BR0001870B1

BR0001870B1 - Peptídeo, processo de obtenção de peptídeo, formulação compreendendo peptídeo, método de prevenção de crescimento de parasitas, fungos e bactérias, método para inativar a endotoxina de bactérias gram-negativas

Info

Publication number: BR0001870B1
Application number: BRPI0001870-8A
Authority: BR
Inventors: Philippe Bulet; Sirlei Daffre; Silva Junio Pedro Ismael Da
Priority date: 2000-05-29
Filing date: 2000-05-29
Publication date: 2014-02-25
Also published as: AU6367601A; US7723468B2; BR0001870A; US20030186854A1; US20060276380A1; WO2001092290A2; WO2001092290A3

Description

PEPTÍDEO, PROCESSO DE OBTENÇÃO DE PEPTÍDEO, FORMULAÇÃO

COMPREENDENDO PEPTÍDEO, MÉTODO DE PREVENÇÃO DE

CRESCIMENTO DE PARASITAS, FUNGOS E BACTÉRIAS, MÉTODO PARA INATIVAR A ENDOTOXINA DE BACTÉRIAS GRAM -NEGATIVAS. A presente invenção refere-se a peptídeos pequenos, com. baixa atividade hemolítica, que apresentam atividades antiparasítica, antifúngica e antibacteriana de mesma ordem de grandeza.

Muitos peptídeos extraídos de animais e plantas tem revelado atividade contra infecção. O pedido PCT WO9503325 publicado em 02 de fevereiro de 1995 menciona peptídeos denominados protegrinas, além de uma revisão da literatura acerca deste assunto, incluindo referências sobre taquiplesinas, polifemusinas, defensinas, β-defensinas, e defensinas de insetos. A patente americana US5.994.306 se refere a protegrinas mais específicas. O pedido PCT WO9702287 publicado em 23 de janeiro de 1997 revelam peptídeos denominados parevinas e taquitegrinas, semelhantes às protegrinas exceto pelas cisternas nas posições 6 e 15. A presente invenção tem por escopo novos peptídeos pequenos que, em alguns aspectos são semelhantes às protegrinas, às taquitegrinas e às parevinas, porém apresentam atividades antiparasíticas, antibacterianas e antifúngicas de mesma ordem de grandeza, além de baixa atividade hemolítica, assim como processos de obtenção e suas aplicações. Trata-se de um peptídeo denominado gomesina, configurado com uma estrutura tipo grampo formado por duas folhas beta-pregueadas antiparalelas unidas por uma dobra tipo beta, contendo 4 resíduos invariáveis de cisteína que formam duas pontes de dissulfeto, com a seguinte formula geral(l)· FÓRMULA GERAL (1) onde: - Zi é: - na ausência de X19i um resíduo com amino terminal livre ou com amino grupo terminal bloqueado, através de metilação, carbamilação e acilação e preferencialmente sendo ácido piroglutâmico, propiciando resistência à atividade de proteases; - na presença de X19, um resíduo básico, hidrofóbico, polar/grande ou pequeno, com amino grupo terminal livre disponível para o fechamento das pontas da molécula, por exemplo glutamina. - C2, C6, Cu e C15 são independentemente cisteína, homocisteína ou penicilamina; - Pje P2são pontes de dissulfeto entre C2 e C1SieC6e Cn> respectivamente; - A3, A4i A5í A12, A13i A14, A16, A17 são independentemente resíduos básicos, hidrofóbicos, polar/grandes ou pequenos, sendo: As A4 e A16 preferencialmente resíduos de aminoácidos básicos, - A5, A12 e A14 preferencialmente resíduos hidrofóbicos, e - A17 preferencialmente resíduo pequeno, - A7 até A10 são resíduos capazes de efetuar um dobra do tipo beta, e podem ser independentemente básicos, hidrofóbicos, polar/grandes ou pequenos, sendo ao menos um deles básico e ao menos um deles hidrofóbico, sendo preferencialmente A8e A10 resíduos de aminoácidos básicos, - A18 é: - na ausência de X19: um resíduo básico, hidrofòbico, polar/grande ou pequeno, preferencialmente básico, tendo um grupo carboxila livre ou formando um sal aceitável como potássio, sódio, cálcio, magnésio ou de outro de ion inorgânico ou orgânico, ou ser amidado por uma amina de fórmula NH3 ou RNH2 ou R2NH, onde R é, independentemente, uma hidrocarbila de um a seis carbonos saturada ou insaturada, por exemplo metila, etila, isopropila, t- butila, n-pentila, ciclohexila, 2-ciclohexenila, 3-ciclohexenila, 4- hexinila, e semelhantes; - na presença de X19: um resíduo básico, hidrofòbico, polar/grande ou pequeno, preferencialmente básico, cujo grupo carboxila terminal livre está envolvido no fechamento de pontas da molécula do peptídeo - X19 pode estar ausente ou presente, e estando presente é ou uma ligação química entre Zj e A18 ou uma molécula ou estrutura química presente entre Zx e A1S e ligada a ambos, fechando as pontas da cadeia de aminoácidos do peptídeo da invenção. - entre cerca de 15% e cerca de 50% de todos os resíduos de aminoácidos devem ser básicos; apresentar carga positiva de ao menos +1 em pH fisiológico.

Alguns dos peptídeos da invenção podem ser obtidos por extração de animais, por exemplo da aranha Acanthoscurria gomesiana, que em função dessa origem denominam-se gomesinas. De outra forma podem ser produzidos sinteticamente, e quando contém somente aminoácidos geneticamente codificados podem ser produzidos recombinantemente. Us peptídeos da invenção tem utilidade no tratamento e prevenção de infecção de animais e plantas, provocadas por parasitas, bactérias e/ou fungos. Em outro aspecto, o DNA codificador dos peptídeos da invenção pode ser expresso in situ, em animais ou plantas, para combater infecções. Os peptídeos da invenção podem ser também usados como padrões em testes antimicrobianos e na ligação com endotoxinas.

Os peptídeos da invenção podem ser obtidos recombinantemente pro expressão do cDNA codificador do peptídeo em sistemas heterólogos bem conhecidos na literatura. A invenção também é direcionada para composições úteis contra bactérias, fungos e parasitas, utilizadas no combate a tais organismos.

Os peptídeos da invenção diferenciam-se genericamente de outros conhecidos no estado da técnica, entre outras razões, por apresentar as seguintes qualidades até agora não encontradas concomitantemente: estrutura pequena, portanto com expectativa de melhor distribuição nos tecidos, sendo menos imonogênicos; - ter atividade bactericida, fungicida e parasítica, de aproximadamente mesma ordem de grandeza (enquanto que protegrinas, por exemplo, são menos eficientes contra fungos); - ter baixa atividade hemolítica, principalmente na configuração cíclica de pontas fechadas.

Os peptídeos da invenção contem uma dobra tipo beta conectando dua folhas beta-pregueadas. Como sabe um técnico no assunto, uma dobra tipo beta se refere tipicamente a um segmento de um peptídeo contendo resíduos de quatro aminoácidos que reverte a direção da cadeia dos aminoácidos. As cisteínas nas posições 2, 6, 11 e 15 propiciam de maneira marcante a existência da dobra do tipo beta pela formação das pontes de dissulfeto entre si, ou seja, entre C2 e C15> eC6e Cn, Conforme conhecido na literatura, as ditas pontes de dissulfeto podem ser substituídas por pontes de lactama, ou qualquer outra que exerça função equivalente.

Os peptídeos da invenção podem, em uma alternativa de realização, apresentar estrutura cíclica de pontas fechadas da cadeia peptídica. A metodogia de obtenção de peptídeos cíclicos fechados é conhecida no estado da técnica.

Nos peptídeos não ciclizados, como é do conhecimento do técnico do assunto, os terminais amino e carboxi podem estar derivatizados. Nos peptídeos da invenção, o amino grupo terminal pode estar metilado, carbamilado, acilado ou sob forma de ácido piroglutâmico. Os peptídeos da invenção podem, através da adição, na carboxila terminal das moléculas, estar sob forma de sais inorgânicos como cloreto, brometo, iodeto, fluoreto, sulfato, nitrato, fosfato, etc., ou orgânicos como acetato, formato, benzoato, etc. A aceitabilidade de cada um dos ditos sais é dependente da utilização desejada, fato corriqueiramente entendido. A carboxila terminal pode também apresentar-se amidaa. As reações de derivação são conhecidas.

Conforme utilização neste texto, os resíduos de aminoácidos dos peptídeos da invenção são definidos em termos das seguintes características: - ácido: o resíduo tem uma carga negativa devido à perda do ion H em pH fisiológico e o resíduo é atraído por solução aquosa de modo a buscar posições superficiais na conformação de um peptídeo no qual está contido quando este está em meio aquoso em pH fisiológico;

básico: o resíduo tem uma carga positiva devido à associação com o ion H em pH fisiológico, e o resíduo é atraído por solução aquosa de modo a buscar posições superficiais na conformação de um peptídeo no qual está contido quando este está em meio aquoso em pH fisiológico; - hidrofóbico: o resíduo não está carregado em pH fisiológico e é repelido por solução aquosa de modo a buscar posições mais internas na conformação de um peptídeo no qual está contido quando o peptídeo está em meio aquoso; polar/grande: o resíduo não está carregados em pH fisiológico, mas não é suficientemente repelido por solução aquosa de modo que poderia buscar posições mais internas na conformação de um peptídeo no qual está contido quando o peptídeo está em meio aquoso; pequeno: resíduo neutro uma vez que suas cadeias laterais não são suficientemente grandes, mesmo se grupos polares estão ausentes, para conferir hidrofobicidade. Contém 4 carbonos ou menos quando pelo - menos um grupo polar aparece na cadeia lateral, e 3 carbonos ou menos quando isso não acontece.

Com relação a aminoácidos de proteínas de ocorrência natural, conforme utilização nos termos deste texto, é utilizada a classificação abaixo. - ácidos: ácido aspártico, ácido glutâmico - básicos: - não cíclicos □ arginina, lisina - cíclicos: histidina pequenos: glicina, serina, alanina, treonina - polar/grande: asparagina, glutamina - hidrofóbicos: tirosina, valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalamna, triptofano.

Aminoácidos comumente encontrados, não codificados no codigo genético, ou quaisquer outros que se adequem às definições apresentadas podem ser equivalentemente utilizados nos peptideos da invenção.

Cisteína e outros resíduos de aminoácidos contendo sulfidrila □ SH não estão contemplados na lista acima uma vez que sua capacidade de formar pontes de dissulfeto provendo estrutura secundária é crítica para os compostos da presente invenção.

Sem criar qualquer limite ao escopo da invenção, entende-se que a ação do peptídeo da invenção contra microrganismos e parasitas é privilegiada em presença de maior número de resíduos de aminoácidos hidrofobicos.

Dentro de formas particulares de realização, os componentes da fórmula geral (1) do peptídeo da invenção são: a) estando X19 ausente - Z1 é ácido piroglutâmico; - A3 A4, Ag, A10 e A16 são resíduos básicos, preferencialmente sendo A3j A4i A10, e A16 arginina, e A8 lisina; - A18 é um resíduo básico, preferencialmente arginina amidada, opcionalmente não amidada; - A5, A7i A12, A14 são resíduos hidrofóbicos, preferencialmente sendo A5 leucina, A,eAu tirosina, e A12valina; - A9 é um resíduo polar/grande, preferencialmente glutamina; - A13 e A17 são resíduos pequenos, sendo preferencialmente A1S treonina e A17 glicina. b) estando X19 presente, e sendo os componentes do peptídeo da invenção os mesmos que acima, exceto: - Z, é um resíduo de aminoácido básico, hidrofóbico, polar/grande ou *-*1 pequeno com amino grupo terminal livre, por exemplo glutamina. - A18é um resíduo básico, com grupo carboxila terminal livre envolvido na fechamento das pontas do peptídeo. X19 é uma estrutura química presente entre Z7 e Alg, ligada a ambos, fechando as pontas da cadeia do peptídeo EXEMPLOS DE PROCESSOS DE OBTENÇÃO DOS PEPTÍDEOS DA

INVENÇÃO 1) EXTRAÇÃO DA GOMESINA A PARTIR DA ARANHA Acanthoscurria gomesiana.

Com o processo descrito a seguir obtém-se a gomesina que corresponde particularmente à seguinte estrutura, dentro da fórmula geral (1), incluindo as duas pontes de dissulfeto (representação espacial esquemática apenas para fins ilustrativos): onde: Z = ácido piroglutâmico C = cisteína R = arginina L = leucina Y = tirosina K = lisina Q = glutamina V = valina T = treonina G = glicina Ra - arginina com o grupo carboxila terminal amidado Hemolinfa (aproximadamente 0,4ml/aranha) de animais de ambos os sexos em diferentes estágios de desenvolvimento foi coletada a partir de animais pré-resfriados por punção cardíaca com seringa apirogênica, e coletada em presença de tampão de citrato de sódio 30mmol/L, pH 4.6, contendo NaCl 450mmol/L EDTA 10 mmol/L e glicose lOOmmol/L. Os hemócitos são removidos do plasma por centrifugação a 800 x g, durante 10 minutos a 4°C. Hemócitos íntegros são lavados uma vez com tampão de citrato de sódio e lisados por concentração em uma centrífuga a vácuo.

Após a concentração, os hemócitos são ressuspendidos em um certo volume de ácido acético 2M suplementados com aprotidina (20pg/ml) como inibidor de protease, foram homogeneizados em um equipamento Dounce (máximo 152 μ, mínimo 76μ). Uma segunda homogeneização é efetuada por sonicação (3 x 30s) em intensidade média, mantido em um banho de água e gelo, e a extração efetuada durante 30 minutos a 4°C sob agitação suave. O material sobrenadante, obtido por centrifugação a 13.800 x g durante 30 minutos a 6°C, é diretamente submetido a pré-purificação por extração em fase sólida.

Os extratos de ácidos citosolico e organela são aplicados em colunas de fase sólida ligadas em série, equilibradas em água acidificada (0,05 /o acido trifluoroacético). Três eluções são efetuadas sucessivamente com acetonitrila 5%, 40% e 80% em água acidificada. A fração 40% de acetonitrila é concentrada em centrifuga a vacuo, reconstituída com água MilliQ e aplicada a cromatografia de fase reversa numa cuja coluna é equilibrada com acetonitrila 2% em água acidificada. Efetua-se eluição com um gradiente linear de acetonitrila de 2 a 60% em agua acidificada durante 120 min., sob fluxo de l,3ml/min. A fração ativa contra a bactéria testada Micrococcus luteus dos hemócitos (AGH2) é adicionalmente purificada por cromatografia de filtração. A eluição é efetuada sob condições isocráticas com acetonitrila 30% em água acidificada com fluxo de 0,4ml/min, Efetua-se purificação com HPLC (cromatografia líquida de alta pressão) em temperatura ambiente. O efluente da coluna é monitorado pela absorbância em 225 nm. Frações correspondentes aos picos de absorbância são coletadas, concentradas a vácuo e reconstituídas em água MilliQ.

Atividade antibateriana das frações coletadas na cromatografia é determinada pelo ensaio líquido de inibição de crescimento de acordo com J.

Biol. Chem., 268, 14893-14897 (1993) usando Micrococcus luteus como bactéria teste, 2) SÍNTESE DA GOMESINA

Peptídeos da invenção foram sintetizados de acordo com procedimento descrito em J.BioLChem., 271, 29537-29544 (1996), de acordo com procedimento Fmoc clássico.

Para fins de comparação com a gomesina obtida por extração conforme mencionado mais atrás, foi sintetizado o seguinte peptídeo: onde a única diferença em relação à gomesina natural mencionada mais atrás é a arginina não amidada em uma das pontas da cadeia. A figura 1 em anexo ilustra uma tabela relativa ao espectro de atividade da gomesina, tanto forma não amidada quanto amidada, contra bactéria, fungos e leveduras. A avaliação das atividades bactericida e fungicida foi realizada de acordo com o descrito em J.BioLChem., 271, 29537-29544 (1996).

Na tabela n.d. significa “não detectado” para a faixa de concentrações testadas até 100 OM e 50 DM de gomesina, e n.m. significa não medido.

Verifica-se pela tabela que os peptídeos da invenção tem propriedades antibacterianas. A gomesina ilustrada (do exemplo 2 acima)tem efeito contra a a maioria das cepas testadas, sendo que 24 das 27 cepas foram suscetíveis à gomesina em MIC (mínima concentração inibitória) abaixo de 1,6 μΜ para metade delas, em concentrações entre 1,6 e 6,25 μΜ (42%).

Também se verificam propriedades bactericidas nos peptídeos da invenção, por exemplo pelas mortandade de Micrococcus luteus e Entamoeba coli D22 ilustrada na figura 2 em anexo, 10 μΜ de gomesina do exemplo 2 (linha sólida) ou água (linhas pontilhadas) foram adicionadas a uma cultura em fase exponencial de M. luteus (círculos) ou E. coli (triângulos). Foram removidas alíquotas de tempos em tempos, e o número de CFU (unidades de formação de colônias) foi determinado em placas de agar Luria Bertani após incubação durante uma noite a 37°C. A velocidade de acão da gomesina, como se pode ver após aproximadamente 1 minuto, é uma das vantagens da invenção.

ATIVIDADE ANTIPARASITICA

Dentro de um exemplo de atividade antiparasítica, foi avaliada a viabilidade celular de Leishmania (leishmania) amazonensis (MRPO/BR/72/M 1841-LV-79) utilizando o ensaio de MTT [brometo de 3- (4,5 -dimetiltiazolila-2) -2,5 -difenil tetrazolio] conforme descrito em J.

ImmunoL Methods 65,55-63 (1983) e adaptado para Leishmani spp, conforme J. ImmunoL Methods 127,11-18 (1990).

Quantidades entre 0,1-100 μΜ foram testadas contra o parasita Leishmania (leishmania) amazonensis. Após uma hora de incubação, verificou-se que a viabilidade do parasita era dependente da concentração da gomesina utilizada, conforme ilustra a figura 3 anexa. Naquele gráfico gomesina sintética do exemplo 2, mostrado como barras sólidas, e um fragmento de hemoglobina (33-61 de alfa-hemoglobina bovina) mostrado como barras hachuradas utilizada como controle positivo, foram incubadas com os parasitas por lh a 22°C em concentrações entre 0,3 e 80 μΜ. A viabilidade do parasita (%) foi medida utilizando o ensaio de MTT descrito em J. ImmunoL. Methods 65,55-63 (1983) e adaptado para Leishmania spp, conforme J. ImmunoL. Methods 127,11-18 (1990).

ANTICORPOS

Anticorpos aos peptídeos da presente invenção podem ser produzidos utilizando técnicas imunológicas padrões para a produção de anticorpos policlonais, e se desejado imortalizando as células produtoras de anticorpos do hospedeiro imunicado para fontes de produção de anticorpos monoclonais, FORMULAÇÕES CONTENDO GOMESINA

Os peptídeos da invenção podem ser usados numa série de composições que atuam contra bactérias, fungos e parasitas. Podem ser utilizados individualmente, em mistura com outros peptídeos da invenção, em mistura com outros agentes microbicidas, ou com ambos, e em conjunto com outros ingredientes conhecidos na técnica, por exemplo princípios ativos do tipo eritromicina, tetraciclina, azitromicina, cefalosporinas, etc., e ingredientes em geral como carreadores, diluentes, excipientes, etc.

Os peptídeos da invenção podem ser formulados para uso farmacêutico ou veterinário.

Claims

1. PEPTIDEO caracterizado pela SEQ ID NO: 1 correspondente à fórmula geraP Onde: Z = ácido piroglutâmico C = cisteína R = arginina L = leucina Y = tirosina K = lisina Q - glutamina V - valina T = treonina G = glicina R = arginina com o grupo carboxila terminal não amidado.

2. PROCESSO DE OBTENÇÃO DE PEPTÍDEO definido na reivindicação 1 caracterizado pelo fato de ser obtido pela técnica de síntese química Fmoc.

3. “PROCESSO DE OBTENÇÃO DO PEPTÍDEO onde: Z = ácido piroglutâmico, C = cisteína, R = arginina, L = leucina, Y = tirosina, K = lisina, Q = glutamina, V = valina, T = treonina, G = glicina e Ra = arginina com o grupo carboxila terminal amidado, caracterizado por compreender as etapas de: (i) Coletar a hemolinfa da Aranha Acanthoscurria gomesiana (ii) Separar os hemócitos presentes na hemolinfa; (iii) Obter um extrato ácido dos hemócitos; (iv) Isolar o peptídeo a partir do extrato (iii).

4. PROCESSO de acordo com a etapa (iv) da reivindicação 3 caracterizado pelo fato do isolamento ser preferencialmente por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).

5. FORMULAÇÃO COMPREENDENDO PEPTÍDEO para combate à infecções em humanos, animais e plantas, principalmente no combate à bactérias, fungos e parasitas, caracterizado pelo fato de compreender o peptídeo descrito na reivindicação 1 e outros componentes farmaceuticamente aceitáveis.

6. FORMULAÇÃO COMPREENDENDO PEPTÍDEO para combate à infecções em humanos, animais e plantas, principalmente no combate à bactérias, fungos e parasitas, caracterizado pelo fato de compreender o peptídeo obtido conforme reivindicação 3 combinado a outros princípios ativos utilizados farmaceuticamente contra infecções.

7. FORMULAÇÃO de acordo com a reivindicação 6 caracterizada pelo fato do peptídeo ser combinado à eritromicina, tetraciclina, azitromicina, cefalosporina ou outros ativos que possuam propriedade antibiótica.

8. MÉTODO DE PREVENÇÃO DE CRESCIMENTO DE FUNGOS E / BACTÉRIAS caracterizado por ser realizado por ensaio de inibição de crescimento em meio líquido na presença do peptídeo descrito na reivindicação 1.

9. MÉTODO DE PREVENÇÃO DE CRESCIMENTO DE PARASITAS caracterizado por ser realizado pelo ensaio de brometo de 3-(4,5- dimetiltiazolila-2)-2,5-difenil tetrazolio na presença do peptídeo descrito na reivindicação 1.

10. MÉTODO DE PREVENÇÃO DE CRESCIMENTO DE PARASITAS de acordo com a reivindicação 9 caracterizado pelo fato de que o parasita é preferivelmente um protozoário.

11. MÉTODO DE PREVENÇÃO DE CRESCIMENTO DE PARASITAS de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo fato de que o parasita é preferivelmente uma Leishmania.

12. MÉTODO PARA INATIVAR A ENDOTOXINA DE BACTÉRIAS GRAM -NEGATIVAS caracterizado por ser realizado por ensaio de inibição de crescimento em meio líquido na presença do peptídeo descrito na reivindicação 1.