CN114026113A - 通过结构稳定化肽选择性靶向泛素及泛素样e1活化酶 - Google Patents

通过结构稳定化肽选择性靶向泛素及泛素样e1活化酶 Download PDF

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Abstract

本公开的特征为用于靶向泛素活化酶(E1)的结构稳定化肽和/或具有弹头的结构稳定化肽抑制剂。还公开了在治疗表达E1或依赖E1的癌症或疾病中使用所述结构稳定化肽和具有弹头的结构稳定化肽的方法。还提供了用于治疗表达E1或依赖E1的疾病的包括所述结构稳定化肽和/或具有弹头的结构稳定化肽的组合疗法。

Description

通过结构稳定化肽选择性靶向泛素及泛素样E1活化酶
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年4月18日提交的第62/835,721号美国临时申请的优先权，所述美国临时申请的内容以全文引用的方式并入本文中。
关于联邦资助研究的声明
本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号R35 CA197583和F30 CA221087下在政府支持下进行的。政府拥有本发明的某些权利。
序列表引用
本申请含有序列表，所述序列表已经以ASCII格式以电子方式提交并且以全文引用的方式并入本文中。所述ASCII副本创建于2020年4月17日，被命名为00530-0348WO1_SL.txt并且大小为720,896字节。
技术领域
本公开涉及靶向泛素和泛素样E1活化酶的结构稳定化肽和使用所述肽治疗癌症和其它病理性细胞存活的疾病的方法。
背景技术
泛素-蛋白酶体系统(UPS)为负责细胞内蛋白质降解的高度调节酶网络。泛素活化酶(E1)催化泛素缀合酶(E2)的泛素(Ub)装载。E1通过首先催化Ub C端的腺苷酰化并且随后在Ub C端与E1催化半胱氨酸之间形成高能硫酯键来使Ub活化。E1随后通过与E2结合并且将Ub从E1催化半胱氨酸转移到E2催化半胱氨酸来对E2进行装载。E2又与泛素连接酶(E3)和底物蛋白质复合以将Ub C端羧基共价转移到底物蛋白质上。与目标蛋白质的单个和多个Ub键的不同架构表示调节蛋白质功能和靶向蛋白质以进行蛋白酶体降解的复杂编码。靶向UPS的许多药物在多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤中已得到临床上成功，所述药物包括重引导E3活性的免疫调节酰亚胺药物(IMiD)和蛋白酶体抑制剂(例如，用于多发性骨髓瘤的硼替佐米(bortezomib))。
人类基因组含有超过600种泛素E3酶、大致40种泛素E2酶和仅两种泛素E1酶UBA1和UBA6。UBA6为仅一种泛素E2(USE1)的E1，而UBA1为所有其它泛素E2的E1且相应地活化>99％的细胞泛素(Jin等人，《自然(Nature)》,447:1135-1138(2007))。因为整个UPS系统几乎完全依赖于UBA1，所以UBA1的抑制引起通常降解的底物的稳定化、内质网应激和细胞周期停滞(Hyer等人，《自然·医学(Nature Medicine)》,24(2):186-193(2018))。已经开发临床级UBA1抑制剂TAK243/MLN7243，并且其展示在实体肿瘤和多发性骨髓瘤的临床前小鼠模型中高度有效(Hyer等人，《自然·医学》，24(2):186-193(2018))，并且最近已完成晚期实体肿瘤的1期临床试验(NCT02045095)。然而，极新近的研究识别了针对药物作用机制的基于点突变的抗性机制(Barghout等人，《白血病(Leukemia)》,2018年6月8日.doi：10.1038/s41375-018-0167-0)，强调针对E1酶的靶向抑制的潜在替代模式的需要和新颖性。
平行于泛素系统，许多其它泛素样蛋白质(UBL)与底物蛋白质共价连接以传导多种目标的信号。这些UBL具有其自身的活化和缀合酶。展现与泛素缀合系统的最高同源性的UBL包括NEDD8和SUMO(Hochstrasser,《自然》,458:422-429(2009))。NEDD8和SUMO的E1分别为异二聚复合体UBA3-NAE1和UBA2-SAE1。已开发具有类似于MLN7243的机制的UBA3-NAE1抑制剂(MLN4924/培沃尼司他(pevonedistat))和UBA2-SAE1抑制剂(ML-792)(Soucy等人，《自然》,458(7239):732-736(2009)；He等人，《自然-化学生物学(Nat Chem Biol.)》,13(11):1164-1171(2017))。NEDD8控制cullin-RING泛素E3连接酶的活性，且相应地MLN4924通过抑制cullin-RING介导的蛋白质周转而发挥其治疗效果。SUMO具有多种细胞作用，包括有丝分裂调节，并且实际上ML-792造成有丝分裂破坏。两种分子都展现体外强效的抗癌活性，且MLN4924当前处于实体肿瘤和恶性血液病的多个2期和3期试验(NCT03268954、NCT02610777、NCT03228186、NCT03238248、NCT03330821、NCT03319537)中。
MLN7243、MLN4924和ML-792为分别与UBA1、UBA3和UBA2上的ATP结合位点结合的腺苷氨磺酸酯。对ATP竞争性抑制剂的癌细胞抗性通常由目标酶ATP结合位点处或周围的突变产生(Krishnamurty和Maly,《ACS化学生物学(ACS Chem Biol.)》,5(1):121-138(2010))；实际上，已充分证实癌细胞中的选择性压力通过正向选择表达UBA3的突变形式的克隆群体而产生随时间推移降低的MLN4924敏感性，所述突变形式包括UBA3A171T、UBA3A171D、UBA3I310N和UBA3Y352H(Milhollen等人，《癌细胞(Cancer Cell)》,21(3):388-401(2012)；Toth等人，《细胞报告(Cell Rep.)》,1(4):309-316(2012)；Xu等人，公共科学图书馆·综合(PLoSOne),9(4):e93530(2014))。UBA1A580T、UBA1A580S和UBA1Y583C同样对MLN7243具有抗性(Misra等人，《结构(Structure)》,25(7):1120-1129(2017),Barghout等人，《白血病》,2018年6月8日.doi：10.1038/s41375-018-0167-0)且UBA2S95N,M97T对ML-792具有抗性(He等人，《自然-化学生物学》,13(11):1164-1171(2017))。因此，尽管这些抑制剂早期获得成功，但经由活性位点突变产生的明显抗性威胁使得有必要开发这些酶的替代抑制模式，以治疗恶性血液病和实体肿瘤。到目前为止，尚未开发出展现泛素E1活化酶抑制的替代模式的其它药物先导化合物。
因此，需要这些泛素和泛素样活化酶的新抑制剂。
发明内容
E1通过首先催化Ub C端的腺苷酰化并且随后在Ub C端与E1催化半胱氨酸之间形成高能硫酯键来使Ub活化。E1随后通过与E2结合并且将Ub从E1催化半胱氨酸转移到E2催化半胱氨酸来对E2进行装载。E2又与泛素连接酶(E3)和底物蛋白质复合以将Ub C端羧基共价转移到底物蛋白质上。E1与E2之间的相互作用掩埋
Figure BDA0003415339150000031
的蛋白质表面积，其中
Figure BDA0003415339150000032
掩埋于E2的螺旋A(E2 hA)与E1泛素折叠结构域(E1 UFD)之间的界面中。E1与E2 hA之间的相互作用在E1-E2相遇复合体的形成中是重要的。本公开提供例如通过E1-E2相互作用的竞争性抑制(参见例如表1-5的E1和E2)可充当E1的直接抑制剂的模拟E2 hA的结构稳定化(例如装钉)α-螺旋肽(例如SEQ ID NO.:1-37、39、55-63或792-806的装钉形式)。在某些方面，结构稳定化(例如装钉)E2 hA肽与E1 UFD(例如SEQ ID NO:845的aa 950到1058；SEQ IDNO:846的aa 444到552；SEQ ID NO:847的aa 445到561；SEQ ID NO:848的aa 950到1052；或SEQ ID NO:849的aa 911到1012)结合。在一些情况下，结构稳定化(例如装钉)E2 hA肽在SEQ ID NO.:1-37、39、55-63或792-806中的任一个内具有1到10个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)氨基酸取代。如果甲硫氨酸存在于肽或结构稳定化肽中，那么在某些情况下，其用正亮氨酸取代。在一些情况下，结构稳定化(例如装钉)肽在N端或C端处具有1到5个缺失。这些结构稳定化变异E2 hA肽抑制E1-E2相互作用。在一些情况下，这些肽以剂量依赖性方式抑制E1介导的硫酯转移到E2。本公开还提供本文所描述的稳定化(例如，装钉)E2 hA肽的具有弹头的形式，其可以与同源E1共价结合。本公开的特征还为在依赖E1和/或表达E1的癌症(例如下文所描述的恶性血液病、实体肿瘤或其它特定癌症)和其它病理性细胞存活的疾病(例如抗体介导的移植排斥、自身免疫性病症或炎症性病症)治疗中单独或与其它治疗剂组合使用所述稳定化肽(或其具有弹头的形式)的方法。
将结构稳定化(例如，内部交联，例如，装钉)引入本文所述的E2 hA肽中的一个或多个修饰可以位于：(i)不参加与E2 hA的同源E1酶直接相互作用的E2 hA面，(ii)E2 hA的极性与非极性面的界面，和/或(iii)直接与E2 hA的同源E1酶相互作用的E2 hA面。在某些情况下，本文所描述的结构稳定化(例如内部交联，例如装钉)E2 hA肽还可以含有一个或多个(例如1、2、3、4、5个)额外氨基酸取代(相对于野生型E2 hA肽序列)，例如，一个或多个(例如，1、2、3、4、5个)保守和/或非保守氨基酸取代(即，除对E2 hA进行以赋予结构稳定化的氨基酸取代以外的一个或多个氨基酸取代)。如果甲硫氨酸存在于肽或结构稳定化肽中，那么在某些情况下，其用正亮氨酸取代。在某些情况下，这些一个或多个额外取代是与E2 hA的同源E1酶直接相互作用的氨基酸的取代。在某些情况下，这些一个或多个额外取代是不参加与E2 hA的同源E1酶直接相互作用的氨基酸的取代。在某些情况下，这些额外取代是与E2hA的同源E1酶直接相互作用的氨基酸和不参加与E2 hA的同源E1酶直接相互作用的氨基酸的取代。在某些情况下，本文所描述的结构稳定化(例如内部交联，例如装钉)E2 hA肽还可含有自E2 hA的N端和/或C端的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)缺失。举例来说，结构稳定化(例如，内部交联，例如装钉)E2 hA肽的长度可为5个或更多个(例如，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个)氨基酸。在某些情况下，结构稳定化(例如，内部交联，例如装钉)E2 hA肽的长度为5到11个氨基酸。在某些情况下，结构稳定化(例如，内部交联，例如装钉)E2 hA肽的长度为5到16个氨基酸。在某些情况下，结构稳定化(例如，内部交联，例如装钉)E2 hA肽的长度为11到16个氨基酸。
因此，本文提供一种肽，其包含具有0到10个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代的SEQ ID NO:132的序列的至少8个连续氨基酸的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述取代如果存在，且不在SEQ ID NO:132的位置5和12处。在某些实施方式中，所述肽抑制人E1-人E2相互作用。在某些实施方式中，所述肽抑制人E1介导的硫酯转移到人E2。在某些实施方式中，位置5为R-辛烯基丙氨酸，且位置12为S-戊烯基丙氨酸。本文还提供所述肽的盐。在一些情况下，所述盐是乙酸盐、硫酸盐或氯化物。
在某些实施方式中，所述肽具有1到10个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代，其中所述取代不位于SEQ ID NO:132的位置7和9，或位置7或9。在某些实施方式中，所述肽具有1到10个氨基酸取代，并且其中所述取代不位于SEQ ID NO:132的位置7、9、10、13和16中的一处或多处(例如1、2、3、4、5个)。在某些实施方式中，所述肽具有1到10个氨基酸取代，并且其中所述取代位于SEQ ID NO:132的位置7、9、10、13和16中的一处或多处，并且其中所述取代在这些位置中的一处或多处是取代为丙氨酸。在某些实施方式中，所述肽具有1到10个氨基酸取代，其中所述取代位于SEQ ID NO:132的位置1、2、3、4、6、8、11、13、14、15、16或17中的一处或多处(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个)。在一些情况下，这些位置被取代为丙氨酸。在一些情况下，SEQ ID NO:132的位置6和8或位置6或8被取代为谷氨酸。在某些实施方式中，所述肽具有1到10个氨基酸取代，其中所述取代包括SEQ ID NO:132的位置6或8中的一处或多处。在一些情况下，这些位置被取代为谷氨酸。在某些实施方式中，所述肽进一步包含可与人E1内的半胱氨酸残基形成共价键的反应性基团，任选地其中所述反应性基团为具有亲电子基团的非天然氨基酸或N端处的亲电子化学帽。反应性基团可处于SEQ ID NO:132的N-C-或内部(即，N端与C端之间的氨基酸可被具有亲电子基团的非天然氨基酸取代，或N端处的亲电子化学帽)。
在某些实施方式中，所述肽的长度为8到50、8到40、8到30、8到25、8到20、8到17、10到50、10到40、10到30、10到25、10到20、10到17、15到50、15到40、15到30、15到25、15到20、15到17、17到50、17到40、17到30、17到25、17到20或8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在某些实施方式中，所述肽或其盐内部交联。在一些情况下，包含烯烃侧链的非天然氨基酸的侧链被连接。
本文还公开一种肽或其盐，所述肽包含从N端到C端具有以下残基的序列的至少8个连续氨基酸：
Xaa1＝B、A，其中B为正亮氨酸，或不存在；
Xaa2＝S、A或不存在；
Xaa3＝T、A或不存在；
Xaa4＝P、A或不存在；
Xaa5＝装钉氨基酸
Xaa6＝R、E或A；
Xaa7＝R或A；
Xaa8＝R、E或A；
Xaa9＝L、A或可与人E1内的半胱氨酸残基形成共价键的反应性基团，任选地其中所述反应性基团为具有亲电子基团的非天然氨基酸或N端处的亲电子化学帽；
Xaa10＝B或A，其中B为正亮氨酸；
Xaa11＝R或A；
Xaa12＝装钉氨基酸；
Xaa13＝F、A、可与人E1内的半胱氨酸残基形成共价键的反应性基团，任选地其中所述反应性基团为具有亲电子基团的非天然氨基酸或N端处的亲电子化学帽，或不存在；
Xaa14＝K、R、A或不存在；
Xaa15＝R、A或不存在
Xaa16＝L、A或不存在；和
Xaa17＝Q、A或不存在，
其中所述肽抑制人E1人E2之间的相互作用。在一些情况下，所述肽抑制人E1介导的硫酯转移到人E2。
在某些实施方式中，所述肽的长度为8到50、8到40、8到30、8到25、8到20、8到17、10到50、10到40、10到30、10到25、10到20、10到17、15到50、15到40、15到30、15到25、15到20、15到17、17到50、17到40、17到30、17到25、17到20或8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在某些实施方式中，所述肽或其盐内部交联。在一些情况下，包含烯烃侧链的非天然氨基酸的侧链经连接。
在另一方面，本公开的特征为一种肽，其包含具有1到10个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸取代的SEQ ID NO.:680、727、752、841、842或844中的任一个的氨基酸序列，其中这些肽中的装钉位置(即具有含烯烃侧链的非天然氨基酸的位置)未被取代。在一些情况下，预测与E1直接相互作用的残基未被取代或被丙氨酸或保守氨基酸取代。所有其它残基都可以被取代。如果甲硫氨酸存在于肽或结构稳定化肽中，那么在某些情况下，其用正亮氨酸取代。这些肽抑制E1-E2相互作用。在一些情况下，其以剂量依赖性方式抑制E1介导的硫酯转移到E2。
本文还提供一种制造结构稳定化肽的方法。在一些情况下，所述方法包括提供如本文所述的肽并且使所述肽交联。在一些情况下，交联是通过RCM反应。在一些情况下，所述方法进一步包括将交联的肽配制为药物组合物。
本文还提供一种药物组合物，其包含本文所公开的任何肽或其盐和药学上可接受的载体。
本文还提供一种治疗有需要的人类受试者的表达E1或依赖E1的疾病的方法，所述方法包括向所述人类受试者施用治疗有效量的本文所公开的任何肽、其盐或药物组合物。在一些情况下，所述表达E1或依赖E1的疾病为癌症。在一些情况下，所述表达E1或依赖E1的疾病为恶性血液病、实体肿瘤、抗体介导的移植排斥、自身免疫性病症或炎症性病症。在一些情况下，所述人类受试者尚未对治疗所述表达E1或依赖E1的疾病的疗法起反应或已对其产生抗性。
在另一方面，本文提供一种肽，其包含：SEQ ID NO:1-33中任一个的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，其中所述A1到A11氨基酸中的一个或多个被另一氨基酸取代；其中所述经修饰氨基酸序列包括至少一个肽结构稳定化修饰；并且其中所述肽结合且抑制泛素活化酶1(UBA1)。
在某些实施方式中，所述肽结构稳定化修饰包括用非天然氨基酸取代SEQ ID NO:1-33中任一个的氨基酸A1到A11中所示的序列的至少两个氨基酸，其中所述非天然氨基酸包含烯烃侧链。
在某些实施方式中，所述肽结构稳定化修饰为烃装钉/缝合、内酰胺装钉/缝合；UV-环加成装钉/缝合；肟装钉/缝合；硫醚装钉/缝合；双击装钉/缝合；双内酰胺装钉/缝合；双芳基化装钉/缝合；或其中任何两种或更多种的组合。在某些实施方式中，所述肽结构稳定化修饰为缝合。
在某些实施方式中，所述肽结构稳定化修饰为装钉。在某些实施方式中，所述装钉位于所述氨基酸序列中的两个位置中的一处或多处，其中所述两个位置是i和i+3；i和i+4；i和i+6；或i和i+7。在某些实施方式中，所述装钉位于所述氨基酸序列中的两个位置中的一处或多处，其中所述两个位置选自由A2和A9、A5和A9、A8和A12、A9和A13、A1和A8、A4和A11，和A5和A12组成的群组。在某些实施方式中，所述装钉位于两个位置处，其中所述两个位置是A2和A9。在某些实施方式中，所述装钉包括位于所述两个位置中的每一处的氨基酸取代，其中所述每一处的氨基酸取代为非天然氨基取代，其中所述非天然氨基酸包含一个或多个烯烃侧链。
在第一方面的肽包含具有烯烃侧链的非天然氨基酸的某些实施方式中，包含烯烃侧链的所述非天然氨基酸选自由以下组成的群组：S-戊烯基丙氨酸、R-辛烯基丙氨酸；R-丙烯基丙氨酸、S-戊烯基丙氨酸；R-戊烯基丙氨酸、S-戊烯基丙氨酸；双戊烯基甘氨酸、S-戊烯基丙氨酸、R-辛烯基丙氨酸；和双戊烯基甘氨酸、S-辛烯基丙氨酸和R-辛烯基丙氨酸。
在某些实施方式中，(a)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:4的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQID NO:4的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；(b)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:6的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:6的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；(c)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:1的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；(d)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:2的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:2的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；(e)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ IDNO:3的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:3的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；(f)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:5的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；(g)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:7的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；(h)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:8的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:8的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；(i)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:9的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；(j)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ IDNO:10的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:10的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；(k)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:11的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；(l)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:12的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:12的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；(m)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:13的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；(n)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:14的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:14的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；(o)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:15的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；(p)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:16的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:16的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；(q)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:17的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；(r)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:18的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:18的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；(s)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:19的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；(t)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:20的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:20的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；(u)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:21的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；(v)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:22的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:22的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；(w)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ IDNO:23的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；(x)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:24的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:24的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；(y)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:25的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；(z)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:26的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:26的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；(aa)所述经修饰氨基酸序列包含SEQID NO:27的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:27的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；(bb)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:28的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:28的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；(cc)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:29的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；(dd)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:30的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:30的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；(ee)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:31的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；(ff)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:32的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:32的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；或(gg)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ IDNO:33的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:33的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代。
在某些实施方式中，(a)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:4的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQID NO:4的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；(b)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:6的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:6的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；(c)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ IDNO:1的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:1的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；(d)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:2的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:2的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；(e)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:3的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；(f)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:5的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；(g)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:7的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；(h)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:8的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:8的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；(i)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ IDNO:9的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；(j)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:10的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:10的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；(k)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ IDNO:11的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:11的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；(l)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:12的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:12的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；(m)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:13的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；(n)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:14的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:14的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；(o)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:15的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；(p)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:16的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:16的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；(q)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:17的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；(r)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:18的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:18的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；(s)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:19的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；(t)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:20的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:20的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；(u)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:21的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；(v)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:22的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:22的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；(w)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:23的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；(x)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:24的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:24的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；(y)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:25的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；(z)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:26的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:26的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；(aa)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:27的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；(bb)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:28的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:28的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；(cc)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:29的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；(dd)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:30的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:30的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；(ee)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:31的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；(ff)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:32的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:32的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；或(gg)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:33的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:33的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代。
在某些实施方式中，被另一氨基酸取代的氨基酸A1-A11中的一个或多个位于SEQID NO:1-33的氨基酸A1-A11的E1非相互作用面上。在某些实施方式中，SEQ ID NO:1-33的所述非相互作用面包括氨基酸A1、A2、A5、A8、A9和A12。
在某些实施方式中，SEQ ID NO:1-33中任一个的氨基酸A1-A11的所述非相互作用面上的0到6个氨基酸被选自由以下组成的群组的氨基酸取代：丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
在某些实施方式中，氨基酸A4、A6、A7和A10中的一个或多个被α-甲基化或α-乙基化天然氨基酸取代。在某些实施方式中，氨基酸A4、A6、A7和A10中的一个或多个被选自由以下组成的群组的氨基酸取代：L-丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
在某些实施方式中，氨基酸A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11中的一个或多个被α-甲基化或α-乙基化天然氨基酸取代。在某些实施方式中，氨基酸A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11中的一个或多个被选自由以下组成的群组的氨基酸取代：L-丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
在某些实施方式中，所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:4的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:6的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:1-33中任一个中所示的序列的经修饰氨基酸序列。在某些实施方式中，SEQ ID NO:1-33的一个或多个氨基酸被一个或多个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：L-丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。在某些实施方式中，将SEQ ID NO:1-33中的0到5个氨基酸从C端去除，或去除并且用1到6个来自由以下组成的群组的氨基酸替换：丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。在某些实施方式中，被另一氨基酸取代的SEQ ID NO:1-33的一个或多个氨基酸位于SEQ ID NO:1-33的氨基酸的E1非相互作用面上。在某些实施方式中，所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:4中所示的序列的经修饰氨基酸序列。在某些实施方式中，所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:6中所示的序列的经修饰氨基酸序列。
在某些实施方式中，(i)所述肽的总疏水性相对于SEQ ID NO:1-33的肽降低；(ii)所述肽的总正电荷相对于SEQ ID NO:1-33的肽降低；或(iii)(i)和(ii)的组合。
在某些实施方式中，所述肽包含SEQ ID NO:132中所示的序列。在某些实施方式中，所述肽包含SEQ ID NO:133中所示的序列。在某些实施方式中，所述肽包含SEQ ID NO:107中所示的序列。在某些实施方式中，所述肽包含SEQ ID NO:50中所示的序列。
在又一方面，本文提供一种肽，其包含：SEQ ID NO:35或36中所示的序列的经修饰氨基酸序列，其中SEQ ID NO:35或36的一个或多个氨基酸被另一氨基酸取代；其中所述经修饰氨基酸序列包括至少一个肽结构稳定化修饰；并且其中所述肽结合且抑制泛素活化酶3(UBA3)。
在某些实施方式中，所述肽结构稳定化修饰包括用非天然氨基酸取代SEQ ID NO:35或36的序列的至少两个氨基酸，其中所述非天然氨基酸包含烯烃侧链。在某些实施方式中，所述肽结构稳定化修饰为烃装钉/缝合、内酰胺装钉/缝合；UV-环加成装钉/缝合；肟装钉/缝合；硫醚装钉/缝合；双击装钉/缝合；双内酰胺装钉/缝合；双芳基化装钉/缝合；或其中任何两种或更多种的组合。在某些实施方式中，所述肽结构稳定化修饰为缝合。
在某些实施方式中，所述肽结构稳定化修饰为装钉。在某些实施方式中，所述装钉位于所述氨基酸序列中的两个位置中的一处或多处，其中所述两个位置是i和i+3；i和i+4；或i和i+7。在某些实施方式中，所述装钉包括位于所述两个位置中的每一处的氨基酸取代，其中所述每一处的氨基酸取代为非天然氨基取代，其中所述非天然氨基酸包含烯烃侧链。
在肽包含具有烯烃侧链的非天然氨基酸的某些实施方式中，包含烯烃侧链的所述非天然氨基酸选自由以下组成的群组：S-戊烯基丙氨酸、R-辛烯基丙氨酸；R-丙烯基丙氨酸、S-戊烯基丙氨酸；R-戊烯基丙氨酸、S-戊烯基丙氨酸；双戊烯基甘氨酸、S-戊烯基丙氨酸、R-辛烯基丙氨酸；和双戊烯基甘氨酸、S-辛烯基丙氨酸和R-辛烯基丙氨酸。
在某些实施方式中，(a)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:35的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由以下组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代：SEQ ID NO:35的Arg-1、Arg-2、Ser-4、Val-5、Arg-6、Asp-7、Leu-9、Leu-10、Glu-13、Ala-15和Glu-16；或(b)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ IDNO:36的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由以下组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代：SEQ ID NO:36的Lys-1、Ser-4、Ala-5、Ala-6、Arg-9、Ile-10和Asp-134。
在某些实施方式中，(a)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:35的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由以下组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代：SEQ ID NO:35的Val-3、Lys-8、Val-11、Lys-12和Val-14；或(b)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:36的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括选自由以下组成的群组的零、一或两个保守氨基酸位置：SEQ ID NO:36的Lys-2、Ala-3、Gln-7、Leu-8、Gln-11、Lys-12、Ile-14、Asn-15和Glu-16。
在某些实施方式中，被另一氨基酸取代的所述一个或多个氨基酸位于SEQ ID NO:35或36的E1非相互作用面上。在某些实施方式中，SEQ ID NO:35的所述非相互作用面包括SEQ ID NO:25的氨基酸Arg-1、Arg-2、Ser-4、Val-5、Arg-6、Asp-7、Leu-9、Leu-10、Glu-13、Ala-15和Glu-16，并且SEQ ID NO:36的所述非相互作用面包括SEQ ID NO:36的氨基酸Lys-1、Ser-4、Ala-5、Ala-6、Arg-9、Ile-10和Asp-13。
在某些实施方式中，SEQ ID NO:35或36的所述非相互作用面上的0到6个氨基酸被选自由以下组成的群组的氨基酸取代：丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
在某些实施方式中，氨基酸B7、B8、B11、B12、B15和B16中的一个或多个被α-甲基化或α-乙基化天然氨基酸取代。在某些实施方式中，氨基酸B7、B8、B11、B12、B15和B16中的一个或多个被选自由以下组成的群组的氨基酸取代：L-丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
在某些实施方式中，氨基酸B1、B2、B3、B4、B5、B6、B9、B10、B13和B14中的一个或多个被α-甲基化或α-乙基化天然氨基酸取代。在某些实施方式中，氨基酸B1、B2、B3、B4、B5、B6、B9、B10、B13和B14中的一个或多个被选自由以下组成的群组的氨基酸取代：L-丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
在某些实施方式中，将SEQ ID NO:35或36中的0到5个氨基酸从C端去除，或去除并且用1到6个来自由以下组成的群组的氨基酸替换：丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
在某些实施方式中，(i)所述肽的总疏水性相对于SEQ ID NO:35或36的肽降低；(ii)所述肽的总正电荷相对于SEQ ID NO:35或36的肽降低；或(iii)(i)和(ii)的组合。
在第三方面，本文提供一种肽，其包含：SEQ ID NO:37中所示的序列的经修饰氨基酸序列，其中SEQ ID NO:37的一个或多个氨基酸被另一氨基酸取代；其中所述经修饰氨基酸序列包括至少一个肽结构稳定化修饰；并且其中所述肽结合且抑制泛素活化酶2(UBA2)。
在某些实施方式中，所述肽结构稳定化修饰包括用非天然氨基酸取代SEQ ID NO:35或36的序列的至少两个氨基酸，其中所述非天然氨基酸包含烯烃侧链。在某些实施方式中，所述肽结构稳定化修饰为烃装钉/缝合、内酰胺装钉/缝合；UV-环加成装钉/缝合；肟装钉/缝合；硫醚装钉/缝合；双击装钉/缝合；双内酰胺装钉/缝合；双芳基化装钉/缝合；或其中任何两种或更多种的组合。在某些实施方式中，所述肽结构稳定化修饰为缝合。
在某些实施方式中，所述肽结构稳定化修饰为装钉。在某些实施方式中，所述装钉位于所述氨基酸序列中的两个位置中的一处或多处，其中所述两个位置是i和i+3；i和i+4；或i和i+7。在某些实施方式中，所述装钉包括位于所述两个位置中的每一处的氨基酸取代，其中所述每一处的氨基酸取代为非天然氨基取代，其中所述非天然氨基酸包含烯烃侧链。
在肽包含具有烯烃侧链的非天然氨基酸的某些实施方式中，包含烯烃侧链的所述非天然氨基酸选自由以下组成的群组：S-戊烯基丙氨酸、R-辛烯基丙氨酸；R-丙烯基丙氨酸、S-戊烯基丙氨酸；R-戊烯基丙氨酸、S-戊烯基丙氨酸；双戊烯基甘氨酸、S-戊烯基丙氨酸、R-辛烯基丙氨酸；和双戊烯基甘氨酸、S-辛烯基丙氨酸和R-辛烯基丙氨酸。
在某些实施方式中，所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由以下组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代：SEQ ID NO:37的Ala-1、Arg-4、Leu-5、Glu-8、Ala-11、Trp-12和Asp-15。
在某些实施方式中，所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由以下组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代：SEQ ID NO:37的Leu-2、Ser-3、Ala-6、Gln-7、Arg-9、Lys-10、Arg-13和Lys-14。
在某些实施方式中，被另一氨基酸取代的所述一个或多个氨基酸位于SEQ ID NO:37的E1非相互作用面上。在某些实施方式中，SEQ ID NO:37的所述非相互作用面包括SEQID NO:37的氨基酸Ala-1、Arg-4、Leu-5、Glu-8、Ala-11、Trp-12和Asp-15。
在某些实施方式中，SEQ ID NO:37的所述非相互作用面上的0到6个氨基酸被选自由以下组成的群组的氨基酸取代：丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
在某些实施方式中，SEQ ID NO:37的氨基酸Leu-2、Ser-3、Ala-6、Gln-7、Arg-9、Lys-10、Arg-13和Lys-14中的一个或多个被α-甲基化或α-乙基化天然氨基酸取代。在某些实施方式中，SEQ ID NO:37的氨基酸Leu-2、Ser-3、Ala-6、Gln-7、Arg-9、Lys-10、Arg-13和Lys-14中的一个或多个被选自由以下组成的群组的氨基酸取代：L-丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
在某些实施方式中，SEQ ID NO:37的氨基酸Ala-1、Arg-4、Leu-5、Glu-8、Ala-11、Trp-12和Asp-15中的一个或多个被α-甲基化或α-乙基化天然氨基酸取代。在某些实施方式中，SEQ ID NO:37的氨基酸Ala-1、Arg-4、Leu-5、Glu-8、Ala-11、Trp-12和Asp-15中的一个或多个被选自由以下组成的群组的氨基酸取代：L-丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
在某些实施方式中，将SEQ ID NO:37中的0到5个氨基酸从C端去除，或去除并且用1到6个来自由以下组成的群组的氨基酸替换：丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
在某些实施方式中，(i)所述肽的总疏水性相对于SEQ ID NO:37的肽降低；(ii)所述肽的总正电荷相对于SEQ ID NO:37的肽降低；或(iii)(i)和(ii)的组合。
在第四方面，本文提供一种肽，其包含：SEQ ID NO:38中所示的序列的经修饰氨基酸序列，其中SEQ ID NO:38的一个或多个氨基酸被另一氨基酸取代；其中所述经修饰氨基酸序列包括至少一个肽结构稳定化修饰；并且其中所述肽结合且抑制泛素活化酶6(UBA6)。
在某些实施方式中，所述肽结构稳定化修饰包括用非天然氨基酸取代SEQ ID NO:38的序列的至少两个氨基酸，其中所述非天然氨基酸包含烯烃侧链。在某些实施方式中，所述肽结构稳定化修饰为烃装钉/缝合、内酰胺装钉/缝合；UV-环加成装钉/缝合；肟装钉/缝合；硫醚装钉/缝合；双击装钉/缝合；双内酰胺装钉/缝合；双芳基化装钉/缝合；或其中任何两种或更多种的组合。在某些实施方式中，所述肽结构稳定化修饰为缝合。
在某些实施方式中，所述肽结构稳定化修饰为装钉。在某些实施方式中，所述装钉位于所述氨基酸序列中的两个位置中的一处或多处，其中所述两个位置是i和i+3；i和i+4；或i和i+7。在某些实施方式中，所述装钉包括位于所述两个位置中的每一处的氨基酸取代，其中所述每一处的氨基酸取代为非天然氨基取代，其中所述非天然氨基酸包含烯烃侧链。
在肽包含具有烯烃侧链的非天然氨基酸的某些实施方式中，包含烯烃侧链的所述非天然氨基酸选自由以下组成的群组：S-戊烯基丙氨酸、R-辛烯基丙氨酸；R-丙烯基丙氨酸、S-戊烯基丙氨酸；R-戊烯基丙氨酸、S-戊烯基丙氨酸；双戊烯基甘氨酸、S-戊烯基丙氨酸、R-辛烯基丙氨酸；和双戊烯基甘氨酸、S-辛烯基丙氨酸和R-辛烯基丙氨酸。
在某些实施方式中，所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由以下组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代：SEQ ID NO:38的Met-1、Ala-2、Ala-3、Ser-4、Leu-6、Asn-9、Leu-10、Arg-12、Leu-13、Ser-15、Arg-16和Cys-17。
在某些实施方式中，所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由以下组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代：SEQ ID NO:38的Arg-5、Glu-7、Leu-8、Val-11和Leu-14。
在某些实施方式中，被另一氨基酸取代的所述一个或多个氨基酸位于SEQ ID NO:38的E1非相互作用面上。在某些实施方式中，SEQ ID NO:38的所述非相互作用面包括SEQID NO:38的氨基酸Met-1、Ala-2、Ala-3、Ser-4、Leu-6、Asn-9、Leu-10、Arg-12、Leu-13、Ser-15、Arg-16和Cys-17。
在某些实施方式中，SEQ ID NO:38的所述非相互作用面上的0到6个氨基酸被选自由以下组成的群组的氨基酸取代：丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
在某些实施方式中，SEQ ID NO:38的氨基酸Arg-5、Glu-7、Leu-8、Val-11和Leu-14中的一个或多个被α-甲基化或α-乙基化天然氨基酸取代。在某些实施方式中，SEQ ID NO:38的氨基酸Arg-5、Glu-7、Leu-8、Val-11和Leu-14中的一个或多个被选自由以下组成的群组的氨基酸取代：L-丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
在某些实施方式中，SEQ ID NO:38的氨基酸Met-1、Ala-2、Ala-3、Ser-4、Leu-6、Asn-9、Leu-10、Arg-12、Leu-13、Ser-15、Arg-16和Cys-17中的一个或多个被α-甲基化或α-乙基化天然氨基酸取代。在某些实施方式中，SEQ ID NO:38的氨基酸Met-1、Ala-2、Ala-3、Ser-4、Leu-6、Asn-9、Leu-10、Arg-12、Leu-13、Ser-15、Arg-16和Cys-17中的一个或多个被选自由以下组成的群组的氨基酸取代：L-丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
在某些实施方式中，将SEQ ID NO:38中的0到5个氨基酸从C端去除，或去除并且用1到6个来自由以下组成的群组的氨基酸替换：丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
在某些实施方式中，(i)所述肽的总疏水性相对于SEQ ID NO:38的肽降低；(ii)所述肽的总正电荷相对于SEQ ID NO:38的肽降低；或(iii)(i)和(ii)的组合。
在第五方面，本文提供第一方面的肽的衍生物，其中所述肽的衍生物包含亲电子弹头。在某些实施方式中，所述亲电子弹头位于氨基酸位置A7、A8或A11处。在某些实施方式中，所述亲电子弹头位于所述肽的N端。在某些实施方式中，所述亲电子弹头不位于所述肽的N端。
在某些实施方式中，所述亲电子弹头为具有亲电子基团的非天然氨基酸。在某些实施方式中，所述具有亲电子基团的非天然氨基酸具有与多肽主链连接的亲电子丙烯酰胺或经取代的丙烯酰胺。在某些实施方式中，所述具有亲电子基团的非天然氨基酸选自由以下组成的群组：(S)-1-丙烯酰基吡咯烷-3-甲酰胺；1-丙烯酰哌啶-4-甲酰胺、(R)-1丙烯酰基哌啶-3-甲酰胺；(S)-1-丙烯酰基哌啶-3-甲酰胺；(S)-1-丙烯酰基吡咯烷-2-甲酰胺；(R)-1-丙烯酰基吡咯烷-2-甲酰胺；(E)-4-(二甲氨基)丁-2-烯酰胺；丙烯酰胺；氮丙啶、二氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯烷、咪唑烷、吡唑烷、噁唑烷、异噁唑烷、噻唑烷、异噻唑烷、哌啶、哌嗪、吗啉、硫代吗啉、氮杂环庚烷氮杂环丙烯(azepaneazirine)、二氮杂环丙烯、氮杂环丁二烯、吡咯、咪唑、吡唑、噁唑、异噁唑、噻唑、异噻唑、吡啶、二嗪、噁嗪、噻嗪、苯基吖庚因(苯胺)；萘、蒽、菲、吲哚、异吲哚、吲哚嗪、喹诺酮、异喹啉、喹喔啉、酞嗪、喹唑啉、嘌呤、咔唑、吲唑、苯并咪唑、氮杂吲哚、α-氰基丙烯酰胺、丙炔酰胺、反4-二甲氨基-2-丁酰胺、反4-哌啶基-2-丁酰胺、经取代的丙烯酰胺和乙烯基-磺酰胺。在某些实施方式中，所述亲电子弹头为端接溴乙酰基的二氨基丁酸或端接丙烯酰胺的二氨基丁酸。在某些实施方式中，所述亲电子弹头为半胱氨酸反应性D-六氢烟碱酸部分。在某些实施方式中，所述亲电子弹头为半胱氨酸反应性部分。
在某些实施方式中，所述衍生物包含SEQ ID NO:392、428、464、500、680、716、752和788中的任一个中所示的序列。在某些实施方式中，所述衍生物包含SEQ ID NO:680中所示的序列。在某些实施方式中，所述衍生物包含SEQ ID NO:752中所示的序列。在某些实施方式中，所述衍生物包含SEQ ID NO:393、429、465、501、681、717、753和789中任一个中所示的序列。在某些实施方式中，所述衍生物包含SEQ ID NO:367、403、439、655、727和757中的任一个中所示的序列。在某些实施方式中，所述衍生物包含SEQ ID NO:727中所示的序列。在某些实施方式中，所述衍生物包含SEQ ID NO:833-836和841-844中的任一个中所示的序列。在某些实施方式中，所述衍生物包含SEQ ID NO:841中所示的序列。在某些实施方式中，所述衍生物包含SEQ ID NO:842中所示的序列。在某些实施方式中，所述衍生物包含SEQ IDNO:844中所示的序列。
在某些实施方式中，所述衍生物与UBA1共价结合。
在第六方面，本文提供一种药物组合物，其包含第一到第四方面中的任一个的肽或第五方面的肽的衍生物，和药学上可接受的载体。
在第七方面，本文提供一种治疗有需要的人类受试者的表达E1或依赖E1的疾病的方法，所述方法包括向所述人类受试者施用治疗有效量的第一到第四方面中的任一个的肽、第五方面的肽的衍生物或第六方面的药物组合物。在某些实施方式中，所述表达E1或依赖E1的疾病为癌症。在某些实施方式中，所述表达E1或依赖E1的疾病为恶性血液病、实体肿瘤、抗体介导的移植排斥、自身免疫性病症或炎症性病症。
在第八方面，本公开的特征为一种组合物，其包含抑制泛素活化酶(E1)与泛素缀合酶(E2)之间的相互作用的手段。在一些情况下，抑制相互作用的手段为抑制E1与E2之间的相互作用的稳定化(例如，装钉、缝合)肽。在某些情况下，抑制相互作用的手段为模拟E2hA的稳定化肽(参见例如表1到6)。在一些情况下，抑制相互作用的手段为表7、8或9中的肽或其变异体。在一种情况下，抑制相互作用的手段为是基于UBE2A/UBE2B E2hA(即，SEQ IDNO:4)的装钉肽的稳定化肽。在一种情况下，抑制相互作用的手段为是SAH-UBE2A-11(SEQID NO:132)或其变异体的稳定化肽。在一种情况下，抑制相互作用的手段为包含SEQ IDNO:65、96或101中所示的序列或其变异体的稳定化肽。在一些情况下，所述组合物是药物组合物并且包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
在第九方面，本公开提供一种治疗有需要的人类受试者的表达E1或依赖E1的疾病的方法。所述方法包括向所述人类受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含抑制泛素活化酶(E1)与泛素缀合酶(E2)之间的相互作用的手段。在一些情况下，抑制相互作用的手段为抑制E1与E2之间的相互作用的稳定化(例如，装钉、缝合)肽。在某些情况下，抑制相互作用的手段为模拟E2 hA的稳定化肽(参见例如表1到6)。在一些情况下，抑制相互作用的手段为表7、8或9中的肽或其变异体。在一种情况下，抑制相互作用的手段为是基于UBE2A/UBE2B E2 hA(即，SEQ ID NO:4)的装钉肽的稳定化肽。在一种情况下，抑制相互作用的手段为是SAH-UBE2A-11(SEQ ID NO:132)或其变异体的稳定化肽。在一种情况下，抑制相互作用的手段为包含SEQ ID NO:65、96或101中所示的序列或其变异体的稳定化肽。在一些情况下，所述组合物是药物组合物并且包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。在某些情况下，表达E1或依赖E1的疾病为癌症。在某些情况下，表达E1或依赖E1的疾病为恶性血液病、实体肿瘤、抗体介导的移植排斥、自身免疫性病症、炎症性病症或病理性细胞存活的疾病。
附图说明
图1A-1C：UBA1结合装钉肽的设计。图1A说明UBA1抑制剂肽设计的结构基础。所描绘的是E2酶Ubc15与粟酒裂殖酵母(S.pombe)E1酶Ube1结合的晶体结构(PDB ID：5KNL)。Ubc15展示于带描绘中且Ube1展示于表面描绘中。虚线框指示E2的α螺旋，其形成设计抑制剂肽的基础。图1B-1C：说明沿着SEQ ID NO:40的氨基酸5-18的‘i+4’装钉路线(staplewalk)(图1B；装钉位置2-9)和‘i+7’装钉路线(图1C；装钉位置10-15)。轮描绘表示预期为α-螺旋的肽部分，其中E2螺旋A(hA)肽残基由单字母氨基酸编码和其在SEQ ID NO:40中的位置指示。
图2展示通过选择E2 hA装钉肽抑制E1介导的泛素转移到E2(1-15分别对应于SEQID NO:40-54)。顶部图区是三个独立的带移实验的定量。在底部图区中示出了一个代表性带移实验。
图3描绘了在人E2 hA的螺旋部分中的示例性装钉位置，包括装钉肽SAH-UBE2A-11(左图区)、SAH-UBE2G2-11(中图区)和SAH-UBE2D2-11(右图区)。
图4A和4B展示装钉肽SAH-Ubc15-11(SEQ ID NO:50)、SAH-UBE2G2-11(SEQ ID NO:133)、SAH-UBE2D2-11(SEQ ID NO:107)和SAH-UBE2A-11(SEQ ID NO:132)以剂量依赖性方式抑制E1介导的硫酯转移到E2，具有所指示的效力范围。图4A为定量三个独立抑制实验的图式。图4B描绘一个代表性实验。
图5展示在非还原条件下在Bis-Tris蛋白质凝胶上操作的体外硫酯转移抑制分析样品的银染色。体外硫酯转移抑制分析用广泛多样的重组人E1活化蛋白质UBA1、E2酶、泛素、Mg-ATP和SAH-UBE2A-11装钉肽(SEQ ID NO:132)或SAH-UBE2A-11-R7E突变对照装钉肽(BSTPX1RERLBRX2FKRLQ(SEQ ID NO:1338)，“X1”为S-戊烯基丙氨酸，且“X2”为R-辛烯基丙氨酸)进行。游离E2以17kDa观测；E2～泛素缀合物以约26kDa观测。在每种情况下，SAH-UBE2A-11抑制E1硫酯转移活性，其通过单一点突变(R7E)缓和，突出显示E1抑制活性的序列特异性。
图6A-6D鉴定了通过丙氨酸筛选突变诱发所测定的哪些残基对于目标结合是重要的并且促成目标结合。图6A描绘对应于SEQ ID NO:4的氨基酸1到17的氨基酸序列；SAH-UBE2A(SEQ ID NO:132)；和在SAH-UBE2A(SEQ ID NO:132)的第1(B1A)、第2(S2A)、第3(T3A)、第四(P4A)、第六(R6A)、第7(R7A)、第8(R8A)、第9(L9A)、第10(B10A)、第11(R11A)、第13(F13A)、第14(K14A)、第15(R15A)、第16(L16A)或第17(Q17A)个氨基酸处具有突变的变异SAH-UBE2A装钉肽的序列。图6A以出现顺序分别公开SEQ ID NO 1321、132和1322-1336。图6B展示在非还原条件下在Bis-Tris蛋白质凝胶上操作的体外硫酯转移抑制分析样品的银染色。体外硫酯转移抑制分析用重组人E1活化蛋白质UBA1、E2酶、泛素、Mg-ATP和SAH-UBE2A-11装钉肽突变体进行。游离E2以17kDa观测；E2～泛素缀合物以约26kDa观测。顶部图区是底部图区中的带的定量。图6C描绘基于丙氨酸突变诱发识别为对肽抑制活性尤其重要的氨基酸位置的位置。促成性氨基酸位置用黑色星形标注。图6D描绘相对于所预测的UBA1结合表面的重要氨基酸位置的位置。预测与UBA1直接相互作用的氨基酸位置在UBE2A螺旋1对接到UBA1的模型(PDB ID：6DC6)上标记且用黑色星形标注。
图7A-7D鉴定了通过电荷反转突变诱发所测定的哪些带电N端残基对于目标结合是重要的并且促成目标结合。图7A描绘对应于SEQ ID NO:4的氨基酸1到17的氨基酸序列；SAH-UBE2A-11(SEQ ID NO:132)；和在SAH-UBE2A-11(SEQ ID NO:132)的第6(R6E)、第7(R7E)或第8(R8E)个氨基酸处具有R到E取代的变异SAH-UBE2A-11装钉肽的序列。图7A以出现顺序分别公开SEQ ID NO 1321、132和1337-1339。图7B展示在非还原条件下在Bis-Tris蛋白质凝胶上操作的体外硫酯转移抑制分析样品的银染色。体外硫酯转移抑制分析用重组人E1活化蛋白质UBA1、E2酶、泛素、Mg-ATP和SAH-UBE2A-11装钉肽突变体进行。游离E2以17kDa观测；E2～泛素缀合物以约26kDa观测。顶部图区是底部图区中的带的定量。图7C描绘识别为对于肽抑制活性来说重要的阳离子氨基酸位置的位置(用黑色星形标注)。图7D描绘相对于所预测的UBA1结合表面的关键阳离子氨基酸位置的位置，如在UBE2A螺旋1对接到UBA1的模型(PDB ID：6DC6)上标记且用黑色星形标注。
图8为利用生物素标记的SAH-UBE2A和重组UBA1的抗生蛋白链菌素-生物素下拉(pull-down)实验的银染色蛋白质凝胶，其展示生物素标记的SAH-UBE2A与重组UBA1的直接结合。
图9A和图9B为描绘如通过荧光偏振分析所测量的SAH-UBE2A与重组UBA1的直接结合的图式。在不存在泛素和ATP的情况下进行图9A中所描绘的实验。在泛素和ATP存在下进行图9B中所描绘的实验。
图10为展示SAH-UBE2A剂量反应性结合E1而非E2的氢-氘交换质谱分析的图式。
图11为利用生物素标记的SAH-UBE2A和HeLa细胞溶解物的抗生蛋白链菌素-生物素下拉实验的蛋白质印迹，其描绘SAH-UBE2A与天然UBA1的直接结合。
图12为描绘通过SAH-UBE2A对细胞溶解物中的泛素路径的抑制的蛋白质印迹。在过量泛素和ATP再生溶液存在下，与SAH-UBE2A或媒剂对照物一起培育HeLa细胞质部分，且随后使其经历非还原凝胶电泳和针对泛素的蛋白质印迹。与媒剂对照物相比，SAH-UBE2A剂量依赖性地抑制多聚泛素链的形成。
图13说明预期为α螺旋的SEQ ID NO:36(左图区)和SEQ ID NO:35(右图区)的肽部分的轮状描绘图。
图14说明预期为α螺旋的SEQ ID NO:37的肽部分的轮状描绘图。
图15说明预期为α螺旋的SEQ ID NO:38的肽部分的轮状描绘图。
图16展示体外重组泛素路径重构分析的蛋白质印迹。E1：UBA1；E2：UBE2A E3：HDM2Ub：泛素；DUB：去泛素化酶USP7；且SAH-UBE2A：SEQ ID NO:132。SAH-UBE2A在与E1(UBA1)、E2(UBE2A)、E3(HDM2)、Ub和ATP共同培育时抑制p53的泛素化。当用抗p53抗体产生蛋白质印迹时，以蛋白质梯(laddering)检测p53泛素化。用预活化E2取代未活化E2和Ub避开SAH-UBE2A的抑制活性，表明SAH-UBE2A抑制针对E2活化的特异性。无关于SAH-UBE2A存在，将去泛素化酶(DUB)USP7添加到反应混合物中引起以蛋白质梯损失检测的p53的去泛素化，进一步表明SAH-UBE2A抑制E2的活化的特异性且在泛素级联中无其它步骤。
图17展示在经优化以从泛素缀合UBA1(UBA1～Ub)分辨UBA1的操作时间下在非还原条件下在Bis-Tris蛋白质凝胶上操作的体外硫酯转移抑制分析样品的银染色。SAH-UBE2A(SEQ ID NO:132)对UBA1形成共价UBA1～Ub硫酯加成物，即硫酯转移到E2前UBA1催化循环中的酶步骤的能力没有影响，如跨越SAH-UBE2A的所有浓度硫酯转移酶分析中在终点UBA1、UBA1～Ub双联体的存在所表明。
图18展示不存在或存在非离子清洁剂(0.01％Triton X-100)下在非还原条件下在Bis-Tris蛋白质凝胶上操作的体外硫酯转移抑制分析样品的银染色。将Triton X-100添加到分析缓冲液中对SAH-UBE2A(SEQ ID NO:132)的抑制活性无影响。
图19为描绘在Ni-NTA琼脂糖珠粒(顶部行)、Ni-NTA琼脂糖珠粒和His-UBE1(中间行)和Ni-NTA琼脂糖珠粒和His-p53(底部行)存在下FITC-SAH-UBE2A(与SEQ ID NO:132缀合的FITC)与重组UBA1的特异性直接结合的亮场和荧光显微图像。Ni-NTA琼脂糖珠粒用于捕获His标记的UBE1或His标记的p53作为不相关蛋白质对照组，随后与FITC-SAH-UBE2A一起培育。FITC-SAH-UBE2A仅在His-UBE1(中间行)存在下与珠粒结合，且不非特异性与珠粒(顶部行)或His-p53(底部行)结合。
图20为展示通过圆二色谱所测量的肽UBE2A(BSTPARRRLBRDFKRLQ；SEQ ID NO:1343)、SAH-UBE2A(SEQ ID NO:132)、Ubc15-1(BPSSASRQLLRKQLKEIQK；SEQ ID NO:1340)和SAH-Ubc15-11(SEQ ID NO:50)的α-螺旋性的图式。肽装钉诱导Ubc15和UBE2A肽的α-螺旋折叠，否则它们是溶液中的无规线圈。
图21为展示通过圆二色谱所测量的肽SAH-Ubc15-11(SEQ ID NO:50)、SAH-UBE2D2(SEQ ID NO:107)、SAH-UBE2G2(SEQ ID NO:133)和SAH-UBE2A(SEQ ID NO:132)的α-螺旋性的图式。肽装钉诱导α-螺旋折叠，但氨基酸序列自身决定存在或不存在E1抑制活性。
图22为展示通过圆二色谱所测量的肽SAH-UBE2A(SEQ ID NO:132)、SAH-UBE2A-R6A(SEQ ID NO:1326)、SAH-UBE2A-R7A(SEQ ID NO:1327)、SAH-UBE2A-R8A(SEQ ID NO:1328)、SAH-UBE2A-R6E(SEQ ID NO:1337)、SAH-UBE2A-R7E(SEQ ID NO:1338)和SAH-UBE2A-R8E(SEQ ID NO:1339)的α-螺旋性的图式。肽装钉诱导α-螺旋折叠，但氨基酸序列自身决定存在或不存在E1抑制活性。
图23为展示在蛋白酶K消化条件下UBE2A(SEQ ID NO:4)和SAH-UBE2A(SEQ ID NO:132)的相对蛋白酶稳定性的图式。UBE2A和SAH-UBE2A与蛋白酶K一起培育，并且通过基于液相色谱/质谱的分析随时间推移对完整肽的量进行定量。肽装钉使SAH-UBE2A的蛋白酶稳定性相比于未装钉的UBE2A增加23倍。
图24展示UBE2A(BSTPARRRLBRDFKRLQ SEQ ID NO:1343)、SAH-UBE2A(SEQ ID NO:132)、SAH-UBE2A-R7E(SEQ ID NO:1338)和SAH-UBE2A-AAA(BSTPX1RARAARX2FKRLQ；SEQ IDNO:1354)的E1介导的泛素转移到E2的抑制比较。顶部图区为展示于底部图区中的带移(band-shift)实验的定量。未装钉的UBE2A(SEQ ID NO:4)和三点突变SAH-UBE2A-AAA(BSTPX1RARAARX2FKRLQ；SEQ ID NO:1353)不显示针对UBE1酶功能的抑制活性，其通过硫酯转移分析所评估。单点突变SAH-UBE2A-R7E(SEQ ID NO:1338)相比于SAH-UBE2A具有降低的抑制活性。
图25为通过氢-氘交换质谱分析所测量的定量UBA1与UBE2A(BSTPARRRLBRDFKRLQSEQ ID NO:1343)、SAH-UBE2A(SEQ ID NO:132)、SAH-UBE2A-R7E(SEQ ID NO:1338)和SAH-UBE2A-AAA(BSTPX1RARAARX2FKRLQ；SEQ ID NO:1354)的组之间的直接相互作用的图式。
图26展示用以产生各种种类的装钉的示例性非天然氨基酸的化学结构(顶部)。中间图区说明具有各种长度的装钉的肽。底部图区说明沿肽序列的装钉路线。
图27为展示各种双重和三重装钉策略以及示例性装钉路线的表示的示意图。
图28为展示使用各种长度的分支双重装钉或“缝合”部分的示例性装钉路线的示意图。
图29为展示用于产生装钉肽衍生物的示例性化学改变的示意图。
具体实施方式
E1酶通过首先催化Ub C端的腺苷酰化并且随后在Ub C端与E1催化半胱氨酸之间形成高能硫酯键来使Ub活化。E1随后通过与E2结合并且将Ub从E1催化半胱氨酸转移到E2催化半胱氨酸来对E2进行馈入。E2又与泛素连接酶(E3)和底物蛋白质复合以将Ub C端羧基共价转移到底物蛋白质上。E1与E2之间的相互作用掩埋
Figure BDA0003415339150000271
的蛋白质表面积，其中
Figure BDA0003415339150000272
掩埋于E2的螺旋A(E2 hA)与E1泛素折叠结构域(E1 UFD)之间的界面中。因此，E1与E2 hA之间的相互作用在E1-E2相遇复合体的形成中是重要的。本公开提供例如通过E1-E2相互作用的竞争性抑制可充当E1的直接抑制剂的模拟E2 hA的结构稳定化(例如装钉)α-螺旋肽。在某些方面，结构稳定化(例如装钉)E2 hA肽与E1 UFD结合。本公开还提供本文所描述的稳定化(例如，装钉)E2 hA肽的具有弹头的形式，其可以与同源E1共价结合。在不受任何理论束缚的情况下，本文所提供的稳定化E2 hA阻止E1对E2进行装载，由此表示抑制E1的机制。本公开的特征还为在依赖E1和/或表达E1的癌症(例如本文所描述的恶性血液病、实体肿瘤或其它特定癌症)和其它病理性细胞存活的疾病(例如抗体介导的移植排斥、自身免疫性病症或炎症性病症)治疗中单独或与其它治疗剂组合使用所述稳定化肽(或其具有弹头的形式)的方法。
E1蛋白质
下文提供人UBA1的氨基酸序列(GenBank登录编号NP_695012)：
Figure BDA0003415339150000281
人UBA1的UFD由SEQ ID NO:845的氨基酸残基950到1058组成。
下文提供人UBA2的氨基酸序列(GenBank登录编号NP_005490)：
Figure BDA0003415339150000291
人UBA2的UFD由SEQ ID NO:846的氨基酸残基444到552组成。
下文提供人UBA3的氨基酸序列(GenBank登录编号NP_003959)：
Figure BDA0003415339150000292
人UBA3的UFD由SEQ ID NO:847的氨基酸残基445到561组成。
下文提供人UBA6的氨基酸序列(GenBank登录编号NP_060697)：
Figure BDA0003415339150000301
人UBA6的UFD由SEQ ID NO:848的氨基酸残基950到1052组成。
下文提供粟酒裂殖酵母UBA1的氨基酸序列(GenBank登录编号CAA22354.2)：
Figure BDA0003415339150000302
Figure BDA0003415339150000311
粟酒裂殖酵母UBA1的UFD由SEQ ID NO:849的氨基酸残基911到1012组成。
E2螺旋A肽
本公开的示范性E2 hA肽是表1-5的肽。E2 hA肽的相互作用面上的氨基酸促成E2hA肽与E1，例如UBA1、UBA6、UBA2或UBA3之间的相互作用。相比之下，E2 hA肽的非相互作用面上的氨基酸不涉及E2 hA肽与E1，例如UBA1、UBA6、UBA2或UBA3之间的直接相互作用。涉及E2 hA肽与其同源E1酶(例如SEQ ID NO:1-34：UBA1，SEQ ID NO:38：UBA6，SEQ ID NO:37：UBA2，和SEQ ID NO:35和36：UBA3)直接相互作用的残基在表1-5中呈粗体；所有其它氨基酸不涉及与其同源E1酶的直接相互作用(或预测不涉及直接相互作用)。
本公开提供结合并且抑制UBA1 E1的E2 hA肽。在某些实施方式中，E2 hA肽与UBA1E1 UFD结合。本公开的示例性UBA1结合E2 hA肽提供于表1(来自粟酒裂殖酵母)和表2(来自智人)中。用于UBA1结合肽的共同位置编号(A#)提供于下表1和表2中。评估UBA1的肽抑制的方法为所属领域中已知且描述在本文中。
表1.来自粟酒裂殖酵母的UBA1结合肽.与UBA1直接相互作用的残基呈粗体。
Figure BDA0003415339150000321
与UBA1直接相互作用，例如结合的Ubc4 E2 hA(SEQ ID NO:1)的残基是氨基酸共同位置A1、A3、A4、A7、A10和A11。举例来说，在SEQ ID NO:1的位置编号的情形下，与UBA1直接相互作用的Ubc4 E2 hA残基为：Met-1(即A1)、Leu-3(即A3)、Lys-4(即A4)、Asn-7(即A7)、Leu-10(即A10)和Ala-11(即A11)(参见Lv等人，2017,《分子细胞(Mol.Cell)》,65(4):699-714)。
不参加与UBA1直接相互作用，例如结合的Ubc4 E2 hA(即SEQ ID NO:1)的残基为：A2、A5、A6、A8、A9、A12、A13、A14、A15和A16。举例来说，在SEQ ID NO:1的位置编号的情形下，不参加与UBA1直接相互作用的Ubc4 E2 hA残基为：Ala-2(即A2)、Arg-5(即A5)、Ile-6(即A6)、Arg-8(即A8)、Glu-9(即A9)、Asp-12(即A12)、Leu-13(即A13)、Gly-14(即A14)、Lys-15(即A15)和Asp-16(即A16)。
与UBA1直接相互作用，例如结合的Ubc15 E2 hA(SEQ ID NO:2)的残基是氨基酸共同位置A-4、A-3、A-2、A-1、A3、A7、A8、A10、A11和A14。举例来说，在SEQ ID NO:2的位置编号的情形下，与UBA1直接相互作用的Ubc15 E2 hA残基为：Met-1(即A-4)、Pro-2(即A-3)、Ser-3(即A-2)、Ser-4(即A-1)、Glu-7(即A3)、Arg-11(即A7)、Lys-12(即A8)、Leu-14(即A10)、Lys-15(即A11)和Gln-18(即A14)(参见Lv等人，2017,《分子细胞》,65(4):699-714)。
不参加与UBA1直接相互作用，例如结合的Ubc15 E2 hA(即SEQ ID NO:2)的残基为：A1、A2、A4、A5、A6、A9、A12、A13、A15和A16。举例来说，在SEQ ID NO:2的位置编号的情形下，不参加与UBA1直接相互作用的Ubc4 E2 hA残基为：Ala-5(即A1)、Ser-6(即A2)、Gln-8(即A4)、Leu-9(即A5)、Leu-10(即A6)、Gln-13(即A9)、Glu-16(即A12)、Ile-17(即A13)、Lys-19(即A15)和Asn-20(即A16)。
预测与UBA1直接相互作用，例如结合的SEQ ID NO:3-20和22-34的E2 hA肽的残基是氨基酸共同位置A4、A6、A7、A10和任选A13。举例来说，在SEQ ID NO:4的位置编号的情形下，预测与UBA1直接相互作用的UBE2A E2 hA(SEQ ID NO:4)残基为：Arg-7(即A4)、Leu-9(即A6)、Met-10(即A7)、Phe-13(即A10)和任选Leu-16(即A13)。在另一实例中，在SEQ ID NO:6的位置编号的情形下，预测与UBA1直接相互作用的UBE2G2 E2 hA(SEQ ID NO:6)残基预测为：Lys-7(即A4)、Leu-9(即A6)、Met-10(即A7)、Tyr-13(即A10)和任选Leu-16(即A13)。在又一实例中，在SEQ ID NO:10的位置编号的情形下，预测与UBA1直接相互作用的UBE2D2 E2 hA(SEQ ID NO:10)残基为：Lys-4(即A4)、Ile-6(即A6)、His-7(即A7)、Leu-10(即A10)和任选Leu-13(即A13)。
预测不参加与UBA1直接相互作用，例如结合的SEQ ID NO:3-20和22-34的E2 hA肽的残基是：A1、A2、A3、A5、A8、A9、A11、A12、A14、A15、A16和A1 N端的位置。举例来说，在SEQ ID NO:4的位置编号的情形下，预测不参加与UBA1直接相互作用的UBE2A E2 hA残基为：Met-1(即A-3)、Ser-2(即A-2)、Thr-3(即A-1)、Pro-4(即A1)、Ala-5(即A2)、Arg-6(即A3)、Arg-8(即A5)、Arg-11(即A8)、Asp-12(即A9)、Lys-14(即A11)、Arg-15(即A12)、Gln-17(即A14)、Glu-18(即A15)和Asp-19(即A16)。在另一实例中，在SEQ ID NO:6的位置编号的情形下，预测不参加与UBA1直接相互作用的UBE2G2 E2 hA残基为：Met-1(即A-3)、Ala-2(即A-2)、Gly-3(即A-1)、Thr-4(即A1)、Ala-5(即A2)、Leu-6(即A3)、Arg-7(即A5)、Ala-10(即A8)、Glu-11(即A9)、Lys-13(即A11)、Gln-14(即A12)、Thr-16(即A14)、Leu-17(即A15)和Asn-18(即A16)。在又一实例中，在SEQ ID NO:10的位置编号的情形下，预测不参加与UBA1直接相互作用的UBE2D2 E2残基为：Met-1(即A1)、Ala-2(即A2)、Leu-3(即A3)、Arg-5(即A5)、Lys-8(即A8)、Glu-9(即A9)、Asn-11(即A11)、Asp-12(即A12)、Ala-14(即A14)、Arg-15(即A15)和Asp-16(即A16)。
在一种情况下，本公开的特征为具有序列BPSSASRQLLRKQLKEIQZ(SEQ ID NO:1340)的肽，其中B为正亮氨酸并且Z为生物素标记的赖氨酸(Lys(生物素))。在一些情况下，所述肽包括至少两个(例如2、3、4、5个)氨基酸取代，其中氨基酸取代为具有烯烃侧链的非天然氨基酸。在一些情况下，至少两个被取代氨基酸由2、3或6个氨基酸分隔开。这些肽抑制E1-E2相互作用。
在一种情况下，本公开的特征为具有序列BPSSASRQLLRKQLKEIQ(SEQ ID NO:1341)的肽，其中B为正亮氨酸。在一些情况下，所述肽包括至少两个(例如2、3、4、5个)氨基酸取代，其中氨基酸取代为具有烯烃侧链的非天然氨基酸。在一些情况下，至少两个被取代氨基酸由2、3或6个氨基酸分隔开。这些肽抑制E1-E2相互作用。
表2.来自智人的UBA1结合肽.预测与UBA1直接相互作用的残基呈粗体(对于SEQID NO:3-20和22-34氨基酸共同位置A4、A6、A7和A10，和任选地，A13；对于SEQ ID NO:21氨基酸共同位置A-1、A2、A3、A4、A6、A7、A8、A10、A11和A14)。
Figure BDA0003415339150000341
与UBA1直接相互作用，例如结合的UBE2T E2 hA(SEQ ID NO:21)的残基是氨基酸共同位置A-1、A2、A3、A4、A6、A7、A8、A10、A11和A14。举例来说，在SEQ ID NO:21的位置编号的情形下，与UBA1直接相互作用的UBE2T E2 hA残基为：Met-1(即A-1)、Arg-3(即A2)、Ala-4(即A3)、Ser-5(即A4)、Leu-7(即A6)、Lys-8(即A7)、Arg-9(即A8)、Leu-11(即A10)、His-12(即A11)和Ala-15(即A14)(参见Lv等人，2018,JBC,293(47):18337-18352)。
不参加与UBA1直接相互作用，例如结合的UBE2T E2 hA(即SEQ ID NO:21)的残基为：A1、A5、A9、A12、A13、A15和A16。举例来说，在SEQ ID NO:21的位置编号的情形下，不参加与UBA1直接相互作用的UBE2T E2 hA残基为：Gln-2(即A1)、Arg-6(即A5)、Glu-10(即A9)、Met-13(即A12)、Leu-14(即A13)、Tyr-16(即A15)和Glu-17(即A16)。
本公开还提供结合且抑制E1 UBA6的E2 hA肽。在某些实施方式中，E2 hA肽与UBA6E1 UFD结合。本公开的示例性UBA6结合E2 hA肽提供于表3(即，SEQ ID NO:38)。评估UBA6的肽抑制的方法为所属领域中已知且描述在本文中。
在一种情况下，本公开的特征为具有序列BSTPARRRLBRDFKRLQZ(SEQ ID NO:1342)的肽，其中B为正亮氨酸并且Z为生物素标记的赖氨酸(Lys(生物素))。在一些情况下，所述肽包括至少两个(例如2、3、4、5个)氨基酸取代，其中氨基酸取代为具有烯烃侧链的非天然氨基酸。在一些情况下，至少两个被取代氨基酸由2、3或6个氨基酸分隔开。这些肽抑制E1-E2相互作用。
在一种情况下，本公开的特征为具有序列BSTPARRRLBRDFKRLQ(SEQ ID NO:1343)的肽，其中B为正亮氨酸。在一些情况下，所述肽包括至少两个(例如2、3、4、5个)氨基酸取代，其中氨基酸取代为具有烯烃侧链的非天然氨基酸。在一些情况下，至少两个被取代氨基酸由2、3或6个氨基酸分隔开。这些肽抑制E1-E2相互作用。
表3.UBA6结合肽.预测与UBA6直接相互作用的残基呈粗体(氨基酸Arg-5、Glu-7、Leu-8、Val-11和Leu-14)。
SEQ ID NO: 基因 序列
38 USE1 MAASRLELNLVRLLSRC
在SEQ ID NO:38的位置编号的情形下，预测与UBA6直接相互作用，例如结合的USE1 E2 hA(SEQ ID NO:38)的残基为Arg-5、Glu-7、Leu-8、Val-11和Leu-14。
在SEQ ID NO:38的位置编号的情形下，预测不参加与UBA6直接相互作用，例如结合的USE1 E2 hA(SEQ ID NO:38)的残基为：Met-1、Ala-2、Ala-3、Ser-4、Leu-6、Asn-9、Leu-10、Arg-12、Leu-13、Ser-15、Arg-16和Cys-17。
本公开还提供结合且抑制E1 UBA3的E2 hA肽。在某些实施方式中，E2 hA肽与UBA3E1 UFD结合。能够与UBA3结合的本公开的示范性人E2 hA肽提供于表4中。评估UBA3的肽抑制的方法为所属领域中已知且描述在本文中。
表4.UBA3结合肽.与UBA3直接相互作用的残基呈粗体。
Figure BDA0003415339150000361
在SEQ ID NO:35的位置编号的情形下，与UBA3直接相互作用，例如结合的UBE2FE2 hA(SEQ ID NO:35)的残基为：Val-3、Lys-8、Val-11、Lys-12和Val-14(参见Huang等人，2009,《分子细胞》,33(4):483-95)。
在SEQ ID NO:35的位置编号的情形下，不参加与UBA3直接相互作用的UBE2F E2hA(SEQ ID NO:35)的残基为：Arg-1、Arg-2、Ser-4、Val-5、Arg-6、Asp-7、Leu-9、Leu-10、Glu-13、Ala-15和Glu-16。
在SEQ ID NO:36的位置编号的情形下，与UBA3直接相互作用，例如结合的UBE2ME2 hA(SEQ ID NO:36)的残基为：Lys-2、Ala-3、Gln-7、Leu-8、Gln-11、Lys-12、Ile-14、Asn-15和Glu-16(参见Huang等人，2005,《分子细胞》,17(3):341-350)。
在SEQ ID NO:36的位置编号的情形下，不参加与UBA3直接相互作用的UBE2M E2hA(SEQ ID NO:36)的残基为：Lys-1、Ser-4、Ala-5、Ala-6、Arg-9、Ile-10和Asp-13。
本公开还提供结合且抑制UBA2的E2 hA肽。在某些实施方式中，E2 hA肽与UBA2 E1UFD结合。能够结合UBA2的本公开的示范性人E2 hA肽提供于表5(即SEQ ID NO:37)。评估UBA2的肽抑制的方法为所属领域中已知且描述在本文中。
表5.UBA2结合肽.与UBA2直接相互作用的残基呈粗体(氨基酸Leu-2、Ser-3、Ala-6、Gln-7、Arg-9、Lys-10、Arg-13和Lys-14)。
SEQ ID NO: 基因 序列
37 UBE2I ALSRLAQERKAWRKD
在SEQ ID NO:37的位置编号的情形下，与UBA2直接相互作用，例如结合的UBE2IE2 hA(SEQ ID NO:37)的残基为：Leu-2、Ser-3、Ala-6、Gln-7、Arg-9、Lys-10、Arg-13和Lys-14(参见Wang等人，2010,公共科学图书馆·综合,5(12):e15805)。
在SEQ ID NO:37的位置编号的情形下，不参加与UBA2直接相互作用的UBE2I E2hA(SEQ ID NO:37)的残基为：Ala-1、Arg-4、Leu-5、Glu-8、Ala-11、Trp-12和Asp-15。
在某些实施方式中，本文还提供包含本文所述的E2 hA肽的经修饰氨基酸序列的肽。
在一些情况下，肽经修饰以将结构稳定化引入肽(例如以维持肽的α-螺旋性)。结构稳定化可以通过例如“装钉”或“缝合”肽。在一些情况下，装钉或缝合是烃装钉或缝合。将结构稳定化(例如，内部交联，例如，装钉，缝合)引入本文所述的E2 hA肽中的一个或多个修饰可以位于：(i)不参加与E2 hA的同源E1酶直接相互作用的E2 hA面，(ii)E2 hA的极性与非极性面的界面，和/或(iii)直接与E2 hA的同源E1酶相互作用的E2 hA面。
在一些情况下，E2 hA肽通过在E2 hA的极性与非极性面的界面处引入装钉或缝合(例如烃装钉或缝合)来稳定化。在一些情况下，E2 hA肽通过在直接与E2 hA的同源E1酶相互作用的E2 hA面上引入装钉或缝合来稳定化-例如装钉可“模拟”在螺旋的相互作用面的相互作用面上的疏水区。在某些情况下，本文所描述的结构稳定化(例如内部交联，例如装钉)E2 hA肽还可以含有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7个)额外氨基酸取代(相对于野生型E2 hA肽序列)，例如，一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7个)保守和/或非保守氨基酸取代(即，除对E2 hA进行以赋予结构稳定化的氨基酸取代以外的一个或多个氨基酸取代)。在某些情况下，这些一个或多个额外取代是与E2 hA的同源E1酶直接相互作用的氨基酸的取代。在某些情况下，这些一个或多个额外取代是不参加与E2 hA的同源E1酶直接相互作用的氨基酸的取代。在某些情况下，这些额外取代是与E2 hA的同源E1酶直接相互作用的氨基酸和不参加与E2 hA的同源E1酶直接相互作用的氨基酸的取代。在某些情况下，本文所描述的结构稳定化(例如内部交联，例如装钉)E2 hA肽还可含有自E2 hA的N端和/或C端的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)缺失。举例来说，结构稳定化(例如，内部交联，例如装钉)E2 hA肽的长度可以是5个或更多个(例如，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、23、27个)氨基酸。在某些情况下，结构稳定化(例如，内部交联，例如装钉)E2 hA肽的长度为5到11个氨基酸。在某些情况下，结构稳定化(例如，内部交联，例如装钉)E2 hA肽的长度为5到17个氨基酸。在某些情况下，结构稳定化(例如，内部交联，例如装钉)E2 hA肽的长度为11到17个氨基酸。在某些情况下，结构稳定化(例如，内部交联，例如装钉)E2 hA肽的长度为5到27个氨基酸。在某些情况下，结构稳定化(例如，内部交联，例如装钉)E2 hA肽的长度为11到27个氨基酸。在某些情况下，结构稳定化(例如，内部交联，例如装钉)E2 hA肽的长度为17到27个氨基酸。
在某些实施方式中，本公开的E2 hA肽可具有SEQ ID NO:1到38中的任一个中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸取代(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸经保守或非保守取代)。举例来说，在某些实施方式中，本公开的E2 hA肽包含SEQ IDNO:4中所示的序列的经修饰氨基酸序列，其中经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:4，其在SEQ ID NO:4序列中具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸取代(例如经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:4，不同之处在于SEQ ID NO:4的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸是经保守或非保守取代的氨基酸)。在另一实例中，在某些实施方式中，本公开的E2 hA肽包含SEQ ID NO:6中所示的序列的经修饰氨基酸序列，其中经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:6，其在SEQ ID NO:6序列中具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸取代(例如经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:6，不同之处在于SEQ ID NO:6的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸是经保守或非保守取代的氨基酸)。在另一实例中，在某些实施方式中，本公开的E2 hA肽包含SEQ ID NO:10中所示的序列的经修饰氨基酸序列，其中经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:10，其在SEQ ID NO:10序列中具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸取代(例如经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:10，不同之处在于SEQID NO:10的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸是经保守或非保守取代的氨基酸)。“保守氨基酸取代”意指取代用具有类似侧链的另一氨基酸残基替换一个氨基酸。所属领域中已定义具有类似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。在一些情况下，SEQ ID NO:1-38中任一个的一个到三个氨基酸是被取代的。SEQ ID NO:1-38中任一个中的氨基酸取代可以是与E2 hA的同源E1酶直接相互作用(或预测直接相互作用)或不参加与E2 hA的同源E1酶直接相互作用(或预测不参加直接相互作用)的氨基酸的取代。相比于与E2 hA的同源E1酶直接相互作用(或预测直接相互作用)的E2 hA氨基酸，不参加与E2 hA的同源E1酶直接相互作用(或预测不参加直接相互作用)的E2 hA氨基酸中准许大得多的变异性。实际上，不参加与E2 hA的同源E1酶直接相互作用(或预测不参加直接相互作用)的氨基酸中的几乎约每一个可以被取代(例如，保守或非保守氨基酸取代或用丙氨酸取代)。在某些实施方式中，与E2 hA的同源E1酶直接相互作用(或预测直接相互作用)的1、2或3个E2 hA氨基酸被另一氨基酸取代。在一些情况下，一个或多个取代是保守氨基酸取代。在其它情况下，一个或多个取代为非保守氨基酸取代。在一些情况下，在存在超过一个氨基酸取代的情况下，取代都是保守的和非保守的氨基酸取代。在一些情况下，在存在超过一个氨基酸取代的情况下，取代中的每一个为保守氨基酸取代。在一些情况下，在SEQ ID NO:1-38中任一个的一个到三个氨基酸(例如1、2或3个)被取代的情况下，取代都是不参加与E2 hA的同源E1酶直接相互作用(或预测不参加直接相互作用)的E2 hA氨基酸的取代。在一些情况下，在SEQ ID NO:1-38中任一个的一个到三个氨基酸(例如1、2或3个)被取代的情况下，取代都是与E2 hA的同源E1酶直接相互作用(或预测直接相互作用)的E2 hA氨基酸的取代。在一些情况下，在SEQ ID NO:1-38中任一个的一个到三个氨基酸(例如1、2或3个)被取代的情况下，取代为与E2 hA的同源E1酶直接相互作用(或预测直接相互作用)的E2 hA氨基酸和不参加与E2 hA的同源E1酶直接相互作用(或预测不参加直接相互作用)的E2 hA氨基酸的取代。在某些实施方式中，SEQ ID NO:132或SEQ ID NO:4的稳定化形式或其截短形式(例如其中从N端和/或C端去除1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个氨基酸)的氨基酸位置8和11中的每一个被另一氨基酸取代。在某些实施方式中，SEQ ID NO:132或SEQ ID NO:4的稳定化形式或其截短形式(例如其中从N端和/或C端去除1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个氨基酸)的氨基酸位置8和11中的每一个被谷氨酸取代。在某些实施方式中，SEQ ID NO:132或SEQ IDNO:4的稳定化形式或其截短形式(例如其中从N端和/或C端去除1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个氨基酸)的氨基酸位置4、6、11、14和15中的每一个被丙氨酸取代。在某些实施方式中，SEQ ID NO:132或SEQ ID NO:4的稳定化形式或其截短形式(例如其中从N端和/或C端去除1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个氨基酸)的氨基酸位置4、14和15中的每一个被丙氨酸取代，并且SEQ ID NO:132或SEQ ID NO:4的稳定化形式或其截短形式(例如其中从N端和/或C端去除1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个氨基酸)的氨基酸位置6、8和11中的每一个被谷氨酸取代。
在某些情况下，一个或多个被取代氨基酸选自由以下组成的群组：L-Ala、D-Ala、Aib、Sar、Ser、经取代丙氨酸或经取代甘氨酸衍生物。在某些情况下，经修饰Ubc15 E2 hA肽包含经精氨酸取代的E7残基(编号根据SEQ ID NO:2)。
在某些实施方式中，本公开的E2 hA肽可从SEQ ID NO:1-38中的任一个中所示的序列的C端去除/删除1、2、3、4或5个氨基酸。举例来说，在某些实施方式中，本公开的E2 hA肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的经修饰氨基酸序列，其中从SEQ ID NO:4的序列的C端去除/删除两个氨基酸(即E2 hA肽包含以下或由以下组成：SEQID NO:39的氨基酸序列)。在另一实例中，在某些实施方式中，本公开的E2 hA肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的经修饰氨基酸序列，其中从SEQ ID NO:6的序列的C端去除/删除五个氨基酸(即E2 hA肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:55的氨基酸序列)。在某些实施方式中，本公开的E2 hA肽可从SEQ ID NO:1-38中的任一个中所示的序列的N端去除/删除1、2、3、4或5个氨基酸。在某些实施方式中，本公开的UBA1相互作用E2 hA肽可从SEQ ID NO:1-34中的任一个中所示的序列的C端去除/删除氨基酸位置A12-A16。举例来说，在某些实施方式中，本公开的E2 hA肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的经修饰氨基酸序列，其中从SEQ ID NO:6的序列的C端去除/删除氨基酸位置A12-A16(即E2 hA肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:55的氨基酸序列)。在某些实施方式中，本公开的UBA1结合E2 hA肽可从SEQ ID NO:1-34中的任一个中所示的序列的N端去除/删除氨基酸位置A1 N端的1、2、3个或所有氨基酸位置。在某些实施方式中，本公开的E2 hA肽可从SEQ ID NO:1-38中的任一个中所示的序列的N端和C端去除/删除1、2、3、4或5个氨基酸。在某些实施方式中，本公开的UBA1结合E2 hA肽可从SEQ ID NO:1-34中的任一个中所示的序列的C端去除/删除1、2、3、4或5个氨基酸，且从序列的N端去除/删除氨基酸位置A1 N端的1、2、3个或所有氨基酸。举例来说，在某些实施例中，本公开的UBA1结合E2 hA肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的经修饰氨基酸序列，其中从SEQ ID NO:6去除/删除氨基酸A-3-A-1和A12-A16(即肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:6的氨基酸A1-A11)。在另一实例中，在某些实施方式中，本公开的UBA1结合E2 hA肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的经修饰氨基酸序列，其中从SEQ ID NO:4去除/删除氨基酸A-3-A-1和A12-A16(即肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:4的氨基酸A1-A11)。在又一实例中，在某些实施方式中，本公开的UBA1结合E2 hA肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的经修饰氨基酸序列，其中从SEQ ID NO:10去除/删除氨基酸A12-A16(即肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:10的氨基酸A1-A11)。在某些情况下，这些所去除的氨基酸可以被1到6个(例如1、2、3、4、5或6个)选自由以下组成的群组的氨基酸替换：L-Ala、D-Ala、Aib、Sar、Ser、经取代丙氨酸或经取代甘氨酸衍生物。
本公开还涵盖与SEQ ID NO:1-38中任一个至少14％(例如至少14到50％、至少14到45％、至少14到40％、至少14到35％、至少14到30％、至少14到25％、至少14到20％、至少20％到50％、至少20％到45％、至少20％到40％、至少20％到35％、至少20％到30％、至少20％到25％、至少15％、至少20％、至少27％、至少34％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％)相同的E2 hA肽。SEQ ID NO:1-38中任一个的氨基酸序列的变异可在α螺旋的直接相互作用侧和非直接相互作用侧中的一个或两个上。不参加与E2 hA的同源E1酶直接相互作用(或预测不参加直接相互作用)的E2 hA氨基酸中的几乎约每一个可以变化。与E2 hA的同源E1酶直接相互作用(或预测直接相互作用)的E2 hA氨基酸也可以变化。在具体实施方式中，E2 hA肽包含与SEQ ID NO:1-38中的任一个至少90％相同的氨基酸序列。在具体实施方式中，E2 hA肽包含与SEQ ID NO:1-38中的任一个至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列。在具体实施方式中，E2 hA肽由SEQ ID NO:1-38、99和55中的任一个的氨基酸序列组成。用于测定氨基酸序列之间的同一性百分比的方法为所属领域中已知的。举例来说，出于最优比较目的对序列进行比对(例如，可以将空位引入第一和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中以最优比对，并且出于比较目的可以忽略非同源序列)。在优选实施方式中，出于比较目的比对的参考序列的长度为参考序列长度的至少30％，优选地至少40％，更优选地至少50％，甚至更优选地至少60％，并且甚至更优选地至少70％、80％、90％或100％。随后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在所述位置是相同的。使用BLAST 2.0程序实现两个氨基酸序列之间的同一性百分比的测定。使用无空位比对且使用默认参数(Blossom 62矩阵，空位存在罚分(gap existence cost)11，每残基空位罚分(per residue gapped cost)1，且λ比0.85)进行序列比较。BLAST程序中使用的数学算法描述于Altschul等人(《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》25:3389-3402,1997)。
在一些实施方式中，本公开的特征为SEQ ID NO:1-38中任一个的变异体，其中肽变异体与E1(例如SEQ ID NO:1-34的UBA1、SEQ ID NO:38的UBA6、SEQ ID NO:37的UBA2和SEQ ID NO:35和36的UBA3)非共价结合。
在某些情况下，E2 hA肽具有下表6中所示的氨基酸序列。本公开的特征还为这些变异E2 hA肽的稳定化形式(例如，内部交联)。举例来说，由例如3或6个氨基酸分隔的这些变异体的两个(或更多个)残基被可以通过烯烃复分解(methathesis)形成交联的非天然氨基酸替换。交联位于这些变异体中不破坏E2 hA肽与其同源E1酶的结合的位置处。在一些情况下，变异E2 hA肽通过烃装钉或缝合、内酰胺装钉或缝合、UV-环加成装钉或缝合、肟装钉或缝合、硫醚装钉或缝合、双击装钉或缝合、双内酰胺装钉或缝合、双芳基化装钉或缝合或其中任何两种或更多种的组合来稳定化。
表6.示例性变异E2 hA肽
Figure BDA0003415339150000421
Figure BDA0003415339150000431
本文所述的E2 hA肽可以经优化以用于治疗用途。举例来说，如果上述E2 hA肽中的任一个引起膜破坏(细胞溶解)，那么肽可以通过降低总体肽疏水性来优化。这可以例如通过用具有较低疏水性的氨基酸(例如，丙氨酸)取代尤其疏水性残基来实现。膜破坏还可以通过减少肽的总正电荷来降低。这可以通过用不带电或酸性残基取代碱性残基来实现。在某些情况下，总体肽疏水性和肽的总正电荷均降低。
在某些实施方式中，本文所述的E2 hA肽的长度在5与35个氨基酸之间、长度在5与25个氨基酸之间、长度在5与20个氨基酸之间、长度在5与18个氨基酸之间、长度在10与35个氨基酸之间、长度在10与25个氨基酸之间、长度在10与20个氨基酸之间、长度在10与18个氨基酸之间、长度在15与26个氨基酸之间、长度在15与18个氨基酸之间或长度在10与28个氨基酸之间。在某些实施方式中，本文所述的E2 hA肽的长度为11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个氨基酸。
在某些情况下，本文所述的E2 hA肽结构稳定化。为了使这些E2 hA肽稳定化，肽可以包括两个或更多个取代来用非天然氨基酸替换例如E2 hA肽的氨基酸，使得肽可以装钉和/或缝合。
稳定化肽
肽螺旋为调节许多如细胞凋亡的重要生物过程的关键蛋白质-蛋白质相互作用的重要介体；然而，当所述螺旋从蛋白质内其情境中取出并且分离制备时，其通常呈现无规线圈构象，引起生物活性的急剧降低并且因此降低治疗潜力。本公开提供E2 hA的结构稳定化肽。本公开包括结构稳定化E2 hA肽(如上文所描述的那些肽)，其包含通过内部(分子内)交联(或装钉)接合的至少两个经修饰氨基酸，并且在某些情况下，具有反应性基团(“弹头”，如具有亲电子基团的非天然氨基酸)，所述反应性基团可与结构稳定化肽结合的目标蛋白质(例如E1)内的半胱氨酸(Cys)残基形成共价键。如本文所描述的稳定化肽包括装钉肽和缝合肽以及含有多个缝合、多个装钉或装钉与缝合的混合物的肽，或用于结构加固的其它化学策略(参见例如Balaram P.《结构生物学新观点(Cur.Opin.Struct.Biol.)》1992；2:845；Kemp DS等人，《美国化学学会志(J.Am.Chem.Soc.)》1996；118:4240；Orner BP等人，《美国化学学会志》2001；123:5382；Chin JW等人，《国际版(Int.Ed.)》2001；40:3806；Chapman RN等人，《美国化学学会志》2004；126:12252；Horne WS等人，《化学国际版(Chem.,Int.Ed.)》2008；47:2853；Madden等人，《化学通讯(剑桥)(Chem Commun(Camb))》.2009年10月7日；(37):5588-5590；Lau等人，《化学学会评论(Chem.Soc.Rev.)》,2015,44:91-102；和Gunnoo等人，《有机生物分子化学(Org.Biomol.Chem.)》,2016,14:8002-8013；其全部以全文引用的方式并入本文中)。
在某些实施方式中，本文所描述的E2 hA肽中的一种或多种可以通过肽装钉来稳定化(参见例如Walensky,《药物化学杂志(J.Med.Chem.)》,57:6275-6288(2014)，其内容以全文引用的方式并入本文中)。肽是“稳定化”的，因为其维持其天然二级结构。举例来说，装钉允许倾向于具有α-螺旋二级结构的多肽维持其天然α-螺旋构象。此二级结构增加多肽对蛋白水解裂解和热的抗性，并且还可以增加目标结合亲和力、疏水性和细胞渗透率。因此，本文所描述的装钉(交联)多肽相对于对应的未装钉(未交联)多肽具有提高的生物活性。
“肽装钉”是从一种合成方法创造的术语，所述方法中存在于多肽链中的两个含烯烃侧链(例如可交联侧链)使用环封闭复分解(RCM)反应共价接合(例如“装钉在一起”)以形成交联环(参见例如Blackwell等人，《有机化学杂志(J.Org.Chem.)》,66:5291-5302,2001；Angew等人，《化学国际版》37:3281,1994)。如本文所用，术语“肽装钉”包括接合可存在于多肽链中的两个(例如，至少一对)含双键的侧链、含三键的侧链或含双键的和含三键的侧链，使用任何数目的反应条件和/或催化剂以促进所述反应，以提供单“装钉”多肽。术语“多重装钉”多肽是指含有超过一个个别装钉，并且可以含有不同间距的两个、三个或更多个独立装钉的那些多肽。另外，如本文所用，术语“肽缝合”是指提供其中举例来说两个装钉与共同残基连接的“缝合”(例如，串联或多重装钉)多肽的单个多肽链中的多个和串联“装钉”事件。肽缝合公开于例如WO 2008/121767和WO 2010/068684中，其都以全文引用的方式并入本文中。在一些情况下，如本文所用，装钉可以保持不饱和键或可以还原。
在某些实施方式中，本文所述的肽中的一种或多种可以稳定化。在一些情况下，本公开的E2 hA肽通过烃装钉或缝合、内酰胺装钉或缝合、UV-环加成装钉或缝合、肟装钉或缝合、硫醚装钉或缝合、双击装钉或缝合、双内酰胺装钉或缝合、双芳基化装钉或缝合或其中任何两种或更多种的组合来稳定化。在一种情况下，本文所描述的肽通过烃装钉来稳定化。在一些实施方式中，装钉肽为包含以下或由以下组成的多肽的交联形式：SEQ ID NO:1-39、55-63或792-806的氨基酸序列中的任一个。在一些情况下，装钉肽为包含以下或由以下组成的多肽的烃装钉形式：SEQ ID NO:1-39、55-63或792-806的氨基酸序列中的任一个。在一些情况下，装钉肽为包含以下或由以下组成的多肽：SEQ ID NO:1-39、55-63或792-806的氨基酸序列中的任一个，不同之处在于SEQ ID NO:1-39、55-63或792-806的至少两个(例如2、3、4、5、6个)氨基酸被非天然氨基酸替换(例如S5、R8)。在一些实施方式中，装钉肽为包含以下或由以下组成的多肽：SEQ ID NO:1-38的氨基酸序列中的任一个，或其中包括1到13(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)个氨基酸取代、缺失和/或插入(例如如上文和以下实例中所描述，例如SEQ ID NO:39、55或47)。在某些情况下，装钉肽包括至少两个(例如2、3、4、5、6个)氨基酸取代，其中被取代氨基酸由两个、三个或六个氨基酸分隔开，并且其中取代的氨基酸为具有烯烃侧链的非天然氨基酸。存在许多已知的非天然(non-natural/unnatural)氨基酸，其中的任一个可以包含于本公开的肽中。非天然氨基酸的一些实例为4-羟基脯氨酸、锁链素、γ-氨基丁酸、β-氰基丙氨酸、正缬氨酸、4-(E)-丁烯基-4(R)-甲基-N-甲基-L-苏氨酸、N-甲基-L-亮氨酸、1-氨基-环丙烷甲酸、1-氨基-2-苯基-环丙烷甲酸、1-氨基-环丁烷甲酸、4-氨基-环戊烯甲酸、3-氨基-环己烷甲酸、4-哌啶基乙酸、4-氨基-1-甲基吡咯-2-甲酸、2,4-二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸、2,4-二氨基丁酸、2-氨基庚二酸、4-(氨基甲基)苯甲酸、4-氨基苯甲酸、邻-、间-和/对-经取代苯丙氨酸(例如被-C(＝O)C6H5；-CF3；-CN；-卤基；-NO2；CH3取代)、二取代苯丙氨酸、经取代酪氨酸(例如，进一步被-C＝O)C6H5；-CF3；-CN；-卤基；-NO2；CH3取代)和他汀。另外，氨基酸可以衍生化为包括羟基化、磷酸化、磺化、酰化或糖基化的氨基酸残基。
烃装钉多肽包含两个非天然氨基酸之间的一个或多个系链(键联)，所述系链显著增强多肽的α-螺旋二级结构。一般来说，系链延伸跨越一个或两个螺旋转角的长度(即，约3.4或约7个氨基酸)。因此，定位在i和i+3；i和i+4；或i和i+7处的氨基酸是化学修饰和交联的理想候选物。因此，举例来说，在肽具有序列...X1，X2，X3，X4，X5，X6，X7，X8，X9...的情况下，X1与X4之间或X1与X5之间或X1与X8之间的交联为所述肽的有用烃装钉形式，X2与X5之间或X2与X6之间或X2与X9之间等的交联也是。还考虑多个交联(例如，2、3、4或更多个)的使用。使用多个交联在肽稳定化和优化方面极有效，尤其在增加的肽长度的情况下。因此，本公开涵盖在多肽序列内并入超过一个交联以进一步稳定化序列或促进较长多肽片段的结构稳定化、蛋白水解抗性、酸稳定性、热稳定性、细胞渗透率和/或生物活性增强。关于烃装钉多肽的制造和使用的额外描述可见于例如第2012/0172285号、第2010/0286057号和第2005/0250680号美国专利公开中，其内容都以全文引用的方式并入本文中。
在某些实施方式中，当装钉在i和i+3残基时，R-丙烯基丙氨酸和S-戊烯基丙氨酸；或R-戊烯基丙氨酸和S-戊烯基丙氨酸取代那些位置处的氨基酸。在某些实施方式中，当装钉在i和i+4残基时，S-戊烯基丙氨酸取代那些位置处的氨基酸。在某些实施方式中，当装钉在i和i+7残基时，S-戊烯基丙氨酸和R-辛烯基丙氨酸取代那些位置处的氨基酸。在一些情况下，当肽经缝合时，涉及“缝合”的肽的氨基酸经以下取代：双戊烯基甘氨酸、S-戊烯基丙氨酸和R-辛烯基丙氨酸；或双戊烯基甘氨酸、S-辛烯基丙氨酸和R-辛烯基丙氨酸。
在待装钉的肽中，干扰(例如抑制或降低其效率)装钉反应的氨基酸应被不干扰(例如不抑制或不实质上降低其效率)装钉反应的氨基酸取代。举例来说，甲硫氨酸(Met，M)可干扰装钉反应；因此，在某些实施方式中，待装钉的肽中的一个或多个甲硫氨酸被例如一个或多个正亮氨酸替换。
在肽是UBA1结合E2 hA(例如SEQ ID NO:1-34或其修饰形式(例如SEQ ID NO:39、55或57)中的任一个)的某些实施方式中，在位置A2和A9、A5和A9、A8和A12、A9和A13、A1和A8、A4和A11或A5和A12处进行装钉和/或缝合。在肽是UBA1结合E2 hA(例如SEQ ID NO:1-34或其修饰形式(例如SEQ ID NO:39、55或57或其修饰形式)中的任一个)的某些实施方式中，在位置A2和A9处进行装钉和/或缝合(示范性装钉肽参见表7)。在肽是UBA1结合E2 hA(例如SEQ IDNO:1-34或其修饰形式(例如SEQ ID NO:39、55或57或其修饰形式)中的任一个)的某些实施方式中，在位置A1和A8处进行装钉和/或缝合。可以通过测试装钉路线中的不同装钉位置来改变装钉位置。
在肽包含以下或由以下组成的某些实施方式中：SEQ ID NO:35或其修饰形式，在位置Arg-6和Glu-13处进行装钉和/或缝合。在肽包含以下或由以下组成的某些实施方式中：SEQ ID NO:36或其修饰形式，在位置Ala-6和Asp-13处进行装钉和/或缝合。在肽包含以下或由以下组成的某些实施方式中：SEQ ID NO:37或其修饰形式，在位置Leu-5和Trp-12处进行装钉和/或缝合。在肽包含以下或由以下组成的某些实施方式中：SEQ ID NO:38或其修饰形式，在位置Ala-3和Leu-10处进行装钉和/或缝合。关于示范性装钉肽，参见表7和8。
表7.示范性装钉肽.SEQ ID NO:64-99和850(分别从顶部到底部)：“B”为正亮氨酸，“X1”和“X2”为可使用环封闭复分解(RCM)反应共价接合(“装钉在一起”)以形成交联环的非天然氨基酸。SEQ ID NO:100-135和851(分别从顶部到底部)：“B”是正亮氨酸，“X1”是R-辛烯基丙氨酸，并且“X2”是S-戊烯基丙氨酸。“tr”＝截短；“m”＝突变
Figure BDA0003415339150000471
Figure BDA0003415339150000481
表8.示范性装钉肽.SEQ ID NO:136-139(分别从顶部到底部)：“B”为正亮氨酸，“X1”和“X2”为可使用环封闭复分解(RCM)反应共价接合(“装钉在一起”)以形成交联环的非天然氨基酸。SEQ ID NO:140-143(分别从顶部到底部)：“B”是正亮氨酸，“X1”是R-辛烯基丙氨酸，并且“X2”是S-戊烯基丙氨酸。
Figure BDA0003415339150000482
图26顶部图区展示可用于产生各种交联化合物的非天然氨基酸的示范性化学结构。图26中间图区说明在位置i和i+3；i和i+4；和i和i+7残基之间具有烃交联的肽。图26底部图区说明沿肽序列的装钉路线。图27展示具有双重和三重装钉策略的各种肽序列，和示范性装钉路线。图28说明使用各种长度的分支缝合部分的示范性装钉路线。图29说明基于点突变和装钉扫描和N端和C端缺失、添加和/或衍生的肽变异体。
在一个方面，稳定化E2 hA肽具有式(I)，
Figure BDA0003415339150000483
其中：
每个R1和R2独立地为H或C1到C10烷基、烯基、炔基、芳烷基、环烷基烷基、杂芳基烷基或杂环基烷基；
R3为烷基、烯基、炔基；[R4-K-R4]n；其中的每一个被0到6个R5取代；
R4为烷基、烯基或炔基；
R5是卤基、烷基、OR6、N(R6)2、SR6、SOR6、SO2R6、CO2R6、R6、荧光部分或放射性同位素；
K为O、S、SO、SO2、CO、CO2、CONR6或
Figure BDA0003415339150000491
R6为H、烷基或治疗剂；
n为1到4的整数；
x为2到10的整数；
每个y独立地是0到100的整数；
z为1到10的整数(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)；
且每个Xaa独立地为氨基酸。在一些实施方式中，式(I)的N端[Xaa]y、式(I)的[Xaa]x和式(I)的C端[Xaa]y中的每一个如表9的构建体1到225中的任一个所描述。举例来说，对于包含表9的构建体7的N端[Xaa]y、[Xaa]x和C端[Xaa]y的稳定化肽，N端[Xaa]y、[Xaa]x和C端[Xaa]y可以是：(i)分别为SEQ ID NO:871、SEQ ID NO:872和SEQ ID NO:873，(ii)分别为P、SEQ ID NO:872和SEQ ID NO:873，(iii)分别为P、SEQ ID NO:872和FK或(iv)分别为SEQ ID NO:871、SEQ ID NO:872和FK。
表9.式(I)构建体1-225的N端[Xaa]y、[Xaa]x和C端[Xaa]y序列.
Figure BDA0003415339150000492
Figure BDA0003415339150000501
Figure BDA0003415339150000511
Figure BDA0003415339150000521
Figure BDA0003415339150000531
Figure BDA0003415339150000541
Figure BDA0003415339150000551
Figure BDA0003415339150000561
Figure BDA0003415339150000571
Figure BDA0003415339150000581
Figure BDA0003415339150000591
Figure BDA0003415339150000601
Figure BDA0003415339150000611
在某些情况下，以上表9中所示的序列中的甲硫氨酸(M)被正亮氨酸(B)替换。在某些情况下，上文在表9中所示的序列可具有至少一个(例如1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代或缺失。E2 hA肽可以包含本文所述的任何氨基酸序列。
系链可包含烷基、烯基或炔基部分(例如，C5、C8或C11烷基、C5、C8或C11烯基或C5、C8或C11炔基)。系栓氨基酸可以是α二取代的(例如，C1-C3或甲基)。
在一些情况下，x为2、3或6。在一些情况下，每一y独立地为0与15或3与15之间的整数。在一些情况下，R1和R2各自独立地为H或C1-C6烷基。在一些情况下，R1和R2各自独立地为C1-C3烷基。在一些情况下，R1和R2中的至少一个为甲基。举例来说，R1和R2都可为甲基。在一些情况下，R3为烷基(例如，C8烷基)且x为3。在一些情况下，R3为C11烷基且x为6。在一些情况下，R3为烯基(例如，C8烯基)且x为3。在一些情况下，x为6且R3为C11烯基。在一些情况下，R3为直链烷基、烯基或炔基。在一些情况下，R3为-CH2-CH2-CH2-CH═CH-CH2-CH2-CH2-。
在另一方面，两个α,α二取代的立构中心都呈R构型或S构型(例如，i、i+4交联)，或一个立构中心为R且另一个为S(例如，i、i+7交联)。因此，其中式I描绘为：
Figure BDA0003415339150000621
例如当x为3时，C′和C″二取代的立构中心可以都呈R构型，或其可以都呈S构型。当x为6时，C′二取代立构中心呈R构型，并且C″二取代立构中心呈S构型。R3双键可呈E或Z立体化学构型。
在一些情况下，R3为[R4-K-R4]n；且R4为直链烷基、烯基或炔基。
在一些实施方式中，本公开的特征为包含SEQ ID NO:1-38(或其修饰形式(例如SEQ ID NO:39、55或57或其修饰形式)中任一个的氨基酸序列的内部交联(“装钉”或“缝合”)肽，其中由两个、三个或六个氨基酸分隔开的两个氨基酸的侧链被内部装钉替换；三个氨基酸的侧链被内部缝合替换；四个氨基酸的侧链被两个内部装钉替换，或五个氨基酸的侧链被内部装钉和内部缝合的组合替换。在某些情况下，SEQ ID NO:1的位置Met-1、Leu-3、Lys-4、Asn-7、Leu-10和Ala-11中的一处或多处的氨基酸不被装钉或缝合替换。在某些情况下，SEQ ID NO:2的位置Met-1、Pro-2、Ser-3、Ser-4、Glu-7、Arg-11、Lys-12、Leu-14、Lys-15和Gln-18中的一处或多处的氨基酸不被装钉或缝合替换。在某些情况下，SEQ ID NO:3-20和22-34中的任一个的位置A4、A6、A7、A10和任选A13中的一处或多处的氨基酸不被装钉或缝合替换。在某些情况下，SEQ ID NO:21的位置Met-1、Arg-3、Ala-4、Ser-5、Leu-7、Lys-8、Arg-9、Leu-11、His-12和Ala-15中的一处或多处的氨基酸不被装钉或缝合替换。在某些情况下，SEQ ID NO:35的位置Val-3、Lys-8、Val-11、Lys-12和Val-14中的一处或多处的氨基酸不被装钉或缝合替换。在某些情况下，SEQ ID NO:36中任一个的位置Lys-2、Ala-3、Gln-7、Leu-8、Gln-11、Lys-12、Ile-14、Asn-15和Glu-16中的一处或多处的氨基酸不被装钉或缝合替换。在某些情况下，SEQ ID NO:37的位置Leu-2、Ser-3、Ala-6、Gln-7、Arg-9、Lys-10、Arg-13和Lys-14中的一处或多处的氨基酸不被装钉或缝合替换。在某些情况下，SEQ IDNO:38的位置Arg-5、Glu-7、Leu-8、Val-11和Leu-14中的一处或多处的氨基酸不被装钉或缝合替换。装钉/缝合肽的长度可以是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。在一具体实施方式中，装钉/缝合肽的长度为11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一具体实施方式中，装钉/缝合肽的长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个氨基酸。在一具体实施方式中，装钉/缝合肽的长度为11个氨基酸。在一具体实施方式中，装钉/缝合肽的长度为12个氨基酸。示范性E2 hA装钉肽展示于表7、8和11到15中。在一个实施方式中，E2 hA装钉肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:65、96、101和132中所示的氨基酸序列。在一个实施方式中，E2 hA装钉肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:132中所示的氨基酸序列。在一个实施例中，E2 hA装钉肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:67、97、103和133中所示的氨基酸序列。在一个实施方式中，E2 hA装钉肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:71和107中所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，装钉多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1-39、55-63、792-806中的任一个中所示的氨基酸序列，其中由2、3或6个氨基酸分隔开的至少两个氨基酸经修饰以在结构上稳定化肽(例如通过用非天然氨基酸取代所述氨基酸以准许烃装钉)。在某些实施方式中，装钉多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1-39、55-63、792-806中的任一个中所示的氨基酸序列的变异体，其中由2、3或6个氨基酸分隔开的至少两个氨基酸经修饰以在结构上稳定化肽(例如通过用非天然氨基酸取代所述氨基酸以准许烃装钉)。在某些实施方式中，装钉多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:4(或其修饰形式)中所示的氨基酸序列，其中由2、3或6个氨基酸分隔开的至少两个氨基酸经修饰以在结构上稳定化肽(例如通过用非天然氨基酸取代所述氨基酸以准许烃装钉)。在某些实施方式中，装钉多肽包含以下或由以下组成：SEQID NO:39(或其修饰形式)中所示的氨基酸序列，其中由2、3或6个氨基酸分隔开的至少两个氨基酸经修饰以在结构上稳定化肽(例如通过用非天然氨基酸取代所述氨基酸以准许烃装钉)。在某些实施方式中，装钉多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:6(或其修饰形式)中所示的氨基酸序列，其中由2、3或6个氨基酸分隔开的至少两个氨基酸经修饰以在结构上稳定化肽(例如通过用非天然氨基酸取代所述氨基酸以准许烃装钉)。在某些实施方式中，装钉多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:55(或其修饰形式)中所示的氨基酸序列，其中由2、3或6个氨基酸分隔开的至少两个氨基酸经修饰以在结构上稳定化肽(例如通过用非天然氨基酸取代所述氨基酸以准许烃装钉)。在某些实施方式中，装钉多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:10(或其修饰形式)中所示的氨基酸序列，其中由2、3或6个氨基酸分隔开的至少两个氨基酸经修饰以在结构上稳定化肽(例如通过用非天然氨基酸取代所述氨基酸以准许烃装钉)。在某些实施方式中，装钉多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:57(或其修饰形式)中所示的氨基酸序列，其中由2、3或6个氨基酸分隔开的至少两个氨基酸经修饰以在结构上稳定化肽(例如通过用非天然氨基酸取代所述氨基酸以准许烃装钉)。
虽然烃系链是常见的，但本文所述的E2 hA肽中也可以采用其它系链。举例来说，系链可包含醚、硫醚、酯、胺或酰胺或三唑部分中的一种或多种。在一些情况下，天然存在的氨基酸侧链可并入到系链中。举例来说，系链可以与官能团，如丝氨酸中的羟基、半胱氨酸中的硫醇、赖氨酸中的伯胺、天冬氨酸酯或谷氨酸酯中的酸或天冬酰胺或谷氨酰胺中的酰胺偶合。因此，有可能使用天然存在的氨基酸来产生系链而非使用通过两个非天然存在的氨基酸偶合制得的系链。还可能使用单一非天然存在的氨基酸以及天然存在的氨基酸。可使用含三唑(例如1,4三唑或1,5三唑)交联(参见例如Kawamoto等人2012《药物化学杂志(Journal of Medicinal Chemistry)》55:1137；WO 2010/060112)。另外，进行不同类型的装钉的其它方法在所属领域中是众所周知的，并且可以与本文所述的E2 hA肽一起使用(参见例如内酰胺装钉：Shepherd等人，《美国化学学会志》,127:2974-2983(2005)；UV-环加成装钉：Madden等人，《生物有机化学与医药化学快报(Bioorg.Med.Chem.Lett.)》,21:1472-1475(2011)；二硫键装钉：Jackson等人，《美国化学学会(Am.Chem.Soc.)》,113:9391-9392(1991)；肟装钉：Haney等人，《化学通讯》,47:10915-10917(2011)；硫醚装钉：Brunel和Dawson,《化学通讯》,552-2554(2005)；光可切换装钉：J.R.Kumita等人，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》,97:3803-3808(2000)；双击装钉：Lau等人，《化学科学(Chem.Sci.)》,5:1804-1809(2014)；双内酰胺装钉：J.C.Phelan等人，《美国化学学会志》,119:455-460(1997)；和双芳基化装钉：A.M.Spokoyny等人，《美国化学学会志》,135:5946-5949(2013))。
进一步设想，可以改变系链的长度。举例来说，期望对二级α-螺旋结构提供相对较高程度的约束时，可使用较短长度的系链，而在一些情况下，期望对二级α-螺旋结构提供较少约束，且因此可需要较长的系链。
另外，尽管跨越氨基酸i到i+3、i到i+4和i到i+7的系链是常见的，以便提供主要在α螺旋的单一面上的系链，但系链可以合成以跨越氨基酸数目的任何组合并且还以组合方式使用以安装多个系链。
在一些情况下，可进一步操纵本文所描述的烃系链(即，交联)。在一种情况下，烃烯基系链(例如，如使用钌催化的环封闭复分解(RCM)合成)的双键可被氧化(例如，通过环氧化、氨基羟基化或二羟基化)以提供以下化合物中的一种。
Figure BDA0003415339150000651
环氧部分或游离羟基部分中的一个可以进一步官能化。举例来说，环氧化物可以用亲核试剂处理，其提供可以例如用于连接治疗剂的额外官能团。所述衍生化可以替代地通过合成操纵多肽的氨基或羧基端或通过氨基酸侧链实现。其它试剂可以与官能化系链连接，例如有助于多肽进入细胞的试剂。
在一些情况下，α二取代氨基酸用于多肽中以提高α螺旋二级结构的稳定性。然而，α二取代氨基酸不必需，并且还设想使用单α取代基的情况(例如，在系栓氨基酸中)。
装钉多肽可以包含药物、毒素、聚乙二醇衍生物、第二多肽、碳水化合物等。在聚合物或其它试剂与装钉多肽连接的情况下，可期望组合物是实质上均相的。
聚乙二醇(PEG)分子的添加可改进多肽的药物动力学和药效学特性。举例来说，PEG化可以降低肾清除率并且可以产生更稳定的血浆浓度。PEG为水溶性聚合物且可表示为如下式与多肽连接：
XO--(CH2CH2O)n--CH2CH2--Y其中n为2到10,000并且X为H或末端修饰，例如C1-4烷基；并且Y为与多肽的胺基(包括但不限于赖氨酸的ε胺或N端)的酰胺、氨基甲酸酯或脲键。Y还可为与硫醇基(包括但不限于半胱氨酸的硫醇基)的马来酰亚胺键。所属领域的普通技术人员已知将PEG直接或间接连接到多肽的其它方法。PEG可以是线性或支化的。包含各种官能化衍生物的各种形式的PEG为可商购的。
可使用在主链中具有可降解键的PEG。举例来说，可以制备具有经历水解的酯键的PEG。具有可降解PEG键的缀合物描述于WO 99/34833；WO 99/14259和U.S.6,348,558中。
在某些实施方式中，大分子聚合物(例如PEG)通过中间连接子与本文所述的试剂连接。在某些实施方式中，连接子由通过肽键连接的1到20个氨基酸构成，其中所述氨基酸选自20种天然存在的氨基酸。这些氨基酸中的一些可以是糖基化的，如所属领域的技术人员所充分理解。在其它实施方式中，1到20个氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。在其它实施方式中，连接子由大部分空间不受阻氨基酸，如甘氨酸和丙氨酸构成。非肽连接子也是可能的。举例来说，可使用烷基连接子，如-NH(CH2)nC(O)-，其中n＝2-20。这些烷基连接子可以进一步被任何非空间阻碍基团，如低碳数烷基(例如C1-C6)低碳数酰基、卤素(例如Cl、Br)、CN、NH2、苯基等取代。第5,446,090号美国专利描述双官能PEG连接子和其在形成在PEG连接子末端中的每一个处具有肽的缀合物中的用途。
在一些实施方式中，装钉肽也可以经修饰，例如以进一步促进细胞吸收或增加体内稳定性。举例来说，酰化或PEG化肽模拟物大环促进细胞吸收、增加生物可用性、增加血液循环、改变药物动力学、降低免疫原性和/或降低所需施用频率。
在一些实施方式中，本文所公开的装钉肽具有增强的穿透细胞膜的能力(例如，相对于未装钉肽)。参见例如第WO 2017/147283号国际公开，其以全文引用的方式并入本文中。
合成本文所述的稳定化肽的方法为所属领域中已知的。尽管如此，可使用以下示例性方法。应了解，各种步骤可以替代性顺序或次序进行以便得到所要化合物。可用于合成本文中所描述的化合物的合成化学转化和保护基方法(保护和脱除保护基)在所属领域中已知并且包括例如如以下中所描述的那些：R.Larock,《全面有机转化(ComprehensiveOrganic Transformations)》,VCH出版社(1989)；T.W.Greene和P.G.M.Wuts,《有机合成中的保护基(Protective Groups in Organic Synthesis)》,第3版,John Wiley and Sons(1999)；L.Fieser和M.Fieser,《费舍尔和费舍尔的有机合成试剂(Fieser and Fieser'sReagents for Organic Synthesis)》,John Wiley and Sons(1994)；和L.Paquette编,《有机合成试剂百科全书(Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis)》,JohnWiley and Sons(1995)和其后续版本。
本发明的肽可以通过化学合成方法制造，所述化学合成方法对于普通技术人员是众所周知的。参见例如Fields等人，《合成肽：用户指南(Synthetic Peptides:A User'sGuide)》中的第3章，Grant,W.H.编，纽约州纽约Freeman公司,1992,第77页。因此，肽可以使用固相合成的自动化Merrifield技术用由t-Boc或Fmoc化学物质保护的α-NH2使用侧链保护的氨基酸，在例如Applied Biosystems肽合成器型号430A或431上合成。
本文所述的肽的一种制造方式是使用固相肽合成(SPPS)。C端氨基酸通过与连接分子的酸不稳定键与交联聚苯乙烯树脂连接。这种树脂不溶于用于合成的溶剂中，使洗掉过量试剂和副产物相对简单且快速。N端用Fmoc基团保护，所述基团在酸中稳定但可通过碱去除。用碱稳定酸不稳定基团保护任何侧链官能团。
较长肽可以通过使用天然化学接合使个别合成肽联合来制造。或者，较长合成肽可以通过众所周知的重组DNA技术合成。所述技术在具有详细方案的众所周知的标准手册中提供。为了构建编码本发明的肽的基因，反向翻译氨基酸序列以获得编码氨基酸序列的核酸序列，优选地具有对于其中待表达基因的生物体来说最优的密码子。接着，通常通过合成编码肽的寡核苷酸和必要时任何调节元件来制造合成基因。将合成基因插入适合的克隆载体中并且转染到宿主细胞中。肽随后在适合于所选择的表达系统和宿主的适合条件下表达。肽通过标准方法经纯化且表征。
肽可以例如使用可从Advanced Chemtech购得的高通量多通道组合合成器以高通量组合方式制造。肽键可以被以下替换，例如以增加肽的生理稳定性：逆转-反向键(C(O)-NH)；经还原酰胺键(NH-CH2)；硫代亚甲基键(S-CH2或CH2-S)；氧代亚甲基键(O-CH2或CH2-O)；亚乙基键(CH2-CH2)；硫代酰胺键(C(S)-NH)；反烯烃键(CH＝CH)；氟取代的反烯烃键(CF＝CH)；酮亚甲基键(C(O)-CHR)或CHR-C(O)，其中R为H或CH3；和氟-酮亚甲基键(C(O)-CFR或CFR-C(O)，其中R为H或F或CH3。
多肽可以通过以下进一步修饰：乙酰化、酰胺化、生物素化、肉桂酰化、法呢基化、荧光素化、甲酰化、肉豆蔻酰化、棕榈酰化、磷酸化(Ser、Tyr或Thr)、硬脂酰化、琥珀酰化和磺酰化。如上文所指出，肽可以与例如聚乙二醇(PEG)；烷基(例如，C1-C20直链或分支链烷基)；脂肪酸基团；和其组合缀合。含有不同长度的烯烃侧链的α,α-二取代的非天然氨基酸可通过已知方法合成(Williams等人《美国化学学会志》,113:9276,1991；Schafmeister等人《美国化学学会志》,122:5891,2000；和Bird等人，《酶学方法(Methods Enzymol.)》,446:369,2008；Bird等人《化学生物学当前方案(Current Protocols in Chemical Biology)》,2011)。对于其中使用i连接i+7装钉的肽(螺旋的两个转角稳定化)：a)使用一个S5氨基酸和一个R8；或b)使用一个S8氨基酸和一个R5氨基酸。R8使用相同途径合成，不同之处在于起始手性助剂赋予R-烷基-立体异构体。此外，使用8-碘辛烯代替5-碘戊烯。抑制剂使用MBHA树脂上的固相肽合成(SPPS)在固体支撑物上合成(参见例如WO 2010/148335)。
Fmoc保护的α-氨基酸(除烯烃氨基酸Fmoc-S5-OH、Fmoc-R8-OH、Fmoc-R8-OH、Fmoc-S8-OH和Fmoc-R5-OH以外)、六氟磷酸2-(6-氯-1-H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基铵(HCTU)和Rink Amide MBHA可购自例如Novabiochem(加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,CA))。二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、N,N-二异丙基乙胺(DIEA)、三氟乙酸(TFA)、1,2-二氯乙烷(DCE)、异硫氰酸荧光素(FITC)和哌啶可购自例如Sigma-Aldrich。烯烃氨基酸合成报告在所属领域中(Williams等人，《有机合成(Org.Synth.)》,80:31,2003)。
同样，适合于获得(例如合成)、装钉和纯化本文所公开的肽的方法在所属领域中也是已知的(参见例如Bird等人，《酶学方法》,446:369-386(2008)；Bird等人，《化学生物学当前方案》,2011；Walensky等人，《科学》,305:1466-1470(2004)；Schafmeister等人，《美国化学学会志》,122:5891-5892(2000)；2010年3月18日提交的第12/525,123号美国专利申请；和2010年5月25日发布的第7,723,468号美国专利，其各自以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施方式中，肽实质上不含未装钉肽污染物或是经分离的。纯化肽的方法包括例如在固相支撑物上合成肽。在环化后，固相支撑物可以分离并且悬浮于溶剂，如DMSO、DMSO/二氯甲烷混合物或DMSO/NMP混合物的溶液中。DMSO/二氯甲烷或DMSO/NMP混合物可包含约30％、40％、50％或60％DMSO。在一具体实施方式中，使用50％/50％DMSO/NMP溶液。溶液可以培育1、6、12或24小时的时间段，随后树脂可以例如用二氯甲烷或NMP洗涤。在一个实施方式中，树脂用NMP洗涤。可以进行振荡和将惰性气体鼓泡到溶液中。
本文还提供一种产生稳定化肽的方法，其包括：(a)装钉或缝合E2 hA肽；和(b)分离装钉或缝合的肽。
本发明的装钉(交联)多肽的特性可以例如使用下文和实例中所描述的方法来分析。
测定α-螺旋性的分析：将化合物溶解于水性溶液(例如，pH 7下的5mM磷酸钾溶液或蒸馏H2O，到25-50μM的浓度)。圆二色谱(CD)使用标准测量参数(例如温度，20℃；波长，190到260nm；步进分辨率，0.5nm；速度，20nm/秒；累积，10；反应，1秒；带宽，1nm；路径长度，0.1cm)在分光偏振计(例如Jasco J-710,Aviv)上获得。每个肽的α-螺旋含量通过平均残基椭圆度除以模型螺旋十肽的报告值计算(Yang等人，《酶学方法》130:208(1986))。
测定熔融温度(Tm)的分析：将交联的或未经修饰的模板肽溶解于蒸馏H2O或其它缓冲剂或溶剂中(例如，在50μM的最终浓度下)并且Tm通过使用标准参数(例如波长222nm；步进分辨率，0.5nm；速度，20nm/秒；累积，10；反应，1秒；带宽，1nm；温度增加速率：1℃/min；路径长度，0.1cm)在分光偏振计(例如Jasco J-710,Aviv)上测量温度范围(例如4℃到95℃)内的椭圆度变化来确定。
体外蛋白酶抗性分析：肽主链的酰胺键易于受蛋白酶水解，从而使得肽化合物容易在体内快速降解。然而，肽螺旋形成通常掩埋和/或扭曲和/或遮蔽酰胺主链，并且因此可防止或实质上延迟蛋白水解裂解。本发明的肽模拟物大环可经历体外酶蛋白水解(例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶)以评估降解速率与对应未交联或可替代地，装钉多肽相比的任何变化。举例来说，肽模拟物大环和对应未交联多肽与胰蛋白酶琼脂糖一起培育，且反应在各种时间点通过离心和随后HPLC注射淬灭以通过280nm下的紫外线吸收对残余底物定量。简单来说，肽模拟物大环和肽模拟物前体(5mcg)与胰蛋白酶琼脂糖(Pierce)(S/E～125)一起培育0、10、20、90和180分钟。反应通过高速台面离心来淬灭；通过在280nm下基于HPLC的峰检测对分离的上清液中的剩余底物进行定量。蛋白水解反应显示一级动力学和从ln[S]相对于时间的曲线确定的速率常数k。
肽模拟物大环和/或对应的未交联多肽可各自与新鲜小鼠、大鼠和/或人类血清(例如1到2mL)在37℃下一起培育例如0、1、2、4、8和24小时。不同大环浓度的样品可以通过用血清连续稀释来制备。为了测定完整化合物的水平，可使用以下程序：提取样品，例如通过将100μL的血清转移到2ml离心管，随后添加10μL的50％甲酸和500μL乙腈，并且在4+/-2℃下在14,000RPM下离心10分钟。随后，将上清液转移到新2ml管中，并且在N2<10psi，37℃下在Turbovap上蒸发。样品在100μL 50:50乙腈:水中复原且提交进行LC-MS/MS分析。用于测试离体稳定性的等效或类似程序为已知的且可用于确定血清中大环的稳定性。
体内蛋白酶抗性分析：肽装钉的关键益处为将体外蛋白酶抗性转换为显著改进的体内药物动力学。
体外结合分析：为了评估肽模拟物大环和肽模拟物前体与接受体蛋白质的结合和亲和力，可以例如使用荧光偏振分析(FPA)。FPA技术使用偏振光和荧光示踪剂测量分子定向和迁移率。当用偏振光激发时，相比于与较小分子连接的荧光示踪剂(例如溶液中游离的FITC标记的肽)，与具有高表观分子量的分子连接的荧光示踪剂(例如FITC)(例如与大蛋白质结合的FITC标记的肽)归因于其较慢的旋转速率而发射较高水平的偏振荧光。
体外酶抑制分析：为了评估E2 hA肽对E1酶的抑制，可以例如使用体外酶抑制分析。体外酶抑制分析测量E2 hA肽抑制泛素通过E1与E2的缀合的能力。简单来说，重组E1(例如UBA1)、重组E2(例如UBE2A)、泛素和Mg-ATP在E2 hA肽或媒剂对照物(例如1％DMSO)存在下在室温下在含有例如50mM NaCl、50mM HEPES pH 7.5的缓冲液中组合一段时间(例如30分钟)。对照组反应不包含E1。通过添加含SDS装载染料来淬灭反应，并且在非还原条件下，在凝胶(例如，4-12％Bis-Tris蛋白质凝胶)上分辨样品。凝胶上的蛋白质通过例如银染色观测。通过游离E2(约17kDa)到E2～泛素缀合物(约26kDa)的转化来监测泛素通过E1与E2的缀合。
稳定化E2 hA肽变异体
在一些实施方式中，内部交联肽可通过修饰(例如，通过氨基酸取代)SEQ ID NO:1-38中任一个的肽或其修饰形式(即，其变异体(例如，SEQ ID NO:39、55或57)来制造。在一些实施方式中，内部装钉替换2个氨基酸的侧链，即，每个装钉在由例如2、3或6个氨基酸分隔开的两个氨基酸之间。在一些实施方式中，内部缝合替换3个氨基酸的侧链，即，缝合是由例如3和6个氨基酸分隔开的三个氨基酸之间的一对交联。在一些实施方式中，内部装钉和/或内部缝合包括至少两个内部装钉(替换4个氨基酸的侧链，即，每个装钉在由例如3个氨基酸分隔开的两个氨基酸之间)。在一些实施方式中，内部装钉和/或内部缝合包括至少一个内部装钉与内部缝合的组合。在一些实施方式中，内部缝合替换第一氨基酸和第二和第三氨基酸的侧链，由此通过内部交联将第一氨基酸(其处于第二与第三氨基酸之间)与第二和第三氨基酸交联，其中第一和第二氨基酸由两个、三个或六个氨基酸分隔开，第一和第三氨基酸由两个、三个或六个氨基酸分隔开，并且第二和第三氨基酸为不同氨基酸。在一些实施方式中，本公开的内部交联多肽的四个氨基酸的侧链被两个不同内部装钉替换。在一些实施方式中，两个不同内部装钉中的第一个使由两个、三个或六个氨基酸分隔开的第一对氨基酸交联，并且至少两个不同内部装钉中的第二个使由两个、三个或六个氨基酸分隔开的第二对氨基酸交联。
装钉多肽包含通过内部分子内交联(或“装钉”)接合的至少两个经修饰氨基酸，其中至少两个氨基酸由2、3或6个氨基酸分隔开。本文中的稳定化肽包括装钉肽，包括具有两个装钉的肽和/或缝合肽。至少两个经修饰氨基酸可为非天然α-氨基酸(包括但不限于α,α-二取代和N-烷基化氨基酸)。存在许多已知的非天然氨基酸，其中的任一个可以包含于本发明的肽中。非天然氨基酸的一些实例为4-羟基脯氨酸、锁链素、γ-氨基丁酸、β-氰基丙氨酸、正缬氨酸、4-(E)-丁烯基-4(R)-甲基-N-甲基-L-苏氨酸、N-甲基-L-亮氨酸、1-氨基-环丙烷甲酸、1-氨基-2-苯基-环丙烷甲酸、1-氨基-环丁烷甲酸、4-氨基-环戊烯甲酸、3-氨基-环己烷甲酸、4-哌啶基乙酸、4-氨基-1-甲基吡咯-2-甲酸、2,4-二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸、2,4-二氨基丁酸、2-氨基庚二酸、4-(氨基甲基)苯甲酸、4-氨基苯甲酸、邻-、间-和/对-经取代苯丙氨酸(例如被-C(＝O)C6H5；-CF3；-CN；-卤基；-NO2；CH3取代)、二取代苯丙氨酸、经取代酪氨酸(例如，进一步被-Q＝O)C6H5；-CF3；-CN；-卤基；-NO2；CH3取代)和他汀。
在一些实施方式中，本公开的内部交联E2 hA肽变异体由SEQ ID NO:1-38中任一个的多肽制备，且具有例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸取代(例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸经保守或非保守取代)和/或具有从N端和/或C端的例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸缺失(例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸从N端和/或C端删除)。示例性E2 hA肽，包括变异体提供在表1到6中。举例来说，在某些实施例中，本公开的内部交联E2 hA肽变异体可以在SEQ ID NO:1-38中的任一个中具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸取代(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸经保守或非保守取代)。在一些情况下，SEQ ID NO:1-38中任一个的一个到三个氨基酸是被取代的。SEQ ID NO:1-38中任一个中的氨基酸取代可以是与E2 hA的同源E1酶直接相互作用(或预测直接相互作用)或不参加与E2hA的同源E1酶直接相互作用(或预测不参加直接相互作用)的氨基酸的取代。相比于与E2hA的同源E1酶直接相互作用(或预测直接相互作用)的氨基酸，不参加与E2 hA的同源E1酶直接相互作用(或预测不参加直接相互作用)的氨基酸中准许大得多的变异性。实际上，不参加与E2 hA的同源E1酶直接相互作用(或预测不参加直接相互作用)的氨基酸中的几乎约每一个(例如，非直接相互作用氨基酸(或预测不直接相互作用的氨基酸)中的5、4、3、2或1个氨基酸)可以被取代(例如，保守或非保守氨基酸取代或用丙氨酸取代)。在某些实施方式中，与E2 hA的同源E1酶直接相互作用(或预测直接相互作用)的1、2或3个氨基酸被另一氨基酸取代。在一些情况下，一个或多个取代是保守氨基酸取代。在其它情况下，一个或多个取代为非保守氨基酸取代。在一些情况下，在存在超过一个氨基酸取代的情况下，取代都是保守的和非保守的氨基酸取代。在一些情况下，在存在超过一个氨基酸取代的情况下，取代中的每一个为保守氨基酸取代。在一些情况下，在SEQ ID NO:1-38中任一个的一个到三个氨基酸(例如1、2或3个)被取代的情况下，取代都是不参加与E2 hA的同源E1酶直接相互作用(或预测不参加直接相互作用)的氨基酸的取代。在一些情况下，在SEQ ID NO:1-38中任一个的一个到三个氨基酸(例如1、2或3个)被取代的情况下，取代都是与E2 hA的同源E1酶直接相互作用(或预测直接相互作用)的氨基酸的取代。在一些情况下，在SEQ ID NO:1-38中任一个的一个到三个氨基酸(例如1、2或3个)被取代的情况下，取代为与E2 hA的同源E1酶直接相互作用(或预测直接相互作用)的氨基酸和不参加与E2 hA的同源E1酶直接相互作用(或预测不参加直接相互作用)的氨基酸的取代。在某些情况下，一个或多个被取代氨基酸选自由以下组成的群组：L-Ala、D-Ala、Aib、Sar、Ser、经取代丙氨酸或经取代甘氨酸衍生物。在某些情况下，经修饰Ubc15 E2 hA肽包含经精氨酸取代的E7残基(编号根据SEQ IDNO:2)。
在某些实施方式中，本公开的内部交联E2 hA肽变异体可以从SEQ ID NO:1-38中的任一个中所示的序列的C端去除/删除1、2、3、4或5个氨基酸。举例来说，在某些实施方式中，本公开的内部交联E2 hA肽变异体包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的经修饰氨基酸序列，其中从SEQ ID NO:4的序列的C端去除/删除两个氨基酸(例如内部交联E2 hA肽变异体包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:39的氨基酸序列)。在另一实例中，在某些实施方式中，本公开的内部交联E2 hA肽变异体包含以下或由以下组成：SEQID NO:6中所示的氨基酸序列的经修饰氨基酸序列，其中从SEQ ID NO:6的序列的C端去除/删除五个氨基酸(例如内部交联E2 hA肽变异体包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:55的氨基酸序列)。在某些实施方式中，本公开的内部交联E2 hA肽变异体可以从SEQ ID NO:1-38中的任一个中所示的序列的N端去除/删除1、2、3、4或5个氨基酸。在某些实施方式中，本公开的UBA1结合E2 hA肽可从SEQ ID NO:1-34中的任一个中所示的序列的C端去除/删除氨基酸位置A12-A16。在某些实施方式中，本公开的UBA1结合内部交联E2 hA肽变异体可从SEQ IDNO:1-34中的任一个中所示的序列的N端去除/删除氨基酸位置A1 N端的1、2、3个或所有氨基酸位置。在某些实施方式中，本公开的内部交联E2 hA肽变异体可以从SEQ ID NO:1-38中的任一个中所示的序列的N端和C端去除/删除1、2、3、4或5个氨基酸。在某些实施方式中，本公开的UBA1结合内部交联E2 hA肽变异体可从SEQ ID NO:1-34中的任一个中所示的序列的C端去除/删除1、2、3、4或5个氨基酸，且从序列的N端去除/删除氨基酸位置A1 N端的1、2、3个或所有氨基酸。在某些情况下，这些所去除的氨基酸可以被1到6个(例如1、2、3、4、5或6个)选自由以下组成的群组的氨基酸替换：L-Ala、D-Ala、Aib、Sar、Ser、经取代丙氨酸或经取代甘氨酸衍生物。
在某些情况下，内部交联E2 hA肽或变异体具有表7、8和11到15中任一个中所示的氨基酸序列。
本文所述的内部交联E2 hA肽变异体可经优化以用于治疗用途。举例来说，如果上述内部交联E2 hA肽变异体中的任一种引起膜破坏(细胞溶解)，那么肽可以通过降低总体肽疏水性来优化。这可以例如通过用具有较低疏水性的氨基酸(例如，丙氨酸)取代尤其疏水性残基来实现。膜破坏还可以通过减少肽的总正电荷来降低。这可以通过用不带电或酸性残基取代碱性残基来实现。在某些情况下，总体肽疏水性和肽的总正电荷均降低。
在某些实施方式中，本文所述的内部交联E2 hA肽变异体的长度在5与35个氨基酸之间、长度在5与25个氨基酸之间、长度在5与20个氨基酸之间、长度在5与18个氨基酸之间、长度在10与35个氨基酸之间、长度在10与25个氨基酸之间、长度在10与20个氨基酸之间、长度在10与18个氨基酸之间、长度在15与26个氨基酸之间或长度在15与18个氨基酸之间。在某些实施方式中，本文所述的内部交联E2 hA肽变异体长度为11、12、13、14、15、16、17、18或19个氨基酸。
在某些实施方式中，装钉E2 hA肽变异体包含以下或由以下组成：表7、8和11-15中的任一个中所示的氨基酸序列。这些肽的结构稳定化的非限制性实例可通过在这些序列中由2、3或6个氨基酸分隔开的位置处引入非天然氨基酸的烃装钉实现。
具有弹头的稳定化E2 hA肽变异体
本公开的特征为稳定化UBA1结合E2 hA肽，其包含弹头-即，反应性基团，如具有亲电子基团的非天然氨基酸。重要地，这些含有弹头的肽允许相关E2 hA肽的氨基酸序列中的显著变异性(比在不存在弹头的情况下大得多)，因为UBA1结合E2 hA肽与E1之间的非共价相互作用通过亲电体与UBA1的位置Cys-1039(即SEQ ID NO:845的位置1039)处的半胱氨酸之间的共价键巩固。因此，即使在SEQ ID NO:1-34中的任一个中存在取代和/或缺失，包括与E2 hA的同源E1酶直接相互作用(或预测直接相互作用)的氨基酸(例如，对于SEQ ID NO:3-20和22-34位置A4、A5、A7和A10)的取代，这些具有弹头的肽也可能在结合UBA1方面有效。此外，在存在弹头的情况下，E2 hA肽(例如表1、2、6和7的序列中的任一个)的大小可在长度上减小(例如减小到14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个氨基酸)。
亲电体不仅可在非天然氨基酸的情形下安装，还可作为稳定化(例如，交联)E2 hA肽的N端或C端的化学帽安装。在一些情况下，亲电体可安装在稳定化肽内。所述具有弹头的稳定化肽能够与其所相互作用的蛋白质中的至少一些形成共价键。举例来说，所述具有弹头的E2 hA肽可以共价修饰UBA1(例如通过与UBA1的Cys1039共价结合和与UBA1非共价相互作用。
弹头可在多肽序列N端、C端或内部。在某些实施方式中，弹头处于位置A7处。在某些实施例中，弹头处于位置A8处。在某些实施方式中，弹头处于位置A11处。在一些情况下，弹头为非天然含亲电体氨基酸。在某些实施方式中，弹头选自由以下组成的群组：端接溴乙酰基的二氨基丁酸、端接丙烯酰胺的二氨基丁酸；端接丙烯酰胺的3S-1-吡咯烷-3-甲酸；端接丙烯酰胺的D-高脯氨酸；端接丙烯酰胺的L-高脯氨酸；端接丙烯酰胺的异哌啶甲酸；端接丙烯酰胺的D-六氢烟碱酸；端接丙烯酰胺的L-六氢烟碱酸；端接丙烯酰胺的D-脯氨酸；端接丙烯酰胺的L-脯氨酸；反-4-二甲基氨基巴豆酸；和丙烯酸。在某些实施例中，弹头为端接溴乙酰基的二氨基丁酸。在某些实施方式中，弹头为端接丙烯酰胺的二氨基丁酸。
在一些实施方式中，亲电子弹头为半胱氨酸反应性D-六氢烟碱酸部分。在其它实施方式中，亲电子弹头为半胱氨酸反应性部分。
在某些实施方式中，弹头为具有亲电子基团的非天然氨基酸，所述亲电子基团选自由以下组成的群组：(S)-1-丙烯酰基吡咯烷-3-甲酰胺；1-丙烯酰哌啶-4-甲酰胺、(R)-1丙烯酰基哌啶-3-甲酰胺；(S)-1-丙烯酰基哌啶-3-甲酰胺；(S)-1-丙烯酰基吡咯烷-2-甲酰胺；(R)-1-丙烯酰基吡咯烷-2-甲酰胺；(E)-4-(二甲氨基)丁-2-烯酰胺；和丙烯酰胺。在其它实施例中，弹头不是氨基酸。举例来说，亲电子部分和肽通过含氮杂环连接，所述含氮杂环饱和(氮丙啶、二氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯烷、咪唑烷、吡唑烷、噁唑烷、异噁唑烷、噻唑烷、异噻唑烷、哌啶、哌嗪、吗啉、硫代吗啉、氮杂环庚烷)或非饱和(氮杂环丙烯、二氮杂环丙烯、氮杂环丁二烯、吡咯、咪唑、吡唑、噁唑、异噁唑、噻唑、异噻唑、吡啶、二嗪、噁嗪、噻嗪、吖庚因)。肽和亲电体还可以通过经取代的氨基官能化环(例如N-芳基丙烯酰胺)，如苯基(苯胺)，或通过更复杂的双环或多环，例如萘、蒽、菲、吲哚、异吲哚、吲哚嗪、喹诺酮、异喹啉、喹喔啉、酞嗪、喹唑啉、嘌呤、咔唑、吲唑、苯并咪唑、氮杂吲哚连接。在一些实施例中，亲电子弹头为丙烯酰胺，或更一般定义为α,β-不饱和羰基，如α-氰基丙烯酰胺、丙炔酰胺、反4-二甲氨基-2-丁酰胺或反4-哌啶基-2-丁酰胺，或任何其它经取代的丙烯酰胺，或N-官能化乙烯基磺酰基、α-氟乙酰基、α-氯乙酰基、α-溴乙酰基和α-碘乙酰基或其它亲电子部分。亲电体不仅可在非天然氨基酸的情形下安装，还可作为交联(例如，装钉、缝合)多肽的N端或C端的化学帽安装。
在一个方面，结合UBA1的具有弹头的E2 hA包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1-34中任一个中所示的氨基酸序列，或上文中或实例中所述的其修饰形式(例如SEQ ID NO:39、55或57)，并且经修饰以包含弹头。在另一方面，结合UBA1的具有弹头的E2 hA肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1-34中任一个中所示的氨基酸序列，或其修饰形式(例如SEQID NO:39、55或57)，并且经修饰以包含弹头。在另一方面，结合UBA1的具有弹头的E2 hA肽包含以下或由以下组成：含有SEQ ID NO:1-34中任一个中所示的序列的5个或更多个(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14个)氨基酸的氨基酸序列，并且经修饰以包含弹头。在另一方面，结合UBA1的具有弹头的E2 hA肽包含以下或由以下组成：在SEQ ID NO:1-34中任一个中所示的序列的C端或N端处含有1到8个缺失(例如1、2、3、4、5、6、7或8个)的氨基酸序列，并且经修饰以包含弹头。在另一方面，结合UBA1的具有弹头的E2 hA肽包含以下或由以下组成：表1、2、6和7中任一个中所示的氨基酸序列，经修饰以包含弹头。在一些情况下，亲电子弹头在肽的N端。在其它情况下，亲电子弹头在肽内，例如位于位置A7、A8或A11处。
在一个实施方式中，结合UBA1的具有弹头的E2 hA肽具有选自以下表10中所示的序列的序列。
表10.示例性具有弹头的肽.SEQ ID NO:144-251和827-829(分别从顶部到底部)：“J”为非天然含亲电体氨基酸，或在不是氨基酸的部分的情形下提供的亲电子弹头(亲电体可充当化学帽)。SEQ ID NO:252-359和830-832(分别从顶部到底部)：“J”为端接丙烯酰胺的二氨基丁酸或端接溴乙酰基的二氨基丁酸。“tr”＝截短；“m”＝突变
Figure BDA0003415339150000751
Figure BDA0003415339150000761
Figure BDA0003415339150000771
Figure BDA0003415339150000781
在某些情况下，以上具有弹头的序列可通过所属领域中已知或本文中所描述的任何方法在结构上稳定化。举例来说，由2、3或6个氨基酸分隔开的序列的至少两个氨基酸(例如2、3、4、5个)可以由非天然氨基酸替换，所述非天然氨基酸可以形成装钉和/或缝合。
在一些实施方式中，装钉具有弹头的多肽包含以下或由以下组成：选自表11的氨基酸序列。
表11.示例性具有弹头的装钉肽。SEQ ID NO:360-503和833-836(分别从顶部到底部)：“B”是正亮氨酸；“X1”和“X2”为可使用环封闭复分解(RCM)反应共价接合(“装钉在一起”)以形成交联环的非天然氨基酸；“J”为非天然含亲电体氨基酸，或在不是氨基酸的部分的情形下提供的亲电子弹头(亲电体可充当化学帽)。SEQ ID NO:504-647和837-840(分别从顶部到底部)：“B”是正亮氨酸；“X1”是R-辛烯基丙氨酸，“X2”是S-戊烯基丙氨酸，且“J”为非天然含亲电体氨基酸，或在不是氨基酸的部分的情形下提供的亲电子弹头(亲电体可充当化学帽)。SEQ ID NO:648-791和841-844(分别从顶部到底部)：“B”是正亮氨酸；“X1”是R-辛烯基丙氨酸，“X2”是S-戊烯基丙氨酸，且“J”为端接丙烯酰胺的二氨基丁酸或端接溴乙酰基的二氨基丁酸。“tr”＝截短；“m”＝突变
Figure BDA0003415339150000791
Figure BDA0003415339150000801
Figure BDA0003415339150000811
Figure BDA0003415339150000821
Figure BDA0003415339150000831
Figure BDA0003415339150000841
Figure BDA0003415339150000851
Figure BDA0003415339150000861
在一些实施方式中，具有弹头的装钉肽包含以下或由以下组成：以上表11中列出的氨基酸序列，其中不参加与E2 hA的同源E1酶直接相互作用的多个(例如1、2、3、4、5、6个)残基被选自由以下组成的群组的残基替换：Ala(丙氨酸)、D-Ala(D-丙氨酸)、Aib(α-氨基异丁酸)、Sar(N-甲基甘氨酸)和Ser(丝氨酸)、其它经取代丙氨酸和甘氨酸衍生物。另外，这些残基中的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6个)可以附接到肽的C端。在一些情况下，表11的上述肽的C端处的0到5个氨基酸被一个或多个选自由以下组成的群组的残基替换：Ala(丙氨酸)、D-Ala(D-丙氨酸)、Aib(α-氨基异丁酸)、Sar(N-甲基甘氨酸)和Ser(丝氨酸)、其它经取代丙氨酸和甘氨酸衍生物。
在一些实施方式中，本公开的特征为一种具有弹头的E2 hA装钉肽，其与表10或11中所示的氨基酸序列至少14％、至少15％、至少20％、至少27％、至少34％、至少40％、至少47％、至少50％、至少53％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，并且其中经修饰的肽共价结合UBA1。在一些实施方式中，这些经修饰的肽在氨基酸变异之前相对于装钉E2 hA肽具有降低的疏水性和/或总正电荷。在一些实施方式中，独立地增强疏水性或正电荷以优化细胞渗透率。
在某些实施方式中，本公开的特征为一种具有弹头的E2 hA装钉肽，其相对于表10或11中所示的氨基酸序列具有1到10个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸取代，并且其中经修饰的肽共价结合UBA1。在一些实施方式中，这些经修饰的肽在氨基酸取代之前相对于装钉E2 hA肽具有降低的疏水性和/或总正电荷。在一些实施方式中，独立地增强疏水性或正电荷以优化细胞渗透率。
示例性稳定化E2 hA肽变异体和具有弹头的稳定化E2 hA肽变异体
在一具体实施方式中，稳定化肽是基于具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失的SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一具体实施方式中，稳定化肽是基于具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失的SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在一具体实施方式中，稳定化肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失的BSTPX1RRRLBRX2FKRLQ的氨基酸序列，其中“B”为正亮氨酸，其中“X1”为S-戊烯基丙氨酸，并且其中“X2”为R-辛烯基丙氨酸(SEQ ID NO:132)。在一特定实施方式中，装钉肽进一步包括在以上部分“E2 hA肽”和“稳定化肽”中描述的修饰中的一种或多种。在另一实施方式中，稳定化肽由SEQ ID NO:132的氨基酸序列组成。在某些实施方式中，被另一氨基酸取代的SEQ ID NO:132的零到六个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸位于SEQ ID NO:132的螺旋的E1非相互作用面上。在一些实施方式中，将SEQ ID NO:132中的0到3个氨基酸从C端去除，或去除并且用1到6个来自由以下组成的群组的氨基酸替换：丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。在一些实施方式中，SEQ ID NO:132中的非相互作用面上的0到6个氨基酸被选自由以下组成的群组的氨基酸取代：丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。在一些实施方式中，SEQ ID NO:132的以下氨基酸Arg-7(即A4)，Leu-9(即A6)，正亮氨酸-10(即A7)，Phe-13(即A10)和任选Leu-16(即A13)中的一个或多个被α-甲基化或α-乙基化天然氨基酸取代。在一些实施方式中，SEQ ID NO:132的以下氨基酸Arg-7(即A4)，Leu-9(即A6)，正亮氨酸-10(即A7)，Phe-13(即A10)和任选Leu-16(即A13)中的一个或多个被选自由以下组成的群组的氨基酸取代：L-丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。在一些实施方式中，SEQ ID NO:132的以下氨基酸正亮氨酸-1(即A-3)，Ser-2(即A-2)，Thr-3(即A-1)，Pro-4(即A1)，Ala-5(即A2)，Arg-6(即A3)，Arg-8(即A5)，Arg-11(即A8)，Asp-12(即A9)，Lys-14(即A11)，Arg-15(即A12)和Gln-17(即A14)中的一个或多个被α-甲基化或α-乙基化天然氨基酸取代。在某些实施方式中，SEQ ID NO:132的以下氨基酸正亮氨酸-1(即A-3)，Ser-2(即A-2)，Thr-3(即A-1)，Pro-4(即A1)，Ala-5(即A2)，Arg-6(即A3)，Arg-8(即A5)，Arg-11(即A8)，Asp-12(即A9)，Lys-14(即A11)，Arg-15(即A12)和Gln-17(即A14)中的一个或多个被选自由以下组成的群组的氨基酸取代：L-丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。在某些情况下，被另一氨基酸取代的SEQ ID NO:132的一个到六个氨基酸位于SEQ ID NO:132的螺旋的E1相互作用面上。在其它情况下，被另一氨基酸取代的SEQ IDNO:132的一个到六个氨基酸位于SEQ ID NO:132的螺旋的E1非相互作用和相互作用面上。在某些实施方式中，SEQ ID NO:132的一个到六个氨基酸被一个或多个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：L-丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
在一具体实施方式中，稳定化肽是基于具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失的SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一具体实施方式中，稳定化肽是基于具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失的SEQ ID NO:55的氨基酸序列。在一具体实施方式中，稳定化肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失的BAGTX1LKRLBAX2YK的氨基酸序列，其中“B”为正亮氨酸，其中“X1”为S-戊烯基丙氨酸，并且其中“X2”为R-辛烯基丙氨酸(SEQ ID NO:133)。在一特定实施方式中，装钉肽进一步包括在以上部分“E2 hA肽”和“稳定化肽”中描述的修饰中的一种或多种。在另一实施方式中，稳定化肽由SEQ ID NO:133的氨基酸序列组成。在某些实施例中，被另一氨基酸取代的SEQ ID NO:133的零到六个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸位于SEQ ID NO:133的螺旋的E1非相互作用面上。在一些实施方式中，将SEQ ID NO:133中的0到3个氨基酸从C端去除，或去除并且用1到6个来自由以下组成的群组的氨基酸替换：丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。在一些实施例中，SEQID NO:133中的非相互作用面上的0到6个氨基酸被选自由以下组成的群组的氨基酸取代：丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。在一些实施方式中，SEQ ID NO:133的以下氨基酸Lys-7(即A4)，Leu-9(即A6)，正亮氨酸-10(即A7)，Tyr-13(即A10)和任选Leu-16(即A13)中的一个或多个被α-甲基化或α-乙基化天然氨基酸取代。在一些实施方式中，SEQ ID NO:133的以下氨基酸Lys-7(即A4)，Leu-9(即A6)，正亮氨酸-10(即A7)，Tyr-13(即A10)和任选Leu-16(即A13)中的一个或多个被选自由以下组成的群组的氨基酸取代：L-丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。在一些实施方式中，SEQ ID NO:133的以下氨基酸正亮氨酸-1(即A-3)，Ala-2(即A-2)，Gly-3(即A-1)，Thr-4(即A1)，Ala-5(即A2)，Leu-6(即A3)，Arg-7(即A5)，Ala-10(即A8)，Glu-11(即A9)和Lys-13(即A11)中的一个或多个被α-甲基化或α-乙基化天然氨基酸取代。在某些实施方式中，SEQ ID NO:107的以下氨基酸正亮氨酸-1(即A-3)，Ala-2(即A-2)，Gly-3(即A-1)，Thr-4(即A1)，Ala-5(即A2)，Leu-6(即A3)，Arg-7(即A5)，Ala-10(即A8)，Glu-11(即A9)和Lys-13(即A11)中的一个或多个被选自由以下组成的群组的氨基酸取代：L-丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。在某些情况下，被另一氨基酸取代的SEQ ID NO:133的一个到六个氨基酸位于SEQ ID NO:133的螺旋的E1相互作用面上。在其它情况下，被另一氨基酸取代的SEQ ID NO:133的一个到六个氨基酸位于SEQ ID NO:133的螺旋的E1非相互作用和相互作用面上。在某些实施方式中，SEQ ID NO:133的一个到六个氨基酸被一个或多个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：L-丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
在一具体实施方式中，稳定化肽是基于具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失的SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一具体实施方式中，稳定化肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失的BX1LKRIHKX2LNDLARD的氨基酸序列，其中“B”为正亮氨酸，其中“X1”为S-戊烯基丙氨酸，并且其中“X2”为R-辛烯基丙氨酸(SEQ ID NO:107)。在一特定实施方式中，装钉肽进一步包括在以上部分“E2 hA肽”和“稳定化肽”中描述的修饰中的一种或多种。在另一实施方式中，稳定化肽由SEQ ID NO:107的氨基酸序列组成。在某些实施例中，被另一氨基酸取代的SEQ ID NO:107的零到六个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸位于SEQ ID NO:107的螺旋的E1非相互作用面上。在一些实施方式中，将SEQ ID NO:107中的0到3个氨基酸从C端去除，或去除并且用1到6个来自由以下组成的群组的氨基酸替换：丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。在一些实施方式中，SEQ ID NO:107中的非相互作用面上的0到6个氨基酸被选自由以下组成的群组的氨基酸取代：丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。在一些实施方式中，SEQ ID NO:107的以下氨基酸Lys-4(即A4)，Ile-6(即A6)，His-7(即A7)，Leu-10(即A10)和任选Leu-13(即A13)中的一个或多个被α-甲基化或α-乙基化天然氨基酸取代。在一些实施方式中，SEQ ID NO:107的以下氨基酸Lys-4(即A4)，Ile-6(即A6)，His-7(即A7)，Leu-10(即A10)和任选Leu-13(即A13)中的一个或多个被选自由以下组成的群组的氨基酸取代：L-丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。在一些实施方式中，SEQ ID NO:107的以下氨基酸正亮氨酸-1(即A1)，Ala-2(即A2)，Leu-3(即A3)，Arg-5(即A5)，Lys-8(即A8)，Glu-9(即A9)，Asn-11(即A11)，Asp-12(即A12)，Ala-14(即A14)，Arg-15(即A15)和Asp-16(即A16)中的一个或多个被α-甲基化或α-乙基化天然氨基酸取代。在某些实施方式中，SEQ ID NO:107的以下氨基酸正亮氨酸-1(即A1)，Ala-2(即A2)，Leu-3(即A3)，Arg-5(即A5)，Lys-8(即A8)，Glu-9(即A9)，Asn-11(即A11)，Asp-12(即A12)，Ala-14(即A14)，Arg-15(即A15)和Asp-16(即A16)中的一个或多个被选自由以下组成的群组的氨基酸取代：L-丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。在某些情况下，被另一氨基酸取代的SEQ ID NO:107的一个到六个氨基酸位于SEQ ID NO:107的螺旋的E1相互作用面上。在其它情况下，被另一氨基酸取代的SEQ ID NO:107的一个到六个氨基酸位于SEQ ID NO:107的螺旋的E1非相互作用和相互作用面上。在某些实施方式中，SEQ ID NO:107的一个到六个氨基酸被一个或多个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：L-丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
在另一具体实施方式中，肽为本文所描述的结合E1的具有弹头的E2 hA肽。举例来说，SEQ ID NO:4、6、10、39、55的肽或其上述变异体经修饰以包含非天然含亲电体氨基酸，或在不是氨基酸的部分的情形下提供的亲电子弹头(亲电体可充当化学帽)(例如半胱氨酸反应性部分，例如端接丙烯酰胺的二氨基丁酸或端接溴乙酰基的二氨基丁酸)。
在一具体实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:176的序列。在一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:392的序列。在另一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:680的序列。在一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽(例如SEQ ID NO:176，392或680)进一步包括在以上部分“E2 hA肽”和“稳定化肽”中描述的修饰中的一种或多种。
在一具体实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:212的序列。在一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:428的序列。在另一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:716的序列。在一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽(例如SEQ ID NO:212，428或716)进一步包括在以上部分“E2 hA肽”和“稳定化肽”中描述的修饰中的一种或多种。
在一具体实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:248的序列。在一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:464的序列。在另一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:752的序列。在一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:500的序列。在另一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ IDNO:788的序列。在一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽(例如SEQ ID NO:248，464，500，752或788)进一步包括在以上部分“E2 hA肽”和“稳定化肽”中描述的修饰中的一种或多种。
在一具体实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:177的序列。在一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:393的序列。在另一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:681的序列。在一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽(例如SEQ ID NO:177，393或681)进一步包括在以上部分“E2 hA肽”和“稳定化肽”中描述的修饰中的一种或多种。
在一具体实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:213的序列。在一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:429的序列。在另一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:717的序列。在一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽(例如SEQ ID NO:213，429或717)进一步包括在以上部分“E2 hA肽”和“稳定化肽”中描述的修饰中的一种或多种。
在一具体实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:249的序列。在一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:465的序列。在另一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:753的序列。在一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:501的序列。在另一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ IDNO:789的序列。在一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽(例如SEQ ID NO:249，465，501，753或789)进一步包括在以上部分“E2 hA肽”和“稳定化肽”中描述的修饰中的一种或多种。
在一具体实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:151的序列。在一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:367的序列。在另一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:655的序列。在一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽(例如SEQ ID NO:151，367或655)进一步包括在以上部分“E2 hA肽”和“稳定化肽”中描述的修饰中的一种或多种。
在一具体实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:187的序列。在一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:403的序列。在另一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:691的序列。在一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽(例如SEQ ID NO:187，403或691)进一步包括在以上部分“E2 hA肽”和“稳定化肽”中描述的修饰中的一种或多种。
在一具体实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:223的序列。在一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:439的序列。在另一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:727的序列。在一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:475的序列。在另一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ IDNO:763的序列。在一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽(例如SEQ ID NO:223，439，727，757或763)进一步包括在以上部分“E2 hA肽”和“稳定化肽”中描述的修饰中的一种或多种。
在一具体实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:827的序列。在一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:835的序列。在另一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:843的序列。在一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽(例如SEQ ID NO:827，835或843)进一步包括在以上部分“E2 hA肽”和“稳定化肽”中描述的修饰中的一种或多种。
在一具体实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:828的序列。在一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:834的序列。在另一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:842的序列。在一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽(例如SEQ ID NO:828，834或842)进一步包括在以上部分“E2 hA肽”和“稳定化肽”中描述的修饰中的一种或多种。
在一具体实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:829的序列。在一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:836的序列。在另一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:844的序列。在一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ ID NO:833的序列。在另一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽包含具有0到6个(即，0、1、2、3、4、5、6个)氨基酸取代、插入和/或缺失(如上文所描述)的SEQ IDNO:841的序列。在一特定实施方式中，结合E1的具有弹头的E2 hA肽(例如SEQ ID NO:829，833，836，841或844)进一步包括在以上部分“E2 hA肽”和“稳定化肽”中描述的修饰中的一种或多种。
治疗方法
本公开的特征为使用本文所述的稳定化肽(或包含所述稳定化肽的药物组合物)中的任一种预防和/或治疗表达E1或依赖E1的疾病的方法。表达E1或依赖E1的疾病的非限制性实例包括癌症、恶性血液病、实体肿瘤、抗体介导的移植排斥、自身免疫性病症、炎症性病症和其它病理性细胞存活的疾病。如本文所用，术语“治疗(treat/treating)”是指缓解、抑制或改善受试者罹患的疾病或病状。
本文所述的肽(或包含所述肽的组合物)可用于治疗患有表达E1的癌症的人类受试者。本文所述的肽(或包含所述肽的组合物)还可用于治疗患有依赖E1的癌症的人类受试者。在某些实施方式中，癌症为实体肿瘤或液体肿瘤。在某些实施方式中，实体肿瘤为膀胱癌肿瘤、胆管癌肿瘤、骨癌肿瘤、软组织肉瘤、脑瘤、脊髓肿瘤、乳腺癌肿瘤、胰腺癌肿瘤、结肠直肠癌肿瘤、直肠癌肿瘤、小肠癌肿瘤、前列腺癌肿瘤、肾癌肿瘤、肝细胞癌肿瘤、胆囊癌肿瘤、肺癌肿瘤、支气管癌肿瘤、卵巢癌肿瘤、子宫颈癌肿瘤、阴道癌肿瘤、子宫内膜癌肿瘤、胃癌肿瘤、食道癌肿瘤、头颈癌(例如鼻咽、口咽、唾液腺和甲状腺癌)肿瘤、黑色素瘤肿瘤、眼黑色素瘤肿瘤或神经内分泌肿瘤。在某些实施方式中，癌症为黑色素瘤、白血病、淋巴瘤或其它恶性血液病或实体肿瘤。在某些实施方式中，恶性血液病为急性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、骨髓发育不良综合症、多发性骨髓瘤、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓单核细胞性白血病、淋巴瘤(例如，霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤和T细胞淋巴瘤)、骨髓增生综合症或华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom'smacroglobulinemia)。在某些实施方式中，癌症为乳腺癌、自主神经节癌、胰腺癌、皮肤癌、CNS癌、造血或淋巴癌、肺癌、大肠癌、胃癌、软组织肉瘤或骨癌。在某些情况下，实体肿瘤为黑色素瘤、乳腺癌或肺癌。在某些实施方式中，自身免疫或炎症性病症为胃肠道病症(例如，乳糜泻、克隆氏病(Crohn's disease)或溃疡性结肠炎)、皮肤和肌肉骨胳病状(例如，斑秃、硬皮病、牛皮癣、类天疱疮、类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣性关节炎、纤维肌痛、风湿性多肌痛、强直性脊髓炎、白塞病(Behcet'sdisease)、克雷斯综合征(CREST syndrome)、红斑狼疮或白斑病)、气道和肺部疾病(例如哮喘或COPD)、自身免疫神经病(例如慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、急性运动轴索神经病、多发性硬化症或不宁腿综合征)、血管炎、肾炎、肝炎、胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、心肌炎、艾迪森氏病(Addison's disease)、抗磷脂综合症、再生障碍性贫血、脑炎、慢性疲劳综合症、糖尿病、子宫内膜异位、格雷夫斯病(Graves'disease)、吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barre syndrome)、结节病、感染相关发炎、局部缺血相关发炎或神经退化性病症(例如阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease))。
在某些实施方式中，向有需要的人类受试者施用选自由表7、8和11到15的序列组成的群组的肽。在某些实施方式中，向有需要的人类受试者施用包含以下或由以下组成的装钉E2 hA肽：SEQ ID NO:4或其修饰形式，例如包含以下或由以下组成的肽：SEQ ID NO:65、96、101和132中的任一个的氨基酸序列。在某些实施方式中，向有需要的人类受试者施用包含以下或由以下组成的装钉E2 hA肽：SEQ ID NO:6或其修饰形式，例如包含以下或由以下组成的肽：SEQ ID NO:67、97、103和133中的任一个的氨基酸序列。在某些实施方式中，向有需要的人类受试者施用包含以下或由以下组成的装钉E2 hA肽：SEQ ID NO:10或其修饰形式，例如包含以下或由以下组成的肽：SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:107的氨基酸序列。在某些实施方式中，向有需要的人类受试者施用包含以下或由以下组成的装钉E2 hA肽：SEQ ID NO:2或其修饰形式，例如包含以下或由以下组成的肽：SEQ ID NO:99、135、850和851的氨基酸序列。
在某些实施方式中，向有需要的人类受试者施用选自由表10和14的序列组成的群组的具有弹头的肽。在某些实施方式中，向有需要的人类受试者施用基于SEQ ID NO:4的具有弹头的装钉肽，例如包含以下或由以下组成的肽：SEQ ID NO:361、392、397、428、433、464、469、500、505、536、541、572、577、608、613、644、649、680、685、716、721、752、757和788的氨基酸序列。在某些实施方式中，向有需要的人类受试者施用基于SEQ ID NO:6的具有弹头的装钉肽，例如包含以下或由以下组成的肽：SEQ ID NO:363、393、399、429、435、465、471、501、507、537、543、573、579、609、615、645、651、681、687、717、723、753、759和789的氨基酸序列。在某些实施方式中，向有需要的人类受试者施用基于SEQ ID NO:10的具有弹头的装钉肽，例如包含以下或由以下组成的肽：SEQ ID NO:367、403、439、475、511、547、583、619、655、691、727和763的氨基酸序列。在某些实施方式中，向有需要的人类受试者施用基于SEQ ID NO:2的具有弹头的装钉肽，例如包含以下或由以下组成的肽：SEQ ID NO:395、431、467、502、503、539、575、611、646、647、683、719、755、790、791和833-844的氨基酸序列。在某些实施方式中，向有需要的人类受试者施用肽，其与选自由表10和14的序列组成的群组的氨基酸序列至少14％、至少15％、至少20％、至少27％、至少34％、至少40％、至少47％、至少50％、至少53％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同。
在治疗癌症、自身免疫性病症或炎症性病症的一些情况下，向有需要的人类受试者共施用放射线疗法、免疫疗法或化学疗法。化学疗法的非限制性实例包括烷基化剂(例如，白消安(busulfan)、卡铂、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、达卡巴嗪(dacarbazine)、异环磷酰胺、洛莫司汀(lomustine)、美法仑(mephelan)、奥沙利铂(oxaliplatin)、丙卡巴肼(procarbazine)盐酸盐、替莫唑胺(temozolomide)或噻替派(thiotepa))、抗代谢物(例如硫唑嘌呤、卡培他滨(capecitibine)、克拉曲滨(cladrabine)、氯法拉滨(clofarabine)、阿糖胞苷、地西他滨(decitabine)、氟尿拉丁(floxuradine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、羟基脲、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、普拉曲沙(pralatrexate)、硫鸟嘌呤、喷司他汀(pentostatin)或阿糖腺苷)、抗肿瘤抗生素(例如更生霉素(dactinomycin)、博莱霉素(bleomycin)、丝裂霉素C(mitomycin C)、阿德力霉素(adriamycin)、道诺霉素(daunorubicin)、伊达比星(idarubicin)、多柔比星(doxorubicin)或米托蒽醌)、有丝分裂抑制剂(例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、长春瑞滨(vinorelbine)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine))、铂药剂(例如顺铂、卡铂或奥沙利铂)、蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)、拓扑异构酶抑制剂(例如依托泊苷(etoposide)、替尼泊甙(teniposide)、喜树碱(camptothecin)、拓扑替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan)、多柔比星或道诺霉素)、沙利度胺(thalidomide)和相关类似物、类固醇(例如，地塞米松(dexamethasone)或强的松(prednisone))和抗体(例如，曲妥珠单抗(trastuzumab)、利妥昔单抗(rituximab)、西妥昔单抗(cetuximab)和贝伐单抗(bevacizumab))。在一些情况下，向有需要的人类受试者共施用免疫调节剂或消炎剂。免疫调节剂的非限制性实例包括甲氨蝶呤、来氟米特(leflunomide)、环磷酰胺、环孢菌素A(cyclosporine A)、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)、雷帕霉素(rapamycin)、咪唑立宾(mizoribine)、脫氧精胍菌素(deoxyspergualin)和布喹那(brequinar)。消炎剂的非限制性实例包括非类固醇消炎药(例如，水杨酸、乙酰水杨酸、水杨酸甲酯、二氟尼柳(diflunisal)、双水杨酸酯、奥沙拉嗪(olsalazine)、柳氮磺胺吡啶、乙酰胺苯酚、吲哚美辛(indomethacin)、舒林酸、依托度酸、甲芬那酸、甲氯芬那酸钠、托麦汀(tolmetin)、酮咯酸、二氯芬酸(dichlofenac)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、萘普生钠、非诺洛芬(fenoprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、氟比洛芬(flurbinprofen)、奥沙普嗪(oxaprozin)、吡罗昔康(piroxicam)、美洛昔康(meloxicam)、安吡昔康(ampiroxicam)、屈恶昔康(droxicam)、比沃昔康(pivoxicam)、替诺昔康(tenoxicam)、萘丁美酮(nabumetome)、保泰松(phenylbutazone)、羟布宗(oxyphenbutazone)、安替必灵(antipyrine)、氨基比林(aminopyrine)、阿扎丙宗(apazone)和尼美舒利(nimesulide)；白三烯拮抗剂，包括齐留通(zileuton)、金硫葡糖(aurothioglucose)、硫代苹果酸金钠或金诺芬(auranofin))、类固醇(例如二丙酸阿氯米松(alclometasone diproprionate)、安西奈德(amcinonide)、二丙酸倍氯米松(beclomethasone dipropionate)、倍他米松(betametasone)、苯甲酸倍他米松、二丙酸倍他米松、磷酸倍他米松钠(betamethasone sodium phosphate)、戊酸倍他米松、丙酸氯倍他索(clobetasol proprionate)、特戊酸氯可托龙(clocortolonepivalate)、氢皮质酮、氢皮质酮衍生物、地奈德(desonide)、地梭灭达松(desoximatasone)、地塞米松(dexamethasone)、氟尼缩松(flunisolide)、福克诺利(flucoxinolide)、氟氢缩松(flurandrenolide)、哈西诺(halcinocide)、甲羟松(medrysone)、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)、乙酸甲泼尼松龙、琥珀酸甲基泼尼松龙钠、糠酸莫米松(mometasone furoate)、乙酸帕拉米松(paramethasone acetate)、泼尼松龙、乙酸泼尼松龙、磷酸泼尼松龙钠、叔丁乙泼尼松龙(tebuatate prednisolone)、泼尼松(prednisone)、曲安西龙(triamcinolone)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、二乙酸曲安西龙(triamcinolone diacetate)或己曲安奈德(triamcinolone hexacetonide))；和其它消炎剂(例如甲氨蝶呤、秋水仙碱(colchicine)、别嘌呤醇、丙磺舒(probenecid)、苯磺唑酮或苯溴马隆(benzbromarone))。
在一些实施方式中，人类受试者患有癌症、恶性血液病、实体肿瘤、抗体介导的移植排斥、自身免疫性病症或炎症性病症。
一般来说，方法包括选择受试者并且向受试者施用有效量的本文中的肽中的一种或多种，例如在药物组合物中或作为药物组合物，并且任选地视需要重复施用以预防或治疗癌症，并且可以口服、静脉内或局部施用。可以基于例如确定受试者患有表达E1的癌症来选择受试者进行治疗。本公开的肽可以用于确定受试者癌症是否表达E1，或受试者癌症是否依赖E1。
针对任何特定患者的特定剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括所采用的特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、排泄率、药物组合、疾病、病状或症状的严重程度和病程、患者对疾病、病状或症状的倾向(disposition)和治疗医师的判断。
有效量可以一次或多次给予、施用或剂量施用。治疗有效量的治疗性化合物(即，有效剂量)取决于所选择的治疗性化合物。组合物可以每天一次或多次到每周一次或多次施用；包括每隔一天一次施用。熟练技术人员应理解，某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量和时间安排，包括但不限于疾病或病症的严重程度、先前治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄，和存在的其它疾病。此外，用治疗有效量的本文所述的治疗性化合物治疗受试者可以包括单一治疗或一系列治疗。举例来说，有效量可以至少施用一次。
药物组合物
本文所述的任何稳定化肽中的一种或多种可以配制用作药物组合物或在药物组合物中使用。药物组合物可用于本文所描述的治疗方法中(参见上文)。在某些实施方式中，药物组合物包含肽，所述肽包含以下或由以下组成：与表7到14中任一个中所示的氨基酸序列相同的氨基酸序列，不同之处在于1到10、1到9、1到8、1到7、1到6、1到5、1到4、1到3、1到2或1个氨基酸取代、插入或缺失。氨基酸序列的这些改变可以在这些肽的E1非相互作用α-螺旋面上(即，对于不参加/预测不参加与E1直接相互作用的氨基酸)和/或E1相互作用α-螺旋面上(即，对于与E1直接相互作用/预测直接相互作用的氨基酸)进行。所述组合物可以经配制或经调适用于通过任何途径，例如食品和药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准的任何途径向受试者施用。示例性方法描述于FDA的CDER数据标准手册，版本号004(其可在fda.give/cder/dsm/DRG/drg00301.htm获得)。举例来说，组合物可以经配制或经调适用于通过吸入(例如，口服和/或经鼻吸入(例如，通过喷雾器或喷雾))、注射(例如，静脉内、动脉内、皮下(subdermally)、腹膜内、肌肉内和/或皮下(subcutaneously))施用；和/或用于口服施用、经粘膜施用和/或局部施用(包括局部(例如，经鼻)喷雾和/或溶液)。
在一些情况下，药物组合物可包含有效量的一种或多种稳定化肽。如本文所用，术语“有效量”和“可有效治疗”是指使用一段时间(包括急性或慢性施用和周期性或连续施用)的本文所述的一种或多种化合物或药物组合物的量或浓度，其在其施用的情形下有效地引起预期作用或生理结果(例如治疗感染)。
本发明的药物组合物可包含一种或多种肽和任何药学上可接受的载体和/或媒剂。在一些情况下，药品可以可有效实现疾病或疾病症状的调节的量进一步包含一种或多种额外治疗剂。举例来说，药物组合物可包含放射线治疗剂、免疫治疗剂、化学治疗剂、免疫调节剂或消炎剂。
术语“药学上可接受的载体或佐剂”是指可以与本发明化合物一起向患者施用并且不破坏其药理学活性的载体或佐剂，并且其当以足以递送治疗量的化合物的剂量施用时无毒性。
可用于本发明的药物组合物中的药学上可接受的载体、佐剂和媒剂包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂；自乳化药物递送系统(SEDDS)，如d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯；用于药物剂型中的表面活性剂，如Tween或其它类似聚合递送基质；血清蛋白，如人血清白蛋白；缓冲物质，如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶态二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。环糊精，如α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精也可以有利地用于增强本文所述的式的化合物的递送。
本发明的药物组合物可含有任何常规无毒的药学上可接受的载体、佐剂或媒剂。在一些情况下，可以用药学上可接受的酸、碱或缓冲剂调节配制物的pH以增强配制的化合物或其递送形式的稳定性。如本文所用，术语肠胃外包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。
药物组合物可以呈用于吸入和/或经鼻施用的溶液或粉末形式。所述组合物可根据所属领域中已知的技术使用适合的分散剂或湿润剂(例如Tween 80)和悬浮剂来配制。无菌可注射制剂也可以为于无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如呈于1,3-丁二醇中的溶液形式。在可接受的媒剂和溶剂当中，可以采用的是甘露糖醇、水、林格氏溶液(Ringer's solution)和等渗氯化钠溶液。另外，无菌不挥发性油常规地用作溶剂或悬浮介质。出于这个目的，可以采用任何温和的不挥发性油，包括合成单甘油酯或二甘油酯。如油酸的脂肪酸和其甘油酯衍生物如天然的药学上可接受的油，如尤其呈其聚氧乙基化形式的橄榄油或蓖麻油般可用于制备可注射剂。这些油溶液或悬浮液还可以含有长链醇稀释剂或分散剂，或羧甲基纤维素或通常用于配制药学上可接受的剂型，如乳液和或悬浮液的类似分散剂。为了配制的目的，也可以使用其它常用表面活性剂，如Tween或Span，和/或常用于制造药学上可接受的固体、液体或其它剂型的其它类似乳化剂或生物可用性增强剂。
药物组合物可以任何口服可接受的剂型，包括但不限于胶囊、片剂、乳液和水性悬浮液、分散液和溶液口服施用。在口服使用的片剂的情况下，常用载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还添加润滑剂，如硬脂酸镁。对于以胶囊形式口服施用，有用的稀释剂包括乳糖和干燥玉米淀粉。当口服施用水性悬浮液和/或乳液时，可将活性成分悬浮或溶解于与乳化剂和/或悬浮剂合并的油相中。必要时，可添加某些甜味剂和/或调味剂和/或着色剂。
或者或另外，药物组合物可通过鼻用雾剂或经鼻吸入施用。所述组合物是根据药物配制领域众所周知的技术制备的，并且可以使用苯甲醇或其它适合的防腐剂、用于增强生物可用性的吸收促进剂、碳氟化合物和/或所属领域中已知的其它增溶剂或分散剂制备为生理盐水中的溶液。
在一些情况下，本文所公开的一种或多种肽可以例如与载体蛋白缀合。所述缀合组合物可以是单价或多价的。举例来说，缀合的组合物可包含本文所公开的一种与载体蛋白缀合的肽。或者，缀合的组合物可包含本文所公开的两种或更多种与载体缀合的肽。
如本文所用，当两个实体彼此“缀合”时，其通过直接或间接共价或非共价相互作用而连接。在某些实施方式中，缔合为共价的。在其它实施方式中，缔合为非共价的。非共价相互作用包括氢键结、范德华力相互作用(van der Waals interaction)、疏水性相互作用、磁性相互作用、静电相互作用等。间接共价相互作用是两个实体任选地通过连接基团共价连接的情况。
载体蛋白可包括增加或增强受试者中的免疫原性的任何蛋白质。示范性载体蛋白描述于所属领域中(参见例如Fattom等人，《感染与免疫(Infect.Immun.)》,58:2309-2312,1990；Devi等人，《美国国家科学院院刊》88:7175-7179,1991；Li等人，《感染与免疫》57:3823-3827,1989；Szu等人，《感染与免疫》59:4555-4561,1991；Szu等人，《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》166:1510-1524,1987；和Szu等人，《感染与免疫》62:4440-4444,1994)。聚合载体可以是含有一个或多个伯和/或仲氨基、叠氮基或羧基的天然或合成材料。载体可以是水溶性的。
制造稳定化肽的方法
本公开的特征为制造稳定化(例如单一装钉、双重装钉或缝合)肽的方法。所述方法涉及提供包含两个或更多个非天然氨基酸的本文所述的肽中的任一种的未交联形式，并且使所述肽交联。在一种情况下，交联是通过闭环复分解(RCM)反应。
装钉肽合成：基于Fmoc的固相肽合成可以用于根据所报告的用于产生全烃装钉肽的方法合成装钉肽融合抑制剂。举例来说，为了实现各种装钉长度，使用例如两个S-2-(4′-戊烯基)丙氨酸(S5)残基；两个(R)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-2-甲基-癸-9-烯酸(R8)残基；或一个S5残基和一个S8残基将α-甲基、α-烯基氨基酸安装在i，i+4(或i，i+7)位置处。在一些情况下，为了实现各种装钉长度，使用例如R-辛烯基丙氨酸(例如(R)-α-(7′-辛烯基)丙氨酸)；R-戊烯基丙氨酸(例如(R)-α-(4′-戊烯基)丙氨酸)；一个双戊烯基甘氨酸(例如α,α-双(4′-戊烯基)甘氨酸)；一个一个双辛烯基甘氨酸(例如α,α-双(7′-辛烯基)甘氨酸)；或S-辛烯基丙氨酸(例如(S)-α-(7′-辛烯基)丙氨酸)将α-甲基、α-烯基氨基酸安装在i，i+4(或i和i+7)位置处。对于装钉反应，将溶解于二氯乙烷中的Grubbs第1代钌催化剂添加到树脂结合肽中。为了确保最大转化，进行三轮到五轮装钉。随后使用三氟乙酸将肽从树脂裂解出来，使用己烷:乙醚(1:1)混合物沉淀，风干，并且通过LC-MS纯化。肽可以通过氨基酸分析来定量。
缝合肽合成：合成缝合肽的方法为所属领域中已知的。尽管如此，可使用以下示范性方法。可用于合成本文中所描述的化合物的合成化学转化和保护基方法(保护和脱除保护基)在所属领域中已知并且包括例如如以下中所描述的那些：R.Larock,《全面有机转化》,VCH出版社(1989)；T.W.Greene和P.G.M.Wuts,《有机合成中的保护基》,第3版,JohnWiley and Sons(1999)；L.Fieser和M.Fieser,《费舍尔和费舍尔的有机合成试剂》,JohnWiley and Sons(1994)；和L.Paquette编,《有机合成试剂百科全书》,John Wiley andSons(1995)和其后续版本。
本发明的肽可以通过化学合成方法制造，所述化学合成方法对于普通技术人员是众所周知的。参见例如Fields等人，《合成肽：用户指南》中的第3章，Grant,W.H.编，纽约州纽约Freeman公司,1992,第77页。因此，肽可以使用固相合成的自动化Merrifield技术用由t-Boc或Fmoc化学物质保护的α-NH2使用侧链保护的氨基酸，在例如Applied Biosystems肽合成器型号430A或431上合成。
本文所述的肽的一种制造方式是使用固相肽合成(SPPS)。C端氨基酸通过与连接分子的酸不稳定键与交联聚苯乙烯树脂连接。这种树脂不溶于用于合成的溶剂中，使洗掉过量试剂和副产物相对简单且快速。N端用Fmoc基团保护，所述基团在酸中稳定但可通过碱去除。用碱稳定酸不稳定基团保护任何侧链官能团。
较长肽可以通过使用天然化学接合使个别合成肽联合来制造。缝合氨基酸的插入可以如例如Young和Schultz,《生物化学杂志(J Biol Chem.)》2010年4月9日；285(15):11039-11044中所描述进行。或者，较长合成肽可以通过众所周知的重组DNA技术合成。所述技术在具有详细方案的众所周知的标准手册中提供。为了构建编码本发明的肽的基因，反向翻译氨基酸序列以获得编码氨基酸序列的核酸序列，优选地具有对于其中待表达基因的生物体来说最优的密码子。接着，通常通过合成编码肽的寡核苷酸和必要时任何调节元件来制造合成基因。将合成基因插入适合的克隆载体中并且转染到宿主细胞中。肽随后在适合于所选择的表达系统和宿主的适合条件下表达。肽通过标准方法经纯化且表征。
肽可以例如使用可从例如购自Advanced Chemtech或Symphony X的高通量多通道组合合成器以高通量组合方式制造。肽键可以被以下替换，例如以增加肽的生理稳定性：逆转-反向键(C(O)-NH)；经还原酰胺键(NH-CH2)；硫代亚甲基键(S-CH2或CH2-S)；氧代亚甲基键(O-CH2或CH2-O)；亚乙基键(CH2-CH2)；硫代酰胺键(C(S)-NH)；反烯烃键(CH＝CH)；氟取代的反烯烃键(CF＝CH)；酮亚甲基键(C(O)-CHR)或CHR-C(O)，其中R为H或CH3；和氟-酮亚甲基键(C(O)-CFR或CFR-C(O)，其中R为H或F或CH3。
肽可以通过以下进一步修饰：乙酰化、酰胺化、生物素化、肉桂酰化、法呢基化、荧光素化、甲酰化、肉豆蔻酰化、棕榈酰化、磷酸化(Ser、Tyr或Thr)、硬脂酰化、琥珀酰化和磺酰化。如上文所指出，肽可以与例如聚乙二醇(PEG)；烷基(例如，C1-C20直链或分支链烷基)；脂肪酸基团；和其组合缀合。含有不同长度的烯烃侧链的α,α-二取代的非天然氨基酸可通过已知方法合成(Williams等人《美国化学学会志》,113:9276,1991；Schafmeister等人《美国化学学会志》,122:5891,2000；和Bird等人，《酶学方法》,446:369,2008；Bird等人《化学生物学当前方案》,2011)。在一些情况下，对于其中使用i连接i+7，i+7连接i+14缝合的肽(螺旋的四个转角稳定化)：使用一个R-辛烯基丙氨酸(例如(R)-α-(7′-辛烯基)丙氨酸)、一个一个双戊烯基甘氨酸(例如α,α-双(4′-戊烯基)甘氨酸)和一个R-辛烯基丙氨酸(例如(R)-α-(7′-辛烯基)丙氨酸)。在一些情况下，对于其中使用i连接i+7，i+7连接i+14缝合的肽(螺旋的四个转角稳定化)：使用一个S-辛烯基丙氨酸(例如(S)-α-(7′-辛烯基)丙氨酸)、一个一个双戊烯基甘氨酸(例如α,α-双(4′-戊烯基)甘氨酸)和一个R-辛烯基丙氨酸(例如(R)-α-(7′-辛烯基)丙氨酸)。在一些情况下，对于其中使用i连接i+7，i+7连接i+14缝合的肽(螺旋的四个转角稳定化)：使用一个S-辛烯基丙氨酸(例如(S)-α-(7′-辛烯基)丙氨酸)、一个双戊烯基甘氨酸(例如α,α-双(4′-戊烯基)甘氨酸)和一个S-辛烯基丙氨酸(例如(S)-α-(7′-辛烯基)丙氨酸)。在一些情况下，对于其中使用i连接i+7，i+7连接i+14缝合的肽(螺旋的四个转角稳定化)：使用一个R-戊烯基丙氨酸(例如(R)-α-(4′-戊烯基)丙氨酸)、一个双辛烯基甘氨酸(例如α,α-双(7′-辛烯基)甘氨酸)和一个S-戊烯基丙氨酸(例如(S)-α-(4′-戊烯基)丙氨酸)。在一些情况下，对于其中使用i连接i+7，i+7连接i+14缝合的肽(螺旋的四个转角稳定化)：使用一个R-戊烯基丙氨酸(例如(R)-α-(4′-戊烯基)丙氨酸)、一个双辛烯基甘氨酸(例如α,α-双(7′-辛烯基)甘氨酸)和一个R-戊烯基丙氨酸(例如(R)-α-(4′-戊烯基)丙氨酸)。在一些情况下，对于其中使用i连接i+7，i+7连接i+14缝合的肽(螺旋的四个转角稳定化)：使用一个S-戊烯基丙氨酸(例如(S)-α-(4′-戊烯基)丙氨酸)、一个双辛烯基甘氨酸(例如α,α-双(7′-辛烯基)甘氨酸)和一个R-戊烯基丙氨酸(例如(R)-α-(4′-戊烯基)丙氨酸)。在一些情况下，对于其中使用i连接i+7，i+7连接i+14缝合的肽(螺旋的四个转角稳定化)：使用一个S-戊烯基丙氨酸(例如(S)-α-(4′-戊烯基)丙氨酸)、一个双辛烯基甘氨酸(例如α,α-双(7′-辛烯基)甘氨酸)和一个S-戊烯基丙氨酸(例如(S)-α-(4′-戊烯基)丙氨酸)。R-辛烯基丙氨酸使用相同途径合成，不同之处在于起始手性助剂赋予R-烷基-立体异构体。此外，使用8-碘辛烯代替5-碘戊烯。抑制剂使用MBHA树脂上的固相肽合成(SPPS)在固体支撑物上合成(参见例如WO 2010/148335)。
Fmoc保护的α-氨基酸(除烯烃氨基酸N-Fmoc-α,α-双(4′-戊烯基)甘氨酸、(S)-N-Fmoc-α-(4′-戊烯基)丙氨酸、(R)-N-Fmoc-α-(7′-辛烯基)丙氨酸、(R)-N-Fmoc-α-(7′-辛烯基)丙氨酸和(R)-N-Fmoc-α-(4′-戊烯基)丙氨酸以外)、六氟磷酸2-(6-氯-1-H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基铵(HCTU)和Rink Amide MBHA可购自例如Novabiochem(加利福尼亚州圣地亚哥)。二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、N,N-二异丙基乙胺(DIEA)、三氟乙酸(TFA)、1,2-二氯乙烷(DCE)、异硫氰酸荧光素(FITC)和哌啶可购自例如Sigma-Aldrich。烯烃氨基酸合成报告在所属领域中(Williams等人，《有机合成》,80:31,2003)。
同样，适合于获得(例如合成)、缝合和纯化本文所公开的肽的方法在所属领域中也是已知的(参见例如Bird等人，《酶学方法》,446:369-386(2008)；Bird等人，《化学生物学当前方案》,2011；Walensky等人，《科学》,305:1466-1470(2004)；Schafmeister等人，《美国化学学会志》,122:5891-5892(2000)；2010年3月18日提交的第12/525,123号美国专利申请；和2010年5月25日发布的第7,723,468号美国专利，其各自以全文引用的方式并入本文中)。
在一些情况下，肽实质上不含未缝合肽污染物或经分离。纯化肽的方法包括例如在固相支撑物上合成肽。在环化后，固相支撑物可以分离并且悬浮于溶剂，如DMSO、DMSO/二氯甲烷混合物或DMSO/NMP混合物的溶液中。DMSO/二氯甲烷或DMSO/NMP混合物可包含约30％、40％、50％或60％DMSO。在特定情况下，使用50％/50％DMSO/NMP溶液。溶液可以培育1、6、12或24小时的时间段，随后树脂可以例如用二氯甲烷或NMP洗涤。在一种情况下，树脂用NMP洗涤。可以进行振荡和将惰性气体鼓泡到溶液中。
可以例如使用下文和实施例中所描述的方法分析本公开的缝合或装钉肽的特性。
实施例
提供以下实施例是为了更好地说明要求保护的发明，而不应理解为限制本发明的范围。在提及特定材料的程度上，其仅出于说明的目的，且并不意图限制本发明。所属领域的技术人员无需履行发明能力且在不脱离本发明范围的情况下可开发出等效方式或反应物。
实施例1：粟酒裂殖酵母E2 hA装钉肽的制备
在泛素系统中，E1与E2之间的相互作用掩埋
Figure BDA0003415339150001052
的蛋白质表面积，其中
Figure BDA0003415339150001053
掩埋于E2的螺旋A(E2 hA)与E1泛素折叠结构域(E1 UFD)之间的界面中。E1-E2相互作用的Kd在低于个位数纳摩尔范围内，并且E2 hA占所述相互作用的结合能的至少40％。此外，E1与E2 hA之间的相互作用在E1-E2相遇复合体的形成中是重要的。因此，设计和制备模拟E2 hA的稳定化α-螺旋肽，其可充当E1-E2相互作用的竞争性抑制剂，阻止E1对E2进行装载，且因此表示抑制E1活性的新颖机制。
提供UBA1抑制剂肽设计的结构基础的Ubc15与粟酒裂殖酵母Ube1结合的晶体结构(PDB ID：5KNL)(图1A)。结构稳定化α-螺旋E2相关肽通过在具有粟酒裂殖酵母Ubc15螺旋A(hA)的经修饰序列的肽中的[i，i+4]或[i，i+7]位置处具有烯烃侧链的非天然氨基酸的取代，包括E7R氨基酸取代制备。E7R氨基酸取代已展示引起Km的约80倍减少(Lv等人，2017,《分子细胞》,65(4):699-714)。表12提供所制备的肽的序列。图1B和1C说明预期为α螺旋的SEQ ID NO:40的肽部分的轮描绘图，且描绘引入到SEQ ID NO:40中以产生SEQ ID NO:41-54的装钉肽(以下表12)的[i，i+4](图1B)和[i，i+7](图1C)氨基酸装钉位置。
表12.E2 hA肽。“B”为正亮氨酸，“X1”是R-辛烯基丙氨酸，且“X2”是S-戊烯基丙氨酸。
Figure BDA0003415339150001051
Figure BDA0003415339150001061
评价E2 hA装钉肽(SEQ ID NO:41-54)抑制E1介导的泛素转移到E2的能力。人E1活化酶UBA1(10nM)、UbcH5b E2酶(150nM)、泛素(1μM)和Mg-ATP(20μM)在100μM E2hA未装钉对照肽(SEQ ID NO:40)、装钉肽(SEQ ID NO:41-54中的任一个)或媒剂对照物(1％DMSO)存在下在室温下在含有50mM NaCl、50mM HEPES、1mM TCEP pH 7.5的缓冲液中组合45分钟。对照反应不包含E1酶。通过添加含SDS装载染料来淬灭反应，并且在非还原条件下，在4-12％Bis-Tris蛋白质凝胶上分辨样品。蛋白质通过银染色观测。通过游离E2(17kDa)到E2～泛素缀合物(26kDa)的转化来监测泛素通过E1与E2的缀合。
包括位于氨基酸位置A2和A9处的装钉的肽(SEQ ID NO:50)在此组中在抑制E1介导的泛素转移到E2中是最优的(图2)。包括位于氨基酸位置A5和A9(SEQ ID NO:44)、A8和A12(SEQ ID NO:46)、A9和A13(SEQ ID NO:47)、A1和A8(SEQ ID NO:49)、A4和A11(SEQ ID NO:52)和A5和A12(SEQ ID NO:53)处的装钉的肽也抑制通过E1 E2转化为E2～泛素(图2)。
本研究揭露，并非所有引入粟酒裂殖酵母Ubc15 E2 hA肽的装钉位置抑制E1介导的泛素转移到E2。不受任何特定理论束缚，假设包括位于位置A1和A5(SEQ ID NO:41)、A2和A6(SEQ ID NO:42)、A4和A8(SEQ ID NO:43)、A6和A10(SEQ ID NO:45)、A10和A14(SEQ ID NO:48)、A3和A10(SEQ ID NO:51)和A6和A13(SEQ ID NO:54)处的装钉的肽因为引入装钉干扰E2/E1结合界面或阻断E2螺旋A肽的重要残基而不能抑制E1介导的泛素转移到E2。
实施例2：智人E2 hA装钉肽的制备
鉴于包括位于位置A2和A9处的装钉的粟酒裂殖酵母Ubc15 E2hA肽(SEQ ID NO:50)有效抑制E1介导的泛素转移到E2，和人与粟酒裂殖酵母E1之间的高同源性，基于人E2 hA序列设计和产生E2 hA装钉肽。以上表2提供由32种不同人类基因编码的E2 hA的序列。产生具有位于位置A2和A9处的装钉的包含UBE2D2的E2 hA或UBE2G2或UBE2A的E2 hA的截短形式的肽，(分别为肽“SAH-UBE2G2-11”、“SAH-UBED2-11”和“SAH-UBE2A-11”；参见表13；也参见图3，其提供这些肽的螺旋轮部分的描绘)。
表13.装钉E2 hA肽。“B”为正亮氨酸，其中“X1”是R-辛烯基丙氨酸，并且其中“X2”是S-戊烯基丙氨酸。
名称 序列 SEQ ID NO
SAH-UBE2G2-11 BAGTX<sub>1</sub>LKRLBAX<sub>2</sub>YK 133
SAH-UBED2-11 BX<sub>1</sub>LKRIHKX<sub>2</sub>LNDLARD 107
SAH-UBE2A-11 BSTPX<sub>1</sub>RRRLBRX<sub>2</sub>FKRLQ 132
评价肽抑制E1介导的硫酯转移到E2的能力。人E1活化酶UBA1(10nM)、UbcH5b E2酶(150nM)、泛素(1μM)和Mg-ATP(20μM)在一系列浓度的装钉肽或媒剂对照物(1％DMSO)存在下在室温下在含有50mM NaCl、50mM HEPES、1mM TCEP pH 7.5的缓冲液中组合45分钟。通过添加含SDS装载染料来淬灭反应，并且在非还原条件下，在4-12％Bis-Tris蛋白质凝胶上分辨样品。蛋白质通过银染色观测。通过游离E2(17kDa)到E2～泛素缀合物(26kDa)的转化来监测泛素通过E1与E2的缀合。抑制百分比由银染色图像的密度测量计算。装钉肽SAH-Ubc15-11(SEQ ID NO:50)、SAH-UBE2G2-11(SEQ ID NO:133)、SAH-UBE2D2-11(SEQ ID NO:107)和SAH-UBE2A-11(SEQ ID NO:132)中的每一个以剂量依赖性方式抑制E1介导的硫酯转移到E2(图4)，其中SAH-UBE2A-11具有最强效活性。
实施例3：E2 hA装钉肽为泛素路径的E1-E2相互作用的泛活性抑制剂
鉴于SAH-UBE2A-11(SEQ ID NO:132)的效力，选择此肽进一步评价。人类编码由人E1酶UBA1活化的至少33种人E2酶。为了测试SAH-UBE2A-11(SEQ ID NO:132)的泛抑制活性，使用人E1活化酶UBA1、SAH-UBE2A-11或点突变阴性对照物SAH-UBE2A-11-R7E(BSTPX1RERLBRX2FKRLQ，“X1”是S-戊烯基丙氨酸，并且“X2”是R-辛烯基丙氨酸；SEQ ID NO:852)，和多种不同人E2酶(UBE2A、UBE2B、UBE2C、UBE2D1、UBE2D2、UBE2D3、UBE2D4、UBE2E1、UBE2E3、UBE2G1、UBE2L3、UBE2J1、UBE2J2、UBE2R1、UBE2R2、UBE2S、UBE2T、UBE3Q1、UBE2Q1和UBE2W2)进行体外酶抑制。SAH-UBE2A-11抑制E1介导的硫酯转移到所测试的所有人E2酶，而点突变对照物SAH-UBE2A-11-R7E具有减弱的抑制能力，突出显示作用的特异性(图5)。这些研究揭露SAH-UBE2A-11在其抑制E1介导的硫酯转移到E2的能力方面的泛活性：SAH-UBE2A-11不仅抑制转移到其衍生自的E2(即UBE2A)，而且抑制转移到众多其它人E2酶。
实施例4：SAH-UBE2A-11中的关键结合残基的鉴定
对SAH-UBE2A-11(SEQ ID NO:132)肽进行丙氨酸扫描突变诱发(图6)和电荷反转(R到E氨基酸取代)(图7)突变诱发以识别促成功能性E2 hA装钉肽活性的关键氨基酸残基(图6和7)。用突变SAH-UBE2A-11肽进行的体外酶抑制分析揭露氨基酸R7、L9、B10、F13和L16(位置A4、A6、A7、A10、A13)对于肽功能尤其重要(图6和7)。
实施例5：SAH-UBE2A与UBA1的直接结合
SAH-UBE2A与UBA1的直接结合通过链霉亲和素捕获(图8)、荧光偏振分析(图9)和氢-氘交换质谱分析(图10)评估。链霉亲和素捕获与重组蛋白混合的生物素标记的肽，随后洗涤、洗脱并通过蛋白质凝胶电泳进行检测，展现SAH-UBE2A与UBA1的直接结合(图8)。在泛素和ATP存在和不存在下进行的荧光偏振分析展现SAH-UBE2A不依赖于泛素和ATP与UBA1结合(图9)。氢-氘交换质谱分析展示与重组UBA1一起培育，相对于单独肽培育，以剂量依赖性方式保护SAH-UBE2A免于氘吸收。相比之下，使肽与重组E2一起培育不产生显著保护(图10)。
实施例6：SAH-UBE2A与天然UBA1结合且抑制细胞溶解物中的泛素级联
SAH-UBE2A与天然UBA1的直接结合通过抗生蛋白链菌素捕获与HeLa细胞溶解物混合的生物素标记的肽，随后洗涤、洗脱、蛋白质凝胶电泳和针对UBA1的蛋白质印迹来展现(图11)。癌细胞溶解物中泛素级联的抑制通过泛素化分析展现。在过量泛素和ATP再生溶液存在下，与SAH-UBE2A或媒剂对照物一起培育HeLa细胞质部分，且随后使其经历非还原凝胶电泳和针对泛素的蛋白质印迹。与媒剂对照物相比，SAH-UBE2A剂量依赖性地抑制多聚泛素链的形成(图12)。
实施例7：额外E2 hA装钉肽的产生
设计和产生额外装钉E2 hA肽。表14提供额外产生的E2 hA装钉肽的序列，其中的每一个抑制E1介导的硫酯转移到E2。换句话说，表14的E2 hA装钉肽中的每一个是功能性的。表15提供额外产生的E2 hA装钉肽的序列，其中的每一个展示抑制E1介导的硫酯转移到E2的能力减弱。换句话说，表15的E2 hA装钉肽展现显著减弱的功能，突出显示对于临床前和临床开发设计、合成、测试和迭代以达到最优功能性E2 hA装钉肽的重要性。
表14.产生的功能性E2 hA装钉肽。“B”为正亮氨酸，“X1”是R-辛烯基丙氨酸，且“X2”是S-戊烯基丙氨酸。
SEQ ID NO: 序列
807 ASTPX<sub>1</sub>RRRLBRX<sub>2</sub>FKRLQ
808 BSTPX<sub>1</sub>RRRLBRX<sub>2</sub>FRRLQ
809 BSTPX<sub>1</sub>ERRLBRX<sub>2</sub>FKRLQ
810 BSTPX<sub>1</sub>RRELBRX<sub>2</sub>FKRLQ
813 BATPX<sub>1</sub>RRRLBRX<sub>2</sub>FKRLQ
814 BSAPX<sub>1</sub>RRRLBRX<sub>2</sub>FKRLQ
815 BSTAX<sub>1</sub>RRRLBRX<sub>2</sub>FKRLQ
816 BSTPX<sub>1</sub>ARRLBRX<sub>2</sub>FKRLQ
818 BSTPX<sub>1</sub>RRALBRX<sub>2</sub>FKRLQ
821 BSTPX<sub>1</sub>RRRLBAX<sub>2</sub>FKRLQ
823 BSTPX<sub>1</sub>RRRLBRX<sub>2</sub>FARLQ
824 BSTPX<sub>1</sub>RRRLBRX<sub>2</sub>FKALQ
826 BSTPX<sub>1</sub>RRRLBRX<sub>2</sub>FKRLA
表15.产生的非功能性E2 hA装钉肽。“B”为正亮氨酸，“X1”是R-辛烯基丙氨酸，且“X2”是S-戊烯基丙氨酸。
SEQ ID NO: 序列
811 BSTPX<sub>1</sub>RRRLBEX<sub>2</sub>FKRLQ
812 BSTPX<sub>1</sub>RRRLBRX<sub>2</sub>FKELQ
817 BSTPX<sub>1</sub>RARLBRX<sub>2</sub>FKRLQ
819 BSTPX<sub>1</sub>RRRABRX<sub>2</sub>FKRLQ
820 BSTPX<sub>1</sub>RRRLARX<sub>2</sub>FKRLQ
822 BSTPX<sub>1</sub>RRRLBRX<sub>2</sub>AKRLQ
825 BSTPX<sub>1</sub>RRRLBRX<sub>2</sub>FKRAQ
853 BSSPSPGX<sub>1</sub>RRBLRDX<sub>2</sub>VK
854 X<sub>1</sub>ALKRIHX<sub>2</sub>ELNDLARD
实施例1-7中使用的方法
装钉肽合成和纯化：在Symphony X肽合成器上使用固相Fmoc化学物质产生装钉肽，其中氨基酸依序添加到rink amide AM树脂中。两个S-戊烯基丙氨酸或一个S-戊烯基丙氨酸和一个R-辛烯基丙氨酸非天然氨基酸分别替换i、i+4或i、i+7位置处的两个天然氨基酸。通过使用Grubbs第一代钌催化剂的烯烃复分解形成全烃装钉，随后肽脱除保护基和从树脂裂解。如所指示，肽用乙酰基N端衍生化，且C端酰胺化或用FITC衍生化。肽通过反相高效液相色谱和质谱分析(LC/MS)纯化并且通过氨基酸分析定量。
体外结合分析：为了评估配体与接受体蛋白质的结合和亲和力，可以例如使用荧光偏振分析(FPA)。FPA技术使用偏振光和荧光示踪剂测量分子定向和迁移率。当用偏振光激发时，相比于与较小分子连接的荧光示踪剂(例如溶液中游离的FITC标记的肽)，与具有高表观分子量的分子连接的荧光示踪剂(例如FITC)(例如与大蛋白质结合的FITC标记的肽)归因于其较慢的旋转速率而发射较高水平的偏振荧光。如所指示，在含有或不含有泛素(10μM)和ATP(20μM)的结合缓冲液中进行FP分析。
抗生蛋白链菌素-生物素下拉分析：对于重组蛋白下拉，10pmol重组人UBA1在1mL结合缓冲液(50mM NaCl，20mM HEPES，pH 7.4，5mM DTT)的总体积下在4℃下与5nmol C端生物素标记的SAH-UBE2A或DMSO媒剂对照物一起培育1.5小时。随后添加30μL的预平衡抗生蛋白链菌素琼脂糖珠粒，且在4℃下再培育1.5小时。珠粒通过离心粒化并且用NP-40缓冲液(20mM HEPES，pH 7.4，50mM NaCl，5mM DTT，0.5％[v/v]NP-40)洗涤三次，随后通过在3×SDS装载缓冲液中在70℃下加热10分钟从珠粒洗脱蛋白质样品。使样品经历电泳和银染色(Pierce 24612)。对于从细胞溶解物下拉，0.75mg HeLa细胞溶解物在1mL含有蛋白酶-磷酸酶抑制剂混合液的结合缓冲液(50mM NaCl，20mM HEPES，pH 7.4，5mM DTT)的总体积下在4℃下与5nmol C端生物素标记的SAH-UBE2A或DMSO媒剂对照物一起培育2小时。随后添加30μL的预平衡抗生蛋白链菌素琼脂糖珠粒(ThermoFisher 20357)，且在4℃下再培育1.5小时。珠粒通过离心粒化并且用NP-40缓冲液(20mM HEPES，pH 7.4，50mM NaCl，5mM DTT，0.5％[v/v]NP-40)洗涤三次，随后通过在3×SDS装载缓冲液中在70℃下加热10分钟从珠粒洗脱蛋白质样品。蛋白质通过SDS-PAGE凝胶电泳分离并且通过针对UBE1(Abcam ab34711)的蛋白质印迹检测。
体外酶抑制分析：重组人E1活化酶UBA1(10nM)、E2酶(150nM)、泛素(1μM)和Mg-ATP(20μM)在肽或媒剂对照物(1％DMSO)存在下在室温下在含有50mM NaCl、50mM HEPES pH7.5的缓冲液中组合45分钟。对照反应不包含E1酶。通过添加含SDS装载染料来淬灭反应，并且在非还原条件下，在4-12％Bis-Tris蛋白质凝胶上分辨样品。蛋白质通过银染色观测。通过游离E2(17kDa)到E2～泛素缀合物(26kDa)的转化来监测泛素通过E1与E2的缀合。抑制百分比定量由银染色图像的密度测量计算。误差条表示由三个独立实验计算的±1个SEM。
HXMS分析：氢-氘交换质谱分析(HXMS)实验如所述进行(Barclay,L.A.等人，通过非标准相互作用机制抑制促细胞凋亡BAX(Inhibition of Pro-apoptotic BAX by anoncanonical interaction mechanism).《分子细胞》57,873-886,doi：10.1016/j.molcel.2015.01.014(2015))。SAH-UBE2A单独或与所指示摩尔比的重组人UBA1、UBE2D2或媒剂对照物在含有50mM NaCl、5mM MgCl2、500nM泛素、20mM ATP、5mM DTT、20mM HEPES、pH 7.4的缓冲液中在冰上培育十分钟。以18倍稀释到D2O缓冲液(20mM HEPES，50mM NaCl，pD 8)中起始氘标记。在标记10秒之后，标记反应用添加相等体积的淬灭缓冲液(0.8M氯化胍，0.8％[v/v]甲酸)淬灭。随后注射样品，并且肽在VanGuard预柱捕获器(2.1mm×5mm，ACQUITY UPLC BEH C18，1.7μm)上完整捕获并且脱盐3分钟，在65μL/min的流动速率下在6分钟内使用5％到35％乙腈梯度从捕获器洗脱，且随后使用ACQUITY UPLC HSS T3，1.8μm，1.0mm×50mm柱在Waters nanoACQUITY LC上分离。Waters Synapt G2Si质谱仪在离子迁移模式中操作且分析数据。所有质谱使用DynamX 3.0(Waters公司)处理。氘水平未针对反向交换校正且因此相对地报告。所指出的所有变化在至少n＝2个生物学重复样品中是一致的。
细胞溶解物酶抑制分析：在pH 7.4的含有1×ATP再生溶液、20mM HEPES、50mMNaCl、5mM MgCl2、2mM DTT、100nM泛素醛和蛋白酶-磷酸酶抑制剂混合液的分析缓冲液中，用1mg/mL最终浓度的HeLa S100溶解物部分和指定浓度的肽或DMSO媒剂对照物进行细胞溶解物分析。通过添加泛素到100μM的最终浓度来起始反应并且使其在室温下进行30分钟，随后用非还原LDS装载缓冲液淬灭。蛋白质通过SDS-PAGE凝胶电泳分离并且通过针对多聚泛素(Cell Signaling Technology CST3936)的蛋白质印迹检测。
实施例8：并入亲电子弹头的SAH-E2肽的修饰
为了产生具有与UBA1的Cys1039形成共价键的潜力的额外E2 hA装钉肽变异体，产生数种变异体，其中“弹头”替换位置A8或A11。变异体基于Ubc15(SEQ ID NO:2)、UBE2D2(SEQID NO:10)和UBE2A(SEQ ID NO:4)的E2 hA序列。表16和17提供所产生的各种E2 hA装钉肽弹头变异体的序列。基于肽到人E1的晶体结构上的对接(PDF 6dc6)来确定弹头位置。选择肽的E1结合面上或附近且接近UBA1(SEQ ID NO:845)的Cys1039的位置以用弹头取代。估计氨基酸共同位置A7的α碳距UBA1(SEQ ID NO:845)的Cys1039的硫5.4埃。估计氨基酸共同位置A8的α碳与UBA1(SEQ ID NO:845)的Cys1039的硫的距离为6.6埃。估计氨基酸共同位置A11的α碳与UBA1(SEQ ID NO:845)的Cys1039的硫的距离为4.8埃。
表16.所产生的E2 hA具有弹头的装钉肽。“J”是二氨基丁酸(“Dab”)的具有丙烯酰胺的形式，“B”为正亮氨酸，“X1”是R-辛烯基丙氨酸，且“X2”是S-戊烯基丙氨酸
SEQ ID NO: 序列* 弹头位置 装钉位置
841 BPSSX<sub>1</sub>SRQLLRX<sub>2</sub>QLJEIQ A<sub>11</sub> A<sub>1</sub>和A<sub>8</sub>
842 BPSSAX<sub>1</sub>RQLLRJX<sub>2</sub>LKEIQ A<sub>8</sub> A<sub>2</sub>和A<sub>9</sub>
844 BPSSAX<sub>1</sub>RQLLRKX<sub>2</sub>LJEIQ A<sub>11</sub> A<sub>2</sub>和A<sub>9</sub>
727 BX<sub>1</sub>LKRIHKX<sub>2</sub>LJDLARD A<sub>11</sub> A<sub>2</sub>和A<sub>9</sub>
680 BSTPX<sub>1</sub>RRRLJRX<sub>2</sub>FKRLQ A<sub>7</sub> A2和A9
752 BSTPX<sub>1</sub>RRRLBRX<sub>2</sub>FJRLQ A<sub>11</sub> A2和A9
表17.所产生的E2 hA具有弹头的装钉肽。“J”是二氨基丁酸(“Dab”)的具有丙烯酰胺的形式，“B”为正亮氨酸，“X1”是R-辛烯基丙氨酸，且“X2”是S-戊烯基丙氨酸。
SEQ ID NO: 序列 弹头位置 装钉位置
763 X<sub>1</sub>ALKRIHX<sub>2</sub>ELJDLARD A<sub>11</sub> A<sub>1</sub>和A<sub>8</sub>
691 BX<sub>1</sub>LKRIHJX<sub>2</sub>LNDLARD A<sub>8</sub> A<sub>2</sub>和A<sub>9</sub>
SEQ ID NO:727、841、842和844的具有弹头的E2 hA装钉肽抑制E1介导的硫酯转移到E2。SEQ ID NO:680和752的具有弹头的E2 hA装钉肽抑制E1介导的硫酯转移到E2。SEQ IDNO:691和763的具有弹头的E2 hA装钉肽不抑制E1介导的硫酯转移到E2。
实施例9.产生的装钉肽和产生的具有弹头的装钉肽
产生并测试表18和19中列出的装钉肽和具有弹头的装钉肽。应注意，本公开还涵盖端接C端“Z”的那些装钉肽的变异体，其中变异体不具有Z。此外，本公开的特征为在1到10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸位置处不同于下文列出的序列，但非天然氨基酸(X1、X2)未被取代的装钉肽。在一些情况下，经取代的残基为不预测涉及与E1的相互作用的那些残基。这些变异体抑制E1-E2相互作用。在一些情况下，这些变异体抑制E1介导的硫酯转移到E2。本公开的特征为一种药物组合物，其包含没有末端Z的表18和19中列出的肽中的任一种或其盐(例如，乙酸盐、硫酸盐、氯化物)和药学上可接受的载体；以及其用于治疗癌症或其它表达E1或依赖E1的疾病的方法。
表18.产生的装钉肽
SEQ ID NO: 基因 序列
1344 Ubc15-tr-m_4 BPSSAX<sub>1</sub>RQLLRKX<sub>2</sub>LKEIQK
1345 UBE2D2-m_5 BX<sub>1</sub>LKRIHKX<sub>2</sub>LNDLARDZ
1346 UBE2G2-tr-m_6 BAGTX<sub>1</sub>LKRLBAX<sub>2</sub>YKZ
1347 UBE2A/UBE2B-tr-m_7 BSTPX<sub>1</sub>ARRLBRX<sub>2</sub>FKRLQZ
1348 UBE2A/UBE2B-tr-m BSTPX<sub>1</sub>RARLBRX<sub>2</sub>FKRLQZ
1349 UBE2A/UBE2B-tr-m BSTPX<sub>1</sub>RRALBRX<sub>2</sub>FKRLQZ
1350 UBE2A/UBE2B-tr-m BSTPX<sub>1</sub>ERRLBRX<sub>2</sub>FKRLQZ
1351 UBE2A/UBE2B-tr-m BSTPX<sub>1</sub>RERLBRX<sub>2</sub>FKRLQZ
1352 UBE2A/UBE2B-tr-m BSTPX<sub>1</sub>RRELBRX<sub>2</sub>FKRLQZ
1353 UBE2A/UBE2B-tr-m BSTPX<sub>1</sub>RARAARX<sub>2</sub>FKRLQZ
1354 UBE2A/UBE2B-tr-m BSTPX<sub>1</sub>RARAARX<sub>2</sub>FKRLQ
1355 UBE2A/UBE2B-tr-m BSTPX<sub>1</sub>RRELBEX<sub>2</sub>FKRLQZ
1356 UBE2A/UBE2B-tr-m BSTAX<sub>1</sub>ERELBEX<sub>2</sub>FAALQZ
1357 UBE2A/UBE2B-tr-m BSTPX<sub>1</sub>RRRLCRX<sub>2</sub>FKRLQ
1358 UBE2A/UBE2B-tr-m BSTPX<sub>1</sub>RRRLCRX<sub>2</sub>FKRLQZ
在表18中，“B”为正亮氨酸；“X1”为R-辛烯基丙氨酸；“X2”为S-戊烯基丙氨酸；“tr”＝截短；“m”＝突变；Z＝lys(生物素)(应注意，本公开还涵盖以上肽中的每一个，但不具有末端“Z”(在存在时))。
表19：产生的具有弹头的装钉肽
SEQ ID NO: 基因 序列
1359 UBE2A/UBE2B-tr-m BSTPX<sub>1</sub>RRRLJRX<sub>2</sub>FKRLQ
1360 UBE2A/UBE2B-tr-m BSTPX<sub>1</sub>RRRLBRX<sub>2</sub>FJRLQ
1361 UBE2A/UBE2B-tr-m BSTPX<sub>1</sub>RRRLBRX<sub>2</sub>FKRUQZ
1362 UBE2A/UBE2B-tr-m BSTPX<sub>1</sub>RRRLBRX<sub>2</sub>UAALQZ
1363 UBE2A/UBE2B-tr-m USTPX<sub>1</sub>RRRLBRX<sub>2</sub>FKRLQZ
1364 UBE2A/UBE2B-tr-m BSTPX<sub>1</sub>RRRLURX<sub>2</sub>FKRLQZ
1365 UBE2A/UBE2B-tr-m BSTPX<sub>1</sub>RRRLBRX<sub>2</sub>UKRLQZ
在表19中，“B”为正亮氨酸，“X1”是R-辛烯基丙氨酸，且“X2”是S-戊烯基丙氨酸；“J”为端接溴乙酰基的二氨基丁酸；“U”为非天然含二苯甲酮氨基酸；“tr”＝截短；“m”＝突变；Z＝lys(生物素)。
实施例10.E2 hA装钉肽呈现针对E1硫酯转移活性的高度特异性抑制活性
SAH-UBE2A-11(SEQ ID NO:132)抑制活性对E1介导的硫酯转移到E2具有高度特异性，如由其缺乏对非E1蛋白质或活性的作用或干扰所示。检查SAH-UBE2A-11(SEQ ID NO:132)的作用机制的特异性，SAH-UBE2A-11(SEQ ID NO:132)不展示对UBA1自身共价馈入泛素，即在硫酯转移到E2之前的酶步骤的能力的影响(图17)。此外，在体外重构整个泛素级联以展现SAH-UBE2A-11(SEQ ID NO:132)仅在抑制E2馈入的水平上影响级联(图16)。当与蛋白底物p53和泛素级联组分E1(UBA1)、E2(UBE2A)、E3(HDM2)、Ub和ATP一起培育时，SAH-UBE2A-11(SEQ ID NO:132)抑制p53蛋白质的泛素化。然而，当将已经用Ub预活化的E2而非未馈入E2和Ub包含于反应混合物中时，SAH-UBE2A-11(SEQ ID NO:132)对p53的泛素化无影响；用预馈入E2躲避SAH-UBE2A-11的抑制作用表明SAH-UBE2A-11(SEQ ID NO:132)针对E2的馈入的抑制作用的特异性。SAH-UBE2A-11(SEQ ID NO:132)还对去泛素化酶USP7针对p53的活性无影响(图16)。为了排除潜在肽聚集对SAH-UBE2A-11(SEQ ID NO:132)的活性的任何影响，进一步展示针对UBA1的肽的抑制活性完全不受非离子清洁剂的存在影响，所述非离子清洁剂可以另外溶解小分子或肽聚集体(图18)。在SAH-UBE2A-11(SEQ ID NO:132)与UBA1直接和特异性结合的进一步检查中，荧光显微法展示FITC标记的SAH-UBE2A-11(SEQID NO:132)与用His-UBA1标记的Ni-NTA珠粒特异性结合，且不接合未标记的珠粒或用不相关蛋白质(His-p53)标记的珠粒，指示与UBA1的特异性肽结合(图19)。
实施例11.E2 hA装钉肽在装钉后经历α-螺旋结构加强，其中α-螺旋E2 hA肽的生物活性取决于肽序列
肽装钉在E2 hA肽中诱导α-螺旋折叠。圆二色谱展示未经修饰的UBE2A肽(BSTPARRRLBRDFKRLQ，其中“B”为正亮氨酸；SEQ ID NO:1343)在溶液中显示21％螺旋性，对应于主要呈现无规线圈构象，而SAH-UBE2A-11(SEQ ID NO:132)展示具有54％螺旋含量的α-螺旋构象的稳定化(图20)。类似地，肽装钉诱导Ubc15肽主链中的α-螺旋折叠，且未经修饰的Ubc15-1肽(Ubc15-tr-m-z_1z；BPSSASRQLLRKQLKEIQZ，其中“B”是正亮氨酸，且“Z”为生物素标记的赖氨酸(Lys(生物素))；SEQ ID NO:1340)显示仅19％螺旋含量且装钉SAH-Ubc15-11肽(SEQ ID NO:50)显示51％螺旋含量。单独螺旋形状不足以赋予E2 hA肽生物活性，因为一系列E2 hA肽(SEQ ID NO:50、107、132、133；1327-1329；和1337-1339)的螺旋百分比不与其抑制活性相关，其生物活性除了需要α-螺旋增强之外，还需要相容氨基酸序列(图20-22)。
实施例12.E2 hA装钉肽具有蛋白酶抗性
肽装钉赋予E2 hA肽蛋白水解稳定性。溶液蛋白酶K消化后SAH-UBE2A-11(SEQ IDNO:132)的半衰期>6小时，相对于未装钉肽UBE2A(BSTPARRRLBRDFKRLQ；SEQ ID NO:1343)延长23倍(图23)。
实施例13.hA装钉肽呈现与破坏结合界面的特定突变明确相关的结合和生物结构-活性，其中破坏结合界面的特定突变逐渐减弱SAH-UBE2A的抑制活性
如以上实施例4中所展示，发现点突变R7A、L9A和B10A各自减弱SAH-UBE2A-11的抑制活性(参见图6B)。发现三个点突变的组合，如在肽SAH-UBE2A-AAA(BSTPX1RARAARX2FKRLQ；SEQ ID NO:1354)中，相比于单点突变肽SAH-UBE2A-R7E，逐渐减弱抑制活性。三重突变肽显示可忽略的抑制活性，类似于缺乏螺旋结构的未装钉的UBE2A肽(BSTPARRRLBRDFKRLQ；SEQID NO:1343)(图24)。单点和三点突变肽的抑制活性的减弱程度与每个肽与UBA1的结合程度相关，如通过氢-氘交换质谱分析所测量(图25)。
实施例10-13中所使用的额外方法
体外泛素路径重构分析：如所指示，在存在或不存在肽(30μM)、UBA1(0.1μM)、UBE2D(1μM)、HDM2(1μM)、泛素(1μM)和ATP(10mM)(全部Boston Biochem K-200B)、预活化Ub-UBEA2(3μM)(Boston Biochem E2-802)和USP7(1μM)(BostonBiochem E-519)下将含有重组His-p53(0.1μM)的反应物混合并且在37℃下在30μl的最终体积下培育2小时，随后通过在含SDS装载染料中在90℃下沸腾10分钟来变性。样品通过琼脂糖凝胶电泳分辨并且转移到硝酸纤维膜。膜用3％乳阻断1小时，在1:1000稀释下在含有3％BSA和小鼠p53抗体(Boston Biochem K-200B)的PBS中培育过夜，在含有0.1％Tween-20的PBS中洗涤，且随后在室温下在1:5000稀释下在含有3％BSA和抗小鼠二级抗体(BioRad AAC10P)的PBS中培育1小时。将膜再次在含有0.1％Tween-20的PBS中洗涤，且使用Amersham ECL Prime(GE LifeSciences)在Amersham成像器680(GE Life Sciences)上成像。
荧光显微法：将His标记的UBA1(25μg)与Ni-NTA琼脂糖珠粒(100μl)(InvitrogenTM R90110)一起在PBS中培育30分钟。随后将珠粒与FITC标记的肽(10μM)一起培育30分钟。珠粒以386孔板形式(10μl/孔)(Corning 384孔高含量成像玻璃底微量板)涂铺，且用Olympus宽视场落射荧光显微镜、63×LCPlanFL NA 0.7物镜和CoolSNAP DYNO相机成像。
圆二色谱：将乙酰化肽溶解于10％(vol/vol)乙腈/水中以用于如所报告在AvivBiomedical分光光度计上进行的圆二色谱分析(参见Bird等人，《酶学方法》,446:369-386(2008))。
肽蛋白水解分析：体外蛋白水解降解使用以下参数通过LC/MS(Agilent 1200)测量：20μl注射，0.6mL流动速率，20分钟操作时间，由以下组成：在15分钟内水(0.1％甲酸)到20％到80％乙腈(0.75％甲酸)的梯度，4分钟洗涤以恢复到开始梯度条件，和0.5分钟后时。MSD设置成扫描模式，其中一个通道为(M+2H)/2，±1个质量单元，一个通道为(M+3H)/3，±1个质量单元，且另一通道为(M+4H)/4，±1个质量单元。每一MSD信号的积分产生>108计数的曲线下面积。反应样品由5μl含肽的DMSO(1mM储备液)和195μl由50mM Tris HCl，pH 7.4组成的缓冲液构成。在注射零时样品后，添加6μl 20ng/μL蛋白酶K(New England Biolabs)，并且随时间推移通过连续注射定量完整肽的量。MSD面积相对于时间的曲线产生指数衰变曲线，且通过使用Prism软件(GraphPad)的非线性回归分析测定半衰期。
实施例14.UBA2结合、UBA3结合和UBA6结合装钉肽
如上文所描述产生结合UBA2、UBA3和UBA6的装钉肽。进行UBE2F、UBE2m、UBE2I和USE1 E2 hA肽(SEQ ID NO:35-38)的装钉扫描，结合评估装钉肽抑制UBA2、UBA3或UBA6的能力的分析(例如上文所描述的体外酶抑制分析)。图13说明预期为α螺旋的SEQ ID NO:36(左图区)和SEQ ID NO:35(右图区)的肽部分的轮描绘。图14说明预期为α螺旋的SEQ ID NO:37的肽部分的轮描绘。图15说明预期为α螺旋的SEQ ID NO:38的肽部分的轮描绘。
其它实施例
虽然已经结合其具体实施方式对本发明进行了描述，但前面的描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围定义。其它方面、优点和修改在所附权利要求书的范围内。

Claims (141)

1.一种肽，其包含SEQ ID NO:132的序列中至少8个连续氨基酸的氨基酸序列且具有0到10个氨基酸取代，其中所述取代如果存在不位于SEQ ID NO:132的位置5和12处，并且其中所述肽抑制人E1介导的硫酯转移到人E2，并且任选地其中位置5为S-戊烯基丙氨酸并且位置12为R-辛烯基丙氨酸，或其中位置5为R-辛烯基丙氨酸并且位置12为S-戊烯基丙氨酸；或其盐。
2.根据权利要求1所述的肽或其盐，其中所述肽具有1到10个氨基酸取代，并且其中所述取代不位于SEQ ID NO:132的位置7和/或9处。
3.根据权利要求1所述的肽或其盐，其中所述肽具有1到10个氨基酸取代，并且其中所述取代不位于SEQ ID NO:132的位置7、9、10、13和16中的一处或多处。
4.根据权利要求1所述的肽或其盐，其中所述肽具有1到10个氨基酸取代，并且其中所述取代位于SEQ ID NO:132的位置7、9、10、13和16中的一处或多处，并且其中所述取代在这些位置中的一处或多处是取代为丙氨酸。
5.根据权利要求1所述的肽或其盐，其中所述肽具有1到10个氨基酸取代，并且其中所述取代位于SEQ ID NO:132的位置1、2、3、4、6、8、11、13、14、15、16或17中的一处或多处，并且任选地其中这些位置被取代为丙氨酸，并且如果位置6和/或8被取代，那么这些位置也可以被取代为谷氨酸。
6.根据权利要求1所述的肽或其盐，其中所述肽具有1到10个氨基酸取代，并且其中所述取代包括SEQ ID NO:132的位置6或8中的一处或多处，并且任选地其中这些位置被取代为谷氨酸。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的肽或其盐，其进一步包含可与所述人E1内的半胱氨酸残基形成共价键的反应性基团，任选地其中所述反应性基团为具有亲电子基团的非天然氨基酸或N端处的亲电子化学帽。
8.一种肽或其盐，所述肽包含从N端到C端具有以下残基的序列的至少8个连续氨基酸：
Xaa1＝B、A，其中B为正亮氨酸，或不存在；
Xaa2＝S、A或不存在；
Xaa3＝T、A或不存在；
Xaa4＝P、A或不存在；
Xaa5＝装钉氨基酸
Xaa6＝R、E或A；
Xaa7＝R或A；
Xaa8＝R、E或A；
Xaa9＝L、A或可与所述人E1内的半胱氨酸残基形成共价键的反应性基团，任选地其中所述反应性基团为具有亲电子基团的非天然氨基酸或N端处的亲电子化学帽；
Xaa10＝B或A，其中B为正亮氨酸；
Xaa11＝R或A；
Xaa12＝装钉氨基酸；
Xaa13＝F、A、可与所述人E1内的半胱氨酸残基形成共价键的反应性基团，任选地其中所述反应性基团为具有亲电子基团的非天然氨基酸或N端处的亲电子化学帽，或不存在；
Xaa14＝K、R、A或不存在；
Xaa15＝R、A或不存在
Xaa16＝L、A或不存在；和
Xaa17＝Q、A或不存在，
其中所述肽抑制人E1人E2之间的相互作用，并且任选地其中所述肽抑制人E1介导的硫酯转移到人E2。
9.根据权利要求8所述的肽或其盐，其中所述肽的长度为8到50、8到40、8到30、8到25、8到20或8到17个氨基酸。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的肽或其盐，其中所述肽内部交联。
11.一种制造结构稳定化肽的方法，所述方法包括：
(a)提供根据权利要求1到9中任一项所述的肽；和
(b)使所述肽交联；任选地，其中所述交联是通过RCM反应。
12.根据权利要求11所述的方法，其进一步包括将所述交联的肽配制为药物组合物。
13.一种药物组合物，其包含根据权利要求1到10中任一项所述的肽或其盐和药学上可接受的载体。
14.一种治疗有需要的人类受试者的表达E1或依赖E1的疾病的方法，所述方法包括向所述人类受试者施用治疗有效量的根据权利要求1到10中任一项所述的肽或其盐或根据权利要求13所述的药物组合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述表达E1或依赖E1的疾病为癌症。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述表达E1或依赖E1的疾病为恶性血液病、实体肿瘤、抗体介导的移植排斥、自身免疫性病症或炎症性病症。
17.根据权利要求14到16中任一项所述的方法，其中所述人类受试者尚未对治疗所述表达E1或依赖E1的疾病的先前疗法起反应或已对其产生抗性。
18.根据权利要求1到10中任一项所述的肽或其盐，其中所述盐为乙酸盐、硫酸盐或氯化物。
19.一种肽，其包含：SEQ ID NO:1-33中任一个的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，其中所述A1到A11氨基酸中的一个或多个被另一氨基酸取代；其中所述经修饰氨基酸序列包括至少一个肽结构稳定化修饰；并且其中所述肽结合且抑制泛素活化酶1(UBA1)。
20.根据权利要求19所述的肽，其中所述肽结构稳定化修饰包括用非天然氨基酸取代SEQ ID NO:1-33中任一个的氨基酸A1到A11中所示的序列的至少两个氨基酸，其中所述非天然氨基酸包括一个或多个烯烃侧链。
21.根据权利要求19所述的肽，其中所述肽结构稳定化修饰为烃装钉/缝合、内酰胺装钉/缝合；UV-环加成装钉/缝合；肟装钉/缝合；硫醚装钉/缝合；双击装钉/缝合；双内酰胺装钉/缝合；双芳基化装钉/缝合；或其中任何两种或更多种的组合。
22.根据权利要求19所述的肽，其中所述肽结构稳定化修饰为缝合。
23.根据权利要求19所述的肽，其中所述肽结构稳定化修饰为装钉。
24.根据权利要求23所述的肽，其中所述装钉位于所述氨基酸序列中的两个位置中的一处或多处，其中所述两个位置是i和i+3；i和i+4；i和i+6；或i和i+7。
25.根据权利要求23所述的肽，其中所述装钉位于所述氨基酸序列中的两个位置中的一处或多处，其中所述两个位置选自由A2和A9、A5和A9、A8和A12、A9和A13、A1和A8、A4和A11，和A5和A12组成的群组。
26.根据权利要求23所述的肽，其中所述装钉位于两个位置处，其中所述两个位置是A2和A9。
27.根据权利要求23到26中任一项所述的肽，其中所述装钉包括位于所述两个位置中的每一处的氨基酸取代，其中所述每一处的氨基酸取代为非天然氨基取代，其中所述非天然氨基酸包含一个或多个烯烃侧链。
28.根据权利要求20或27所述的肽，其中包含烯烃侧链的所述非天然氨基酸选自由以下组成的群组：S-戊烯基丙氨酸、R-辛烯基丙氨酸；R-丙烯基丙氨酸、S-戊烯基丙氨酸；R-戊烯基丙氨酸、S-戊烯基丙氨酸；双戊烯基甘氨酸、S-戊烯基丙氨酸、R-辛烯基丙氨酸；和双戊烯基甘氨酸、S-辛烯基丙氨酸和R-辛烯基丙氨酸。
29.根据权利要求19到28中任一项所述的肽，其中：
(a)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:4的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:4的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；
(b)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:6的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:6的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；
(c)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:1的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；
(d)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:2的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:2的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；
(e)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:3的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；
(f)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:5的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；
(g)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:7的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；
(h)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:8的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:8的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；
(i)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:9的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；
(j)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:10的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:10的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；
(k)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:11的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；
(l)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:12的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:12的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；
(m)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:13的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；
(n)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:14的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:14的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；
(o)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:15的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；
(p)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:16的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:16的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；
(q)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:17的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；
(r)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:18的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:18的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；
(s)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:19的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；
(t)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:20的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:20的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；
(u)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:21的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；
(v)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:22的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:22的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；
(w)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:23的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；
(x)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:24的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:24的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；
(y)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:25的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；
(z)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:26的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:26的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；
(aa)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:27的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；
(bb)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:28的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:28的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；
(cc)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:29的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；
(dd)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:30的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:30的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；
(ee)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:31的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；
(ff)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:32的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:32的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代；或
(gg)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:33的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:33的A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代。
30.根据权利要求19到29中任一项所述的肽，其中：
(a)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:4的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:4的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；
(b)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:6的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:6的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；
(c)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:1的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；
(d)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:2的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:2的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；
(e)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:3的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；
(f)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:5的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；
(g)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:7的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；
(h)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:8的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:8的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；
(i)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:9的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；
(j)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:10的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:10的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；
(k)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:11的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；
(l)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:12的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:12的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；
(m)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:13的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；
(n)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:14的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:14的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；
(o)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:15的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；
(p)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:16的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:16的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；
(q)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:17的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；
(r)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:18的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:18的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；
(s)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:19的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；
(t)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:20的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:20的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；
(u)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:21的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；
(v)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:22的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:22的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；
(w)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:23的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；
(x)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:24的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:24的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；
(y)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:25的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；
(z)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:26的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:26的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；
(aa)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:27的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；
(bb)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:28的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:28的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；
(cc)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:29的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；
(dd)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:30的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:30的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；
(ee)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:31的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；
(ff)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:32的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:32的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代；或
(gg)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:33的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由SEQ ID NO:33的A4、A6、A7和A10组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代。
31.根据权利要求19到30中任一项所述的肽，其中所述被另一氨基酸取代的氨基酸A1-A11中的一个或多个位于SEQ ID NO:1-33的氨基酸A1-A11的E1非相互作用面上。
32.根据权利要求31所述的肽，其中SEQ ID NO:1-33的所述非相互作用面包括氨基酸A1、A2、A5、A8、A9和A12。
33.根据权利要求19到32中任一项所述的肽，其中SEQ ID NO:1-33中任一个的氨基酸A1-A11的所述非相互作用面上的0到6个氨基酸被选自由以下组成的群组的氨基酸取代：丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
34.根据权利要求19到33中任一项所述的肽，其中氨基酸A4、A6、A7和A10中的一个或多个被α-甲基化或α-乙基化天然氨基酸取代。
35.根据权利要求19到33中任一项所述的肽，其中氨基酸A4、A6、A7和A10中的一个或多个被选自由以下组成的群组的氨基酸取代：L-丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
36.根据权利要求19到35中任一项所述的肽，其中氨基酸A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11中的一个或多个被α-甲基化或α-乙基化天然氨基酸取代。
37.根据权利要求19到35中任一项所述的肽，其中氨基酸A1、A2、A3、A5、A8、A9和A11中的一个或多个被选自由以下组成的群组的氨基酸取代：L-丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
38.根据权利要求19到37中任一项所述的肽，其中所述经修饰氨基酸序列包含SEQ IDNO:4的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列。
39.根据权利要求19到37中任一项所述的肽，其中所述经修饰氨基酸序列包含SEQ IDNO:6的氨基酸A1到A11中所示的序列的经修饰氨基酸序列。
40.根据权利要求19到37中任一项所述的肽，其中所述经修饰氨基酸序列包含SEQ IDNO:1-33中任一个中所示的序列的经修饰氨基酸序列。
41.根据权利要求40所述的肽，其中SEQ ID NO:1-33的一个或多个氨基酸被一个或多个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：L-丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
42.根据权利要求40或41所述的肽，其中将SEQ ID NO:1-33中的0到5个氨基酸从C端去除，或去除并且用1到6个来自由以下组成的群组的氨基酸替换：丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
43.根据权利要求40到42中任一项所述的肽，其中被另一氨基酸取代的SEQ ID NO:1-33的所述一个或多个氨基酸位于SEQ ID NO:1-33的氨基酸的E1非相互作用面上。
44.根据权利要求40到43中任一项所述的肽，其中所述经修饰氨基酸序列包含SEQ IDNO:4中所示的序列的经修饰氨基酸序列。
45.根据权利要求40到43中任一项所述的肽，其中所述经修饰氨基酸序列包含SEQ IDNO:6中所示的序列的经修饰氨基酸序列。
46.根据权利要求19到45中任一项所述的肽，其中：(i)所述肽的总疏水性相对于SEQID NO:1-33的肽降低；(ii)所述肽的总正电荷相对于SEQ ID NO:1-33的肽降低；或(iii)(i)和(ii)的组合。
47.根据权利要求19所述的肽，其包含SEQ ID NO:132中所示的序列。
48.根据权利要求19所述的肽，其包含SEQ ID NO:133中所示的序列。
49.根据权利要求19所述的肽，其包含SEQ ID NO:107中所示的序列。
50.根据权利要求19所述的肽，其包含SEQ ID NO:50中所示的序列。
51.一种肽，其包含：SEQ ID NO:35或36中所示的序列的经修饰氨基酸序列，其中SEQID NO:35或36的一个或多个氨基酸被另一氨基酸取代；其中所述经修饰氨基酸序列包括至少一个肽结构稳定化修饰；并且其中所述肽结合且抑制泛素活化酶3(UBA3)。
52.根据权利要求51所述的肽，其中所述肽结构稳定化修饰包括用非天然氨基酸取代SEQ ID NO:35或36的序列的至少两个氨基酸，其中所述非天然氨基酸包含一个或多个烯烃侧链。
53.根据权利要求51所述的肽，其中所述肽结构稳定化修饰为烃装钉/缝合、内酰胺装钉/缝合；UV-环加成装钉/缝合；肟装钉/缝合；硫醚装钉/缝合；双击装钉/缝合；双内酰胺装钉/缝合；双芳基化装钉/缝合；或其中任何两种或更多种的组合。
54.根据权利要求51所述的肽，其中所述肽结构稳定化修饰为缝合。
55.根据权利要求51所述的肽，其中所述肽结构稳定化修饰为装钉。
56.根据权利要求55所述的肽，其中所述装钉位于所述氨基酸序列中的两个位置中的一处或多处，其中所述两个位置是i和i+3；i和i+4；或i和i+7。
57.根据权利要求55或56所述的肽，其中所述装钉包括位于所述两个位置中的每一处的氨基酸取代，其中所述每一处的氨基酸取代为非天然氨基取代，其中所述非天然氨基酸包含一个或多个烯烃侧链。
58.根据权利要求52或57所述的肽，其中包含烯烃侧链的所述非天然氨基酸选自由以下组成的群组：S-戊烯基丙氨酸、R-辛烯基丙氨酸；R-丙烯基丙氨酸、S-戊烯基丙氨酸；R-戊烯基丙氨酸、S-戊烯基丙氨酸；双戊烯基甘氨酸、S-戊烯基丙氨酸、R-辛烯基丙氨酸；和双戊烯基甘氨酸、S-辛烯基丙氨酸和R-辛烯基丙氨酸。
59.根据权利要求51到58中任一项所述的肽，其中：
(a)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:35的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由以下组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代：SEQ ID NO:35的Arg-1、Arg-2、Ser-4、Val-5、Arg-6、Asp-7、Leu-9、Leu-10、Glu-13、Ala-15和Glu-16；或
(b)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:36的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由以下组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代：SEQ ID NO:36的Lys-1、Ser-4、Ala-5、Ala-6、Arg-9、Ile-10和Asp-134。
60.根据权利要求51到59中任一项所述的肽，其中：
(a)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:35的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由以下组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代：SEQ ID NO:35的Val-3、Lys-8、Val-11、Lys-12和Val-14；或
(b)所述经修饰氨基酸序列包含SEQ ID NO:36的经修饰氨基酸序列，并且其中所述经修饰氨基酸序列包括选自由以下组成的群组的零、一或两个保守氨基酸位置：SEQ ID NO:36的Lys-2、Ala-3、Gln-7、Leu-8、Gln-11、Lys-12、Ile-14、Asn-15和Glu-16。
61.根据权利要求51到60中任一项所述的肽，其中被另一氨基酸取代的所述一个或多个氨基酸位于SEQ ID NO:35或36的E1非相互作用面上。
62.根据权利要求61所述的肽，其中SEQ ID NO:35的所述非相互作用面包括SEQ IDNO:25的氨基酸Arg-1、Arg-2、Ser-4、Val-5、Arg-6、Asp-7、Leu-9、Leu-10、Glu-13、Ala-15和Glu-16，并且SEQ ID NO:36的所述非相互作用面包括SEQ ID NO:36的氨基酸Lys-1、Ser-4、Ala-5、Ala-6、Arg-9、Ile-10和Asp-13。
63.根据权利要求51到62中任一项所述的肽，其中SEQ ID NO:35或36的所述非相互作用面上的0到6个氨基酸被选自由以下组成的群组的氨基酸取代：丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
64.根据权利要求51到62中任一项所述的肽，其中氨基酸B7、B8、B11、B12、B15和B16中的一个或多个被α-甲基化或α-乙基化天然氨基酸取代。
65.根据权利要求51到62中任一项所述的肽，其中氨基酸B7、B8、B11、B12、B15和B16中的一个或多个被选自由以下组成的群组的氨基酸取代：L-丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
66.根据权利要求51到65中任一项所述的肽，其中氨基酸B1、B2、B3、B4、B5、B6、B9、B10、B13和B14中的一个或多个被α-甲基化或α-乙基化天然氨基酸取代。
67.根据权利要求51到65中任一项所述的肽，其中氨基酸B1、B2、B3、B4、B5、B6、B9、B10、B13和B14中的一个或多个被选自由以下组成的群组的氨基酸取代：L-丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
68.根据权利要求51到67中任一项所述的肽，其中将SEQ ID NO:35或36中的0到5个氨基酸从C端去除，或去除并且用1到6个来自由以下组成的群组的氨基酸替换：丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
69.根据权利要求51到68中任一项所述的肽，其中：(i)所述肽的总疏水性相对于SEQID NO:35或36的肽降低；(ii)所述肽的总正电荷相对于SEQ ID NO:35或36的肽降低；或(iii)(i)和(ii)的组合。
70.一种肽，其包含：SEQ ID NO:37中所示的序列的经修饰氨基酸序列，其中SEQ IDNO:37的一个或多个氨基酸被另一氨基酸取代；其中所述经修饰氨基酸序列包括至少一个肽结构稳定化修饰；并且其中所述肽结合且抑制泛素活化酶2(UBA2)。
71.根据权利要求70所述的肽，其中所述肽结构稳定化修饰包括用非天然氨基酸取代SEQ ID NO:35或36的序列的至少两个氨基酸，其中所述非天然氨基酸包含一个或多个烯烃侧链。
72.根据权利要求70所述的肽，其中所述肽结构稳定化修饰为烃装钉/缝合、内酰胺装钉/缝合；UV-环加成装钉/缝合；肟装钉/缝合；硫醚装钉/缝合；双击装钉/缝合；双内酰胺装钉/缝合；双芳基化装钉/缝合；或其中任何两种或更多种的组合。
73.根据权利要求70所述的肽，其中所述肽结构稳定化修饰为缝合。
74.根据权利要求70所述的肽，其中所述肽结构稳定化修饰为装钉。
75.根据权利要求74所述的肽，其中所述装钉位于所述氨基酸序列中的两个位置中的一处或多处，其中所述两个位置是i和i+3；i和i+4；或i和i+7。
76.根据权利要求74或75所述的肽，其中所述装钉包括位于所述两个位置中的每一处的氨基酸取代，其中所述每一处的氨基酸取代为非天然氨基取代，其中所述非天然氨基酸包含一个或多个烯烃侧链。
77.根据权利要求71或76所述的肽，其中包含烯烃侧链的所述非天然氨基酸选自由以下组成的群组：S-戊烯基丙氨酸、R-辛烯基丙氨酸；R-丙烯基丙氨酸、S-戊烯基丙氨酸；R-戊烯基丙氨酸、S-戊烯基丙氨酸；双戊烯基甘氨酸、S-戊烯基丙氨酸、R-辛烯基丙氨酸；和双戊烯基甘氨酸、S-辛烯基丙氨酸和R-辛烯基丙氨酸。
78.根据权利要求70到77中任一项所述的肽，其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由以下组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代：SEQ ID NO:37的Ala-1、Arg-4、Leu-5、Glu-8、Ala-11、Trp-12和Asp-15。
79.根据权利要求70到78中任一项所述的肽，其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由以下组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代：SEQ ID NO:37的Leu-2、Ser-3、Ala-6、Gln-7、Arg-9、Lys-10、Arg-13和Lys-14。
80.根据权利要求70到79中任一项所述的肽，其中被另一氨基酸取代的所述一个或多个氨基酸位于SEQ ID NO:37的E1非相互作用面上。
81.根据权利要求80所述的肽，其中SEQ ID NO:37的所述非相互作用面包括SEQ IDNO:37的氨基酸Ala-1、Arg-4、Leu-5、Glu-8、Ala-11、Trp-12和Asp-15。
82.根据权利要求70到81中任一项所述的肽，其中SEQ ID NO:37的所述非相互作用面上的0到6个氨基酸被选自由以下组成的群组的氨基酸取代：丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
83.根据权利要求70到82中任一项所述的肽，其中SEQ ID NO:37的氨基酸Leu-2、Ser-3、Ala-6、Gln-7、Arg-9、Lys-10、Arg-13和Lys-14中的一个或多个被α-甲基化或α-乙基化天然氨基酸取代。
84.根据权利要求70到82中任一项所述的肽，其中SEQ ID NO:37的氨基酸Leu-2、Ser-3、Ala-6、Gln-7、Arg-9、Lys-10、Arg-13和Lys-14中的一个或多个被选自由以下组成的群组的氨基酸取代：L-丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
85.根据权利要求70到84中任一项所述的肽，其中SEQ ID NO:37的氨基酸Ala-1、Arg-4、Leu-5、Glu-8、Ala-11、Trp-12和Asp-15中的一个或多个被α-甲基化或α-乙基化天然氨基酸取代。
86.根据权利要求70到84中任一项所述的肽，其中SEQ ID NO:37的氨基酸Ala-1、Arg-4、Leu-5、Glu-8、Ala-11、Trp-12和Asp-15中的一个或多个被选自由以下组成的群组的氨基酸取代：L-丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
87.根据权利要求70到86中任一项所述的肽，其中将SEQ ID NO:37中的0到5个氨基酸从C端去除，或去除并且用1到6个来自由以下组成的群组的氨基酸替换：丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
88.根据权利要求70到87中任一项所述的肽，其中：(i)所述肽的总疏水性相对于SEQID NO:37的肽降低；(ii)所述肽的总正电荷相对于SEQ ID NO:37的肽降低；或(iii)(i)和(ii)的组合。
89.一种肽，其包含：SEQ ID NO:38中所示的序列的经修饰氨基酸序列，其中SEQ IDNO:38的一个或多个氨基酸被另一氨基酸取代；其中所述经修饰氨基酸序列包括至少一个肽结构稳定化修饰；并且其中所述肽结合且抑制泛素活化酶6(UBA6)。
90.根据权利要求89所述的肽，其中所述肽结构稳定化修饰包括用非天然氨基酸取代SEQ ID NO:38的序列的至少两个氨基酸，其中所述非天然氨基酸包含一个或多个烯烃侧链。
91.根据权利要求89所述的肽，其中所述肽结构稳定化修饰为烃装钉/缝合、内酰胺装钉/缝合；UV-环加成装钉/缝合；肟装钉/缝合；硫醚装钉/缝合；双击装钉/缝合；双内酰胺装钉/缝合；双芳基化装钉/缝合；或其中任何两种或更多种的组合。
92.根据权利要求89所述的肽，其中所述肽结构稳定化修饰为缝合。
93.根据权利要求89所述的肽，其中所述肽结构稳定化修饰为装钉。
94.根据权利要求93所述的肽，其中所述装钉位于所述氨基酸序列中的两个位置中的一处或多处，其中所述两个位置是i和i+3；i和i+4；或i和i+7。
95.根据权利要求93或94所述的肽，其中所述装钉包括位于所述两个位置中的每一处的氨基酸取代，其中所述每一处的氨基酸取代为非天然氨基取代，其中所述非天然氨基酸包含一个或多个烯烃侧链。
96.根据权利要求90或95所述的肽，其中包含烯烃侧链的所述非天然氨基酸选自由以下组成的群组：S-戊烯基丙氨酸、R-辛烯基丙氨酸；R-丙烯基丙氨酸、S-戊烯基丙氨酸；R-戊烯基丙氨酸、S-戊烯基丙氨酸；双戊烯基甘氨酸、S-戊烯基丙氨酸、R-辛烯基丙氨酸；和双戊烯基甘氨酸、S-辛烯基丙氨酸和R-辛烯基丙氨酸。
97.根据权利要求89到96中任一项所述的肽，其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由以下组成的群组的氨基酸位置处的零、一、二、三、四或五个氨基酸取代：SEQ ID NO:38的Met-1、Ala-2、Ala-3、Ser-4、Leu-6、Asn-9、Leu-10、Arg-12、Leu-13、Ser-15、Arg-16和Cys-17。
98.根据权利要求89到97中任一项所述的肽，其中所述经修饰氨基酸序列包括位于选自由以下组成的群组的氨基酸位置处的零、一或两个保守氨基酸取代：SEQ ID NO:38的Arg-5、Glu-7、Leu-8、Val-11和Leu-14。
99.根据权利要求89到98中任一项所述的肽，其中被另一氨基酸取代的所述一个或多个氨基酸位于SEQ ID NO:38的E1非相互作用面上。
100.根据权利要求99所述的肽，其中SEQ ID NO:38的所述非相互作用面包括SEQ IDNO:38的氨基酸Met-1、Ala-2、Ala-3、Ser-4、Leu-6、Asn-9、Leu-10、Arg-12、Leu-13、Ser-15、Arg-16和Cys-17。
101.根据权利要求89到100中任一项所述的肽，其中SEQ ID NO:38的所述非相互作用面上的0到6个氨基酸被选自由以下组成的群组的氨基酸取代：丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
102.根据权利要求89到101中任一项所述的肽，其中SEQ ID NO:38的氨基酸Arg-5、Glu-7、Leu-8、Val-11和Leu-14中的一个或多个被α-甲基化或α-乙基化天然氨基酸取代。
103.根据权利要求89到101中任一项所述的肽，其中SEQ ID NO:38的氨基酸Arg-5、Glu-7、Leu-8、Val-11和Leu-14中的一个或多个被选自由以下组成的群组的氨基酸取代：L-丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
104.根据权利要求89到103中任一项所述的肽，其中SEQ ID NO:38的氨基酸Met-1、Ala-2、Ala-3、Ser-4、Leu-6、Asn-9、Leu-10、Arg-12、Leu-13、Ser-15、Arg-16和Cys-17中的一个或多个被α-甲基化或α-乙基化天然氨基酸取代。
105.根据权利要求89到103中任一项所述的肽，其中SEQ ID NO:38的氨基酸Met-1、Ala-2、Ala-3、Ser-4、Leu-6、Asn-9、Leu-10、Arg-12、Leu-13、Ser-15、Arg-16和Cys-17中的一个或多个被选自由以下组成的群组的氨基酸取代：L-丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
106.根据权利要求89到105中任一项所述的肽，其中将SEQ ID NO:38中的0到5个氨基酸从C端去除，或去除并且用1到6个来自由以下组成的群组的氨基酸替换：丙氨酸、D-丙氨酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸、丝氨酸、经取代的丙氨酸和甘氨酸衍生物。
107.根据权利要求89到106中任一项所述的肽，其中：(i)所述肽的总疏水性相对于SEQID NO:38的肽降低；(ii)所述肽的总正电荷相对于SEQ ID NO:38的肽降低；或(iii)(i)和(ii)的组合。
108.一种根据权利要求19到50中任一项所述的肽的衍生物，其中所述肽的衍生物包含亲电子弹头。
109.根据权利要求108所述的肽的衍生物，其中所述亲电子弹头位于氨基酸位置A7、A8或A11处。
110.根据权利要求108所述的肽的衍生物，其中所述亲电子弹头位于所述肽的N端。
111.根据权利要求108所述的肽的衍生物，其中所述亲电子弹头不位于所述肽的N端。
112.根据权利要求108到111中任一项所述的肽的衍生物，其中所述亲电子弹头为具有亲电子基团的非天然氨基酸。
113.根据权利要求112所述的肽的衍生物，其中所述具有亲电子基团的非天然氨基酸具有与多肽主链连接的亲电子丙烯酰胺或经取代的丙烯酰胺。
114.根据权利要求113所述的肽的衍生物，其中所述具有亲电子基团的非天然氨基酸选自由以下组成的群组：(S)-1-丙烯酰基吡咯烷-3-甲酰胺；1-丙烯酰哌啶-4-甲酰胺、(R)-1丙烯酰基哌啶-3-甲酰胺；(S)-1-丙烯酰基哌啶-3-甲酰胺；(S)-1-丙烯酰基吡咯烷-2-甲酰胺；(R)-1-丙烯酰基吡咯烷-2-甲酰胺；(E)-4-(二甲氨基)丁-2-烯酰胺；丙烯酰胺；氮丙啶、二氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯烷、咪唑烷、吡唑烷、噁唑烷、异噁唑烷、噻唑烷、异噻唑烷、哌啶、哌嗪、吗啉、硫代吗啉、氮杂环庚烷氮杂环丙烯(azepaneazirine)、二氮杂环丙烯、氮杂环丁二烯、吡咯、咪唑、吡唑、噁唑、异噁唑、噻唑、异噻唑、吡啶、二嗪、噁嗪、噻嗪、苯基吖庚因(苯胺)；萘、蒽、菲、吲哚、异吲哚、吲哚嗪、喹诺酮、异喹啉、喹喔啉、酞嗪、喹唑啉、嘌呤、咔唑、吲唑、苯并咪唑、氮杂吲哚、α-氰基丙烯酰胺、丙炔酰胺、反4-二甲氨基-2-丁酰胺、反4-哌啶基-2-丁酰胺、经取代丙烯酰胺和乙烯基-磺酰胺。
115.根据权利要求112所述的肽的衍生物，其中所述亲电子弹头为端接溴乙酰基的二氨基丁酸或端接丙烯酰胺的二氨基丁酸。
116.根据权利要求112所述的肽的衍生物，其中所述亲电子弹头为半胱氨酸反应性D-六氢烟碱酸部分。
117.根据权利要求112所述的肽的衍生物，其中所述亲电子弹头为半胱氨酸反应性部分。
118.根据权利要求108所述的肽的衍生物，其包含SEQ ID NO:392、428、464、500、680、716、752和788中任一个中所示的序列。
119.根据权利要求108所述的肽的衍生物，其包含SEQ ID NO:680中所示的序列。
120.根据权利要求108所述的肽的衍生物，其包含SEQ ID NO:752中所示的序列。
121.根据权利要求108所述的肽的衍生物，其包含SEQ ID NO:393、429、465、501、681、717、753和789中任一个中所示的序列。
122.根据权利要求108所述的肽的衍生物，其包含SEQ ID NO:367、403、439、655、727和757中任一个中所示的序列。
123.根据权利要求108所述的肽的衍生物，其包含SEQ ID NO:727中所示的序列。
124.根据权利要求108所述的肽的衍生物，其包含SEQ ID NO:833-836和841-844中的任一个中所示的序列。
125.根据权利要求108所述的肽的衍生物，其包含SEQ ID NO:841中所示的序列。
126.根据权利要求108所述的肽的衍生物，其包含SEQ ID NO:842中所示的序列。
127.根据权利要求108所述的肽的衍生物，其包含SEQ ID NO:844中所示的序列。
128.根据权利要求108到127中任一项所述的肽的衍生物，其中所述肽的衍生物与UBA1共价结合。
129.一种药物组合物，其包含根据权利要求19到107中任一项所述的肽或根据权利要求108到128中任一项所述的肽的衍生物和药学上可接受的载体。
130.一种治疗有需要的人类受试者的表达E1或依赖E1的疾病的方法，所述方法包括向所述人类受试者施用治疗有效量的根据权利要求19到107中任一项所述的肽、根据权利要求108到128中任一项所述的肽的衍生物或根据权利要求129所述的药物组合物。
131.根据权利要求130所述的方法，其中所述表达E1或依赖E1的疾病为癌症。
132.根据权利要求130所述的方法，其中所述表达E1或依赖E1的疾病为恶性血液病、实体肿瘤、抗体介导的移植排斥、自身免疫性病症或炎症性病症。
133.一种制造结构稳定化肽的方法，所述方法包括：
(a)提供根据权利要求19到107中任一项所述的肽或根据权利要求108到128中任一项所述的肽的衍生物；和
(b)使所述肽或所述肽的衍生物交联；任选地，其中所述交联是通过RCM反应。
134.根据权利要求133所述的方法，其进一步包括将所述交联的肽配制为药物组合物。
135.一种化合物，其包含具有下式的内部交联序列氨基酸序列，或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0003415339140000231
其中：
每个R1和R2独立地是H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂芳基烷基或杂环基烷基，其中的任一个是经取代的或未经取代的；
每个R3独立地为亚烷基、亚烯基或亚炔基，其中的任一个是经取代的或未经取代的；
每个x独立地是2、3或6；
每个w和y独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20；
z为1或2；和
每个Xaa独立地是氨基酸，
其中交联氨基酸序列相对于SEQ ID NO:4、6或10的序列具有2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代和0、1、2、4或5个氨基酸缺失，
其中所述氨基酸取代中的至少两个是取代为包含烯烃侧链的非天然氨基酸，其中被取代氨基酸在SEQ ID NO:4、6或10中间隔2、3或6个氨基酸；
其中所述交联氨基酸序列具有α螺旋构象，和
其中所述化合物以剂量依赖性方式抑制E1-E2相互作用和/或抑制E10介导的硫酯转移到E2；和
任选地其中至少一个氨基酸序列被可与所述人E1中的半胱氨酸残基形成共价键的反应性基团取代，并且任选地其中所述反应性基团为具有亲电子基团的非天然氨基酸或N端处的亲电子化学帽。
136.根据权利要求135所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述缺失位于N端和/或C端。
137.根据权利要求135或136所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述氨基酸取代包括SEQ ID NO:4、6或10中不涉及与E1相互作用的位置。
138.根据权利要求135所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述交联氨基酸序列具有含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代的SEQ ID NO.:132、133、107、680、727、752、841、842或844中的任一个的序列，其中这些肽中具有含烯烃侧链的所述非天然氨基酸的位置未被取代。
139.根据权利要求138所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中预测与所述E1直接相互作用的氨基酸未被取代或被丙氨酸或保守氨基酸取代。
140.根据权利要求138或139所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中预测不与所述E1直接相互作用的氨基酸是被取代的。
141.根据权利要求135-140中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述药学上可接受的盐为乙酸盐、硫酸盐或氯化物。
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