 스루 용액. 예상되는 크기의 EGFP 융합 단백질은 "GFP-헤어핀"으로 나타내어지고 EGFP는 "GFP"로 나타내어진다.
도 3. 패널 A는 두 개의 β-바디, 리간드 1 및 리간드 2에 결합된 IL-1의 모델을 보여준다. 패널 B 및 C는 리간드 2 (패널 B)(신호 없음) 또는 리간드 2 및 IL1 (패널 C)(양성 신호)와 함께 배양된 리간드 1에 연결된 PEGA 비드를 보여준다. 리간드 1 및 2를 혼합하고 4h 동안 배양하였다 (t=0에서의 이미지). IL-1을 첨가하고(50 nM) 20 min 동안 배양하였다 (t=20에서의 이미지).
도 4. 패널 A는 두 개의 β-바디, 리간드 5 및 리간드 6에 결합된 IL-6의 모델을 보여준다. 패널 B, C 및 D는 리간드 6 (패널 B 및 C)(신호 없음) 또는 리간드 6 및 IL6 (패널 D)(양성 신호)와 함께 배양된 리간드 5에 연결된 PEGA 비드를 보여준다. 리간드 5 및 6을 혼합하고 4 h 동안 배양하였다 (t=0에서의 이미지). Il6을 첨가하고(20nM) 20 min 동안 배양하였다 (t=20에서의 이미지). 비드를 이미징 전에 pbs 완충액으로 세척하였다.
도 5. β-턴을 통해 서로 연결된 두 개의 β-시트 및/또는 β-헤어핀을 포함하는 β-바디의 도식적 표현.
각각의 β-시트 및/또는 β-헤어핀은 다음을 특징으로 한다:
· β-헤어핀 또는 β-시트 구조에 기여하는 아미노산 측쇄로 구성된 하나의 표면 (표면 1) (구조적 부위);
· 표적 화합물과 특이적으로 상호작용하는 아미노산 측쇄로 구성된 제2 표면 (표면 2) (인식 부위).
나타낸 β-바디에서, 표면 1을 구성하는 아미노산과 표면 2를 구성하는 아미노산은 β-헤어핀 또는 β-시트를 구성하는 β-가닥 내의 교호적 위치에 위치한다. 패널 A는 외향 배향으로 인식 잔기를 갖는 β-바디를 보여주고; 패널 B A는 내향 배향으로 인식 잔기를 갖는 β-바디를 보여준다.
도 6. (A) 비처리된 및 (B) 희석된 대장균(E.coli)으로부터의 용해물 중의 GFP에 결합하는 β-바디.
도 7. (A-1) 하나는 eGFP에 대한 공유 결합된 β-바디를 갖고 다른 하나는 인터류킨 1 (IL1)에 대한 공유 결합된 β-바디를 가지며 둘 다 eGFP 분자와 함께 배양된 두 개의 비드의 명시야 이미지. (A-2) 같은 이미지이지만 β-바디가 eGFP에 선택적으로 결합한다는 것을 보여주는 형광 현미경 하에서 기록된 이미지. (B-1) 하나는 eGFP에 대한 공유 결합된 β-바디를 갖고 다른 하나는 IL1에 대한 공유 결합된 β-바디를 가지며 둘 다 IL1 분자와 함께 배양된 두 개의 비드의 명시야 이미지. (B-2) 같은 이미지이지만 β-바디가 IL1에 선택적으로 결합한다는 것을 보여주는 형광 현미경 하에서 기록된 이미지.
도 8. NHAc로 변형된 비드는 β-바디 1-F*(A) 또는 2-F*(B)와 함께 배양된다. β-바디 1로 변형된 비드는 β-바디 1-F*(C) 또는 2-F*(D)와 함께 배양된다. β-바디 2로 변형된 비드는 β-바디 1-F*(E) 또는 2-F*(F)와 함께 배양된다.
정의
용어 "알킬"은 하나의 -H의 제거에 의해 알칸으로부터 유도된 치환체를 가리킨다.
본원에서 사용되는 용어 "아미노산"은 α-아미노산, β-아미노산 및 γ-아미노산을 가리킨다. 바람직하게는, 아미노산은 하기 일반 구조 I의 화합물이다:
용어 "아미노산 잔기"는 폴리펩타이드 내의 아미노산 단량체를 가리킨다. 아미노산 잔기는 바람직하게는 일반 구조 IV를 갖는다: 
, 여기서 R은 아미노산 측쇄를 나타낸다. 아미노산 잔기가 Gly이 아닌 경우, 아미노산 잔기는 일반 구조 V를 갖는다: 
, 여기서 *는 인접한 아미노산 잔기에 대한 부착점을 나타낸다. 대부분의 N-말단 아미노 잔기에서 N에 연결된 *으로 나타내어진 위치는 -H인 반면, 대부분의 C-말단 아미노산 잔기에서 C=O에 연결된 *으로 나타내어진 위치는 -OH 또는 -NH2이다.
본원에서 사용되는 용어 "아릴"은 환에서 C로부터 하나의 -H의 제거에 의해 아렌으로부터 유도된 치환체를 가리킨다. 본 발명에 사용하기에 유용한 아릴의 예는 페닐, 나프틸, 안트라세닐, 페난트레닐, 피레닐 또는 -F, -Cl, -Br, -I, -OH, -OMe, NH2 , -CF3, -COOH, -OPO3H2, 또는 -CH2-PO3H2와 같은 치환체를 포함한 이의 치환된 버전을 포함한다.
용어 "β-분지화된 아미노산"은 β-탄소원자가 분지화된 아미노산을 가리킨다. 따라서, β-분지화된 아미노산에서, β-탄소원자는 α-탄소, 및 -H가 아닌 적어도 2개의 추가의 원자에 직접적으로 공유 결합된다.
본원에서 사용되는 용어 "β-아미노산"은 표준 아미노산에서와 같이 α 탄소보다는 β 탄소에 결합되는 아미노 그룹을 갖는 아미노산을 가리킨다.
본원에서 사용되는 용어 "검출 가능한 표지"는 검출될 수 있는 임의의 표지를 가리킨다. 검출 가능한 표지는 예를 들면 방사성 표지, 비오틴, 형광 표지, 발광 표지 및 유색 표지로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "γ-아미노산"은 표준 아미노산에서와 같이 α 탄소보다는 γ-탄소에 결합되는 아미노 그룹을 갖는 아미노산을 가리킨다.
본원에서 사용되는 용어 "Kd"는 해리 상수를 가리킨다. 따라서, Kd는 β-바디와 이의 표적 화합물 간의 결합 친화도의 척도로서 사용될 수 있다. Kd는 하기 방정식을 사용하여 계산될 수 있다:
여기서, [A]는 표적 화합물의 농도를 나타내고, [B]는 유리 β-바디의 농도를 나타내며 [AB]는 평형에서 복합체의 농도를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "내향 β-바디"는 아래 "아미노산 Z" 섹션에 정의된 바와 같은 Z 아미노산 잔기, 예를 들면 트레오닌이 β-타입2-턴에 바로 선행하여 따르는 β-바디를 가리킨다.
본원에서 사용되는 용어 "외향 β-바디"는 아래 "아미노산 X" 섹션에 정의된 바와 같은 X 아미노산 잔기와 같은 인식 잔기가 β-타입2-턴에 바로 선행하여 따르는 β-바디를 가리킨다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기의 서열을 가리킨다. 일반적으로 폴리펩타이드는 적어도 4개의 아미노산 잔기를 포함한다.
용어 "표준 아미노산"은 표준 유전 암호에 의해 암호화된 20개 아미노산을 가리킨다. 아미노산은 표준 IUPAC 명명법을 사용하여 본원에서 언급된다. 표준 아미노산은 모두 L-아미노산이다.
본원에서 사용되는 용어 "표준 브릿징 아미노산"은 가닥 배열의 혼란없이 두 개의 가닥을 가로질러 공유 화학 결합 또는 수소 결합을 형성할 수 있는, 반대 가닥 상에 위치한 두 개의 아미노산을 가리킨다. 공유 가닥 브릿징은 구리-촉매된 아지드-알킨 고리부가반응(CuAAC) - 클릭 반응에 의해 형성된 디설파이드 결합 및 트리아졸을 포함한다.
β-
바디
본 발명은 β-턴 펩타이드 서열(들)에 의해 연결된 적어도 두 개의 β-가닥 펩타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 화합물에 관한 것이며, 여기서 상기 β-가닥 펩타이드 서열은 교호하는 정방향 및 역방향 β-가닥 펩타이드 서열의 역-평행 배열로 조직화될 수 있다. 이러한 화합물을 또한 본원에서 "베타-바디" 또는 "β-바디"라고 할 수 있다.
각각의 정방향 β-가닥 펩타이드 서열은 개별적으로 하기 일반 서열 I을 가질 수 있고:
Xr(ZX)m
"정방향 β-가닥 펩타이드 서열" 섹션에서 보다 상세히 본원에 기술된 펩타이드 서열 중 임의의 것일 수 있다. β-바디가 하나 이상의 정방향 β-가닥 서열을 포함하는 본 발명의 양태에서 정방향 β-가닥 펩타이드 서열이 동일한 일반 서열을 갖는다고 하더라도, β-바디 내의 각각의 정방향 β-가닥은 상이한 특정 서열을 가질 수 있는 것으로 이해된다.
각각의 역방향 β-가닥 펩타이드 서열은 개별적으로 다음의 일반 서열 II를 가질 수 있고:
(XZ)nXr
"역방향 β-가닥 펩타이드 서열" 섹션에서 보다 상세히 본원에 기술된 펩타이드 서열 중 임의의 것일 수 있다. β-바디가 하나 이상의 역방향 β-가닥 서열을 포함하는 본 발명의 양태에서 역방향 β-가닥 펩타이드 서열이 동일한 일반 서열을 갖는다고 하더라도, β-바디 내의 각각의 역방향 β-가닥은 상이한 특정 서열을 가질 수 있는 것으로 이해된다.
Z로 표시된 아미노산은 아래 "아미노산 Z" 섹션에 기술된 아미노산 중 임의의 것일 수 있는 반면, 아미노산 X는 아래 본원의 "아미노산 X" 섹션에 기술된 아미노산 중 임의의 것일 수 있다. 각각의 β-가닥 펩타이드 서열은 다수의 아미노산 Z 및 X를 포함한다. β-가닥 서열 내의 Z는 동일한 아미노산, 부분적으로 동일한 아미노산 또는 상이한 아미노산일 수 있는 것으로 이해된다. 유사하게, β-가닥 서열 내의 X는 동일한 아미노산, 부분적으로 동일한 아미노산 또는 상이한 아미노산일 수 있다.
따라서 용어 (XZ)n은 두 가지 유형의 아미노산의 반복 서열을 나타내지만 반드시 동일한 두 아미노산의 반복 서열은 아니다. 일반적으로 아미노산 Z는 β-가닥 구조를 보장하며, 또한 수 용해도를 제공한다. 따라서, 전형적으로, β-바디는 수용성이며, 이에 따라 아래 기술된 바와 같이 진단제 또는 치료제로서 유용하다. 일반적으로 β-가닥의 모든 아미노산 Z의 측쇄는 대략 동일한 방향을 가리킬 것이며, 이로써 β-바디의 제1 표면에 참여하게 된다. 전형적으로, β-바디의 모든 아미노산 Z의 모든 측쇄는 대략 동일한 방향을 가리킬 것이며, 이로써 β-바디의 제1 표면에 형성한다. 이것은 3차원 구조, 예를 들어 β-바디의 β-헤어핀 또는 β-시트의 안정성을 보장할 수 있다. β-바디의 개략적인 예가 도 5에 제공되어 있으며, 여기서 아미노산 Z의 측쇄는 볼로 도시된다.
유사하게, 일반적으로 β-가닥의 모든 아미노산 X의 측쇄는 대략 동일한 방향을 가리킬 것이며, 이로써 β-바디의 제2 표면에 참여하게 된다. 바람직하게는, 아미노산 Z의 측쇄는 아미노산 X의 측쇄와는 상이한 방향을 가리킬 것이다. 전형적으로, β-가닥의 모든 아미노산 X의 모든 측쇄는 대략 동일한 방향을 가리킬 것이며, 이로써 β-바디의 제2 표면을 형성한다. β-바디의 제2 표면은 전형적으로 β-바디의 결합 특이성을 제공한다. β-바디의 개략적인 예가 도 5에 제공되어 있으며, 여기서 아미노산 X의 측쇄는 다양한 다각형 형태로 도시된다.
일반적으로 β-바디의 모든 아미노산 X의 모든 측쇄는 대략 동일한 방향을 가리킬 것이며, 이로써 β-바디의 표면을 형성한다. 이것은 3차원 구조, 예를 들어 β-바디의 β-헤어핀 또는 β-시트의 안정성을 보장할 수 있다.
β-가닥 펩타이드 서열은 β-턴 서열에 의해 연결된다. 전형적으로, β-턴 서열은 펩타이드에 굴곡(bend)을 도입하여, β-턴에 부착된 두 개의 β-가닥이 역-평행 배열로 서로 근접하여 위치하게 한다. β-턴은 두 개의 반대 가닥에서 골격 아미드 사이의 수소 결합을 가능하게 할 수 있다.
각각의 β-턴 서열은 개별적으로 다음의 일반 서열 III을 가질 수 있고:
XqBUXq
"β-턴 펩타이드 서열" 섹션에서 보다 상세히 본원에 기술된 β-턴 펩타이드 서열 중 임의의 것일 수 있다. β-바디가 하나 이상의 β-턴 서열을 포함하는 본 발명의 양태에서, β-턴 펩타이드 서열이 동일한 일반 서열을 갖는다고 하더라도, β-바디 내의 각각의 β-턴은 상이한 특정 서열을 가질 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명의 β-바디의 펩타이드 서열은 전형적으로 교호하는 정방향 β-가닥 펩타이드 서열과 역방향 β-가닥 펩타이드 서열로서 조직화되며, 여기서 임의의 두 개의 β-가닥 펩타이드 서열은 β-턴 펩타이드 서열에 의해 분리된다.
각각의 β-바디는 다수의 β-가닥 펩타이드 서열을 포함할 수 있다. β-바디는 적어도 두 개의 β-가닥 서열(전형적으로 정방향 β-가닥 펩타이드 서열과 역방향 β-가닥 펩타이드 서열)을 포함해야 하지만, 원칙적으로 β-가닥 펩타이드 서열의 수에 대한 상한은 없으며, 여기서 β-가닥 펩타이드 서열은 β-턴을 통해 서로 연결될 수 있다. 그러나, β-바디의 β-가닥 펩타이드 서열이 β-헤어핀 또는 β-시트를 형성할 수 있는 것이 바람직하다. β-바디가 단지 두 개의 β-가닥 펩타이드 서열을 포함하는 경우, 이들은 전형적으로 β-헤어핀을 형성하는 반면, 두 개 이상의 β-가닥 펩타이드 서열을 포함하는 β-바디는 바람직하게 β-시트를 형성한다.
하나의 양태에서 β-바디는 β-턴 펩타이드 서열에 의해 연결된 2 내지 10개 범위의 β-가닥 펩타이드 서열을 포함할 수 있다. 상기 β-가닥 서열은 바람직하게는 β-턴 펩타이드 서열에 의해 연결된 교호하는 정방향 및 역방향 β-가닥 펩타이드 서열이다.
하나의 양태에서 β-바디는 β-턴 펩타이드 서열에 의해 연결된 2 내지 8개 범위, 예를 들어 2 내지 6개 범위의 β-가닥 펩타이드 서열을 포함할 수 있다. 상기 β-가닥 서열은 바람직하게는 β-턴 펩타이드 서열에 의해 연결된 교호하는 정방향 및 역방향 β-가닥 펩타이드 서열이다.
하나의 양태에서 β-바디는 β-턴 펩타이드 서열에 의해 연결된 2 내지 4개 범위의 β-가닥 펩타이드 서열을 포함할 수 있다. 상기 β-가닥 서열은 바람직하게는 β-턴 펩타이드 서열에 의해 연결된 교호하는 정방향 및 역방향 β-가닥 펩타이드 서열이다.
하나의 양태에서 β-바디는 다음의 구조를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다:
정방향 β-가닥 서열-
β-턴 펩타이드 서열-
역방향 β-가닥 서열,
여기서 정방향 β-가닥 서열 및 역방향 β-가닥 서열은 역평행 β-가닥으로서 배열된다.
하나의 양태에서, β-바디는 다음의 구조를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다:
정방향 β-가닥 서열-
β-턴 펩타이드 서열-
역방향 β-가닥 서열-
β-턴 펩타이드 서열-
정방향 β-가닥 서열,
여기서 정방향 β-가닥 서열 및 역방향 β-가닥 서열은 역평행 β-가닥으로서 배열된다.
하나의 양태에서, β-바디는 다음의 구조를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다:
정방향 β-가닥 서열 -
β-턴 펩타이드 서열 -
역방향 β-가닥 서열 -
β-턴 펩타이드 서열 -
정방향 β-가닥 서열 -
β-턴 펩타이드 서열 -
역방향 β-가닥 서열,
여기서 정방향 β-가닥 서열 및 역방향 β-가닥 서열은 역평행 β-가닥으로서 배열된다.
하나의 양태에서 β-바디는 일반 서열 XIX를 갖는 폴리펩타이드를 포함하거나 이들로 이루어진 화합물일 수 있다:
Xr(ZX)mXqPGXq(XZ)nXr,
여기서
각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산, 예를 들어 아래 "아미노산 X" 섹션에서 본원에 기술된 아미노산 중의 임의의 것일 수 있고, 각각의 r은 개별적으로 0 내지 5의 범위, 바람직하게는 0 내지 3의 범위의 정수이며, 예를 들면 각각의 r은 0이고, Z는 아래 "아미노산 Z" 섹션에서 본원에 기술된 바와 같고, 바람직하게는 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개를 제외한 모든 Z는 Thr이며, 각각의 q는 "β-턴 펩타이드 서열" 섹션에 보다 상세하게 본원에 기술된 바와 같은 0 내지 3 범위의 정수이다.
하나의 양태에서 β-바디는 일반 서열 XVI을 갖는 폴리펩타이드를 포함하거나 이들로 이루어진 화합물일 수 있다:
Xr(ZX)mPG(XZ)nXr,
여기서
각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산, 예를 들어 아래 "아미노산 X" 섹션에서 본원에 기술된 아미노산 중의 임의의 것일 수 있고, 각각의 r은 개별적으로 0 내지 5의 범위, 바람직하게는 0 내지 3의 범위의 정수이며, 예를 들면 각각의 r은 0이고, Z는 아래 "아미노산 Z" 섹션에서 본원에 기술된 바와 같고, 바람직하게는 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개를 제외한 모든 Z는 Thr이다.
하나의 양태에서 β-바디는 일반 서열 XX을 갖는 폴리펩타이드를 포함하거나 이들로 이루어진 화합물일 수 있다:
Xr(TX)mXqPGXq(XT)nXr,
여기서
각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산, 예를 들어 아래 "아미노산 X" 섹션에서 본원에 기술된 아미노산 중의 임의의 것일 수 있고, 각각의 r은 개별적으로 0 내지 5의 범위, 바람직하게는 0 내지 3의 범위의 정수이며, 예를 들면 각각의 r은 0이고, 각각의 q는 "β-턴 펩타이드 서열" 섹션에 보다 상세하게 본원에 기술된 바와 같은 0 내지 3 범위의 정수이다.
하나의 양태에서 β-바디는 일반 서열 IV를 갖는 폴리펩타이드를 포함하거나 이들로 이루어진 화합물일 수 있다:
Xr(TX)mPG(XT)nXr,
여기서
각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산, 예를 들어 아래 "아미노산 X" 섹션에서 본원에 기술된 아미노산 중의 임의의 것일 수 있고, 각각의 r은 개별적으로 0 내지 5의 범위, 바람직하게는 0 내지 3의 범위의 정수이며, 예를 들면 각각의 r은 0이다.
하나의 양태에서 β-바디는 일반 서열 XXI을 갖는 폴리펩타이드를 포함하거나 이들로 이루어진 화합물일 수 있다:
Xr(ZX)mXqPGXq(XZ)nXXqPGXqX(ZX)mXr
여기서
각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산, 예를 들어 아래 "아미노산 X" 섹션에서 본원에 기술된 아미노산 중의 임의의 것일 수 있고, 각각의 r은 개별적으로 0 내지 5의 범위, 바람직하게는 0 내지 3의 범위의 정수이며, 예를 들면 각각의 r은 0이고, Z는 아래 "아미노산 Z" 섹션에서 본원에 기술된 바와 같고, 바람직하게는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개를 제외한 모든 Z는 Thr이며, 각각의 q는 "β-턴 펩타이드 서열" 섹션에 보다 상세하게 본원에 기술된 바와 같은 0 내지 3 범위의 정수이다.
하나의 양태에서 β-바디는 일반 서열 XVII를 갖는 폴리펩타이드를 포함하거나 이들로 이루어진 화합물일 수 있다:
Xr(ZX)mPG(XZ)nXPGX(ZX)mXr
여기서
각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산, 예를 들어 아래 "아미노산 X" 섹션에서 본원에 기술된 아미노산 중의 임의의 것일 수 있고, 각각의 r은 개별적으로 0 내지 5의 범위, 바람직하게는 0 내지 3의 범위의 정수이며, 예를 들면 각각의 r은 0이고, Z는 아래 "아미노산 Z" 섹션에서 본원에 기술된 바와 같고, 바람직하게는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개를 제외한 모든 Z는 Thr이다.
하나의 양태에서 β-바디는 일반 서열 XXII를 갖는 폴리펩타이드를 포함하거나 이들로 이루어진 화합물일 수 있다:
Xr(TX)mXqPGXq(XT)nXXqPGXqX(TX)mXr
여기서
각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산, 예를 들어 아래 "아미노산 X" 섹션에서 본원에 기술된 아미노산 중의 임의의 것일 수 있고, 각각의 r은 개별적으로 0 내지 5의 범위, 바람직하게는 0 내지 3의 범위의 정수이며, 예를 들면 각각의 r은 0이고, 각각의 q는 "β-턴 펩타이드 서열" 섹션에 보다 상세하게 본원에 기술된 바와 같은 0 내지 3 범위의 정수이다.
하나의 양태에서 β-바디는 일반 서열 V를 갖는 폴리펩타이드를 포함하거나 이들로 이루어진 화합물일 수 있다:
Xr(TX)mPG(XT)nXPGX(TX)mXr
여기서
각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산, 예를 들어 아래 "아미노산 X" 섹션에서 본원에 기술된 아미노산 중의 임의의 것일 수 있고, 각각의 r은 개별적으로 0 내지 5의 범위, 바람직하게는 0 내지 3의 범위의 정수이며, 예를 들면 각각의 r은 0이다.
하나의 양태에서 β-바디는 일반 서열 XXIII을 갖는 폴리펩타이드를 포함하거나 이들로 이루어진 화합물일 수 있다:
Xr(ZX)mXqPGXq(XZ)nXXqPGXqX(ZX)mXqPGXq(XZ)nXr
여기서
각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산, 예를 들어 아래 "아미노산 X" 섹션에서 본원에 기술된 아미노산 중의 임의의 것일 수 있고, 각각의 r은 개별적으로 0 내지 5의 범위, 바람직하게는 0 내지 3의 범위의 정수이며, 예를 들면 각각의 r은 0이고, Z는 아래 "아미노산 Z" 섹션에서 본원에 기술된 바와 같고, 바람직하게는 최대 4개, 예를 들어 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개를 제외한 모든 Z는 Thr이며, 각각의 q는 "β-턴 펩타이드 서열" 섹션에 보다 상세하게 본원에 기술된 바와 같은 0 내지 3 범위의 정수이다.
하나의 양태에서 β-바디는 일반 서열 XVIII을 갖는 폴리펩타이드를 포함하거나 이들로 이루어진 화합물일 수 있다:
Xr(ZX)mPG(XZ)nXPGX(ZX)mPG(XZ)nXr
여기서
각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산, 예를 들어 아래 "아미노산 X" 섹션에서 본원에 기술된 아미노산 중의 임의의 것일 수 있고, 각각의 r은 개별적으로 0 내지 5의 범위, 바람직하게는 0 내지 3의 범위의 정수이며, 예를 들면 각각의 r은 0이고, Z는 아래 "아미노산 Z" 섹션에서 본원에 기술된 바와 같고, 바람직하게는 최대 4개, 예를 들어 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개를 제외한 모든 Z는 Thr이다.
하나의 양태에서 β-바디는 일반 서열 XXIV를 갖는 폴리펩타이드를 포함하거나 이들로 이루어진 화합물일 수 있다:
Xr(TX)mXqPGXq(XT)nXXqPGXqX(TX)mXqPGXq(XT)nXr
여기서
각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산, 예를 들어 아래 "아미노산 X" 섹션에서 본원에 기술된 아미노산 중의 임의의 것일 수 있고, 각각의 r은 개별적으로 0 내지 5의 범위, 바람직하게는 0 내지 3의 범위의 정수이며, 예를 들면 각각의 r은 0이고, 각각의 q는 "β-턴 펩타이드 서열" 섹션에 보다 상세하게 본원에 기술된 바와 같은 0 내지 3 범위의 정수이다.
하나의 양태에서 β-바디는 일반 서열 VI을 갖는 폴리펩타이드를 포함하거나 이들로 이루어진 화합물일 수 있다:
Xr(TX)mPG(XT)nXPGX(TX)mPG(XT)nXr
여기서
각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산, 예를 들어 아래 "아미노산 X" 섹션에서 본원에 기술된 아미노산 중의 임의의 것일 수 있고, 각각의 r은 개별적으로 0 내지 5의 범위, 바람직하게는 0 내지 3의 범위의 정수이며, 예를 들면 각각의 r은 0이다.
본원 다른 곳에 기술된 바와 같이 아미노산은 IUPAC 1-글자 코드 또는 3-글자 코드를 사용하여 명명될 수 있다. 따라서, 일반 서열 IV, V 및 VI에 대한 T 및 P는 각각 트레오닌 및 프롤린이다. 상기 트레오닌 및 프롤린은 D 또는 L 배위 중의 어느 하나일 수 있다. 본원 다른 곳에 기술된 바와 같이 단일 β-가닥 내의 모든 아미노산이 동일한 D 또는 L 배위 중의 어느 하나인 것이 바람직하다.
일반 서열 I, IV, V, VI, XVI, XVII, XVIII, XIX, XX, XXI, XXII, XXIII 또는 XXIV에 대해 m은 개별적으로 임의의 정수, 전형적으로 적어도 2의 정수, 바람직하게는 적어도 3의 정수, 예를 들면 3 내지 12 범위의 정수, 예를 들어 3 내지 7 범위의 정수, 예를 들면 3 내지 5 범위의 정수일 수 있다. 수 개의 정방향 β-가닥 펩타이드 서열 또는 수 개의 (TX)m 서열을 포함하는 β-바디에 관한 본 발명의 양태에서, m은 각각의 정방향 β-가닥 펩타이드 서열 및 각각의 (TX)m 서열에 관하여 동일하거나 상이한 정수일 수 있는 것으로 이해된다. 하나의 양태에서 하나의 β-바디 내의 모든 m은 서로 +/- 2의 범위 내에 있는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면 하나의 β-바디 내의 모든 m은 서로 +/- 1의 범위 내에 있을 수 있거나 이들은 동일할 수 있다.
일반 서열 II, IV, V, VI, XVI, XVII, XVIII, XIX, XX, XXI, XXII, XXIII 또는 XXIV에 대해, n은 개별적으로 임의의 정수, 전형적으로 적어도 2의 정수, 바람직하게는 적어도 3의 정수, 예를 들면 3 내지 12 범위의 정수, 예를 들어 3 내지 7 범위의 정수, 예를 들면 3 내지 5 범위의 정수일 수 있다. 수 개의 역방향 β-가닥 펩타이드 서열 또는 수 개의 (XT)n 서열을 포함하는 β-바디에 관한 본 발명의 양태에서, n은 각각의 역방향 β-가닥 펩타이드 서열 및 각각의 (XT)n 서열에 관하여 동일하거나 상이한 정수일 수 있는 것으로 이해된다. 하나의 양태에서 하나의 β-바디 내의 모든 n은 서로 +/- 2의 범위 내에 있는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면 하나의 β-바디 내의 모든 n은 서로 +/- 1의 범위 내에 있을 수 있거나 이들은 동일할 수 있다.
하나의 양태에서 하나의 β-바디 내의 모든 m 및 n은 서로 +/- 2의 범위 내에 있을 수 있다. 예를 들면 하나의 β-바디 내의 모든 m 및 n은 서로 +/- 1의 범위 내에 있을 수 있거나 이들은 동일할 수 있다.
기존의 항체에 비해, 본 발명의 β-바디는 전형적으로 소 분자이다. 전형적으로 이들은 10 내지 100개 범위의 아미노산, 예를 들어 15 내지 50개 범위의 아미노산, 예를 들면 15 내지 25개 범위의 아미노산으로 이루어진다. 하나의 양태에서, 본 기재내용의 β-바디는 서열번호 1 내지 서열번호 61로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하거나 이루어진다.
본 발명에 따르는 β-바디는 또한 사이클릭일 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, β-바디의 대부분의 N-말단 아미노산은 β-바디의 대부분의 C-말단 아미노산에 공유적으로 연결될 수 있다. 즉, β-바디는 사이클릭 펩타이드일 수 있다. 본원에 제공된 서열이 선형 포맷으로 제공되어 있기는 하지만, 이들 서열을 갖는 펩타이드는 또한 사이클릭일 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 예를 들면 β-바디는 일반 서열 I, IV, V, VI, XVI, XVII 또는 XVIII 중의 어느 것을 포함하거나 이루어진 사이클릭 펩타이드일 수 있다.
그러나, 바람직한 양태에서 β-바디는 선형, 예를 들면 일반 서열 I, IV, V, VI, XVI, XVII 또는 XVIII 중의 어느 것을 포함하거나 이루어진 선형 펩타이드이다.
하나의 양태에서 β-바디는 내향 β-바디이며, 여기서 아래 "아미노산 Z" 섹션에 정의된 바와 같은 Z 아미노산 잔기, 예를 들면 트레오닌은 β-타입2-턴에 바로 선행하여 따른다.
하나의 양태에서 β-바디는 외향 β-바디이며, 여기서 인식 잔기, 예를 들어 아래 "아미노산 X" 섹션에 정의된 바와 같은 X 아미노산 잔기는 β-타입2-턴에 바로 선행하여 따른다.
정방향 β-가닥
펩타이드
서열
본 발명은 정방향 β-가닥 펩타이드 서열을 포함하는 화합물에 관한 것이다. 정방향 β-가닥 펩타이드 서열은 전형적으로 하기 일반 서열 I을 갖는다:
(ZX)m
일반 서열 I의 정방향 β-가닥 펩타이드 서열과 관련하여, 각각의 Z는 개별적으로 아래 "아미노산 Z" 섹션에서 본원에 기술된 아미노산 중의 어느 것일 수 있다. 따라서, 전형적으로 각각의 Z는 개별적으로 극성 β-분지화 아미노산 및 가닥 브릿징 아미노산(strand bridging amino acid)으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 아미노산 Z가 일반적으로 β-바디의 3차원 구조에 기여할 수 있지만, 각 정방향 β-가닥 펩타이드 서열 내의 기껏해야 하나의 Z가 임의의 아미노산일 수 있음을 받아들일만 하다. 따라서, 각 정방향 β-가닥 서열 내의 기껏해야 하나의 Z는 β-분지화 또는 가닥 브릿징 아미노산이 아닌 아미노산일 수 있다. 정방향 β-가닥 펩타이드 서열 내의 Z는 동일하거나, 부분 동일하거나, 상이한 아미노산일 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명의 하나의 바람직한 양태에서, β-바디 내의 적어도 하나, 예를 들면, 모든 정방향 β-가닥 서열은 하기 일반 서열 VII을 가질 수 있다:
(TX)m
여기서, T는 트레오닌이다.
일반 서열 I 및 VII의 정방향 β-가닥 펩타이드 서열과 관련하여, 각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산, 예를 들어 아래 "아미노산 X" 섹션에서 본원에 기술된 아미노산 중의 어느 것일 수 있다. 정방향 β-가닥 펩타이드 서열 내의 각각의 X는 모두 동일하거나, 부분 동일하거나, 상이한 아미노산일 수 있는 것으로 이해된다.
일반 서열 I 및 VII의 정방향 β-가닥 펩타이드 서열과 관련하여, m은 임의의 정수, 전형적으로 적어도 2의 정수, 바람직하게는 적어도 3의 정수, 예를 들면 3 내지 12 범위의 정수, 예를 들어 3 내지 7 범위의 정수, 예를 들면 3 내지 5 범위의 정수일 수 있다.
일반 서열 I 및 VII의 아미노산 Z, X 및 T는 D 또는 L 배위 중 어느 하나일 수 있다. 하나의 β-가닥 펩타이드 서열 내의 모든 아미노산은 모두 동일한 D 또는 L 배위 중의 어느 하나를 갖는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 몇몇 양태에서 일반 서열 I의 모든 아미노산 Z 및 X는 D-배위이다. 본 발명의 몇몇 양태에서 일반 서열 I의 모든 아미노산 Z 및 X는 L-배위이다. 따라서, 본 발명의 몇몇 양태에서 일반 서열 VII의 모든 아미노산 T 및 X는 D-배위이다. 본 발명의 몇몇 양태에서 일반 서열 VII의 모든 아미노산 T 및 X는 L-배위이다.
몇몇 양태에서, β-바디의 정방향 β-가닥 펩타이드 서열은 동일한 β-바디의 역방향 β-가닥 펩타이드 서열에 공유 결합되어 사이클릭 β-바디를 형성할 수 있다.
몇몇 양태에서, β-바디의 정방향 β-가닥 펩타이드 서열 및 역방향 β-가닥 펩타이드 서열은 둘 다 비-단백질생성 아미노산 잔기를 포함할 수 있으며, β-바디는 사이클릭 형태이다.
역방향 β-가닥
펩타이드
서열
본 발명은 역방향 β-가닥 펩타이드 서열을 포함하는 화합물에 관한 것이다. 역방향 β-가닥 펩타이드 서열은 전형적으로 하기 일반 서열 II를 갖는다:
(XZ)nXr
일반 서열 II의 역방향 β-가닥 펩타이드 서열과 관련하여, 각각의 Z는 개별적으로 아래 "아미노산 Z" 섹션에서 본원에 기술된 아미노산 중의 어느 것일 수 있다. 따라서, 전형적으로 각각의 Z는 개별적으로 극성 β-분지화 아미노산 및 가닥 브릿징 아미노산으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 아미노산 Z가 일반적으로 β-바디의 3차원 구조에 기여할 수 있지만, 각 역방향 β-가닥 펩타이드 서열 내의 기껏해야 하나의 Z가 임의의 아미노산일 수 있음을 받아들일만 하다. 따라서, 각 역방향 β-가닥 서열 내의 기껏해야 하나의 Z는 β-분지화 또는 가닥 브릿징 아미노산이 아닌 아미노산일 수 있다. 역방향 β-가닥 펩타이드 서열 내의 Z는 동일하거나, 부분 동일하거나, 상이한 아미노산일 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명의 하나의 바람직한 양태에서, β-바디 내의 적어도 하나, 예를 들면 모든 역방향 β-가닥 서열은 하기 일반 서열 VIII을 가질 수 있다:
(XT)n
여기서, T는 트레오닌이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태에서, β-바디 내의 적어도 하나, 예를 들면 모든 역방향 β-가닥 서열은 하기 일반 서열 IX를 가질 수 있다:
(XT)nXr
여기서, T는 트레오닌이다.
일반 서열 II, VIII 및 IX의 역방향 β-가닥 펩타이드 서열과 관련하여, 각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산, 예를 들어 아래 "아미노산 X" 섹션에서 본원에 기술된 아미노산 중의 어느 것일 수 있다. 역방향 β-가닥 펩타이드 서열 내의 X는 동일하거나, 부분적으로 동일하거나, 상이한 아미노산일 수 있는 것으로 이해된다.
일반 서열 II, VIII 및 IX의 역방향 β-가닥 펩타이드 서열과 관련하여, n은 임의의 정수, 전형적으로 적어도 2의 정수, 바람직하게는 적어도 3의 정수, 예를 들면 3 내지 12 범위의 정수, 예를 들어 3 내지 7 범위의 정수, 예를 들면 3 내지 5 범위의 정수일 수 있다.
일반 서열 II 및 IX의 역방향 β-가닥 펩타이드 서열과 관련하여, r은 임의의 정수, 전형적으로 최대 3의 정수, 예를 들면 0 내지 3 범위의 정수일 수 있다. 따라서, r은 예를 들면 0 또는 1일 수 있다.
일반 서열 II, VIII 및 IX의 아미노산 Z, X 및 T는 D 또는 L 배위 중의 어느 하나일 수 있다. 하나의 역방향 β-가닥 펩타이드 서열 내의 모든 아미노산은 모두 동일한 D 또는 L 배위 중의 어느 하나를 갖는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 몇몇 양태에서 일반 서열 II의 모든 아미노산 Z 및 X는 D-배위이다. 본 발명의 몇몇 양태에서 일반 서열 II의 모든 아미노산 Z 및 X는 L-배위이다. 따라서, 본 발명의 몇몇 양태에서 일반 서열 VIII 또는 IX의 모든 아미노산 T 및 X는 D-배위이다. 본 발명의 몇몇 양태에서 일반 서열 VIII 또는 IX의 모든 아미노산 T 및 X는 L-배위이다.
β-턴
펩타이드
서열
본 발명은 β-턴 펩타이드 서열을 포함하는 화합물에 관한 것이다. β-턴 펩타이드 서열은 전형적으로 하기 일반 서열 III을 갖는다:
Xq1BUXq2.
본 발명의 몇몇 양태에서 B는 프롤린이다. 따라서, β-바디 내의 적어도 하나, 예를 들면 모든 β-턴 펩타이드 서열은 하기 일반 서열 X를 가질 수 있다:
Xq1PUXq2.
본 발명의 몇몇 양태에서 U는 글리신이다. 따라서, β-바디 내의 적어도 하나, 예를 들면 모든 β-턴 펩타이드 서열은 하기 일반 서열 XI을 가질 수 있다:
Xq1BGXq2.
본 발명의 몇몇 양태에서 β-바디 내의 적어도 하나, 예를 들면 모든 β-턴 펩타이드 서열은 하기 일반 서열 XII를 가질 수 있다:
Xq1PGXq2.
일반 서열 III 및 X의 β-턴 펩타이드 서열과 관련하여, U는 아래 "아미노산 U" 섹션에서 본원에 기술된 아미노산 U 중의 어느 것일 수 있다.
일반 서열 III 및 XI의 β-턴 펩타이드 서열과 관련하여, B는 예를 들면 프롤린, 치환된 프롤린 및 피페콜산으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 치환된 프롤린은 예를 들면 -OH, -NH2, -O-R, -NH-R, -NR2, 할로겐 및 C1-3-알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치환체로 치환된 프롤린일 수 있으며, 여기서 R은 알킬, 아실 또는 펩타이드이다. 하나의 양태에서 B는 Pro, 하이드록시프롤린(Hyp), 4-아미노-Pro 및 피페콜산으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
q1 및 q는 아미노산 Z의 측쇄가 β-바디의 동일 표면 상의 반대 위치에 위치하도록 정방향 β-가닥의 아미노산 Z가 역방향 β-가닥의 Z에 대향하여 위치하는 것을 보장하도록 선택되는 것이 바람직하다. 이것은 q1과 q2 간의 관계가 q1 - q2 = -4, -2, 0, 2 또는 4로 되도록 보장함으로써 수득될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "q1 - q2"를 "q1 마이너스 q2"라고 한다.
일반 서열 III, X, XI 및 XII의 β-턴 펩타이드 서열과 관련하여, 각각의 q1 및 q2는 개별적으로 정수, 바람직하게는 최대 5의 정수, 예를 들어 0 내지 5 범위의 정수, 예를 들어 0 내지 3 범위의 정수일 수 있다. q1과 q2 간의 관계는 바람직하게는 q1 - q2 = -4, -2, 0, 2 또는 4, 바람직하게는 q1 - q2 = 0으로 되도록 한다. 따라서, q1 및 q2는 예를 들면 둘 다 0일 수 있거나 둘 다 1일 수 있다. β-바디 내의 q1 및 q2는 동일하거나 상이한 정수일 수 있는 것으로 이해된다.
하나의 양태에서 β-바디 내의 적어도 하나, 예를 들면 모든 β-턴 펩타이드 서열은 하기 일반 서열 XIII을 가질 수 있다:
XPGX.
하나의 양태에서 β-바디 내의 적어도 하나, 예를 들면 모든 β-턴 펩타이드 서열은 하기 일반 서열 XIV를 가질 수 있다:
PGX.
하나의 양태에서 β-바디 내의 적어도 하나, 예를 들면 모든 β-턴 펩타이드 서열은 하기 일반 서열 XV를 가질 수 있다:
XPG.
일반 서열 III, X, XI, XII, XIII, XIV 및 XV의 β-턴 펩타이드 서열과 관련하여 각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산, 예를 들면 아래 "아미노산 X" 섹션에서 본원에 기술된 아미노산 중의 어느 것일 수 있다.
하나의 양태에서 β-바디 내의 적어도 하나, 예를 들면 모든 β-턴 펩타이드 서열은 하기 서열을 가질 수 있다:
PG
본원 다른 곳에 기술된 바와 같이 아미노산은 IUPAC 1-글자 코드를 사용하여 명명될 수 있다. 따라서, P 및 G는 각각 프롤린 및 글리신이다.
일반 서열 III, X, XI, XII, XIII, XIV 및 XV의 아미노산 X, B, U, P 및 G는 D 또는 L 배위 중의 어느 하나일 수 있다.
아미노산 X
본 발명은 하나 이상의 아미노산 X를 포함하는 펩타이드 서열을 포함하는 화합물에 관한 것이다.
아미노산 X는 임의의 아미노산, β-아미노산 또는 γ-아미노산, 예를 들어 하기 일반 구조 I의 화합물: 
일 수 있다. 아미노산 X가 펩타이드 서열의 일부인 경우, 아미노산은 펩타이드 결합을 통해 인접 아미노산에 결합된다.
하나의 양태에서 아미노산 X는 단백질생성 아미노산, 즉, 단백질에 삽입되는 임의의 아미노산일 수 있다.
하나의 양태에서 아미노산 X는 단백질에 삽입되는 단백질생성 아미노산의 에난티오머성 D-형태, 즉, L-아미노산에 대응하는 임의의 D-아미노산일 수 있다. 바람직하게는, 소정의 β-바디는 단지 D-형태 또는 L-형태 중의 어느 하나의 아미노산을 포함한다. 그러나, β-바디는 모두 L-형태 또는 모두 D-형태인 아미노산을 포함할 수 있고, 여기서 1 내지 3개의 아미노산은 반대 배위를 가질 수 있으며, 즉 L-β-바디가 1 내지 3개의 D-아미노산을 함유할 수 있고 그 반대일 수도 있다.
하나의 양태에서, 아미노산 X 중의 하나 이상, 예를 들어 모든 아미노산 X는 글리신, 알라닌, α-아미노-n-부티르산, 노르발린, 발린, 노르류신, 류신, 이소류신, 알로이소류신, t-류신, α-아미노-n-헵탄산, 프롤린, 피페콜산, α,β-디아미노프로피온산, α,γ-디아미노부티르산, 오르니틴, 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 알로트레오닌, 메티오닌, 호모시스테인, 호모세린, β-알라닌, β-아미노-n-부티르산, β-아미노이소부티르산, γ-아미노부티르산, α-아미노이소부티르산, 이소발린, 사르코신, N-에틸 글리신, N-프로필 글리신, N-이소프로필 글리신, N-메틸 알라닌, N-에틸 알라닌, N-메틸 β-알라닌, N-에틸 β-알라닌, 이소세린, α-하이드록시-γ-아미노부티르산, 프로파르길글리신 및 4-아지도-2-아미노부탄산으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
β-시트 완전성을 개선하기 위해, 각각의 β-바디가 최대 2개, 예를 들어 최대 하나의 β- 또는 γ-아미노산을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 바람직하게는, 상기 β- 또는 γ-아미노산은 β-턴에 또는 β-바디의 말단에 위치한다.
바람직하게는, 아미노산 X는 N-알킬화되지 않는다. 빈번히, β-가닥에 위치한 아미노산 X의 질소원자는 가닥간 수소 결합에 관여할 수 있다.
하나의 양태에서 하나 이상의 아미노산 X는 치환된 글리신의 그룹으로부터 선택될 수 있다. 치환된 글리신 잔기는 바람직하게는 화학식 -NH-CHR-CO-를 가지며, 여기서 R은 직쇄 C1-C20-알킬, 측쇄 C1-C20-알킬 그룹, 아릴 및 치환된 알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 상기 측쇄 C1-C20-알킬 그룹은 바람직하게는 iPr, iBu, tBu, sBu, 펜트-2-일, 펜트-3-일 및 2,2-디메틸프로필로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 상기 치환된 알킬은 바람직하게는 하나 이상의 치환체로 치환된 C1-20-알킬일 수 있다. 예를 들면 치환된 알킬은 벤질, 알릴, 프로파르길, 아릴-알킬, 하이드록시알킬, 아미노알킬, 설프하이드릴알킬 알킬아미노알킬, 디알킬아미노알킬, 알콕시알킬, 알킬티오알킬, 설포닐알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 치환된 알킬은 또한 벤질, C1-C20-알릴, 프로파르길, 아릴-C1-C20-알킬, C1-C20-하이드록시알킬, C1-C20-아미노알킬, C1-C20-설프하이드릴-알킬, C1-C20-알킬아미노알킬, C1-C20-디알킬아미노알킬, C1-C20-알콕시알킬, C1-C20-알킬티오알킬, 설포닐-C1-C20-알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 치환된 알킬 그룹은 또한 하전된 그룹, 예를 들어 포스페이트 설포네이트, 설페이트, 카복실레이트, 암모늄 및 구아니딜 그룹으로 치환될 수 있다.
하나의 양태에서 하나 이상의 아미노산 X는 이치환된 글리신의 그룹으로부터 선택될 수 있다. 이치환된 글리신 잔기는 바람직하게는 화학식 -NH-CR1R2-CO-를 가지며, 여기서 R1 및 R2는 개별적으로 직쇄 C1-C20-알킬, 측쇄 C1-C20-알킬 및 아릴로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 상기 측쇄 알킬은 특히 iPr, iBu 및 tBu로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
하나의 양태에서, 소정의 β-바디 내의 1 내지 4개의 아미노산 X는 β- 및 γ-아미노산, 예를 들어 상기한 아미노산과 유사한 β- 및 γ-아미노산의 그룹으로부터 선택될 수 있다.
하나의 양태에서, 아미노산 X 중의 하나 이상은 단백질생성 아미노산 및 비-단백질생성 아미노산으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있으며, 여기서 비-단백질생성 아미노산은 α-아미노-n-부티르산, 노르발린, 노르류신, 알로이소류신, t-류신, α-아미노-n-헵탄산, α,β-디아미노프로피온산, α,γ-디아미노부티르산, 오르니틴, 알로트레오닌, 호모시스테인, 호모세린, α-아미노이소부티르산, 이소발린, 사르코신, 호모페닐알라닌, 프로파르길글리신, 4-아지도-2-아미노부탄산 및 단백질생성 아미노산 중의 어느 것의 D-형태로 이루어진 아미노산의 그룹으로부터 선택된다. 상기한 비-단백질생성 아미노산은 D-형태 또는 L-형태 중의 어느 하나일 수 있다.
단백질생성 아미노산은 특히 알라닌, 시스테인, 아스파르트산, 글루탐산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 리신, 류신, 메티오닌, 아스파라긴, 피롤리신, 프롤린, 글루타민, 아르기닌, 세린, 트레오닌, 셀레노시스테인, 발린, 트립토판 및 티로신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산일 수 있다.
하나의 양태에서 아미노산 X 중의 하나 이상, 예를 들어 모든 아미노산 X는 표준 아미노산의 그룹으로부터 선택될 수 있다. 따라서, 하나의 양태에서, β-바디의 적어도 70%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들면 적어도 90%, 예를 들어 모든 X는 표준 아미노산이다.
아미노산 X는 일반적으로 L 또는 D-배위일 수 있다. 하나의 양태에서 하나의 β-가닥 펩타이드 서열 내의 모든 아미노산 X는 D-배위이다. 하나의 양태에서 하나의 β-가닥 서열 내의 모든 아미노산 X는 L-배위이다. 따라서, 하나의 양태에서 아미노산 X는 표준 아미노산 중의 어느 것에 대응하지만 D 배위인 아미노산일 수 있다. 따라서, 하나의 양태에서, β-바디의 적어도 70%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들면 적어도 90%, 예를 들어 모든 X는 표준 아미노산에 대응하지만 D-배위이다.
하나의 양태에서 β-바디 내의 모든 아미노산은 D-배위 또는 L-배위 중의 어느 하나인 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 하나의 양태에서 β-바디 내의 모든 β-가닥 서열의 모든 아미노산 X 및 모든 아미노산 Z는 D-배위이다. 또 다른 양태에서 β-바디의 모든 β-가닥 펩타이드 서열 내의 모든 아미노산 X 및 Z는 L-배위이다.
아미노산 Z
본 발명은 다수의 아미노산 Z를 포함하는 펩타이드 서열을 포함하는 화합물에 관한 것이다.
아미노산 Z는 바람직하게는 β-바디의 3차원 구조에 기여할 수 있는 아미노산이다. 특히, 각각의 아미노산 Z는 개별적으로 Thr, 극성 β-분지화 아미노산, β-가닥 구조를 촉진하는 비-단백질생성 α-분지화 아미노산 및 가닥 브릿징 아미노산으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
게다가, 각 β-가닥 내에서 최대 두 개의 아미노산 Z, 예를 들면 최대 하나의 아미노산 Z는 임의의 아미노산일 수 있다. 따라서 각 β-가닥 내의 두 개 이하의 아미노산 Z, 예를 들어 하나 이하의 아미노산 Z는 Thr, 극성 β-분지화 아미노산 및 가닥 브릿징 아미노산이 아닌 아미노산일 수 있다.
따라서, 하나의 양태에서 하나 이상의 아미노산 Z는 β-분지화 아미노산이다. 따라서, 하나 이상의 아미노산 Z는 이소류신, 트레오닌, 알로트레오닌, 알로이소류신, 발린, 2-아미노이소부티르산, 2-아미노-3,3-디메틸부탄산, 프로파르길글리신 및 4-아지도-2-아미노부탄산으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
하나의 양태에서 하나 이상의 아미노산 Z는 β-가닥 구조를 촉진시키는 비-단백질생성 α-분지화 아미노산, 예를 들어 α-아미노이소부티르산, 디에틸글리신, 디프로필글리신, 디페닐글리신, 1-아미노사이클로부탄-1-카복실산, 1-아미노사이클로펜탄-1-카복실산, 1-아미노사이클로헥산-1-카복실산, 1-아미노사이클로헵탄-1-카복실산, 프로파르길글리신 및 4-아지도-2-아미노부탄산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산이다.
하나의 양태에서 하나 이상의 아미노산 Z는 가닥 브릿징 아미노산이다. 따라서, 하나 이상의 아미노산 Z는 시스테인, 아스파라긴, 트레오닌, 아스파르트산, 글루탐산, β-아미노 알라닌, γ-아미노-α-아미노부티르산, 오르니틴, 리신, 알킨으로 치환된 아미노산, 아지드로 치환된 아미노산 및 환원적 아민화에 의한 브릿징에 적합한 아미노산으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 알킨 또는 아지드로 치환된 아미노산은 바람직하게는 클릭 화학에 유용한 아미노산, 예를 들어 프로파르길 글리신, β-아지도알라닌, γ-아지도-α-아미노부티르산 또는 4-아지도-2-아미노부탄산이다. 환원적 아민화에 의한 브릿징에 적합한 아미노산은 아미노산 알데히드, 예를 들면 디하이드록실화/산화를 통해 예를 들어 2-알릴-글리신 또는 2-호모알릴-글리신으로부터 생성된 알데히드를 포함한다.
하나의 양태에서 아미노산 Z 중의 하나 이상은 임의의 직쇄 C1-C20-알킬, 측쇄 C1-C20-알킬, 또는 치환된 알킬 그룹으로 N-알킬화될 수 있다. 상기 치환된 알킬은 예를 들면 치환된 C1-C20-알킬, 예를 들어 벤질, 알릴, 프로파르길, 아지도알킬, 아미노알킬, 설프하이드릴알킬 또는 할로알킬일 수 있으며, 여기서 상기한 것들 중의 어느 것은 바람직하게는 치환된 C1-20-알킬이다. 상기 측쇄 C1-C20-알킬은, 예를 들면 iPr, iBu, 또는 tBu일 수 있다.
바람직한 양태에서 아미노산 Z 중의 적어도 일부는 트레오닌이다. 따라서, 각각의 β-가닥 펩타이드 서열 내의 아미노산 Z의 적어도 70%, 예를 들어 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%는 트레오닌일 수 있다. 또한, β-바디 내의 아미노산 Z의 적어도 70%, 예를 들어 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%가 트레오닌일 수 있는 것이 바람직하다.
하나의 양태에서 β-바디 내의 모든 아미노산 Z는 트레오닌이다.
아미노산 Z는 L 또는 D-배위 중의 어느 하나일 수 있다. 따라서, 하나의 양태에서 하나의 β-가닥 펩타이드 서열 내의 모든 아미노산 Z는 D-배위이다. 또 다른 양태에서 하나의 β-가닥 서열 내의 모든 아미노산 Z는 L-배위이다.
따라서, 하나의 양태에서 β-바디 내의 적어도 일부, 예를 들면 모든 아미노산 Z는 L-트레오닌이다. 또 다른 양태에서 β-바디 내의 적어도 일부, 예를 들면 모든 아미노산 Z는 D-트레오닌이다.
아미노산 U
본 발명은 아미노산 U를 포함하는 펩타이드 서열을 포함하는 화합물에 관한 것이다.
아미노산 U는 전형적으로 프롤린 옆에 위치할 경우 β-턴의 형성을 도울 수 있는 비교적 작은 아미노산이다. 특히, 각각의 아미노산 U는 개별적으로 일반 구조 VI의 아미노산일 수 있다: 
, 여기서 Ra 및 Rb는 개별적으로 -H 및 C1-6-알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 여기서 Ra 및 Rb는 결합하여 사이클릭 구조를 형성할 수 있다. Ra가 Rb와 다르다면, 아미노산 U는 S 또는 L 배위 중의 어느 하나일 수 있다.
하나의 양태에서 아미노산 U는 글리신이다. 아미노산 U는 S 또는 R 배위일 수 있다. 아미노산 U는 예를 들면 D-글리신 또는 L-글리신일 수 있다.
β-
바디를
제조하는 방법
본 발명에 따르는 β-바디는 다수의 연결된 펩타이드 서열를 포함하거나 이들로 이루어진다. 따라서, β-바디는 폴리펩타이드를 포함하거나 심지어 이것으로 이루어진다.
따라서, β-바디는 폴리펩타이드를 생산하기 위한 표준 방법에 의해 제조될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명의 β-바디는 표준 화학 펩타이드 합성에 의해, 예를 들면 고체상 펩타이드 합성(SPPS)에 의해 제조된다.
전형적으로 이러한 방법은 펩타이드 쇄가 구축될 수 있는 링커에 부착된 고체 지지체의 사용을 포함한다. 합성 동안 β-바디는 고체 지지체에 공유 결합된 상태로 있을 것이며, 그후 합성이 완료되면 고체 지지체로부터 임의로 절단될 수 있다. 따라서, 링커는 절단 가능한 링커일 수 있다.
SPPS는 통상적으로 고체 지지체와 결합된 펩타이드의 유리 N-말단 아민을 N-보호된 아미노산과 반응시키는 여러 사이클을 포함한다. 사이클은 아미노산의 서열이 제어될 수 있도록 순서가 정해진다. SPPS는 통상적으로 C-말단에서 N-말단 방식으로 진행된다. 따라서, 방법은 다음의 단계들을 포함할 수 있다:
i. 유리 아미노 그룹을 포함하는 링커에 부착된 고체 지지체를 제공하는 단계,
ii. β-바디 폴리펩타이드 서열의 제1 아미노산을 N-보호된 아미노산의 형태로 제공하는 단계,
iii. 상기 유리 아미노 그룹을 상기 아미노산과 반응시켜 펩타이드 결합을 형성하는 단계,
iv. 아미노 그룹 결합된 아미노산을 탈보호하여 유리 아미노 그룹을 제조하는 단계,
v. 유리 반응물을 세척 제거하는 단계,
vi. β-바디 폴리펩타이드 서열의 다음 아미노산을 N-보호된 아미노산의 형태로 제공하는 단계,
vii. 유리 아미노 그룹을 상기 아미노산과 반응시켜 펩타이드 결합을 형성하는 단계,
viii. 전체 폴리펩타이드가 생산될 때까지 단계 iv. 내지 vii을 반복하는 단계,
ix. 임의로 링커를 절단하는 단계.
N-보호된 아미노산은 예를 들면 Fmoc 또는 Boc로 보호될 수 있다. SPPS는 수동으로 또는 자동 합성기의 도움으로 수행될 수 있다.
고체 지지체는 임의의 유용한 고체 지지체일 수 있으며, 예를 들면 고체 지지체는 폴리스티렌 수지, 폴리아미드 수지, PEG 혼성 폴리스티렌 수지 및 PEG 기반 수지로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 특히, 고체 지지체는 수지 비드, 예를 들어 PEGA 비드의 형태일 수 있다. 이러한 비드는 마이크로-입자로 인코딩될 수 있으며 예를 들면 문헌(Meldal and Christensen, 2010)에 기술된 수지 비드 중의 어느 것일 수 있다.
트리아졸 또는 디설파이드 결합의 클릭 형성을 통한 고리화는 β-구조 안정성 및 선택성을 증가시키는데 바람직할 수 있다. 예를 들면, 두 개의 대향하는 트레오닌 잔기는 구리(I)-촉매된 아지드 알킨 고리부가(CuACC) 반응을 위해 L-프로파르길글리신(Pra) 및 L-4-아지도-2-아미노부탄산(Abu(N3)) 잔기로 또는 디설파이드 형성을 위해 두 개의 시스테인 잔기로 대체될 수 있다. β-바디의 개방 말단에 가까운 두 개의 트레오닌 잔기는 사이클릭 구조를 형성하도록 선택하기에 유리할 수 있다. 몇몇 트레오닌 쌍이 적합 β-바디 구조에 가장 적은 영향을 주는 쌍을 식별하기 위해 시험될 수 있다. 대안적으로, 고리화는 상기한 퇴화된 β-바디의 단계에서 이미 구현될 수 있다. 연신 프로브를 β-바디에 추가할 가능성을 또한 평가할 수 있다. "접합 모이어티"섹션에 기술된 바와 같은 추가의 모이어티 뿐만 아니라 프로브, 펩타이드, 또는 고체 지지체에 β-바디를 연결시키기 위해 연신 프로브를 추가하는 것이 유익할 수 있다. 예를 들면, β-바디를 글리신, 알라닌 및/또는 세린과 같은 잔기로 연신시키는 것은 β-바디의 기능에 유익할 수 있다. β-바디를 아르기닌 및/또는 리신과 같은 잔기로 연신시키는 것은 β-바디의 용해도를 개선시키는데 유익할 수 있다.
β-바디가 접합 모이어티에 연결된 본 발명의 양태에서, β-바디는 상기한 바와 같이 합성될 수 있고 적절한 클릭 파트너를 함유하는 여분의 아미노산 구성 블록을 갖출 수 있으며 정제시 클릭 반응을 위해 적절한 파트너에 부착되어 결합된 모이어티일 수 있다. 상기 모이어티는 (인코딩된) 생체적합성 수지 또는 또 다른 표면일 수 있다. 클릭 파트너는 예를 들면 테트라진, 알데히드, 아민옥시-그룹, 아지드 또는 알킨일 수 있다.
대안적으로, β-바디는 β-바디의 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 수반하는 재조합 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 방법은 또한 당업계에 널리 공지되어 있으며 다음의 단계들을 포함할 수 있다:
· β-바디의 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종 핵산을 포함하는 숙주를 제공하는 단계
· 숙주 세포의 성장을 가능케 하는 조건하에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계
· 임의로 숙주 세포로부터 β-바디를 정제하는 단계
β-바디는 또한 시험관내에서, 예를 들면 다음의 단계들을 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다:
· β-바디의 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 제공하는 단계
· 상기 핵산을 전사 및 번역할 수 있는 시약을 제공하는 단계
· 상기 핵산을 상기 시약과 배양하는 단계
β-
바디를
확인하는 방법
본원에 기술된 바와 같이 본 발명은 표적 화합물에 특이적으로 결합할 수 있는 β-바디에 관한 것이다. β-바디의 아미노산 Z, B 및 U가, 예를 들어 β-헤어핀 또는 β-시트의 형태로 β-바디의 안정한 3차원 구조를 가능하게 하지만, 아미노산 X는 임의의 아미노산일 수 있고 □-바디의 특이성을 결정할 수 있다. 따라서, 아미노산 X는 β-바디와 표적 화합물 간의 특이 결합을 가능하게 하도록 선택된다. 표적 화합물은 임의의 화합물, 예를 들면 또 다른 β-바디, 펩타이드, 올리고당 또는 단백질일 수 있다.
관심 표적 화합물에 결합하는 β-바디를 확인하는 몇 가지 방법이 있다. 표적 화합물이 단백질인 본 발명의 양태에서, 표적 화합물을 "관심 단백질" 또는 POI라고 할 수 있다.
β-바디를 확인하는 방법
본원에 기술된 바와 같이 본 발명은 표적 화합물에 특이적으로 결합할 수 있는 β-바디에 관한 것이다. β-바디의 아미노산 Z, B 및 U가, 예를 들어 β-헤어핀 또는 β-시트의 형태로 β-바디의 안정한 3차원 구조를 가능하게 하지만, 아미노산 X는 임의의 아미노산일 수 있고 β-바디의 특이성을 결정할 수 있다. 따라서, 아미노산 X는 β-바디와 표적 화합물 간의 특이 결합을 가능하게 하도록 선택된다. 표적 화합물은 임의의 화합물, 예를 들면 또 다른 β-바디, 펩타이드, 올리고당 또는 단백질일 수 있다.
관심 표적 화합물에 결합하는 β-바디를 확인하는 몇 가지 방법이 있다. 표적 화합물이 단백질인 본 발명의 양태에서, 표적 화합물을 "관심 단백질" 또는 POI라고 할 수 있다.
표적 화합물의 3차원 구조가 알려져 있다면, 방법은 표적 화합물 상의 부위를 구조적으로 맞추는 β-바디를 확인하기 위한 컴퓨터 기반 방법일 수 있다. 표적 화합물의 구조는 예를 들어 x선 결정학 또는 NMR에 의해 결정될 수 있거나, 예를 들어 PDB (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do) 또는 PSILO (http://www.chemcomp.com/PSILO-Protein_Structure_Database_System.htm)와 같은 공용 데이터베이터에서 공개적으로 이용 가능할 수 있다.
따라서, 표적 화합물에 결합할 수 있는 β-바디를 확인하는 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
a. 컴퓨터에서 표적 화합물의 공간 구조 표현의 원자 좌표를 제공하는 단계;
b. 표면 토폴로지 및 전하 분포를 나타내는 정전기 VDW 표면을 상기 공간 구조에 제공하는 단계;
c. 컴퓨터에서 본 발명에 따르는 다수의 β-바디의 공간 구조 표현을 생성하는 단계;
d. 상기 컴퓨터에서 표적 화합물의 공간 구조의 적어도 일부에 맞춘 β-바디를 선택하는 단계;
e. 상기 선택된 β-바디의 공간 구조 표현에 정전기 VDW 표면 표현을 제공하는 단계;
f. 상기 컴퓨터에서 표면 토폴로지 및 전하-전하 상호작용 둘 다의 최적 상보성을 갖는 β-바디를 선택하기 위해 분자 동역학 계산을 사용함으로써
표적 화합물에 결합할 수 있는 β-바디를 확인하는 단계.
방법은 유용한 소프트웨어의 도움으로, 예를 들면 케미칼 컴퓨팅 그룹(Chemical Computing Group)의 분자 작동 환경(Molecular Operating Environment)(예를 들어 MOE - ver.2015.10)을 사용하여 수행할 수 있다. 방법을 수행하는데 유용한 소프트웨어의 또 다른 예는 RosettaTM이다. 전형적으로 단계 a.는 표적 화합물의 구조에 관한 정보를 컴퓨터에, 예를 들어, PDB-파일의 형태로 로딩하는 단계를 포함한다. 일단 공간 구조 표현이 이용가능해지면 이것을 예를 들어 수소 원자의 추가 및/또는 누락된 부분의 구조의 조사 및 보정에 의해, 예를 들어 상동성 모델링에 의해 또는 가능하다면 제한된 동역학에 의해 변형시킬 수 있다. 바람직하게는 모델링은 구조로부터 정확하게 수득된 단면을 교란시키지 않는다.
방법의 단계 b. 및 c.는 아래와 같이 수행될 수 있다.
공간 구조 표현이 이용 가능해지면 모델을 공간에 고정시키고 컴퓨터에 분자 정전기 표면을 장착할 수 있다. β-바디의 공간 구조는 β-바디의 무작위 라이브러리를 사용하여 제조될 수 있다. 그러나 β-바디의 공간 구조는 또한 참조 β-바디의 공간 구조를 제조함으로써 제조될 수 있다. 참조 β-바디는 임의의 β-바디, 예를 들어 "β-바디" 섹션에서 상기 본원에 기술된 β-바디 중의 어느 것일 수 있다. 예를 들면 이것은 그 섹션에 기술된 일반 서열 IV, V 또는 VI 중의 어느 것에 따르는 β-바디일 수 있다. 단순화를 위해 참조 β-바디의 모든 아미노산 X는 동일한 아미노산, 및 바람직하게는 매우 다른 화학적 특성이 없는 아미노산, 예를 들어 Ala으로 설정될 수 있다. 따라서, 참조 β-바디는 일반 서열 (TX)mPG(XT)n의 β-바디일 수 있으며, 여기서 X는 초기에 알라닌일 수 있고, 트레오닌의 30% 이하는 다른 β-분지화 또는 가닥 브릿징 아미노산 중의 어느 하나로 무작위로 대체될 수 있다.
참조 β-바디와 표적 화합물 간에 최적 맞춤(best fit)을 찾아낸다. 이것은 수동으로 및/또는 컴퓨터 보조 수단에 의해, 예를 들어 전반적인 형태 적합성 및 아미노산 측쇄와의 상호 작용에 유망한 그루브(groove), 피트(pit) 및 패치(patch)의 존재의 측면에서 최적의 상호작용을 위한 부위를 확인하기 위해 표적 화합물의 표면을 가로질러 참조 β-바디의 공간 구조 표현을 이동 및/또는 회전시킴으로써 행해질 수 있다.
표적 화합물에 대한 친화도를 더욱 개선시키기 위해, 트레오닌이 β-타입2-턴에 바로 선행하여 따르는 퇴화된 내향 β-바디, 또는 인식 잔기가 β-타입2-턴에 바로 선행하여 따르는 외향 β-바디(이들 둘 다는 D- 및/또는 L-아미노산을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다)가 선택되고 각각 갈라진 틈(cleft)(예를 들어 활성 부위) 또는 표면 인식을 위한 MOE로 가져올 수 있다.
표적 화합물을 고정된 위치에 유지하면서, β-바디는 유리하게는 한 방울의 물에 침지될 수 있고(인실리코), 여기서 이것은 계산 과정의 나머지에 걸쳐 유지될 수 있으며 전체 구조를 표면의 형상에 맞추기 위해 곧(0.1 fs 내지 10 ns) 273K의 온도에 적용될 수 있다.
참조 β-바디의 가장 유망한 위치가 선택될 수 있으며, 예를 들어 1 내지 10개의 가장 유망한 위치가 선택될 수 있다. 이때 최상의 아미노산 X는 선택된 결합면에의 각각의 측쇄에 대한 최적 맞춤을 수득하기 위해 β-바디의 각각의 아미노산 X에 대해 결정된다. 표면 접촉은 토폴로지와 정전기 전위 측면에서 최적화된다. 따라서, 참조 β-바디의 모든 아미노산 X가 알라닌인 경우, 알라닌 측쇄에 대한 최상의 교체가 결정된다. 접촉을 개선시킬 가능성이 가장 큰 잔기 교체는 주쇄의 N 또는 CO 중 어느 하나에 대해 180°의 α-β 결합의 비틀림 각을 사용하여 전형적으로 수행된다. 드문 경우에 또는 β-분지화 잔기가 있는 경우에만 60°,-60°의 옵션이 사용된다. 교체 후에는 친화도 또는 적합도가 개선되었는지 평가하기 위해 50 ps MD-계산이 뒤따른다.
이 공정 동안 어닐링에 의한 분자 역학을 이용한 여러 라운드의 맞춤이 수행될 수 있다. 전형적으로, 1 내지 20회 범위의 라운드, 예를 들어 1 내지 10회 범위의 라운드가 최적 맞춤을 찾기 위해 수행된다. 각 라운드에서 상호작용이 평가될 수 있으며 정전기 전위의 양호한 접촉 및 일치를 보일 수 있지만 다른 잔기가 단백질 표면에 도달하는 것을 방지할 수 있는 잔기가 확인된다. 어닐링에 의한 분자 역학을 이용한 맞춤은 임의의 유용한 온도, 빈번히 450 내지 300 K 범위의 온도에서 0.1 fs 내지 10 ns 동안 수행될 수 있다. 맞춤은 8-10층의 물의 부가 층으로 수행될 수 있으며, 아미노산 측쇄 배향, H-결합 망상구조, 소수성 상호작용, 전하-전하 상호작용의 부가 효과를 고려하여 수행될 수 있다.
일단 유용한 β-바디의 러프 모델이 설계되면, β-바디와 직접 접촉하는 표적 화합물의 잔기가 고정으로부터 해제될 수 있다. 따라서, 표적 화합물이 단백질인 경우 β-바디와 직접 접촉하는 POI의 아미노산은 고정으로부터 해제될 수 있는 반면 POI 구조의 나머지는 여전히 고정될 수 있다. 상호 작용을 개량하기 위해 아미노산 X의 추가 교환이 수행될 수 있다.
일단 유용한 β-바디가 설계되면, 상호작용을 1-2 ns 동안 450 내지 300 K 범위의 온도에서 어닐링함으로써 분자 역학에 의해 시험할 수 있다. 이러한 조건하에서 표적 화합물과 안정한 상호작용을 보이는 β-바디가 선택된다.
방법은 또한 β-바디를 최적화하는 단계를 포함할 수 있다. 최적화는 예를 들면 각 아미노산(예를 들어, 각 아미노산 X)을 다른 아미노산, 예를 들어 Ala로 대체하여 β-바디를 스캐닝함으로써 잠재적으로 최적화된 β-바디의 그룹을 수득함을 포함할 수 있다. 최적화는 또한 하나의 아미노산, 예를 들어, 아미노산 X를 수 개의 다른 아미노산으로 대체하여 β-바디를 스캐닝함으로써 잠재적으로 최적화된 β-바디의 그룹을 수득함을 포함할 수 있다. 그후 잠재적으로 최적화된 β-바디를 개선된 특성, 예를 들어, 보다 낮은 어닐링 온도를 갖는지에 대해 시험할 수 있다. 이러한 시험은 상기한 바와 같은 컴퓨터 모델을 사용하여 수행될 수 있거나 실험실에서 시험될 수 있다.
표적 결정 구조의 부재시, 시험 β-바디를 라이브러리로서 합성하거나 인식 잔기의 변형을 가진 파지 디스플레이 라이브러리에서 발현시킨 다음 표적 단백질 또는 다른 생체-표면에 대해 스크리닝할 수 있다. 원-비드 원-화합물(one-bead one-compound) 합성 라이브러리, 예를 들어 구조적 턴 잔기와 트레오닌이 유지되는 분할-믹스(split-mix) 접근법을 통해 생성된 것들이 유리하게 사용될 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리는 DNA-시퀀싱을 통해 해독된 고 친화성 리간드를 생성하기 위해 통상적인 방식으로 표적 단백질에 대해 패닝될 수 있다.
일단 유용한 β-바디가 설계되면, 이것은 "β-바디를 제조하는 방법" 섹션에서 상기 본원에 기술된 바와 같이 제조하고 시험할 수 있다. 따라서, 확인을 위한 방법은 다음의 단계들을 추가로 포함할 수 있다:
d. 단계 c.에서 확인된 공간 구조의 β-바디를 제공하는 단계
e. 표적 화합물을 제공하는 단계
f. 상기 β-바디가 상기 표적 화합물에 결합할 수 있는지를 결정하는 단계
g. 상기 표적 화합물에 결합할 수 있는 β-바디를 선택하는 단계.
β-바디는 또한 추정 β-바디의 라이브러리로부터의 선택에 의해 확인될 수 있다. 따라서, 표적 화합물에 결합할 수 있는 β-바디를 확인하는 방법은 다음의 단계들을 포함할 수 있다:
· 표적 화합물을 제공하는 단계
· 다수의 시험 β-바디, 예를 들어 상기 본원의 "β-바디" 섹션에 기술된 β-바디 중의 어느 것을 포함하는 라이브러리를 제공하는 단계
· 상기 시험 β-바디가 상기 표적 화합물에 결합할 수 있는지를 결정하는 단계
· 상기 표적 화합물에 결합할 수 있는 β-바디를 선택함으로써
표적 화합물에 결합할 수 있는 β-바디를 확인하는 단계.
라이브러리의 취급을 용이하게 하기 위해, β-바디는 고체 지지체 상에 고정될 수 있다. 상기 고체 지지체는 예를 들어 폴리스티렌 수지, 폴리아미드 수지, PEG 혼성 폴리스티렌 수지 또는 PEG 기반 수지를 포함한 임의의 유용한 고체 지지체일 수 있다. 하나의 양태에서, 시험 β-바디는 각 유형의 β-바디가 다른 유형의 β-바디와는 공간적으로 분리되도록 하는 방식으로 고체 지지체에 연결된다. 예를 들면 β-바디는 고체 지지체 상에, 개별 웰 또는 용기에 또는 수지 비드 상에 불연속 점으로 고정될 수 있다.
하나의 양태에서 β-바디는 수지 비즈, 예를 들어 β-바디의 온-비드 합성(on-bead synthesis)에 유용한 수지 비드 상에 고정된다. 따라서, 수지 비드는 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 수지, 예를 들어 PEGA (폴리에틸렌글리콜 아크릴아미드 공중합체; Meldal M., 1992, Tetrahedron Lett ., 33: 3077-80), POEPOP (폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌; Renil et al., 1996, Tetrahedron Lett ., 37: 6185-88) 또는 SPOCC (초 침투성 유기 결합 화학; Rademann et al, 1999, J. Am. Chem . Soc., 121: 5459-66)일 수 있다. 이들 수지는 상이한 기공 크기로 이용 가능하다.
본 발명의 하나의 양태에서 수지 비드는 Jandagel® 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하는 수지 비드로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 수지 비드는 폴리에틸렌글리콜 아크릴아미드 공중합체(PEGA), 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌(POEPOP), 초 투과성 유기 결합 화학(SPOCC), POEPS 및 Tentagel®로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
라이브러리는 원-비드-원-β-바디 라이브러리일 수 있으며, 여기서 각 비드는 동일 서열의 β-바디에만 연결된다. 원-비드-원-화합물 라이브러리는 문헌(Christensen et al., 2003, Lam et al., 1976, or Lam et al., 1991)에 요약된 원리에 따라 제조될 수 있다. 요컨대, 짧은 라이브러리는 다음의 단계들을 포함하는 분할/믹스 방법에 의해 제조될 수 있다:
1. 수지 비즈의 수 개의 혼주물(pool)을 제공하는 단계
2. 하나의 아미노산을, 예를 들어 "β-바디를 제조하는 방법" 섹션에서 상기 기술된 바와 같은 SPPS에 의해 수지 비드의 각 혼주물의 수지 비드에 부착시키는 단계(여기서 상이한 아미노산은 상이한 혼주물의 수지 비드에 부착될 수 있다)
3. 상기 혼주물을 혼합하여 단일 혼주물을 수득하는 단계
4. 상기 혼주물을 분할하여 신규 혼주물을 수득하는 단계
5. 단계 2 내지 4를 반복하는 단계.
라이브러리는 표지된 표적 화합물과 함께 배양될 수 있으며 라이브러리 비드의 형광 강도가 결정되어 원하는 특성을 갖는 β-바디를 선별하는데 사용될 수 있다. 이들은 수지로부터 방출되고, 예를 들면 MS-MS 시퀀싱, 또는 유리하게는 변형된 및/또는 비-단백질생성 아미노산 잔기의 경우에 뿐만 아니라 사이클릭 펩타이드에 대해 유익한 마이크로-입자 매트릭스 디코딩을 통해 디코딩될 수 있다. 확인된 활성 β-바디는 재합성될 수 있으며 결합을 측정하여 구조 활성 관계를 확인할 수 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, β-바디를 확인하는 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
· 검출 가능한 표지에 연결된 표적 화합물을 제공하는 단계,
· 예를 들어 상기한 바와 같이 제조된 원-비드-원-β-바디 라이브러리를 제공하는 단계,
· 상기 표적 화합물을 상기 라이브러리와 배양하는 단계,
· 검출 가능한 표지와 관련된 비드를 확인하는 단계,
· 상기 확인된 비드에 연결된 β-바디의 구조를 결정하는 단계.
표적 화합물에 결합하는 β-
바디
상기 본원에 명시된 바와 같이 본 발명의 β-바디는 바람직하게는 높은 친화도 및/또는 특이성으로 표적 화합물에 결합할 수 있다.
따라서, β-바디는 최대 10-6 M 이하, 예를 들어 10-7 M 이하, 예를 들어 10-8 M 이하, 예를 들면 10-9 M 이하, 예를 들어 10-10 M, 또는 심지어 10-11 M 이하의 Kd로 이의 표적 화합물에 결합할 수 있다.
일단 표적 화합물, 예를 들어 단백질에 결합하는 β-바디가 확인되면, 상기 β-바디에 대한 친화도는 상기 β-바디의 아미노산 X, Z, B 또는 U를 다른 유사한 아미노산으로 치환함으로써 실험적으로 개선될 수 있다. 이것은 평행 또는 집중 조합 합성에 의해, 예를 들어 컬럼의 배열로 또는 표면상의 스팟 합성에 의해 달성될 수 있다.
본 기재내용의 하나의 양태에서 β-바디는 서열번호 1 내지 서열번호 61로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
본 기재내용의 하나의 양태에서 β-바디는 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 녹색 형광 단백질 (GFP)에 결합한다.
본 기재내용의 하나의 양태에서 β-바디는 서열번호 5 내지 서열번호 13으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 인터류킨 1 (IL1)에 결합한다.
본 기재내용의 하나의 양태에서 β-바디는 서열번호 14 및 서열번호 15로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 인터류킨 2 (IL2)에 결합한다.
본 기재내용의 하나의 양태에서 β-바디는 서열번호 16 내지 서열번호 19로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 인터류킨 6 (IL6)에 결합한다.
본 기재내용의 하나의 양태에서 β-바디는 서열번호 20 및 서열번호 21로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 인터류킨 10 (IL10)에 결합한다.
본 기재내용의 하나의 양태에서 β-바디는 서열번호 22 및 서열번호 23으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 인터류킨 12 (IL12)에 결합한다.
본 기재내용의 하나의 양태에서 β-바디는 서열번호 24 및 서열번호 25로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 인터류킨 18 (IL18)에 결합한다.
본 기재내용의 하나의 양태에서 β-바디는 서열번호 26 내지 서열번호 27로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 종양 괴사 인자 알파(TNFα)에 결합한다.
본 기재내용의 하나의 양태에서 β-바디는 서열번호 28 내지 서열번호 29로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile)로부터의 독소 A에 결합한다.
본 기재내용의 하나의 양태에서 β-바디는 아미노산 서열 서열번호 30을 포함하거나 이들로 이루어지고, 보툴리눔 독소(BTX)에 결합한다.
본 기재내용의 하나의 양태에서 β-바디는 아미노산 서열 서열번호 31을 포함하거나 이들로 이루어지고, 리신에 결합한다.
본 기재내용의 하나의 양태에서 β-바디는 서열번호 32 내지 서열번호 45로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 게피린(gephyrin)에 결합한다.
본 기재내용의 하나의 양태에서 β-바디는 서열번호 32 및 서열번호 33으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 게피린의 단백질-단백질 계면에서 결합한다.
본 기재내용의 하나의 양태에서 β-바디는 서열번호 34, 서열번호 41, 서열번호 42 및 서열번호 43으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 게피린의 펩타이드 결합 부위에 결합한다.
본 기재내용의 하나의 양태에서 β-바디는 서열번호 35 및 서열번호 36으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 게피린의 유리 부위에서 결합한다.
본 기재내용의 하나의 양태에서 β-바디는 서열번호 37 내지 서열번호 40으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 게피린의 몰리브덴 결합 부위에 결합한다.
본 기재내용의 하나의 양태에서 β-바디는 서열번호 46 및 서열번호 47로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 서브틸리신에 결합한다.
본 기재내용의 하나의 양태에서 β-바디는 서열번호 48 내지 서열번호 52로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 파파인에 결합한다.
검출 방법
하나의 양태에서 본 발명은 샘플에서 표적 화합물의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
a. 샘플을 제공하는 단계;
b. 상기 표적 화합물에 결합할 수 있는 β-바디, 예를 들어 "β-바디" 섹션에서 상기 본원에 기술된 β-바디 중의 어느 것을 제공하는 단계
c. 상기 샘플을 상기 β-바디와 배양하는 단계
d. 상기 샘플에 결합된 β-바디를 검출하는 단계
β-바디는 고체 지지체, 예를 들어 "β-바디를 확인하는 방법" 섹션에서 상기 본원에 기술된 고체 지지체 중의 어느 것 상에 고정될 수 있다.
하나의 양태에서 본 발명은 샘플에서 표적 화합물의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
a. 샘플을 제공하는 단계
b. 적어도 두 개의 상이한 β-바디, 예를 들어 "β-바디" 섹션에서 상기 본원에 기술된 β-바디 중의 어느 것을 제공하는 단계(여기서, 상기 β-바디 둘 다는 상기 표적 화합물에 결합할 수 있다)
c. 상기 샘플을 상기 β-바디와 배양하는 단계
d. 상기 샘플에 결합된 β-바디를 검출하는 단계
바람직하게는, 상기 β-바디는 상기 표적 화합물 상의 상이한 부위들에 결합할 수 있다. 상기 β-바디 중의 하나는 고체 지지체 상에 고정될 수 있고, 다른 β-바디는 검출 가능한 표지에 연결될 수 있다. 상기 샘플에 결합된 β-바디를 검출하는 단계는 고체 지지체와 관련된 검출 가능한 표지를 검출함을 포함할 수 있다.
하나의 양태에서 본 발명은 샘플에서 다수의 표적 화합물의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 다수의 표적 화합물 각각에 대해 상기한 방법을 수행함을 포함한다.
각 표적 화합물을 인식하는 β-바디 중의 하나는 개별 고체 지지체 상에 고정될 수 있고, 각 표적 화합물을 인식하는 다른 β-바디는 상이한 검출 가능한 표지에 연결될 수 있다.
다수의 표적 화합물 각각에 대한 방법은 어느 순서로 순차적으로, 부분적으로 순차적으로 수행될 수 있거나, 동시에 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명의 b-바디는 예를 들어 다중 진단에 사용될 수 있다. 고정된 β-바디는 표적 화합물 또는 POI에 대한 트래핑 파트너로서 샌드위치 분석에서 직접 사용될 수 있다.
본 기재내용의 하나의 양태에서 표적 화합물은 녹색 형광 단백질 (GFP)이고 이것은 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 β-바디에 의해 인식된다.
본 기재내용의 하나의 양태에서 표적 화합물은 인터류킨 1 (IL1)이고 이것은 서열번호 5 내지 서열번호 13으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 β-바디에 의해 인식된다.
본 기재내용의 하나의 양태에서 표적 화합물은 인터류킨 2 (IL2)이고 이것은 서열번호 14 및 서열번호 15로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 β-바디에 의해 인식된다.
본 기재내용의 하나의 양태에서 표적 화합물은 인터류킨 6 (IL6)이고 이것은 서열번호 16 내지 서열번호 19로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 β-바디에 의해 인식된다.
본 기재내용의 하나의 양태에서 표적 화합물은 인터류킨 10 (IL10)이고 이것은 서열번호 20 및 서열번호 21로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 β-바디에 의해 인식된다.
본 기재내용의 하나의 양태에서 표적 화합물은 인터류킨 12 (IL12)이고 이것은 서열번호 22 및 서열번호 23으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 β-바디에 의해 인식된다.
본 기재내용의 하나의 양태에서 표적 화합물은 인터류킨 18 (IL18)이고 이것은 서열번호 24 및 서열번호 25로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 β-바디에 의해 인식된다.
본 기재내용의 하나의 양태에서 표적 화합물은 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)이고 이것은 서열번호 26 및 서열번호 27로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 β-바디에 의해 인식된다.
본 기재내용의 하나의 양태에서 표적 화합물은 클로스트리듐 디피실로부터의 독소 A이고 이것은 서열번호 28 및 서열번호 29로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 β-바디에 의해 인식된다.
본 기재내용의 하나의 양태에서 표적 화합물은 보툴리눔 독소 (BTX)이고 이것은 아미노산 서열 서열번호 30의 β-바디에 의해 인식된다.
본 기재내용의 하나의 양태에서 표적 화합물은 리신이고 이것은 아미노산 서열 서열번호 31의 β-바디에 의해 인식된다.
본 기재내용의 하나의 양태에서 표적 화합물은 게피린이고 이것은 서열번호 32 내지 서열번호 45로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 β-바디에 의해 인식된다.
본 기재내용의 하나의 양태에서 표적 화합물은 서브틸리신이고 이것은 서열번호 46 및 서열번호 47로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 β-바디에 의해 인식된다.
본 기재내용의 하나의 양태에서 표적 화합물은 파파인이고 이것은 서열번호 38 내지 서열번호 52로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 β-바디에 의해 인식된다.
진단 방법
하나의 양태에서 본 발명은 임상 상태를 진단하는 방법에 관한 것이며, 상기 임상 상태는 하나 이상의 표적 화합물의 존재 또는 부재와 관련된다. 이러한 방법은 다음의 단계들을 포함할 수 있다:
a. 상기 임상 상태를 획득할 위험이 있는 개체로부터 샘플을 제공하는 단계
b. "검출 방법" 섹션에 기술된 표적 화합물(들)을 검출하는 방법을 수행하는 단계
c. 여기서 상기 표적 화합물(들)의 존재 또는 부재는 상기 개체가 상기 임상 상태를 앓고 있는지를 나타낸다.
하나의 양태에서 본 발명은 다공성 물질 상에 또는 겔 매트릭스에서 표면 상에 고정된 수 개의 상이한 β-바디로 수행되는 다중 진단을 위한 방법에 관한 것이다. 상기 물질은 예를 들면 모두 평면 웰 또는 비드의 형태일 수 있다.
치료 방법
하나의 양태에서 본 발명은 임상 상태를 치료하는 방법에 사용하기 위한 β-바디에 관한 것이며, 상기 임상 상태는 표적 화합물의 발현을 특징으로 하고, 상기 β-바디는 상기 표적 화합물에 결합할 수 있다. β-바디는 "β-바디" 섹션에서 상기 본원에 기술된 β-바디 중의 어느 것일 수 있다.
표적 화합물은 폴리펩타이드 또는 단백질일 수 있다. 표적 화합물은 또한 다당류, 올리고당, 폴리펩타이드 또는 하나 이상의 단백질일 수 있다. 따라서, β-바디는 예를 들면 두 개의 단백질을 복합체로 브릿징할 수 있다.
하나의 양태에서 β-바디는 단백질 단백질 상호작용을 억제함으로써 상기 상호작용을 통해 매개되는 생물학적 기능을 억제하도록 설계될 수 있다. 예를 들면, 본 기재내용의 β-바디는 인터류킨, 예를 들어 IL1, IL2, IL6, IL10, IL12 또는 IL18의 생물학적 기능을 억제할 수 있다. 본 기재내용의 β-바디는 또한 TNFα의 생물학적 기능을 억제할 수 있다. 본 기재내용의 β-바디는 또한 게피린, 서브틸리신 또는 파파인의 생물학적 기능을 억제할 수 있다. 따라서, β-바디는 전술한 것 중 어느 하나의 증가된 또는 바람직하지 않은 기능을 특징으로 하는 임상 상태, 특히 면역 질환의 치료 방법에서 사용될 수 있다.
하나의 양태에서 β-바디는 독의 독성 효과를 중화시키는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 예를 들면 독은 클로스트리듐 디피실로부터의 독소 A, 리신, 또는 보툴리눔 독소 (BTX)일 수 있다. 또 다른 독이 또한 본 기재내용의 β-바디에 의해 표적화될 수 있다.
하나의 양태에서 β-바디는 면역 반응을 조절하는 방법에서 사용하기 위한 것이다.
하나의 양태에서 β-바디는 암세포의 아폽토시스를 조절하는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 따라서, β-바디는 암의 치료 방법에서 사용할 수 있다.
하나의 양태에서 β-바디는 호르몬-호르몬 수용체 반응을 조절하는 방법에서 사용하기 위한 것이다.
β-
바디의
이량체
본 발명은 또한 "β-바디" 섹션에서 상기 본원에 기술된 β-바디 중의 어느 것일 수 있는 β-바디의 이량체를 제공한다. 상기 이량체는 제1 β-바디 및 제2 β-바디를 포함할 수 있으며, 여기서 제1 및 제2 β-바디는 서로 결합할 수 있다.
하나의 양태에서 이량체는 제1 및 제2 β-바디를 포함하는 이형이량체이며, 여기서 상기 제1 β-바디는 제2 β-바디와는 상이하고, 상기 제1 및 제2 β-바디는 서로 결합할 수 있다.
하나의 양태에서 제1 β-바디의 적어도 2개의 아미노산 X는 양으로 하전되며, 제2 β-바디의 대략 동일한 수의 아미노산 X는 음으로 하전된다.
하나의 양태에서 제1 β-바디의 적어도 2개의 아미노산 X는 소수성 아미노산 잔기이며, 제2 β-바디의 대략 동일한 수의 아미노산 X는 소수성 아미노산 잔기이다.
하나의 양태에서 이량체는 두 개의 동일한 β-바디를 포함하는 동형이량체이며, 여기서 상기 β-바디는 자신에 결합할 수 있다.
하나의 양태에서 상기 β-바디의 아미노산 X의 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 90%는 방향족 또는 소수성 아미노산이다.
하나의 양태에서 상기 β-바디의 아미노산 X의 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 90%는 티로신 잔기이다.
하나의 양태에서, 본 발명은 제1 β-바디에 공유 결합된 제1 모이어티 및 제2 β-바디에 연결된 제2 모이어티를 포함하는 이량체에 관한 것이며, 여기서 제1 및 제2 β-바디는 서로 결합할 수 있다. 따라서, 상기 이량체의 제1 및 제2 β-바디는 상기 이 섹션에 기술된 이량체 중의 어느 것일 수 있다.
하나의 양태에서 상기 제1 및/또는 제2 모이어티는 단백질(들)이다.
하나의 양태에서 제1 및/또는 제2 모이어티는 아래 "접합된 모이어티" 색션에서 본원에 기술된 접합된 모이어티 중의 어느 것이다.
하나의 양태에서 상기 제1 및 제2 모이어티는 서로 상이하다.
하나의 양태에서 상기 제1 β-바디 및 상기 제2 β-바디는 서열번호 56; 서열번호 57; 서열번호 58; 서열번호 59; 서열번호 60으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 갖는다.
접합된
모이어티
본 발명은 또한 β-바디, 예를 들어 β-바디 섹션에서 상기 본원에 기술된 β-바디 중의 어느 것에 관한 것이며, 여기서 상기 β-바디는 접합된 모이어티에 공유 결합된다.
접합된 모이어티는 임의의 모이어티일 수 있으며, 예를 들어 이것은 검출 가능한 표지, 예를 들어 방사성 표지, 항체에 대한 항원, 비오틴, 형광 표지, 발광 표지 또는 유색 표지로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
접합된 모이어티는 또한 생활성 화합물, 예를 들어 탄수화물, 폴리펩타이드, 단백질, 세포독성 화합물, 효소 억제제, 효소 기질, 막 결합 분자 또는 수용체 리간드로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
항목
1. β-턴 펩타이드 서열(들)에 의해 연결된 적어도 두 개의 β-가닥 펩타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 화합물이고, 상기 β-가닥 펩타이드 서열이 교호하는 정방향 및 역방향 β-가닥 펩타이드 서열의 역평행 배열로 조직화되며, 여기서
각각의 정방향 β-가닥 펩타이드 서열은 개별적으로 다음의 서열을 갖고
Xr(ZX)m
각각의 역방향 β-가닥 펩타이드 서열은 개별적으로 다음의 서열을 갖고
(XZ)nXr
여기서
각각의 Z는, 각 β-가닥 서열에서 최대 두 개의 Z가 Thr, 극성 β-분지화 아미노산, β-가닥 구조를 촉진시키는 비-단백질생성 α-분지화 아미노산 또는 가닥 브리징 아미노산 중의 하나가 아닌 아미노산일 수 있음을 제외하고는, 개별적으로 Thr, 극성 β-분지화 아미노산, β-가닥 구조를 촉진시키는 비-단백질생성 α-분지화 아미노산 또는 가닥 브리징 아미노산이고;
각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산, β-아미노산 또는 γ-아미노산이고;
각각의 m 및 n은 개별적으로 3 내지 12 범위의 정수이고;
각각의 r은 0 내지 5 범위의 정수이고;
각각의 β-턴 펩타이드 서열은 개별적으로 다음의 서열을 갖고
Xq1BUXq2
여기서
각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산이고;
각각의 U는 개별적으로 화학식 
의 아미노산이고, 여기서 Ra 및 Rb는 개별적으로 -H 및 C1-6-알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, Ra 및 Rb는 결합하여 사이클릭 구조를 형성할 수 있으며;
B는 Pro, 치환된 Pro 및 피페콜산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
각각의 q은 개별적으로 0 내지 5 범위의 정수이고, 여기서 q1 - q2는 -4, -2, 0, 2 또는 4이고;
선형 또는 사이클릭인 β-바디.
2. β-바디가 선형인, 항목 1에 따르는 β-바디.
3. 화합물이 β-턴 펩타이드 서열에 의해 연결된 2 내지 10개 범위의 β-가닥 펩타이드 서열을 포함하는, 상기 항목들 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
4. 화합물이 β-턴 펩타이드 서열에 의해 연결된 2 내지 4개 범위의 β-가닥 펩타이드 서열을 포함하는, 상기 항목들 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
5. 상기 화합물이 다음의 구조를 갖고:
정방향 β-가닥 서열-
β-턴 펩타이드 서열-
역방향 β-가닥 서열,
여기서 정방향 β-가닥 서열 및 역방향 β-가닥 서열이 역평행 β-가닥으로서 배열되는, 상기 항목들 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
6. 상기 화합물이 다음의 구조로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하고:
정방향 β-가닥 서열-
β-턴 펩타이드 서열-
역방향 β-가닥 서열-
β-턴 펩타이드 서열-
정방향 β-가닥 서열
여기서 정방향 β-가닥 서열 및 역방향 β-가닥 서열이 역평행 β-가닥으로서 배열되는, 항목 1 내지 4 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
7. 상기 화합물이 다음의 구조로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는, 항목 1 내지 4 중의 어느 하나에 따르는 β-바디:
정방향 β-가닥 서열 -
β-턴 펩타이드 서열 -
역방향 β-가닥 서열 -
β-턴 펩타이드 서열 -
정방향 β-가닥 서열 -
β-턴 펩타이드 서열 -
정방향 β-가닥 서열.
8. 각 β-가닥 펩타이드 서열 내의 Z의 적어도 70%가 Thr인, 상기 항목들 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
9. 각 β-가닥 펩타이드 서열 내의 Z의 적어도 90%가 Thr인, 상기 항목들 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
10. 적어도 하나의 정방향 β-가닥 서열이 다음의 서열을 갖는, 상기 항목들 중의 어느 하나에 따르는 β-바디:
Xr(TX)m
여기서
T는 Thr이고;
각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산이고;
각각의 m은 개별적으로 3 내지 12 범위의 정수이고;
r은 0 내지 5 범위의 정수이다.
11. 적어도 하나의 역방향 β-가닥 서열이 다음의 서열을 갖는, 상기 항목들 중의 어느 하나에 따르는 β-바디:
(XT)nXr
여기서
각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산이고;
각각의 n은 개별적으로 3 내지 12 범위의 정수이고;
r은 0 내지 5 범위의 정수이다.
12. 적어도 하나의 β-턴 펩타이드 서열이 다음의 서열을 갖는, 상기 항목들 중의 어느 하나에 따르는 β-바디:
XqPGXq
여기서
각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산이고;
각각의 q는 개별적으로 0 내지 3 범위의 정수이다.
13. 하나 이상의 q가 0 내지 1 범위의 정수(들)인, 상기 항목들 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
14. 각각의 β-턴 내에서 q1 - q2가 0인, 상기 항목들 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
15. q1 및 q2가 개별적으로 0 내지 3 범위의 정수인, 상기 항목들 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
16. 적어도 하나 또는 모든 β-턴 펩타이드 서열이 다음의 서열 중의 하나를 갖는, 상기 항목들 중의 어느 하나에 따르는 β-바디:
XPGX; 또는
PGX; 또는
PG
여기서
각각의 X가 개별적으로 임의의 아미노산이다.
17.
화합물이 다음의 일반 구조를 갖는 폴리펩타이드를 포함하는, 항목 1에 따르는 β-바디:
(TX)mXqPGXq(XT)n,
여기서
각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산, β-아미노산 또는 γ-아미노산이고;
m 및 n은 개별적으로 3 내지 12 범위의 정수이고;
q는 개별적으로 0 내지 3 범위의 정수이다.
18. 화합물이 다음의 일반 구조를 갖는 폴리펩타이드를 포함하는, 항목 1에 따르는 β-바디:
(TX)mPG(XT)n,
여기서
각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산, β-아미노산 또는 γ-아미노산이고;
m 및 n은 개별적으로 3 내지 12 범위의 정수이다.
19.
화합물이 다음의 일반 구조를 갖는 폴리펩타이드를 포함하는, 항목 1에 따르는 β-바디:
(TX)mPG(XT)nXPGX(TX)m
여기서
각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산, β-아미노산 또는 γ-아미노산이고;
각각의 m 및 n은 개별적으로 3 내지 12 범위의 정수이다.
20.
화합물이 다음의 일반 구조를 갖는 폴리펩타이드를 포함하는, 항목 1에 따르는 β-바디:
(TX)mPG(XT)nXPGX(TX)mPG(XT)n
여기서
각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산, β-아미노산 또는 γ-아미노산이고;
각각의 m 및 n은 개별적으로 3 내지 12 범위의 정수이다.
21.
화합물이 다음의 일반 서열 XIX를 갖는 폴리펩타이드를 포함하는, 항목 1에 따르는 β-바디:
Xr(ZX)mXqPGXq(XZ)nXr ,
여기서
각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산, β-아미노산 또는 γ-아미노산이고;
각각의 r은 개별적으로 0 내지 5 범위의 정수이고;
각각의 m 및 n은 개별적으로 3 내지 12 범위의 정수이고;
각각의 Z는 개별적으로 Thr, 극성 β-분지화 아미노산, β-가닥 구조를 촉진시키는 비-단백질생성 α-분지화 아미노산 또는 가닥 브리징 아미노산이고, 바람직하게는 단, 최대 2개를 제외한 모든 Z는 Thr이며;
각각의 q는 개별적으로 0 내지 3 범위의 정수이다.
22.
화합물이 다음의 일반 서열 XVI를 갖는 폴리펩타이드를 포함하는, 항목 1에 따르는 β-바디:
Xr(ZX)mPG(XZ)nXr,
여기서
각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산, β-아미노산 또는 γ-아미노산이고;
각각의 r은 개별적으로 0 내지 5 범위의 정수이고;
각각의 m 및 n은 개별적으로 3 내지 12 범위의 정수이고;
각각의 Z는 개별적으로 Thr, 극성 β-분지화 아미노산, β-가닥 구조를 촉진시키는 비-단백질생성 α-분지화 아미노산 또는 가닥 브리징 아미노산이고, 바람직하게는 단, 최대 2개를 제외한 모든 Z는 Thr이다.
23. 화합물이 다음의 일반 서열 XXI를 갖는 폴리펩타이드를 포함하는, 항목 1에 따르는 β-바디:
Xr(ZX)mXqPGXq(XZ)nXXqPGXqX(ZX)mXr
여기서
각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산, β-아미노산 또는 γ-아미노산이고;
각각의 r은 개별적으로 0 내지 5 범위의 정수이고;
각각의 m 및 n은 개별적으로 3 내지 12 범위의 정수이고;
각각의 Z는 개별적으로 Thr, 극성 β-분지화 아미노산, β-가닥 구조를 촉진시키는 비-단백질생성 α-분지화 아미노산 또는 가닥 브리징 아미노산이고, 바람직하게는 단, 최대 2개를 제외한 모든 Z는 Thr이고;
각각의 q는 개별적으로 0 내지 3 범위의 정수이다.
24. 화합물이 다음의 일반 서열 XVII를 갖는 폴리펩타이드를 포함하는, 항목 1에 따르는 β-바디:
Xr(ZX)mPG(XZ)nXPGX(ZX)mXr
여기서
각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산, β-아미노산 또는 γ-아미노산이고;
각각의 r은 개별적으로 0 내지 5 범위의 정수이고;
각각의 m 및 n은 개별적으로 3 내지 12 범위의 정수이고;
각각의 Z는 개별적으로 Thr, 극성 β-분지화 아미노산, β-가닥 구조를 촉진시키는 비-단백질생성 α-분지화 아미노산 또는 가닥 브리징 아미노산이고, 바람직하게는 단, 최대 2개를 제외한 모든 Z는 Thr이다.
25. 화합물이 다음의 일반 서열 XXIII를 갖는 폴리펩타이드를 포함하는, 항목 1에 따르는 β-바디:
Xr(ZX)mXqPGXq(XZ)nXXqPGXqX(ZX)mXqPGXq(XZ)nXr
여기서
각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산, β-아미노산 또는 γ-아미노산이고;
각각의 r은 개별적으로 0 내지 5 범위의 정수이고;
각각의 m 및 n은 개별적으로 3 내지 12 범위의 정수이고;
각각의 Z는 개별적으로 Thr, 극성 β-분지화 아미노산, β-가닥 구조를 촉진시키는 비-단백질생성 α-분지화 아미노산 또는 가닥 브리징 아미노산이고, 바람직하게는 단, 최대 2개를 제외한 모든 Z는 Thr이고;
각각의 q는 개별적으로 0 내지 3 범위의 정수이다.
26. 화합물이 다음의 일반 서열 XVIII를 갖는 폴리펩타이드를 포함하는, 항목 1에 따르는 β-바디:
Xr(ZX)mPG(XZ)nXPGX(ZX)mPG(XZ)nXr
여기서
각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산, β-아미노산 또는 γ-아미노산이고;
각각의 r은 개별적으로 0 내지 5 범위의 정수이고;
각각의 m 및 n은 개별적으로 3 내지 12 범위의 정수이고;
각각의 Z는 개별적으로 Thr, 극성 β-분지화 아미노산, β-가닥 구조를 촉진시키는 비-단백질생성 α-분지화 아미노산 또는 가닥 브리징 아미노산이고, 바람직하게는 단, 최대 2개를 제외한 모든 Z는 Thr이다.
27. 하나 이상의 m이 3 내지 7 범위의 정수인, 상기 항목들 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
28. 하나 이상의 n이 3 내지 5 범위의 정수인, 상기 항목들 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
29. 하나 이상의, 바람직하게는 모든 아미노산 X가 일반 구조 
를 갖는, 상기 항목들 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
30. 하나 이상의 아미노산 X가 화학식 -NH-CHR-CO-의 치환된 글리신의 그룹으로부터 선택되고, 여기서 R이 직쇄 C1-C20-알킬, 측쇄 C1-C20-알킬, 아릴, 및 치환된 알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있는, 상기 항목들 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
31. 하나 이상의 아미노산 X가 화학식 -NH-CR1R2-CO-의 이치환된 글리신의 그룹으로부터 선택되고, 여기서 R1 및 R2가 개별적으로 직쇄 C1-C20-알킬, 측쇄 C1-C20-알킬, 아릴, 및 치환된 알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 상기 항목들 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
32. 하나 이상의, 바람직하게는 모든 아미노산 X가 단백질생성 아미노산 및 비-단백질생성 아미노산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기서 비-단백질생성 아미노산이 α-아미노-n-부티르산, 노르발린, 노르류신, 알로이소류신, t-류신, α-아미노-n-헵탄산, α,β-디아미노프로피온산, α,γ-디아미노부티르산, 오르니틴, 알로트레오닌, 호모시스테인, 호모세린, α-아미노이소부티르산, 이소발린, 사르코신, 호모페닐알라닌, 프로파르길글리신 및 4-아지도-2-아미노부탄산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 상기 항목들 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
33. 상기 β-바디의 아미노산 잔기의 적어도 일부가 L-아미노산인, 상기 항목들 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
34. 상기 β-바디의 아미노산 잔기의 전부가 L-아미노산인, 상기 항목들 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
35. 상기 β-바디의 아미노산 잔기의 전부가 D-아미노산인, 상기 항목들 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
36. 적어도 70%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들면 적어도 90%, 예를 들어 모든 X가 표준 아미노산인, 상기 항목들 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
37. 최대 한 개의 아미노산 Z가 Thr, 극성 β-분지화 아미노산, β-가닥 구조를 촉진시키는 비-단백질생성 α-분지화 아미노산 또는 가닥 브리징 아미노산이거나, 예를 들어 아미노 Z 중의 어느 것도 Thr, 극성 β-분지화 아미노산, β-가닥 구조를 촉진시키는 비-단백질생성 α-분지화 아미노산 또는 가닥 브리징 아미노산이 아닌, 상기 항목들 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
38. 하나 이상의 아미노산 Z가 이소류신, 트레오닌, 알로트레오닌, 알로이소류신, 발린, 2-아미노이소부티르산, 2-아미노-3,3-디메틸부탄산, 프로파르길글리신 및 4-아지도-2-아미노부탄산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 β-분지화 아미노산인, 상기 항목들 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
39. 하나 이상의 아미노산 Z가 α-아미노이소부티르산, 디에틸글리신, 디프로필글리신, 디페닐글리신, 1-아미노사이클로부탄-1-카복실산, 1-아미노사이클로펜탄-1-카복실산, 1-아미노사이클로헥산-1-카복실산, 및 1-아미노사이클로헵탄-1-카복실산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 비-단백질생성 α-분지화 아미노산인, 상기 항목들 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
40. 하나 이상의 아미노산 Z가 시스테인, 아스파라긴, 트레오닌, 아스파르트산, 글루탐산, β-아미노 알라닌, γ-아미노-α-아미노부티르산, 오르니틴, 리신, 프로파르길글리신, 4-아지도-2-아미노부탄산, 알킨으로 치환된 아미노산, 아지드로 치환된 아미노산 및 환원적 아민화에 의한 브릿징에 적합한 아미노산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 가닥 브릿징 아미노산인, 상기 항목들 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
41. 각각의 r이 개별적으로 0 내지 3 범위의 정수이고, 바람직하게는 각각의 r이 0인, 상기 항목들 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
42. 상기 화합물이 최대 10-6 M, 예를 들면 10-7 M 이하, 예를 들어 10-8 M 이하, 예를 들어 10-9 M 이하, 예를 들면 10-10 M 이하, 또는 심지어 10-11 M 이하의 Kd로 표적 화합물에 결합할 수 있는, 상기 항목들 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
43. 상기 β-바디가 서열번호 1 내지 서열번호 61로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지는, 상기 항목들 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
44. 상기 β-바디가 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 상기 표적 화합물이 녹색 형광 단백질(GFP)인, 항목 1 내지 38 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
45. 상기 β-바디가 서열번호 5 내지 서열번호 13으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 상기 표적 화합물이 인터류킨 1 (IL1)인, 항목 1 내지 42 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
46. 상기 β-바디가 서열번호 14 및 서열번호 15로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 상기 표적 화합물이 인터류킨 2 (IL2)인, 항목 1 내지 42 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
47. 상기 β-바디가 서열번호 16 내지 서열번호 19로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 상기 표적 화합물이 인터류킨 6 (IL6)인, 항목 1 내지 42 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
48. 상기 β-바디가 서열번호 20 및 서열번호 21로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 상기 표적 화합물이 인터류킨 10 (IL10)인, 항목 1 내지 42 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
49. 상기 β-바디가 서열번호 22 및 서열번호 23으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 상기 표적 화합물이 인터류킨 12 (IL12)인, 항목 1 내지 42 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
50. 상기 β-바디가 서열번호 24 및 서열번호 25로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 상기 표적 화합물이 인터류킨 18 (IL18)인, 항목 1 내지 42 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
51. 상기 β-바디가 서열번호 26 및 서열번호 27로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 상기 표적 화합물이 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)인, 항목 1 내지 42 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
52. 상기 β-바디가 서열번호 28 내지 서열번호 29로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 상기 표적 화합물이 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile)로부터의 독소 A인, 항목 1 내지 42 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
53. 상기 β-바디가 아미노산 서열 서열번호 30을 포함하거나 이들로 이루어지고, 상기 표적 화합물이 보툴리눔 독소 (BTX)인, 항목 1 내지 42 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
54. 상기 β-바디가 아미노산 서열 서열번호 31을 포함하거나 이들로 이루어지고, 상기 표적 화합물이 리신인, 항목 1 내지 42 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
55. 상기 β-바디가 서열번호 32 내지 서열번호 46으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 상기 표적 화합물이 게피린인, 항목 1 내지 42 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
56. 상기 β-바디가 서열번호 47 및 서열번호 48로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 상기 표적 화합물이 서브틸리신인, 항목 1 내지 42 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
57. 상기 β-바디가 서열번호 49 내지 서열번호 54로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 상기 표적 화합물이 파파인인, 항목 1 내지 42 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
58.
a. 컴퓨터에서 표적 화합물의 공간 구조 표현을 제공하는 단계;
b. 컴퓨터에서 상기 청구항 중의 어느 한 항에 따르는 다수의 β-바디의 공간 구조 표현을 생성하는 단계;
c. 상기 컴퓨터에서 표적 화합물의 공간 구조의 적어도 일부에 맞춘 β-바디를 선택함으로써, 표적 화합물에 결합할 수 있는 β-바디를 확인하는 단계를 포함하여, 상기 항목들 중의 어느 하나에 따르는 β-바디(여기서, 상기 β-바디는 가 표적 화합물에 결합할 수 있다)를 확인하는 방법.
59. 선택된 β-바디가 1ps - 10 s 범위의 기간 동안 450 내지 200 범위의 온도에서 표적 화합물과 안정적으로 결합하는, 항목 58에 따르는 방법.
60.
h. 단계 c.에서 확인된 공간 구조의 β-바디를 제공하는 단계
i. 표적 화합물을 제공하는 단계
j. 상기 β-바디가 상기 표적 화합물에 결합할 수 있는지를 결정하는 단계
k. 상기 표적 화합물에 결합할 수 있는 β-바디를 선택하는 단계를 추가로 포함하는, 항목 58 내지 57 중의 어느 하나에 따르는 방법.
61.
i. 표적 화합물을 제공하는 단계
ii. 항목 1 내지 57 중의 어느 하나에 따르는 다수의 시험 β-바디를 포함하는 라이브러리를 제공하는 단계
iii. 상기 시험 β-바디가 상기 표적 화합물에 결합할 수 있는지를 결정하는 단계
iv. 상기 표적 화합물에 가장 잘 결합할 수 있는 β-바디를 선택함으로써, 표적 화합물에 결합할 수 있는 β-바디를 확인하는 단계를 포함하여, 항목 1 내지 57 중의 어느 하나에 따르는 β-바디(여기서, 상기 β-바디는 표적 화합물에 결합할 수 있다)를 확인하는 방법.
62. 라이브러리가 고체 지지체 상에 고정된 β-바디를 포함하는, 항목 61에 따르는 방법.
63. 라이브러리가 원-비드-원-화합물 라이브러리이고, 여기서 각각의 비드가 동일한 서열의 β-바디에 연결되는, 항목 61 내지 62 중의 어느 하나에 따르는 방법.
64.
· 검출 가능한 표지에 연결된 표적 화합물을 제공하는 단계
· 상기 원-비드-원-화합물 라이브러리를 제공하는 단계,
· 상기 표적 화합물을 상기 라이브러리와 배양하는 단계,
· 검출 가능한 표지와 관련된 비드를 확인하는 단계,
· 상기 확인된 비드에 연결된 β-바디의 구조를 결정하는 단계를 포함하는, 항목 61 내지 63 중의 어느 하나에 따르는 방법.
65.
a. 샘플을 제공하는 단계
b. 항목 1 내지 57 중의 어느 하나에 따르는 β-바디를 제공하는 단계(여기서, 상기 β-바디는 상기 표적 화합물에 결합할 수 있다)
c. 상기 샘플을 상기 β-바디와 배양하는 단계
d. 상기 샘플에 결합된 β-바디를 검출하는 단계를 포함하여, 샘플에서 표적 화합물의 존재를 검출하는 방법.
66. 상기 β-바디가 고체 지지체 상에 고정되는, 항목 65에 따르는 방법.
67.
a. 샘플을 제공하는 단계
b. 항목 1 내지 57 중의 어느 하나에 따르는 적어도 두 개의 상이한 β-바디를 제공하는 단계(여기서, 상기 β-바디 둘 다는 상기 표적 화합물에 결합할 수 있다)
c. 상기 샘플을 상기 β-바디와 배양하는 단계
d. 상기 샘플에 결합된 β-바디를 검출하는 단계를 포함하여, 샘플에서 표적 화합물의 존재를 검출하는 방법.
68. 상기 β-바디 중의 하나는 고체 지지체 상에 고정되고, 다른 β-바디는 검출 가능한 표지에 연결되는, 항목 67에 따르는 방법.
69. 상기 샘플에 결합된 β-바디를 검출하는 단계가 고체 지지체와 관련된 검출 가능한 표지를 검출함을 포함하는, 항목 64에 따르는 방법.
70. 다수의 표적 화합물의 각각에 대해 항목 65 내지 69 중의 어느 하나에 따르는 방법을 수행함을 포함하여, 샘플에서 다수의 표적 화합물의 존재를 검출하는 방법.
71. 각각의 표적 화합물을 인식하는 하나의 β-바디는 개별 고체 지지체 상에 고정되고, 각각의 표적 화합물을 인식하는 다른 β-바디는 상이한 검출 가능한 표지에 연결되는, 항목 70에 따르는 방법.
72. 다수의 표적 화합물의 각각에 대해 항목 65 내지 69 중의 어느 하나에 따르는 방법이 동시에 수행되는, 항목 71에 따르는 방법.
73. 다수의 β-바디를 마이크로어레이 포맷으로 고체 표면 상에 고정시키는 단계 및 상기 마이크로어레이를 검출 가능한 표지에 연결된 하나 이상의 표적 화합물(들)과 접촉시켜 표적 화합물과의 상호작용을 검출하는 단계를 포함하여, β-바디와 표적 화합물 간의 상호작용을 검출하는 방법.
74.
a. 독을 포함하는 샘플을 제공하는 단계
b. 항목 1 내지 57 중의 어느 하나에 따르는 β-바디를 제공하는 단계(여기서, 상기 β-바디는 상기 독소에 결합할 수 있다)
c. 상기 샘플을 상기 β-바디와 배양하는 단계를 포함하여, 독의 독성 효과를 중화시키는 방법.
75.
a. 상기 임상 상태에 의해 영향을 받거나 영향을 받는 것으로 의심되는 개체로부터 샘플을 제공하는 단계
b. 항목 74에 따라 독소를 중화시키는 방법을 수행하는 단계를 포함하여, 독의 존재와 관련된 임상 상태를 치료하는 방법.
76.
a. 상기 임상 상태를 획득할 위험이 있는 개체로부터 샘플을 제공하는 단계
b. 항목 65 내지 72 중의 어느 하나에 따라 표적 화합물(들)을 검출하는 방법을 수행하는 단계를 포함하고,
c. 여기서 상기 표적 화합물(들)의 존재 또는 부재는 상기 개체가 상기 임상 상태를 앓고 있는지를 나타내는, 하나 이상의 표적 화합물의 존재 또는 부재와 관련된 임상 상태를 진단하는 방법.
77. 상기 임상 상태가 표적 화합물의 발현을 특징으로 하고, 상기 β-바디가 상기 표적 화합물에 결합할 수 있는, 임상 상태를 치료하는 방법에서 사용하기 위한 항목 1 내지 57 중의 어느 하나에 따르는 β-바디.
78. 표적 화합물이 폴리펩타이드인, 항목 77에 따르는 β-바디, 또는 항목 58 내지 71 중의 어느 하나에 따르는 방법.
79. 상기 제1 β-바디가 제2 β-바디와는 상이하고, 상기 제1 및 제2 β-바디가 서로 결합할 수 있는, 항목 1 내지 57 중의 어느 하나에 따르는 제1 및 제2 β-바디를 포함하는 이형이량체.
80. 제1 β-바디의 적어도 2개의 X가 양으로 하전되고, 제2 β-바디의 대략 동일한 양의 X가 음으로 하전되는, 항목 79에 따르는 이형이량체.
81. 제1 β-바디의 적어도 2개의 X가 소수성 아미노산 잔기이고, 제2 β-바디의 대략 동일한 양의 X가 소수성 아미노산 잔기인, 항목 79 내지 80 중의 어느 하나에 따르는 이형이량체.
82. 각각의 β-바디가 항목 1 내지 57 중의 어느 하나에 따르고, 상기 β-바디가 자체 결합할 수 있는, 두 개의 동일한 β-바디를 포함하는 동형이형체.
83. 상기 β-바디의 X 중의 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 90%가 방향족 또는 소수성 잔기인, 항목 82에 따르는 동형이량체.
84. 상기 β-바디의 X 중의 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 90%가 티로신 잔기인, 항목 82 내지 83 중의 어느 하나에 따르는 동형이량체.
85. 제1 및 제2 β-바디가 항목 1 내지 57 중의 어느 하나에 따르는 β-바디이고, 제1 및 제2 β-바디가 서로 결합할 수 있는, 제1 β-바디에 공유 결합된 제1 모이어티 및 제2 β-바디에 결합된 제2 모이어티를 포함하는 이량체.
86. 제1 및 제2 β-바디가 항목 79 내지 81 중의 어느 하나에 따르는 이형이량체를 형성할 수 있는, 항목 85에 따르는 이량체.
87. 제1 및 제2 β-바디가 항목 82 내지 84 중의 어느 하나에 따르는 동형이량체를 형성할 수 있는, 항목 86에 따르는 이량체.
88. 제1 및/또는 제2 모이어티가 단백질(들)인, 항목 85 내지 87 중의 어느 하나에 따르는 이량체.
89. 제1 및 제2 모이어티가 서로 상이한, 항목 85 내지 88 중의 어느 하나에 따르는 이량체.
90. 친화도 크로마토그래피의 방법에서 또는 단백질의 융합 파트너로서의 하나 이상의 β-바디(여기서, 각각의 β-바디는 항목 1 내지 57 중의 어느 하나에 따른다)의 용도.
91. 상기 β-바디가 접합된 모이어티에 공유 결합되는, 항목 1 내지 57 중의 어느 하나에 따르는 β-바디를 포함하는 화합물.
92. 접합된 모이어티가 검출 가능한 표지, 예를 들어 방사성 표지, 항체에 대한 항원, 비오틴, 형광 표지, 발광 표지 또는 유색 표지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 항목 91에 따르는 화합물.
93. 접합된 모이어티가 생활성 화합물, 예를 들어 폴리펩타이드, 단백질, 세포독성 화합물, 효소 억제제, 효소 기질, 막 결합 분자 또는 수용체 리간드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 항목 91에 따르는 화합물.
94. 접합된 모이어티가 폴리펩타이드인, 항목 91에 따르는 화합물.
95. β-바디가 단백질-단백질 상호작용을 억제함으로써 상기 상호작용을 통해 매개된 생물학적 기능을 억제하도록 설계되는, 항목 1 내지 57 중의 어느 하나에 따르는 β-바디, 항목 79 내지 89 중의 어느 하나에 따르는 이형이량체, 동형이량체 또는 이량체 또는 항목 91 내지 94 중의 어느 하나에 따르는 화합물.
96. β-바디가 독의 독성 효과를 중화시키는 방법에서 사용하기 위한 것인, 항목 1 내지 57 중의 어느 하나에 따르는 β-바디, 항목 79 내지 89 중의 어느 하나에 따르는 이형이량체, 동형이량체 또는 이량체 또는 항목 91 내지 94 중의 어느 하나에 따르는 화합물.
97. β-바디가 면역 반응을 조절하는 방법에서 사용하기 위한 것인, 항목 1 내지 57 중의 어느 하나에 따르는 β-바디, 항목 79 내지 89 중의 어느 하나에 따르는 이형이량체, 동형이량체 또는 이량체 또는 항목 91 내지 94 중의 어느 하나에 따르는 화합물.
98. β-바디가 호르몬-호르몬 수용체 반응을 조절하는 방법에서 사용하기 위한 것인, 항목 1 내지 57 중의 어느 하나에 따르는 β-바디, 항목 79 내지 89 중의 어느 하나에 따르는 이형이량체, 동형이량체 또는 이량체 또는 항목 91 내지 94 중의 어느 하나에 따르는 화합물.
실시예
실시예
1
알려진 단백질 구조에 대한 β-바디의 설계.
알려진 단백질 구조에 특이적으로 결합하는 β-바디의 설계는 예를 들어 PDB (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)에서의 관심 단백질(POI)에 대한 검색으로 시작하였다. 단백질 구조는 PDB 파일로 획득되었다. 모든 모델링은 케미칼 컴퓨팅 그룹(Chemical Computing Group)으로부터의 분자 작동 환경(Molecular Operating Environment)(MOE - ver.2015.10, 및 포스 필드 ETH10 또는 ETH12)으로 수행하였다. PDB-파일을 로드하고, 수소 원자를 추가하고 구조를 철저히 조사하여, 예를 들어 가능하다면 상동성 모델링에 의해 또는 제한된 동역학에 의해 누락된 부분을 수정하였다. 모델을 공간에 고정시키고 분자 정전기 표면을 장착하였다.
구조 (TX)mPG(XT)n의 두-가닥 β-바디의 공간 구조를 제작하였으며, 여기서 PG는 두 개의 트레오닌 풍부 β-가닥이 측면에 있는 타입 2 β-턴을 구성하며 X는 초기에 알라닌이었다. 트레오닌의 30% 이하는, POI와의 분자 상호작용을 위해 필요한 경우, 다른 β-분지화 또는 가닥 브릿징 아미노산으로 무작위로 대체될 수 있지만 일반적으로 가닥의 트레오닌 측면은 단백질 결합 동안 용매와 마주한다. 턴 영역은 또한 단백질 결정 구조에서 자연적으로 발생하는 β-턴 또는 β-턴을 유도하는 것으로 알려진 비자연적인 아미노산 서열에서 발견되는 것과 같은 다른 서열을 구성하도록 변형될 수 있다.
초기 T/A 풍부 β-바디의 공간 구조를 POI의 전체 표면을 가로질러 수동으로 이동시키고 회전시켜 전체 형태 적합성 및 아미노산 측쇄와의 상호작용을 위해 유망한 그루브, 피트 및 패치의 존재 측면에서 최적의 상호작용을 위한 부위를 확인하였다. T/A 풍부 β-바디의 1 내지 3개의 가장 유망한 배향을 알라닌 측쇄 치환을 위해 선택하여 각각의 측쇄를 선택된 결합측면에 최적으로 피팅시켰다. 이 과정 동안 8-10층의 물의 부가 층으로 어닐링(450 - 300 K, 스텝 0.5 fs)에 의한 분자 역학을 사용한 여러 라운드의 피팅을 수행하여 아미노산 측쇄 배향, H-결합 망상구조, 소수성 상호작용, 전하-전하 상호작용의 부가 효과를 고려하였다. 러프 모델이 수득되었을 때 β-바디와 직접 접촉하는 POI의 아미노산은 고정에서 해제되는 반면 POI 구조의 나머지는 고정된 상태로 남아 있다. 상호작용의 개량 및 측쇄의 최종 조정이 수행되었다. 전체 최적화에 이어 각각 POI와 β-바디 상의 두 표면의 정전기 상호작용을 평가하여, 결국 표면 상에 양성과 음성 및 소수성과 소수성 패치의 최대 중첩을 수득하였다. 가장 중요하게도 β-바디의 측쇄의 크기(분자 공간)는 POI와 β-바디 사이의 표면을 중단없이 최대로 중첩시킬 수 있어야 하며, 이에 의해 물 분자를 최적으로 배제하는 단백질-β-바디 상호작용 상보성을 제공해야 한다. 최종 β-바디-POI-물 복합체는 300 K에서 1-2 ns의 역학적 계산 동안 처음에는 완화될 수 있었다(대부분의 POI가 여전히 고정되어 있음).
β-바디의 소정의 3차원 구조는 수득된 친화성을 위해 매우 중요하다. 따라서, POI를 제거하고 β-바디를 벽-구속된 물방울에 침지시켰다. 분자 역학은 300 K에서 1-2 ns 동안 계속되어 β-바디의 구조적 안정성과 무결성에 접근하였다. 이것이 어떤 이유로 안정적이지 않다면, 구조적 안정성이 수득되어 충분한 안정성을 제공할 때까지 상기 과정을 상기 어느 위치에서든 반복하였다. 이 과정 동안 클릭할 수 있는 산성-알킨 아미노산 또는 디설파이드 결합과 같은 β-바디의 트레오닌 측면 상의 구속 쌍을 사용하는 것이 종종 합리적일 것이다. 또한 덜 최적의 표면 피팅을 희생하더라도, 상호작용에서 소수성 패치에 β-분지화 이소류신 또는 발린을 사용하는 것이 도움이 될 것이다.
[표 1]. 설계된 β-바디의 목록. 표적 화합물과의 결합에 대해 시험되고 결합이 달성된 이러한 β-바디는 (T)로 표시된다.
실시예
2
샌드위치 분석
β-바디는 샌드위치 분석에 사용될 수 있으며, 여기서 두 개의 상이한 β-바디는 상이한 부위에서 동일한 POI에 결합한다.
POI를 갖는 두 개의 β-바디의 샌드위치 분석을 위해, 상기 T/A - β-바디로 확인된 POI 상의 두번째 또는 세번째 최적 부위에 대해 실시예 1에 기술된 과정을 반복하는 동시에 두 개의 β-바디 사이의 원치않는 특정 상호작용이 일어나지 않도록 보장하였다. 이것은 물방울 쌍의 300K에서의 제한된 (β-바디 주쇄 구조를 유지하는) 분자 역학 동안 두 분자의 표면 불일치를 보장함으로써 이루어졌다.
실시예
3
샌드위치 분석
샌드위치 분석을 위해 실시예 1 및 2에 기술된 바와 같이 확인된 β-바디를 생체적합성 PEGA-비드(예를 들어 70 kDa 이하의 단백질의 침투를 허용하는 다공도를 갖는 PEGA1900) 상에서 표준 Fmoc-기반 고체상 펩타이드 합성에 의해 합성하였다. PEGA 비드는 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)로부터 이용 가능하다.
샌드위치 분석의 실시예에서 인터류킨(IL1, IL2, IL6, IL10, IL12, IL18 및 TNFα)의 결정 구조를 실시예 1 및 2에 기술된 과정에 적용한다.
IL1 모델
IL1의 경우, IL1의 대향면에 결합하는 두 개의 β-바디를 실시예 1 및 2에 기술된 바와 같이 확인하고, 다음과 같이 고체상으로 합성하였다:
A: 리간드 1: (서열번호 5) ETDTYTETYPGYTSTWTITD---비드(PEGA1900 수지에 여전히 부착된 채로 합성, 탈보호 및 사용됨. 작은 분획이 사용된 하이드록시메틸벤즈아미드(HMBA) 링커로부터 방출되었으며 HRMS에 의해 특성화됨)
B: 리간드 2: RhodamineX---(서열번호 7) TKTDRVTEPGRTMTFTGT-OH (0.1 M NaOH로의 처리에 의해 방출된 HMBA-PEGA800 상에서 합성되고, 분취용 HPLC에 의해 정제되며, 동결건조되고 HRMS에 의해 특성화됨.)
리간드 1 및 리간드 2에 결합된 IL-1의 모델이 도 3A에 나타내어져 있다.
샌드위치 결합 분석을 입증하기 위해 상기 펩타이드 A의 네 개의 비드를 100 nM의 펩타이드 B를 함유하는 미세적정 웰에서 50 μL Milli-Q 물에 첨가하였다. 웰을 ROX 필터 큐브를 사용하여 ICX73 형광 현미경(Olympus)으로 영상화하였다. 백그라운드를 능가하는 형광 축적은 검출할 수 없었다(도 3B 참조). 이것은 두 개의 β-바디 사이의 특이 결합 상호작용이 없음을 나타내었다. 이에 인터류킨 1의 용액 (50 nM)을 첨가하였으며 짧은 시간 후에 비드에서 상당한 ROX 형광의 축적이 IL1이 A에 결합하고 B를 비드에 모집한다는 표시로서 관찰되었다. 20 min. 배양 후 형광도가 도 3C에 나타내어져 있다. 형광의 강도는 IL1의 농도 및 상호작용의 친화도의 척도이다.
IL2 - 모델
IL2의 경우, IL2의 대향면에 결합하는 두 개의 β-바디를 실시예 1 및 2에 기술된 바와 같이 확인하고 다음과 같이 합성하였다:
C: 리간드 3: NTVTNTMTRPGVTETVTQTD (서열번호 15)는 PEGA1900 수지 비드 상에서 직접 고체상 합성에 의해 합성하였다. 리간드는 하이드록시메틸벤즈아미드 (HMBA) 링커를 통해 비드에 부착하였다. 리간드는 PEGA1900 수지에 여전히 부착한 채로 합성, 탈보호 및 사용하였다. 작은 분획을 사용된 하이드록시메틸벤즈아미드 (HMBA) 링커로부터 방출시키고 HRMS에 의해 특성화하였다
D: 리간드 4: 형광단 RhodamineX에 연결된 TRTLTYTEPGITQTKTEA (서열번호 14). (리간드 4는 HMBA-PEGA800 비드 상에서 합성하고 0.1 M NaOH로의 처리에 의해 방출하며, 분취용 HPLC에 의해 정제하고, 동결건조하고 HRMS에 의해 특성화하였다.
리간드 3 및 리간드 4에 결합된 IL-2의 모델이 도 1A에 나타내어져 있다.
샌드위치 결합 분석은 다음과 같이 수행하였다: 상기한 바와 같이 제조된 리간드 C를 갖는 네 개의 비드를 100 nM의 펩타이드 D를 함유하는 미세적정 웰에서 50 μL MilliQ 물에 첨가하였다. 웰을 ROX 필터 큐브를 사용하여 ICX73 형광 현미경(Olympus)으로 영상화하였다. 백그라운드를 능가하는 형광 축적은 검출할 수 없었다(도 1B 참조). 이것은 두 개의 β-바디 사이의 특이 결합 상호작용이 없음을 나타내었다.
이에 인터류킨 2의 용액 (50 nM)을 첨가하였으며 짧은 시간 후에 비드에서 상당한 ROX 형광의 축적이 IL2가 C에 결합하고 D를 비드에 모집한다는 표시로서 관찰되었다. 형광의 강도는 IL2의 농도 및 상호작용의 친화도의 척도이다. 3 min. 배양 후 수득된 결과는 도 1C에 나타내어져 있고 20 min. 배양 후 수득된 결과는 도 1D에 나타내어져 있다.
IL6 - 모델
IL6의 경우, IL6의 대향면에 결합하는 두 개의 β-바디를 실시예 1 및 2에 기술된 바와 같이 확인하고 다음과 같이 합성하였다:
E: 리간드 5: PEGA1900-비드에 연결된 HTWTDTLTRPGYTVTHTLTL (서열번호 17)은 PEGA1900 수지 비드 상에서 직접 고체상 합성에 의해 합성하였다. 리간드는 하이드록시메틸벤즈아미드 (HMBA) 링커를 통해 비드에 부착하였다. 리간드는 PEGA1900 수지에 여전히 부착한 채로 합성, 탈보호 및 사용하였다. 작은 분획을 사용된 하이드록시메틸벤즈아미드 (HMBA) 링커로부터 방출시키고 HRMS에 의해 특성화하였다
F: 리간드 6: 형광단 RhodamineX에 연결된 TMTDTDTYPGFTDTLTHA (서열번호 16). (리간드 6은 HMBA-PEGA800 비드 상에서 합성하고 0.1 M NaOH로의 처리에 의해 방출하며, 분취용 HPLC에 의해 정제하고, 동결건조하고 HRMS에 의해 특성화하였다.
리간드 5 및 리간드 6에 결합된 IL-6의 모델이 도 4A에 나타내어져 있다.
샌드위치 결합 분석은 다음과 같이 수행하였다: 상기한 바와 같이 제조된 리간드 E를 갖는 두 개의 비드를 별도의 웰에 담고, 100 nM의 펩타이드 F를 함유하는 미세적정 웰에서 50 μL MilliQ 물에 첨가하였다. 혼합물을 수 시간 동안 배양하였다.
웰 중의 하나에 인터류킨 6의 용액 (20 nM)을 첨가하였으며 짧은 시간 후에 비드에서 상당한 ROX 형광의 축적이, IL6이 E에 결합하고 F를 비드에 모집하지만 이것이 인터류킨 6의 부재하에서는 일어나지 않았다는 표시로서, 인터류킨 6을 갖는 웰에서는 관찰되었지만 다른 웰에서는 관찰되지 않았다. 비드를 신호 대 잡음(signal to noise)을 개선시키기 위해 PBS로 두 번 세척하였다.
웰을 ROX 필터 큐브를 사용하여 ICX73 형광 현미경(Olympus)으로 영상화하였다. 백그라운드를 능가하는 형광 축적(도 4B 및 향상된 이미지 4C 참조)은 IL 6이 없는 웰에서는 검출할 수 없었지만 IL 6의 존재하에서는 강한 형광이 관찰되었다. 이것은 두 개의 β-바디 사이에 특이 결합 상호작용이 없지만 형광의 강도가 IL6의 농도 및 상호작용의 친화도의 척도임을 나타내었다. 20 nM IL6과의 20 min. 배양 후 수득된 결과가 도 4D에 나타내어져 있다.
실시예
4
β-바디의 분자 라이브러리로부터의 β-바디의 선택.
조합 방법에 의한 분자 상호작용을 위한 결합 파트너의 선택은 특정 상호작용을 위한 고친화성 분자의 확인을 위한 매우 강력한 기술이다. 더 큰 단백질 구조의 점 및 부위 돌연변이를 갖는 파지 디스플레이 라이브러리가 POI에 결합하는 단백질을 발견하는데 광범위하게 사용되어 왔다. 그러나 이들은 단백질 발현에 의해서만 접근 가능한 더 큰 분자이다. 본 발명은 POI에 대한 고 친화도의 화합물을 확인하기 위해 β-바디의 고체상 원 비드 원 화합물 (OBOC) 라이브러리의 조합 합성 및 스크리닝을 사용할 수 있다.
K(TX)4PG(XT)4EG의 라이브러리는 본질적으로 문헌[Christensen et al, 2003]에 기술된 바와 같이 분할-혼합 방법에 의해 HMBA-PEGA1900 수지 상에서 합성하였으며 95% TFA로 탈보호하였다. POI를 pH 7.5의 인산염 완충액에 용해시키고, AMC-(CH2)3-CO-OSu (4 eqv, 30 min)를 사용하여 아미노메틸쿠마린으로 표지하고 FPLC로 정제하였다. HRMS는 POI가 1개의 AMC 그룹을 함유함을 나타내었다. 단백질을 100 nM 농도로 용해시키고 라이브러리를 이들 용액과 10배 희석(10nM)으로 2 h 동안 배양하였다. 라이브러리를 GFP 필터큐브를 사용하여 ICX73 형광 현미경 하에서 검사하였다. 강한 AMC-형광을 갖는 비드를 마이크로시린지를 사용하여 별도의 에펜도르프 튜브에 수집하였다. 비드를 세척하고 물 중의 5% 트리에틸아민을 첨가하였다. 밤새 배양 후 상청액을 또 다른 에펜도르프 튜브로 옮기고 비드를 70% 아세토니트릴/물로 세척하였다. 합한 용액을 스피드백(speedvacc)을 두 번 사용하여 건조될 때까지 농축시키고 잔류물을 50% 아세토니트릴/물에 용해시켰다. 생성물을 α-시아노-4-하이드록시 신남산 매트릭스를 갖는 MALDI 플레이트 상에 점적(spottet)하고 Bruker Solarix ICR-기기 상에서 MSMS 시퀀싱에 의해 분석하여 KTQTYNGTGPGRTGTVTYTEG (서열번호 55), KTYTYNYTGPGRTSTATLTEG (서열번호 56) 및 KTGTQNLTGPGRTHTQTATEG (서열번호 3)와 같은 강한 결합 β-바디 서열을 제공하였다. POI 상의 상호작용 부위는 규명되지 않았다.
실시예
5
당해 실시예는 선형 펩타이드를 인식하는 β-바디를 어떻게 확인하는지를 예시한다. 본 발명에 따르는 21.000.000개 β-바디의 분할-혼합 라이브러리는 상기 실시예 4에 기술된 바와 같은 조합 합성에 의해 제조하였다. 이것은 형광이 없는 100 μm 비드 상에서 수행하였다. 470.000개 헥사펩타이드의 제2 분할-혼합 라이브러리는 이 라이브러리가 몇몇 관능 그룹에 부착된 형광 표지를 갖는 보다 큰 400 μm 비드 상에서 제조되었다는 것을 제외하고는 유사한 방식으로 제조하였다. 두 가지 라이브러리를 혼합하고 하나는 큰 형광 비드이고 하나는 작은 비-형광 비드인 쌍으로 서로에 부착하는 비드의 쌍을 수집하고 두 개의 펩타이드를 MSMS로 확인하였다. 펩타이드의 재합성 및 비드 결합 분석은 쌍 상호작용의 높은 특이성 및 10-8 - 10-6 M의 결합 상수 Kd를 보여주었다. β-바디 - 펩타이드 쌍 (KTGTQNLTGPGRTHTQTATEG (서열번호 3) 및 HRMVRG (서열번호 45))이 히스태그 - EGFP - 스페이서 - KTGTQNLTGPGRTHTQTATEG (서열번호 3)를 함유하는 EGFP 융합 단백질을 제조하는데 사용되었다. 비드에 연결된 헥사펩타이드에 결합된 이러한 융합 단백질의 모델이 도 2A에 나타내어져 있다. EGFP는 향상된 녹색 형광 단백질 (Enhanced Green Fluorescent Protein)의 약자이다. 융합 단백질 뿐만 아니라 EGFP를 대장균에서 과발현시키고 헥사펩타이드 파트너, HRMVRG (서열번호 4)가 부착된 PEGA 고체 지지체를 사용하여 세포 용해물로부터 정제하였다. EGFP-β-바디 융합 단백질은 비드와 관련된 녹색 형광에 의해 입증되는 바와 같이 (서열번호 5) HRMVRG-PEGA1900에 결합(도 2B 참조)하는 반면 EGFP는 그렇지 않다(도 2C 참조).
정제를 위해, 융합 단백질을 대장균에서 과발현시키고 세포를 용해시켰다. 세포 용해물을 원심분리하고 상청액을 (서열번호 5) HRMVRG-PEGA1900을 함유하는 친화도 컬럼에 통과시켰다. 컬럼을 물로 세척하고 단백질을 pH 6의 PBS 완충액으로 용출시켰다. 정제된 EGFP-융합 단백질을 PBS로 용출시켰으며 FPLC 및 MS에 따라 순수하였다.
도 2D는 정제 동안 수득된 다양한 분획의 SDS-PAGE 분석을 보여준다. 컬럼 4는 용출물을 나타내는 반면, 컬럼 1은 조 추출물을 나타내었다. 예상된 크기의 융합 단백질은 "GFP-헤어핀"으로 나타내어지는 반면 예상된 크기의 EGFP는 "GFP"로 나타내어진다.
EGFP의 친화성 정제
대장균 세포에서 발현된 EGFP를 선회시키고 용해시켰다. 둘 다 비처리(EGFP 150 μM) 및 희석(EGFP 500nM)된 용해물을 β-바디 비드 (β-바디 서열번호 1; TETKTVTITRPKMTWTFTHTVTG)와 함께 배양하였다.
도 6은 비처리된(A) 및 희석된(B) 용해물 둘 다에서의 EGFP-β-바디 융합 복합체를 보여준다.
당해 실시예는 어떻게 β-바디가 친화성 정제에 사용될 수 있는지를 예시한다.
실시예
6
선택성 분석: GFP vs. IL1
GFP (60 nM)를 다른 β-바디 비드, GFP에 특이적인 제1 타입의 β-바디 비드 (β-바디 서열번호 1; TETKTVTITRPKMTWTFTHTVTG) 및 IL1에 특이적인 제2 타입의 β-바디 비드 (β-바디 서열번호 5)와 동시에 배양하였다.
도 7A는 GFP에 특이적인 β-바디 비드만이 결합을 수행함을 보여준다.
동일한 실험을 IL1로 반복하였다. ROX-IL1 (100 nM)을 다른 β-바디 비드, GFP에 특이적인 제1 타입의 β-바디 비드 (β-바디 서열번호 1) 및 IL1에 특이적인 제2 타입의 β-바디 (β-바디 서열번호 5; ETDTYTETYPGYTSTWTITD)와 동시에 배양하였다.
도 7B는 IL1에 특이적인 β-바디 비드만이 결합을 수행함을 보여준다.
실시예
7
게피린의 억제를 위한 β-바디
게피린은 3개의 도메인으로 이루어진 93kDa 다기능성 단백질이다: N-말단 G 도메인, C-말단 E 도메인 및 T-말단을 -말단 도메인과 연결하는 비구조화된 링커 도메인. 세포에서, 게피린은 적어도 3개의 하위단위의 올리고머를 형성하는 것으로 보인다. 게피린의 상이한 부위들을 표적화하는 수 개의 β-바디를 설계하였다.
특히:
a) 단백질-단백질 계면을 표적화하는 두 개의 β-바디:
Pra-KTKTWTMTGPGGEKTRTLTA-Abu(N3)-G-OH (서열번호 32), 및
Pra-WTNTGTYTIPGVTVTMTETV-Abu(N3)-E (서열번호 33);
b) 펩타이드 결합 부위를 표적화하는 β-바디:
Pra-TVTGTLYPGTLLGFET-Abu(N3) (서열번호 34);
TTVTGTLYPGTLLGFETT (서열번호 41);
CTVTGTLYPGTLLGFETC (서열번호 42);
TTVTGTLYPGTLLGAATT (서열번호 43); 및
(Abu(N3)-TVTGTLYPGTLLGFET-Pra (서열번호 44);
c) 몰리브덴 결합 부위를 표적화하는 네 개의 β-바디:
PraTWTLTHTPGTMEITET-Abu(N3)-OH, 역전됨, (서열번호 39),
PraTW(6-NH2)TLTHTPGTMEITET-Abu(N3)-OH, 역전됨, (서열번호 40),
Pra-YTYTDTTPGVTRTLTWG-Abu(N3)-OH, 정상, (서열번호 38), 및
KTW-Pra-LTITPGTMEI-Abu(N3)-DTV, 최적화되지 않은 b-hp, (서열번호 37);
d) 유리 부위:
HTLTKTITQTWPGKTYTITWTFTW (서열번호 36), 및
Ac-VTWTDTLTFTLPGVTWTITMTITE (서열번호 35).
다음의 β-바디 TTVTGTLYPGTLLGFETT (서열번호 41)는 알라닌 스캐닝을 통해 최적화를 수행하였다. 생성된 9개 β-바디를 게피린의 글리신 수용체 결합 부위 (펩타이드 결합 부위)에 대한 이들의 친화도에 대해 시험하였다. 원래의 펩타이드의 친화도가 개선될 수 있으며 최적화된 β-바디는 다음의 서열 CTVTGTLYPGTLLGFETC (서열번호 42) 및 TTVTGTLYPGTLLGAATT (서열번호 43)를 갖는 것으로 밝혀졌다.
β-바디 TTVTGTLYPGTLLGFETT (서열번호 41)를 사이클릭 형태로 되도록 더욱 변형시켰다:
Abu(N3)-TVTGTLYPGTLLGFET-Pra (서열번호 44), 및 Pra-TVTGTLYPGTLLGFET-Abu(N3) (서열번호 34);
게피린의 글리신 수용체 결합 부위 (펩타이드 결합 부위)에 대한 이들의 친화도는 변하지 않았다.
실시예
7
이형이량체
β-바디를 동형이량체보다는 이형이량체를 형성하려는 경향이 더 높도록 설계할 수 있다.
다음의 두 개의 β-바디가 설계되었다:
(1) TYTYTYPGLTRTHT (서열번호 57)
(2) TTYTYPGDTFTI (서열번호 58)
(3) TFTFTFPGLTRTHT (서열번호 59)
(4) TDTRTYTYTVPGRTRTRTWTET (서열번호 60), 및
(5) DTITYTYTGPGRTDTETNTEG (서열번호 61).
형광 프로브를 (1), (2) 및 (3)에 부착하였다. 그후 형광 β-바디를 다음과 함께 배양하였다:
- NHAc로 변형된 비드; 또는
- (1)로 변형된 비드; 또는
- (2)로 변형된 비드.
도 8은 (1) 및 (2)가 각각 (2) 및 (1)로 변형된 비드(이형이량체)에 가장 잘 결합할 수 있음을 보여준다(도 8D 및 E). 이들은 또한 각각 (1) 및 (2)로 변형된 비드(동형이량체)에 높은 친화도로 결합할 수 있다(도 8C 및 F). (3)은 티로신 잔기 (Y)가 페닐알라닌 잔기로 치환된 (2)의 변형된 버전이다. 이러한 치환은 비드-(2)-형광성-(1)에 대해 7*10-7의 Kd에서 비드-(2)-형광성-(3)에 대해 5*10-6의 Kd로의 결합의 7x 감소를 초래하였다. 비특이 NHAc-변형된 비드에 대한 형광성 β-바디의 결합은 사소하였다(도 8A 및 B).
실시예
8
β-바디는 또한 독성을 중화시키는데 사용될 수 있다. 이를 입증하기 위해, 클로스트리듐 디피실로부터의 독소 A, 보툴린 독소 및 리신에 결합하는 β-바디를 다음에 따라 설계하였다:
- 2G7CA로부터의 클로스트리듐 디피실: wEHTHTeTNPGNTYTST (서열번호 29);
- 구조 4JRA.pdb로부터의 보툴리눔 독소: E-Abu(N3)FTMEQTWTGPGSTKTFTFTH-Pra-G (서열번호 30);
- 구조 4Z9K.pdb로부터의 리신: LTFTFTVTPGTFTWTGTKPGETYTFTRTE (서열번호 31).
클로스트리듐 디피실로부터의 독소 A를 표적화하는 β-바디는 탄수화물 부위에 결합하며, 여기서 이것이 사당류를 대체하여 독소 A의 중화를 야기한다.
당해 실시예는 어떻게 β-바디가 독소를 중화시키는데 사용될 수 있는지를 예시한다.
실시예
9
β-바디는 또한 프로테아제를 억제하는데 사용될 수 있다.
서브틸리신 및 파파인이 중심으로 향하는 내향 (인식) 잔기 및 외향 배향된 β-바디 둘 다로의 억제를 위한 시험 프로테아제로서 선택되었다.
다음의 내향 배향된 β-바디가 구조 1NDQ.pdb, D-아미노산으로부터의 서브틸리신을 위해 설계되었다:
tltmtwtythtpGtitwtytdtttG-OH; 서열번호 47; 및
abu(N3)-ltmtwtythtpGtitwtytdtt-pra-G-OH; 서열번호 48;
도 YY는 β-바디 - 활성 부위 상호작용의 두 개의 측면을 보여준다. 적합도는 갈라진 틈의 바닥에서 매우 우수하다.
다음의 내향 배향된 β-바디가 구조 9PAP.pdb로부터의 파파인을 위해 설계되었다.
내향 배향된 β-바디는 파파인의 결합 부위에 있는 평탄부(plateaus) 둘 다에 매우 우수한 적합도를 제공하며 강하게 상호작용해야 한다. 모든 D-아미노산 펩타이드:
abu(N3)-qtmtGtltwtpGtqtntltwtf-pra-G (서열번호 51); 및
tqtmtGtltwtpGtqtntltwtftG (서열번호 50).
다음의 외향 배향된 β-바디는 상기 내향 배향된 구조 이외에 D-아미노산 (4-아지도-2-아미노부탄산 및 프로파르길글리신 포함)을 포함하는 파파인을 위해 설계되었다:
abu(N3)-wtftlpqGtmtn-pra-G; 서열번호 52, 평탄부 1을 표적화함; 및
abu(N3)-wtvtvtfpGitmtttf-pra-OH; 서열번호 54, 평탄부 2를 표적화함.
etltwtgtvtvtfpGitmtttEtmtftf-OH; 서열번호 53, 이것은 상기 두 개의 펩타이드의 조합이지만 L-Glu을 포함하며, 둘 다 평탄부를 표적화한다.
단백질분해 활성이 균형을 이루고 억제가 달성되도록 고 농도의 β-바디가 사용된다. 농도가 충분히 높지 않으면 프로테아제가 β-바디를 절단하고 불활성화시킬 수 있다.
참고문헌
Christensen, C., Bruun Schiodt, C., Taeker Foged, N., & Meldal, M. (2003). Solid Phase Combinatorial Library of 1, 3-Azole Containing Peptides for the Discovery of Matrix Metallo Proteinase Inhibitors. QSAR & Combinatorial Science, 22(7), 754-766.
Lam, K. S.; Krchnak. V.; Lebl. M. Chem. Rev. 1997, 97, 411-448
Lam, K.S., Salmon, S.E., Hersh, E.M., Hruby, V., Kazmierski, W.M. and Knapp, R.J.,A new type of synthetic peptide library for identifying ligand-binding activity, Nature, 354 (1991) 82-84.
Meldal, Morten, Christensen, Soren Flygering, 2010, Microparticle Matrix Encoding of Beads, Angewandte Chemie International Edition, Vol. 49, Issue 20, p.3473-3476.
SEQUENCE LISTING
<110> UNIVERSITY OF COPENHAGEN
<120> BINDING PEPTIDES
<130> IPA190589-DK
<150> DK PA 2016 70899
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<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(18)
<223> Peptide
<400> 13
Glu Thr Tyr Thr Glu Thr Tyr Pro Gly Tyr Thr Ser Thr Trp Thr Ile
1 5 10 15
Asp Asp
<210> 14
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(18)
<223> Peptide
<400> 14
Thr Arg Thr Leu Thr Tyr Thr Glu Pro Gly Ile Thr Gln Thr Lys Thr
1 5 10 15
Glu Ala
<210> 15
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(20)
<223> Peptide
<400> 15
Asn Thr Val Thr Asn Thr Met Thr Arg Pro Gly Val Thr Glu Thr Val
1 5 10 15
Thr Gln Thr Asp
20
<210> 16
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(18)
<223> Peptide
<400> 16
Thr Met Thr Asp Thr Asp Thr Tyr Pro Gly Phe Thr Asp Thr Leu Thr
1 5 10 15
His Ala
<210> 17
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(20)
<223> Peptide
<400> 17
His Thr Trp Thr Asp Thr Leu Thr Arg Pro Gly Tyr Thr Val Thr His
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu
20
<210> 18
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(20)
<223> X2=L-propargylglycin X19=L-4-azido-2-aminobutanoic acid
<400> 18
Gly Xaa Ser Thr Trp Thr Met Thr Asn Pro Gly Trp Thr Lys Thr His
1 5 10 15
Thr Leu Xaa Gly
20
<210> 19
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(23)
<223> X3= L-4-azido-2-aminobutanoic acid ; X21=L-propargylglycin
<400> 19
Gly Gly His Xaa Trp Thr Asp Thr Leu Thr Arg Pro Gly Tyr Thr Val
1 5 10 15
Thr His Thr Leu Xaa Leu Gly
20
<210> 20
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(20)
<223> Peptide
<400> 20
Ala Thr Asn Thr Leu Thr Met Thr Trp Pro Gly Arg Thr Asn Thr Asp
1 5 10 15
Thr Phe Thr Trp
20
<210> 21
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(18)
<223> Peptide
<400> 21
Thr Lys Thr Arg Thr Tyr Thr Ile Pro Gly Glu Arg Tyr Thr Asp Thr
1 5 10 15
Trp Ala
<210> 22
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(19)
<223> Peptide
<400> 22
Thr Leu Thr Phe Thr Ala Thr Arg Pro Gly Leu Thr Lys Thr Ile Thr
1 5 10 15
Ile Thr Leu
<210> 23
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(19)
<223> Peptide
<400> 23
Asp Thr Val Thr Lys Thr Phe Thr Trp Pro Gly Ala Lys Leu Thr Phe
1 5 10 15
Thr Lys Thr
<210> 24
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(20)
<223> Peptide
<400> 24
Lys Thr Trp Thr Leu Thr His Thr Lys Pro Gly Asn Thr Ala Thr Asp
1 5 10 15
Thr His Thr Ile
20
<210> 25
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(18)
<223> Peptide
<400> 25
Arg Leu Thr Trp Thr Met Thr Ile Pro Gly Leu Thr Leu Thr Leu Thr
1 5 10 15
Asp Thr
<210> 26
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(18)
<223> Peptide
<400> 26
Thr Trp Thr Leu Thr Trp Thr Lys Pro Gly Gln Glu Gln Thr Met Thr
1 5 10 15
His Ala
<210> 27
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(20)
<223> Peptide
<400> 27
Tyr Thr Leu Thr Asp Thr Glu Thr Tyr Pro Gly His Thr Arg Thr Ala
1 5 10 15
Thr Gln Thr Glu
20
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(17)
<223> Peptide
<400> 28
Trp Glu His Thr His Thr Glu Thr Ser Pro Gly Asn Thr Gln Thr Ser
1 5 10 15
Thr
<210> 29
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(17)
<223> Peptide
<400> 29
Trp Glu His Thr His Thr Glu Thr Ser Pro Gly Asn Thr Tyr Thr Ser
1 5 10 15
Thr
<210> 30
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(24)
<223> X2=L-4-azido-2-aminobutanoic acid ; X23=L-propargylglycin
<400> 30
Glu Xaa Phe Thr Met Glu Gln Thr Trp Thr Gly Pro Gly Ser Thr Lys
1 5 10 15
Thr Phe Thr Phe Thr His Xaa Gly
20
<210> 31
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(29)
<223> Peptide
<400> 31
Leu Thr Phe Thr Phe Thr Val Thr Pro Gly Thr Phe Thr Trp Thr Gly
1 5 10 15
Thr Lys Pro Gly Glu Thr Tyr Thr Phe Thr Arg Thr Glu
20 25
<210> 32
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(23)
<223> X1= L-propargylglycin ; X22= L-4-azido-2-aminobutanoic acid ;
G23=G-OH
<400> 32
Xaa Lys Thr Lys Thr Trp Thr Met Thr Gly Pro Gly Gly Glu Lys Thr
1 5 10 15
Arg Thr Leu Thr Ala Xaa Gly
20
<210> 33
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(24)
<223> X1=L-propargylglycin ; X23=L-4-azido-2-aminobutanoic acid
<400> 33
Xaa Trp Thr Asn Thr Gly Thr Tyr Thr Ile Pro Gly Val Thr Val Thr
1 5 10 15
Met Thr Glu Thr Val Ala Xaa Glu
20
<210> 34
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(18)
<223> X1= L-propargylglycin ; X18=L-4-azido-2-aminobutanoic acid
<400> 34
Xaa Thr Val Thr Gly Thr Leu Tyr Pro Gly Thr Leu Leu Gly Phe Glu
1 5 10 15
Thr Xaa
<210> 35
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(24)
<223> V1= Ac-V (ACYLATED)
<400> 35
Val Thr Trp Thr Asp Thr Leu Thr Phe Thr Leu Pro Gly Val Thr Trp
1 5 10 15
Thr Ile Thr Met Thr Ile Thr Glu
20
<210> 36
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(24)
<223> Peptide
<400> 36
His Thr Leu Thr Lys Thr Ile Thr Gln Thr Trp Pro Gly Lys Thr Tyr
1 5 10 15
Thr Ile Thr Trp Thr Phe Thr Trp
20
<210> 37
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(18)
<223> X4=L-propargylglycin ; X15=L-4-azido-2-aminobutanoic acid
<400> 37
Lys Thr Trp Xaa Leu Thr Ile Thr Pro Gly Thr Met Glu Ile Xaa Asp
1 5 10 15
Thr Val
<210> 38
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(19)
<223> X1= L-propargylglycin ; X19=L-4-azido-2-aminobutanoic acid ,
hydroxylated
<400> 38
Xaa Tyr Thr Tyr Thr Asp Thr Thr Pro Gly Val Thr Arg Thr Leu Thr
1 5 10 15
Trp Gly Xaa
<210> 39
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(18)
<223> X1=L-propargylglycin ; X18=L-4-azido-2-aminobutanoic acid ,
hydroxylated
<400> 39
Xaa Thr Trp Thr Leu Thr His Thr Pro Gly Thr Met Glu Ile Thr Glu
1 5 10 15
Thr Xaa
<210> 40
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(18)
<223> X3=6-NH2; X18=L-4-azido-2-aminobutanoic acid , hydroxylated
<400> 40
Thr Trp Xaa Thr Leu Thr His Thr Pro Gly Thr Met Glu Ile Thr Glu
1 5 10 15
Thr Xaa
<210> 41
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(18)
<223> Peptide
<400> 41
Thr Thr Val Thr Gly Thr Leu Tyr Pro Gly Thr Leu Leu Gly Phe Glu
1 5 10 15
Thr Thr
<210> 42
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(18)
<223> Peptide
<400> 42
Cys Thr Val Thr Gly Thr Leu Tyr Pro Gly Thr Leu Leu Gly Phe Glu
1 5 10 15
Thr Cys
<210> 43
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(18)
<223> Peptide
<400> 43
Thr Thr Val Thr Gly Thr Leu Tyr Pro Gly Thr Leu Leu Gly Ala Ala
1 5 10 15
Thr Thr
<210> 44
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(18)
<223> X1= L-4-azido-2-aminobutanoic acid ; X18= L-propargylglycin
<400> 44
Xaa Thr Val Thr Gly Thr Leu Tyr Pro Gly Thr Leu Leu Gly Phe Glu
1 5 10 15
Thr Xaa
<210> 45
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(23)
<223> Peptide
<400> 45
Thr Ile Thr Lys Thr Ala Arg Tyr Thr Met Pro Gly Lys Thr Leu Thr
1 5 10 15
Lys Thr Gly Thr Leu Thr Gly
20
<210> 46
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(23)
<223> X1= L-propargylglycin ; X22=L-4-azido-2-aminobutanoic acid
<400> 46
Xaa Ile Thr Lys Thr Ala Arg Tyr Thr Met Pro Gly Lys Thr Leu Thr
1 5 10 15
Lys Thr Gly Thr Leu Xaa Gly
20
<210> 47
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(25)
<223> Residues 1-12 D-amino acid residues; Residues 14-24 D-amino acid
residues; G25=G-OH
<400> 47
Thr Leu Thr Met Thr Trp Thr Tyr Thr His Thr Pro Gly Thr Ile Thr
1 5 10 15
Trp Thr Tyr Thr Asp Thr Thr Thr Gly
20 25
<210> 48
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(25)
<223> Residues 1-12 D-amino acid residues; Residues 14-24 D-amino acid
residues; G25=G-OH; X1= D-propargylglycin ; X24=
D-3-azido-2-aminobutanoic acid; G25=G-OH
<400> 48
Xaa Leu Thr Met Thr Trp Thr Tyr Thr His Thr Pro Gly Thr Ile Thr
1 5 10 15
Trp Thr Tyr Thr Asp Thr Thr Xaa Gly
20 25
<210> 49
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(23)
<223> X4= D-3-azido-2-aminobutanoic acid ; X21= D-propargylglycin
<400> 49
Ile His Val Xaa Val Thr Thr Arg Thr Met Pro Gly His Pro Ile Ala
1 5 10 15
Gly Ala Asp Ala Xaa Thr Gly
20
<210> 50
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(25)
<223> All D-amino acid residues (except for the glycine residues)
<400> 50
Thr Gln Thr Met Thr Gly Thr Leu Thr Trp Thr Pro Gly Thr Gln Thr
1 5 10 15
Asn Thr Leu Thr Trp Thr Phe Thr Gly
20 25
<210> 51
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(25)
<223> All D-amino acid residues (except for the glycin residues). X1=
D-4-azido-2-aminobutanoic acid ; X24= D-propargylglycin
<400> 51
Xaa Gln Thr Met Thr Gly Thr Leu Thr Trp Thr Pro Gly Thr Gln Thr
1 5 10 15
Asn Thr Leu Thr Trp Thr Phe Xaa Gly
20 25
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(15)
<223> All D-amino acid residues (except the glycine residues).
X1=D-4-azido-2-aminobutanoic acid ; X14= D-propargylglycin
<400> 52
Xaa Trp Thr Phe Thr Leu Pro Gln Gly Thr Met Thr Asn Xaa Gly
1 5 10 15
<210> 53
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(28)
<223> All D-amino acid residues (except the glycine residues). F28=F-OH
<400> 53
Glu Thr Leu Thr Trp Thr Gly Thr Val Thr Val Thr Phe Pro Gly Ile
1 5 10 15
Thr Met Thr Thr Thr Glu Thr Met Thr Phe Thr Phe
20 25
<210> 54
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(18)
<223> All D-amino acid residues (except the glycine residues). X1=
D-4-azido-2-aminobutanoic acid ; X18= D-propargylglycin,
hydroxylated
<400> 54
Xaa Trp Thr Val Thr Val Thr Phe Pro Gly Ile Thr Met Thr Thr Thr
1 5 10 15
Phe Xaa
<210> 55
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(21)
<223> Peptide
<400> 55
Lys Thr Gln Thr Tyr Asn Gly Thr Gly Pro Gly Arg Thr Gly Thr Val
1 5 10 15
Thr Tyr Thr Glu Gly
20
<210> 56
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(21)
<223> Peptide
<400> 56
Lys Thr Tyr Thr Tyr Asn Tyr Thr Gly Pro Gly Arg Thr Ser Thr Ala
1 5 10 15
Thr Leu Thr Glu Gly
20
<210> 57
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(14)
<223> Peptide
<400> 57
Thr Tyr Thr Tyr Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Arg Thr His Thr
1 5 10
<210> 58
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(12)
<223> Peptide
<400> 58
Thr Thr Tyr Thr Tyr Pro Gly Asp Thr Phe Thr Ile
1 5 10
<210> 59
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(14)
<223> Peptide
<400> 59
Thr Phe Thr Phe Thr Phe Pro Gly Leu Thr Arg Thr His Thr
1 5 10
<210> 60
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(22)
<223> Peptide
<400> 60
Thr Asp Thr Arg Thr Tyr Thr Tyr Thr Val Pro Gly Arg Thr Arg Thr
1 5 10 15
Arg Thr Trp Thr Glu Thr
20
<210> 61
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Designed peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(21)
<223> Peptide
<400> 61
Asp Thr Ile Thr Tyr Thr Tyr Thr Gly Pro Gly Arg Thr Asp Thr Glu
1 5 10 15
Thr Asn Thr Glu Gly
20
Claims (15)
- β-턴 펩타이드(β-turn peptide) 서열(들)에 의해 연결된 적어도 두 개의 β-가닥 펩타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 화합물이고, 상기 β-가닥 펩타이드 서열이 교호하는 정방향 및 역방향 β-가닥 펩타이드 서열의 역평행 배열(anti-parallel arrangement)로 조직화되며, 여기서
각각의 정방향 β-가닥 펩타이드 서열은 개별적으로 다음의 서열을 갖고
Xr(ZX)m
각각의 역방향 β-가닥 펩타이드 서열은 개별적으로 다음의 서열을 갖고
(XZ)nXr
여기서
각각의 Z는, 각 β-가닥 서열에서 최대 두 개의 Z가 Thr, 극성 β-분지화 아미노산, β-가닥 구조를 촉진시키는 비-단백질생성 α-분지화 아미노산 또는 가닥 브리징 아미노산(strand bridging amino acid) 중의 하나가 아닌 아미노산일 수 있음을 제외하고는, 개별적으로 Thr, 극성 β-분지화 아미노산, β-가닥 구조를 촉진시키는 비-단백질생성 α-분지화 아미노산 또는 가닥 브리징 아미노산이고;
각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산, β-아미노산 또는 γ-아미노산이고;
각각의 m 및 n은 개별적으로 3 내지 12 범위의 정수이고;
각각의 r은 0 내지 5 범위의 정수이고;
각각의 β-턴 펩타이드 서열은 개별적으로 다음의 서열을 갖고;
Xq1BUXq2
여기서
각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산이고;
각각의 U는 개별적으로 화학식의 아미노산이고, 여기서 Ra 및 Rb는 개별적으로 -H 및 C1-6-알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, Ra 및 Rb는 결합하여 사이클릭 구조를 형성할 수 있으며;
B는 Pro, 치환된 Pro 및 피페콜산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
각각의 q은 개별적으로 0 내지 5 범위의 정수이고, 여기서 q1 - q2는 -4, -2, 0, 2 또는 4이고;
선형 또는 사이클릭인 β-바디(β-body). - 제1항에 있어서, 화합물이 β-턴 펩타이드 서열에 의해 연결된 2 내지 10개 범위의 β-가닥 펩타이드 서열을 포함하는 β-바디.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 화합물이 다음의 구조를 갖고:
정방향 β-가닥 서열-
β-턴 펩타이드 서열-
역방향 β-가닥 서열,
여기서 정방향 β-가닥 서열 및 역방향 β-가닥 서열이 역평행 β-가닥으로서 배열되는 β-바디. - 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 각 β-가닥 펩타이드 서열 내의 Z의 적어도 70%가 Thr인 β-바디.
- 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 정방향 β-가닥 서열이 다음의 서열을 갖는 β-바디:
Xr(TX)m
여기서
T는 Thr이고;
각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산이고;
각각의 m은 개별적으로 3 내지 12 범위의 정수이고;
r은 0 내지 5 범위의 정수이다. - 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 역방향 β-가닥 서열이 다음의 서열을 갖는 β-바디:
(XT)nXr
여기서
각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산이고;
각각의 n은 개별적으로 3 내지 12 범위의 정수이고;
r은 0 내지 5 범위의 정수이다. - 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 β-턴 펩타이드 서열이 다음의 서열을 갖는 β-바디:
XqPGXq
여기서
각각의 X는 개별적으로 임의의 아미노산, β-아미노산 또는 γ-아미노산이고;
각각의 q는 개별적으로 0 내지 3 범위의 정수이다. - 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 β-바디의 아미노산 잔기의 전부가 L-아미노산인 β-바디.
- 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 β-바디의 아미노산 잔기의 전부가 D-아미노산인 β-바디.
- 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 최대 10-6 M, 예를 들면 10-7 M 이하, 예를 들어 10-8 M 이하, 예를 들어 10-9 M 이하, 예를 들면 10-10 M 이하, 또는 심지어 10-11 M 이하의 Kd로 표적 화합물에 결합할 수 있는 β-바디.
- 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 서열번호 61로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지는 β-바디.
- a. 컴퓨터에서 표적 화합물의 공간 구조 표현을 제공하는 단계;
b. 컴퓨터에서 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 따르는 다수의 β-바디의 공간 구조 표현을 생성하는 단계;
c. 상기 컴퓨터에서 표적 화합물의 공간 구조의 적어도 일부에 맞춘 β-바디를 선택함으로써, 표적 화합물에 결합할 수 있는 β-바디를 확인하는 단계를 포함하여, 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 따르는 β-바디(여기서, 상기 β-바디는 표적 화합물에 결합할 수 있다)를 확인하는 방법. - a. 샘플을 제공하는 단계;
b. 제1항 내지 제35항 중의 어느 한 항에 따르는 β-바디를 제공하는 단계(여기서, 상기 β-바디는 상기 표적 화합물에 결합할 수 있다);
c. 상기 샘플을 상기 β-바디와 배양하는 단계;
d. 상기 샘플에 결합된 β-바디를 검출하는 단계를 포함하여, 샘플에서 표적 화합물의 존재를 검출하는 방법. - 제1 β-바디가 제2 β-바디와는 상이하거나, 상기 제1 및 제2 β-바디가 동일하고, 상기 제1 및 제2 β-바디가 서로 결합할 수 있는, 제1항 내지 제35항 중의 어느 한 항에 따르는 제1 및 제2 β-바디를 포함하는 이량체.
- 제1항 내지 제34항 중의 어느 한 항에 따르는 β-바디를 포함하는 화합물로서, 상기 β-바디가 접합된 모이어티(moiety)에 공유 결합되는 화합물.
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