JP2022530853A - 構造的に安定化されたペプチドによるユビキチンおよびユビキチン様e1活性化酵素の選択的標的化 - Google Patents
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Abstract
本開示は、ユビキチン活性化酵素(E1)を標的とするための構造的に安定化されたおよび/または弾頭部を有する構造的に安定化されたペプチド阻害剤を特徴とする。E1を発現するがんもしくは疾患またはE1に依存するがんもしくは疾患の処置において、このような構造的に安定化されたペプチドおよび弾頭部を有する構造的に安定化されたペプチドを使用する方法も開示される。E1を発現する疾患またはE1に依存する疾患の処置のための、このような構造的に安定化されたおよび/または弾頭部を有する構造的に安定化されたペプチドを含む併用療法も提供される。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2019年4月18日に出願した米国仮特許出願第62/835,721号の優先権の利益を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
連邦政府から資金提供を受けた研究に関する記載
本出願は、2019年4月18日に出願した米国仮特許出願第62/835,721号の優先権の利益を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
連邦政府から資金提供を受けた研究に関する記載
本発明は、国立衛生研究所から授与された助成金番号R35 CA197583およびF30 CA221087の下で、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
配列表への言及
配列表への言及
本出願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含有し、ここに参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。前記ASCIIコピーは、2020年4月17日に作成され、00530-0348WO1_SL.txtという名称であり、720,896バイトのサイズである。
技術分野
技術分野
本開示は、ユビキチンおよびユビキチン様E1活性化酵素を標的とする構造的に安定化されたペプチド、ならびにがんおよび病的細胞の生存に関わる他の疾患の処置において、このようなペプチドを使用するための方法に関する。
ユビキチン-プロテアソームシステム(UPS)は、細胞内タンパク質分解を担う高度に調節された酵素ネットワークである。ユビキチン活性化酵素(E1)は、ユビキチン結合酵素(ubiquitin conjugating enzyme)(E2)へのユビキチン(Ub)の受け渡しを触媒する。E1は、最初に、UbのC末端のアデニル化を触媒し、次いで、UbのC末端とE1の触媒システインとの間の高エネルギーチオエステル結合を形成することによって、Ubを活性化する。次いで、E1は、E2に結合し、UbをE1の触媒システインからE2の触媒システインに転移することによって、E2への受け渡しを行う。E2は、次に、ユビキチンリガーゼ(E3)および基質タンパク質と複合体を形成し、UbのC末端のカルボキシル基を共有結合により基質タンパク質に転移する。標的タンパク質に対する単一および複数のUb結合の多様な構成は、タンパク質の機能を調節しタンパク質をプロテアソーム分解の標的とする複雑なコードを表す。E3活性をリダイレクトする免疫調節イミド薬(IMiD)およびプロテアソーム阻害剤(例えば、多発性骨髄腫に関するボルテゾミブ)を含む、UPSを標的とするいくつかの薬物が、多発性骨髄腫およびマントル細胞リンパ腫において臨床的に成功している。
ヒトゲノムは、600種類を超えるユビキチンE3酵素、おおまかに40種のユビキチンE2酵素、および2種のみのユビキチンE1酵素、すなわちUBA1およびUBA6を含有する。UBA6は、1つのユビキチンE2(USE1)のみに対するE1であるが、UBA1は、他のユビキチンE2すべてに対するE1であり、それに対応して細胞ユビキチンの99%より多くを活性化する(Jin et al., Nature, 447: 1135-1138 (2007))。UPSシステム全体は、ほぼ完全にUBA1に依拠するため、UBA1の阻害によって、通常分解される基質の安定化、小胞体ストレス、および細胞周期停止がもたらされる(Hyer et al., Nature Medicine, 24(2):186-193 (2018))。臨床グレードのUBA1阻害剤であるTAK243/MLN7243が開発され、固形腫瘍および多発性骨髄腫の前臨床マウスモデルにおいて高度に有効であることが示されており(Hyer et al., Nature Medicine, 24(2):186-193 (2018))、進行性固形腫瘍に関する第1相臨床試験を最近になって完了させた(NCT02045095)。しかし、ごく最近の研究によって、薬物の作用機序に対する点変異に基づく耐性機序が特定され(Barghout et al., Leukemia, 2018 Jun 8. doi: 10.1038/s41375-018-0167-0)、E1酵素の標的化阻害に関する潜在的な代替様式に対する必要性およびその新規性が強調されている。
ユビキチンシステムと並行して、いくつかの他のユビキチン様タンパク質(UBL)は、基質タンパク質に共有結合し、種々の運命に向けてのシグナルとなる。これらのUBLは、それら自体の活性化酵素および結合酵素を有する。ユビキチン結合システムに対して最も高い相同性を示すUBLには、NEDD8およびSUMOが含まれる(Hochstrasser, Nature, 458: 422-429 (2009))。NEDD8およびSUMOに対するE1は、それぞれ、ヘテロ二量体複合体であるUBA3-NAE1およびUBA2-SAE1である。MLN7243に類似する機序を有するUBA3-NAE1(MLN4924/ペボネジスタット)およびUBA2-SAE1(ML-792)の阻害剤が開発されている(Soucy et al., Nature, 458(7239):732-736 (2009);He et al., Nat Chem Biol., 13(11):1164-1171 (2017))。NEDD8は、カリン-RINGユビキチンE3リガーゼの活性を制御し、それに対応して、MLN4924は、カリン-RING媒介性タンパク質代謝回転の阻害によって、その治療効果を発揮する。SUMOは、有糸分裂の調節を含む複数の細胞の役割を有し、実際に、ML-792は、有糸分裂の混乱を引き起こす。両分子は、in vitroで、強力な抗がん活性を示し、MLN4924は、現在、固形腫瘍および血液悪性腫瘍に関する複数の第2相および第3相試験中である(NCT03268954、NCT02610777、NCT03228186、NCT03238248、NCT03330821、NCT03319537)。
MLN7243、MLN4924、およびML-792は、それぞれ、UBA1、UBA3、およびUBA2のATP結合部位に結合するアデノシルスルファメート(adenosyl sulfamate)である。ATP競合阻害剤に対するがん細胞耐性は、標的酵素ATP結合部位での、またはその周辺での変異によって発生することが多く(Krishnamurty and Maly, ACS Chem Biol., 5(1):121-138 (2010));実際に、がん細胞における選択圧によって、UBA3A171T、UBA3A171D、UBA3I310N、およびUBA3Y352Hを含むUBA3の変異体バージョンを発現するクローン集団の正の選択を介して、経時的にMLN4924感度の低下をもたらす(Milhollen et al., Cancer Cell, 21(3):388-401 (2012);Toth et al., Cell Rep., 1(4):309-316 (2012);Xu et al., PLoS One, 9(4):e93530 (2014))。UBA1A580T、UBA1A580S、およびUBA1Y583Cは、同様に、MLN7243に耐性であり(Misra et al., Structure, 25(7): 1120-1129 (2017)、Barghout et al., Leukemia, 2018 Jun 8. doi: 10.1038/s41375-018-0167-0)、UBA2S95N,M97Tは、ML-792に耐性である(He et al., Nat Chem Biol., 13(11):1164-1171 (2017))。よって、これらの阻害剤の初期の成功にも関わらず、活性部位変異による耐性の明らかな脅威によって、血液悪性腫瘍および固形腫瘍の処置に関するこれらの酵素の代替の阻害様式の開発が必要とされる。今日までに、ユビキチンE1活性化酵素阻害の代替様式を示す他の薬物リード化合物は開発されていない。
MLN7243、MLN4924、およびML-792は、それぞれ、UBA1、UBA3、およびUBA2のATP結合部位に結合するアデノシルスルファメート(adenosyl sulfamate)である。ATP競合阻害剤に対するがん細胞耐性は、標的酵素ATP結合部位での、またはその周辺での変異によって発生することが多く(Krishnamurty and Maly, ACS Chem Biol., 5(1):121-138 (2010));実際に、がん細胞における選択圧によって、UBA3A171T、UBA3A171D、UBA3I310N、およびUBA3Y352Hを含むUBA3の変異体バージョンを発現するクローン集団の正の選択を介して、経時的にMLN4924感度の低下をもたらす(Milhollen et al., Cancer Cell, 21(3):388-401 (2012);Toth et al., Cell Rep., 1(4):309-316 (2012);Xu et al., PLoS One, 9(4):e93530 (2014))。UBA1A580T、UBA1A580S、およびUBA1Y583Cは、同様に、MLN7243に耐性であり(Misra et al., Structure, 25(7): 1120-1129 (2017)、Barghout et al., Leukemia, 2018 Jun 8. doi: 10.1038/s41375-018-0167-0)、UBA2S95N,M97Tは、ML-792に耐性である(He et al., Nat Chem Biol., 13(11):1164-1171 (2017))。よって、これらの阻害剤の初期の成功にも関わらず、活性部位変異による耐性の明らかな脅威によって、血液悪性腫瘍および固形腫瘍の処置に関するこれらの酵素の代替の阻害様式の開発が必要とされる。今日までに、ユビキチンE1活性化酵素阻害の代替様式を示す他の薬物リード化合物は開発されていない。
Jin et al., Nature, 447: 1135-1138 (2007)
Hyer et al., Nature Medicine, 24(2):186-193 (2018)
Barghout et al., Leukemia, 2018 Jun 8. doi: 10.1038/s41375-018-0167-0
Soucy et al., Nature, 458(7239):732-736 (2009)
He et al., Nat Chem Biol., 13(11):1164-1171 (2017)
Krishnamurty and Maly, ACS Chem Biol., 5(1):121-138 (2010)
したがって、これらのユビキチンおよびユビキチン様活性化酵素の新たな阻害剤に対する需要が存在する。
E1は、最初に、UbのC末端のアデニル化を触媒し、次いで、UbのC末端とE1の触媒システインとの間の高エネルギーチオエステル結合を形成することによって、Ubを活性化する。次いで、E1は、E2に結合し、UbをE1の触媒システインからE2の触媒システインに転移することによって、E2への受け渡しを行う。E2は、次に、ユビキチンリガーゼ(E3)および基質タンパク質と複合体を形成し、UbのC末端のカルボキシル基を共有結合により基質タンパク質に転移する。E1とE2との間の相互作用は、タンパク質表面積の3000Å2を埋め、そのうちの1000Å2は、E2のヘリックスA(E2 hA)とE1ユビキチンフォールドドメイン(E1 UFD)との間の界面に埋もれている。E1とE2 hAとの間の相互作用は、E1-E2遭遇複合体(encounter complex)の形成において重要である。本開示は、例えば、E1-E2相互作用の競合的阻害によって(例えば、表1~5のE1およびE2を参照されたい)、E1の直接的阻害剤として作用し得る、E2 hAを模倣する、構造的に安定化された(例えば、ステープル化(stapled))アルファ-ヘリックスペプチド(例えば、配列番号1~37、39、55~63、または792~806のステープル化バージョン(stapled version))を提供する。ある特定の態様では、構造的に安定化された(例えば、ステープル化)E2 hAペプチドは、E1 UFD(例えば、配列番号845のアミノ酸950~1058;配列番号846のアミノ酸444~552;配列番号847のアミノ酸445~561;配列番号848のアミノ酸950~1052;または配列番号849のアミノ酸911~1012)に結合する。一部の場合には、構造的に安定化された(例えば、ステープル化)E2 hAペプチドは、配列番号1~37、39、55~63、または792~806のいずれか1つの中に1~10(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)個のアミノ酸置換を有する。ある特定の例では、ペプチドまたは構造的に安定化されたペプチド内にメチオニンが存在する場合、メチオニンはノルロイシンで置換されている。一部の場合には、構造的に安定化された(例えば、ステープル化)ペプチドは、N末端またはC末端に1~5個の欠失を有する。これらの構造的に安定化されたバリアントE2 hAペプチドは、E1-E2相互作用を阻害する。一部の場合には、これらのペプチドは、用量依存的に、E2へのE1媒介性チオエステル転移を阻害する。本開示は、同族E1に共有結合により結合し得る、本明細書に記載の安定化された(例えば、ステープル化)E2 hAペプチドの弾頭部(warhead)を有するバージョンも提供する。本開示は、E1に依存するがんおよび/またはE1を発現するがん(例えば、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、または以下の本明細書に記載の他の特定のがん)ならびに病的細胞の生存に関わる他の疾患(例えば、抗体媒介性移植拒絶、自己免疫障害、または炎症性障害)の処置において、単独で、または他の治療剤と組み合わせて、このような安定化されたペプチド(またはその弾頭部を有するバージョン)を使用するための方法も特徴とする。
構造的安定化(例えば、内部架橋、例えば、ステープリング)を本明細書に記載のE2 hAペプチドに導入するための修飾は、(i)E2 hAの同族E1酵素との直接相互作用に関与しないE2 hAの面、(ii)E2 hAの極性面と非極性面の界面、および/または(iii)E2 hAの同族E1酵素と直接相互作用するE2 hAの面に位置し得る。ある特定の例では、本明細書に記載の構造的に安定化された(例えば、内部で架橋した、例えば、ステープル化)E2 hAペプチドは、1個または複数(例えば、1、2、3、4、5個)の追加のアミノ酸置換(野生型E2 hAペプチド配列と比較して)、例えば、1個または複数(例えば、1、2、3、4、5個)の保存的および/または非保存的アミノ酸置換(すなわち、E2 hAに構造的安定化を付与するためになされるアミノ酸置換に加えて、1個または複数のアミノ酸置換)も含有し得る。ある特定の例では、ペプチドまたは構造的に安定化されたペプチド内にメチオニンが存在する場合、メチオニンはノルロイシンで置換されている。ある特定の例では、これらの追加の置換は、E2 hAの同族E1酵素と直接相互作用するアミノ酸置換である。ある特定の例では、これらの追加の置換は、E2 hAの同族E1酵素との直接相互作用に関与しないアミノ酸置換である。ある特定の例では、これらの追加の置換は、E2 hAの同族E1酵素と直接相互作用するアミノ酸と、E2 hAの同族E1酵素との直接相互作用に関与しないアミノ酸の両方の置換である。ある特定の例では、本明細書に記載の構造的に安定化された(例えば、内部で架橋した、例えば、ステープル化)E2 hAペプチドは、E2 hAのN末端および/またはC末端からの1個または複数(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個)の欠失を含有し得る。例えば、構造的に安定化された(例えば、内部で架橋した、例えば、ステープル化)E2 hAペプチドは、5またはそれより多い(例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 15、16)アミノ酸長であり得る。ある特定の例では、構造的に安定化された(例えば、内部で架橋した、例えば、ステープル化)E2 hAペプチドは、5~11アミノ酸長である。ある特定の例では、構造的に安定化された(例えば、内部で架橋した、例えば、ステープル化)E2 hAペプチドは、5~16アミノ酸長である。ある特定の例では、構造的に安定化された(例えば、内部で架橋した、例えば、ステープル化)E2 hAペプチドは、11~16アミノ酸長である。
よって、0~10(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)個のアミノ酸置換を有する配列番号132の配列の少なくとも8個の連続アミノ酸のアミノ酸配列を含むペプチドが、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、置換は、存在する場合、配列番号132の5および12位にはない。ある特定の実施形態では、ペプチドは、ヒトE1-ヒトE2相互作用を阻害する。ある特定の実施形態では、ペプチドは、ヒトE2へのヒトE1媒介性チオエステル転移を阻害する。ある特定の実施形態では、5位はR-オクテニルアラニンであり、12位はS-ペンテニルアラニンである。ペプチドの塩も本明細書において提供される。一部の例では、塩は、酢酸塩、硫酸塩、または塩化物である。
ある特定の実施形態では、ペプチドは、1~10(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)個のアミノ酸置換を有し、置換は、配列番号132の7および9位、または7もしくは9位にはない。ある特定の実施形態では、ペプチドは、1~10個のアミノ酸置換を有し、置換は、配列番号132の7、9、10、13、および16位の1個または複数(例えば、1、2、3、4、5個)にはない。ある特定の実施形態では、ペプチドは、1~10個のアミノ酸置換を有し、置換は、配列番号132の7、9、10、13、および16位の1個または複数にあり、置換は、これらの位置の1個または複数におけるアラニンへの置換である。ある特定の実施形態では、ペプチドは、1~10個のアミノ酸置換を有し、置換は、配列番号132の1、2、3、4、6、8、11、13、14、15、16、または17位の1個または複数(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個)にある。一部の場合には、これらの位置は、アラニンに置換されている。一部の場合には、配列番号132の6および8位、または6もしくは8位は、グルタミン酸に置換されている。ある特定の実施形態では、ペプチドは、1~10個のアミノ酸置換を有し、置換は、配列番号132の6または8位の1個または複数を含む。一部の場合には、これらの位置は、グルタミン酸に置換されている。ある特定の実施形態では、ペプチドは、ヒトE1内のシステイン残基と共有結合を形成することができる反応性基をさらに含み、必要に応じて、反応性基は、N末端に求電子性基または求電子性化学的キャップを有する非天然アミノ酸である。反応性基は、配列番号132のN~Cまたはその中に存在し得る(すなわち、N末端とC末端との間のアミノ酸は、N末端の求電子性基または求電子性化学的キャップを有する非天然アミノ酸で置換され得る)。
ある特定の実施形態では、ペプチドは、8~50、8~40、8~30、8~25、8~20、8~17、10~50、10~40、10~30、10~25、10~20、10~17、15~50、15~40、15~30、15~25、15~20、15~17、17~50、17~40、17~30、17~25、17~20、または8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、ペプチドまたはその塩は、内部で架橋している。一部の場合には、オレフィン側鎖を含む非天然アミノ酸の側鎖は、連結している。
ペプチドまたはその塩であって、ペプチドが、N末端からC末端に、以下の残基:
Xaa1=B、A(Bは、ノルロイシンであるか、または存在しない);
Xaa2=S、A、または存在しない;
Xaa3=T、A、または存在しない;
Xaa4=P、A、または存在しない;
Xaa5=ステープリングアミノ酸
Xaa6=R、E、またはA;
Xaa7=RまたはA;
Xaa8=R、E、またはA;
Xaa9=L、A、またはヒトE1内のシステイン残基と共有結合を形成することができる反応性基(必要に応じて、反応性基はN末端に求電子性基または求電子性化学的キャップを有する非天然アミノ酸である);
Xaa10=BまたはA(Bは、ノルロイシンである);
Xaa11=RまたはA;
Xaa12=ステープリングアミノ酸;
Xaa13=F、A、ヒトE1内のシステイン残基と共有結合を形成することができる反応性基(必要に応じて、反応性基はN末端に求電子性基または求電子性化学的キャップを有する非天然アミノ酸である)、または存在しない;
Xaa14=K、R、A、または存在しない;
Xaa15=R、A、または存在しない
Xaa16=L、A、または存在しない;および
Xaa17=Q、A、または存在しない
を有する配列の少なくとも8個の連続するアミノ酸を含み、
ペプチドがヒトE1とヒトE2との間の相互作用を阻害する、ペプチドまたはその塩も、本明細書に開示される。一部の場合には、ペプチドは、ヒトE2へのヒトE1媒介性チオエステル転移を阻害する。
Xaa1=B、A(Bは、ノルロイシンであるか、または存在しない);
Xaa2=S、A、または存在しない;
Xaa3=T、A、または存在しない;
Xaa4=P、A、または存在しない;
Xaa5=ステープリングアミノ酸
Xaa6=R、E、またはA;
Xaa7=RまたはA;
Xaa8=R、E、またはA;
Xaa9=L、A、またはヒトE1内のシステイン残基と共有結合を形成することができる反応性基(必要に応じて、反応性基はN末端に求電子性基または求電子性化学的キャップを有する非天然アミノ酸である);
Xaa10=BまたはA(Bは、ノルロイシンである);
Xaa11=RまたはA;
Xaa12=ステープリングアミノ酸;
Xaa13=F、A、ヒトE1内のシステイン残基と共有結合を形成することができる反応性基(必要に応じて、反応性基はN末端に求電子性基または求電子性化学的キャップを有する非天然アミノ酸である)、または存在しない;
Xaa14=K、R、A、または存在しない;
Xaa15=R、A、または存在しない
Xaa16=L、A、または存在しない;および
Xaa17=Q、A、または存在しない
を有する配列の少なくとも8個の連続するアミノ酸を含み、
ペプチドがヒトE1とヒトE2との間の相互作用を阻害する、ペプチドまたはその塩も、本明細書に開示される。一部の場合には、ペプチドは、ヒトE2へのヒトE1媒介性チオエステル転移を阻害する。
ある特定の実施形態では、ペプチドは、8~50、8~40、8~30、8~25、8~20、8~17、10~50、10~40、10~30、10~25、10~20、10~17、15~50、15~40、15~30、15~25、15~20、15~17、17~50、17~40、17~30、17~25、17~20、または8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、ペプチドまたはその塩は、内部で架橋している。一部の場合には、オレフィン側鎖を含む非天然アミノ酸の側鎖は、連結している。
別の態様では、本開示は、1~10(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10)個のアミノ酸置換を有する配列番号680、727、752、841、842、または844のいずれか1つのアミノ酸配列を含むペプチドであって、これらのペプチドのステープル化位置(stapled position)(すなわち、オレフィン側鎖を含む非天然アミノ酸を有する位置)が置換されていない、ペプチドを特徴とする。一部の場合には、E1と直接相互作用することが予測される残基は、置換されていないか、またはアラニンもしくは保存的アミノ酸で置換されている。すべての他の残基は置換され得る。ある特定の例では、ペプチドまたは構造的に安定化されたペプチド内にメチオニンが存在する場合、メチオニンはノルロイシンで置換されている。これらのペプチドは、E1-E2相互作用を阻害する。一部の例では、これらは、用量依存的にE2へのE1媒介性チオエステル転移を阻害する。
構造的に安定化されたペプチドを作製する方法も本明細書において提供される。一部の例では、本方法は、本明細書に記載されているペプチドを得るステップと、ペプチドを架橋させるステップとを含む。一部の例では、架橋は、RCM反応による。一部の例では、本方法は、架橋したペプチドを医薬組成物として製剤化するステップをさらに含む。
本明細書に開示されるいずれかのペプチドまたはその塩、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も、本明細書において提供される。
それを必要とするヒト対象において、E1を発現する疾患またはE1に依存する疾患を処置する方法であって、ヒト対象に、本明細書に開示されるいずれかのペプチド、その塩、または医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む、方法も本明細書において提供される。一部の例では、E1を発現する疾患またはE1に依存する疾患は、がんである。一部の例では、E1を発現する疾患またはE1に依存する疾患は、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、抗体媒介性移植拒絶、自己免疫障害、または炎症性障害である。一部の例では、ヒト対象は、E1を発現する疾患またはE1に依存する疾患を処置するための治療に対して、応答性でなかったか、または耐性を生じたことがある。
別の態様では、配列番号1~33のいずれか1つのアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含むペプチドであって、A1~A11アミノ酸の1個または複数が、別のアミノ酸によって置換されており、修飾されたアミノ酸配列が、少なくとも1個のペプチド構造を安定化させる修飾を含み、ペプチドが、ユビキチン活性化酵素1(UBA1)に結合し、それを阻害する、ペプチドが、本明細書において提供される。
ある特定の実施形態では、ペプチド構造を安定化させる修飾は、配列番号1~33のいずれか1つのアミノ酸A1~A11に示される配列の少なくとも2個のアミノ酸の、非天然アミノ酸による置換を含み、非天然アミノ酸は、オレフィン側鎖を含む。
ある特定の実施形態では、ペプチド構造を安定化させる修飾は、炭化水素ステープル/ステッチ、ラクタムステープル/ステッチ;UV環化付加ステープル/ステッチ;オキシムステープル/ステッチ;チオエーテルステープル/ステッチ;ダブルクリックステープル/ステッチ;ビス-ラクタムステープル/ステッチ;ビス-アリール化ステープル/ステッチ;またはこれらのいずれか2つもしくはそれより多くの組合せである。ある特定の実施形態では、ペプチド構造を安定化させる修飾は、ステッチである。
ある特定の実施形態では、ペプチド構造を安定化させる修飾は、ステープルである。ある特定の実施形態では、ステープルは、アミノ酸配列における2個の位置の1個または複数に存在し、2個の位置は、iおよびi+3、iおよびi+4、iおよびi+6、またはiおよびi+7である。ある特定の実施形態では、ステープルは、アミノ酸配列における2個の位置の1個または複数に存在し、2個の位置は、A2およびA9、A5およびA9、A8およびA12、A9およびA13、A1およびA8、A4およびA11、ならびにA5およびA12からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ステープルは、2個の位置に存在し、2個の位置は、A2およびA9である。ある特定の実施形態では、ステープルは、2個の位置のそれぞれにおいてアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換のそれぞれは、非天然アミノによる置換であり、非天然アミノ酸は、オレフィン側鎖(複数可)を含む。
第1の態様のペプチドが、オレフィン側鎖を含む非天然アミノ酸を含むある特定の実施形態では、オレフィン側鎖を含む非天然アミノ酸は、S-ペンテニルアラニン、R-オクテニルアラニン;R-プロペニルアラニン、S-ペンテニルアラニン;R-ペンテニルアラニン、S-ペンテニルアラニン;Bis-ペンテニルグリシン、S-ペンテニルアラニン、R-オクテニルアラニン;ならびにBis-ペンテニルグリシン、S-オクテニルアラニン、およびR-オクテニルアラニンからなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、(a)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号4のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号4のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(b)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号6のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号6のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(c)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号1のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号1のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(d)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号2のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号2のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(e)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号3のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号3のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(f)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号5のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号5のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(g)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号7のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号7のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(h)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号8のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号8のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(i)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号9のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号9のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(j)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号10のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号10のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(k)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号11のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号11のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(l)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号12のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号12のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(m)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号13のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号13のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(n)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号14のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号14のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(o)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号15のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号15のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(p)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号16のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号16のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(q)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号17のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号17のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(r)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号18のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号18のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(s)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号19のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号19のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(t)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号20のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号20のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(u)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号21のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号21のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(v)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号22のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号22のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(w)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号23のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号23のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(x)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号24のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号24のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(y)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号25のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号25のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(z)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号26のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号26のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミ
ノ酸置換を含むか;(aa)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号27のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号27のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(bb)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号28のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号28のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(cc)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号29のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号29のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(dd)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号30のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号30のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(ee)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号31のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号31のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(ff)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号32のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号32のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;または(gg)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号33のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号33のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含む。
ノ酸置換を含むか;(aa)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号27のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号27のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(bb)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号28のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号28のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(cc)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号29のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号29のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(dd)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号30のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号30のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(ee)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号31のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号31のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;(ff)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号32のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号32のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;または(gg)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号33のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号33のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含む。
ある特定の実施形態では、(a)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号4のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号4のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか;(b)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号6のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号6のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか;(c)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号1のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号1のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか;(d)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号2のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号2のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか;(e)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号3のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号3のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか;(f)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号5のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号5のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか;(g)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号7のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号7のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか;(h)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号8のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号8のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか;(i)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号9のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号9のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか;(j)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号10のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号10のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか;(k)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号11のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号11のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか;(l)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号12のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号12のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか;(m)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号13のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号13のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか;(n)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号14のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号14のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか;(o)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号15のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号15のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか;(p)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号16のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号16のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか;(q)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号17のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号17のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか;(r)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号18のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号18のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか;(s)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号19のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号19のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか;(t)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号20のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号20のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか;(u)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号21のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号21のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか;(v)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号22のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号22のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか;(w)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号23のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号23のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか;(x)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号24のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号24のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか;(y)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号25のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号25のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか;(z)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号26のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号26のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか;(aa)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号27のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号27のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか;(bb)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号28のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号28のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか;(cc)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号29のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号29のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか;(dd)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号30のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号30のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか;(ee)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号31のアミノ酸A1~A11に示される配列
の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号31のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか;(ff)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号32のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号32のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか;または(gg)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号33のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号33のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含む。
の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号31のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか;(ff)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号32のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号32のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか;または(gg)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号33のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号33のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含む。
ある特定の実施形態では、別のアミノ酸で置換されたアミノ酸A1~A11の1つまたは複数は、配列番号1~33のアミノ酸A1~A11のE1と相互作用しない面に存在する。ある特定の実施形態では、配列番号1~33の相互作用しない面は、アミノ酸A1、A2、A5、A8、A9、およびA12を含む。
ある特定の実施形態では、配列番号1~33のいずれか1つのアミノ酸A1~A11の相互作用しない面における0~6個のアミノ酸は、アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。
ある特定の実施形態では、アミノ酸A4、A6、A7、およびA10の1つまたは複数は、アルファ-メチル化またはアルファ-エチル化された天然アミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、アミノ酸A4、A6、A7、およびA10の1つまたは複数は、L-アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。
ある特定の実施形態では、アミノ酸A1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11の1つまたは複数は、アルファ-メチル化またはアルファ-エチル化された天然アミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、アミノ酸A1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11の1つまたは複数は、L-アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。
ある特定の実施形態では、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号4のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号6のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号1~33のいずれか1つに示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、配列番号1~33の1個または複数のアミノ酸は、L-アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸(1個または複数)で置換されている。ある特定の実施形態では、配列番号1~33の0~5個のアミノ酸は、C末端から除去されているか、または除去されて、アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群からの1~6個のアミノ酸で置き換えられている。ある特定の実施形態では、別のアミノ酸で置換された配列番号1~33の1個または複数のアミノ酸は、配列番号1~33のアミノ酸のE1と相互作用しない面に存在する。ある特定の実施形態では、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号4に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号6に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、(i)ペプチドの全体的な疎水性は、配列番号1~33のペプチドと比較して低下しているか;(ii)ペプチドの全体的な正荷電は、配列番号1~33のペプチドと比較して低下しているか;または(iii)(i)および(ii)の組合せである。
ある特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号132に示される配列を含む。ある特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号133に示される配列を含む。ある特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号107に示される配列を含む。ある特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号50に示される配列を含む。
さらに別の態様では、配列番号35または36に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含むペプチドであって、配列番号35または36の1個または複数のアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されており、修飾されたアミノ酸配列が、少なくとも1個のペプチド構造を安定化させる修飾を含み、ペプチドが、ユビキチン活性化酵素3(UBA3)に結合し、それを阻害する、ペプチドが、本明細書において提供される。
ある特定の実施形態では、ペプチド構造を安定化させる修飾は、配列番号35または36の配列の少なくとも2個のアミノ酸の、非天然アミノ酸による置換を含み、非天然アミノ酸は、オレフィン側鎖を含む。ある特定の実施形態では、ペプチド構造を安定化させる修飾は、炭化水素ステープル/ステッチ、ラクタムステープル/ステッチ;UV環化付加ステープル/ステッチ;オキシムステープル/ステッチ;チオエーテルステープル/ステッチ;ダブルクリックステープル/ステッチ;ビス-ラクタムステープル/ステッチ;ビス-アリール化ステープル/ステッチ;またはこれらのいずれか2つもしくはそれより多くの組合せである。ある特定の実施形態では、ペプチド構造を安定化させる修飾は、ステッチである。
ある特定の実施形態では、ペプチド構造を安定化させる修飾は、ステープルである。ある特定の実施形態では、ステープルは、アミノ酸配列における2個の位置の1個または複数に存在し、2個の位置は、iおよびi+3、iおよびi+4、またはiおよびi+7である。ある特定の実施形態では、ステープルは、2個の位置のそれぞれにおいてアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換のそれぞれは、非天然アミノによる置換であり、非天然アミノ酸は、オレフィン側鎖を含む。
ペプチドが、オレフィン側鎖を含む非天然アミノ酸を含むある特定の実施形態では、オレフィン側鎖を含む非天然アミノ酸は、S-ペンテニルアラニン、R-オクテニルアラニン;R-プロペニルアラニン、S-ペンテニルアラニン;R-ペンテニルアラニン、S-ペンテニルアラニン;Bis-ペンテニルグリシン、S-ペンテニルアラニン、R-オクテニルアラニン;ならびにBis-ペンテニルグリシン、S-オクテニルアラニン、およびR-オクテニルアラニンからなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、(a)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号35の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号35のArg-1、Arg-2、Ser-4、Val-5、Arg-6、Asp-7、Leu-9、Leu-10、Glu-13、Ala-15、およびGlu-16からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか、または(b)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号36の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号36のLys-1、Ser-4、Ala-5、Ala-6、Arg-9、Ile-10、およびAsp-134からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含む。
ある特定の実施形態では、(a)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号35の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号35のVal-3、Lys-8、Val-11、Lys-12、およびVal-14からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか、または(b)修飾されたアミノ酸配列は、配列番号36の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号36のLys-2、Ala-3、Gln-7、Leu-8、Gln-11、Lys-12、Ile-14、Asn-15、およびGlu-16からなる群から選択される0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸位置を含む。
ある特定の実施形態では、別のアミノ酸で置換された1個または複数のアミノ酸は、配列番号35または36のE1と相互作用しない面に存在する。ある特定の実施形態では、配列番号35の相互作用しない面は、配列番号25のアミノ酸Arg-1、Arg-2、Ser-4、Val-5、Arg-6、Asp-7、Leu-9、Leu-10、Glu-13、Ala-15、およびGlu-16を含み、配列番号36の相互作用しない面は、配列番号36のアミノ酸Lys-1、Ser-4、Ala-5、Ala-6、Arg-9、Ile-10、およびAsp-13を含む。
ある特定の実施形態では、配列番号35または36の相互作用しない面における0~6個のアミノ酸は、アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。
ある特定の実施形態では、アミノ酸B7、B8、B11、B12、B15、およびB16の1つまたは複数は、アルファ-メチル化またはアルファ-エチル化された天然アミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、アミノ酸B7、B8、B11、B12、B15、およびB16の1つまたは複数は、L-アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。
ある特定の実施形態では、アミノ酸B1、B2、B3、B4、B5、B6、B9、B10、B13、およびB14の1つまたは複数は、アルファ-メチル化またはアルファ-エチル化された天然アミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、アミノ酸B1、B2、B3、B4、B5、B6、B9、B10、B13、およびB14の1つまたは複数は、L-アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。
ある特定の実施形態では、配列番号35または36の0~5個のアミノ酸は、C末端から除去されているか、または除去されて、アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群からの1~6個のアミノ酸で置き換えられている。
ある特定の実施形態では、(i)ペプチドの全体的な疎水性は、配列番号35もしくは36のペプチドと比較して低下しているか;(ii)ペプチドの全体的な正荷電は、配列番号35もしくは36のペプチドと比較して低下しているか;または(iii)(i)および(ii)の組合せである。
第3の態様では、配列番号37に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含むペプチドであって、配列番号37の1個または複数のアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されており、修飾されたアミノ酸配列が、少なくとも1個のペプチド構造を安定化させる修飾を含み、ペプチドが、ユビキチン活性化酵素2(UBA2)に結合し、それを阻害する、ペプチドが、本明細書において提供される。
ある特定の実施形態では、ペプチド構造を安定化させる修飾は、配列番号35または36の配列の少なくとも2個のアミノ酸の、非天然アミノ酸による置換を含み、非天然アミノ酸は、オレフィン側鎖を含む。ある特定の実施形態では、ペプチド構造を安定化させる修飾は、炭化水素ステープル/ステッチ、ラクタムステープル/ステッチ;UV環化付加ステープル/ステッチ;オキシムステープル/ステッチ;チオエーテルステープル/ステッチ;ダブルクリックステープル/ステッチ;ビス-ラクタムステープル/ステッチ;ビス-アリール化ステープル/ステッチ;またはこれらのいずれか2つもしくはそれより多くの組合せである。ある特定の実施形態では、ペプチド構造を安定化させる修飾は、ステッチである。
ある特定の実施形態では、ペプチド構造を安定化させる修飾は、ステープルである。ある特定の実施形態では、ステープルは、アミノ酸配列における2個の位置の1個または複数に存在し、2個の位置は、iおよびi+3、iおよびi+4、またはiおよびi+7である。ある特定の実施形態では、ステープルは、2個の位置のそれぞれにおいてアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換のそれぞれは、非天然アミノによる置換であり、非天然アミノ酸は、オレフィン側鎖を含む。
ペプチドが、オレフィン側鎖を含む非天然アミノ酸を含むある特定の実施形態では、オレフィン側鎖を含む非天然アミノ酸は、S-ペンテニルアラニン、R-オクテニルアラニン;R-プロペニルアラニン、S-ペンテニルアラニン;R-ペンテニルアラニン、S-ペンテニルアラニン;Bis-ペンテニルグリシン、S-ペンテニルアラニン、R-オクテニルアラニン;ならびにBis-ペンテニルグリシン、S-オクテニルアラニン、およびR-オクテニルアラニンからなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号37のAla-1、Arg-4、Leu-5、Glu-8、Ala-11、Trp-12、およびAsp-15からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、または5個のアミノ酸置換を含む。
ある特定の実施形態では、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号37のLeu-2、Ser-3、Ala-6、Gln-7、Arg-9、Lys-10、Arg-13、およびLys-14からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、または2個の保存的アミノ酸置換を含む。
ある特定の実施形態では、別のアミノ酸で置換された1個または複数のアミノ酸は、配列番号37のE1と相互作用しない面に存在する。ある特定の実施形態では、配列番号37の相互作用しない面は、配列番号37のアミノ酸Ala-1、Arg-4、Leu-5、Glu-8、Ala-11、Trp-12、およびAsp-15を含む。
ある特定の実施形態では、配列番号37の相互作用しない面における0~6個のアミノ酸は、アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。
ある特定の実施形態では、配列番号37のアミノ酸Leu-2、Ser-3、Ala-6、Gln-7、Arg-9、Lys-10、Arg-13、およびLys-14の1つまたは複数は、アルファ-メチル化またはアルファ-エチル化された天然アミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、配列番号37のアミノ酸Leu-2、Ser-3、Ala-6、Gln-7、Arg-9、Lys-10、Arg-13、およびLys-14の1つまたは複数は、L-アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。
ある特定の実施形態では、配列番号37のアミノ酸Ala-1、Arg-4、Leu-5、Glu-8、Ala-11、Trp-12、およびAsp-15の1つまたは複数は、アルファ-メチル化またはアルファ-エチル化された天然アミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、配列番号37のアミノ酸Ala-1、Arg-4、Leu-5、Glu-8、Ala-11、Trp-12、およびAsp-15の1つまたは複数は、L-アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。
ある特定の実施形態では、配列番号37の0~5個のアミノ酸は、C末端から除去されているか、または除去されて、アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群からの1~6個のアミノ酸で置き換えられている。
ある特定の実施形態では、(i)ペプチドの全体的な疎水性は、配列番号37のペプチドと比較して低下しているか;(ii)ペプチドの全体的な正荷電は、配列番号37のペプチドと比較して低下しているか;または(iii)(i)および(ii)の組合せである。
第4の態様では、配列番号38に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含むペプチドであって、配列番号38の1個または複数のアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されており、修飾されたアミノ酸配列が、少なくとも1個のペプチド構造を安定化させる修飾を含み、ペプチドが、ユビキチン活性化酵素6(UBA6)に結合し、それを阻害する、ペプチドが、本明細書において提供される。
ある特定の実施形態では、ペプチド構造を安定化させる修飾は、配列番号38の配列の少なくとも2個のアミノ酸の、非天然アミノ酸による置換を含み、非天然アミノ酸は、オレフィン側鎖を含む。ある特定の実施形態では、ペプチド構造を安定化させる修飾は、炭化水素ステープル/ステッチ、ラクタムステープル/ステッチ;UV環化付加ステープル/ステッチ;オキシムステープル/ステッチ;チオエーテルステープル/ステッチ;ダブルクリックステープル/ステッチ;ビス-ラクタムステープル/ステッチ;ビス-アリール化ステープル/ステッチ;またはこれらのいずれか2つもしくはそれより多くの組合せである。ある特定の実施形態では、ペプチド構造を安定化させる修飾は、ステッチである。
ある特定の実施形態では、ペプチド構造を安定化させる修飾は、ステープルである。ある特定の実施形態では、ステープルは、アミノ酸配列における2個の位置の1個または複数に存在し、2個の位置は、iおよびi+3、iおよびi+4、またはiおよびi+7である。ある特定の実施形態では、ステープルは、2個の位置のそれぞれにおいてアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換のそれぞれは、非天然アミノによる置換であり、非天然アミノ酸は、オレフィン側鎖を含む。
ペプチドが、オレフィン側鎖を含む非天然アミノ酸を含むある特定の実施形態では、オレフィン側鎖を含む非天然アミノ酸は、S-ペンテニルアラニン、R-オクテニルアラニン;R-プロペニルアラニン、S-ペンテニルアラニン;R-ペンテニルアラニン、S-ペンテニルアラニン;Bis-ペンテニルグリシン、S-ペンテニルアラニン、R-オクテニルアラニン;ならびにBis-ペンテニルグリシン、S-オクテニルアラニン、およびR-オクテニルアラニンからなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号38のMet-1、Ala-2、Ala-3、Ser-4、Leu-6、Asn-9、Leu-10、Arg-12、Leu-13、Ser-15、Arg-16、およびCys-17からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、または5個のアミノ酸置換を含む。
ある特定の実施形態では、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号38のArg-5、Glu-7、Leu-8、Val-11、およびLeu-14からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、または2個の保存的アミノ酸置換を含む。
ある特定の実施形態では、別のアミノ酸で置換された1個または複数のアミノ酸は、配列番号38のE1と相互作用しない面に存在する。ある特定の実施形態では、配列番号38の相互作用しない面は、配列番号38のアミノ酸Met-1、Ala-2、Ala-3、Ser-4、Leu-6、Asn-9、Leu-10、Arg-12、Leu-13、Ser-15、Arg-16、およびCys-17を含む。
ある特定の実施形態では、配列番号38の相互作用しない面における0~6個のアミノ酸は、アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。
ある特定の実施形態では、配列番号38のアミノ酸Arg-5、Glu-7、Leu-8、Val-11、およびLeu-14の1つまたは複数は、アルファ-メチル化またはアルファ-エチル化された天然アミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、配列番号38のアミノ酸Arg-5、Glu-7、Leu-8、Val-11、およびLeu-14の1つまたは複数は、L-アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。
ある特定の実施形態では、配列番号38のアミノ酸Met-1、Ala-2、Ala-3、Ser-4、Leu-6、Asn-9、Leu-10、Arg-12、Leu-13、Ser-15、Arg-16、およびCys-17の1つまたは複数は、アルファ-メチル化またはアルファ-エチル化された天然アミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、配列番号38のアミノ酸Met-1、Ala-2、Ala-3、Ser-4、Leu-6、Asn-9、Leu-10、Arg-12、Leu-13、Ser-15、Arg-16、およびCys-17の1つまたは複数は、L-アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。
ある特定の実施形態では、配列番号38の0~5個のアミノ酸は、C末端から除去されているか、または除去されて、アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群からの1~6個のアミノ酸で置き換えられている。
ある特定の実施形態では、(i)ペプチドの全体的な疎水性は、配列番号38のペプチドと比較して低下しているか;(ii)ペプチドの全体的な正荷電は、配列番号38のペプチドと比較して低下しているか;または(iii)(i)および(ii)の組合せである。
第5の態様では、第1の態様のペプチドの誘導体であって、求電子性弾頭部を含む、ペプチド誘導体が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、求電子性弾頭部は、アミノ酸位置A7、A8、またはA11に存在する。ある特定の実施形態では、求電子性弾頭部は、ペプチドのN末端に存在する。ある特定の実施形態では、求電子性弾頭部は、ペプチドのN末端に存在しない。
ある特定の実施形態では、求電子性弾頭部は、求電子性基を有する非天然アミノ酸である。ある特定の実施形態では、求電子性基を有する非天然アミノ酸は、ポリペプチド骨格に連結した求電子性アクリルアミドまたは置換されたアクリルアミドを有する。ある特定の実施形態では、求電子性基を有する非天然アミノ酸は、(S)-1-アクリロイルピロリジン-3-カルボキサミド;1-アクリロピぺリジン-4-カルボキサミド、(R)-1アクリロイルピぺリジン-3-カルボキサミド;(S)-1-アクリロイルピぺリジン-3-カルボキサミド;(S)-1-アクリロイルピロリジン(acryloylpyyrolidine)-2-カルボキサミド;(R)-1-アクリロイルピロリジン-2-カルボキサミド;(E)-4-(ジメチルアミノ)ブタ-2-エナミド;アクリルアミド;アジリジン、ジアジリジン、アゼチジン、ピロリジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、オキサゾリジン、イソキサゾリジン、チアゾリジン、イソチアゾリジン、ピぺリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、アゼパネアジリン(azepaneazirine)、ジアジリン、アゼト、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、ピリジン、ジアジン、オキサジン、チアジン、アゼピンフェニル(アニリン);ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、インドール、イソインドール、インドリジン、キノロン、イソキノリン、キノキサリン、フタルジン(phthalzine)、キナゾリン、プリン、カルバゾール、インダゾール、ベンズイミダゾール、アザインドール、α-シアノアクリルアミド、プロピオルアミド、trans4-ジメチルアミノ-2-ブテンアミド、trans4-ピペリジニル-2-ブテンアミド、置換アクリルアミド、およびビニル-スルホンアミドからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、求電子性弾頭部は、末端がブロモアセチルであるジアミノブタン酸または末端がアクリルアミドであるジアミノブタン酸である。ある特定の実施形態では、求電子性弾頭部は、システイン反応性D-ニペコチン酸部分である。ある特定の実施形態では、求電子性弾頭部は、システイン反応性部分である。
ある特定の実施形態では、誘導体は、配列番号392、428、464、500、680、716、752、および788のいずれか1つに示される配列を含む。ある特定の実施形態では、誘導体は、配列番号680に示される配列を含む。ある特定の実施形態では、誘導体は、配列番号752に示される配列を含む。ある特定の実施形態では、誘導体は、配列番号393、429、465、501、681、717、753、および789のいずれか1つに示される配列を含む。ある特定の実施形態では、誘導体は、配列番号367、403、439、655、727、および757のいずれか1つに示される配列を含む。ある特定の実施形態では、誘導体は、配列番号727に示される配列を含む。ある特定の実施形態では、誘導体は、配列番号833~836および841~844のいずれか1つに示される配列を含む。ある特定の実施形態では、誘導体は、配列番号841に示される配列を含む。ある特定の実施形態では、誘導体は、配列番号842に示される配列を含む。ある特定の実施形態では、誘導体は、配列番号844に示される配列を含む。
ある特定の実施形態では、誘導体は、UBA1に共有結合により結合する。
第6の態様では、第1から第4の態様のいずれか1つに記載のペプチドまたは第5の態様に記載の誘導体ペプチド、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が、本明細書において提供される。
第7の態様では、それを必要とするヒト対象において、E1を発現する疾患またはE1に依存する疾患を処置する方法であって、ヒト対象に、第1から第4の態様のいずれか1つに記載のペプチド、第5の態様に記載の誘導体ペプチド、または第6の態様に記載の医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む、方法が本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、E1を発現する疾患またはE1に依存する疾患は、がんである。ある特定の実施形態では、E1を発現する疾患またはE1に依存する疾患は、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、抗体媒介性移植拒絶、自己免疫障害、または炎症性障害である。
第8の態様では、本開示は、ユビキチン活性化酵素(E1)とユビキチン結合酵素(E2)との間の相互作用を阻害するための手段を含む組成物を特徴とする。一部の例では、相互作用を阻害する手段は、E1とE2との間の相互作用を阻害する安定化された(例えば、ステープル化(stapled)、ステッチ化(stitched))ペプチドである。ある特定の場合には、相互作用を阻害するための手段は、E2 hAを模倣する安定化されたペプチドである(例えば、表1~6を参照されたい)。一部の例では、相互作用を阻害するための手段は、表7、8、もしくは9のペプチド、またはそのバリアントである。1つの場合には、相互作用を阻害するための手段は、UBE2A/UBE2B E2 hA(すなわち、配列番号4)に基づくステープルペプチド(stapled peptide)である安定化されたペプチドである。1つの場合には、相互作用を阻害するための手段は、SAH-UBE2A-11(配列番号132)である安定化されたペプチドまたはそのバリアントである。1つの場合には、相互作用を阻害するための手段は、配列番号65、96、または101に示される配列を含む安定化されたペプチドまたはそのバリアントである。一部の例では、組成物は、医薬組成物であり、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含む。
第9の態様では、本開示は、それを必要とするヒト対象において、E1を発現する疾患またはE1に依存する疾患を処置する方法を提供する。本方法は、ヒト対象に、ユビキチン活性化酵素(E1)とユビキチン結合酵素(E2)との間の相互作用を阻害するための手段を含む組成物の治療有効量を投与するステップを含む。一部の例では、相互作用を阻害するための手段は、E1とE2との間の相互作用を阻害する安定化された(例えば、ステープル化、ステッチ化)ペプチドである。ある特定の場合には、相互作用を阻害するための手段は、E2 hAを模倣する安定化されたペプチドである(例えば、表1~6を参照されたい)。一部の例では、相互作用を阻害するための手段は、表7、8、もしくは9のペプチド、またはそのバリアントである。1つの場合には、相互作用を阻害するための手段は、UBE2A/UBE2B E2 hA(すなわち、配列番号4)に基づくステープルペプチドである安定化されたペプチドである。1つの場合には、相互作用を阻害するための手段は、SAH-UBE2A-11(配列番号132)である安定化されたペプチド、またはそのバリアントである。1つの場合には、相互作用を阻害するための手段は、配列番号65、96、または101に示される配列を含む安定化されたペプチド、またはそのバリアントである。一部の例では、組成物は、医薬組成物であり、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含む。ある特定の例では、E1を発現する疾患またはE1に依存する疾患は、がんである。ある特定の例では、E1を発現する疾患またはE1に依存する疾患は、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、抗体媒介性移植拒絶、自己免疫障害、炎症性障害、または病的細胞の生存に関わる疾患である。
E1酵素は、最初に、UbのC末端のアデニル化を触媒し、次いで、UbのC末端とE1の触媒システインとの間の高エネルギーチオエステル結合を形成することによって、Ubを活性化する。次いで、E1は、E2に結合し、UbをE1の触媒システインからE2の触媒システインに転移することによって、E2への受け渡しを行う。E2は、次に、ユビキチンリガーゼ(E3)および基質タンパク質と複合体を形成し、UbのC末端のカルボキシル基を共有結合により基質タンパク質に転移する。E1とE2との間の相互作用は、タンパク質表面積の3000Å2を埋め、そのうちの1000Å2は、E2のヘリックスA(E2 hA)とE1ユビキチンフォールドドメイン(E1 UFD)との間の界面に埋もれている。よって、E1とE2との間の相互作用は、E1-E2遭遇複合体の形成において重要である。本開示は、例えば、E1-E2相互作用の競合的阻害によって、E1の直接的阻害剤として作用し得る、E2 hAを模倣する、構造的に安定化された(例えば、ステープル化)アルファ-ヘリックスペプチドを提供する。ある特定の態様では、構造的に安定化された(例えば、ステープル化)E2 hAペプチドは、E1 UFDに結合する。本開示は、同族E1に共有結合により結合し得る、本明細書に記載の安定化された(例えば、ステープル化)E2 hAペプチドの弾頭部を有するバージョンも提供する。いかなる理論にも拘束されないが、本明細書において提供される安定化されたE2 hAは、E1がE2への受け渡しを行うのを妨げ、よって、E1を阻害する機序を表す。本開示は、E1に依存するがんおよび/またはE1を発現するがん(例えば、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、または本明細書に記載の他の特定のがん)ならびに病的細胞の生存に関わる他の疾患(例えば、抗体媒介性移植拒絶、自己免疫障害、または炎症性障害)の処置において、単独で、または他の治療剤と組み合わせて、このような安定化されたペプチド(またはその弾頭部を有するバージョン)を使用するための方法も特徴とする。
E1タンパク質
ヒトUBA1のアミノ酸配列を以下に提供する(GenBank受託番号NP_695012):
E1タンパク質
ヒトUBA1のアミノ酸配列を以下に提供する(GenBank受託番号NP_695012):
ヒトUBA1のUFDは、配列番号845のアミノ酸残基950~1058からなる。
ヒトUBA2のUFDは、配列番号846のアミノ酸残基444~552からなる。
ヒトUBA3のUFDは、配列番号847のアミノ酸残基445~561からなる。
ヒトUBA6のUFDは、配列番号848のアミノ酸残基950~1052からなる。
S.pombe UBA1のUFDは、配列番号849のアミノ酸残基911~1012からなる。
E2ヘリックスAペプチド
E2ヘリックスAペプチド
本開示の例示的なE2 hAペプチドは、表1~5のペプチドである。E2 hAペプチドの相互作用する面におけるアミノ酸は、E2 hAペプチドとE1、例えば、UBA1、UBA6、UBA2、またはUBA3との間の相互作用に寄与する。対照的に、E2 hAペプチドの相互作用しない面におけるアミノ酸は、E2 hAペプチドとE1、例えば、UBA1、UBA6、UBA2、またはUBA3との間の直接相互作用に関与しない。E2 hAペプチドのその同族E1酵素(例えば、配列番号1~34に関するUBA1、配列番号38に関するUBA6、配列番号37に関するUBA2、ならびに配列番号35および36に関するUBA3)に対する直接相互作用に関与する残基は、表1~5の太字であり、他のアミノ酸はすべて、その同族E1酵素に対する直接相互作用に関与しない(または直接相互作用に関与しないことが予測される)。
本開示は、UBA1 E1に結合し、それを阻害するE2 hAペプチドを提供する。ある特定の実施形態では、E2 hAペプチドは、UBA1 E1 UFDに結合する。本開示の例示的なUBA1に結合するE2 hAペプチドは、表1(S.pombe由来)および表2(H.sapiens由来)に提供される。UBA1に結合するペプチドについて使用されるコンセンサス位置の番号付け(A#)は、以下の表1および表2に提供される。ペプチドのUBA1阻害を評価するための方法は、当技術分野において公知であり、本明細書に記載される。
UBA1と直接相互作用する、例えば、UBA1に結合するUbc4 E2 hA(配列番号1)の残基は、アミノ酸コンセンサス位置A1、A3、A4、A7、A10、およびA11である。例えば、配列番号1に関する位置番号付けとの関係で、UBA1と直接相互作用するUbc4 E2 hAの残基は、Met-1(すなわち、A1)、Leu-3(すなわち、A3)、Lys-4(すなわち、A4)、Asn-7(すなわち、A7)、Leu-10(すなわち、A10)、およびAla-11(すなわち、A11)である(Lv et al., 2017, Mol. Cell, 65(4):699-714を参照されたい)。
UBA1との直接相互作用、例えば、UBA1への結合に関与しないUbc4 E2 hA(すなわち、配列番号1)の残基は、A2、A5、A6、A8、A9、A12、A13、A14、A15、およびA16である。例えば、配列番号1に関する位置番号付けとの関係で、UBA1との直接相互作用に関与しないUbc4 E2 hAの残基は、Ala-2(すなわち、A2)、Arg-5(すなわち、A5)、Ile-6(すなわち、A6)、Arg-8(すなわち、A8)、Glu-9(すなわち、A9)、Asp-12(すなわち、A12)、Leu-13(すなわち、A13)、Gly-14(すなわち、A14)、Lys-15(すなわち、A15)、およびAsp-16(すなわち、A16)である。
UBA1と直接相互作用する、例えば、UBA1に結合するUbc15 E2 hA(配列番号2)の残基は、アミノ酸コンセンサス位置A-4、A-3、A-2、A-1、A3、A7、A8、A10、A11、およびA14である。例えば、配列番号2に関する位置番号付けとの関係で、UBA1と直接相互作用するUbc15 E2 hAの残基は、Met-1(すなわち、A-4)、Pro-2(すなわち、A-3)、Ser-3(すなわち、A-2)、Ser-4(すなわち、A-1)、Glu-7(すなわち、A3)、Arg-11(すなわち、A7)、Lys-12(すなわち、A8)、Leu-14(すなわち、A10)、Lys-15(すなわち、A11)、およびGln-18(すなわち、A14)である(Lv et al., 2017, Mol. Cell, 65(4):699-714を参照されたい)。
UBA1との直接相互作用、例えば、UBA1への結合に関与しないUbc15 E2 hA(すなわち、配列番号2)の残基は、A1、A2、A4、A5、A6、A9、A12、A13、A15、およびA16である。例えば、配列番号2に関する位置番号付けとの関係で、UBA1との直接相互作用に関与しないUbc4 E2 hAの残基は、Ala-5(すなわち、A1)、Ser-6(すなわち、A2)、Gln-8(すなわち、A4)、Leu-9(すなわち、A5)、Leu-10(すなわち、A6)、Gln-13(すなわち、A9)、Glu-16(すなわち、A12)、Ile-17(すなわち、A13)、Lys-19(すなわち、A15)、およびAsn-20(すなわち、A16)である。
UBA1と直接相互作用する、例えば、UBA1に結合することが予測される配列番号3~20および22~34のE2 hAペプチドの残基は、アミノ酸コンセンサス位置A4、A6、A7、A10、および必要に応じてA13である。例えば、配列番号4に関する位置番号付けとの関係で、UBA1と直接相互作用することが予測されるUBE2A E2 hA(配列番号4)の残基は、Arg-7(すなわち、A4)、Leu-9(すなわち、A6)、Met-10(すなわち、A7)、Phe-13(すなわち、A10)、および必要に応じてLeu-16(すなわち、A13)である。別の例において、配列番号6に関する位置番号付けとの関係で、UBA1と直接相互作用することが予測されるUBE2G2 E2 hA(配列番号6)の残基は、Lys-7(すなわち、A4)、Leu-9(すなわち、A6)、Met-10(すなわち、A7)、Tyr-13(すなわち、A10)、および必要に応じてLeu-16(すなわち、A13)である。さらに別の例において、配列番号10に関する位置番号付けとの関係で、UBA1と直接相互作用することが予測されるUBE2D2 E2 hA(配列番号10)の残基は、Lys-4(すなわち、A4)、Ile-6(すなわち、A6)、His-7(すなわち、A7)、Leu-10(すなわち、A10)、および必要に応じてLeu-13(すなわち、A13)である。
UBA1との直接相互作用、例えば、UBA1への結合に関与しないことが予測される配列番号3~20および22~34のE2 hAペプチドの残基は、A1、A2、A3、A5、A8、A9、A11、A12、A14、A15、A16、およびA1に対してN末端側の位置である。例えば、配列番号4に関する位置番号付けとの関係で、UBA1との直接相互作用に関与しないことが予測されるUBE2A E2 hAの残基は、Met-1(すなわち、A-3)、Ser-2(すなわち、A-2)、Thr-3(すなわち、A-1)、Pro-4(すなわち、A1)、Ala-5(すなわち、A2)、Arg-6(すなわち、A3)、Arg-8(すなわち、A5)、Arg-11(すなわち、A8)、Asp-12(すなわち、A9)、Lys-14(すなわち、A11)、Arg-15(すなわち、A12)、Gln-17(すなわち、A14)、Glu-18(すなわち、A15)、およびAsp-19(すなわち、A16)である。別の例において、配列番号6に関する位置番号付けとの関係で、UBA1との直接相互作用に関与しないことが予測されるUBE2G2 E2 hAの残基は、Met-1(すなわち、A-3)、Ala-2(すなわち、A-2)、Gly-3(すなわち、A-1)、Thr-4(すなわち、A1)、Ala-5(すなわち、A2)、Leu-6(すなわち、A3)、Arg-7(すなわち、A5)、Ala-10(すなわち、A8)、Glu-11(すなわち、A9)、Lys-13(すなわち、A11)、Gln-14(すなわち、A12)、Thr-16(すなわち、A14)、Leu-17(すなわち、A15)、およびAsn-18(すなわち、A16)である。さらに別の例において、配列番号10に関する位置番号付けとの関係で、UBA1との直接相互作用に関与しないことが予測されるUBE2D2 E2の残基は、Met-1(すなわち、A1)、Ala-2(すなわち、A2)、Leu-3(すなわち、A3)、Arg-5(すなわち、A5)、Lys-8(すなわち、A8)、Glu-9(すなわち、A9)、Asn-11(すなわち、A11)、Asp-12(すなわち、A12)、Ala-14(すなわち、A14)、Arg-15(すなわち、A15)、およびAsp-16(すなわち、A16)である。
一例では、本開示は、配列BPSSASRQLLRKQLKEIQZ(配列番号1340)を有するペプチドであって、Bがノルロイシンであり、Zがビオチン化したリシン(Lys(ビオチン))である、ペプチドを特徴とする。一部の場合には、ペプチドは、少なくとも2個(例えば、2、3、4、5個)のアミノ酸置換を含み、アミノ酸は、オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸に置換されている。一部の場合には、少なくとも2個の置換されたアミノ酸は、2、3、または6個のアミノ酸によって分離されている。これらのペプチドは、E1-E2相互作用を阻害する。
一例では、本開示は、配列BPSSASRQLLRKQLKEIQ(配列番号1341)を有するペプチドであって、Bがノルロイシンである、ペプチドを特徴とする。一部の場合には、ペプチドは、少なくとも2個(例えば、2、3、4、5個)のアミノ酸置換を含み、アミノ酸は、オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸に置換されている。一部の場合には、少なくとも2個の置換されたアミノ酸は、2、3、または6個のアミノ酸によって分離されている。これらのペプチドは、E1-E2相互作用を阻害する。
表2. H. sapiens由来のUBA1に結合するペプチド。UBA1と直接相互作用することが予測される残基は太字である(配列番号3~20および22~34に関するアミノ酸コンセンサス位置A4、A6、A7、およびA10、ならびに必要に応じてA13;配列番号21に関するアミノ酸コンセンサス位置A-1、A2、A3、A4、A6、A7、A8、A10、A11、およびA14)。
UBA1と直接相互作用する、例えば、UBA1に結合するUBE2T E2 hA(配列番号21)の残基は、アミノ酸コンセンサス位置A-1、A2、A3、A4、A6、A7、A8、A10、A11、およびA14である。例えば、配列番号21に関する位置番号付けとの関係で、UBA1と直接相互作用するUBE2T E2 hAの残基は、Met-1(すなわち、A-1)、Arg-3(すなわち、A2)、Ala-4(すなわち、A3)、Ser-5(すなわち、A4)、Leu-7(すなわち、A6)、Lys-8(すなわち、A7)、Arg-9(すなわち、A8)、Leu-11(すなわち、A10)、His-12(すなわち、A11)、およびAla-15(すなわち、A14)である(Lv et al., 2018, JBC, 293(47):18337-18352を参照されたい)。
UBA1との直接相互作用、例えば、UBA1への結合に関与しないUBE2T E2 hA(配列番号21)の残基は、A1、A5、A9、A12、A13、A15、およびA16である。例えば、配列番号21に関する位置番号付けとの関係で、UBA1との直接相互作用に関与しないUBE2T E2 hAの残基は、Gln-2(すなわち、A1)、Arg-6(すなわち、A5)、Glu-10(すなわち、A9)、Met-13(すなわち、A12)、Leu-14(すなわち、A13)、Tyr-16(すなわち、A15)、およびGlu-17(すなわち、A16)である。
本開示は、E1 UBA6に結合し、E1 UBA6を阻害するE2 hAペプチドも提供する。ある特定の実施形態では、E2 hAペプチドは、UBA6 E1 UFDに結合する。本開示の例示的なUBA6に結合するE2 hAペプチドを、表3に提供する(すなわち、配列番号38)。ペプチドのUBA6阻害を評価するための方法は、当技術分野において公知であり、本明細書に記載される。
一例では、本開示は、配列BSTPARRRLBRDFKRLQZ(配列番号1342)を有するペプチドであって、Bがノルロイシンであり、Zがビオチン化したリシン(Lys(ビオチン))である、ペプチドを特徴とする。一部の場合には、ペプチドは、少なくとも2個(例えば、2、3、4、5個)のアミノ酸置換を含み、アミノ酸は、オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸に置換されている。一部の場合には、少なくとも2個の置換されたアミノ酸は、2、3、または6個のアミノ酸によって分離されている。これらのペプチドは、E1-E2相互作用を阻害する。
一例では、本開示は、配列BSTPARRRLBRDFKRLQ(配列番号1343)を有するペプチドであって、Bがノルロイシンである、ペプチドを特徴とする。一部の場合には、ペプチドは、少なくとも2個(例えば、2、3、4、5個)のアミノ酸置換を含み、アミノ酸は、オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸に置換されている。一部の場合には、少なくとも2個の置換されたアミノ酸は、2、3、または6個のアミノ酸によって分離されている。これらのペプチドは、E1-E2相互作用を阻害する。
配列番号38に関する位置番号付けとの関係で、UBA6と直接相互作用する、例えば、UBA6に結合することが予測されるUSE1 E2 hA(配列番号38)の残基は、Arg-5、Glu-7、Leu-8、Val-11、およびLeu-14である。
配列番号38に関する位置番号付けとの関係で、UBA6との直接相互作用、例えば、UBA6への結合に関与しないことが予測されるUSE1 E2 hA(配列番号38)の残基は、Met-1、Ala-2、Ala-3、Ser-4、Leu-6、Asn-9、Leu-10、Arg-12、Leu-13、Ser-15、Arg-16、およびCys-17である。
本開示は、E1 UBA3に結合し、E1 UBA3を阻害するE2 hAペプチドも提供する。ある特定の実施形態では、E2 hAペプチドは、UBA3 E1 UFDに結合する。UBA3と結合することが可能な本開示の例示的なヒトE2 hAペプチドを、表4に提供する。ペプチドのUBA3阻害を評価するための方法は、当技術分野において公知であり、本明細書に記載される
配列番号35に関する位置番号付けとの関係で、UBA3と直接相互作用する、例えば、UBA3に結合するUBE2F E2 hA(配列番号35)の残基は、Val-3、Lys-8、Val-11、Lys-12、およびVal-14である(Huang et al., 2009, Mol. Cell, 33(4):483-95を参照されたい)。
配列番号35に関する位置番号付けとの関係で、UBA3との直接相互作用に関与しないUBE2F E2 hA(配列番号35)の残基は、Arg-1、Arg-2、Ser-4、Val-5、Arg-6、Asp-7、Leu-9、Leu-10、Glu-13、Ala-15、およびGlu-16である。
配列番号36に関する位置番号付けとの関係で、UBA3と直接相互作用する、例えば、UBA3に結合するUBE2M E2 hA(配列番号36)の残基は、Lys-2、Ala-3、Gln-7、Leu-8、Gln-11、Lys-12、Ile-14、Asn-15、およびGlu-16である(Huang et al., 2005, Mol. Cell, 17(3):341-350を参照されたい)。
配列番号36に関する位置番号付けとの関係で、UBA3との直接相互作用に関与しないUBE2M E2 hA(配列番号36)の残基は、Lys-1、Ser-4、Ala-5、Ala-6、Arg-9、Ile-10、およびAsp-13である。
本開示は、UBA2に結合し、それを阻害するE2 hAペプチドも提供する。ある特定の実施形態では、E2 hAペプチドは、UBA2 E1 UFDに結合する。UBA2と結合することが可能な本開示の例示的なヒトE2 hAペプチドを、表5に提供する(すなわち、配列番号37)。ペプチドのUBA2阻害を評価するための方法は、当技術分野において公知であり、本明細書に記載される。
配列番号37に関する位置番号付けとの関係で、UBA2と直接相互作用する、例えば、UBA2に結合するUBE2I E2 hA(配列番号37)の残基は、Leu-2、Ser-3、Ala-6、Gln-7、Arg-9、Lys-10、Arg-13、およびLys-14である(Wang et al., 2010, PLoS ONE, 5(12):e15805を参照されたい)。
配列番号37に関する位置番号付けとの関係で、UBA2との直接相互作用に関与しないUBE2I E2 hA(配列番号37)の残基は、Ala-1、Arg-4、Leu-5、Glu-8、Ala-11、Trp-12、およびAsp-15である。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のE2 hAペプチドの修飾されたアミノ酸配列を含むペプチドも、本明細書において提供される。一部の場合には、ペプチドは、修飾されて、構造的安定化をペプチドに導入する(例えば、ペプチドのアルファ-ヘリシティを維持する)。構造的安定化は、例えば、ペプチドの「ステープリング」または「ステッチング」によるものであってもよい。一部の場合には、ステープルまたはステッチは、炭化水素ステープルまたはステッチである。構造的安定化(例えば、内部架橋、例えば、ステープリング、ステッチング)を本明細書に記載のE2 hAペプチド中に導入する修飾は、(i)E2 hAの同族E1酵素との直接相互作用に関与しないE2 hAの面、(ii)E2 hAの極性面と非極性面の界面、および/または(iii)E2 hAの同族E1酵素と直接相互作用するE2 hAの面に位置し得る。一部の場合には、E2 hAペプチドは、E2 hAの極性面と非極性面の界面に、ステープルまたはステッチ(例えば、炭化水素ステープルまたはステッチ)を導入することによって安定化される。一部の場合には、E2 hAペプチドは、E2 hAの同族E1酵素と直接相互作用するE2 hAの面にステープルまたはステッチを導入することによって安定化される、例えば、ステープルは、ヘリックスの相互作用面の相互作用面において疎水性パッチを「模倣」し得る。ある特定の例では、本明細書に記載の構造的に安定化された(例えば、内部で架橋した、例えば、ステープル化)E2 hAペプチドは、1個または複数(例えば、1、2、3、4、5、6、7個)の追加のアミノ酸置換(野生型E2 hAペプチド配列と比較して)、例えば、1個または複数(例えば、1、2、3、4、5、6、7個)の保存的および/または非保存的アミノ酸置換(すなわち、E2 hAに構造的安定化を付与するためになされるアミノ酸置換に加えて、1個または複数のアミノ酸置換)を含有してもよい。ある特定の例では、これらの追加の置換は、E2 hAの同族E1酵素と直接相互作用するアミノ酸置換である。ある特定の例では、これらの追加の置換は、E2 hAの同族E1酵素との直接相互作用に関与しないアミノ酸置換である。ある特定の例では、これらの追加の置換は、E2 hAの同族E1酵素と直接相互作用するアミノ酸と、E2 hAの同族E1酵素との直接相互作用に関与しないアミノ酸の両方の置換である。ある特定の例では、本明細書に記載の構造的に安定化された(例えば、内部で架橋した、例えば、ステープル化)E2 hAペプチドは、E2 hAのN末端および/またはC末端からの1個または複数(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個)の欠失を含有し得る。例えば、構造的に安定化された(例えば、内部で架橋した、例えば、ステープル化)E2 hAペプチドは、5またはそれより長い(例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、23、27)アミノ酸長であり得る。ある特定の例では、構造的に安定化された(例えば、内部で架橋した、例えば、ステープル化)E2 hAペプチドは、5~11アミノ酸長である。ある特定の例では、構造的に安定化された(例えば、内部で架橋した、例えば、ステープル化)E2 hAペプチドは、5~17アミノ酸長である。ある特定の例では、構造的に安定化された(例えば、内部で架橋した、例えば、ステープル化)E2 hAペプチドは、11~17アミノ酸長である。ある特定の例では、構造的に安定化された(例えば、内部で架橋した、例えば、ステープル化)E2 hAペプチドは、5~27アミノ酸長である。ある特定の例では、構造的に安定化された(例えば、内部で架橋した、例えば、ステープル化)E2 hAペプチドは、11~27アミノ酸長である。ある特定の例では、構造的に安定化された(例えば、内部で架橋した、例えば、ステープル化)E2 hAペプチドは、17~27アミノ酸長である。
ある特定の実施形態では、本開示のE2 hAペプチドは、配列番号1~38のいずれか1つにおいて、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、または13個のアミノ酸置換を有し得る(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、または13個のアミノ酸が保存的にまたは非保存的に置換されている)。例えば、ある特定の実施形態では、本開示のE2 hAペプチドは、配列番号4に示される配列の修飾されたアミノ酸配列であって、配列番号4の配列において、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、または13個のアミノ酸置換を有する配列番号4を含む、修飾されたアミノ酸配列を含む(例えば、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号4の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、または13個のアミノ酸が、保存的または非保存的に置換されているアミノ酸であることを除いて、配列番号4を含む)。別の例において、ある特定の実施形態では、本開示のE2 hAペプチドは、配列番号6に示される配列の修飾されたアミノ酸配列であって、配列番号6の配列において、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、または13個のアミノ酸置換を有する配列番号6を含む、修飾されたアミノ酸配列を含む(例えば、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号6の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、または13個のアミノ酸が、保存的または非保存的に置換されているアミノ酸であることを除いて、配列番号6を含む)。別の例において、ある特定の実施形態では、本開示のE2 hAペプチドは、配列番号10に示される配列の修飾されたアミノ酸配列であって、配列番号10の配列において、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、または13個のアミノ酸置換を有する配列番号10を含む、修飾されたアミノ酸配列を含む(例えば、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号10の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、または13個のアミノ酸が、保存的または非保存的に置換されているアミノ酸であることを除いて、配列番号10を含む)。「保存的アミノ酸置換」は、この置換によって、1個のアミノ酸が、類似する側鎖を有する別のアミノ酸残基で置き換えられていることを意味する。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。一部の例では、配列番号1~38のいずれか1つの1~3個のアミノ酸が置換されている。配列番号1~38のいずれか1つにおけるアミノ酸置換は、E2 hAの同族E1酵素と直接相互作用する(または直接相互作用することが予測される)か、またはE2 hAの同族E1酵素との直接相互作用に関与しない(または直接相互作用に関与しないことが予測される)アミノ酸置換であり得る。さらにより多くの変動性は、E2 hAの同族E1酵素と直接相互作用する(または直接相互作用することが予測される)E2 hAのアミノ酸においてよりも、E2 hAの同族E1酵素との直接相互作用に関与しない(または直接相互作用に関与しないことが予測される)E2 hAのアミノ酸において許容される。実際に、E2 hAの同族E1酵素との直接相互作用に関与しない(または直接相互作用に関与しないことが予測される)アミノ酸のほぼすべては、置換され得る(例えば、保存的もしくは非保存的アミノ酸置換またはアラニンでの置換)。ある特定の実施形態では、E2 hAの同族E1酵素と直接相互作用する(または直接相互作用することが予測される)1、2、または3個のE2 hAのアミノ酸は、別のアミノ酸で置換されている。一部の例では、置換(複数可)は、保存的アミノ酸置換である。他の例では、置換(複数可)は、非保存的アミノ酸置換である。一部の例では、1個より多くのアミノ酸置換が存在する場合、置換は、保存的アミノ酸置換と非保存的アミノ酸置換の両方である。一部の例では、1個より多くのアミノ酸置換が存在する場合、置換のそれぞれは、保存的アミノ酸置換である。一部の場合には、配列番号1~38のいずれか1つの1~3個のアミノ酸(例えば、1、2、または3個)が置換されている場合、置換は、すべて、E2 hAの同族E1酵素との直接相互作用に関与しない(または直接相互作用に関与しないことが予測される)E2 hAのアミノ酸置換である。一部の場合には、配列番号1~38のいずれか1つの1~3個のアミノ酸(例えば、1、2、または3個)が置換されている場合、置換は、すべて、E2 hAの同族E1酵素と直接相互作用する(または直接相互作用することが予測される)E2 hAのアミノ酸置換である。一部の場合には、配列番号1~38のいずれか1つの1~3個のアミノ酸(例えば、1、2、または3個)が置換されている場合、置換は、E2 hAの同族E1酵素と直接相互作用する(または直接相互作用することが予測される)E2 hAのアミノ酸置換およびE2 hAの同族E1酵素との直接相互作用に関与しない(または直接相互作用に関与しないことが予測される)E2 hAのアミノ酸置換の両方である。ある特定の実施形態では、配列番号132のアミノ酸位置8および11位のそれぞれ、もしくは配列番号4の安定化されたバージョン、またはそのトランケートされたバージョン(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個のアミノ酸は、N末端および/またはC末端から除去されている)は、別のアミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、配列番号132のアミノ酸位置8および11位のそれぞれ、もしくは配列番号4の安定化されたバージョン、またはそのトランケートされたバージョン(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個のアミノ酸は、N末端および/またはC末端から除去されている)は、グルタミン酸で置換されている。ある特定の実施形態では、配列番号132のアミノ酸位置4、6、11、14、および15位のそれぞれ、もしくは配列番号4の安定化されたバージョン、またはそのトランケートされたバージョン(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個のアミノ酸は、N末端および/またはC末端から除去されている)は、アラニンで置換されている。ある特定の実施形態では、配列番号132のアミノ酸位置4、14、および15位のそれぞれ、もしくは配列番号4の安定化されたバージョン、またはそのトランケートされたバージョン(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個のアミノ酸は、N末端および/またはC末端から除去されている)は、アラニンで置換されており、配列番号132のアミノ酸位置6、8、および11位のそれぞれ、もしくは配列番号4の安定化されたバージョン、またはそのトランケートされたバージョン(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個のアミノ酸は、N末端および/またはC末端から除去されている)は、グルタミン酸で置換されている。
ある特定の例では、置換されたアミノ酸(複数可)は、L-Ala、D-Ala、Aib、Sar、Ser、置換されたアラニン、または置換されたグリシン誘導体からなる群から選択される。ある特定の例では、修飾されたUbc15 E2 hAペプチドは、アルギニンで置換されたE7残基(配列番号2に従う番号付け)を含む。
ある特定の実施形態では、本開示のE2 hAペプチドは、配列番号1~38のいずれか1つに示される配列のC末端から除去された/欠失した1、2、3、4、または5個のアミノ酸を有し得る。例えば、ある特定の実施形態では、本開示のE2 hAペプチドは、配列番号4に示されるアミノ酸配列の修飾されたアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ここで、2個のアミノ酸は、配列番号4の配列のC末端から除去されている/欠失している(すなわち、E2 hAペプチドは、配列番号39のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる)。別の例において、ある特定の実施形態では、本開示のE2 hAペプチドは、配列番号6に示されるアミノ酸配列の修飾されたアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ここで、5個のアミノ酸は、配列番号6の配列のC末端から除去されている/欠失している(すなわち、E2 hAペプチドは、配列番号55のアミノ酸を含むかまたはそれからなる)。ある特定の実施形態では、本開示のE2 hAペプチドは、配列番号1~38のいずれか1つに示される配列のN末端から除去された/欠失した1、2、3、4、または5個のアミノ酸を有し得る。ある特定の実施形態では、本開示のUBA1と相互作用するE2 hAペプチドは、配列番号1~34のいずれか1つに示される配列のC末端から除去された/欠失したアミノ酸位置A12~A16を有し得る。例えば、ある特定の実施形態では、本開示のE2 hAペプチドは、配列番号6に示されるアミノ酸配列の修飾されたアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ここで、アミノ酸位置A12~A16は、配列番号6の配列のC末端から除去されている/欠失している(すなわち、E2 hAペプチドは、配列番号55のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる)。ある特定の実施形態では、本開示のUBA1に結合するE2 hAペプチドは、配列番号1~34のいずれか1つに示される配列のN末端から除去された/欠失したアミノ酸位置A1に対してN末端側のアミノ酸位置の1、2、3個、またはすべてを有し得る。ある特定の実施形態では、本開示のE2 hAペプチドは、配列番号1~38のいずれか1つに示される配列のN末端とC末端の両方から除去された/欠失した1、2、3、4、または5個のアミノ酸を有し得る。ある特定の実施形態では、本開示のUBA1に結合するE2 hAペプチドは、配列番号1~34のいずれか1つに示される配列のC末端から除去された/欠失した1、2、3、4、または5個のアミノ酸、およびその配列のN末端から除去された/欠失したアミノ酸位置A1に対してN末端側のアミノ酸の1、2、3個、またはすべてを有し得る。例えば、ある特定の実施形態では、本開示のUBA1に結合するE2 hAペプチドは、配列番号6に示されるアミノ酸配列の修飾されたアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ここで、アミノ酸A-3~A-1およびA12~A16は、配列番号6から除去されている/欠失している(すなわち、ペプチドは、配列番号6のアミノ酸A1~A11を含むかまたはそれからなる)。別の例では、ある特定の実施形態では、本開示のUBA1に結合するE2 hAペプチドは、配列番号6に示されるアミノ酸配列の修飾されたアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ここで、アミノ酸A-3~A-1およびA12~A16は、配列番号4から除去されている/欠失している(すなわち、ペプチドは、配列番号4のアミノ酸A1~A11を含むかまたはそれからなる)。さらに別の例において、ある特定の実施形態では、本開示のUBA1に結合するE2 hAペプチドは、配列番号6に示されるアミノ酸配列の修飾されたアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ここで、アミノ酸A12~A16は、配列番号10から除去されている/欠失している(すなわち、ペプチドは、配列番号10のアミノ酸A1~A11を含むかまたはそれからなる)。ある特定の例では、これらの除去されたアミノ酸は、L-Ala、D-Ala、Aib、Sar、Ser、置換されたアラニン、または置換されたグリシン誘導体からなる群から選択される1~6(例えば、1、2、3、4、5、または6)個のアミノ酸で置き換えられ得る。
本開示は、配列番号1~38のいずれか1つに対して、少なくとも14%(例えば、少なくとも14~50%、少なくとも14~45%、少なくとも14~40%、少なくとも14~35%、少なくとも14~30%、少なくとも14~25%、少なくとも14~20%、少なくとも20%~50%、少なくとも20%~45%、少なくとも20%~40%、少なくとも20%~35%、少なくとも20%~30%、少なくとも20%~25%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも27%、少なくとも34%、少なくとも40% 少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%)同一であるE2 hAペプチドも包含する。配列番号1~38のいずれか1つのアミノ酸配列における変動性は、アルファヘリックスの直接相互作用する側と直接相互作用しない側の一方または両方に存在し得る。E2 hAの同族E1酵素との直接相互作用に関与しない(または直接相互作用に関与しないことが予測される)E2 hAのアミノ酸のほぼすべては、変更され得る。E2 hAの同族E1酵素と直接相互作用する(または直接相互作用することが予測される)E2 hAのアミノ酸も変更され得る。具体的な実施形態では、E2 hAペプチドは、配列番号1~38のいずれか1つに対して、少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む。具体的な実施形態では、E2 hAペプチドは、配列番号1~38のいずれか1つに対して、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。具体的な実施形態では、E2 hAペプチドは、配列番号1~38、99、および55のいずれか1つのアミノ酸配列からなる。アミノ酸配列間の同一性パーセントを決定するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、配列は、最適な比較のためにアラインされる(例えば、最適なアライメントのために、第1および第2のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップが導入されてもよく、比較のために非相同配列が無視されてもよい)。好ましい実施形態では、比較のためにアラインされた参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、さらにより好ましくは少なくとも60%、さらにより好ましくは少なくとも70%、80%、90%、または100%である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第1の配列における位置が、第2の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められる場合には、分子はその位置において同一である。2つのアミノ酸配列間の同一性パーセントの決定は、BLAST2.0プログラムを使用して達成される。配列比較は、ギャップなしのアライメントを使用し、デフォルトパラメーターを使用して実施される(Blossom62マトリックス、ギャップ存在コスト11、残基当たりギャップコスト1、およびラムダ比0.85)。BLASTプログラムで使用した数学アルゴリズムは、Altschulら(Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997)に記載されている。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号1~38のいずれか1つのバリアントを特徴とし、ここで、ペプチドのバリアントは、E1に非共有結合により結合する(例えば、配列番号1~34に関するUBA1、配列番号38に関するUBA6、配列番号37に関するUBA2、ならびに配列番号35および36に関するUBA3)。
ある特定の例では、E2 hAペプチドは、以下の表6に示されるアミノ酸配列を有する。本開示は、これらのバリアントE2 hAペプチドの安定化されたバージョン(例えば、内部で架橋したバージョン)も特徴とする。例えば、例えば、3または6個のアミノ酸によって分離されたこれらのバリアントの2個の(またはそれより多い)残基は、オレフィンのメタセシスによって架橋を形成することができる非天然アミノ酸で置き換えられている。架橋は、E2 hAペプチドのその同族E1酵素への結合を破壊しない場所で、これらのバリアント内に配置される。一部の例では、バリアントE2 hAペプチドは、炭化水素ステープルもしくはステッチ、ラクタムステープルもしくはステッチ;UV-環化付加ステープルもしくはステッチ;オキシムステープルもしくはステッチ;チオエーテルステープルもしくはステッチ;ダブルクリックステープルもしくはステッチ;ビス-ラクタムステープルもしくはステッチ;ビス-アリール化ステープルもしくはステッチ;またはこれらのいずれか2つもしくはそれより多くの組合せによって安定化される。
表6. 例示的なバリアントE2 hAペプチド
表6. 例示的なバリアントE2 hAペプチド
本明細書に記載のE2 hAペプチドは、治療使用のために最適化され得る。例えば、上記E2 hAペプチドのいずれかが膜破壊(細胞溶解)を引き起こす場合、全体的なペプチドの疎水性を低下させることによってペプチドを最適化することができる。例えば、これは、特に、疎水性残基を、より低い疎水性を有するアミノ酸(例えば、アラニン)で置換することによって達成され得る。膜破壊は、ペプチドの全体的な正荷電を低下させることによって低下させることもできる。これは、塩基性残基を荷電していないかまたは酸性の残基で置換することによって達成することもできる。ある特定の例では、全体的なペプチドの疎水性とペプチドの全体的な正荷電の両方が低下される。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のE2 hAペプチドは、5から35の間のアミノ酸長、5から25の間のアミノ酸長、5から20の間のアミノ酸長、5から18の間のアミノ酸長、10から35の間のアミノ酸長、10から25の間のアミノ酸長、10から20の間のアミノ酸長、10から18の間のアミノ酸長、15から26の間のアミノ酸長、15から18の間のアミノ酸長、または10から28の間のアミノ酸長である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のE2 hAペプチドは、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、または27アミノ酸長である。
ある特定の例では、本明細書に記載のE2 hAペプチドは、構造的に安定化されている。これらのE2 hAペプチドを安定化させるために、ペプチドは、ペプチドがステープル化および/またはステッチ化され得るように、例えば、E2 hAペプチドのアミノ酸を非天然アミノ酸で置き換える2個またはそれより多い置換を含み得る。
安定化されたペプチド
安定化されたペプチド
ペプチドヘリックスは、アポトーシスなどの多くの重要な生物学的プロセスを調節する鍵となるタンパク質-タンパク質相互作用の重要な媒介物であるが、このようなヘリックスがタンパク質内でその環境(context)から取り除かれ、単離して調製されると、通常ランダムコイル立体構造をとり、生物活性の大幅な低下、よって、治療ポテンシャルの減少をもたらす。本開示は、E2 hAの構造的に安定化されたペプチドを提供する。本開示は、内部(分子内)架橋(またはステープル)によって接合した少なくとも2個の修飾されたアミノ酸を含み、ある特定の例では、構造的に安定化されたペプチドが結合する標的タンパク質(例えば、E1)内のシステイン(Cys)残基と共有結合を形成することができる反応性基(求電子性基を有する非天然アミノ酸などの「弾頭部」)を有する、構造的に安定化されたE2 hAペプチド(上記のものなど)を含む。本明細書に記載されている安定化されたペプチドは、ステープルペプチドおよびステッチペプチド(stitched peptide)、ならびに複数のステッチ、複数のステープルもしくはステープルとステッチの混合物を含有するペプチド、または構造強化のための他の化学的戦略を含む(例えば、Balaram P. Cur. Opin. Struct. Biol. 1992;2:845;Kemp DS, et al., J. Am. Chem. Soc. 1996;118:4240;Orner BP, et al., J. Am. Chem. Soc. 2001;123:5382;Chin JW, et al., Int. Ed. 2001;40:3806;Chapman RN, et al., J. Am. Chem. Soc. 2004;126:12252;Horne WS, et al., Chem., Int. Ed. 2008;47:2853;Madden et al., Chem Commun (Camb). 2009 Oct 7; (37): 5588-5590;Lau et al., Chem. Soc. Rev., 2015,44:91-102;およびGunnoo et al., Org. Biomol. Chem., 2016,14:8002-8013を参照されたい;これらのすべては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のE2 hAペプチドの1つまたは複数は、ペプチドステープリングによって安定化され得る(例えば、Walensky, J. Med. Chem., 57:6275-6288 (2014)を参照されたい(その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる))。ペプチドは、それが、その天然の二次構造を維持するという点で「安定化」される。例えば、ステープリングは、α-ヘリックス二次構造を有しやすくなったポリペプチドが、その天然のα-ヘリックス立体構造を維持するのを可能にする。この二次構造は、ポリペプチドのタンパク質切断および熱に対する耐性を増加させ、標的結合親和性、疎水性、および細胞透過性も増加させることができる。したがって、本明細書に記載のステープル化(架橋した)ポリペプチドは、対応するステープル無し(non-stapled)(架橋していない)ポリペプチドと比較して、改善された生物活性を有する。
「ペプチドステープリング」は、合成方法論からの造語であり、ポリペプチド鎖に存在する2つのオレフィン含有側鎖(例えば、架橋可能な側鎖)が、閉環メタセシス(RCM)反応を使用して共有結合により接合され(例えば、「一緒にステープルされる(stapled together)」)、架橋環を形成する(例えば、Blackwell et al., J. Org. Chem., 66: 5291-5302, 2001;Angew et al., Chem. Int. Ed. 37:3281, 1994を参照されたい)。本明細書で使用される場合、用語「ペプチドステープリング」は、このような反応を促進するいくつもの反応条件および/または触媒を使用して、ポリペプチド鎖に存在し得る2つの二重結合含有側鎖、2つの三重結合含有側鎖、または二重結合含有側鎖と三重結合含有側鎖(例えば、それらの少なくとも1つの対)を接合して、単独で「ステープル化された」ポリペプチドを得ることを含む。用語「複合ステープル化」ポリペプチドは、1つより多くの個々のステープルを含有するこれらのポリペプチドを指し、様々な間隔の2、3、またはそれより多い独立したステープルを含有し得る。さらに、用語「ペプチドステッチング」は、本明細書で使用される場合、単一のポリペプチド鎖における複数かつタンデムな「ステープリング」事象を指し、例えば、2つのステープルが共通の残基に連結した「ステッチ化」(例えば、タンデムまたは複合ステープル化)ポリペプチドを提供する。ペプチドステッチングは、例えば、WO2008/121767およびWO2010/068684に開示されており、これらはいずれも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の例では、ステープルは、本明細書において使用される場合、不飽和結合を保持することができ、または低減され得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のペプチドの1つまたは複数は、安定化され得る。一部の例では、本開示のE2 hAペプチドは、炭化水素ステープルもしくはステッチ、ラクタムステープルもしくはステッチ;UV-環化付加ステープルもしくはステッチ;オキシムステープルもしくはステッチ;チオエーテルステープルもしくはステッチ;ダブルクリックステープルもしくはステッチ;ビス-ラクタムステープルもしくはステッチ;ビス-アリール化ステープルもしくはステッチ;またはこれらのいずれか2つもしくはそれより多くの組合せによって安定化される。一例では、本明細書に記載のペプチドは、炭化水素ステープリングによって安定化される。一部の実施形態では、ステープルペプチドは、配列番号1~39、55~63、または792~806のアミノ酸配列のいずれか1つを含むかまたはそれからなるポリペプチドの架橋バージョンである。一部の例では、ステープルペプチドは、配列番号1~39、55~63、または792~806のアミノ酸配列のいずれか1つを含むかまたはそれからなるポリペプチドの炭化水素ステープル化バージョンである。一部の例では、ステープルペプチドは、配列番号1~39、55~63、または792~806の少なくとも2(例えば、2、3、4、5、6)個のアミノ酸が非天然アミノ酸(例えば、S5、R8)で置き換えられていることを除き、配列番号1~39、55~63、または792~806のアミノ酸配列のいずれか1つを含むかまたはそれからなるポリペプチドである。一部の実施形態では、ステープルペプチドは、配列番号1~38のアミノ酸配列のいずれか1つを含むかもしくはそれからなる、またはこの中に、1~13(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、または13)個のアミノ酸の置換、欠失および/もしくは挿入を含む(例えば、上記および以下の実施例に記載されるように、例えば、配列番号39、55、または47)ポリペプチドである。ある特定の例では、ステープルペプチドは、少なくとも2(例えば、2、3、4、5、6)個のアミノ酸置換を含み、ここで、置換されたアミノ酸は、2、3、または6個のアミノ酸で分離され、かつオレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸である。そのいずれかが本開示のペプチドに含まれ得る多くの公知の非天然(non-natural)または不自然な(unnatural)アミノ酸が存在する。不自然なアミノ酸のいくつかの例は、4-ヒドロキシプロリン、デスモシン、ガンマ-アミノ酪酸、ベータ-シアノアラニン、ノルバリン、4-(E)-ブテニル-4(R)-メチル-N-メチル-L-トレオニン、N-メチル-L-ロイシン、1-アミノ-シクロプロパンカルボン酸、1-アミノ-2-フェニル-シクロプロパンカルボン酸、1-アミノ-シクロブタンカルボン酸、4-アミノ-シクロペンテンカルボン酸、3-アミノ-シクロヘキサンカルボン酸、4-ピペリジル酢酸、4-アミノ-l-メチルピロール-2-カルボン酸、2,4-ジアミノ酪酸、2,3-ジアミノプロピオン酸、2,4-ジアミノ酪酸、2-アミノヘプタン二酸、4-(アミノメチル)安息香酸、4-アミノ安息香酸、オルト-、メタ-および/パラ置換フェニルアラニン(例えば、-C(=O)C6H5;-CF3;-CN;-ハロ;-NO2;CH3で置換された)、二置換フェニルアラニン、置換チロシン(例えば、-C=O)C6H5;-CF3;-CN;-ハロ;-NO2;CH3でさらに置換された)、ならびにスタチンである。さらに、アミノ酸は誘導体化され、ヒドロキシル化、リン酸化、スルホン化、アシル化、またはグリコシル化されたアミノ酸残基を含み得る。
炭化水素ステープルポリペプチド(hydrocarbon stapled polypeptide)は、2個の非天然アミノ酸間に1つまたは複数のテザー(結合)を含み、このテザーによって、ポリペプチドのα-ヘリックス二次構造がかなり増強される。一般的に、テザーは、1つまたは2つのヘリックスターン(すなわち、約3.4または約7個のアミノ酸)の長さを横切って伸長する。したがって、iおよびi+3、iおよびi+4、またはiおよびi+7に配置されたアミノ酸は、化学的修飾および架橋の理想的な候補物質である。よって、例えば、ペプチドが配列...X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9...を有する場合、X1とX4との間、またはX1とX5との間、またはX1とX8との間の架橋は、X2とX5との間、またはX2とX6との間、またはX2とX9との間の架橋などがそうであるように、そのペプチドの有用な炭化水素ステープル化形態(hydrocarbon stapled form)である。複数の架橋(例えば、2、3、4、またはそれより多い)の使用も企図される。複数の架橋の使用は、特にペプチド長が増加したペプチドの安定化および最適化に非常に有効である。よって、本開示は、配列をさらに安定化させるか、または構造的安定化、タンパク質分解耐性、酸安定性、熱安定性、細胞透過性、および/もしくはより長いポリペプチドストレッチの生物活性の増強を促進するために、ポリペプチド配列内に1つより多くの架橋を組み込むことを包含する。炭化水素ステープルポリペプチドの作製および使用に関するさらなる説明は、例えば、米国特許出願公開第2012/0172285号、同第2010/0286057号、および同第2005/0250680号に見出すことができ、これらのすべての内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ある特定の実施形態では、ステープルがiおよびi+3残基に存在する場合、R-プロペニルアラニンおよびS-ペンテニルアラニン;またはR-ペンテニルアラニンおよびS-ペンテニルアラニンは、それらの位置のアミノ酸の代わりとなる。ある特定の実施形態では、ステープルがiおよびi+4残基に存在する場合、S-ペンテニルアラニンは、それらの位置のアミノ酸の代わりとなる。ある特定の実施形態では、ステープルがiおよびi+7残基に存在する場合、S-ペンテニルアラニンおよびR-オクテニルアラニンは、それらの位置のアミノ酸の代わりとなる。一部の例では、ペプチドがステッチ化されている場合、「ステッチ」に関与するペプチドのアミノ酸は、ビス-ペンテニルグリシン、S-ペンテニルアラニン、およびR-オクテニルアラニン;またはビス-ペンテニルグリシン、S-オクテニルアラニン、およびR-オクテニルアラニンで置換されている。
ステープル化されるペプチドでは、ステープリング反応を妨げる(例えば、それを阻害するかまたはその効率を低下させる)アミノ酸は、ステープリング反応を妨げない(例えば、それを阻害しないかまたはその効率を実質的に低下させない)アミノ酸で置換されているべきである。例えば、メチオニン(Met、M)は、ステープリング反応を妨げる場合があり、よって、ある特定の実施形態では、ステープル化されるペプチド内のメチオニン(複数可)は、例えば、ノルロイシン(複数可)で置き換えられている。
ペプチドがUBA1に結合するE2 hA(例えば、配列番号1~34のいずれか1つまたはその修飾されたバージョン(例えば、配列番号39、55、または57))である、ある特定の実施形態では、ステープルおよび/またはステッチは、位置A2およびA9、A5およびA9、A8およびA12、A9およびA13、A1およびA8、A4およびA11、またはA5およびA12において作製される。ペプチドがUBA1に結合するE2 hA(例えば、配列番号1~34のいずれか1つまたはその修飾されたバージョン(例えば、配列番号39、55、もしくは57、またはその修飾されたバージョン))である、ある特定の実施形態では、ステープルおよび/またはステッチは、位置A2およびA9において作製される(例示的なステープルペプチドに関する表7を参照されたい)。ペプチドがUBA1に結合するE2 hA(例えば、配列番号1~34のいずれか1つまたはその修飾されたバージョン(例えば、配列番号39、55、もしくは57、またはその修飾されたバージョン))である、ある特定の実施形態では、ステープルおよび/またはステッチは、位置A1およびA8において作製される。ステープル位置は、ステープルウォークにおいて異なるステープルの場所を試験することによって変更され得る。
ペプチドが配列番号35またはその修飾されたバージョンを含むかまたはそれからなる、ある特定の実施形態では、ステープルおよび/またはステッチは、位置Arg-6およびGlu-13において作製される。ペプチドが配列番号36またはその修飾されたバージョンを含むかまたはそれからなる、ある特定の実施形態では、ステープルおよび/またはステッチは、位置Ala-6およびAsp-13において作製される。ペプチドが配列番号37またはその修飾されたバージョンを含むかまたはそれからなる、ある特定の実施形態では、ステープルおよび/またはステッチは、位置Leu-5およびTrp-12において作製される。ペプチドが配列番号38またはその修飾されたバージョンを含むかまたはそれからなる、ある特定の実施形態では、ステープルおよび/またはステッチは、位置Ala-3およびLeu-10において作製される。例示的なステープルペプチドに関しては、表7および8を参照されたい。
表7. 例示的なステープルペプチド。配列番号64~99および850(それぞれ、上から下へ):「B」はノルロイシンであり、「X1」および「X2」は、架橋環を形成するために閉環メタセシス(RCM)反応を使用して共有結合により接合され得る(「一緒にステープルされる」)非天然アミノ酸である。配列番号100~135および851(それぞれ、上から下へ):「B」はノルロイシンであり、「X1」はR-オクテニルアラニンであり、「X2」はS-ペンテニルアラニンである。「tr」=トランケート;「m」=変異体
表8. 例示的なステープルペプチド。配列番号136~139(それぞれ、上から下へ):「B」はノルロイシンであり、「X1」および「X2」は、架橋環を形成するために閉環メタセシス(RCM)反応を使用して共有結合により接合され得る(「一緒にステープルされる」)非天然アミノ酸である。配列番号140~143(それぞれ、上から下へ):「B」はノルロイシンであり、「X1」はR-オクテニルアラニンであり、「X2」はS-ペンテニルアラニンである。
図26の上のパネルは、様々な架橋した化合物を生成するために使用することができる非天然アミノ酸の例示的な化学構造を示す。図26の真ん中のパネルは、位置iおよびi+3、iおよびi+4、ならびにiおよびi+7の残基の間の炭化水素架橋を有するペプチドを図示する。図26の下のパネルは、ペプチド配列に沿ったステープルウォークを図示する。図27は、二重および三重ステープリング戦略、ならびに例示的なステープルウォークを有する様々なペプチド配列を示す。図28は、様々な長さの分岐ステッチ化部分(branched stitched moieties)を使用する例示的なステープルウォークを図示する。図29は、点変異体およびステープルスキャン、ならびにNおよびC末端の欠失、付加、および/または誘導体化に基づくペプチドのバリアントを図示する。
一態様では、安定化されたE2 hAペプチドは、式(I)、
(式中、
各R1およびR2は、独立して、H、またはC1~C10アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、もしくはヘテロシクリルアルキルであり;
R3は、アルキル、アルケニル、アルキニル;[R4-K-R4]nであり;そのそれぞれは、0~6個のR5で置換されており;
R4は、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり;
R5は、ハロ、アルキル、OR6、N(R6)2、SR6、SOR6、SO2R6、CO2R6、R6、蛍光部分、または放射性同位体であり;
Kは、O、S、SO、SO2、CO、CO2、CONR6、または
であり、
R6は、H、アルキル、または治療剤であり;
nは、1~4の整数であり;
xは、2~10の整数であり;
各yは、独立して、0~100の整数であり;
zは、1~10の整数(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)であり;
各Xaaは、独立して、アミノ酸である)
を有する。一部の実施形態では、式(I)のN末端の[Xaa]y、式(I)の[Xaa]x、および式(I)のC末端の[Xaa]yのそれぞれは、表9の構築物1~225のいずれか1つについて記載された通りである。例えば、表9の構築物7のN末端の[Xaa]y、[Xaa]x、およびC末端の[Xaa]yを含む安定化されたペプチドに関して、N末端の[Xaa]y、[Xaa]x、およびC末端の[Xaa]yは、(i)それぞれ、配列番号871、配列番号872、および配列番号873、(ii)それぞれ、P、配列番号872、および配列番号873、(iii)それぞれ、P、配列番号872、およびFK、または(iv)それぞれ、配列番号871、配列番号872、およびFKであり得る。
各R1およびR2は、独立して、H、またはC1~C10アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、もしくはヘテロシクリルアルキルであり;
R3は、アルキル、アルケニル、アルキニル;[R4-K-R4]nであり;そのそれぞれは、0~6個のR5で置換されており;
R4は、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり;
R5は、ハロ、アルキル、OR6、N(R6)2、SR6、SOR6、SO2R6、CO2R6、R6、蛍光部分、または放射性同位体であり;
Kは、O、S、SO、SO2、CO、CO2、CONR6、または
R6は、H、アルキル、または治療剤であり;
nは、1~4の整数であり;
xは、2~10の整数であり;
各yは、独立して、0~100の整数であり;
zは、1~10の整数(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)であり;
各Xaaは、独立して、アミノ酸である)
を有する。一部の実施形態では、式(I)のN末端の[Xaa]y、式(I)の[Xaa]x、および式(I)のC末端の[Xaa]yのそれぞれは、表9の構築物1~225のいずれか1つについて記載された通りである。例えば、表9の構築物7のN末端の[Xaa]y、[Xaa]x、およびC末端の[Xaa]yを含む安定化されたペプチドに関して、N末端の[Xaa]y、[Xaa]x、およびC末端の[Xaa]yは、(i)それぞれ、配列番号871、配列番号872、および配列番号873、(ii)それぞれ、P、配列番号872、および配列番号873、(iii)それぞれ、P、配列番号872、およびFK、または(iv)それぞれ、配列番号871、配列番号872、およびFKであり得る。
ある特定の例では、表9において上記に示される配列のメチオニン(M)は、ノルロイシン(B)で置き換えられている。ある特定の例では、表9において上記で示される配列は、少なくとも1個(例えば、1、2、3、4、5、6個)のアミノ酸の置換または欠失を有し得る。E2 hAペプチドは、本明細書に記載の任意のアミノ酸配列を含み得る。
テザーは、アルキル、アルケニル、またはアルキニル部分(例えば、C5、C8、もしくはC11アルキル、C5、C8、もしくはC11アルケニル、またはC5、C8、もしくはC11アルキニル)を含み得る。テザーアミノ酸(tethered amino acid)は、アルファ二置換されていてもよい(例えば、C1~C3またはメチル)。
一部の例では、xは、2、3、または6である。一部の例では、各yは、独立して、0から15の間、または3から15の間の整数である。一部の例では、R1およびR2は、それぞれ独立して、HまたはC1~C6アルキルである。一部の例では、R1およびR2は、それぞれ独立して、C1~C3アルキルである。一部の例では、R1およびR2のうちの少なくとも1つは、メチルである。例えば、R1およびR2は、いずれもメチルであってもよい。一部の例では、R3はアルキル(例えば、C8アルキル)であり、xは3である。一部の例では、R3はC11アルキルであり、xは6である。一部の例では、R3はアルケニル(例えば、C8アルケニル)であり、xは3である。一部の例では、xは6であり、R3はC11アルケニルである。一部の例では、R3は、直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニルである。一部の例では、R3は、-CH2-CH2-CH2-CH=CH-CH2-CH2-CH2-である。
別の態様では、2つのアルファ、アルファ二置換立体中心は、いずれもR配置もしくはS配置(例えば、i、i+4架橋)であるか、または一方の立体中心がRであり、他方がSである(例えば、i、i+7架橋)。よって、ここで、式(I)は以下のように示され:
C’およびC’’の二置換立体中心は、いずれもR配置であってもよく、または、これらは、いずれもS配置であってもよい(例えば、xが3の場合)。xが6である場合、C’の二置換立体中心は、R配置にあり、C’’の二置換立体中心は、S配置にある。R3の二重結合は、EまたはZ立体化学配置にあってもよい。
一部の例では、R3は[R4-K-R4]nであり、R4は直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニルである。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号1~38のいずれか1つ(またはその修飾されたバージョン(例えば、配列番号39、55、もしくは57、またはその修飾されたバージョン)のアミノ酸配列を含む内部で架橋した(「ステープル化」または「ステッチ化」)ペプチドであって、2、3、または6個のアミノ酸によって分離された2個のアミノ酸の側鎖が、内部ステープルによって置き換えられているか;3個のアミノ酸の側鎖が、内部ステッチによって置き換えられているか;4個のアミノ酸の側鎖が、2つの内部ステープルによって置き換えられているか;または5個のアミノ酸の側鎖が、内部ステープルと内部ステッチの組合せによって置き換えられている、ペプチドを特徴とする。ある特定の例では、配列番号1の位置Met-1、Leu-3、Lys-4、Asn-7、Leu-10、およびAla-11の1個または複数におけるアミノ酸は、ステープルやステッチで置き換えられていない。ある特定の例では、配列番号2の位置Met-1、Pro-2、Ser-3、Ser-4、Glu-7、Arg-11、Lys-12、Leu-14、Lys-15、およびGln-18の1個または複数におけるアミノ酸は、ステープルやステッチで置き換えられていない。ある特定の例では、配列番号3~20および22~34のいずれか1個の位置A4、A6、A7、A10、および必要に応じてA13の1個または複数におけるアミノ酸は、ステープルやステッチで置き換えられていない。ある特定の例では、配列番号21の位置Met-1、Arg-3、Ala-4、Ser-5、Leu-7、Lys-8、Arg-9、Leu-11、His-12、およびAla-15の1個または複数におけるアミノ酸は、ステープルやステッチで置き換えられていない。ある特定の例では、配列番号35の位置Val-3、Lys-8、Val-11、Lys-12、およびVal-14の1個または複数におけるアミノ酸は、ステープルやステッチで置き換えられていない。ある特定の例では、配列番号36のいずれか1個の位置Lys-2、Ala-3、Gln-7、Leu-8、Gln-11、Lys-12、Ile-14、Asn-15、およびGlu-16の1個または複数におけるアミノ酸は、ステープルやステッチで置き換えられていない。ある特定の例では、配列番号37の位置Leu-2、Ser-3、Ala-6、Gln-7、Arg-9、Lys-10、Arg-13、およびLys-14の1個または複数におけるアミノ酸は、ステープルやステッチで置き換えられていない。ある特定の例では、配列番号38の位置Arg-5、Glu-7、Leu-8、Val-11、およびLeu-14の1個または複数におけるアミノ酸は、ステープルやステッチで置き換えられていない。ステープル化/ステッチ化ペプチドは、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50アミノ酸長であり得る。具体的な実施形態では、ステープル化/ステッチ化ペプチドは、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25アミノ酸長である。具体的な実施形態では、ステープル化/ステッチ化ペプチドは、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、または18アミノ酸長である。具体的な実施形態では、ステープル化/ステッチ化ペプチドは、11アミノ酸長である。具体的な実施形態では、ステープル化/ステッチ化ペプチドは、12アミノ酸長である。例示的なE2 hAステープルペプチドは、表7、8、および11~15に示される。一実施形態では、E2 hAステープルペプチドは、配列番号65、96、101、および132に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、E2 hAステープルペプチドは、配列番号132に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、E2 hAステープルペプチドは、配列番号67、97、103、および133に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、E2 hAステープルペプチドは、配列番号71および107に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。ある特定の実施形態では、ステープルポリペプチド(stapled polypeptide)は、配列番号1~39、55~63、792~806のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ここで、2、3または6個のアミノ酸によって分離された少なくとも2個のアミノ酸が、ペプチドを構造的に安定させるために修飾される(例えば、それらを非天然アミノ酸で置換し、炭化水素ステープリングを可能にすることによって)。ある特定の実施形態では、ステープルポリペプチドは、配列番号1~39、55~63、792~806のいずれか1つに示されるアミノ酸配列のバリアントを含むかまたはそれからなり、ここで、2、3または6個のアミノ酸によって分離された少なくとも2個のアミノ酸が、ペプチドを構造的に安定させるために修飾される(例えば、それらを非天然アミノ酸で置換し、炭化水素ステープリングを可能にすることによって)。ある特定の実施形態では、ステープルポリペプチドは、配列番号4(またはその修飾されたバージョン)に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ここで、2、3または6個のアミノ酸によって分離された少なくとも2個のアミノ酸が、ペプチドを構造的に安定させるために修飾される(例えば、それらを非天然アミノ酸で置換し、炭化水素ステープリングを可能にすることによって)。ある特定の実施形態では、ステープルポリペプチドは、配列番号39(またはその修飾されたバージョン)に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ここで、2、3または6個のアミノ酸によって分離された少なくとも2個のアミノ酸が、ペプチドを構造的に安定させるために修飾される(例えば、それらを非天然アミノ酸で置換し、炭化水素ステープリングを可能にすることによって)。ある特定の実施形態では、ステープルポリペプチドは、配列番号6(またはその修飾されたバージョン)に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ここで、2、3または6個のアミノ酸によって分離された少なくとも2個のアミノ酸が、ペプチドを構造的に安定させるために修飾される(例えば、それらを非天然アミノ酸で置換し、炭化水素ステープリングを可能にすることによって)。ある特定の実施形態では、ステープルポリペプチドは、配列番号55(またはその修飾されたバージョン)に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ここで、2、3または6個のアミノ酸によって分離された少なくとも2個のアミノ酸が、ペプチドを構造的に安定させるために修飾される(例えば、それらを非天然アミノ酸で置換し、炭化水素ステープリングを可能にすることによって)。ある特定の実施形態では、ステープルポリペプチドは、配列番号10(またはその修飾されたバージョン)に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ここで、2、3または6個のアミノ酸によって分離された少なくとも2個のアミノ酸が、ペプチドを構造的に安定させるために修飾される(例えば、それらを非天然アミノ酸で置換し、炭化水素ステープリングを可能にすることによって)。ある特定の実施形態では、ステープルポリペプチドは、配列番号57(またはその修飾されたバージョン)に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ここで、2、3または6個のアミノ酸によって分離された少なくとも2個のアミノ酸が、ペプチドを構造的に安定させるために修飾される(例えば、それらを非天然アミノ酸で置換し、炭化水素ステープリングを可能にすることによって)。
炭化水素テザーは一般的であるが、本明細書に記載のE2 hAペプチドにおいては、他のテザーを用いることもできる。例えば、テザーは、エーテル、チオエーテル、エステル、アミン、またはアミド、またはトリアゾール部分の1つまたは複数を含んでもよい。一部の場合には、天然に存在するアミノ酸側鎖は、テザーに組み込まれてもよい。例えば、テザーは、セリンのヒドロキシル、システインのチオール、リシンの第一級アミン、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸の酸、またはアスパラギンもしくはグルタミンのアミドなどの官能基と連結されてもよい。したがって、2個の天然に存在しないアミノ酸を連結させることによって作製されるテザーを使用するよりもむしろ、天然に存在するアミノ酸を使用するテザーを作製することが可能である。単一の天然に存在しないアミノ酸を天然に存在するアミノ酸と一緒に使用することも可能である。トリアゾールを含有する(例えば、1,4トリアゾールまたは1,5トリアゾール)架橋を使用することができる(例えば、Kawamoto et al. 2012 Journal of Medicinal Chemistry 55:1137;WO2010/060112を参照されたい)。さらに、様々なタイプのステープリングを実施する他の方法が、当技術分野において周知であり、本明細書に記載のE2 hAペプチドと共に用いられ得る(例えば、ラクタムステープリング:Shepherd et al., J. Am. Chem. Soc., 127:2974-2983 (2005);UV-環化付加ステープリング:Madden et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 21:1472-1475 (2011);ジスルフィドステープリング:Jackson et al., Am. Chem. Soc., 113:9391-9392 (1991);オキシムステープリング:Haney et al., Chem. Commun., 47:10915-10917 (2011);チオエーテルステープリング:Brunel and Dawson, Chem. Commun., 552-2554 (2005);光スイッチ可能ステープリング:J. R. Kumita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 97:3803-3808 (2000);ダブルクリックステープリング:Lau et al., Chem. Sci., 5:1804-1809 (2014);ビス-ラクタムステープリング:J. C. Phelan et al., J. Am. Chem. Soc., 119:455-460 (1997);およびビス-アリール化ステープリング:A. M. Spokoyny et al., J. Am. Chem. Soc., 135:5946-5949 (2013)を参照されたい)。
テザーの長さが変更され得ることが、さらに想起される。例えば、二次アルファ-ヘリックス構造に関して比較的高い度合いの拘束をもたらすのが望ましい場合には、より短い長さのテザーを使用することができ、一方、一部の例では、二次アルファ-ヘリックス構造に関してそれほど拘束性をもたらさないのが望ましいため、より長いテザーが望ましい場合がある。
さらに、アミノ酸i~i+3、i~i+4、およびi~i+7に及ぶテザーは、アルファヘリックスの単一の面に主に存在するテザーを提供するために一般的であるが、テザーを合成して多数のアミノ酸の任意の組合せに広げてもよく、テザーを組み合わせて使用して複数のテザーを取り付けてもよい。
一部の例では、本明細書に記載の炭化水素テザー(すなわち、架橋)は、さらに操作されてもよい。一例では、炭化水素アルケニルテザー(例えば、ルテニウムに触媒される閉環メタセシス(RCM)を使用して合成される)の二重結合を酸化させて(例えば、エポキシ化、アミノヒドロキシル化またはジヒドロキシル化によって)、以下の化合物のうちの1つをもたらすことができる。
エポキシド部分または遊離ヒドロキシル部分の1つのいずれかは、さらに官能化されてもよい。例えば、エポキシドを求核剤で処置して、例えば、治療剤を結合させるために使用することができるさらなる官能性を与えてもよい。あるいは、このような誘導体化は、ポリペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシ末端の合成操作によって、またはアミノ酸側鎖によって達成されてもよい。他の作用物質(agent)、例えば、ポリペプチドの細胞への侵入を促進する作用物質を、官能化テザーに結合させてもよい。
一部の例では、アルファ二置換アミノ酸をポリペプチドにおいて使用し、アルファヘリックス二次構造の安定性を改善する。しかし、アルファ二置換アミノ酸が必要とされず、モノアルファ置換基(例えば、テザーアミノ酸において)を使用する例も想起される。
ステープルポリペプチドは、薬物、毒素、ポリエチレングリコールの誘導体、第2のポリペプチド、炭水化物などを含んでもよい。ポリマーまたは他の作用物質がステープルポリペプチドに連結される場合が、実質的に均質である組成物にとっては望ましい場合がある。
ポリエチレングリコール(PEG)分子の付加によって、ポリペプチドの薬物動態および薬力学特性が改善され得る。例えば、PEG化によって、腎クリアランスが低下する場合があり、より安定した血漿中濃度がもたらされ得る。PEGは水溶性ポリマーであり、以下の式のようなポリペプチドに連結されて表されてもよい:
XO--(CH2CH2O)n--CH2CH2--Y(式中、nは2~10,000であり、XはHであるかまたは末端修飾、例えば、C1~4アルキルであり;Yはポリペプチドのアミン基(リシンのイプシロンアミンまたはN末端を含むがこれらに限定されない)へのアミド、カルバメートまたは尿素の結合である。Yは、チオール基(システインのチオール基を含むがこれらに限定されない)へのマレイミド結合であってもよい)。PEGをポリペプチドに直接または間接的に連結させるための他の方法は、当業者に公知である。PEGは直鎖状であっても分岐状であってもよい。様々な官能化誘導体を含むPEGの様々な形態が市販されている。
主鎖に分解可能な結合を有するPEGを使用してもよい。例えば、PEGは、加水分解の対象であるエステル結合により調製されてもよい。分解可能なPEG結合を有するコンジュゲートが、WO99/34833;WO99/14259、および米国特許第6,348,558号に記載されている。
ある特定の実施形態では、高分子ポリマー(例えば、PEG)は、中間体リンカーを介して本明細書に記載の作用物質に結合される。ある特定の実施形態では、リンカーは、ペプチド結合によって連結された1~20個のアミノ酸から構成され、ここで、アミノ酸は、20種の天然に存在するアミノ酸から選択される。これらのアミノ酸の一部は、当業者によって十分に理解されているように、グリコシル化されてもよい。他の実施形態では、1~20個のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびリシンから選択される。他の実施形態では、リンカーは、立体障害のない主要なアミノ酸、例えば、グリシンおよびアラニンから構成される。非ペプチドリンカーも可能である。例えば、-NH(CH2)nC(O)-(式中、n=2~20)などのアルキルリンカーを使用してもよい。これらのアルキルリンカーは、例えば、低級アルキル(例えば、C1~C6) 低級アシル、ハロゲン(例えば、Cl、Br)、CN、NH2、フェニルなどの、任意の非立体障害基によってさらに置換されてもよい。米国特許第5,446,090号は、二官能性PEGリンカーおよび各PEGリンカー末端にペプチドを有するコンジュゲートを形成する際のその使用について記載する。
ステープルペプチドはまた、例えば、一部の実施形態では、細胞取込みをさらに促進するか、またはin vivo安定性をさらに増加させるために、修飾されてもよい。例えば、ペプチド模倣大環状分子をアシル化またはPEG化することによって、細胞取込みを促進させる、バイオアベイラビリティーを増加させる、血液循環を増加させる、薬物動態を変更させる、免疫原性を低下させる、および/または必要とされる投与頻度を減少させる。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるステープルペプチドは、細胞膜を貫通する増強された能力を有する(例えば、ステープル無しペプチドと比較して)。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第2017/147283号を参照されたい。
本明細書に記載の安定化されたペプチドを合成する方法は、当技術分野において公知である。それにもかかわらず、以下の例示的な方法を使用してもよい。所望の化合物を得るために、代替の配列または順序で様々なステップが実施され得ることが認識される。本明細書に記載の化合物を合成するのに有用な合成化学変換(synthetic chemistry transformation)および保護基方法論(保護および脱保護)は当技術分野で公知であり、例えばR. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989);T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3d. Ed., John Wiley and Sons (1999);L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994);およびL. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)、ならびにそれらの改版に記載される方法を含む。
本発明のペプチドは、当業者に周知である化学合成方法によって作製され得る。例えば、Fields et al., Chapter 3 in Synthetic Peptides: A User's Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Co., New York, N.Y., 1992, p. 77を参照されたい。それゆえに、例えば、Applied Biosystems Peptide Synthesizer Model 430Aまたは431上で、側鎖保護されたアミノ酸を使用するt-BocまたはFmoc化学のいずれかにより保護されたα-NH2を用いた固相合成の自動化されたメリフィールド技法を使用してペプチドが合成される。
本明細書に記載のペプチドを作製する1つの方式は、固相ペプチド合成(SPPS)を使用することである。C末端アミノ酸は、リンカー分子との酸不安定結合を介して架橋したポリスチレン樹脂に結合している。この樹脂は合成のために使用される溶媒に不溶性であり、これによって、過剰な試薬および副産物が比較的簡単に、素早く洗い流される。N末端はFmoc基で保護されており、Fmoc基は、酸性で安定しているが、塩基で除去可能である。すべての側鎖官能基は、塩基安定基、酸不安定基を用いて保護される。
より長いペプチドは、天然の化学的ライゲーションを使用して、個々の合成ペプチドをつなぎ合わせることによって作製することができる。あるいは、より長い合成ペプチドは、周知の組換えDNA技法によって合成することができる。このような技法は、詳細なプロトコールを有する周知の標準的マニュアルにおいて提供される。本発明のペプチドをコードする遺伝子を構築するために、アミノ酸配列は、逆翻訳されて、好ましくは、遺伝子が発現されることになる生物に対して最適なコドンを有する、アミノ酸配列をコードする核酸配列が得られる。次に、合成遺伝子は、典型的には、ペプチドおよび必要であれば、任意の調節エレメントをコードするオリゴヌクレオチドを合成することによって作製される。合成遺伝子を好適なクローニングベクターに挿入し、宿主細胞にトランスフェクトする。次いで、選択された発現系および宿主に対して適切である、好適な条件下で、ペプチドを発現させる。ペプチドを精製し、標準的方法で特徴付ける。
ペプチドは、例えば、Advanced Chemtechから入手可能なハイスループットマルチチャネルコンビナトリアルシンセサイザーを使用して、ハイスループットコンビナトリアル様式で作製され得る。ペプチド結合は、例えば、ペプチドの生理学的安定性を増加させるために、レトロインベルソ結合(C(O)-NH);還元アミド結合(NH-CH2);チオメチレン結合(S-CH2またはCH2-S);オキソメチレン結合(O-CH2またはCH2-O);エチレン結合(CH2-CH2);チオアミド結合(C(S)-NH);trans-オレフィン結合(CH=CH);フルオロ置換trans-オレフィン結合(CF=CH);ケトメチレン結合(C(O)-CHR)またはCHR-C(O)(ここで、RはHまたはCH3である);およびフルオロ-ケトメチレン結合(C(O)-CFRまたはCFR-C(O)(ここで、RはHまたはFまたはCH3である))によって置き換えることができる。
アセチル化、アミド化、ビオチン化、シンナモイル化、ファルネシル化、フルオレセイン化、ホルミル化、ミリストイル化、パルミトイル化、リン酸化(Ser、TyrまたはThr)、ステアロイル化、スクシニル化およびスルフリル化によって、ポリペプチドをさらに修飾することができる。上記したように、ペプチドを、例えば、ポリエチレングリコール(PEG);アルキル基(例えば、C1~C20直鎖または分岐鎖アルキル基);脂肪酸ラジカル;およびそれらの組合せとコンジュゲートすることができる。さまざまな長さのオレフィン側鎖を含有するα,α-二置換非天然アミノ酸は、公知の方法によって合成することができる(Williams et al. J. Am. Chem. Soc., 113:9276, 1991;Schafmeister et al., J. Am. Chem Soc., 122:5891, 2000;およびBird et al., Methods Enzymol., 446:369, 2008;Bird et al, Current Protocols in Chemical Biology, 2011)。ペプチドについて、iとi+7を連結するステープルが使用される場合(安定化されたヘリックスの2ターン)、a)1つのS5アミノ酸および1つのR8が使用されるか、またはb)1つのS8アミノ酸および1つのR5アミノ酸が使用される。R8は、出発キラル補助剤(starting chiral auxillary)がR-アルキル-立体異性体を与えることを除けば、同じ経路を使用して合成される。また、5-ヨードペンテンに代えて8-ヨードオクテンが使用される。阻害剤は、MBHA樹脂において固相ペプチド合成(SPPS)を使用して、固体支持体上で合成される(例えば、WO2010/148335を参照されたい)。
Fmoc保護α-アミノ酸(オレフィン系アミノ酸Fmoc-S5-OH、Fmoc-R8-OH、Fmoc-R8-OH、Fmoc-S8-OHおよびFmoc-R5-OH以外)、2-(6-クロロ-1-H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート(HCTU)、およびRink Amide MBHAは、例えば、Novabiochem(San Diego、CA)から市販されている。ジメチルホルムアミド(DMF)、N-メチル-2-ピロリジノン(NMP)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)、トリフルオロ酢酸(TFA)、1,2-ジクロロエタン(DCE)、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、およびピペリジンは、例えば、Sigma-Aldrichから市販されている。オレフィン系アミノ酸合成は、当技術分野において報告されている(Williams et al., Org. Synth., 80:31, 2003)。
やはり、本明細書に開示されるペプチドを得る(例えば、合成する)、ステープリングする、および精製するために好適な方法も、当技術分野において公知である(例えば、Bird et. al., Methods in Enzymol., 446:369-386 (2008);Bird et al, Current Protocols in Chemical Biology, 2011;Walensky et al., Science, 305:1466-1470 (2004);Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc., 122:5891-5892 (2000);2010年3月18日に出願された米国特許出願第12/525,123号;および2010年5月25日に発行された米国特許第7,723,468号(これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)を参照されたい)。
一部の実施形態では、ペプチドは、ステープル無しペプチド夾雑物を実質的に含まないか、または単離されている。ペプチドを精製するための方法としては、例えば、固相支持体上でペプチドを合成することが挙げられる。環化後に、固相支持体を単離し、DMSO、DMSO/ジクロロメタン混合物、またはDMSO/NMP混合物などの溶媒の溶液中に懸濁してもよい。DMSO/ジクロロメタンまたはDMSO/NMP混合物は、約30%、40%、50%または60%のDMSOを含んでもよい。具体的な実施形態では、50%/50%のDMSO/NMP溶液が使用される。溶液は、1、6、12または24時間の期間インキュベートされてもよく、その後、例えば、ジクロロメタンまたはNMPで樹脂が洗浄されてもよい。一実施形態では、樹脂は、NMPで洗浄される。振盪および不活性ガスの溶液中へのバブリングが実施されてもよい。
安定化されたペプチドを生成する方法であって、(a)E2 hAペプチドをステープリングまたはステッチングするステップと、(b)ステープルペプチドまたはステッチペプチドを単離するステップとを含む、方法も本明細書において提供される。
本発明のステープル化(架橋した)ポリペプチドの特性は、例えば、以下および実施例に記載の方法を使用して、アッセイされ得る。
α-ヘリシティを決定するためのアッセイ:化合物を水溶液に溶解させる(例えば、5mMのリン酸カリウム溶液(pH7)、または蒸留したH2O、25~50μMの濃度まで)。標準的な測定パラメーター(例えば、温度、20℃;波長、190~260nm;ステップ解像度(step resolution)、0.5nm;速度、20nm/秒;アキュムレーション、10;応答、1秒;帯域幅、1nm;光路長、0.1cm)を使用して、分光偏光計(例えば、Jasco J-710、Aviv)上で円二色性(CD)スペクトルを得る。平均残基楕円率をモデルヘリックスデカペプチドについて報告された値(Yang et al., Methods Enzymol. 130:208 (1986))で割ることによって、各ペプチドのα-ヘリックス含量を算出する。
融解温度(Tm)を決定するためのアッセイ:架橋または非修飾テンプレートペプチドを、蒸留したH2Oまたは他の緩衝液もしくは溶媒に溶解させ(例えば、50μMの最終濃度で)、分光偏光計(例えば、Jasco J-710、Aviv)において標準的なパラメーター(例えば、波長222nm;ステップ解像度、0.5nm;速度、20nm/秒;アキュムレーション、10;応答、1秒;帯域幅、1nm;温度上昇率:1℃/分;光路長、0.1cm)を使用して、ある温度範囲(例えば、4~95℃)にわたって楕円率の変化を測定することによってTmを決定する。
in vitroプロテアーゼ耐性アッセイ:ペプチド骨格のアミド結合は、プロテアーゼによる加水分解を受けやすく、それによって、ペプチド系化合物はin vivoで急速に分解しやすくなる。しかしながら、ペプチドヘリックス形成は、典型的には、アミド骨格を埋め、および/またはひずませ、および/または保護し、したがって、タンパク質切断を防止するかまたは実質的に遅らせることができる。本発明のペプチド模倣大環状分子をin vitro酵素タンパク質分解(例えば、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン)させて、対応する非架橋ポリペプチドまたは或いはステープルポリペプチドと比較した分解速度の何らかの変化について評価することができる。例えば、ペプチド模倣大環状分子および対応する非架橋ポリペプチドを、トリプシンアガロースと共にインキュベートし、遠心分離によって様々な時点で反応をクエンチし、その後HPLC注入して280nmでの紫外線吸収により残存基質を定量する。簡潔に述べると、ペプチド模倣大環状分子およびペプチド模倣前駆体(5mcg)を、トリプシンアガロース(Pierce)(S/E約125)と共に、0、10、20、90、および180分間インキュベートする。高速での卓上遠心分離によって反応をクエンチし、単離した上清中に残存している基質を280nmでのHPLCによるピーク検出によって定量する。タンパク質分解反応は、一次速度則を示し、ln[S]対時間のプロットから速度定数、kを決定する。
ペプチド模倣大環状分子および/または対応する非架橋ポリペプチドを、各々、マウス、ラットおよび/またはヒトの新鮮な血清(例えば、1~2mL)と共に、37℃で、例えば、0、1、2、4、8、および24時間インキュベートすることができる。大環状分子濃度が異なる試料を、血清による段階希釈によって調製することができる。インタクトな化合物のレベルを決定するために、以下の手順を使用することができる:例えば、血清100μLを2ml遠心チューブに移し、その後、50%のギ酸10μLおよびアセトニトリル500μLを添加し、4+/-2℃で10分間、14,000RPMで遠心分離することにより、試料を抽出する。次いで、上清を新しい2mlチューブに移し、TurbovapにおいてN2<10psiにて37℃で蒸発させる。試料を50:50のアセトニトリル:水100μLで再構成し、LC-MS/MS分析を行う。ex vivo安定性を試験するための同等または同様の手順は公知であり、血清における大環状分子の安定性を決定するために使用することができる。
in vivoプロテアーゼ耐性アッセイ:ペプチドステープリングの鍵となる利益は、in vitroプロテアーゼ耐性を、顕著に向上したin vivoでの薬物動態への移行である。
in vitro結合アッセイ:アクセプタータンパク質に対するペプチド模倣大環状分子およびペプチド模倣性前駆体の結合および親和性を評価するために、例えば、蛍光偏光アッセイ(FPA)を使用することができる。FPA技法は、偏光および蛍光トレーサーを使用して、分子配向および運動を測定する。偏光で励起されると、見掛けの分子量が高い分子と結合した蛍光トレーサー(例えば、FITC)(例えば、大きいタンパク質と結合したFITC標識ペプチド)は、小分子と結合した蛍光トレーサー(例えば、溶液中にて遊離しているFITC標識ペプチド)と比較して、より遅いそれらの回転速度に起因して、より高レベルの偏光蛍光を発光する。
in vitro酵素阻害アッセイ:E2 hAペプチドによるE1酵素の阻害を評価するために、例えば、in vitro酵素阻害アッセイを使用することができる。in vitro酵素阻害アッセイは、E1による、ユビキチンのE2へのコンジュゲーションを阻害するE2 hAペプチドの能力を測定する。簡潔に述べると、例えば、50mMのNaCl、50mMのHEPES(pH7.5)を含有する緩衝液中、室温で一定時間(例えば、30分)、E2 hAペプチドまたはビヒクル対照(例えば、1%のDMSO)の存在下で、組換えE1(例えば、UBA1)、組換えE2(例えば、UBE2A)、ユビキチン、およびMg-ATPを組み合わせる。対照反応はE1を含まない。SDSを含有するローディングダイの添加によって反応をクエンチし、非還元条件下で、試料をゲル(例えば、4~12%のBis-Trisタンパク質ゲル)上で分離する。ゲル上のタンパク質は、例えば、銀染色によって可視化する。E1によるユビキチンのE2へのコンジュゲーションを、遊離E2(約17kDa)のE2~ユビキチンコンジュゲート(約26kDa)への変換によってモニターする。
安定化されたE2 hAペプチドのバリアント
安定化されたE2 hAペプチドのバリアント
一部の実施形態では、配列番号1~38またはその修飾されたバージョン(すなわち、そのバリアント(例えば、配列番号39、55、または57))のいずれか1つのペプチドを修飾することによって(例えば、アミノ酸置換によって)、内部で架橋したペプチドを作製することができる。一部の実施形態では、内部ステープルは、2個のアミノ酸の側鎖を置き換える、すなわち、各ステープルは、例えば、2、3、または6個のアミノ酸によって分離された2個のアミノ酸の間にある。一部の実施形態では、内部ステッチは、3個のアミノ酸の側鎖を置き換える、すなわち、ステッチは、例えば、3および6個のアミノ酸によって分離された3個のアミノ酸の間の一対の架橋である。一部の実施形態では、内部ステープルおよび/または内部ステッチは、少なくとも2つの内部ステープルを含む(4個のアミノ酸の側鎖を置き換える、すなわち、各ステープルは、例えば、3個のアミノ酸によって分離された2個のアミノ酸の間にある)。一部の実施形態では、内部ステープルおよび/または内部ステッチは、少なくとも1つの内部ステープルと内部ステッチの組合せを含む。一部の実施形態では、内部ステッチは、第1のアミノ酸ならびに第2および第3のアミノ酸の側鎖を置き換え、それによって、内部架橋によって、第1のアミノ酸(第2および第3のアミノ酸の間にある)を第2および第3のアミノ酸に架橋させ、ここで、第1および第2のアミノ酸は、2、3、または6個のアミノ酸によって分離され、第1および第3のアミノ酸は、2、3、または6個のアミノ酸によって分離され、かつ第2および第3のアミノ酸は別個のアミノ酸である。一部の実施形態では、本開示の内部で架橋したポリペプチドの4個のアミノ酸の側鎖は、2つの別個の内部ステープルによって置き換えられている。一部の実施形態では、2つの別個の内部ステープルの1つ目は、2、3、または6個のアミノ酸によって分離された第1のアミノ酸の対を架橋させ、少なくとも2つの別個の内部ステープルの2つ目は、2、3、または6個のアミノ酸によって分離された第2のアミノ酸の対を架橋させる。
ステープルポリペプチドは、内部の分子内架橋(または「ステープル」)によって接合された少なくとも2個の修飾されたアミノ酸を含み、この少なくとも2個のアミノ酸は、2、3、または6個のアミノ酸によって分離されている。本明細書において、安定化されたペプチドは、2つのステープルおよび/またはステッチペプチドを有するペプチドを含む、ステープルペプチドを含む。少なくとも2個の修飾されたアミノ酸は、不自然なアルファ-アミノ酸(α,α-二置換アミノ酸およびN-アルキル化アミノ酸を含むがこれらに限定されない)であってもよい。多くの公知の不自然なアミノ酸が存在し、これらはいずれも、本発明のペプチドに含まれ得る。不自然なアミノ酸のいくつかの例は、4-ヒドロキシプロリン、デスモシン、ガンマ-アミノ酪酸、ベータ-シアノアラニン、ノルバリン、4-(E)-ブテニル-4(R)-メチル-N-メチル-L-トレオニン、N-メチル-L-ロイシン、1-アミノ-シクロプロパンカルボン酸、1-アミノ-2-フェニル-シクロプロパンカルボン酸、1-アミノ-シクロブタンカルボン酸、4-アミノ-シクロペンテンカルボン酸、3-アミノ-シクロヘキサンカルボン酸、4-ピペリジル酢酸、4-アミノ-l-メチルピロール-2-カルボン酸、2,4-ジアミノ酪酸、2,3-ジアミノプロピオン酸、2,4-ジアミノ酪酸、2-アミノヘプタン二酸、4-(アミノメチル)安息香酸、4-アミノ安息香酸、オルト-、メタ-および/パラ置換フェニルアラニン(例えば、-C(=O)C6H5;-CF3;-CN;-ハロ;-NO2;CH3で置換された)、二置換フェニルアラニン、置換チロシン(例えば、-Q=O)C6H5;-CF3;-CN;-ハロ;-NO2;CH3でさらに置換された)、ならびにスタチンである。
一部の実施形態では、本開示の内部で架橋したE2 hAペプチドのバリアントは、配列番号1~38のいずれか1つのポリペプチドから調製され、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、もしくは9個のアミノ酸置換を有する(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、または9個のアミノ酸が、保存的にまたは非保存的に置換されている)、ならびに/または例えば、N末端および/もしくはC末端から、1、2、3、4、5、6、7、8、もしくは9個のアミノ酸の欠失を有する(例えば、N末端および/またはC末端から1、2、3、4、5、6、7、8、または9個のアミノ酸が欠失している)。バリアントを含む例示的なE2 hAペプチドが、表1~6に提供される。例えば、ある特定の実施形態では、本開示の内部で架橋したE2 hAペプチドのバリアントは、配列番号1~38のいずれか1つにおいて、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、または13個のアミノ酸置換を有する(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、または13個のアミノ酸が、保存的にまたは非保存的に置換されている)。一部の例では、配列番号1~38のいずれか1つの1~3個のアミノ酸が置換されている。配列番号1~38のいずれか1つにおけるアミノ酸置換は、E2 hAの同族E1酵素と直接相互作用する(または直接相互作用することが予測される)か、またはそれとの直接相互作用に関与しない(または直接相互作用に関与しないことが予測される)アミノ酸の置換であり得る。さらにより多くの変動性は、E2 hAの同族E1酵素と直接相互作用する(または直接相互作用することが予測される)アミノ酸においてよりも、E2 hAの同族E1酵素との直接相互作用に関与しない(または直接相互作用に関与しないことが予測される)アミノ酸において許容される。実際に、E2 hAの同族E1酵素との直接相互作用に関与しない(または直接相互作用に関与しないことが予測される)アミノ酸のほぼすべて(例えば、直接相互作用しない(または直接相互作用しないことが予測される)アミノ酸のうちの5、4、3、2、または1個のアミノ酸)が、置換され得る(例えば、保存的もしくは非保存的アミノ酸置換またはアラニンでの置換)。ある特定の実施形態では、E2 hAの同族E1酵素と直接相互作用する(または直接相互作用することが予測される)1、2、または3個のアミノ酸は、別のアミノ酸で置換されている。一部の例では、置換(複数可)は、保存的アミノ酸置換である。他の例では、置換(複数可)は、非保存的アミノ酸置換である。一部の例では、1個より多くのアミノ酸置換が存在する場合、置換は、保存的アミノ酸置換と非保存的アミノ酸置換の両方である。一部の例では、1個より多くのアミノ酸置換が存在する場合、置換のそれぞれは、保存的アミノ酸置換である。一部の場合には、配列番号1~38のいずれか1つの1~3個のアミノ酸(例えば、1、2、または3個)が置換されている場合、置換は、すべて、E2 hAの同族E1酵素との直接相互作用に関与しない(または直接相互作用に関与しないことが予測される)アミノ酸の置換である。一部の場合には、配列番号1~38のいずれか1つの1~3個のアミノ酸(例えば、1、2、または3個)が置換されている場合、置換は、すべて、E2 hAの同族E1酵素と直接相互作用する(または直接相互作用することが予測される)アミノ酸の置換である。一部の場合には、配列番号1~38のいずれか1つの1~3個のアミノ酸(例えば、1、2、または3個)が置換されている場合、置換は、E2 hAの同族E1酵素と直接相互作用する(または直接相互作用することが予測される)アミノ酸およびE2 hAの同族E1酵素との直接相互作用に関与しない(または直接相互作用に関与しないことが予測される)アミノ酸の置換の両方である。ある特定の例では、置換されたアミノ酸(複数可)は、L-Ala、D-Ala、Aib、Sar、Ser、置換されたアラニン、または置換されたグリシン誘導体からなる群から選択される。ある特定の例では、修飾されたUbc15 E2 hAペプチドは、アルギニンで置換されたE7残基(配列番号2に従う番号付け)を含む。
ある特定の実施形態では、本開示の内部で架橋したE2 hAペプチドのバリアントは、配列番号1~38のいずれか1つに示される配列のC末端から除去された/欠失した1、2、3、4、または5個のアミノ酸を有し得る。例えば、ある特定の実施形態では、本開示の内部で架橋したE2 hAペプチドのバリアントは、配列番号4に示されるアミノ酸配列の修飾されたアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ここで、2個のアミノ酸は、配列番号4の配列のC末端から除去されている/欠失している(例えば、内部で架橋したE2 hAペプチドのバリアントは、配列番号39のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる)。別の例において、ある特定の実施形態では、本開示の内部で架橋したE2 hAペプチドのバリアントは、配列番号6に示されるアミノ酸配列の修飾されたアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ここで、5個のアミノ酸は、配列番号6の配列のC末端から除去されている/欠失している(例えば、内部で架橋したE2 hAペプチドのバリアントは、配列番号55のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる)。ある特定の実施形態では、本開示の内部で架橋したE2 hAペプチドのバリアントは、配列番号1~38のいずれか1つに示される配列のN末端から除去された/欠失した1、2、3、4、または5個のアミノ酸を有し得る。ある特定の実施形態では、本開示のUBA1と結合するE2 hAペプチドは、配列番号1~34のいずれか1つに示される配列のC末端から除去された/欠失したアミノ酸位置A12~A16を有し得る。ある特定の実施形態では、本開示のUBA1に結合する内部で架橋したE2 hAペプチドのバリアントは、配列番号1~34のいずれか1つに示される配列のN末端から除去された/欠失したアミノ酸位置A1に対してN末端側のアミノ酸位置の1、2、3個、またはすべてを有し得る。ある特定の実施形態では、本開示の内部で架橋したE2 hAペプチドのバリアントは、配列番号1~38のいずれか1つに示される配列のN末端とC末端の両方から除去された/欠失した1、2、3、4、または5個のアミノ酸を有し得る。ある特定の実施形態では、本開示のUBA1に結合する内部で架橋したE2 hAペプチドのバリアントは、配列番号1~34のいずれか1つに示される配列のC末端から除去された/欠失した1、2、3、4、または5個のアミノ酸、およびその配列のN末端から除去された/欠失したアミノ酸位置A1に対してN末端側のアミノ酸の1、2、3個、またはすべてを有し得る。ある特定の例では、これらの除去されたアミノ酸は、L-Ala、D-Ala、Aib、Sar、Ser、置換されたアラニン、または置換されたグリシン誘導体からなる群から選択される1~6(例えば、1、2、3、4、5、または6)個のアミノ酸で置き換えられ得る。
ある特定の例では、内部で架橋したE2 hAペプチドまたはバリアントは、表7、8、および11~15のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を有する。
本明細書に記載の内部で架橋したE2 hAペプチドのバリアントは、治療使用のために最適化され得る。例えば、上記内部で架橋したE2 hAペプチドのバリアントのいずれかが膜破壊(細胞溶解)を引き起こす場合、全体的なペプチドの疎水性を低下させることによってペプチドを最適化することができる。例えば、これは、特に、疎水性残基を、より低い疎水性を有するアミノ酸(例えば、アラニン)で置換することによって達成され得る。膜破壊は、ペプチドの全体的な正荷電を低下させることによって低下させることもできる。これは、塩基性残基を荷電していないかまたは酸性の残基で置換することによって達成することができる。ある特定の例では、全体的なペプチドの疎水性とペプチドの全体的な正荷電の両方が低下される。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の内部で架橋したE2 hAペプチドのバリアントは、5から35の間のアミノ酸長、5から25の間のアミノ酸長、5から20の間のアミノ酸長、5から18の間のアミノ酸長、10から35の間のアミノ酸長、10から25の間のアミノ酸長、10から20の間のアミノ酸長、10から18の間のアミノ酸長、15から26の間のアミノ酸長、または15から18の間のアミノ酸長である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の内部で架橋したE2 hAペプチドのバリアントは、11、12、13、14、15、16、17、18、または19アミノ酸長である。
ある特定の実施形態では、ステープル化E2 hAペプチドのバリアントは、表7、8、および11~15のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。これらのペプチドの構造的安定化の非限定的な例は、これらの配列において、2、3、または6個のアミノ酸によって分離された位置に非天然アミノ酸を導入することによる炭化水素ステープリングによって達成される。
弾頭部を有する安定化されたE2 hAペプチドのバリアント
弾頭部を有する安定化されたE2 hAペプチドのバリアント
本開示は、弾頭部、すなわち、求電子性基を有する非天然アミノ酸などの反応性基を含む、安定化されたUBA1に結合するE2 hAペプチドを特徴とする。重要なことに、これらの弾頭部を含有するペプチドによって、UBA1に結合するE2 hAペプチドとE1との間の非共有結合による相互作用が、求電子剤とUBA1の位置Cys-1039のシステイン(すなわち、配列番号845の1039位)との間の共有結合によって接合されるため、関連するE2 hAペプチドのアミノ酸配列において有意な(弾頭部の非存在下におけるよりもはるかに大きな)変動性が可能になる。よって、E2 hAの同族E1酵素と直接相互作用する(または直接相互作用することが予測される)アミノ酸の置換を含む、配列番号1~34のいずれか1つにおける置換および/または欠失が存在する場合であっても(例えば、配列番号3~20および22~34に関する位置A4、A5、A7、およびA10)、これらの弾頭部を有するペプチドは、UBA1に結合する際に効果的である傾向がある。さらに、弾頭部が存在すると、E2 hAペプチド(例えば、表1、2、6、および7の配列のいずれか1つ)のサイズは、長さが低減され得る(例えば、14、13、12、11、10、9、8、7、6、または5個のアミノ酸まで)。
求電子剤は、非天然アミノ酸との関係においてのみではなく、安定化された(例えば、架橋した)E2 hAペプチドのN末端またはC末端に対する化学的キャップとしても、導入され得る。一部の例では、求電子剤は、安定化されたペプチド内に導入され得る。このような弾頭部を有する安定化されたペプチドは、それらが相互作用するタンパク質の少なくとも一部と共有結合を形成することができる。例えば、このような弾頭部を有するE2 hAペプチドは、共有結合によってUBA1を修飾し得る(例えば、UBA1のCys1039との共有結合およびUBA1との非共有結合による相互作用によって)。
弾頭部は、ポリペプチド配列のN末端、C末端、またはその中に存在してもよい。ある特定の実施形態では、弾頭部は、位置A7に存在する。ある特定の実施形態では、弾頭部は、位置A8に存在する。ある特定の実施形態では、弾頭部は、位置A11に存在する。一部の場合には、弾頭部は、非天然求電子剤を有するアミノ酸である。ある特定の実施形態では、弾頭部は、末端がブロモアセチルであるジアミノブタン酸、末端がアクリルアミドであるジアミノブタン酸;末端がアクリルアミドである3S-1-ピロリジン-3-カルボン酸;末端がアクリルアミドであるD-ホモプロリン;末端がアクリルアミドであるL-ホモプロリン;末端がアクリルアミドであるイソニペコチン酸;末端がアクリルアミドであるD-ニペコチン酸;末端がアクリルアミドであるL-ニペコチン酸;末端がアクリルアミドであるD-プロリン;末端がアクリルアミドであるL-プロリン;trans-4-ジメチルアミノクロトン酸;およびアクリル酸からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、弾頭部は、末端がブロモアセチルであるジアミノブタン酸である。ある特定の実施形態では、弾頭部は、末端がアクリルアミドであるジアミノブタン酸である。
一部の実施形態では、求電子性弾頭部は、システイン反応性D-ニペコチン酸部分である。他の実施形態では、求電子性弾頭部は、システイン反応性部分である。
ある特定の実施形態では、弾頭部は、(S)-1-アクリロイルピロリジン-3-カルボキサミド;1-アクリロピペリジン-4-カルボキサミド、(R)-1 アクリロイルピぺリジン-3-カルボキサミド;(S)-1-アクリロイルピぺリジン-3-カルボキサミド;(S)-1-アクリロイルピロリジン-2-カルボキサミド;(R)-1-アクリロイルピロリジン-2-カルボキサミド;(E)-4-(ジメチルアミノ)ブタ-2-エナミド;およびアクリルアミドからなる群から選択される求電子性基を有する非天然アミノ酸である。他の実施形態では、弾頭部は、アミノ酸ではない。例えば、求電子性部分およびペプチドは、飽和(アジリジン、ジアジリジン、アゼチジン、ピロリジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、オキサゾリジン、イソキサゾリジン、チアゾリジン、イソチアゾリジン、ピぺリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、アゼパン)、または不飽和(アジリン、ジアジリン、アゼト、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、ピリジン、ジアジン、オキサジン、チアジン、アゼピン)の窒素を含有する複素環によって連結される。ペプチドおよび求電子剤はまた、フェニル(アニリン)などの置換アミノ官能化環(例えば、N-アリールアクリルアミド)によって、またはより複雑な二環式もしくは多環式環、例えば、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、インドール、イソインドール、インドリジン、キノロン、イソキノリン、キノキサリン、フタルジン、キナゾリン、プリン、カルバゾール、インダゾール、ベンゾイミダゾール、アザインドールによって連結され得る。一部の実施態様では、求電子弾頭部は、アクリルアミドであるか、またはより一般的には、α,β-不飽和カルボニル、例えばα-シアノアクリルアミド、プロピオルアミド、trans4-ジメチルアミノ-2-ブテンアミド、もしくはtrans4-ピペリジニル-2-ブテンアミド、あるいはいずれかの他の置換アクリルアミド、またはN-官能化ビニルスルホニル、アルファ-フルオロアセチル、アルファ-クロロアセチル、アルファ-ブロモアセチル、およびアルファ-ヨードアセチルまたは他の求電子部分として定義される。求電子剤は、非天然アミノ酸との関係において導入され得るだけでなく、架橋(例えば、ステープル化、ステッチ化)ポリペプチドのN末端またはC末端に対する化学的キャップとしても導入され得る。
一態様では、UBA1に結合し、弾頭部を有するE2 hAは、配列番号1~34、または本明細書で上記されるかもしくは実施例に記載されるその修飾されたバージョン(例えば、配列番号39、55、または57)のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、弾頭部を含むよう修飾されている。別の態様では、UBA1に結合し、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、配列番号1~34、またはその修飾されたバージョン(例えば、配列番号39、55、または57)のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、弾頭部を含むよう修飾されている。別の態様では、UBA1に結合し、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、配列番号1~34のいずれか1つに示される配列の5個またはそれより多い(例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14個の)アミノ酸を含有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、弾頭部を含むよう修飾されている。別の態様では、UBA1に結合し、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、配列番号1~34のいずれか1つに示される配列のC末端またはN末端に1~8個の欠失(例えば、1、2、3、4、5、6、7、または8個)を含有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、弾頭部を含むよう修飾されている。別の態様では、UBA1に結合し、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、弾頭部を含むよう修飾された表1、2、6、および7のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。一部の例では、求電子性弾頭部は、ペプチドのN末端に存在する。他の例では、求電子性弾頭部は、ペプチド内、例えば、位置A7、A8、またはA11に存在する。
一実施形態では、UBA1に結合し、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、以下の表10に示される配列から選択される配列を有する。
表10. 例示的な弾頭部を有するペプチド。配列番号144~251および827~829(それぞれ、上から下へ):「J」は、アミノ酸を含有する非天然求電子剤またはアミノ酸ではない部分との関係において提示される求電子性弾頭部である(求電子剤は、化学的キャップとして作用することができる)。配列番号252~359および830~832(それぞれ、上から下へ):「J」は、末端がアクリルアミドであるジアミノブタン酸または末端がブロモアセチルであるジアミノブタン酸である。「tr」=トランケート;「m」=変異体
ある特定の例では、上記弾頭部を有する配列は、当技術分野において公知の任意の方法または本明細書に記載の任意の方法によって、構造的に安定化され得る。例えば、2、3、または6個のアミノ酸によって分離された配列の少なくとも2個のアミノ酸(例えば、2、3、4、5個)は、ステープルおよび/またはステッチを形成することができる非天然アミノ酸で置き換えられてもよい。
一部の実施形態では、ステープル化された、弾頭部を有するポリペプチドは、表11から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
表11. 例示的な弾頭部を有するステープルペプチド。配列番号360~503および833~836(それぞれ、上から下へ):「B」はノルロイシンであり、「X1」および「X2」は、架橋環を形成するために閉環メタセシス(RCM)反応を使用して共有結合により接合され得る(「一緒にステープルされる」)非天然アミノ酸である。「J」は、アミノ酸を含有する非天然求電子剤またはアミノ酸ではない部分との関係において提示される求電子性弾頭部である(求電子剤は、化学的キャップとして作用することができる)。配列番号504~647および837~840(それぞれ、上から下へ):「B」はノルロイシンであり、「X1」はR-オクテニルアラニンであり、「X2」はS-ペンテニルアラニンであり、「J」は、アミノ酸を含有する非天然求電子剤またはアミノ酸ではない部分との関係において提示される求電子性弾頭部である(求電子剤は、化学的キャップとして作用することができる)。配列番号648~791および841~844(それぞれ、上から下へ):「B」はノルロイシンであり、「X1」はR-オクテニルアラニンであり、「X2」はS-ペンテニルアラニンであり、「J」は、末端がアクリルアミドであるジアミノブタン酸または末端がブロモアセチルであるジアミノブタン酸である。「tr」=トランケート;「m」=変異体
一部の実施形態では、弾頭部を有するステープルペプチドは、表11において上記で列挙したアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、E2 hAの同族E1酵素との直接相互作用に関与しない複数(例えば、1、2、3、4、5、6個)の残基は、Ala(アラニン)、D-Ala(D-アラニン)、Aib(α-アミノイソ酪酸)、Sar(N-メチルグリシン)、およびSer(セリン)、他の置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択される残基で置き換えられている。さらに、これらの残基の1個または複数(例えば、1、2、3、4、5、6個)は、ペプチドのC末端に付加され得る。一部の例では、表11の上記ペプチドのC末端の0~5個のアミノ酸は、Ala(アラニン)、D-Ala(D-アラニン)、Aib(α-アミノイソ酪酸)、Sar(N-メチルグリシン)、およびSer(セリン)、他の置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択される残基(1個または複数)で置き換えられている。
一部の実施形態では、本開示は、表10または11に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも14%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも27%、少なくとも34%、少なくとも40%、少なくとも47%、少なくとも50%、少なくとも53%、少なくとも60%、少なくとも65% 少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一である弾頭部を有するE2 hAステープルペプチドを特徴とし、修飾されたペプチドは、UBA1に共有結合により結合する。一部の実施形態では、これらの修飾されたペプチドは、アミノ酸バリエーションの前に、ステープル化E2 hAペプチドと比較して、低下した疎水性および/または全体的な正荷電を有する。一部の実施形態では、疎水性または正荷電は、独立して増強され、細胞貫通性を最適化する。
ある特定の実施形態では、本開示は、表10または11に示されるアミノ酸配列と比較して、1~10(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10)個のアミノ酸置換を有する弾頭部を有するE2 hAステープルペプチドを特徴とし、修飾されたペプチドは、UBA1に共有結合により結合する。一部の実施形態では、これらの修飾されたペプチドは、アミノ酸置換の前に、ステープル化E2 hAペプチドと比較して、低下した疎水性および/または全体的な正荷電を有する。一部の実施形態では、疎水性または正荷電は、独立して増強され、細胞貫通性を最適化する。
例示的な安定化されたE2 hAペプチドのバリアントおよび弾頭部を有する安定化されたE2 hAペプチドのバリアント
例示的な安定化されたE2 hAペプチドのバリアントおよび弾頭部を有する安定化されたE2 hAペプチドのバリアント
具体的な実施形態では、安定化されたペプチドは、0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号4のアミノ酸配列に基づく。具体的な実施形態では、安定化されたペプチドは、0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号39のアミノ酸配列に基づく。具体的な実施形態では、安定化されたペプチドは、BSTPX1RRRLBRX2FKRLQのアミノ酸配列を含み、ここで、「B」はノルロイシンであり、「X1」はS-ペンテニルアラニンであり、「X2」は、R-オクテニルアラニンであり(配列番号132)、0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する。特定の実施形態では、ステープルペプチドは、上記「E2 hAペプチド」および「安定化されたペプチド」の項目に記載された修飾の1個または複数をさらに含む。別の実施形態では、安定化されたペプチドは、配列番号132のアミノ酸配列からなる。ある特定の実施形態では、別のアミノ酸で置換された配列番号132の0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸は、配列番号132のヘリックスのE1と相互作用しない面に存在する。一部の実施形態では、配列番号132の0~3個のアミノ酸は、C末端から除去されているか、または除去されて、アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群からの1~6個のアミノ酸で置き換えられている。一部の実施形態では、配列番号132の相互作用しない面の0~6個のアミノ酸は、アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。一部の実施形態では、配列番号132の以下のアミノ酸、Arg-7(すなわち、A4)、Leu-9(すなわち、A6)、ノルロイシン-10(すなわち、A7)、Phe-13(すなわち、A10)、および必要に応じてLeu-16(すなわち、A13)の1個または複数は、アルファ-メチル化またはアルファ-エチル化された天然アミノ酸で置換されている。一部の実施形態では、配列番号132の以下のアミノ酸、Arg-7(すなわち、A4)、Leu-9(すなわち、A6)、ノルロイシン-10(すなわち、A7)、Phe-13(すなわち、A10)、および必要に応じてLeu-16(すなわち、A13)の1個または複数は、L-アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。一部の実施形態では、配列番号132の以下のアミノ酸、ノルロイシン-1(すなわち、A-3)、Ser-2(すなわち、A-2)、Thr-3(すなわち、A-1)、Pro-4(すなわち、A1)、Ala-5(すなわち、A2)、Arg-6(すなわち、A3)、Arg-8(すなわち、A5)、Arg-11(すなわち、A8)、Asp-12(すなわち、A9)、Lys-14(すなわち、A11)、Arg-15(すなわち、A12)、およびGln-17(すなわち、A14)の1個または複数は、アルファ-メチル化またはアルファ-エチル化された天然アミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、配列番号132の以下のアミノ酸、ノルロイシン-1(すなわち、A-3)、Ser-2(すなわち、A-2)、Thr-3(すなわち、A-1)、Pro-4(すなわち、A1)、Ala-5(すなわち、A2)、Arg-6(すなわち、A3)、Arg-8(すなわち、A5)、Arg-11(すなわち、A8)、Asp-12(すなわち、A9)、Lys-14(すなわち、A11)、Arg-15(すなわち、A12)、およびGln-17(すなわち、A14)の1個または複数は、L-アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。ある特定の例では、別のアミノ酸で置換された配列番号132の1~6個のアミノ酸は、配列番号132のヘリックスのE1と相互作用する面に存在する。他の例では、別のアミノ酸により置換された配列番号132の1~6個のアミノ酸は、配列番号132のヘリックスのE1と相互作用しない面および相互作用する面に存在する。ある特定の実施形態では、配列番号132の1~6個のアミノ酸は、L-アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸(1個または複数)によって置換されている。
具体的な実施形態では、安定化されたペプチドは、0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号6のアミノ酸配列に基づく。具体的な実施形態では、安定化されたペプチドは、0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号55のアミノ酸配列に基づく。具体的な実施形態では、安定化されたペプチドは、BAGTX1LKRLBAX2YKのアミノ酸配列を含み、ここで、「B」はノルロイシンであり、「X1」はS-ペンテニルアラニンであり、「X2」はR-オクテニルアラニンであり(配列番号133)、0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する。特定の実施形態では、ステープルペプチドは、上記「E2 hAペプチド」および「安定化されたペプチド」の項目に記載された修飾の1個または複数をさらに含む。別の実施形態では、安定化されたペプチドは、配列番号133のアミノ酸配列からなる。ある特定の実施形態では、別のアミノ酸により置換された配列番号133の0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸は、配列番号133のヘリックスのE1と相互作用しない面に存在する。一部の実施形態では、配列番号133の0~3個のアミノ酸は、C末端から除去されているか、または除去されて、アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群からの1~6個のアミノ酸で置き換えられている。一部の実施形態では、配列番号133の相互作用しない面の0~6個のアミノ酸は、アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。一部の実施形態では、配列番号133の以下のアミノ酸、Lys-7(すなわち、A4)、Leu-9(すなわち、A6)、ノルロイシン-10(すなわち、A7)、Tyr-13(すなわち、A10)、および必要に応じてLeu-16(すなわち、A13)の1個または複数は、アルファ-メチル化またはアルファ-エチル化された天然アミノ酸で置換されている。一部の実施形態では、配列番号133の以下のアミノ酸、Lys-7(すなわち、A4)、Leu-9(すなわち、A6)、ノルロイシン-10(すなわち、A7)、Tyr-13(すなわち、A10)、および必要に応じてLeu-16(すなわち、A13)の1個または複数は、L-アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。一部の実施形態では、配列番号133の以下のアミノ酸、ノルロイシン-1(すなわち、A-3)、Ala-2(すなわち、A-2)、Gly-3(すなわち、A-1)、Thr-4(すなわち、A1)、Ala-5(すなわち、A2)、Leu-6(すなわち、A3)、Arg-7(すなわち、A5)、Ala-10(すなわち、A8)、Glu-11(すなわち、A9)、およびLys-13(すなわち、A11)の1個または複数は、アルファ-メチル化またはアルファ-エチル化された天然アミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、配列番号107の以下のアミノ酸、ノルロイシン-1(すなわち、A-3)、Ala-2(すなわち、A-2)、Gly-3(すなわち、A-1)、Thr-4(すなわち、A1)、Ala-5(すなわち、A2)、Leu-6(すなわち、A3)、Arg-7(すなわち、A5)、Ala-10(すなわち、A8)、Glu-11(すなわち、A9)、およびLys-13(すなわち、A11)は、L-アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。ある特定の例では、別のアミノ酸により置換された配列番号133の1~6個のアミノ酸は、配列番号133のヘリックスのE1と相互作用する面に存在する。他の例では、別のアミノ酸により置換された配列番号133の1~6個のアミノ酸は、配列番号133のヘリックスのE1と相互作用しない面および相互作用する面に存在する。ある特定の実施形態では、配列番号133の1~6個のアミノ酸は、L-アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸(1個または複数)によって置換されている。
具体的な実施形態では、安定化されたペプチドは、0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号10のアミノ酸配列に基づく。具体的な実施形態では、安定化されたペプチドは、BX1LKRIHKX2LNDLARDのアミノ酸配列を含み、ここで、「B」はノルロイシンであり、「X1」はS-ペンテニルアラニンであり、「X2」はR-オクテニルアラニンであり(配列番号107)、0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する。特定の実施形態では、ステープルペプチドは、上記「E2 hAペプチド」および「安定化されたペプチド」の項目に記載された修飾の1個または複数をさらに含む。別の実施形態では、安定化されたペプチドは、配列番号107のアミノ酸配列からなる。ある特定の実施形態では、別のアミノ酸により置換された配列番号107の0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸は、配列番号107のヘリックスのE1と相互作用しない面に存在する。一部の実施形態では、配列番号107の0~3個のアミノ酸は、C末端から除去されているか、または除去されて、アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群からの1~6個のアミノ酸で置き換えられている。一部の実施形態では、配列番号107の相互作用しない面の0~6個のアミノ酸は、アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。一部の実施形態では、配列番号107の以下のアミノ酸、Lys-4(すなわち、A4)、Ile-6(すなわち、A6)、His-7(すなわち、A7)、Leu-10(すなわち、A10)、および必要に応じてLeu-13(すなわち、A13)の1個または複数は、アルファ-メチル化またはアルファ-エチル化された天然アミノ酸で置換されている。一部の実施形態では、配列番号107の以下のアミノ酸、Lys-4(すなわち、A4)、Ile-6(すなわち、A6)、His-7(すなわち、A7)、Leu-10(すなわち、A10)、および必要に応じてLeu-13(すなわち、A13)の1個または複数は、L-アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。一部の実施形態では、配列番号107の以下のアミノ酸、ノルロイシン-1(すなわち、A1)、Ala-2(すなわち、A2)、Leu-3(すなわち、A3)、Arg-5(すなわち、A5)、Lys-8(すなわち、A8)、Glu-9(すなわち、A9)、Asn-11(すなわち、A11)、Asp-12(すなわち、A12)、Ala-14(すなわち、A14)、Arg-15(すなわち、A15)、およびAsp-16(すなわち、A16)の1個または複数は、アルファ-メチル化またはアルファ-エチル化された天然アミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、配列番号107の以下のアミノ酸、ノルロイシン-1(すなわち、A1)、Ala-2(すなわち、A2)、Leu-3(すなわち、A3)、Arg-5(すなわち、A5)、Lys-8(すなわち、A8)、Glu-9(すなわち、A9)、Asn-11(すなわち、A11)、Asp-12(すなわち、A12)、Ala-14(すなわち、A14)、Arg-15(すなわち、A15)、およびAsp-16(すなわち、A16)の1個または複数は、L-アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。ある特定の例では、別のアミノ酸により置換された配列番号107の1~6個のアミノ酸は、配列番号107のヘリックスのE1と相互作用する面に存在する。他の例では、別のアミノ酸により置換された配列番号107の1~6個のアミノ酸は、配列番号107のヘリックスのE1と相互作用しない面および相互作用する面に存在する。ある特定の実施形態では、配列番号107の1~6個のアミノ酸は、L-アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸(1個または複数)によって置換されている。
別の具体的な実施形態では、ペプチドは、本明細書に記載のE1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドである。例えば、上記配列番号4、6、10、39、55のペプチド、またはそれらのバリアントは、アミノ酸を含有する非天然求電子剤またはアミノ酸ではない部分との関係において提示される求電子性弾頭部を含むよう修飾されている(求電子剤は化学的キャップとして作用する)(例えば、システイン反応性部分、例えば、末端がアクリルアミドであるジアミノブタン酸または末端がブロモアセチルであるジアミノブタン酸)。
具体的な実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号176の配列を含む。特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号392の配列を含む。別の特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号680の配列を含む。特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチド(例えば、配列番号176、392、または680)は、上記「E2 hAペプチド」および「安定化されたペプチド」の項目に記載された1個または複数の修飾をさらに含む。
具体的な実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号212の配列を含む。特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号428の配列を含む。別の特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号716の配列を含む。特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチド(例えば、配列番号212、428、または716)は、上記「E2 hAペプチド」および「安定化されたペプチド」の項目に記載された1個または複数の修飾をさらに含む。
具体的な実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号248の配列を含む。特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号464の配列を含む。別の特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号752の配列を含む。特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号500の配列を含む。別の特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号788の配列を含む。特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチド(例えば、配列番号248、464、500、752、または788)は、上記「E2 hAペプチド」および「安定化されたペプチド」の項目に記載された修飾の1個または複数をさらに含む。
具体的な実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号177の配列を含む。特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号393の配列を含む。別の特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号681の配列を含む。特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチド(例えば、配列番号177、393、または681)は、上記「E2 hAペプチド」および「安定化されたペプチド」の項目に記載された1個または複数の修飾をさらに含む。
具体的な実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号213の配列を含む。特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号429の配列を含む。別の特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号717の配列を含む。特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチド(例えば、配列番号213、429、または717)は、上記「E2 hAペプチド」および「安定化されたペプチド」の項目に記載された1個または複数の修飾をさらに含む。
具体的な実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号249の配列を含む。特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号465の配列を含む。別の特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号753の配列を含む。特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号501の配列を含む。別の特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号789の配列を含む。特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチド(例えば、配列番号249、465、501、753、または789)は、上記「E2 hAペプチド」および「安定化されたペプチド」の項目に記載された修飾の1個または複数をさらに含む。
具体的な実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号151の配列を含む。特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号367の配列を含む。別の特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号655の配列を含む。特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチド(例えば、配列番号151、367、または655)は、上記「E2 hAペプチド」および「安定化されたペプチド」の項目に記載された1個または複数の修飾をさらに含む。
具体的な実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号187の配列を含む。特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号403の配列を含む。別の特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号691の配列を含む。特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチド(例えば、配列番号187、403、または691)は、上記「E2 hAペプチド」および「安定化されたペプチド」の項目に記載された1個または複数の修飾をさらに含む。
具体的な実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号223の配列を含む。特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号439の配列を含む。別の特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号727の配列を含む。特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号475の配列を含む。別の特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号763の配列を含む。特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチド(例えば、配列番号223、439、727、757、または763)は、上記「E2 hAペプチド」および「安定化されたペプチド」の項目に記載された修飾の1個または複数をさらに含む。
具体的な実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号827の配列を含む。特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号835の配列を含む。別の特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有す配列番号843の配列を含む。特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチド(例えば、配列番号827、835、または843)は、上記「E2 hAペプチド」および「安定化されたペプチド」の項目に記載された1個または複数の修飾をさらに含む。
具体的な実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号828の配列を含む。特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号834の配列を含む。別の特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号842の配列を含む。特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチド(例えば、配列番号828、834、または842)は、上記「E2 hAペプチド」および「安定化されたペプチド」の項目に記載された1個または複数の修飾をさらに含む。
具体的な実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号829の配列を含む。特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号836の配列を含む。別の特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号844の配列を含む。特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号833の配列を含む。別の特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチドは、(上記のように)0~6(すなわち、0、1、2、3、4、5、6)個のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を有する配列番号841の配列を含む。特定の実施形態では、E1に結合する、弾頭部を有するE2 hAペプチド(例えば、配列番号829、833、836、841、または844)は、上記「E2 hAペプチド」および「安定化されたペプチド」の項目に記載された修飾の1個または複数をさらに含む。
処置の方法
処置の方法
本開示は、E1を発現する疾患またはE1に依存する疾患の予防および/または処置のために、本明細書に記載の安定化されたペプチド(または前記安定化されたペプチドを含む医薬組成物)のいずれかを使用する方法を特徴とする。E1を発現する疾患またはE1に依存する疾患の非限定的な例としては、がん、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、抗体媒介性移植拒絶、自己免疫障害、炎症性障害、および病的細胞の生存に関わる他の疾患が挙げられる。用語「処置する」または「処置すること」は、本明細書で使用される場合、対象が患っている疾患または状態を緩和すること、阻害すること、または改善することを指す。
本明細書に記載のペプチド(またはペプチドを含む組成物)は、E1を発現するがんを有するヒト対象を処置するのに有用であり得る。本明細書に記載のペプチド(またはペプチドを含む組成物)はまた、E1に依存するがんを有するヒト対象を処置するのに有用であり得る。ある特定の実施形態では、がんは、固形腫瘍または液性腫瘍である。ある特定の実施形態では、固形腫瘍は、膀胱がん腫瘍、胆管がん腫瘍、骨がん腫瘍、軟部組織肉腫、脳腫瘍、脊髄腫瘍、乳がん腫瘍、膵がん腫瘍、結腸直腸がん腫瘍、直腸がん腫瘍、小腸がん腫瘍、前立腺がん腫瘍、腎臓がん腫瘍、肝細胞がん腫瘍、胆嚢がん腫瘍、肺がん腫瘍、気管支がん腫瘍、卵巣がん腫瘍、子宮頸がん腫瘍、膣がん腫瘍、子宮内膜がん腫瘍、胃がん(gastric cancer)腫瘍、食道がん腫瘍、頭頚部がん(例えば、鼻咽頭がん、口腔咽頭がん、唾液腺がん、および甲状腺がん)腫瘍、黒色腫腫瘍、眼内黒色腫腫瘍、または神経内分泌腫瘍である。ある特定の実施形態では、がんは、黒色腫、白血病、リンパ腫、もしくは他の血液悪性腫瘍または固形腫瘍である。ある特定の実施形態では、血液悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、リンパ腫(例えば、ホジキン病、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、B細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、およびT細胞リンパ腫)、骨髄増殖性症候群、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症である。ある特定の実施形態では、がんは、乳がん、自律神経節のがん、膵臓がん、皮膚がん、CNSがん、造血器もしくはリンパ系のがん、肺がん、大腸がん、胃がん(stomach cancer)、軟部組織肉腫、または骨がんである。ある特定の例では、固形腫瘍は、黒色腫、乳がんまたは肺がんである。ある特定の実施形態では、自己免疫障害または炎症性障害は、胃腸障害(例えば、セリアック病、クローン病、または潰瘍性大腸炎)、皮膚および筋骨格状態(例えば、円形脱毛症、強皮症、乾癬、類天疱瘡、関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎、線維筋痛症、リウマチ性多発筋痛症、強直性脊椎炎、ベーチェット病、CREST症候群、エリテマトーデス、または白斑)、気道および肺の疾患(例えば、喘息またはCOPD)、自己免疫ニューロパチー(例えば、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、急性運動性軸索型ニューロパチー、多発性硬化症、または下肢静止不能症候群)、血管炎、腎炎、肝炎、胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、心筋炎、アディソン病、抗リン脂質症候群(antiphospholipid syndrome)、再生不良性貧血、脳炎、慢性疲労症候群、糖尿病、子宮内膜症、グレーブス病、ギランバレー症候群、サルコイドーシス、感染に関連する炎症、虚血に関連する炎症、または神経変性障害(例えば、アルツハイマー病)である。
ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象は、表7、8、および11~15の配列からなる群から選択されるペプチドを投与される。ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象は、配列番号4またはその修飾されたバージョンを含むかまたはそれからなるステープル化E2 hAペプチド、例えば、配列番号65、96、101、および132のいずれか1つのアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるペプチドを投与される。ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象は、配列番号6またはその修飾されたバージョンを含むかまたはそれからなるステープル化E2 hAペプチド、例えば、配列番号67、97、103、および133のいずれか1つのアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるペプチドを投与される。ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象は、配列番号10を含むかまたはそれからなるステープル化E2 hAペプチド、またはその修飾されたバージョン、例えば、配列番号71または配列番号107のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるペプチドを投与される。ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象は、配列番号2を含むかまたはそれからなるステープル化E2 hAペプチド、またはその修飾されたバージョン、例えば、配列番号99、135、850、および851のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるペプチドを投与される。
ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象は、表10および14の配列からなる群から選択される弾頭部を有するペプチドを投与される。ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象は、配列番号4に基づく、弾頭部を有するステープルペプチド、例えば、配列番号361、392、397、428、433、464、469、500、505、536、541、572、577、608、613、644、649、680、685、716、721、752、757、および788のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるペプチドを投与される。ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象は、配列番号6に基づく、弾頭部を有するステープルペプチド、例えば、配列番号363、393、399、429、435、465、471、501、507、537、543、573、579、609、615、645、651、681、687、717、723、753、759、および789のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるペプチドを投与される。ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象は、配列番号10に基づく弾頭部を有するステープルペプチド、例えば、配列番号367、403、439、475、511、547、583、619、655、691、727、および763のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるペプチドを投与される。ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象は、配列番号2に基づく弾頭部を有するステープルペプチド、例えば、配列番号395、431、467、502、503、539、575、611、646、647、683、719、755、790、791、および833~844のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるペプチドを投与される。ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象は、表10および14の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも14%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも27%、少なくとも34%、少なくとも40%、少なくとも47%、少なくとも50%、少なくとも53%、少なくとも60%、少なくとも65% 少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるペプチドを投与される。
がん、自己免疫障害、または炎症性障害の処置のための一部の例では、それを必要とするヒト対象は、放射線療法、免疫療法、または化学療法を共投与される。化学療法の非限定的な例としては、アルキル化剤(例えば、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、イホスファミド、ロムスチン、メフェラン(mephelan)、オキサリプラチン、プロカルバジン塩酸塩、テモゾロミド、またはチオテパ)、代謝拮抗剤(例えば、アザチオプリン、カペシチビン、クラドラビン(cladrabine)、クロファラビン、シタラビン、デシタビン、フロクスウラジン(floxuradine)、フルオロウラシル、ヒドロジウレア(hydrozyurea)、メルカプトプリン、メトトレキサート、プララトレキサート、チオグアニン、ペントスタチン、またはビダラビン)、抗腫瘍抗生物質(例えば、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシンC、アドリアマイシン、ダウノルビシン、イダルビシン、ドキソルビシン、またはミトキサントロン)、有糸分裂阻害剤(例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンブラスチン)、白金剤(例えば、シスプラチン、カルボプラチン、またはオキサリプラチン)、プロテアソーム阻害剤(例えば、ボルテゾミブ)、トポイソメラーゼ阻害剤(例えば、エトポシド、テニポシド、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ドキソルビシン、またはダウノルビシン)、サリドマイドおよび関連するアナログ、ステロイド(例えば、デキサメタゾンまたはプレドニゾン)、ならびに抗体(例えば、トラスツズマブ、リツキシマブ、セツキシマブ、およびベバシズマブ)が挙げられる。一部の例では、それを必要とするヒト対象は、免疫調節剤または抗炎症剤と共投与される。免疫調節剤の非限定的な例としては、メトトレキサート、レフルノミド、シクロホスファミド、シクロスポリンA、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン、ミゾリビン、デオキシスパガリン(deoxyspergualin)、およびブレキナルが挙げられる。抗炎症剤の非限定的な例としては、非ステロイド抗炎症薬(例えば、サリチル酸、アセチルサリチル酸、サリチル酸メチル、ジフルニサル、サルサレート、オルサラジン、スルファサラジン、アセトアミノフェン、インドメタシン、スリンダク、エトドラク、メフェナム酸、メクロフェナム酸ナトリウム、トルメチン、ケトロラク、ジクロフェナク、イブプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、フェノプロフェン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン(flurbinprofen)、オキサプロジン、ピロキシカム、メロキシカム、アンピロキシカム、ドロキシカム、ピボキシカム(pivoxicam)、テノキシカム、ナブメトン(nabumetome)、フェニルブタゾン、オキシフェンブタゾン、アンチピリン、アミノピリン、アパゾンおよびニメスリド;ジロートン、アウロチオグルコース、金チオリンゴ酸ナトリウムまたはオーラノフィンを含むロイコトリエン拮抗薬)、ステロイド(例えば、アルクロメタゾンジプロピオネート(alclometasone diproprionate)、アムシノニド、ベクロメタゾンジプロピオネート、ベタメタゾン、安息香酸ベタメタゾン、ベタメタゾンジプロピオネート(betamethasone diproprionate)、リン酸ベタメタゾンナトリウム、吉草酸ベタメタゾン、プロピオン酸クロベタゾール(clobetasol proprionate)、クロコルトロンピバレート、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン誘導体、デソニド、デソキシマタゾン(desoximatasone)、デキサメタゾン、フルニソリド、フルコキシノリド(flucoxinolide)、フルランドレノリド(flurandrenolide)、ハルシノシド(halcinocide)、メドリソン、メチルプレドニゾロン、酢酸メチルプレドニゾロン(methprednisolone acetate)、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、フロ酸モメタゾン、酢酸パラメタゾン、プレドニゾロン、酢酸プレドニゾロン、リン酸プレドニゾロンナトリウム、テブト酸プレドニゾロン(prednisolone tebuatate)、プレドニゾン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンジアセテート、またはトリアムシノロンヘキサアセトニド);および他の抗炎症剤(例えば、メトトレキサート、コルヒチン、アロプリノール、プロベネシド、スルフィンピラゾンまたはベンズブロマロン)が挙げられる。
一部の実施形態では、ヒト対象は、がん、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、抗体媒介性移植拒絶、自己免疫障害、または炎症性障害を有する。
一般に、方法は、対象を選択するステップと、対象に、例えば、医薬組成物中のまたは医薬組成物として、本明細書のペプチドの1つまたは複数の有効量を投与するステップと、必要に応じて、がんの予防または処置のために必要とされる場合、投与を繰り返すステップとを含み、経口的、静脈内または局所的に投与することができる。例えば、対象がE1を発現するがんを有するという決定に基づいて、対象を処置のために選択することができる。本開示のペプチドを使用して、対象のがんがE1を発現するかどうか、または対象のがんがE1に依存するかどうかを決定することができる。
任意の特定の患者に対する特定の投薬量および処置レジメンは、用いられる特定の化合物の活性、年齢、体重、全般的健康状態、性別、食事、投与時間、排出速度、薬物の組合せ、疾患、状態または症状の重症度および経過、疾患、状態または症状への患者の素因、ならびに処置する医師の判断を含む種々の要因に依存することになる。
1回または複数の投与、適用または投薬量で、有効量を投与することができる。治療化合物の治療有効量(すなわち、有効投薬量)は、選択される治療化合物に依存する。組成物は、1日に1または複数回から1週間に1または複数回(1日おきに1回を含む)で投与することができる。当業者は、疾患または障害の重症度、以前の処置、対象の健康全般および/または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない、ある特定の因子が、対象を効果的に処置するために必要とされる投薬量およびタイミングに影響を及ぼし得ることを認識する。さらに、本明細書に記載の治療化合物の治療有効量による対象の処置は、単回の処置または一連の処置を含み得る。例えば、有効量は、少なくとも1回投与され得る。
医薬組成物
医薬組成物
本明細書に記載の安定化されたペプチドのいずれかの1つまたは複数は、医薬組成物として、または医薬組成物中で使用するために製剤化され得る。医薬組成物は、本明細書に記載の処置方法(上記を参照されたい)において使用されてもよい。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、1~10、1~9、1~8、1~7、1~6、1~5、1~4、1~3、1~2、または1個のアミノ酸の置換、挿入、または欠失を除いて、表7~14のいずれか1つに示されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるペプチドを含む。アミノ酸配列に対するこれらの変更は、これらのペプチドのE1と相互作用しないアルファ-ヘリックス面に(すなわち、E1との直接相互作用に関与しない/関与しないことが予測されるアミノ酸に対して)、および/またはE1と相互作用するアルファ-ヘリックス面に(すなわち、E1と直接相互作用する/直接相互作用することが予測されるアミノ酸に対して)なされ得る。このような組成物は、任意の経路、例えば、米国食品医薬品局(FDA)によって承認された任意の経路によって、対象への投与のために製剤化または適用され得る。例示的な方法は、FDA's CDER Data Standards Manual, version number 004(fda.give/cder/dsm/DRG/drg00301.htmにおいて入手可能である)に記載されている。例えば、組成物は、吸入(例えば、経口および/または経鼻吸入(例えば、ネブライザーまたはスプレーによって))、注射(例えば、静脈内、動脈内、真皮下(subdermally)、腹腔内、筋肉内、および/または皮下(subcutaneously)に)によって投与するために;ならびに/または経口投与、経粘膜投与、および/もしくは局所投与(局所(例えば、経鼻)スプレーおよび/または液剤を含む)のために、製剤化または適用され得る。
一部の例では、医薬組成物は、1つまたは複数の安定化されたペプチドの有効量を含み得る。用語「有効量」および「処置するのに有効な」は、本明細書で使用される場合、その投与に関連して、意図された効果または生理学的帰結(例えば、感染症の処置)をもたらすのに有効である、一定期間(急性または慢性投与および定期的または連続投与を含む)利用される本明細書に記載の1種もしくは複数の化合物または医薬組成物の量または濃度を指す。
本発明の医薬組成物は、1つまたは複数のペプチドならびに任意の薬学的に許容される担体および/またはビヒクルを含み得る。一部の例では、医薬品は、疾患または疾患症状のモジュレーションを達成するのに有効な量で、1種または複数の追加の治療剤をさらに含み得る。例えば、医薬組成物は、放射線治療剤、免疫療法剤、化学療法剤、免疫調節剤、または抗炎症剤を含んでもよい。
用語「薬学的に許容される担体またはアジュバント」は、本発明の化合物と一緒に患者に投与することができ、化合物の治療量を送達するのに十分な用量で投与された場合に、その生理学的活性を破壊せず、非毒性である担体またはアジュバントを指す。
本発明の医薬組成物において使用することができる薬学的に許容される担体、アジュバントおよびビヒクルとしては、以下に限定されないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、d-α-トコフェロールポリエチレングリコール1000スクシネートなどの自己乳化薬物送達系(SEDDS)、Tween(登録商標)または他の類似するポリマー送達マトリックスなどの医薬剤形において使用される界面活性剤、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン-ポリオキシプロピレン-ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂肪が挙げられる。α-、β-、およびγ-シクロデキストリンなどのシクロデキストリンも、本明細書に記載の式の化合物の送達を増強するために有利に使用することができる。
本発明の医薬組成物は、任意の従来の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバントまたはビヒクルを含有してもよい。一部の場合には、製剤のpHは、製剤化された化合物またはその送達形態の安定性を増強するために、薬学的に許容される酸、塩基またはバッファで調整することができる。非経口という用語は、本明細書で使用される場合、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液内、胸骨内、髄腔内(intra-thecal)、病変内および頭蓋内注射または注入の技法を含む。
医薬組成物は、吸入および/または経鼻投与のための液剤または粉剤・散剤(powder)の形態内に存在し得る。このような組成物は、好適な分散剤または湿潤剤(例えば、Tween(登録商標) 80など)および懸濁化剤を使用して、当技術分野で公知の技法に従って製剤化されてもよい。滅菌注射用調製物もまた、非毒性の非経口的に許容される希釈液または溶媒中の滅菌注射用液剤または懸濁剤、例えば1,3-ブタンジオール中の液剤であってもよい。用いることができる許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、マンニトール、水、リンガー溶液および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌固定油は、溶媒または懸濁媒として従来より用いられる。このために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激の固定油を用いることができる。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、天然の薬学的に許容される油、例えばオリーブ油またはヒマシ油(特にそれらのポリオキシエチレン化バージョン)がそうであるように、注射剤の調製において有用である。これらの油液剤または懸濁剤はまた、乳剤およびまたは懸濁剤などの薬学的に許容される剤形の製剤化において通常使用される長鎖アルコール希釈剤もしくは分散剤、またはカルボキシメチルセルロースもしくは類似する分散剤を含有することができる。Tween(登録商標)もしくはSpan(登録商標)などの他の通常使用される界面活性剤および/または薬学的に許容される固体、液体、もしくは他の剤形の製造において通常使用される他の類似する乳化剤もしくはバイオアベイラビリティー増強剤も、製剤化のために使用されてもよい。
医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、乳剤および水性懸濁剤、分散液剤および液剤を含むがこれらに限定されない、任意の経口的に許容される剤形で経口投与され得る。経口的使用のための錠剤の場合には、通常使用される担体としては、ラクトースおよびトウモロコシデンプンが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤も典型的に添加される。カプセル形態での経口投与では、有用な希釈剤としては、ラクトースおよび乾燥トウモロコシデンプンが挙げられる。水性懸濁剤および/または乳剤が経口投与される場合、油層に懸濁または溶解することができる有効成分は、乳化剤および/または懸濁化剤と組み合わされる。所望の場合、ある種の甘味剤および/または風味剤および/または着色剤が添加されてもよい。
あるいはまたはさらに、医薬組成物は、経鼻エアロゾルまたは吸入によって投与することができる。このような組成物は、医薬製剤の技術分野で周知の技法に従って調製され、ベンジルアルコールまたは他の好適な防腐剤、バイオアベイラビリティーを増強するための吸収促進剤、フルオロカーボン、および/または当技術分野において公知の他の可溶化剤もしくは分散剤を用いて、食塩水中の液剤として調製され得る。
一部の例では、本明細書に開示される1つまたは複数のペプチドは、例えば、担体タンパク質にコンジュゲートされ得る。このようなコンジュゲートされた組成物は、一価であっても多価であってもよい。例えば、コンジュゲートされた組成物は、担体タンパク質にコンジュゲートされた本明細書に開示される1つのペプチドを含んでもよい。あるいは、コンジュゲートされた組成物は、担体にコンジュゲートされた本明細書に開示される2つまたはそれより多いペプチドを含んでもよい。
本明細書で使用される場合、2つの実体が互いに「コンジュゲート」される場合、これらは、直接的もしくは間接的共有結合または非共有結合による相互作用によって連結されている。ある特定の実施形態では、会合は共有結合によるものである。他の実施形態では、会合は非共有結合によるものである。非共有結合による相互作用には、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁気相互作用、静電相互作用などが含まれる。間接的共有結合による相互作用は、2つの実体が、必要に応じて、リンカー基を介して、共有結合により接続されている場合である。
担体タンパク質は、対象における免疫原性を増加させるかまたは増強する任意のタンパク質を含み得る。例示的な担体タンパク質は、当技術分野において説明されている(例えば、Fattom et al., Infect. Immun., 58:2309-2312, 1990;Devi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7175-7179, 1991;Li et al., Infect. Immun. 57:3823-3827, 1989;Szu et al., Infect. Immun. 59:4555-4561,1991;Szu et al., J. Exp. Med. 166:1510-1524, 1987;およびSzu et al., Infect. Immun. 62:4440-4444, 1994を参照されたい)。ポリマー担体は、1種または複数の第一級および/または第二級アミノ基、アジド基、またはカルボキシル基を含有する天然または合成の材料であってもよい。担体は、水溶性であってもよい。
安定化されたペプチドを作製する方法
安定化されたペプチドを作製する方法
本開示は、安定化された(例えば、単一ステープル化、二重ステープル化、またはステッチ化)ペプチドを作製する方法を特徴とする。本方法は、2種またはそれより多い非天然アミノ酸を含む本明細書に記載のペプチドのいずれかの架橋されていないバージョンを得るステップと、ペプチドを架橋させるステップを伴う。一例では、架橋は、閉環メタセシス(RCM)反応によるものである。
ステープルペプチドの合成:Fmocに基づく固相ペプチド合成を使用して、すべての炭化水素ステープルペプチドを生成するための報告された方法に従って、ステープルペプチド融合阻害剤を合成することができる。例えば、様々なステープル長を達成するために、α-メチル、α-アルケニルアミノ酸を、例えば、2種のS-2-(4’-ペンテニル)アラニン(S5)残基;2種の(R)-2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニルアミノ)-2-メチル-デカ-9-エン酸(R8)残基;または1個のS5残基および1個のS8残基を使用して、i、i+4(またはi、i+7)位置に導入した。一部の例では、様々なステープル長を達成するために、α-メチル、α-アルケニルアミノ酸を、例えば、R-オクテニルアラニン(例えば、(R)-α-(7’-オクテニル)アラニン);R-ペンテニルアラニン(例えば、(R)-α-(4’-ペンテニル)アラニン);1個のビス-ペンテニルグリシン(例えば、α,α-ビス(4’-ペンテニル)グリシン);1個の1個の(one one)ビス-オクテニルグリシン(例えば、α,α-ビス(7’-オクテニル)グリシン);またはS-オクテニルアラニン(例えば、(S)-α-(7’-オクテニル)アラニン)を使用して、i、i+4(またはi、およびi+7)位置に導入した。ステープリング反応のために、ジクロロエタン中に溶解させたGrubbs第一世代ルテニウム触媒を、樹脂に結合したペプチドに添加する。最大変換を確実にするために、3~5回のステープリングを実施する。次いで、トリフルオロ酢酸を使用してペプチドを樹脂から切り離し、ヘキサン:エーテル(1:1)混合物を使用して沈殿させ、空気乾燥させ、LC-MSによって精製する。ペプチドは、アミノ酸分析によって定量することができる。
ステッチペプチドの合成:ステッチペプチドを合成する方法は、当技術分野において公知である。それにもかかわらず、以下の例示的な方法を使用してもよい。本明細書に記載の化合物を合成するのに有用な合成化学変換および保護基方法論(保護および脱保護)は当技術分野で公知であり、例えば、R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989);T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3d. Ed., John Wiley and Sons (1999);L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994);およびL. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)、ならびにそれらの改版に記載されるような方法を含む。
本発明のペプチドは、当業者に周知である化学合成方法によって作製され得る。例えば、Fields et al., Chapter 3 in Synthetic Peptides: A User's Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Co., New York, N.Y., 1992, p. 77を参照されたい。それゆえに、例えば、Applied Biosystems Peptide Synthesizer Model 430Aまたは431上で、側鎖保護されたアミノ酸を使用するt-BocまたはFmoc化学のいずれかにより保護されたα-NH2を用いた固相合成の自動化されたメリフィールド技法を使用してペプチドを合成することができる。
本明細書に記載のペプチドを作製する1つの方式は、固相ペプチド合成(SPPS)を使用することである。C末端アミノ酸は、リンカー分子との酸不安定結合を介して架橋したポリスチレン樹脂に結合している。この樹脂は合成のために使用される溶媒に不溶性であり、これによって、過剰な試薬および副産物が比較的簡単に、素早く洗い流される。N末端はFmoc基で保護されており、Fmoc基は、酸性で安定しているが、塩基で除去可能である。すべての側鎖官能基は、塩基安定基、酸不安定基を用いて保護される。
より長いペプチドは、天然の化学的ライゲーションを使用して、個々の合成ペプチドをつなぎ合わせることによって作製することができる。ステッチングアミノ酸の挿入は、例えば、Young and Schultz, J Biol Chem. 2010 Apr 9; 285(15): 11039-11044に記載される通りに実施されてもよい。あるいは、より長い合成ペプチドは、周知の組換えDNA技法によって合成することができる。このような技法は、詳細なプロトコールを有する周知の標準的マニュアルにおいて提供される。本発明のペプチドをコードする遺伝子を構築するために、アミノ酸配列は、逆翻訳されて、好ましくは、遺伝子が発現されることになる生物に対して最適なコドンを有する、アミノ酸配列をコードする核酸配列が得られる。次に、合成遺伝子は、典型的には、ペプチドおよび必要であれば、任意の調節エレメントをコードするオリゴヌクレオチドを合成することによって作製される。合成遺伝子を好適なクローニングベクターに挿入し、宿主細胞にトランスフェクトする。次いで、選択された発現系および宿主に対して適切である、好適な条件下で、ペプチドを発現させる。ペプチドを精製し、標準的方法で特徴付ける。
ペプチドは、例えば、例えば、Advanced ChemtechまたはSymphony Xから入手可能なハイスループットマルチプルチャネルコンビナトリアルシンセサイザーを使用して、ハイスループットコンビナトリアル様式で作製することができる。ペプチド結合は、例えば、ペプチドの生理学的安定性を増加させるために、レトロインベルソ結合(C(O)-NH);還元アミド結合(NH-CH2);チオメチレン結合(S-CH2またはCH2-S);オキソメチレン結合(O-CH2またはCH2-O);エチレン結合(CH2-CH2);チオアミド結合(C(S)-NH);trans-オレフィン結合(CH=CH);フルオロ置換trans-オレフィン結合(CF=CH);ケトメチレン結合(C(O)-CHR)またはCHR-C(O)(ここで、RはHまたはCH3である);およびフルオロケトメチレン結合(C(O)-CFRまたはCFR-C(O)(ここで、RはHまたはFまたはCH3である))によって置き換えられてもよい。
アセチル化、アミド化、ビオチン化、シンナモイル化、ファルネシル化、フルオレセイン化、ホルミル化、ミリストイル化、パルミトイル化、リン酸化(Ser、TyrまたはThr)、ステアロイル化、スクシニル化およびスルフリル化によって、ペプチドをさらに修飾することができる。上記したように、ペプチドを、例えば、ポリエチレングリコール(PEG);アルキル基(例えば、C1~C20直鎖または分岐鎖アルキル基);脂肪酸ラジカル;およびそれらの組合せとコンジュゲートすることができる。様々な長さのオレフィン側鎖を含有するα,α-二置換非天然アミノ酸は、公知の方法によって合成することができる(Williams et al. J. Am. Chem. Soc., 113:9276, 1991;Schafmeister et al., J. Am. Chem Soc., 122:5891, 2000;およびBird et al., Methods Enzymol., 446:369, 2008;Bird et al, Current Protocols in Chemical Biology, 2011)。i+7に連結したi、i+14に連結したi+7ステッチが使用される(安定化されたヘリックスの4ターン)ペプチドに関する一部の例では、1個のR-オクテニルアラニン(例えば、(R)-α-(7’-オクテニル)アラニン)、1個の1個のビス-ペンテニルグリシン(例えば、α,α-ビス(4’-ペンテニル)グリシン)、および1個のR-オクテニルアラニン(例えば、(R)-α-(7’-オクテニル)アラニン)が使用される。i+7に連結したi、i+14に連結したi+7ステッチが使用される(安定化されたヘリックスの4ターン)ペプチドに関する一部の例では、1個のS-オクテニルアラニン(例えば、(S)-α-(7’-オクテニル)アラニン)、1個の1個のビス-ペンテニルグリシン(例えば、α,α-ビス(4’-ペンテニル)グリシン)、および1個のR-オクテニルアラニン(例えば、(R)-α-(7’-オクテニル)アラニン)が使用される。i+7に連結したi、i+14に連結したi+7ステッチが使用される(安定化されたヘリックスの4ターン)ペプチドに関する一部の例では、1個のS-オクテニルアラニン(例えば、(S)-α-(7’-オクテニル)アラニン)、1個のビス-ペンテニルグリシン(例えば、α,α-ビス(4’-ペンテニル)グリシン)、および1個のS-オクテニルアラニン(例えば、(S)-α-(7’-オクテニル)アラニン)が使用される。i+7に連結したi、i+14に連結したi+7ステッチが使用される(安定化されたヘリックスの4ターン)ペプチドに関する一部の例では、1個のR-ペンテニルアラニン(例えば、(R)-α-(4’-ペンテニル)アラニン)、1個のビス-オクテニルグリシン(例えば、α,α-ビス(7’-オクテニル)グリシン)、および1個のS-ペンテニルアラニン(例えば、(S)-α-(4’-ペンテニル)アラニン)が使用される。i+7に連結したi、i+14に連結したi+7ステッチが使用される(安定化されたヘリックスの4ターン)ペプチドに関する一部の例では、1個のR-ペンテニルアラニン(例えば、(R)-α-(4’-ペンテニル)アラニン)、1個のビス-オクテニルグリシン(例えば、α,α-ビス(7’-オクテニル)グリシン)、および1個のR-ペンテニルアラニン(例えば、(R)-α-(4’-ペンテニル)アラニン)が使用される。i+7に連結したi、i+14に連結したi+7ステッチが使用される(安定化されたヘリックスの4ターン)ペプチドに関する一部の例では、1個のS-ペンテニルアラニン(例えば、(S)-α-(4’-ペンテニル)アラニン)、1個のビス-オクテニルグリシン(例えば、α,α-ビス(7’-オクテニル)グリシン)、および1個のR-ペンテニルアラニン(例えば、(R)-α-(4’-ペンテニル)アラニン)が使用される。i+7に連結したi、i+14に連結したi+7ステッチが使用される(安定化されたヘリックスの4ターン)ペプチドに関する一部の例では、1個のS-ペンテニルアラニン(例えば、(S)-α-(4’-ペンテニル)アラニン)、1個のビス-オクテニルグリシン(例えば、α,α-ビス(7’-オクテニル)グリシン)、および1個のS-ペンテニルアラニン(例えば、(S)-α-(4’-ペンテニル)アラニン)が使用される。R-オクテニルアラニンは、出発キラル補助剤がR-アルキル-立体異性体を与えることを除けば、同じ経路を使用して合成される。また、5-ヨードペンテンに代えて8-ヨードオクテンが使用される。阻害剤は、MBHA樹脂において固相ペプチド合成(SPPS)を使用して、固体支持体上で合成される(例えば、WO2010/148335を参照されたい)。
Fmoc保護α-アミノ酸(オレフィン系アミノ酸N-Fmoc-α,α-ビス(4’-ペンテニル)グリシン、(S)-N-Fmoc-α-(4’-ペンテニル)アラニン、(R)-N-Fmoc-α-(7’-オクテニル)アラニン、(R)-N-Fmoc-α-(7’-オクテニル)アラニン、および(R)-N-Fmoc-α-(4’-ペンテニル)アラニン以外)、2-(6-クロロ-1-H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート(HCTU)、およびRink Amide MBHAは、例えば、Novabiochem(San Diego、CA)から市販されている。ジメチルホルムアミド(DMF)、N-メチル-2-ピロリジノン(NMP)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)、トリフルオロ酢酸(TFA)、1,2-ジクロロエタン(DCE)、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、およびピペリジンは、例えば、Sigma-Aldrichから市販されている。オレフィン系アミノ酸合成は、当技術分野において報告されている(Williams et al., Org. Synth., 80:31, 2003)。
やはり、本明細書に開示されるペプチドを得る(例えば、合成する)、ステッチングする、および精製するために好適な方法も、当技術分野において公知である(例えば、Bird et. al., Methods in Enzymol., 446:369-386 (2008);Bird et al, Current Protocols in Chemical Biology, 2011;Walensky et al., Science, 305:1466-1470 (2004);Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc., 122:5891-5892 (2000);2010年3月18日に出願された米国特許出願第12/525,123号;および2010年5月25日に発行された米国特許第7,723,468号(これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)を参照されたい)。
一部の例では、ペプチドは、ステッチ化されていないペプチド夾雑物を実質的に含まないか、または単離されている。ペプチドを精製するための方法は、例えば、固相支持体上でペプチドを合成するステップを含む。環化後に、固相支持体を単離し、DMSO、DMSO/ジクロロメタン混合物、またはDMSO/NMP混合物などの溶媒の溶液中に懸濁してもよい。DMSO/ジクロロメタンまたはDMSO/NMP混合物は、約30%、40%、50%または60%のDMSOを含んでもよい。具体的な例では、50%/50%のDMSO/NMP溶液が使用される。溶液は、1、6、12または24時間の期間インキュベートされてもよく、その後、例えば、ジクロロメタンまたはNMPで樹脂が洗浄されてもよい。一例では、樹脂は、NMPで洗浄される。振盪および不活性ガスの溶液中へのバブリングが実施されてもよい。
本開示のステッチペプチドまたはステープルペプチドの特性は、例えば、以下および実施例に記載される方法を使用して、アッセイされ得る。
以下の実施例は、特許請求された発明をより十分に例証するために提供されるものであり、本発明の範囲の限定として解釈されるべきではない。具体的な材料が言及される程度に、これは、単に例証のためであって、本発明を限定することを意図するものではない。当業者は、本発明の能力を行使せず、かつ本発明の範囲を逸脱することなく、同等の手段または反応物を開発することができる。
(実施例1)
S.pombeのE2 hAステープルペプチドの調製
(実施例1)
S.pombeのE2 hAステープルペプチドの調製
ユビキチンシステムでは、E1とE2との間の相互作用は、タンパク質表面積の3000Å2を埋め、そのうちの1000Å2は、E2のヘリックスA(E2 hA)とE1ユビキチンフォールドドメイン(E1 UFD)との間の界面に埋もれている。E1-E2相互作用のKdは、ナノモル濃度未満から1桁のナノモル濃度(sub-to-single-digit nanomolar)の範囲内にあり、E2 hAは、その相互作用の結合エネルギーの少なくとも40%を占める。さらに、E1とE2 hAとの間の相互作用は、E1-E2遭遇複合体の形成において重要である。したがって、E1-E2相互作用の競合阻害剤として作用し得るE2 hAを模倣し、E1がE2への受け渡しを行うのを妨げ、よって、E1活性を阻害する新規機序を表す、安定化されたアルファ-ヘリックスペプチドを設計および調製した。
S.pombeのUbe1(PDB ID:5KNL)に対するUbc15の結合の結晶構造は、UBA1阻害剤ペプチド設計の構造的基礎を提供した(図1A)。非天然アミノ酸を、E7Rアミノ酸置換を含む、S.pombeのUbc15ヘリックスA(hA)の修飾された配列を有するペプチドの[i、i+4]または[i、i+7]位置のオレフィン側鎖で置換することによって、構造的に安定化されたアルファ-ヘリックスE2関連ペプチドを調製した。E7Rアミノ酸置換は、Kmの約80倍の低下をもたらすことが示されている(Lv et al., 2017, Molecular Cell, 65(4):699-714)。表12は、調製したペプチドの配列を提供する。図1Bおよび1Cは、アルファヘリックスであることが予期される配列番号40のペプチド部分のホイール図を例示し、配列番号41~54のステープルペプチドを生成するために、配列番号40に導入された[i、i+4](図1B)および[i、i+7](図1C)アミノ酸ステープル位置を示す(以下の表12)。
E2へのE1媒介性ユビキチン転移を阻害するE2 hAステープルペプチド(配列番号41~54)の能力を評価した。ヒトE1活性化酵素UBA1(10nM)、UbcH5b E2酵素(150nM)、ユビキチン(1μM)、およびMg-ATP(20μM)を、50mMのNaCl、50mMのHEPES、1mMのTCEP pH7.5を含有する緩衝液中、100μMのE2hA非ステープル対照ペプチド(配列番号40)、ステープルペプチド(配列番号41~54のいずれか1つ)、またはビヒクル対照(1%のDMSO)の存在下で、室温で45分間組み合わせた。対照反応物は、E1酵素を含まなかった。SDSを含有するローディングダイを添加することによって反応をクエンチし、非還元条件下で、試料を4~12%のBis-Trisタンパク質ゲル上で分離した。銀染色によってタンパク質を可視化した。E1によるユビキチンのE2へのコンジュゲーションを、遊離E2(17kDa)のE2~ユビキチンコンジュゲート(26kDa)への変換によってモニターした。
アミノ酸位置A2およびA9(配列番号50)にステープルを含むペプチドが、E2へのE1媒介性ユビキチン転移を阻害するのに、このパネルで最も優れていた(図2)。アミノ酸位置A5およびA9(配列番号44)、A8およびA12(配列番号46)、A9およびA13(配列番号47)、A1およびA8(配列番号49)、A4およびA11(配列番号52)、ならびにA5およびA12(配列番号53)にステープルを含むペプチドも、E1によるE2のE2~ユビキチンへの変換を阻害した(図2)。
この研究は、S.pombeのUbc15 E2 hAペプチドに導入されたステープル位置のすべてが、E2へのE1媒介性ユビキチン転移を阻害する訳ではないことを明らかにした。いかなる特定の理論にも拘束されないが、位置A1およびA5(配列番号41)、A2およびA6(配列番号42)、A4およびA8(配列番号43)、A6およびA10(配列番号45)、A10およびA14(配列番号48)、A3およびA10(配列番号51)、ならびにA6およびA13(配列番号54)にステープルを含むペプチドが、そのステープルの導入によってE2/E1結合界面が妨害されたか、またはE2ヘリックスAペプチドの重要な残基がブロックされたために、E2へのE1媒介性ユビキチン転移を阻害することができなかったと仮定される。
(実施例2)
H.sapiensのE2 hAステープルペプチドの調製
(実施例2)
H.sapiensのE2 hAステープルペプチドの調製
位置A2およびA9(配列番号50)にステープルを含むS.pombeのUbc15 E2hAペプチドによる、E2へのE1媒介性ユビキチン転移の強力な阻害ならびにヒトのE1とS.pombeのE1との間の高い相同性を考慮して、E2 hAステープルペプチドを設計し、ヒトE2 hA配列に基づいて生成した。上記表2は、32種の異なるヒト遺伝子によってコードされるE2 hAに関する配列を提供する。位置A2およびA9にステープルを有するUBE2D2のE2 hAまたはUBE2G2もしくはUBE2AのE2 hAのトランケートされた形態を含むペプチド(それぞれ、ペプチド「SAH-UBE2G2-11」、「SAH-UBED2-11」、および「SAH-UBE2A-11」、表13を参照されたい;これらのペプチドのヘリックスホイール部分の図を提供する図3も参照されたい)を生成した。
E2へのE1媒介性チオエステル転移を阻害するペプチドの能力を評価した。ヒトE1活性化酵素UBA1(10nM)、UbcH5b E2酵素(150nM)、ユビキチン(1μM)、およびMg-ATP(20μM)を、50mMのNaCl、50mMのHEPES、1mMのTCEP pH7.5を含有する緩衝液中、一定範囲の濃度のステープルペプチドまたはビヒクル対照(1%のDMSO)の存在下で、室温で45分間組み合わせた。SDSを含有するローディングダイを添加することによって反応をクエンチし、非還元条件下で、試料を4~12%のBis-Trisタンパク質ゲル上で分離した。銀染色によってタンパク質を可視化した。E1によるユビキチンのE2へのコンジュゲーションを、遊離E2(17kDa)のE2~ユビキチンコンジュゲート(26kDa)への変換によってモニターした。銀染色画像のデンシトメトリーから、阻害パーセンテージを計算した。ステープルペプチドSAH-Ubc15-11(配列番号50)、SAH-UBE2G2-11(配列番号133)、SAH-UBE2D2-11(配列番号107)、およびSAH-UBE2A-11(配列番号132)のそれぞれは、E2へのE1媒介性チオエステル転移を用量依存的に阻害し(図4)、SAH-UBE2A-11は、最も強力な活性を有した。
(実施例3)
E2 hAステープルペプチドはユビキチン経路のE1-E2相互作用の汎活性阻害剤である
(実施例3)
E2 hAステープルペプチドはユビキチン経路のE1-E2相互作用の汎活性阻害剤である
SAH-UBE2A-11(配列番号132)の効力を考慮して、このペプチドをさらなる評価のために選択した。ヒトは、ヒトE1酵素UBA1によって活性化される少なくとも33種のヒトE2酵素をコードする。SAH-UBE2A-11(配列番号132)の汎阻害活性を試験するために、ヒトE1活性化酵素UBA1、SAH-UBE2A-11または点変異体陰性対照SAH-UBE2A-11-R7E(BSTPX1RERLBRX2FKRLQ、「X1」はS-ペンテニルアラニンであり、「X2」はR-オクテニルアラニンである;配列番号852)、および様々な異なるヒトE2酵素(UBE2A、UBE2B、UBE2C、UBE2D1、UBE2D2、UBE2D3、UBE2D4、UBE2E1、UBE2E3、UBE2G1、UBE2L3、UBE2J1、UBE2J2、UBE2R1、UBE2R2、UBE2S、UBE2T、UBE3Q1、UBE2Q1、およびUBE2W2)を使用して、in vitro酵素阻害を実施した。SAH-UBE2A-11は、試験したすべてのヒトE2酵素に対するE1媒介性チオエステル転移を阻害したが、一方、点変異体対照SAH-UBE2A-11-R7Eは、阻害能を消失しており、作用の特異性が強調された(図5)。これらの研究は、SAH-UBE2A-11が、E2へのE1媒介性チオエステル転移を阻害するその能力において汎活性であること:SAH-UBE2A-11が、それが由来するE2への転移(すなわち、UBE2A)を阻害するだけでなく、多数の他のヒトE2酵素への転移も阻害することを明らかにした。
(実施例4)
SAH-UBE2A-11における鍵となる結合残基の同定
(実施例4)
SAH-UBE2A-11における鍵となる結合残基の同定
アラニンスキャニング変異誘発(図6)および電荷反転(RからEへのアミノ酸置換)(図7)変異誘発をSAH-UBE2A-11(配列番号132)ペプチドに関して実施し、機能的E2 hAステープルペプチドの活性に寄与する鍵となるアミノ酸残基を同定した(図6および7)。変異体SAH-UBE2A-11ペプチドに関して実施したin vitro酵素阻害アッセイは、アミノ酸R7、L9、B10、F13、およびL16(位置A4、A6、A7、A10、A13)が、ペプチドの機能に対して特に重要であることを明らかにした(図6および7)。
(実施例5)
SAH-UBE2AのUBA1への直接結合
(実施例5)
SAH-UBE2AのUBA1への直接結合
SAH-UBE2AのUBA1への直接結合を、ストレプトアビジン捕捉(図8)、蛍光偏光アッセイ(図9)、および水素-重水素交換質量分析(図10)によって評価した。組換えタンパク質と混合したビオチン化ペプチドのストレプトアビジン捕捉、その後の洗浄、溶出、およびタンパク質ゲル電気泳動による検出は、SAH-UBE2AのUBA1への直接結合を実証した(図8)。ユビキチンおよびATPの存在下と非存在下の両方で実施した蛍光偏光アッセイは、SAH-UBE2Aが、ユビキチンおよびATPとは無関係にUBA1に結合することを実証した(図9)。水素-重水素交換質量分析は、組換えUBA1とのインキュベーションが、ペプチド単独のインキュベーションと比較して、SAH-UBE2Aを重水素取り込みから用量依存的に保護したことを示した。対照的に、ペプチドの組換えE2とのインキュベーションは、有意な保護をもたらさなかった(図10)。
(実施例6)
SAH-UBE2Aは天然のUBA1に結合し、細胞溶解産物中のユビキチンカスケードを阻害する
(実施例6)
SAH-UBE2Aは天然のUBA1に結合し、細胞溶解産物中のユビキチンカスケードを阻害する
SAH-UBE2Aの天然のUBA1への直接結合を、HeLa細胞溶解産物と混合したビオチン化ペプチドのストレプトアビジン捕捉、その後の洗浄、溶出、タンパク質ゲル電気泳動およびUBA1に関するウエスタンブロッティングによって実証した(図11)。がん細胞溶解産物中のユビキチンカスケードの阻害を、ユビキチン化アッセイによって実証した。HeLa細胞の細胞質画分を、過剰なユビキチンおよびATP再生溶液の存在下で、SAH-UBE2Aまたはビヒクル対照と共にインキュベートし、次いで、非還元ゲル電気泳動およびユビキチンに対するウエスタンブロッティングに供した。SAH-UBE2Aは、ビヒクル対照と比較して、ポリユビキチン鎖の形成を用量依存的に阻害した(図12)。
(実施例7)
追加のE2 hAステープルペプチドの生成
(実施例7)
追加のE2 hAステープルペプチドの生成
追加のステープル化E2 hAペプチドを設計および生成した。表14は、追加の生成されたE2 hAステープルペプチド(そのそれぞれは、E2へのE1媒介性チオエステル転移を阻害した)の配列を提供する。言い換えれば、表14のE2 hAステープルペプチドのそれぞれは機能的であった。表15は、追加の生成されたE2 hAステープルペプチド(そのそれぞれは、E2へのE1媒介性チオエステル転移を阻害する能力が損なわれていることが認められた)の配列を提供する。言い換えれば、表15のE2 hAステープルペプチドは、顕著に損なわれた機能を示し、前臨床および臨床開発に関して最適に機能的なE2 hAステープルペプチドを達成するための設計、合成、試験、および反復の重要性を強調した。
表15. 生成した非機能的なE2 hAステープルペプチド。「B」はノルロイシンであり、「X1」はR-オクテニルアラニンであり、「X2」はS-ペンテニルアラニンである。
実施例1~7において使用した方法
ステープルペプチドの合成および精製:リンクアミドAM樹脂にアミノ酸を連続的に付加して、Symphony Xのペプチド合成器で固相Fmoc化学を使用して、ステープルペプチドを生成した。2個のS-ペンテニルアラニンまたは1個のS-ペンテニルアラニンおよび1個のR-オクテニルアラニン非天然アミノ酸は、それぞれ、i、i+4またはi、i+7位置で2個のネイティブなアミノ酸を置き換えた。Grubbs第一世代ルテニウム触媒を使用して、オレフィンメタセシスによってすべての炭化水素ステープルを形成し、その後、ペプチドの脱保護および樹脂からの切断を行った。示したように、ペプチドをアセチルでN末端で誘導体化し、C末端をFITCでアミド化または誘導体化した。ペプチドを、逆相高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析(LC/MS)によって精製し、アミノ酸分析によって定量した。
in vitro結合アッセイ:アクセプタータンパク質に対するリガンドの結合および親和性を評価するために、例えば、蛍光偏光アッセイ(FPA)を使用することができる。FPA技法は、偏光および蛍光トレーサーを使用して、分子配向および運動を測定する。偏光で励起されると、見掛けの分子量が高い分子と結合した蛍光トレーサー(例えば、FITC)(例えば、大きいタンパク質と結合したFITC標識ペプチド)は、小分子と結合した蛍光トレーサー(例えば、溶液中にて遊離しているFITC標識ペプチド)と比較して、より遅いそれらの回転速度に起因して、より高レベルの偏光蛍光を発光する。示したように、ユビキチン(10μM)およびATP(20μM)を含有するかまたは含有していない結合緩衝液中で、FPアッセイを実施した。
ストレプトアビジン-ビオチンプルダウンアッセイ:組換えタンパク質のプルダウンのために、10pmolの組換えヒトUBA1を、総体積1mLの結合緩衝液(50mMのNaCl、20mMのHEPES、pH7.4、5mMのDTT)中、5nmolのC末端をビオチン化したSAH-UBE2AまたはDMSOビヒクル対照と共に、4℃で1.5時間インキュベートした。次いで、30μLの予め平衡化したストレプトアビジンアガロースビーズを添加し、4℃でさらに1.5時間インキュベートした。遠心分離によってビーズをペレット化し、NP-40緩衝液(20mMのHEPES、pH7.4、50mMのNaCl、5mMのDTT、0.5%[v/v]のNP-40)で3回洗浄し、その後、3×SDSローディング緩衝液中で、70℃で10分間加熱することによって、タンパク質試料をビーズから溶出させた。試料を、電気泳動および銀染色(Pierce 24612)に供した。細胞溶解産物からのプルダウンのために、0.75mgのHeLa細胞溶解産物を、プロテアーゼ-ホスファターゼ阻害剤カクテルを含有する総体積1mLの結合緩衝液(50mMのNaCl、20mMのHEPES、pH7.4、5mMのDTT)中、5nmolのC末端をビオチン化したSAH-UBE2AまたはDMSOビヒクル対照と共に、4℃で2時間インキュベートした。次いで、30μLの予め平衡化したストレプトアビジンアガロースビーズ(ThermoFisher 20357)を添加し、4℃でさらに1.5時間インキュベートした。遠心分離によってビーズをペレット化し、NP-40緩衝液(20mMのHEPES、pH7.4、50mMのNaCl、5mMのDTT、0.5%[v/v]のNP-40)で3回洗浄し、その後、3×SDSローディング緩衝液中で、70℃で10分間加熱することによって、タンパク質試料をビーズから溶出させた。タンパク質を、SDS-PAGEゲル電気泳動によって分離し、UBE1(Abcam ab34711)に対するウエスタンブロットによって検出した。
in vitro酵素阻害アッセイ:50mMのNaCl、50mMのHEPES pH7.5を含有する緩衝液中、組換えヒトE1活性化酵素UBA1(10nM)、E2酵素(150nM)、ユビキチン(1μM)、およびMg-ATP(20μM)を、ペプチドまたはビヒクル対照(1%のDMSO)の存在下で、室温で45分間組み合わせる。対照反応はE1酵素を含まない。SDSを含有するローディングダイの添加によって反応をクエンチし、非還元条件下で、試料を4~12%のBis-Trisタンパク質ゲル上で分離する。銀染色によってタンパク質を可視化する。E1によるユビキチンのE2へのコンジュゲーションを、遊離E2(17kDa)のE2~ユビキチンコンジュゲート(約26kDa)への変換によってモニターする。銀染色画像のデンシトメトリーから、阻害パーセントの定量を計算した。エラーバーは、3回の独立した実験から計算した±1SEMを表す。
HXMS分析:水素-重水素交換質量分析(HXMS)実験を、記載された通りに実施した(Barclay, L. A. et al. Inhibition of Pro-apoptotic BAX by a noncanonical interaction mechanism. Molecular Cell 57, 873-886, doi: 10.1016/j.molcel.2015.01.014 (2015))。SAH-UBE2Aを、50mMのNaCl、5mMのMgCl2、500nMのユビキチン、20mMのATP、5mMのDTT、20mMのHEPES、pH7.4を含有する緩衝液中、単独で、または示したモル比の組換えヒトUBA1、UBE2D2、もしくはビヒクル対照と共に、氷上で10分間インキュベートした。重水素標識化をD2O緩衝液(20mMのHEPES、50mMのNaCl、pD8)中への18倍希釈で開始した。10秒の標識化後に、等体積のクエンチング緩衝液(0.8Mの塩化グアニジウム、0.8%[v/v]のギ酸)を添加して標識化反応をクエンチした。次いで、試料を注入し、ペプチドを無傷で捕捉し、VanGuard Pre-Columnトラップ(2.1mm×5mm、ACQUITY UPLC BEH C18、1.7μm)上で3分間脱塩し、65μL/分の流速で6分かけて、5%~35%のアセトニトリル勾配を使用してトラップから溶出させ、次いで、Waters nanoACQUITY LC上のACQUITY UPLC HSS T3、1.8μm、1.0mm×50mmカラムを使用して分離した。Waters Synapt G2Siの質量分析計をイオンモビリティーモードで操作し、データを分析した。すべての質量スペクトルは、DynamX 3.0(Waters Corporation)を使用して処理した。重水素レベルは逆交換のために補正せず、よって、相対値として報告した。記載されたすべての変化は、少なくともn=2の生物学的反復(bioreplicate)において一致した。
細胞溶解産物酵素阻害アッセイ:1×ATP再生溶液、20mMのHEPES、50mMのNaCl、5mMのMgCl2、2mMのDTT、100nMユビキチンアルデヒド、およびプロテアーゼ-ホスファターゼ阻害剤カクテルを含有するアッセイ緩衝液(pH7.4)中で、細胞溶解産物アッセイを、1mg/mLの最終濃度のHeLa S100溶解産物画分および示した濃度のペプチドまたはDMSOビヒクル対照を用いて実施した。反応を、100μMの最終濃度までユビキチンを添加することによって開始させ、室温で30分間進行させ、その後、非還元LDSローディング緩衝液でクエンチした。タンパク質を、SDS-PAGEゲル電気泳動によって分離し、ポリユビキチン(Cell Signaling Technology CST3936)に対するウエスタンブロットによって検出した。
(実施例8)
求電子性弾頭部を組み込むためのSAH-E2ペプチドの修飾
(実施例8)
求電子性弾頭部を組み込むためのSAH-E2ペプチドの修飾
UBA1のCys1039との共有結合を形成する潜在性を有する追加のE2 hAステープルペプチドのバリアントを作製するために、位置A8またはA11を「弾頭部」で置き換えたいくつかのバリアントを生成した。バリアントは、Ubc15(配列番号2)、UBE2D2(配列番号10)、およびUBE2A(配列番号4)のE2 hA配列に基づいた。表16および17は、生成した様々なE2 hAステープルペプチドの弾頭部バリアントの配列を提供する。弾頭部の位置を、ヒトE1の結晶構造へのペプチドのドッキングに基づいて決定した(PDF 6dc6)。ペプチドのE1結合面またはそれに隣接する位置およびUBA1(配列番号845)のCys1039の近傍を、弾頭部による置換のために選択した。アミノ酸コンセンサス位置A7のアルファ炭素は、UBA1(配列番号845)のCys1039の硫黄から5.4オングストロームであると推定される。アミノ酸コンセンサス位置A8のアルファ炭素は、UBA1(配列番号845)のCys1039の硫黄から6.6オングストロームであると推定される。アミノ酸コンセンサス位置A11のアルファ炭素は、UBA1(配列番号845)のCys1039の硫黄から4.8オングストロームであると推定される。
表16. 生成したE2 hAの弾頭部を有するステープルペプチド。「J」は、ジアミノブタン酸(「Dab」)のアクリルアミドを有するバージョンであり、「B」はノルロイシンであり、「X1」はR-オクテニルアラニンであり、「X2」はS-ペンテニルアラニンである
表17. 生成したE2 hAの弾頭部を有するステープルペプチド。「J」は、ジアミノブタン酸(「Dab」)のアクリルアミドを有するバージョンであり、「B」はノルロイシンであり、「X1」はR-オクテニルアラニンであり、「X2」はS-ペンテニルアラニンである。
配列番号727、841、842、および844の弾頭部を有するE2 hAステープルペプチドは、E2へのE1媒介性チオエステル転移を阻害した。配列番号680および752の弾頭部を有するE2 hAステープルペプチドは、E2へのE1媒介性チオエステル転移を阻害した。配列番号691および763の弾頭部を有するE2 hAステープルペプチドは、E2へのE1媒介性チオエステル転移を阻害しなかった。
(実施例9)
生成したステープルペプチドおよび生成した弾頭部を有するステープルペプチド
(実施例9)
生成したステープルペプチドおよび生成した弾頭部を有するステープルペプチド
表18および19に列挙したステープルペプチドおよび弾頭部を有するステープルペプチドを生成し、試験した。本開示は、末端が、C末端の「Z」であるこれらのステープルペプチド(バリアントはZを欠く)のバリアントも包含することに留意されたい。さらに、本開示は、非天然アミノ酸(X1、X2)が置換されていないことを除いて(except that that)、1~10(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)個のアミノ酸位置で、以下に列挙した配列と異なるステープルペプチドを特徴とする。一部の場合には、置換された残基は、E1との相互作用に関与することが予測されないものである。これらのバリアントは、E1-E2相互作用を阻害する。一部の場合には、これらのバリアントは、E2へのE1媒介性チオエステル転移を阻害する。本開示は、末端のZやその塩(例えば、酢酸塩、硫酸塩、塩化物)を含まない表18および19に列挙したペプチドのいずれか、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物、ならびにがんまたは他のE1を発現する疾患もしくはE1に依存する疾患を処置する際のそれらの使用方法を特徴とする。
表18. 生成したステープルペプチド
表18. 生成したステープルペプチド
表18では、「B」はノルロイシンであり;「X1」はR-オクテニルアラニンであり;「X2」はS-ペンテニルアラニンであり;「tr」=トランケートされた;「m」=変異体;Z=lys(ビオチン)(本開示は、存在する場合、末端の「Z」を含まない以外は上記ペプチドのそれぞれも包含することに留意されたい)
表19: 生成した弾頭部を有するステープルペプチド
表19: 生成した弾頭部を有するステープルペプチド
表19では、「B」はノルロイシンであり、「X1」はR-オクテニルアラニンであり、「X2」はS-ペンテニルアラニンであり;「J」は末端がブロモアセチルであるジアミノブタン酸であり;「U」は非天然ベンゾフェノンを含有するアミノ酸であり;「tr」=トランケートされた;「m」=変異体;Z=lys(ビオチン)。
(実施例10)
E2 hAステープルペプチドは、E1チオエステル転移活性に対して高い特異的阻害活性を示す
(実施例10)
E2 hAステープルペプチドは、E1チオエステル転移活性に対して高い特異的阻害活性を示す
SAH-UBE2A-11(配列番号132)の阻害活性は、非E1タンパク質または活性への効果の欠如またはそれへの干渉によって例示されるように、E2へのE1媒介性チオエステル転移に対して非常に特異的である。SAH-UBE2A-11(配列番号132)の作用機序の特異性を調査したところ、SAH-UBE2A-11(配列番号132)は、E2へのチオエステル転移に先立つ酵素ステップである、UBA1の共有結合によりそれ自体にユビキチンを受け渡しする能力に効果を示さなかった(図17)。さらに、ユビキチンカスケード全体をin vitroで再構成し、SAH-UBE2A-11(配列番号132)が、E2への受け渡しを阻害するレベルでしかカスケードに影響を及ぼさないことを実証した(図16)。タンパク質基質p53ならびにユビキチンカスケードの構成成分であるE1(UBA1)、E2(UBE2A)、E3(HDM2)、Ub、およびATPと共にインキュベートした場合、SAH-UBE2A-11(配列番号132)は、p53タンパク質のユビキチン化を阻害した。しかし、Ubで予め活性化されたE2が、受け渡しされていないE2およびUbの代わりに、反応混合物中に含まれる場合、SAH-UBE2A-11(配列番号132)は、p53のユビキチン化に影響を及ぼさず;予め受け渡しされたE2に関するSAH-UBE2A-11の阻害効果の回避によって、E2への受け渡しに対するSAH-UBE2A-11(配列番号132)の阻害効果の特異性が実証される。SAH-UBE2A-11(配列番号132)は、p53に対する脱ユビキチン化酵素であるUSP7の活性にも影響を及ぼさなかった(図16)。SAH-UBE2A-11(配列番号132)の活性への潜在的なペプチド凝集のいかなる影響も排除するために、UBA1に対するペプチドの阻害活性が、非イオン性界面活性剤(他の方法で、低分子またはペプチドの凝集物を可溶化することができる)の存在によって、全く影響を受けないことをさらに示した(図18)。SAH-UBE2A-11(配列番号132)のUBA1への直接的かつ特異的結合のさらなる調査において、蛍光顕微鏡法は、FITCで標識したSAH-UBE2A-11(配列番号132)が、His-UBA1でタグ付けしたNi-NTAビーズに特異的に結合し、タグ付けされていないビーズにも無関係なタンパク質(His-p53)でタグ付けされたビーズにも関与しなかったことを示し、UBA1への特異的ペプチド結合を示した(図19)。
(実施例11)
E2 hAステープルペプチドは、ステープリングの際にα-ヘリックス構造の強化を受け、α-ヘリックスE2 hAペプチドの生物学的活性はペプチド配列に依存する。
(実施例11)
E2 hAステープルペプチドは、ステープリングの際にα-ヘリックス構造の強化を受け、α-ヘリックスE2 hAペプチドの生物学的活性はペプチド配列に依存する。
ペプチドステープリングは、E2 hAペプチドにおけるα-ヘリックスフォールディングを誘導した。円二色性は、修飾されていないUBE2Aペプチド(BSTPARRRLBRDFKRLQ、ここで「B」はノルロイシンである;配列番号1343)が、ランダムコイル立体構造を優先的にとることに対応して、溶液中で21%のヘリシティを示したことを示したが、一方、SAH-UBE2A-11(配列番号132)は、54%のヘリックス含量を有するアルファ-ヘリックス立体構造の安定化を示した(図20)。同様に、ペプチドステープリングは、Ubc15ペプチド主鎖においてアルファ-ヘリックスフォールディングを誘導し、修飾されていないUbc15-1ペプチド(Ubc15-tr-m-z_1z;BPSSASRQLLRKQLKEIQZ、ここで、「B」はノルロイシンであり、「Z」はビオチン化したリシン(Lys(ビオチン))である;配列番号1340)は、19%のヘリックス含量しか示さず、ステープル化SAH-Ubc15-11ペプチド(配列番号50)は、51%のヘリックス含量を示した。一連のE2 hAペプチド(配列番号50、107、132、133;1327~1329;および1337~1339)のヘリシティのパーセントがそれらの阻害活性と相関しなかったため、ヘリックス形状単独では、E2 hAペプチドに対して生物学的活性を付与するのに十分ではなく、アルファ-ヘリックスの強化に加えて、適合するアミノ酸配列を必要とした(図20~22)。
(実施例12)
E2 hAステープルペプチドはプロテアーゼ耐性である
(実施例12)
E2 hAステープルペプチドはプロテアーゼ耐性である
ペプチドのステープリングによって、E2 hAペプチドのタンパク質分解安定性が付与された。プロテイナーゼK溶液による消化の際のSAH-UBE2A-11(配列番号132)の半減期は6時間を超え、非ステープルペプチドUBE2A(BSTPARRRLBRDFKRLQ;配列番号1343)に対して23倍延長された(図23)。
(実施例13)
hAステープルペプチドは、明白な結合と、結合界面を破壊して、SAH-UBE2Aの阻害活性を漸次的に損なう特異的変異との生物学的構造-活性-関係を示す。
hAステープルペプチドは、明白な結合と、結合界面を破壊して、SAH-UBE2Aの阻害活性を漸次的に損なう特異的変異との生物学的構造-活性-関係を示す。
上記実施例4で実証したように、点変異R7A、L9A、およびB10Aはそれぞれ、SAH-UBE2A-11の阻害活性を損なうことが判明した(図6Bを参照されたい)。ペプチドSAH-UBE2A-AAA(BSTPX1RARAARX2FKRLQ;配列番号1354)におけるように、3つの点変異の組合せによって、単一の点変異ペプチドSAH-UBE2A-R7Eと比較して、阻害活性が漸次的に損なわれることが判明した。三重の変異体ペプチドは、ヘリックス構造を欠く、非ステープルUBE2Aペプチド(BSTPARRRLBRDFKRLQ;配列番号1343)と同様に、無視できる程度の阻害活性しか示さなかった(図24)。単一の点変異体ペプチドと三重の点変異体ペプチドの阻害活性が損なわれる度合いは、水素-重水素交換質量分析によって測定した場合、UBA1に対する各ペプチドの結合度合と相関した(図25)。
実施例10~13において使用した追加の方法
実施例10~13において使用した追加の方法
in vitroユビキチン経路再構成アッセイ:示したように、ペプチド(30μM)UBA1(0.1μM)、UBE2D(1μM)、HDM2(1μM)、ユビキチン(1μM)およびATP(10mM)(すべてBoston Biochem K-200B)、予め活性化されたUb-UBEA2(3μM)(Boston Biochem E2-802)、およびUSP7(1μM)(BostonBiochem E-519)の存在下または非存在下で、組換えHis-p53(0.1μM)を含有する反応物を混合し、最終体積30μlで、37℃で2時間インキュベートし、その後、SDSを含有するローディングダイ中で90℃で10分間ボイルすることによって変性させた。試料を、アガロースゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロース膜に転写した。膜を3%のミルクで1時間ブロッキングし、1:1000の希釈で3%のBSAとマウスp53抗体(Boston Biochem K-200B)を含有するPBS中で一晩インキュベートし、0.1%のTween(登録商標)-20を含有するPBS中で洗浄し、次いで、1:5000希釈で3%のBSAと抗マウス二次抗体(BioRad AAC10P)を含有するPBS中で、室温で1時間インキュベートした。0.1%のTween(登録商標)-20を含有するPBS中で膜を再度洗浄し、Amersham Imager 680(GE Life Sciences)上でAmersham ECL Prime(GE Life Sciences)を使用して撮像した。
蛍光顕微鏡法:Hisタグ付きUBA1(25μg)を、PBS中でNi-NTAアガロースビーズ(100μl)(Invitrogen TM R90110)と共に30分間インキュベートした。次いで、ビーズを、FITCで標識したペプチド(10μM)と共に30分間インキュベートした。ビーズを386ウェルプレート形式(10μl/ウェル)(Corning 384ウェル High Content Imaging Glass Bottom Microplate)でプレーティングし、Olympusの広視野落射蛍光顕微鏡、63×LCPlanFL NA 0.7対物レンズ、およびCoolSNAP DYNOカメラを用いて撮像した。
円二色性:報告されたように(Bird et. al., Methods in Enzymol., 446:369-386 (2008)を参照されたい)、Aviv Biomedicalの分光光度計で実施される円二色性分析のために、アセチル化ペプチドを水中10%(vol/vol)のアセトニトリルに溶解させた。
ペプチドタンパク質分解アッセイ:in vitroでのタンパク質分解は、以下のパラメーター:20μlの注射、0.6mLの流速、水(0.1%のギ酸)から20%~80%のアセトニトリル(0.75%のギ酸)への15分にわたる勾配、出発勾配条件に戻すための4分の洗浄、および0.5分のポストタイムからなる20分のランタイムを使用して、LC/MS(Agilent 1200)によって測定した。MSDは、(M+2H)/2、±1質量単位の1チャネル、(M+3H)/3、±1質量単位の1チャネル、および(M+4H)/4、および±1質量単位の他のチャネルを有するスキャンモードに設定した。各MSDシグナルを統合して、108を超えるカウントの曲線下面積を得た。反応試料は、DMSO(1mMのストック)中5μlのペプチドおよび50mMのTris HClからなる緩衝液195μl(pH7.4)から構成した。ゼロ時間の試料の注射の際に、20ng/μLのプロテイナーゼK(New England Biolabs)6μlを添加し、無傷のペプチドの量を経時的に連続注射によって定量した。時間に対するMSD面積のプロットによって指数減衰曲線が得られ、Prismソフトウェア(GraphPad)を使用して非線形回帰分析によって半減期を決定した。
(実施例14)
UBA2-、UBA3-、およびUBA6-に結合するステープルペプチド
(実施例14)
UBA2-、UBA3-、およびUBA6-に結合するステープルペプチド
UBA2、UBA3、およびUBA6に結合するステープルペプチドは、上記のように生成される。UBE2F、UBE2m、UBE2I、およびUSE1 E2 hAペプチド(配列番号35~38)のステープルスキャンは、ステープルペプチドのUBA2、UBA3、またはUBA6を阻害する能力を評価するためのアッセイ(例えば、上記のin vitro酵素阻害アッセイ)と併せて実施される。図13は、アルファヘリックスであることが予期される配列番号36(左のパネル)および配列番号35(右のパネル)のペプチド部分のホイール図を例示する。図14は、アルファヘリックスであることが予期される配列番号37のペプチド部分のホイール図を例示する。図15は、アルファヘリックスであることが予期される配列番号38のペプチド部分のホイール図を例示する。
他の実施形態
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と併せて説明されてきたが、前述の説明は、本発明を例証することを意図するものであり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではない。他の態様、利点、および修正は、以下の特許請求の範囲内である。
Claims (141)
- 0~10個のアミノ酸置換を有する配列番号132の配列の少なくとも8個の連続アミノ酸のアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記置換が、存在する場合、配列番号132の5および12位にはなく、前記ペプチドが、ヒトE2へのヒトE1媒介性チオエステル転移を阻害し、必要に応じて、5位がS-ペンテニルアラニンであり、12位がR-オクテニルアラニンであるか、または5位がR-オクテニルアラニンであり、12位がS-ペンテニルアラニンである、ペプチド、またはその塩。
- 前記ペプチドが、1~10個のアミノ酸置換を有し、前記置換が、配列番号132の7および/または9位にはない、請求項1に記載のペプチドまたはその塩。
- 前記ペプチドが、1~10個のアミノ酸置換を有し、前記置換が、配列番号132の7、9、10、13、および16位の1個または複数にはない、請求項1に記載のペプチドまたはその塩。
- 前記ペプチドが、1~10個のアミノ酸置換を有し、前記置換が、配列番号132の7、9、10、13、および16位の1個または複数にあり、前記置換が、これらの位置の1個または複数におけるアラニンへの置換である、請求項1に記載のペプチドまたはその塩。
- 前記ペプチドが、1~10個のアミノ酸置換を有し、前記置換が、配列番号132の1、2、3、4、6、8、11、13、14、15、16、または17位の1個または複数にあり、必要に応じて、これらの位置が、アラニンに置換されており、6および/または8位が置換されている場合、これらの位置がまた、グルタミン酸に置換されていてもよい、請求項1に記載のペプチドまたはその塩。
- 前記ペプチドが、1~10個のアミノ酸置換を有し、前記置換が、配列番号132の6または8位の1個または複数を含み、必要に応じて、これらの位置が、グルタミン酸に置換されている、請求項1に記載のペプチドまたはその塩。
- ヒトE1内のシステイン残基と共有結合を形成することができる反応性基をさらに含み、必要に応じて、前記反応性基が、N末端に求電子性基または求電子性化学的キャップを有する非天然アミノ酸である、請求項1から6のいずれか一項に記載のペプチドまたはその塩。
- ペプチドまたはその塩であって、前記ペプチドが、N末端からC末端に以下の残基:
Xaa1=B、A(Bは、ノルロイシンであるか、または存在しない);
Xaa2=S、A、または存在しない;
Xaa3=T、A、または存在しない;
Xaa4=P、A、または存在しない;
Xaa5=ステープリングアミノ酸
Xaa6=R、E、またはA;
Xaa7=RまたはA;
Xaa8=R、E、またはA;
Xaa9=L、A、またはヒトE1内のシステイン残基と共有結合を形成することができる反応性基(必要に応じて、前記反応性基は前記N末端に求電子性基または求電子性化学的キャップを有する非天然アミノ酸である);
Xaa10=BまたはA(Bは、ノルロイシンである);
Xaa11=RまたはA;
Xaa12=ステープリングアミノ酸;
Xaa13=F、A、ヒトE1内のシステイン残基と共有結合を形成することができる反応性基(必要に応じて、前記反応性基は前記N末端に求電子性基または求電子性化学的キャップを有する非天然アミノ酸である)、または存在しない;
Xaa14=K、R、A、または存在しない;
Xaa15=R、A、または存在しない
Xaa16=L、A、または存在しない;および
Xaa17=Q、A、または存在しない
を有する配列の少なくとも8個の連続アミノ酸を含み、
前記ペプチドが、ヒトE1とヒトE2との間の相互作用を阻害し、必要に応じて、前記ペプチドが、ヒトE2へのヒトE1媒介性チオエステル転移を阻害する、ペプチドまたはその塩。 - 前記ペプチドが、8~50、8~40、8~30、8~25、8~20、または8~17アミノ酸長である、請求項8に記載のペプチドまたはその塩。
- 前記ペプチドが、内部で架橋している、請求項1から9のいずれか一項に記載のペプチドまたはその塩。
- 構造的に安定化されたペプチドを作製する方法であって、
(a)請求項1から9のいずれか一項に記載のペプチドを得るステップと、
(b)前記ペプチドを架橋させるステップであって、必要に応じて、前記架橋が、RCM反応によるものである、ステップと
を含む、方法。 - 前記架橋したペプチドを医薬組成物として製剤化するステップをさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 請求項1から10のいずれか一項に記載のペプチドまたはその塩、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
- それを必要とするヒト対象において、E1を発現する疾患またはE1に依存する疾患を処置する方法であって、前記ヒト対象に、請求項1から10のいずれか一項に記載のペプチドもしくはその塩、または請求項13に記載の医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む、方法。
- 前記E1を発現する疾患またはE1に依存する疾患が、がんである、請求項14に記載の方法。
- 前記E1を発現する疾患またはE1に依存する疾患が、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、抗体媒介性移植拒絶、自己免疫障害、または炎症性障害である、請求項14に記載の方法。
- 前記ヒト対象が、前記E1を発現する疾患またはE1に依存する疾患を処置するための以前の治療に対して、応答性でなかったか、または耐性を生じたことがある、請求項14から16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記塩が、酢酸塩、硫酸塩、または塩化物である、請求項1から10のいずれか一項に記載のペプチドまたはその塩。
- 配列番号1~33のいずれか1つのアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記A1~A11アミノ酸の1個または複数が、別のアミノ酸で置換されており、前記修飾されたアミノ酸配列が、少なくとも1個のペプチド構造を安定化させる修飾を含み、前記ペプチドが、ユビキチン活性化酵素1(UBA1)に結合し、それを阻害する、ペプチド。
- 前記ペプチド構造を安定化させる修飾が、配列番号1~33のいずれか1つのアミノ酸A1~A11に示される配列の少なくとも2個のアミノ酸の、非天然アミノ酸による置換を含み、前記非天然アミノ酸が、オレフィン側鎖を含む、請求項19に記載のペプチド。
- 前記ペプチド構造を安定化させる修飾が、炭化水素ステープル/ステッチ、ラクタムステープル/ステッチ;UV環化付加ステープル/ステッチ;オキシムステープル/ステッチ;チオエーテルステープル/ステッチ;ダブルクリックステープル/ステッチ;ビス-ラクタムステープル/ステッチ;ビス-アリール化ステープル/ステッチ;またはこれらのいずれか2つもしくはそれより多くの組合せである、請求項19に記載のペプチド。
- 前記ペプチド構造を安定化させる修飾が、ステッチである、請求項19に記載のペプチド。
- 前記ペプチド構造を安定化させる修飾が、ステープルである、請求項19に記載のペプチド。
- 前記ステープルが、前記アミノ酸配列における2個の位置の1個または複数に存在し、前記2個の位置が、iおよびi+3、iおよびi+4、iおよびi+6、またはiおよびi+7である、請求項23に記載のペプチド。
- 前記ステープルが、前記アミノ酸配列における2個の位置の1個または複数に存在し、前記2個の位置が、A2およびA9、A5およびA9、A8およびA12、A9およびA13、A1およびA8、A4およびA11、ならびにA5およびA12からなる群から選択される、請求項23に記載のペプチド。
- 前記ステープルが、2個の位置に存在し、前記2個の位置が、A2およびA9である、請求項23に記載のペプチド。
- 前記ステープルが、前記2個の位置のそれぞれにおいてアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換のそれぞれが、非天然アミノによる置換であり、前記非天然アミノ酸が、オレフィン側鎖を含む、請求項23から26のいずれか一項に記載のペプチド。
- オレフィン側鎖を含む前記非天然アミノ酸が、S-ペンテニルアラニン、R-オクテニルアラニン;R-プロペニルアラニン、S-ペンテニルアラニン;R-ペンテニルアラニン、S-ペンテニルアラニン;Bis-ペンテニルグリシン、S-ペンテニルアラニン、R-オクテニルアラニン;ならびにBis-ペンテニルグリシン、S-オクテニルアラニン、およびR-オクテニルアラニンからなる群から選択される、請求項20または27に記載のペプチド。
- (a)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号4のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号4のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか、
(b)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号6のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号6のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか、
(c)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号1のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号1のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか、
(d)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号2のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号2のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか、
(e)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号3のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号3のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか、
(f)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号5のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号5のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか、
(g)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号7のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号7のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか、
(h)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号8のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号8のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか、
(i)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号9のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号9のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか、
(j)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号10のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号10のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか、
(k)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号11のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号11のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか、
(l)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号12のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号12のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか、
(m)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号13のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号13のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか、
(n)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号14のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号14のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか、
(o)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号15のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号15のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか、
(p)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号16のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号16のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか、
(q)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号17のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号17のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか、
(r)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号18のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号18のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか、
(s)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号19のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号19のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか、
(t)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号20のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号20のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか、
(u)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号21のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号21のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか、
(v)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号22のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号22のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか、
(w)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号23のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号23のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか、
(x)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号24のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号24のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか、
(y)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号25のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号25のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか、
(z)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号26のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号26のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか、
(aa)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号27のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号27のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか、
(bb)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号28のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号28のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか、
(cc)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号29のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号29のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか、
(dd)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号30のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号30のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか、
(ee)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号31のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号31のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか、
(ff)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号32のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号32のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか;または
(gg)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号33のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号33のA1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含む、請求項19から28のいずれか一項に記載のペプチド。 - (a)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号4のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号4のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか、
(b)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号6のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号6のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか、
(c)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号1のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号1のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか、
(d)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号2のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号2のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか、
(e)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号3のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号3のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか、
(f)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号5のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号5のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか、
(g)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号7のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号7のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか、
(h)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号8のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号8のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか、
(i)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号9のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号9のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか、
(j)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号10のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号10のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか、
(k)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号11のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号11のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか、
(l)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号12のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号12のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか、
(m)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号13のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号13のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか、
(n)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号14のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号14のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか、
(o)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号15のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号15のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか、
(p)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号16のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号16のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか、
(q)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号17のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号17のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか、
(r)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号18のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号18のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか、
(s)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号19のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号19のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか、
(t)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号20のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号20のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか、
(u)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号21のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号21のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか、
(v)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号22のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号22のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか、
(w)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号23のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号23のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか、
(x)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号24のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号24のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか、
(y)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号25のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号25のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか、
(z)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号26のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号26のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか、
(aa)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号27のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号27のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか、
(bb)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号28のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号28のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか、
(cc)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号29のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号29のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか、
(dd)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号30のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号30のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか、
(ee)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号31のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号31のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか、
(ff)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号32のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号32のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか、または
(gg)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号33のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号33のA4、A6、A7、およびA10からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含む、請求項19から29のいずれか一項に記載のペプチド。 - 別のアミノ酸で置換されたアミノ酸A1~A11の前記1つまたは複数が、配列番号1~33のアミノ酸A1~A11のE1と相互作用しない面に存在する、請求項19から30のいずれか一項に記載のペプチド。
- 配列番号1~33の相互作用しない面が、アミノ酸A1、A2、A5、A8、A9、およびA12を含む、請求項31に記載のペプチド。
- 配列番号1~33のいずれか1つのアミノ酸A1~A11の相互作用しない面における0~6個のアミノ酸が、アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、請求項19から32のいずれか一項に記載のペプチド。
- アミノ酸A4、A6、A7、およびA10の1つまたは複数が、アルファ-メチル化またはアルファ-エチル化された天然アミノ酸で置換されている、請求項19から33のいずれか一項に記載のペプチド。
- アミノ酸A4、A6、A7、およびA10の1つまたは複数が、L-アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、請求項19から33のいずれか一項に記載のペプチド。
- アミノ酸A1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11の1つまたは複数が、アルファ-メチル化またはアルファ-エチル化された天然アミノ酸で置換されている、請求項19から35のいずれか一項に記載のペプチド。
- アミノ酸A1、A2、A3、A5、A8、A9、およびA11の1つまたは複数が、L-アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、請求項19から35のいずれか一項に記載のペプチド。
- 前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号4のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含む、請求項19から37のいずれか一項に記載のペプチド。
- 前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号6のアミノ酸A1~A11に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含む、請求項19から37のいずれか一項に記載のペプチド。
- 前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号1~33のいずれか1つに示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含む、請求項19から37のいずれか一項に記載のペプチド。
- 配列番号1~33の1個または複数のアミノ酸が、L-アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸(1つまたは複数)で置換されている、請求項40に記載のペプチド。
- 配列番号1~33の0~5個のアミノ酸が、C末端から除去されているか、または除去されて、アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群からの1~6個のアミノ酸で置き換えられている、請求項40または41に記載のペプチド。
- 別のアミノ酸で置換された配列番号1~33の1個または複数のアミノ酸が、配列番号1~33のアミノ酸のE1と相互作用しない面に存在する、請求項40から42のいずれか一項に記載のペプチド。
- 前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号4に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含む、請求項40から43のいずれか一項に記載のペプチド。
- 前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号6に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含む、請求項40から43のいずれか一項に記載のペプチド。
- (i)前記ペプチドの全体的な疎水性が、配列番号1~33のペプチドと比較して低下しているか;(ii)前記ペプチドの全体的な正荷電が、配列番号1~33のペプチドと比較して低下しているか;または(iii)(i)と(ii)の組合せである、請求項19から45のいずれか一項に記載のペプチド。
- 配列番号132に示される配列を含む、請求項19に記載のペプチド。
- 配列番号133に示される配列を含む、請求項19に記載のペプチド。
- 配列番号107に示される配列を含む、請求項19に記載のペプチド。
- 配列番号50に示される配列を含む、請求項19に記載のペプチド。
- 配列番号35または36に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含むペプチドであって、配列番号35または36の1個または複数のアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されており、前記修飾されたアミノ酸配列が、少なくとも1個のペプチド構造を安定化させる修飾を含み、前記ペプチドが、ユビキチン活性化酵素3(UBA3)に結合し、それを阻害する、ペプチド。
- 前記ペプチド構造を安定化させる修飾が、配列番号35または36の配列の少なくとも2個のアミノ酸の、非天然アミノ酸による置換を含み、前記非天然アミノ酸が、オレフィン側鎖を含む、請求項51に記載のペプチド。
- 前記ペプチド構造を安定化させる修飾が、炭化水素ステープル/ステッチ、ラクタムステープル/ステッチ;UV環化付加ステープル/ステッチ;オキシムステープル/ステッチ;チオエーテルステープル/ステッチ;ダブルクリックステープル/ステッチ;ビス-ラクタムステープル/ステッチ;ビス-アリール化ステープル/ステッチ;またはこれらのいずれか2つもしくはそれより多くの組合せである、請求項51に記載のペプチド。
- 前記ペプチド構造を安定化させる修飾が、ステッチである、請求項51に記載のペプチド。
- 前記ペプチド構造を安定化させる修飾が、ステープルである、請求項51に記載のペプチド。
- 前記ステープルが、前記アミノ酸配列における2個の位置の1個または複数に存在し、前記2個の位置が、iおよびi+3、iおよびi+4、またはiおよびi+7である、請求項55に記載のペプチド。
- 前記ステープルが、前記2個の位置のそれぞれにおいてアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換のそれぞれが、非天然アミノによる置換であり、前記非天然アミノ酸が、オレフィン側鎖を含む、請求項55または56に記載のペプチド。
- オレフィン側鎖を含む前記非天然アミノ酸が、S-ペンテニルアラニン、R-オクテニルアラニン;R-プロペニルアラニン、S-ペンテニルアラニン;R-ペンテニルアラニン、S-ペンテニルアラニン;Bis-ペンテニルグリシン、S-ペンテニルアラニン、R-オクテニルアラニン;ならびにBis-ペンテニルグリシン、S-オクテニルアラニン、およびR-オクテニルアラニンからなる群から選択される、請求項52または57に記載のペプチド。
- (a)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号35の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号35のArg-1、Arg-2、Ser-4、Val-5、Arg-6、Asp-7、Leu-9、Leu-10、Glu-13、Ala-15、およびGlu-16からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含むか、または
(b)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号36の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号36のLys-1、Ser-4、Ala-5、Ala-6、Arg-9、Ile-10、およびAsp-134からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を含む、請求項51から58のいずれか一項に記載のペプチド。 - (a)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号35の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号35のVal-3、Lys-8、Val-11、Lys-12、およびVal-14からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸置換を含むか、または
(b)前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号36の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号36のLys-2、Ala-3、Gln-7、Leu-8、Gln-11、Lys-12、Ile-14、Asn-15、およびGlu-16からなる群から選択される0、1、もしくは2個の保存的アミノ酸位置を含む、請求項51から59のいずれか一項に記載のペプチド。 - 別のアミノ酸で置換された前記1個または複数のアミノ酸が、配列番号35または36のE1と相互作用しない面に存在する、請求項51から60のいずれか一項に記載のペプチド。
- 配列番号35の相互作用しない面が、配列番号25のアミノ酸Arg-1、Arg-2、Ser-4、Val-5、Arg-6、Asp-7、Leu-9、Leu-10、Glu-13、Ala-15、およびGlu-16を含み、配列番号36の相互作用しない面が、配列番号36のアミノ酸Lys-1、Ser-4、Ala-5、Ala-6、Arg-9、Ile-10、およびAsp-13を含む、請求項61に記載のペプチド。
- 請求項35または36の相互作用しない面における0~6個のアミノ酸が、アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、請求項51から62のいずれか一項に記載のペプチド。
- アミノ酸B7、B8、B11、B12、B15、およびB16の1つまたは複数が、アルファ-メチル化またはアルファ-エチル化された天然アミノ酸で置換されている、請求項51から62のいずれか一項に記載のペプチド。
- アミノ酸B7、B8、B11、B12、B15、およびB16の1つまたは複数が、L-アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、請求項51から62のいずれか一項に記載のペプチド。
- アミノ酸B1、B2、B3、B4、B5、B6、B9、B10、B13、およびB14の1つまたは複数が、アルファ-メチル化またはアルファ-エチル化された天然アミノ酸で置換されている、請求項51から65のいずれか一項に記載のペプチド。
- アミノ酸B1、B2、B3、B4、B5、B6、B9、B10、B13、およびB14の1つまたは複数が、L-アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、請求項51から65のいずれか一項に記載のペプチド。
- 配列番号35または36の0~5個のアミノ酸が、C末端から除去されているか、または除去されて、アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群からの1~6個のアミノ酸で置き換えられている、請求項51から67のいずれか一項に記載のペプチド。
- (i)前記ペプチドの全体的な疎水性が、配列番号35もしくは36のペプチドと比較して低下しているか;(ii)前記ペプチドの全体的な正荷電が、配列番号35もしくは36のペプチドと比較して低下しているか;または(iii)(i)と(ii)の組合せである、請求項51から68のいずれか一項に記載のペプチド。
- 配列番号37に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含むペプチドであって、配列番号37の1個または複数のアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されており、前記修飾されたアミノ酸配列が、少なくとも1個のペプチド構造を安定化させる修飾を含み、前記ペプチドが、ユビキチン活性化酵素2(UBA2)に結合し、それを阻害する、ペプチド。
- 前記ペプチド構造を安定化させる修飾が、配列番号35または36の配列の少なくとも2個のアミノ酸の、非天然アミノ酸による置換を含み、前記非天然アミノ酸が、オレフィン側鎖を含む、請求項70に記載のペプチド。
- 前記ペプチド構造を安定化させる修飾が、炭化水素ステープル/ステッチ、ラクタムステープル/ステッチ;UV環化付加ステープル/ステッチ;オキシムステープル/ステッチ;チオエーテルステープル/ステッチ;ダブルクリックステープル/ステッチ;ビス-ラクタムステープル/ステッチ;ビス-アリール化ステープル/ステッチ;またはこれらのいずれか2つもしくはそれより多くの組合せである、請求項70に記載のペプチド。
- 前記ペプチド構造を安定化させる修飾が、ステッチである、請求項70に記載のペプチド。
- 前記ペプチド構造を安定化させる修飾が、ステープルである、請求項70に記載のペプチド。
- 前記ステープルが、前記アミノ酸配列における2個の位置の1個または複数に存在し、前記2個の位置が、iおよびi+3、iおよびi+4、またはiおよびi+7である、請求項74に記載のペプチド。
- 前記ステープルが、前記2個の位置のそれぞれにおいてアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換のそれぞれが、非天然アミノによる置換であり、前記非天然アミノ酸が、オレフィン側鎖を含む、請求項74または75に記載のペプチド。
- オレフィン側鎖を含む前記非天然アミノ酸が、S-ペンテニルアラニン、R-オクテニルアラニン;R-プロペニルアラニン、S-ペンテニルアラニン;R-ペンテニルアラニン、S-ペンテニルアラニン;Bis-ペンテニルグリシン、S-ペンテニルアラニン、R-オクテニルアラニン;ならびにBis-ペンテニルグリシン、S-オクテニルアラニン、およびR-オクテニルアラニンからなる群から選択される、請求項71または76に記載のペプチド。
- 前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号37のAla-1、Arg-4、Leu-5、Glu-8、Ala-11、Trp-12、およびAsp-15からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、または5個のアミノ酸置換を含む、請求項70から77のいずれか一項に記載のペプチド。
- 前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号37のLeu-2、Ser-3、Ala-6、Gln-7、Arg-9、Lys-10、Arg-13、およびLys-14からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、または2個の保存的アミノ酸置換を含む、請求項70から78のいずれか一項に記載のペプチド。
- 別のアミノ酸で置換された前記1個または複数のアミノ酸が、配列番号37のE1と相互作用しない面に存在する、請求項70から79のいずれか一項に記載のペプチド。
- 配列番号37の相互作用しない面が、配列番号37のアミノ酸Ala-1、Arg-4、Leu-5、Glu-8、Ala-11、Trp-12、およびAsp-15を含む、請求項80に記載のペプチド。
- 配列番号37の相互作用しない面における0~6個のアミノ酸が、アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、請求項70から81のいずれか一項に記載のペプチド。
- 配列番号37のアミノ酸Leu-2、Ser-3、Ala-6、Gln-7、Arg-9、Lys-10、Arg-13、およびLys-14の1つまたは複数が、アルファ-メチル化またはアルファ-エチル化された天然アミノ酸で置換されている、請求項70から82のいずれか一項に記載のペプチド。
- 配列番号37のアミノ酸Leu-2、Ser-3、Ala-6、Gln-7、Arg-9、Lys-10、Arg-13、およびLys-14の1つまたは複数が、L-アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、請求項70から82のいずれか一項に記載のペプチド。
- 配列番号37のアミノ酸Ala-1、Arg-4、Leu-5、Glu-8、Ala-11、Trp-12、およびAsp-15の1つまたは複数が、アルファ-メチル化またはアルファ-エチル化された天然アミノ酸で置換されている、請求項70から84のいずれか一項に記載のペプチド。
- 配列番号37のアミノ酸Ala-1、Arg-4、Leu-5、Glu-8、Ala-11、Trp-12、およびAsp-15の1つまたは複数が、L-アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、請求項70から84のいずれか一項に記載のペプチド。
- 配列番号37の0~5個のアミノ酸が、C末端から除去されているか、または除去されて、アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群からの1~6個のアミノ酸で置き換えられている、請求項70から86のいずれか一項に記載のペプチド。
- (i)前記ペプチドの全体的な疎水性が、配列番号37のペプチドと比較して低下しているか;(ii)前記ペプチドの全体的な正荷電が、配列番号37のペプチドと比較して低下しているか;または(iii)(i)と(ii)の組合せである、請求項70から87のいずれか一項に記載のペプチド。
- 配列番号38に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含むペプチドであって、配列番号38の1個または複数のアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されており、前記修飾されたアミノ酸配列が、少なくとも1個のペプチド構造を安定化させる修飾を含み、前記ペプチドが、ユビキチン活性化酵素6(UBA6)に結合し、それを阻害する、ペプチド。
- 前記ペプチド構造を安定化させる修飾が、配列番号38の配列の少なくとも2個のアミノ酸の、非天然アミノ酸による置換を含み、前記非天然アミノ酸が、オレフィン側鎖を含む、請求項89に記載のペプチド。
- 前記ペプチド構造を安定化させる修飾が、炭化水素ステープル/ステッチ、ラクタムステープル/ステッチ;UV環化付加ステープル/ステッチ;オキシムステープル/ステッチ;チオエーテルステープル/ステッチ;ダブルクリックステープル/ステッチ;ビス-ラクタムステープル/ステッチ;ビス-アリール化ステープル/ステッチ;またはこれらのいずれか2つもしくはそれより多くの組合せである、請求項89に記載のペプチド。
- 前記ペプチド構造を安定化させる修飾が、ステッチである、請求項89に記載のペプチド。
- 前記ペプチド構造を安定化させる修飾が、ステープルである、請求項89に記載のペプチド。
- 前記ステープルが、前記アミノ酸配列における2個の位置の1個または複数に存在し、前記2個の位置が、iおよびi+3、iおよびi+4、またはiおよびi+7である、請求項93に記載のペプチド。
- 前記ステープルが、前記2個の位置のそれぞれにおいてアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換のそれぞれが、非天然アミノによる置換であり、前記非天然アミノ酸が、オレフィン側鎖を含む、請求項93または94に記載のペプチド。
- オレフィン側鎖を含む前記非天然アミノ酸が、S-ペンテニルアラニン、R-オクテニルアラニン;R-プロペニルアラニン、S-ペンテニルアラニン;R-ペンテニルアラニン、S-ペンテニルアラニン;Bis-ペンテニルグリシン、S-ペンテニルアラニン、R-オクテニルアラニン;ならびにBis-ペンテニルグリシン、S-オクテニルアラニン、およびR-オクテニルアラニンからなる群から選択される、請求項90または95に記載のペプチド。
- 前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号38のMet-1、Ala-2、Ala-3、Ser-4、Leu-6、Asn-9、Leu-10、Arg-12、Leu-13、Ser-15、Arg-16、およびCys-17からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、2、3、4、または5個のアミノ酸置換を含む、請求項89から96のいずれか一項に記載のペプチド。
- 前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号38のArg-5、Glu-7、Leu-8、Val-11、およびLeu-14からなる群から選択されるアミノ酸位置に、0、1、または2個の保存的アミノ酸置換を含む、請求項89から97のいずれか一項に記載のペプチド。
- 別のアミノ酸で置換された前記1個または複数のアミノ酸が、配列番号38のE1と相互作用しない面に存在する、請求項89から98のいずれか一項に記載のペプチド。
- 配列番号38の相互作用しない面が、配列番号38のアミノ酸Met-1、Ala-2、Ala-3、Ser-4、Leu-6、Asn-9、Leu-10、Arg-12、Leu-13、Ser-15、Arg-16、およびCys-17を含む、請求項99に記載のペプチド。
- 配列番号38の相互作用しない面における0~6個のアミノ酸が、アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、請求項89から100のいずれか一項に記載のペプチド。
- 配列番号38のアミノ酸Arg-5、Glu-7、Leu-8、Val-11、およびLeu-14の1つまたは複数が、アルファ-メチル化またはアルファ-エチル化された天然アミノ酸で置換されている、請求項89から101のいずれか一項に記載のペプチド。
- 配列番号38のアミノ酸Arg-5、Glu-7、Leu-8、Val-11、およびLeu-14の1つまたは複数が、L-アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、請求項89から101のいずれか一項に記載のペプチド。
- 配列番号38のアミノ酸Met-1、Ala-2、Ala-3、Ser-4、Leu-6、Asn-9、Leu-10、Arg-12、Leu-13、Ser-15、Arg-16、およびCys-17の1つまたは複数が、アルファ-メチル化またはアルファ-エチル化された天然アミノ酸で置換されている、請求項89から103のいずれか一項に記載のペプチド。
- 配列番号38のアミノ酸Met-1、Ala-2、Ala-3、Ser-4、Leu-6、Asn-9、Leu-10、Arg-12、Leu-13、Ser-15、Arg-16、およびCys-17の1つまたは複数が、L-アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、請求項89から103のいずれか一項に記載のペプチド。
- 配列番号38の0~5個のアミノ酸が、C末端から除去されているか、または除去されて、アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群からの1~6個のアミノ酸で置き換えられている、請求項89から105のいずれか一項に記載のペプチド。
- (i)前記ペプチドの全体的な疎水性が、配列番号38のペプチドと比較して低下しているか;(ii)前記ペプチドの全体的な正荷電が、配列番号38のペプチドと比較して低下しているか;または(iii)(i)と(ii)の組合せである、請求項89から106のいずれか一項に記載のペプチド。
- 求電子性弾頭部を含む、請求項19から50のいずれか一項に記載のペプチドの誘導体。
- 前記求電子性弾頭部が、アミノ酸位置A7、A8、またはA11に存在する、請求項108に記載のペプチド誘導体。
- 前記求電子性弾頭部が、前記ペプチドのN末端に存在する、請求項108に記載のペプチド誘導体。
- 前記求電子性弾頭部が、前記ペプチドのN末端に存在しない、請求項108に記載のペプチド誘導体。
- 前記求電子性弾頭部が、求電子性基を有する非天然アミノ酸である、請求項108から111のいずれか一項に記載のペプチド誘導体。
- 求電子性基を有する前記非天然アミノ酸が、ポリペプチド骨格に連結した求電子性アクリルアミドまたは置換されたアクリルアミドを有する、請求項112に記載のペプチド誘導体。
- 求電子性基を有する前記非天然アミノ酸が、(S)-1-アクリロイルピロリジン-3-カルボキサミド;1-アクリロピぺリジン-4-カルボキサミド、(R)-1アクリロイルピぺリジン-3-カルボキサミド;(S)-1-アクリロイルピぺリジン-3-カルボキサミド;(S)-1-アクリロイルピロリジン-2-カルボキサミド;(R)-1-アクリロイルピロリジン-2-カルボキサミド;(E)-4-(ジメチルアミノ)ブタ-2-エナミド;アクリルアミド;アジリジン、ジアジリジン、アゼチジン、ピロリジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、オキサゾリジン、イソキサゾリジン、チアゾリジン、イソチアゾリジン、ピぺリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、アゼパネアジリン、ジアジリン、アゼト、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、ピリジン、ジアジン、オキサジン、チアジン、アゼピンフェニル(アニリン);ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、インドール、イソインドール、インドリジン、キノロン、イソキノリン、キノキサリン、フタルジン、キナゾリン、プリン、カルバゾール、インダゾール、ベンズイミダゾール、アザインドール、α-シアノアクリルアミド、プロピオルアミド、trans4-ジメチルアミノ-2-ブテンアミド、trans4-ピペリジニル-2-ブテンアミド、置換アクリルアミド、およびビニル-スルホンアミドからなる群から選択される、請求項113に記載のペプチド誘導体。
- 前記求電子性弾頭部が、末端がブロモアセチルであるジアミノブタン酸または末端がアクリルアミドであるジアミノブタン酸である、請求項112に記載のペプチド誘導体。
- 前記求電子性弾頭部が、システイン反応性D-ニペコチン酸部分である、請求項112に記載のペプチド誘導体。
- 前記求電子性弾頭部が、システイン反応性部分である、請求項112に記載のペプチド誘導体。
- 配列番号392、428、464、500、680、716、752、および788のいずれか1つに示される配列を含む、請求項108に記載のペプチド誘導体。
- 配列番号680に示される配列を含む、請求項108に記載のペプチド誘導体。
- 配列番号752に示される配列を含む、請求項108に記載のペプチド誘導体。
- 配列番号393、429、465、501、681、717、753、および789のいずれか1つに示される配列を含む、請求項108に記載のペプチド誘導体。
- 配列番号367、403、439、655、727、および757のいずれか1つに示される配列を含む、請求項108に記載のペプチド誘導体。
- 配列番号727に示される配列を含む、請求項108に記載のペプチド誘導体。
- 配列番号833~836および841~844のいずれか1つに示される配列を含む、請求項108に記載のペプチド誘導体。
- 配列番号841に示される配列を含む、請求項108に記載のペプチド誘導体。
- 配列番号842に示される配列を含む、請求項108に記載のペプチド誘導体。
- 配列番号844に示される配列を含む、請求項108に記載のペプチド誘導体。
- UBA1に共有結合により結合する、請求項108から127のいずれか一項に記載のペプチド誘導体。
- 請求項19から107のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項108から128のいずれか一項に記載の誘導体ペプチド、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
- それを必要とするヒト対象において、E1を発現する疾患またはE1に依存する疾患を処置する方法であって、前記ヒト対象に、請求項19から107のいずれか一項に記載のペプチド、請求項108から128のいずれか一項に記載の誘導体ペプチド、または請求項129に記載の医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む、方法。
- 前記E1を発現する疾患またはE1に依存する疾患が、がんである、請求項130に記載の方法。
- 前記E1を発現する疾患またはE1に依存する疾患が、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、抗体媒介性移植拒絶、自己免疫障害、または炎症性障害である、請求項130に記載の方法。
- 構造的に安定化されたペプチドを作製する方法であって、
(a)請求項19から107のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項108から128のいずれか一項に記載の誘導体ペプチドを得るステップと、
(b)前記ペプチドまたは前記ペプチド誘導体を架橋させるステップであって、必要に応じて、前記架橋が、RCM反応によるものである、ステップと
を含む、方法。 - 前記架橋したペプチドを医薬組成物として製剤化するステップをさらに含む、請求項133に記載の方法。
- 式:
または薬学的に許容されるその塩であって、
式中、
各R1およびR2は、独立して、H、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキルまたはヘテロシクリルアルキルであり、そのいずれかは、置換されているかまたは置換されておらず、
各R3は、独立して、アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり、そのいずれかは、置換されているかまたは置換されておらず、
各xは、独立して、2、3、または6であり、
各wおよびyは、独立して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20であり、
zは、1または2であり、
各Xaaは、独立して、アミノ酸であり、
前記架橋したアミノ酸配列が、配列番号4、6、または10の配列と比較して、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸置換および0、1、2、4、または5個のアミノ酸の欠失を有し、
前記アミノ酸置換の少なくとも2個が、オレフィン側鎖を含む(ciomprising)非天然アミノ酸への置換であり、前記置換されたアミノ酸が、配列番号4、6、または10において、2、3、または6アミノ酸離れており、
前記架橋したアミノ酸配列が、アルファヘリックス立体構造を有し、
前記化合物がE1-E2相互作用を阻害し、および/または、用量依存的に、E2へのE10媒介性チオエステル転移を阻害し、
必要に応じて、少なくとも1つのアミノ酸配列が、ヒトE1内のシステイン残基と共有結合を形成することができる反応性基で置換されており、必要に応じて、前記反応性基が、N末端に求電子性基または求電子性化学的キャップを有する非天然アミノ酸である、化合物または薬学的に許容されるその塩。 - 前記欠失が、N末端および/またはC末端に存在する、請求項135に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩。
- 前記アミノ酸置換が、E1との相互作用に関与しない配列番号4、6、または10における位置を含む、請求項135または136に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩。
- 前記架橋したアミノ酸配列が、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸置換を有する配列番号132、133、107、680、727、752、841、842、または844のいずれか1つの配列を有し、これらのペプチドにおけるオレフィン側鎖を含む前記非天然アミノ酸を有する位置が、置換されていない、請求項135に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩。
- 前記E1と直接相互作用することが予測されるアミノ酸が、置換されていないか、またはアラニンもしくは保存的アミノ酸で置換されている、請求項138に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩。
- 前記E1と直接相互作用しないことが予測されるアミノ酸が、置換されている、請求項138または139に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩。
- 前記薬学的に許容される塩が、酢酸塩、硫酸塩、または塩化物である、請求項135から140のいずれか一項に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩。
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