JP5908832B2 - 構築されたウィルス性ペプチド組成物及び使用方法 - Google Patents

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Description

（連邦支援研究によってなされた発明に対する権利の声明）
本研究の一部は、国立衛生研究所（National Institute of Health）の所内研究プログラム（Intramural Research Program）である、グラントＮｏ．１Ｒ０１ ＡＩ０８４１０２によって支援された。政府は本発明にある特定の権利を有している。
（関連出願への言及）
本出願は、表題が「ウィルス感染症の治療のための組成物及び方法」である、国際出願日２００９年１月２３日のＰＣＴ特許出願／ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０００４３８号と関連していて、これはその全てが参照により、本明細書に取り込まれている。本出願は２００９年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／２１８，２０９号の優先権を主張し、これはその全てが参照により、本明細書に取り込まれている。
ウィルス外被タンパク質が宿主細胞の表面受容体を認識して結合する、ウィルス融合の分子過程は、ウィルス感染症の予防及び治療における重要な標的である。宿主細胞受容体によるウィルス性グリコタンパク質の認識により、ウィルス融合タンパク質がウィルスの融合及び感染に必須である構造変化を受ける。Ｎ及びＣ末端に位置する一連の疎水性アミノ酸が纏まって宿主細胞膜を貫通する複合体を形成する。２つの両親媒性７個繰り返しドメインを含有している隣接ウィルス性グリコタンパク質が互いに折り畳んで、スパイクと呼ばれる６α-螺旋バンドルから成っている、ヘアピンの三量体を形成する。三量体のそ
れぞれのグリコタンパク質は膜近位細胞外ドメイン領域（ＮＰＥＲ）によってウィルス表面に拘束される。この６螺旋バンドルモチーフは多くのウィルスファミリー内に保存されていて、フィロウィルス（エボラ）（Malashkevich, V.N., et al., PNAS, 1999, 96: 2662-2667; Weissenhorn, W., et al., Molecular Cell, 1998, 2(5): p. 605-616）、オルソミクソウィルス（インフルエンザ）（Wilson, I.A., J.J. Skehel, and D.C. Wiley, Nature, 1981. 289: 366-37; Bullough, P.A., et al., Nature, 1994. 371(6492): p. 37-43）、コロナウィルス（ＳＡＲＳ）（Xu, Y.H., et al., Journal of Biological Chemistry, 2004. 279: 49414-49419）、パラミクソウィルス（ＨＲＳＶ）（Zhao, X., et al., PNAS, 2000. 14172-14177）及びレトロウィルス（ＨＩＶ）（Chan, D.C. et al., Cell, 1997. 89: 263-27; Weissenhorn, W., et al., Nature, 1997. 387: 426-430）を包含
する。
ワクチンは、ウィルス感染を予防する有効な方法を提供できる。しかしながら、適切なウイルス抗原の選択及び／又は創出はささいな仕事ではない。ワクチン開発の挑戦は、大きな構造多様性を有しそして／又は急速な変異を受けるウィルスによる感染の予防のためには特に困難である。ワクチン開発の実質的な課題は、ビリオン表面ｇｐ１６０スパイクタンパク質がその例である、ＨＩＶタンパク質のウィルス配列多様性を包含する、ＨＩＶ−１生態の多様な側面に起因している（Korber,B., et al., 2001. Evolutionary and immunological implications of contemporary HIV-1 variation. Br. Med. Bull. 58, 19-42）。上記の一般的なウィルス融合過程においても同様だが、ｇｐ１６０は前駆体として合成され、トランスゴルジ中のフーリン様酵素によって、非共有結合しているｇｐ１２０及びｇｐ４１サブユニットに切断されて、ヘテロ三量体に組み立てられる。ｇｐ１２０はＣＤ４細胞表面に結合し、次いで、コレセプター接着部位を露出する構造変化を受ける（Feng et al., 1996. HIV-1 entry co-factor: functional cDNA cloning of a seven-transmembrane, G protein coupled receptor. Science 272, 872-877）。この連結反応は次いで膜貫通ｇｐ４１サブユニット内で構造再配列を誘発してウィルスと宿主細胞を融合する（Chan et al., 1997. Core structure of gp41 from the HIV envelope glycoprotein. Cell 89, 263-273）。ｇｐ１６０は広範囲にわたってグリコシル化され、顕著な可変性ループ断片を表示し、数種の立体配座状態で存在し、そしてタンパク分解的に不安定である。結果的に、ＨＩＶに対する抗体応答は菌株特異的な傾向があり、そしてこのようなエピトープに対するワクチンはＨＩＶ感染の予防に実質的に有用ではない。
種を越えてウィルスを中和する天然の抗体は、ＨＩＶ感染更にはその他のウィルス感染において、通常は隠蔽されていて、アクセスが困難であるか、或いは一過性である保存構造成分に対してはめったに誘発されない。驚くべきことではないが、ＨＩＶに対するたった一握りのヒト広範囲中和抗体（ＢＮＡｂ）が最近同定された（Douek et al., 2006. The rational design of AIDS vaccine. Cell 124, 677-681 に概説されている）。最大の
ウィルスクレード及び菌株幅を有するこれらのＢＮＡｂは、モノクローナル抗体２Ｆ５及び４Ｅ１０（ＨＩＶ−１感染個体の不死化Ｂ細胞由来）及びＺ１３ｅｌ（クレードＢ−感染個体由来の骨髄ＲＮＡを用いて親和性−成熟ファージ提示ライブラリー（affinity-matured phage display library）から選択）を包含し、それぞれはｇｐ４１の膜近接外部領域（ＭＰＥＲ）を標的にしている（Nelson et al., An affinity enhanced neutralizing antibody against the MPER of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) gp41 recognizes an epitope between those of 2F5 and 4E10. J. Virol. 81, 4033-4043）。
ＭＰＥＲは、抗体に接近しやすいが、めったに自然感染の間にＢＮＡｂを誘発しない。
本発明は構造的に拘束されたウィルス性ペプチド、特にＨＩＶに基づいたペプチド、及びそれらのペプチドを治療並びに予防薬剤として使用する方法を提供する。
一実施態様では、本発明はＭＰＥＲドメインの３〜２２のアミノ酸を有している構造的に拘束されているペプチドを提供する。ある特定の実施態様では、ＭＰＥＲドメインの３〜２２のアミノ酸はペプチドの一次配列内の連続アミノ酸であってよい。ある特定の実施態様では、アミノ酸は互いに隣接していて、例えば、全長のタンパク質に関するペプチド配列の少なくとも１つの天然状態における、螺旋の同じ面に存在している。例えば、隣接アミノ酸は螺旋におけるアミノ酸の単一スタックドカラム(stacked column)内に、又は構築された螺旋の単一面におけるアミノ酸の隣接スタック内に存在できる。一実施態様では、構造的に拘束されたペプチドは、炭化水素架橋、アミノ酸突然変異、及び非天然アミノ酸の組み込み：よりなる群からの少なくとも１つの修飾を包含している。ある特定の実施態様では、構造的に拘束されたペプチドは２、３、４、５又はそれ以上の修飾を包含している。ある特定の実施態様では、拘束されたペプチドは、これに限定されないが、Ｒ３−Ｓ６対合、Ｒ６−Ｓ３対合、Ｒ３−Ｓ５対合、及びＲ５−Ｓ３対合よりなる群から選ばれる対合を包含する多様な炭化水素架橋を含有している。
一実施態様では、ＭＰＥＲドメインの３〜２２のアミノ酸は、少なくとも３つの連続アミノ酸、又は螺旋の単一面上に少なくとも２つのアミノ酸、又は少なくとも２つの相互作用面アミノ酸、又はこれらの同類置換を含有している。螺旋の単一面は１、２、３又は４つのアミノ酸の隣接スタックドカラムを含有していて、このアミノ酸のスタックドカラムは、アミノ酸が逐次連続的に位置ａ−ｇを割り当てられている（例えば、図３を参照されたい）、２回繰り返し当り７個のアミノ酸を有しているアルファ螺旋内の、位置ａ、ｄ、及びｇ；位置ｂ及びｅ；又は位置ｃ及びｆ；並びにアミノ酸が逐次連続的に位置ａ−ｆを割り当てられている、２回繰り返し当り２個のアミノ酸を有している３１０螺旋内の、位置ａ及びｄ；位置ｂ及びｅ；又は位置ｃ及びｆ：又はこれらの相同体によって定義付けられる。
本発明は、本発明で用いるためのＭＰＥＲアミノ酸配列を提供する。本発明の構造的に拘束されたＭＰＥＲペプチドは、１７及び２０位の間の炭化水素架橋及び任意に３及び７位の間の炭化水素架橋（例えば、配列番号８５、９２、９８−１００、及び１０３）を含有している、配列番号１３７に記載の配列（ＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦＮＩＴＮＷＬＷＹＩＫ）の少なくと２〜２０個のアミノ酸（例えば、配列の１、２、３、４、５、６、７、８、又は９個の追加アミノ酸を含んで）；配列番号１７〜２３に記載の配列のアミノ酸３５−５７；配列番号５０〜５７及び６４〜７０に記載の配列のアミノ酸１９−３６；配列番号２４〜２５、配列番号４１〜４３、配列番号７５〜１２８、及び配列番号１３５〜１４０に記載の配列よりなる群から選ばれるアミノ酸配列の、少なくとも３個の連続アミノ酸、又は螺旋の単一面上の少なくとも２個のアミノ酸、又は少なくとも２つの相互作用面アミノ酸、又はそれらの相同体を包含する。本発明の構造的に拘束されたペプチドは、ＭＰＥＲ配列単独、又は別のアミノ酸配列がＣ末端又はＮ末端、或いはその両方の側面に位置しているＭＰＥＲ配列を包含できる。本発明で提供されるペプチドは、ペプチドを構造的に拘束する修飾に加えて、非アミノ酸修飾を更に包含できる。例えば、ペプチドは、インビボでのペプチドの標的のための、或いはペプチドの薬物動態及び／又は薬力学特性を変えるための官能基を包含することができる。このような修飾は当該技術分野において公知である。
アミノ酸のスタックドカラムを構成するアミノ酸の位置は、ＨＩＶ ｇｐ−１６０であ
る、配列番号１に示される配列上の位置に対応している位置によって定義付けられる。構造的に拘束されたペプチドの配列は配列番号１に記載の配列と、特にＨＩＶ ＭＰＥＲド
メインの配列について、合致させることができる。配列アラインメントを実施する方法は当業者に周知である。更に、螺旋内の対応するアミノ酸は、公的に入手可能な多くのコイル検出プログラムを用いて決定できる。配列番号１でもたらされる配列を参照すると、アミノ酸のスタックドカラムは、例えば、次のアミノ酸グループを包含している：Ｇｌｕ−６６２、Ｌｙｓ−６６５、Ｔｒｐ−６６６、Ｌｅｕ６６９、及びＴｒｐ６７２；Ｌｅｕ−６６３、Ｔｒｐ−６６６、Ａｌａ−６６７、及びＴｒｐ−６７０；Ａｓｐ−６６４、Ａｌａ−６６７、Ｓｅｒ−６６８、及びＡｓｎ−６７１；Ｌｙｓ−６６５、Ｓｅｒ−６６８、Ｌｅｕ−６６９、及びＴｒｐ−６７２；Ｔｒｐ−６６６、Ｌｅｕ−６６９、及びＴｒｐ−６７０；Ａｌａ−６６７、Ｔｒｐ−６７０、及びＡｓｎ−６７１；Ｓｅｒ−６６８、Ａｓｎ−６７１、及びＴｒｐ−６７２１；Ｉｌｅ−６７５、Ｔｒｐ−６７８、及びＴｙｒ−６８１；Ａｓｎ−６７６、Ｌｅｕ−６７９、及びＩｌｅ−６８２；Ｔｈｒ−６７７、Ｔｒｐ−６８０、及びＬｙｓ−６８３；Ｉｌｅ−６７５、Ｔｒｐ−６７８、Ｔｒｐ−６７９、及びＩｌｅ−６８２；Ｔｈｒ−６７６、Ｌｅｕ−６７９、Ｔｒｐ−６８０、及びＬｙｓ−６８３；Ａｓｎ−６７７、Ｔｒｐ−６８０、Ｔｙｒ−６８１；Ｔｒｐ−６７８、Ｔｙｒ−６８１、Ｉｌｅ−６８２；Ｌｅｕ−６７９、Ｉｌｅ−６８２、及びＬｙｓ−６８３；又はこれらの相同体。
本発明は、配列番号１に記載のペプチド配列由来の、少なくとも３個の相互作用面アミノ酸又は相互作用面アミノ酸の同類置換、又はそれらの相同体を有するペプチドも提供する。ペプチドの相互作用面はペプチドの単一面であって、ここで相互作用面のアミノ酸は、配列番号１に記載のアミノ酸Ｔｒｐ−６７２、Ｐｈｅ−６７３、Ａｓｎ−６７４、Ｉｌｅ−６７５、Ｔｈｒ−６７６、Ｌｅｕ−６７９、及びＷ−６８０に対応する位置から選択される。これらのアミノ酸位置はその他のＨＩＶ配列の変動を包含することが知られている。指示位置のために可能性のあるその他のアミノ酸は、Ａｓｎ／Ａｓｐ／Ｓｅｒ−６７４、及びＴｈｒ／Ｓｅｒ−６７６を包含する。
本発明が提供する構造的に拘束されたペプチドは、ＭＰＥＲに隣接して自然に生じるｇｐ１６０（例えば、配列番号１）由来の他の配列、或いは配列番号１の別の部分に由来する配列、その他のタンパク質、又は合成配列の何れかである、追加のアミノ酸配列を包含できる。追加のアミノ酸配列は構造的に拘束されていてもいなくてもよい。ある特定の実施態様では、ＨＲ２配列に操作可能に結合する構造的に拘束されたＭＰＥＲ配列を提供する。本発明のある特定の実施態様では、ＨＲ−２ペプチドをＭＰＥＲ配列に結合せずに単独で用いることができる。例えば、ＭＰＥＲ配列のＮ末端を、例えば図２Ｃ、７Ｂ、及び９に示したように、ＨＲ−２配列のＣ末端に操作可能に結合することができる。本発明は、ＨＲ−２ペプチドの少なくとも３個の連続アミノ酸、又はＨＲ−２ペプチドの螺旋の単一面上の少なくとも２個のアミノ酸、又はＨＲ−２ペプチドの少なくとも２個の相互作用面アミノ酸、又はこれらの同一置換を有している、ＨＲ−２配列のＭＰＥＲ配列との同時使用を提供する。ＨＲ−２ペプチドの螺旋の単一面は、アミノ酸の隣接スタックドカラムを１、２、３、又は４つ（ここでアミノ酸のスタックドカラムはアルファ螺旋内の位置ａ、ｄ、及びｇ；位置ｂ及びｅ；又は位置ｃ及びｆ（ここで位置ａはその螺旋内のアミノ酸であって、このアミノ酸はアルファ螺旋内でｇまでの文字を逐次連続的に割り当てられている）によって定義付けられる）；又はそれらの相同体を包含する。例えば、ペプチドのアルファ螺旋及びアミノ酸のスタックドカラムは、配列番号１０〜２３、配列番号２６〜４０、配列番号４５〜４８、配列番号５８〜６３、配列番号７１〜７４の位置１、４、５、８、１１、１２、１５、１８、１９、２２、２５、２６、２９、３２、及び３３；又は位置２、５、６、９、１２、１３、１６、１９、２０、２３、２６、２７、３０、３３、及び３４；又は位置３、６、７、１０、１３、１４、１７、２０、２１、２４、２７、２８、３１、及び３４；又は位置４、７、８、１１、１４、１５、１８、２１、２２、２５、２８、２９、３２、及び３５；又は位置５、８、９、１２、１５、１６、１９、２２、２３、２６、２９、３０、及び３３；又は位置６、９、１０、１３、１６、１７、２０、２３、２４、２７、３０、３１、及び３４；又は７、１０、１１、１４、１７、１８、２１、２４、２５、２８、３１、３２、及び３５、及び配列番号４９〜５７のアミノ酸１〜２５、配列番号６４〜７０のアミノ酸１〜２５；配列番号７６〜１２８及び１３５〜１４０の配列又はそれらの相同体として定義される。本明細書に提供されているような、アルファ螺旋構造を有するペプチドの単一面はアミノ酸の隣接スタックドカラムを１、２、３、又は４つ包含することができる。
本発明は更に、ＨＲ−２ペプチドの相互作用面アミノ酸を有するペプチドを提供する。
相互作用面は、本発明によって提供される螺旋ペプチド上の１つの面の例である。相互作用面内のアミノ酸は、配列番号１上の位置Ｔｈｒ−６２７、Ｔｒｐ−６２８、Ｔｒｐ−６３１、Ａｓｐ−６３２、Ａｒｇ−６３３、Ｉｌｅ−６３５、Ｔｙｒ−６３８、Ｉｌｅ−６４２、Ｌｅｕ−６４５、Ｉｌｅ−６４６、Ｓｅｒ−６４９、Ｇｌｎ−６５０、Ｇｌｎ−６５２、Ｇｌｎ−６５３、Ｇｌｕ−６５４、Ｌｙｓ−６５５、Ａｓｎ−６５６、Ｇｌｕ−６５７、Ｇｌｕ−６５９、Ｌｅｕ−６６０、Ｇｌｕ−６６２、及びＬｅｕ−６６３に対応するアミノ酸を包含するか、又は配列番号１上の位置Ｔｒｐ−６２８、Ｔｒｐ−６３１、Ｉｌｅ−６３５、Ｔｙｒ−６３８、Ｉｌｅ−６４２、Ｌｅｕ−６４５、Ｓｅｒ−６４９、Ｇｌｎ−６５２、Ａｓｎ−６５６、Ｇｌｕ−６５９、及びＬｅｕ−６６３に対応するアミノ酸に更に限定されてもよい。
本発明は、ＭＰＥＲペプチド配列と共に又はこれなしで使用するための、ＨＲ−２ペプチドの例を提供する。本発明の構造的に拘束されたペプチドにおいて、本発明で用いることができるＨＲ−２ペプチド配列は、配列番号１０〜２３、配列番号２６〜４０、配列番号４５〜４８、配列番号５８〜６３、配列番号７１〜７４に記載の配列、配列番号４９〜５７のアミノ酸１〜２５、及び配列番号６４〜７０のアミノ酸１〜２５よりなる群から選ばれるアミノ酸配列の、少なくとも３個の連続アミノ酸、少なくとも２個の単一螺旋面上アミノ酸、又は少なくとも２個の相互作用面アミノ酸を含有しているペプチドのカルボキシ−末端に直接或いは間接的に操作可能に結合している、配列番号１７〜２３のアミノ酸３７〜５７；配列番号５０〜５７及び６４〜７０のアミノ酸１９〜３６；配列番号２４〜２５、配列番号４１〜４３、配列番号７５〜１２８、及び配列番号１３５〜１４０に記載の配列によって提供されるような配列の、少なくとも３個の連続アミノ酸、少なくとも２個の単一螺旋面上アミノ酸又は少なくとも２個の相互作用面アミノ酸を有しているアミノ酸配列を包含している。
本発明は、薬学的に許容される担体中の本発明の構造的に拘束されたペプチドの何れかを提供する。本発明は更に、単位剤形の医薬用担体中の本発明のペプチドを提供する。本発明のある特定の実施態様では、薬学的に許容される担体はワクチンアジュバントを包含する。
本発明は、担体タンパク質に機能的に連結している本発明の構造的に拘束されたペプチドを提供する。ある特定の実施態様では、担体タンパク質は構造的に拘束されたペプチドの薬物動態及び／又は薬物動態特性を変えるタンパク質を包含する。ある特定の実施態様では、担体タンパク質はアジュバント特性を有していもよい。ある特定の実施態様では、組成物の構造的に拘束されたペプチドは、部位特異的連結によって確立されるような特定方向に担体タンパク質と機能的に連結している。
本発明は更に、本発明の構造的に拘束されたペプチドの何れかと特異的に結合する抗体を提供する。ある特定の実施態様では、中和抗体、例えば、広範囲中和抗体である。抗体は、これに限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ分子、Ｆａｂタンパク質、一価抗体、二重特異性抗体、及びヒト化抗体を包含する、何れの天然又は非天然抗体型も包含できる。ある特定の実施態様では、本発明の抗体は、２Ｆ５、Ｚ１３ｅ１、及び４Ｅ１０モノクローナル抗体のような公知広範囲中和抗体の対ＣＤＲ（相補性決定領域）を有している抗体を包含しない。しかしながら、本発明の抗体は当然、全てのＣＤＲが同一でない限り、公知広範囲中和抗体由来のＣＤＲを１つ又はそれ以上包含することができる。
本発明は更に、本発明の構造的に拘束されたペプチドに特異的に結合する抗体を作成及び／又は選択する方法を提供する。特異抗原に対する抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。例えば、本発明は、本発明の構造的に拘束されたペプチドを、アジュバントと、又はアジュバントなしで、対象に投与して免疫応答を促進することを包含している、抗体を作成する方法を提供する。当然のことながら、対象内で産生される抗体はポリクローナル抗体である。しかしながら、免役された対象からモノクローナル抗体を製造する方法は当該技術分野において周知である。モノクローナル抗体を製造して、ＣＤＲの配列を確認することができる。このことは、抗体のエピトープ結合部位を、多種の形式に操作することを可能にする。当然のことながら、さらに抗体を、対象の免疫によるよりむしろ、ライブラリースクリーニング方法によって得ることができる。このような方法は当該技術分野において周知である。また、望ましい抗体形態に操作又は挿入するためにライブラリーから選択された抗体からＣＤＲを単離することができる。本発明の方法で作成される抗体は、これに限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ分子、Ｆａｂタンパク質、一価抗体、二重特異性抗体、及びヒト化抗体を包含できる。対象から抗体を単離及び精製する方法は当該技術分野において周知である。抗体は、タンパク質として、又は抗体を発現するＢ細胞として単離することができる。
本発明は、本発明の抗体を含有している薬学的に許容される組成物を提供する。本発明の薬学的に許容される組成物は、単位剤形に包装することができる
本発明は、例えば、本発明の構造的に拘束されたペプチド又は本発明の抗体を対象に治療有効量で投与することによる、対象における、ウィルス感染を予防、改善、又は治療する方法を提供する。方法は更に、対象がウィルス感染の予防、改善又は治療を必要としていると確認すること、又はウィルス感染の予防、改善、又は治療について患者をモニタリングすることの１つ又はそれ以上を包含できる。ある特定の実施態様では、ウィルス感染はＨＩＶ感染を包含する。ある特定の実施態様では、本発明は、方法がウィルス融合又はウィルス感染性の阻害又は抑制のうちの少なくとも１つを包含している、ウィルス感染の予防、改善又は治療の方法を提供する。
本発明は、本発明の構造的に拘束されたペプチド又はそれに特異的に結合する抗体を薬学的に許容される担体中に含有している医薬品の製造方法を提供する。医薬品はウィルス感染、特にＨＩＶ感染の予防及び／又は治療するためであってよい。
ある特定の実施態様では、本発明は、本発明の構造的に拘束されたペプチド又は本発明の抗体の少なくとも１つ、及び使用説明書を含有しているキットを提供する。
本発明のその他の実施態様は、以下に提供されている開示に基づいて理解されるだろう。
図１Ａ〜Ｆは、以下のＨＲ２及びＭＰＥＲ（配列番号１のアミノ酸６２６〜６８３）ドメインのアミノ酸配列を有するｇｐ４１グリコタンパク質のドメインの概略図（Ａ）を示す。ＭＰＥＲドメイン配列に下線を引いて；そして指定するアミノ酸のＲ基で示すＨＲ２（配列番号１のアミノ酸６２６〜６６１）（Ｂ）及びＭＰＥＲドメイン（配列番号１のアミノ酸６６２〜６８３）（Ｃ）のリボン図である。（Ｄ）宿主細胞を感染すると、示されたｇｐ４１サブユニットはすぐに消えて部分的に隠される構造配置の連続体を採る。（Ｅ）天然ＭＰＥＲ構造の４Ｅ１０及び２Ｆ５抗体認識について示したように、免疫原への露出及び中和免疫応答を最大化する目的で、中和可能な構造を補強して、その分解を抑えるために炭化水素架橋を適用して、（Ｆ）ＨＲ１及びＨＲ２ドメインの相互作用を妨害して融合を阻害するペプチド又はそれに由来する抗体を提供した。 図２は、異なったＨＩＶ株由来の、（Ａ）ＨＩＶ−１ ｇｐ４１ ＨＲ−１（配列番号３〜９）、（Ｂ）ＨＩＶ−１ ｇｐ４１ ＨＲ−２（配列番号１０〜１６）、及び（Ｃ）ＨＩＶ−１ ｇｐ４１ ＨＲ２−ＭＰＥＲ（配列番号１７〜２３）ドメイン、並びにＨＩＶ−１ＫＲ５０８６ウィルス（配列番号２４）及びＳＡＲＳウィルス（配列番号２５）における相同領域の１つの例のアミノ酸配列を示す。ダッシュ（−）は適切な配置を挿入するためのスペースでアミノ酸を示していない。 図３Ａ〜Ｂは、（Ａ）ＨＩＶ６螺旋バンドル及び螺旋Ｎ３６及びＣ３４の主要な螺旋内相互作用を示す。Ｎ３６の１つと２つのＣ３４の螺旋は明確化のために表示省略している。螺旋輪はａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、命名に基づいた螺旋間の主要接触をさらに説明している。（Ｂ）ＲＳＶ、インフルエンザ、ＳＡＲＳ、及びエボラ由来のＲＨ類縁ドメインによって形成された融合性バンドル。６螺旋融合性バンドルは多数の種にわたって高度に保持されている。 図４Ａ及びＢは、（Ａ）切断型ＳＡＨ−ｇｐ４１化合物（配列番号２６）、（Ｂ）ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６〜６４５）（Ａ）（配列番号２７）の例示的な合成デザインを示す。Ｘ＝Ｓ５アミノ酸、Ｂ＝ノルロイシン。 図５は、ＨＩＶ ｇｐ４１（配列番号２８のアミノ酸６２６〜６６２）及び関連する適切なアミノ酸残基に適用した７個アミノ酸繰り返しドメインモチーフを説明している。ＨＲ１相互作用を保存するのに必要な特定アミノ酸残基を表すＨＩＶ−１ ＨＲ２ドメイン内の配列鋳型の例を（Ｃ、配列番号２９）及び（Ｄ、配列番号３０）に提供する。 図６は、本発明を実行する実施態様を説明するワークフローを示す。 図７Ａ及びＢは、ＨＲ２及びＭＰＥＲドメインを有する、図示的に表されているリボン図（Ａ）、ＢＮＡｂエピトープ、及びドメインのアミノ酸配列に基づいて、ｇｐ４１ＨＲ２及びＭＰＥＲ領域（配列番号１のアミノ酸６２６〜６８３）の構造的に拘束されたペプチドの例示的なデザインを示す。（Ｂ）に示されているように、ペプチド断片ａ〜ｊ（それぞれ、配列番号３１〜４０）を含有しているＨＲ２架橋は何れも、３つの架橋されたＭＰＥＲペプチド断片（配列番号４１〜４３）の何れかと結合することができる。＊は炭化水素架橋の位置を示す。ＳＡＳ−ｇｐ４１ペプチドは、例えば、４Ｅ１０エピトープのＣ末端螺旋部分を安定化するためにデザインされた３種の核架橋強化（Ａ：ｉ、ｉ＋３；、Ｂ：ｉ、ｉ＋４；、Ｃ：ｉ、ｉ＋７）のうちの１つから、構築される。ＭＰＥＲのＮ末端部分を架橋せずに（２Ｆ５エピトープが延長した構造を採ることができる）或いは位置１（ｉ、ｉ＋４）、２（ｉ、ｉ＋４）又は３（ｉ、ｉ＋７）内に１つ又はそれ以上の架橋を行って、４Ｅ１０エピトープのＮ末端螺旋部分を安定化する。ねじれ（kink）を強化するために、周辺のＦ６７３、Ｎ６７１Ｐ、又はＤ６７４Ｐ突然変異を行って天然の又は非天然のアミノ酸を組み込む。位置Ｆ６７３の突然変異は、領域内の他の突然変異と連動して又はそれとは独立して、行って、何れかの天然の又は非天然のアミノ酸、例えば、図１１Ａに示されているようなフェニルアラニン類縁体を組み込む。ＨＲ２螺旋を含有して構築物を延長することの影響を検討するために、示した二重架橋ＨＲ２ペプチド（ａ〜ｊ）のような、一重又は多重架橋したＨＲ２ドメインを付加する。ＨＲ２−ＭＰＥＲ構築物については、随意的なＱ５６８Ｐ突然変異を、ＭＰＥＲの直前でＨＲ２螺旋を終結するようにデザインした。示した構築物の小区分を含有しているＨＲ２−ＭＰＥＲの欠失構築物も想定される（例えば、ＭＰＥＲと組み合わせてＨＲ２のＣ末端部分）。 図８Ａ〜Ｄは、位置（Ａ）２つのＳ５アミノ酸を用いる螺旋の１回転を隔てたｉ、及びｉ＋４；（Ｂ）１個のＳ８及び１個のＲ５アミノ酸、又は１個のＲ８及び１個のＳ５アミノ酸を用いる螺旋の２回転を隔てたｉ、及びｉ＋７；（Ｃ）２個のｉ、ｉ＋４、２個のｉ、ｉ＋７、又は１個のｉ、ｉ＋４及び１個のｉ、ｉ＋７架橋を使用する二重架橋；及び（Ｄ）ｉ、ｉ＋４、ｉ、ｉ＋７、又はその他の架橋（例えば、ｉ、ｉ＋３）の何れかの組み合わせを用いる三重架橋、に形成されるα螺旋を安定化するための螺旋安定化架橋の例示的な組み合わせを示す。 図９Ａ〜Ｂは、ｉ、ｉ＋３架橋ペプチドを容易に産生するために最適化された新規な非天然アミノ酸の架橋を製造するための反応スキームを示す。 図１０Ａ〜Ｃは、（Ａ）ＳＡＨ−ｇｐ４１（配列番号４４〜４５、４９）の配列、一重架橋ペプチド（例えば、Ｎ末端：Ａｃ、ＦＩＴＣ−βＡｌａ、ビオチン−βＡｌａ；Ｃ末端：ＣＯＮＨ２、ＣＯＯＨ）の配列（配列番号４６〜４８及び５０〜５７）、（Ｂ）二重及び三重架橋ＳＡＨｇｐ４１ペプチド（例えば、Ｎ末端：Ａｃ、ＦＩＴＣ−βＡｌａ、ビオチン−βＡｌａ；Ｃ末端：ＣＯＮＨ２、ＣＯＯＨ）を包含する多種架橋ＨＩＶ ＨＲドメインを示す。Ｘ＝Ｓ５アミノ酸、Ｂ＝ノルロイシン（配列番号５８〜７４）。 図１１は、ｇｐ４１のＭＰＥＲ領域（配列番号１のアミノ酸６６２〜６８３）の３つの構造成分、アミノ酸６６２〜６７２由来のα−螺旋、アミノ酸のＲ基を示すアミノ酸６７２〜６７５由来の「ねじれ」、及びアミノ酸６７５〜６８３由来の３１０−螺旋の概略図を示す。３１０−螺旋は、１０原子を含有しているＨ−結合ループを形成している、１回転あたり３．０残基があるα−螺旋の形態である。例えば、「標準」α−螺旋も、この命名法を用いて３．６１３螺旋と呼ばれる。 図１２は、架橋「Ｓ５」アミノ酸を（Ａ、配列番号７５〜８２）（ｉ、ｉ＋４）位、（Ｂ，配列番号８３〜８９）（ｉ、ｉ＋３）位、及び（Ｃ、配列番号９０〜９７）（ｉ、ｉ＋４）及び（ｉ、ｉ＋３）両方の位置に挿入するｇｐ４１のＭＰＥＲドメインのα−及び３１０−螺旋の例示的な架橋位置を示す。図１２Ｄは、Ｒ３及びＳ６架橋非天然アミノ酸を含んでいる（ｉ、ｉ＋３）架橋の使用を含む、異なった長さ及び架橋組成のＳＡＨ−ＭＰＥＲにおける例示的な架橋位置を示す（配列番号９８〜１０５）。 図１３Ａ〜Ｄは、（Ａ）は市販されている構造的に拘束されたフェニルアラニン類縁体の例を示し；（Ｂ）はＰｈｅ類縁体のうちの１つを用いた、ＭＰＥＲねじれ領域の結合配座及びねじれ領域の模擬の拘束された構造を示し；（Ｃ）はＦ６７３が一連のフェニルアラニン類縁体（配列番号１０６〜１２８）で置換されている、配列番号１のアミノ酸６６２〜６８３から成る合成ペプチドを示し；（Ｄ）は４Ｅ１０抗体競合結合ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示し、これは組み込まれた非天然アミノ酸によるねじれを含んでいるＭＰＥＲ構築物が、天然のペプチドに匹敵する、高親和性４Ｅ１０結合を保持していることを示している。 図１４Ａ〜Ｂは、炭化水素架橋されたｇｐ４１ＨＲ２ペプチドが円偏光二色性分光法によって、対応する非修飾ペプチドと比較して、増大したα−螺旋構造を示すことを示している。（Ａ）非架橋ペプチド、エンフビルチド（配列番号４９）及び架橋ペプチド、順に、配列番号５０、５２、６５、及び６４。（Ｂ）非架橋ペプチド、Ｔ６４９ｖ（配列番号４５）及び架橋ペプチド、順に、配列番号４７、７６、５８、及び５９。 図１５Ａ〜Ｅは、ＨＩＶウィルス株を用いる感染性アッセイにおける、エンフビルチド及び本発明の構造的に拘束されたペプチドの活性を示す。（Ａ）ＨＸＢｃ２；非架橋ペプチド、エンフビルチド（配列番号４９）及び架橋ペプチド、順に、配列番号５１、５２、６５、及び６６。（Ｂ）ＡＤＡ；非架橋ペプチド、エンフビルチド（配列番号４９）及び架橋ペプチド、順に、配列番号５０、５２、６５、及び６４。（Ｃ）ＨＸＢｃ２ｐ ３．２；非架橋ペプチド、エンフビルチド（配列番号４９）及び架橋ペプチド、順に、配列番号５０、５２、６５、及び６４。（Ｄ）対照Ａ−ＭＬＶウィルス株；非架橋ペプチド、エンフビルチド（配列番号４９）及び架橋ペプチド、順に、配列番号５０、５２、６５、及び６４。結果を（Ｅ）の表に要約した。 図１６Ａ〜Ｉは、エンフビルチド感受性株ＨＸＢｃ２（Ａ）及びエンフビルチド耐性及び中和耐性株ＹＵ２（Ｂ）をアッセイで用いる、ＨＩＶ−１感染性を阻害する本発明の構造的に拘束されたペプチドの活性を示す。ＨＩＶ−１阻害に対する拘束されたペプチドの特異性を、非ＨＩＶ−１ウィルス対照株Ａ−ＭＬＶの感染性をそれらが阻害できないことによって例示した（Ｃ）。図Ｄ〜Ｇは、二重架橋ペプチドがエンフビルチド結合を阻害する二重変異ＨＲ１ドメインと結合でき（Ｃ〜Ｅ）、そしてエンフビルチド耐性二重変異ＨＸＢｃ２ウィルス株に打ち勝ってＨＩＶ−１感染性を阻害する（Ｆ、Ｇ）ことを天然ＰＡＧＥ分析で明らかにしている。このような突然変異はＨＩＶ−１に感染しているヒトに起きてエンフビルチド耐性を引き起こす。用いたペプチド、配列番号４９（エンフビルチド）、４５（Ｔ６４９ｖ）、４７（Ａ）、４６（Ｆ）、及び５８（ａ、Ｆ）。図１６Ｈ〜Ｉは、本発明の構造的に拘束されたペプチドが、対照のウィルスＡ−ＭＬＶが対応する架橋ペプチドによる処置で全く影響を受けない時に、ＨＩＶ−１感染性を特異的に阻害することを立証している。 図１７は、（Ａ〜Ｂ）天然のアミノ酸置換、螺旋性促進アラニン残基、及び／又は（ｉ、ｉ＋４）塩架橋を含有している、報告されている一連の次世代ｇｐ４１ＨＲ２ペプチド（配列番号４９、４５、及び１２９〜１３４）（Dwyer et al, PNAS, 2007; He et al JBC, 2008）がキモトリプシンへ暴露すると急速なタンパク質分解を示すこと；（Ｃ）一重架橋ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６〜６６２）ペプチド（配列番号４５、４７、４６、及び５８）が非修飾ペプチドと比較して６〜８倍長い半減期を示して、二重架橋は２４倍増大したキモトリプシン耐性をもたらしたこと；（Ｄ）一重架橋ＳＡＨ−ｇｐ４１（６３８〜６７３）誘導体（配列番号４９、５０、５２、及び６５）は、ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６〜６６２）ペプチドと同様に、テンプレートペプチドと比較して増大したキモトリプシン耐性を有していて、二重架橋ペプチドは明らかにタンパク分解に対してより耐性であったこと；（Ｅ）ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６〜６６２）（Ａ、Ｆ）（配列番号５８）及びＴ６４９ｖ（配列番号４５）を１０ｍｇ／ｋｇでマウスに静脈内投与して無傷のペプチドの血漿濃度を示した時点で測定する薬物動態分析が、Ｔ６４９ｖと比較してＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６〜６６２）（Ａ，Ｆ）の顕著なインビボ安定性を明らかにしたこと；（Ｆ）ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６〜６６２）（Ａ，Ｆ）がｐＨ７よりｐＨ２で、両条件でＴ６４９ｖを越えて、より大きなα−螺旋性を示したことを円偏光二色性分析が明らかにしたこと；（Ｇ）ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６〜６６２）（Ａ，Ｆ）及びＴ６４９ｖをｐＨ２でペプシンに暴露して明らかにされた、ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６〜６６２）（Ａ，Ｆ）の著しい酸プロテアーゼ耐性；（Ｈ）ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６〜６６２）（Ａ，Ｆ）を経口投与して経口吸収に変換したＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６〜６６２）（Ａ，Ｆ）の酸プロテアーゼ耐性が、測定可能で用量応答性の血漿濃度をもたらしたが、Ｔ６４９ｖは検出不可能であったことを示す。血漿濃度、平均値＋標準誤差；ＮＤ、検出不能。 図１８は、（Ａ）担体タンパク質のような、担体と比べて、免疫付与して異なった抗原提示方向をもたらす構造的に拘束されたｇｐ４１ペプチドについての例示的な代替的結合部位、及び（Ｂ〜Ｄ）免疫学的応答を最大化するために脂質認識モチーフをＳＡＨ−ＭＰＥＲペプチドに導入する３つの例示的なアプローチ（S. M. Alam et al., Proc Natl Acad Sci USA 106, 20234 (2009); J. P. Julien et al., J Virol 84, 4136 (2010); E. M. Scherer, et al, Proc Natl Acad Sci USA 107, 1529 (2010)）を示し、これらは（Ｂ）ＭＰＥＲペプチドのＣ末端へのミリストイル化リジン及びその他のリポペプチド複合体の組み込み（D. S. Watson, F. C. Szoka, Vaccine 27, 4672 (2009); H. Y. Xu et al., J Virol 84, 1076 (2010)）、（Ｃ）炭化水素架橋自体を疎水性且つ脂質部分として拡張［例えば、（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）アラニン及び（Ｒ）−２−（４’−オクテニル）アラニンを用いて、１１−炭素鎖（ｉ，ｉ＋７）を挿入及び誘導体化する］、及び（Ｄ）脂質−ＮＴＡ−Ｎｉ含有リポソームに結合するために、ＳＡＨ−ＭＰＥＲ構築物のＣ末端にヘキサ−ヒスチジンモチーフを組み込んでＭＰＥＲで被覆したリポソーム１５の作出（K. J. Oh et al., J Biol Chem 281, 36999 (2006); L. D. Walensky et al., Mol Cell 24, 199 (2006)）を包含している。 図１９は、（ｉ、ｉ＋３）、（ｉ、ｉ＋４）及び二重（ｉ、ｉ＋３）、（ｉ、ｉ＋４）架橋を有する「Ｓ５」−架橋ＳＡＨ−ＭＰＥＲペプチドを用いる、４Ｅ１０抗体競合結合ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。 図１９は、免疫原性試験の結果を示す。ＳＡＨ−ＨＲ２（Ａ、Ｆ）及びそれに対応する非修飾ペプチドをＫＬＨに結合するために拡大し、次いで（Ａ）に示されているスケジュールに従う時限追加免疫を用いてウサギ免疫付与プロトコルに展開した後、対応する抗原に対して誘導した抗血清のＥＬＩＳＡ分析（Ｂ）及び交差抗原分析（Ｃ）を行った。結果は、ペプチドモチーフを天然の三次元形態に固定する構造化された抗原はより強い抗体応答を生じさせるばかりか、この構造的安定化なしに、得られた抗血清は螺旋性ｇｐ４１ドメインを認識することが実質的に不可能であった。 図２０は、蛍光偏光で測定した、４Ｅ１０抗体のＦＩＴＣ−ＭＰＥＲ野生型ペプチドへの結合を示す；この４Ｅ１０／ＦＩＴＣ−ＭＰＥＲ複合体は、ＳＡＨ−ＭＰＥＲペプチドの競合結合活性を試験するために用いる４Ｅ１０抗体競合結合ＥＬＩＳＡ分析の基準を形成した。 図２１Ａ〜Ｂは、「Ｓ５］置換、一重架橋（ｉ、ｉ＋４）又は（ｉ、ｉ＋３）ペプチド（配列番号１３５、１３６、７８、及び１３７）、及び二重架橋（ｉ、ｉ＋４）、（ｉ、ｉ＋３）、（配列番号７８、７７、８５、９２、９３、及び１３７）の、野生型Ａｃ−ＭＰＥＲペプチドを凌いでいる、４Ｅ１０抗体結合に対する野生型ＦＩＴＣ−ＭＰＥＲペプチドと効果的に競合する能力を示す。 図２２は、Ｒ３−Ｓ５及びＲ３−Ｓ６（ｉ、ｉ＋３）架橋を含んでいる短縮ＳＡＨ−ＭＰＥＲペプチド（配列番号１３７〜１４０）の、４Ｅ１０抗体結合に対する野生型Ａｃ−ＭＰＥＲペプチドより効果的に競合する能力を示す。 図２３Ａ〜Ｂは、（Ａ）ｉ、ｉ＋４架橋を含んでいる典型的な炭化水素架橋ＲＳＶ ＨＲ２ドメインペプチド（配列番号１４１〜１４６）及び（Ｂ）ＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＲＳＶペプチド及び組み替えＲＳＶ５−螺旋バンドルを用いた蛍光偏光結合分析の結果を示す。 図２４は、配列番号１及び配列番号２を示す。
本発明は、構造的に拘束されたウィルス性ペプチドを利用する組成物、キット及び方法を対象としている。組成物はウィルス感染を治療及び／又は予防するために有用である。
組成物は対象の免疫応答を刺激するためのワクチンとして有用である。組成物は単離されて予防及び／又は治療薬剤として用いられる構造的に拘束されたペプチドに対する抗体を作成するためにも用いることができる。抗体は、治療薬剤としてを包含する多くの適用の何れかで使用するために対象又は実験動物から直接単離できる。或いは、モノクローナル抗体を製造するために、対象又は実験動物からＢ細胞を採取し、骨髄腫細胞のような不死細胞と融合することができる。
本発明は、少なくとも一部が、炭化水素架橋された、α−螺旋ウィルス性ペプチドが優れた構造、タンパク質分解、酸、及び熱安定性を有し、ウィルス／細胞融合を妨害する上で極めて有効であることを明らかにして、このペプチドに結合する抗体はウィルス感染、特にＨＩＶ感染及びＡＩＤＳの予防又は治療用の広範囲中和抗体を提供するだろうことを示唆している、本明細書に提供されている結果に基づいている。更に、このペプチドは、それらの非修飾対応体と比較してインビボにおける優れた薬理特性を有していて、天然のペプチド配列と比較して投与に必要な構造的に拘束されたペプチドの頻度及び量を減少し、そして抗原暴露が持続することを保証する。加えて、重要な免疫原性モチーフを指向性合成結合を介して免疫系に適切に方向付けることによって、ペプチドは関連抗体の中和に対する高い力価を引き出す優れた能力を有する。
本明細書で提供される構造的に拘束されたウィルス性ペプチドは、少なくとも１つの７個繰り返しドメイン−２（ＨＲ−２）又は少なくとも１つのＭＰＥＲドメインを包含している。ある特定の実施態様では、ペプチドはＨＲドメイン及びＭＰＥＲドメインの両方、又はそれらの一部を包含している。
本明細書で提供される化合物において、α−螺旋ＨＲ−２ドメインは少なくとも１つの分子鎖、例えば、炭化水素架橋によって安定化されるが、２つ、３つ又はそれ以上の炭化水素架橋を包含してもよい。複数炭化水素架橋の包含は、長さが２０個又はそれ以上のアミノ酸であるα−螺旋ペプチドに特に適している。１つ以上の（例えば、ペプチドの長さに依存して２、３、４、５）炭化水素架橋は、修飾ポリペプチドの非常に優れた構造、酸及び熱安定性をもたらし、インビボにおける顕著に増強された薬理特性を有する生物活性ペプチドを生じる。
本明細書で提供される化合物において、ＭＰＥＲドメインは天然の配列の１つ又はそれ以上の修飾によって構造的に拘束されている。ＭＰＥＲドメインのα−螺旋及び／又は３１０螺旋は、炭化水素架橋のような分子鎖を用いて、ＨＲ−２ドメインと同様に安定化できる。ＭＰＥＲドメインの２つの螺旋の間のねじれは、これに限定されないが、炭化水素架橋又は２つの螺旋の間の好ましい角度を促進或いは保持する若しくは螺旋を互いに関連して方向付けるその他の分子鎖を包含する、多くの化学修飾の何れかによって安定化できる。あるいは、またさらに、ねじれ領域内又はそれに隣接してアミノ酸置換をおこなって、天然又は非天然アミノ酸を含めて、ねじれの望ましい構造を促進し、２つの螺旋間の望ましい角度を促進或いは保持し又は螺旋を互いに関連して方向付けることができる。一実施態様では、ＭＰＥＲの少なくとも１つの螺旋は、炭化水素架橋のような分子鎖を含有してドメインの螺旋特性を促進又は維持する。別の実施態様では、ＭＰＥＲの両方の螺旋は、炭化水素架橋のような分子鎖を含有してドメインの螺旋特性を促進又は維持する。一実施態様では、ＭＰＥＲの両方の螺旋は、炭化水素架橋、及び拘束されたフェニルアラニン類縁体、のような分子鎖を含有してドメインの螺旋特性を促進又は維持して、螺旋間のねじれを補強する。
ｇｐ４１ＨＲ−２由来ペプチドである、Ｔ２０及びＴ６４９Ｖを、それぞれ、残基６３８〜６７３及び残基６２６〜６６２の配列に基づいて、製造して生理的ｐＨで円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルで確認した。天然のペプチドは、溶液中のα−螺旋を反映する２２２ｎｍ及び２０８ｎｍの特徴的な最小値を欠いていて、むしろ、これらは圧倒的にランダムコイルとして存在していることを示唆している。実際に、計算したα−螺旋含量（Forood, B., E.J. Feliciano, and K.P. Nambiar, PNAS, 1993. 90(3): p. 838-84; J. Martin Scholts, Biopolymers, 1991. 31(13): p. 1643-1470; Lawless, M.K., et al., Biochemistry, 1996. 35(42): p. 13697-13708）はＴ２０で〜２５％そしてＴ６４９ｖで１４
％のみであった。従って、合成ｇｐ４１−由来ＨＲ−２ペプチドは溶液中で圧倒的に無秩序であり、生物活性構造の有意な欠失を反映している。
ＨＩＶのＨＲ−２領域に隣接している、ＭＰＥＲ領域は、ＨＩＶ感染を予防及び／又は抑制するのに有効な公知広範囲中和抗体の少なくとも３つ、２Ｆ５、Ｚ１３ｅｌ、及び４Ｅ１０抗体に結合するエピトープであることが明らかにされている。（エピトープ結合部位に関する図７を参照されたい。）しかしながら、対象を免役するためにこの領域由来のペプチドを用いて中和抗体を作成する多くの試みが成功していない（例えば、Penn-Nicholson et al., 2008. Assessment of antibody responses against gp41 in HIV-1-infected patients using soluble gp41 fusion proteins and peptides derived from M group consensus envelope. Virology. 2008 March 15; 372: 442-456; Zwick et al., 2005. Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antibodies 2F5 and 4E10 Require Surprisingly Few Crucial Residues in the Membrane-Proximal External Region of Glycoprotein gp41 To Neutralize HIV-1. J. Virol., 79:1252-1261、及びこれらで引用
している引例を参照されたい。これらの全ては参照により本明細書に取り込まれている）。ｇｐ４１及び／又はｇｐ１２０タンパク質の全長をＢＮＡｂｓの作成に用いる試みは同様に不成功である。用いた抗原に結合する抗体を同定しても、この抗体は広範囲中和機能を有していない。
本明細書で、そして参照により本明細書に取り込まれている、同一発明者による関連ＰＣＴ出願国際公開第ＰＣＴ／ＵＳ２００９−０００７４３８号で明らかにされているように、ＨＲ−２ドメインの配列及びＨＲ−２とＭＰＥＲドメインを横断する配列に基づき構造的に拘束されたペプチドが、実質的に高いα−螺旋性、５螺旋バンドル結合、抗ウィルス活性、タンパク質分解及び熱安定性、並びに比較の構造的に拘束されていないペプチド、エンフビルチド、ＡＩＤＳ治療用の最終手段として承認された薬剤（配列番号１のアミノ酸６３８〜６７３）より望ましい薬物動態及び生体内分布特性を明らかにしている。エンフビルチドは、耐性の発現、商品原価、頻回及び高用量の皮下投与を必要とする低いインビボ安定性、経口バイオベラビリティーの欠如、及び他の種類の経口利用できる薬剤の突出を包含する多くの理由により最終手段の治療法である。しかし、重要なことは、エンフビルチドは感染予防に独特な効果を提供するのに対して、他の種類の抗ＨＩＶ薬剤は感染後のウィルス抑制剤である。本明細書及び関連出願で明らかにしたように、構造的に拘束されたペプチドは、インビトロアッセイにおいて非構造化エンフビルチドより感染阻害により有効である。更に、構造化ペプチドはエンフビルチド耐性ＨＩＶ株を用いる感染性アッセイにおいてエンフビルチドに対する耐性に打ち勝ち、インビボにおいてエンフビルチドより少なくとも１０倍安定であり、そして経口バイオアベイラビリティーを示した。
これらのデータは、本発明の構造化ペプチドが非構造化ペプチドより、より効果的なウィルススパイクの模倣構造であることを明らかにしている。従って、本明細書で提供される構造的に拘束されたペプチドは、免疫応答誘発時、好ましくは広範囲中和抗体免疫応答時に、ウィルス抗原に対して効果的である。
(定義)
本明細書で用いられる、ワクチン組成物中の本発明の構造的に拘束されたペプチドと共に用いるための「アジュバント」は、抗原又は免疫原、或いは担体に結合している抗原又は免疫原と混合したときに、抗体応答を増大するために注入された物質を蓄積又は隔絶することを助ける物質と理解される。アジュバントは、フロインド（Freund's）完全及び不完全アジュバント、ＣｐＧ−ＯＤＮ、Ｉｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍ、Ｒｉｂｉアジュバント、
及び当該技術分野で公知のその他のものを包含する。
本明細書では、「薬剤」は、治療活性化合物又は潜在的に治療活性な化合物を包含するよう理解される。薬剤は既に公知の又は未知の化合物であってよい。本明細書で用いられる薬剤は一般に細胞に基づいていない化合物であるが、薬剤は生物学的治療薬、例えば、ペプチド又は核酸治療薬、サイトカイン、抗体等を包含することができる。
本明細書で用いられる「ＡＩＤＳ」又は「後天性免疫不全症候群」は、これに限定されないが、日和見感染（例えば、クリプトストリジウム症、微胞子虫症、非定型抗酸菌複合体（ＭＡＣ）及びウィルス、アストロウィルス、アデノウィルス、ロタウィルス及びサイトメガロウィルス）、ニューモシスチス肺炎、カポシ肉腫、バーキットリンパ腫のような高悪性度Ｂ細胞リンパ腫を包含するＡＩＤＳ関連疾患の少なくとも１つを併発しているＨＩＶ感染；或いはＡＩＤＳ又はＡＩＤＳ進行の臨床的に受け入れられているその他の指標の何れかで特徴付けられている疾患であると理解される。ＡＩＤＳに関連する日和見感染は一般に、Ｔ細胞ＣＤ４数が２００／ｍＬ以下に落ちたときに発症する。ＡＩＤＳの診断法、例えば、ＨＩＶ抗体、抗原、及びＰＣＲ試験、並びにＣＤ４数などは当業者に公知である。
本明細書で用いられる「改善」又は「治療」は、特定の病気又は疾患の兆候、症状、兆し、又は影響の低下又は減少を意味すると理解される。例えば、ＨＩＶ感染の改善又は治療は、ウィルス量を減少する、ＣＤ４＋細胞数を増加する、日和見感染（例えば、クリプトストリジウム症、微胞子虫症、非定型抗酸菌複合体（ＭＡＣ）及びウィルス、アストロウィルス、アデノウィルス、ロタウィルス及びサイトメガロウィルス）、ニューモシスチス肺炎、カポシ肉腫、バーキットリンパ腫のような高悪性度Ｂ細胞リンパ腫を包含するＡＩＤＳ関連疾患；病状又は進行の臨床的に受け入れられているその他の指標の何れかの１つ又はそれ以上の発症を遅延又は取り除くことができる。改善及び治療は薬剤の一用量以上の、単独の又は他の治療剤又は医療介入と併用した、投与を必要とする。改善又は治療は、病気又は疾患が治ることを必要としていない。
用語「アミノ酸」は、アミノ基及びカルボキシル基を含有している分子を示す。適切なアミノ酸は、これに限定されないが、有機合成又はその他の代謝経路で製造されて、特定の用途、例えば、化学的多様性、機能性、結合能力、構造模倣、及び安定性を増大するなど、に適用できる（例えば、図１１）、ペプチド中に見られる２０の通常の天然アミノ酸（例えば、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖ（１文字略号として知られている）のＤ及びＬ異性体の両方、更にβアミノ酸を包含する天然又は非天然のアミノ酸を包含する。
用語「アミノ酸側鎖」又は「アミノ酸Ｒ基」は、アミノ酸のα炭素に付加している部分を示す。例えば、アラニンのアミノ酸側鎖又はＲ基はメチルであり、フェニルアラニンのアミノ酸側鎖はフェニルメチルであり、システインのアミノ酸側鎖はチオメチルであり、アスパラギン酸のアミノ酸側鎖はカルボキシルメチルであり、チロシンのアミノ酸側鎖は４−ヒドロキシフェニルメチルである、などである。その他の非天然アミノ酸側鎖、例えば、天然のもの（例えばアミノ酸代謝物）又は合成で作られたもの（例えば、α−ジ置換アミノ酸、βアミノ酸）も包含する。
本明細書で用いられる「抗体」は、天然又は非天然の抗体、例えば、Ｆａｂ分子、Ｆａｂタンパク質、単鎖ポリペプチド、又は抗原に対して結合親和性を有している多機能抗体のようなものの、何れかの反応性断片又は複数の断片を包含する。この用語は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＥを含有する全ての型の抗体を包含する。この用語は、キメラ抗体、改変抗体、一価抗体、二重特異性抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、及びヒト化抗体を包含する。抗体の製造方法は当該技術分野で公知である。
本明細書で用いられる「広範囲中和抗体」又は「ＢＮＡｂ」は、有効用量が送達されると、７つ以上のＨＩＶ株に対する、好ましくは８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上のＨＩＶの株に対する、ＨＩＶ感染又はＡＩＤＳの予防又は治療用の治療薬剤として使用できる、何れかの方法で得られる抗体であると理解される。本発明は更に、有効用量が送達されるとＨＩＶ感染又はＡＩＤＳの予防又は治療用治療薬剤として使用できる「中和抗体」を提供する。中和抗体は、少なくとも１つの、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のＨＩＶ株に対する有効な予防又は治療薬剤である。用語「中和抗体」はＢＮＡｂのサブクラスを包含する。既に同定されているＨＩＶに対するＢＮＡｂは、これに限定されないが、２Ｆ５、Ｚ１３ｅｌ、及び４Ｅ１０（NIH AIDS Research and Reference Reagent Program Catalogue: HIV-1 gp41 Monoclonal Antibody (4E10) Catalog Number 10091 HIV-1 gp41 MAb (IgG1 Z13e1) Catalog Number 11557 HIV-1 gp41 Monoclonal Antibody (2F5) Catalog Number 1475）を包含する。一実施態様では、ＢＮＡｂは、本発明の構造的に拘束されたペプチ
ドを用いて産生又は選択される。好ましい実施態様では、ＢＮＡｂは、本発明の構造的に拘束されたペプチドを用いて産生又は選択され、そして抗体は２Ｆ５、Ｚ１３ｅｌ、及び４Ｅ１０抗体の何れかの対合重鎖及び対合軽鎖を包含していない。一実施態様では、ＢＮＡｂは、本発明の構造的に拘束されたペプチドを用いて産生又は選択され、そして抗体は２Ｆ５、Ｚ１３ｅｌ、及び４Ｅ１０抗体の何れかの対合重鎖及び対合軽鎖由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）を包含していない。
本明細書で用いられる、ワクチン組成物中の本発明の構造的に拘束されたペプチドと用いるための「担体タンパク質」は、構造化ペプチドと結合するとＴ細胞及びＢ細胞から強力な且つ／又は増強した免疫原性応答を誘発するタンパク質又はその他の物質であるとして理解される。担体タンパク質の例は、ブルー・キャリヤー・免疫原性タンパク質（Blue Carrier Immunogenic Protein）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホール・リンペット・へモシアニン（ＫＬＨ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、カチオン化ウシ血清アルブミン（ｃＢＳＡ）、又は当該技術分野で公知のその他の担体複合体を包含する。
本明細書で用いられる「対象と比較して変化した」試料又は対象は、検体のレベル又は検出される診断又は治療上の指標のレベルが、正常、未処置、又は対照試料とは統計的に異なっているレベルを有していると理解される。対照試料は、例えば、培養細胞、１つ又はそれ以上の実験動物、又は１人又はそれ以上のヒト対象を包含する。対照試料を選択して試験する方法は当業者の能力範囲内である。検体は細胞又は有機体（例えば、抗体）によって特徴的に発現又は生産される天然の物質、又はレポーター構築物（例えば、βガラクトシダーゼ又はルシフェラーゼ）によって生産される物質であってよい。検出のために用いた方法によって、変化の量及び測定値は変化する。対照の参照試料と比較した変化は、抗体、拮抗薬、又はその他の阻害剤の存在下での、リガンド、例えば、ウィルスのスパイク、受容体、例えば、ウィルス細胞表面受容体の減少した結合も包含する。統計的有意性の判定は当業者の能力の範囲内である。
本発明のポリペプチドに関連して本明細書で用いられる用語「キメラ」又は「キメラの」は、天然では見られない様式で結合している、少なくとも２つの異なったＨＲドメインを有している、又は単一のＨＲドメイン領域を有している、又はＭＰＥＲドメインを有しているポリペプチドを示す。ＨＲ及びＭＰＥＲドメインの例は図２、７、９、及び１０に示されている。図２ｃはＨＩＶ（及びＳＩＶ）の多種の株に由来するＭＰＥＲを含んでいて、このドメインの保存特性を示している。例えば、キメラポリペプチドはＨＩＶ−１ ｇｐ４１ ＨＲ−２ドメインの第一部分とＳＩＶ ｇｐ４１ ＨＲ−２由来の第二部分を有することができる。これらのキメラポリペプチドは、互いに融合又は結合することができるヌクレオチド配列によってコードされて、天然に生じないコード配列をもたらす。キメラは、野生型ＨＲポリペプチド（ＨＩＶ−１ ｇｐ４１ ＨＲ−２）と実質的に類似していてよく、及び同様な活性（すなわち、野生型ＨＲの活性、例えば、融合、ウィルス感染性の阻害の、最も好ましくは９０％、より好ましくは７０％、好ましくは４０％、又は少なくとも１０％）を持つ、機能的誘導体、断片、変異体、類縁体、又は化学誘導体の何れかを包含する。
本明細書で用いられる「同時投与」は、１つ又はそれ以上の薬剤を、薬剤が対象の体内に同時に存在して活性であるように、対象に投与することであると理解される。同時投与は、その薬剤の混合剤の製造あるいは一緒に投与することを必要としない。
「同類アミノ酸置換」は、アミノ酸残基を類似した側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えることである。例えば、類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を包含する。ペプチドの電荷を修正するためにアスパラギンをアスパラギン酸に置換するときのような、アミノ酸側鎖ファミリーを超えてその他の同類アミノ酸置換が生じてもよい。従って、ＨＲドメインポリペプチド内の予測される非必須アミノ酸を、例えば、同じ側鎖ファミリー又はファミリーを超える類縁体からの他のアミノ酸残基で置き換えること（例えば、アスパラギン酸にアスパラギンを、グルタミン酸にグルタミンを）が好ましい。同類交換は更に、化学的に類似している非天然アミノ酸の置換（すなわち、ロイシンに代えて合成非天然疎水性アミノ酸、トリプトファンに代えて合成非天然芳香族アミノ酸）を包含できる。
「細胞に接触すること」は本明細書では，薬剤又は単離細胞が試験細胞又は処理される細胞と相互作用できるように、試験細胞又は処理される細胞に取り込まれることを可能にするように、そして試験細胞又は処理される細胞に影響を及ぼすように、薬剤を試験細胞に、例えば、培養液中又は動物内で処理される細胞に、供給することと理解される。薬剤又は単離細胞は細胞に、直接（例えば、培養液への薬剤の添加によって、又は目的の細胞又は組織への注入によって）、或いは循環系、リンパ系、又はその他の手段による細胞への送達のための経腸ルート又は非経口ルートで生命体への送達によって、送達することができる。
本明細書で用いられる「検出すること」、「検出」等は、試料中の特定の検体、試料中のレポーター構築物からの産物、或いは試料中の薬剤の活性（例えば、結合阻害、合胞体形成の阻害、感染性阻害）を同定するために実施するアッセイと理解される。検出は、ウィルス量、抗体の存在、抗体の結合特性の確認を包含できる。試料中の検体又は検出された活性の量は、無くても、或いはアッセイ又は方法の検出レベル以下でもよい。
本明細書で用いられる用語「診断すること」は、病気、疾患又は障害の少なくとも１つのサイン又は兆候の存在に基いて、病気、障害又は疾患を有している対象を同定するための観察、試験、又は状況に基づく対象の疾患の臨床的又はその他の判断を示す。一般に、本発明の方法を用いる診断は、病気、障害又は疾患の他のサイン又は兆候についての観察を包含する。
用語「有効量」又は「有効用量」は、意図された薬理学、治療又は予防の結果を生じる薬剤の量を示す。薬理学的有効量は、ウィルス性障害の１つ又はそれ以上のサイン又は兆候の改善をもたらすか、ウィルスによる感染又はウィルス性疾患の進展を予防するか、疾患の退縮をもたらすか、又はウィルス感染を減少する。例えば、治療有効量は、非治療対照の対象と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上、ウィルス感染の速度を減少するか、ウィルス量を減少するか、或いはウィルス感染細胞の数を減少する治療薬剤の量を示すことが好ましい。ＨＩＶに関連すると、治療有効量は、非治療対照の対象と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上、ＣＤ４＋細胞数を増大するか、ＡＩＤＳ進展までの時間を増大するか、或いは生存期間を増大する治療薬剤の量も示す。薬剤の１回以上の投与が有効用量をもたらすために必要であろう。
本明細書で用いられる用語「有効な」及び「有効性」は、薬理学的有効性及び薬理学的安全性の両方を包含する。薬理学的有効性は、患者において所望の生物学的効果をもたらす治療の能力を示す。薬理学的安全性は、治療を施すことによって生じる、細胞、臓器及び／又は生体レベルでの毒性、又はその他の有害な薬理学的影響（副作用と示すことが多い）を示す。一方、用語「無効な」は、少なくとも非成層化集団において、有害効果が存在しなくても、治療的に有用である薬理学的効果を治療が十分にもたらさないことを示す。（このような治療は発現プロファイル(複数も)で同定できるサブグループにおいても無効であろう。）「効果が弱い」は、治療的に有意に低いレベルの薬理学的有効性及び／又は治療的に高いレベルの有害な薬理学的影響、例えばより高い肝臓毒性を治療がもたらすことを意味する。
従って、薬剤の投与と結び付けると、病気又は疾患に「対して有効な」薬剤は、臨床的に適切な方法での投与が、少なくとも統計的に有意な割合の患者に有益な効果、例えば、症状の改善、治癒、病気のサイン又は兆候の減少、寿命の延長、生活の質の改善、或いは特定のタイプの病気又は疾患を治療することを熟知している医師によって陽性であると一般に認識されているその他の効果をもたらすということを示す。
本明細書で用いられる「エピトープ（抗原決定基）」は、抗体が特異的に結合する、抗原の領域、例えば、構造化ペプチドを包含しているペプチド、として理解される。エピトープは連続した、線状のアミノ酸配列、及びアミノ酸が折り畳みペプチド内のそれらの三次元配座で認識されるように折り畳みペプチド内で互いに隣接している非連続アミノ酸、例えば、螺旋の単一面上の一連のアミノ酸、の両方を包含する。
本明細書で用いられる螺旋、例えば、α−螺旋又は３１０螺旋、の「面」は、螺旋が垂直に位置したときに、単一面のアミノ酸が他のものの頂部上にあるように表現されるように（例えば、図３を参照されたい）、タンパク質の螺旋内に「積み重ねられている（stacked)」アミノ酸として理解される。例えば、α−螺旋は１回転あたり約３．６個のアミノ酸を有している。従って、配列ａｂｃｄｅｆｇａ’ｂ’ｃ’ｄ’ｅ’ｆ’ｇ’を有するペプチドがα螺旋を形成するとき、４番目及び５番目のアミノ酸（ｉ＋３及びｉ＋４）、すなわちアミノ酸ｄ及びｅは、第１アミノ酸（位置１＋〜３．６アミノ酸）の上に積み重ねられ、そして８番目のアミノ酸であるアミノ酸ａ’（ｉ＋７）はアミノ酸ａの上に積み重ねられて螺旋のある面を形成して、アミノ酸ａ’から新しい回転が始まるだろう（例えば、図３を参照されたい）。α−螺旋において、第２アミノ酸である、アミノ酸ｂは５番目及び６番目のアミノ酸、すなわち＋３及び＋４位のアミノ酸ｅ及びｆと共に、＋３及び＋４位に積み重ねられて、そして＋７位でアミノ酸ｂ’と共に螺旋の面を形成する。アミノ酸ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、及びｇで始まる螺旋上の面は上記の開示に基づいて容易に確認できる。更に、ある螺旋のある面は「積み重ねられた」残基の２つの隣接する、３つの隣接する、又は４つの隣接する列(カラム)を包含できる。例えば、再び図３Ａを参照すると、積み重ねられた残基の列（例えば、１つの螺旋Ｌ５７６、Ｔ５６９、Ｑ６５２、Ｌ５５５、Ｉ５４８上のＤの次）が１つの螺旋上のＤＡＥ、第２螺旋上のＧＤＡ、及び第３螺旋上の全ての螺旋ＡＤＧＣＦＢＥの互いの螺旋位置に隣接して提供される。図３Ａに描かれている様に面を形成する何れか２つの隣接螺旋は螺旋対、ＡＤ、ＤＧ、ＧＣ、ＣＦ、ＦＢ、ＢＥ、及びＥＡから選択できる。図３Ａに描かれている様に面を形成する何れか３つの隣接螺旋は螺旋群、ＡＤＧ、ＤＧＣ、ＧＣＦ、ＣＦＢ、ＦＢＥ，ＢＥＡ、及びＥＡＤから選択できる。図３Ａに描かれている様に面を形成する何れか４つの隣接螺旋は螺旋群、ＡＤＧＣ、ＤＧＣＦ、ＧＣＦＢ、ＣＦＢＥ、ＦＢＥＡ、ＢＥＡＤ及びＥＡＤＧから選択できる。
螺旋の「面」の例は、螺旋の「相互作用面」を包含する。「相互作用面」アミノ酸残基は、ポリペプチドの野生型配列から変化すると、螺旋バンドル中の１つ又はそれ以上の螺旋と接触して（例えば、図３を参照されたい）、ポリペプチドの機能活性を無効に又は実質的に無効にする。実質的に無効にするとは、ＭＰＥＲ又はＨＲドメインの機能活性を、適切なアッセイ（例えば、４Ｅ１０結合アッセイ、合胞体形成アッセイ、感染性阻害アッセイ等において野生型ペプチドの約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満に減少することとして理解される。ＨＲ及びＨＲ様ドメインの相互作用面アミノ酸残基は、当該技術分野で周知の及び本明細書に記載されている方法によって容易に確認できる。一実施態様では、必須アミノ酸残基は、７個繰り返しドメインの「ａ」又は「ｄ」位に存在するのに対して、非必須アミノ酸は「ｂ」、「ｃ」、「ｅ」、「ｆ」又は「ｇ」位に生じる（図３）。本明細書で用いられる用語「相互作用面」アミノ酸残基は、配列の機能を妨害しない相互作用面アミノ酸の同類置換を包含する。一般に、「相互作用面」アミノ酸残基はα螺旋の相互作用面で見られる。例えば、ＨＩＶｇｐ４１ ＨＲ−２ドメインにおいては、相互作用
面は「ａ」及び「ｄ」位のアミノ酸を包含している（図３を参照されたい）。別の実施態様では、改変ポリペプチドは、Ｌｅｕ−５５６、Ｌｅｕ−５６５、Ｖａｌ−５７０、Ｇｌｙ−５７２、及びＡｒｇ−５７９を有するｇｐ４１ ＨＲ−１ドメインを含有している（Lu, M., et al., J. Vir, 2001. 75(22); p. 11146-11156）。ＭＰＥＲの必須アミノ酸は
例えば、Ｔｒｐ−６７２、Ｐｈｅ−６７３、及びＴｈｒ−６７６を包含する（Dawson et al, J Vir, 2006, 80(4), p1680-7）。当然のことながら、ペプチドによって形成される
相互作用面は免疫原としてのペプチドの活性を必要としていない。
本明細書で用いられる「７個繰り返しドメイン」及び「ＨＲドメイン」は、適切に折り畳むとα−螺旋を形成してウィルス融合機構に関与するポリペプチドを示す。用語「７個繰り返しドメイン」及び「ＨＲドメイン」は、「ＨＲ様」及び「ＨＲ類縁」ドメインを包含する。細胞接着及び融合に関連する多くのウィルス性タンパク質は、ＨＩＶ、パラインフルエンザ、コロナウィルス、その他を包含する、ＨＲ、ＨＲ様及びＨＲ類縁ドメインを含有している（図２を参照されたい）。一般に、ＨＲドメインはＨＩＶのｇｐ４１に由来しているのに対して、ＨＲ類縁ドメインは非ＨＩＶウィルスのエンベロープグリコタンパク質に由来している。多くのＨＲ及びＨＲ類縁ドメインポリペプチドは当該技術分野で公知であって本明細書に記載されている。一実施態様では、ＨＲドメインは、図２Ａ又は２Ｂの何れかに示されている配列（配列番号３〜１６、２６〜４０、４５〜４８、５８〜６３、７１〜７４；又は配列番号１７〜２５、４９〜５７、６４〜７０、又は７５〜８９のＨＲ２部分）と４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％同一であるアミノ酸配列を有していて；ここではペプチドはα螺旋を形成している。一実施態様では、７個繰り返しドメインは、配列番号：配列番号３〜１６、２６〜４０、４５〜４８、５８〜６３、７１〜７４；又は配列番号１７〜２５、４９〜５７、６４〜７０、又は７５〜８９のＨＲ２部分の何れかの少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０の連続アミノ酸と同一のアミノ酸を有するペプチドである。一実施態様では、７個繰り返しドメインは、ＨＲ又はＨＲ様ドメインの螺旋の単一面上の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上のアミノ酸を有するアミノ酸配列を有しているペプチドである。ＨＲドメイン及びＨＲ様ドメインは、非相互作用面より相互作用面上により保存性を有し、相同性は低いが、共通のα螺旋構造を共有していることに注目されたい（特に図２及び３を参照されたい）。
一実施態様では、ＨＲ改変ポリペプチドは式：ａｂｃｄｅｆｇを有する７個繰り返しドメインを包含し、ここでａ及びｄは疎水性のアミノ酸残基であり、ｂ、ｃ、ｅ、ｆ及びｇは何れかのアミノ酸である。好ましくは、この式は並列して２回又はそれ以上繰り返され、位置ａ〜ｇのそれぞれはそれぞれの繰り返しにおいて独立して選択される。
例えば、一実施態様では、改変ポリペプチドの７個繰り返しドメインは式（大文字はアミノ酸を示し、小文字は位置を示す）：Ｗ（ａ）、ｂ、ｃ、Ｗ（ｄ）、ｅ、ｆ、ｇ、Ｉ（ａ）、ｂ、ｃ、Ｙ（ｄ）、ｅ、ｆ、ｇ、Ｉ（ａ）、ｂ、ｃ、Ｌ（ｄ）、ｅ、ｆ、ｇ、Ｓ（ａ）、ｂ、ｃ、Ｑ（ｄ）、ｅ、ｆ、ｇ、Ｎ（ａ）、ｂ、ｃ、Ｅ（ｄ）、ｅ、ｆ、ｇ、Ｌ（ａ）、又はこれらの同類アミノ酸置換を有し、ここでｂ、ｃ、ｅ、ｆ及びｄは何れかのアミノ酸でよい（図５ｃ、配列番号２９を参照されたい）。
更なる実施態様では、改変ポリペプチドの７個繰り返しドメインは式：Ｔ（ｇ）、Ｗ（ａ）、ｂ、ｃ、Ｗ（ｄ）、Ｄ（ｅ）、Ｒ（ｆ）、ｇ、Ｉ（ａ）、ｂ、ｃ、Ｙ（ｄ）、ｅ、ｆ、ｇ、Ｉ（ａ）、ｂ、ｃ、Ｌ（ｄ）、Ｉ（ｅ）、ｆ、ｇ、ａ、Ｑ（ｂ）、ｃ、ｄ、Ｑ（ｅ）、Ｅ（ｆ）、Ｋ（ｇ）、ａ、Ｅ（ｂ）、ｃ、ｄ、Ｌ（ｅ）、ｆ、Ｅ（ｇ）、Ｌ（ａ）、又はこれらの同類アミノ酸置換を有し、ここで指定されていないアミノ酸は何れかのアミノ酸でよい（図５Ｄ、配列番号３０を参照されたい）。
ＨＲ領域は複数の７アミノ酸残基ストレッチ又は「ヘプタ−ド」（各ヘプタ−ド中の７個のアミノ酸は「ａ」から「ｇ」で示される）を含んでいることが知られていて、「ａ」位及び「ｄ」位のアミノ酸は一般に疎水性である。一般に、ＨＲ領域は、イソロイシン又はロイシンから始まって終わる８アミノ酸配列を含有する、１つ又はそれ以上のロイシン・ジッパー様のモチーフ（「ロイシン・ジッパー様繰り返し」とも言われる）を包含するだろう。ヘプタード及びロイシン・ジッパー様モチーフは、ｇｐ４１のコイルドコイル構造の及びＨＲ領域由来ペプチドのコイルドコイル構造の形成に寄与する。一般に、コイルドコイルは、第１位（「ａ」）及び第４位（「ｄ」）に優先的に疎水性残基を有するアミノ酸の７個繰り返し、高い頻度で第５位（「ｅ」）及び第７位（「ｇ」）にある荷電残基、並びに「ａ」位及び「ｄ」位にあるアミノ酸がオリゴマー状態及び螺旋方向に影響を与える第１の決定因子であるというコイルドコイルの特徴を有する、オリゴマー形成において互いの周りに包み込まれている２つ又はそれ以上の螺旋からなることが知られている（例えば、Akey et al., 2001, Biochemistry, 40:6352-60 を参照されたい）。
「ａ」位及び「ｄ」位を含む様々な位置の様々なアミノ酸を置換することによる、モデルのコイルドコイルの安定性及びオリゴマー化状態に対する影響は既に報告されていて、三量体構造の形成は「ｄ」位の置換に特に依存している（例えば、 Tripet et al., J. Mol. Biol. 300:377-402 (2000); Wagschal et al., J. Mol. Biol. 285:785-803 (2000); and Dwyer et al., PNAS USA. 104;12772-12777 (2007) を参照されたい）。
免疫原性であり（過度の実験を行わずに当該技術分野で標準的な方法を用いて確認できるような）、そして領域の全て又は画分を含有しているＨＩＶｇｐ４１のＨＲ１ドメイン又はＨＲ２ドメイン又はＭＰＥＲドメイン、或いはこれらの何れかの組み合わせの天然配列由来の何れかのペプチドを、天然配列として用いることができて、その中に１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、好ましくは同類置換をドメイン中に導入してよく、本発明で提供される合成ペプチドを生産できるということは当業者に明らかであろう。説明の目的で、天然配列由来で、それから合成ペプチドを生産できる、そのようなペプチドは、これに限定されないが、図２、７、９、及び１０に示され、配列番号３〜８９に提供されているようなものを包含する。
幾つかのＨＲ及びＭＰＥＲドメインは置換されにくい一方、他のものは変化を受けやすいということは当業者に明らかである。例えば、７個繰り返しの位置ａ及びｄのアミノ酸は突然変異させないか又は同類変異のみ行うことが好ましい（図３及び５を参照されたい）。一実施態様では、７個繰り返しドメインは式、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇを有し、ここでａ及びｄは疎水性アミノ酸である。更なる実施態様では、７個繰り返しドメインは式、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇの２回又はそれ以上の繰り返しを有している。例えば、一実施態様では、ＨＲドメインは図３に示されているアミノ酸配列又はその同類置換を有しているだろう。従って、ＨＲ及びＨＲ様ドメインはアミノ酸配列の有意な変動性を有するが、α螺旋構造及び免疫原性、特に中和抗体、好ましくはＢＮＡｂを産生する免疫原性を保持するだろう。
ＨＲ、ＨＲ様、ＨＲ類縁、及びＭＰＥＲ、ＭＰＥＲ様、並びにＭＰＥＲ類縁ドメインは、当業者により、配列に基づく相同性、構造相同性及び／又は機能相同性によって容易に同定できる。このような方法は当該技術分野において周知であって、対合残基相関に基づくバイオインフォマティクスプログラム（例えば、ch.embnet.org/software/COILS_form.html）を包含し、これはタンパク質配列由来のコイルドコイルを認識して、及びそれらの構造をモデル化することができる（Lupas, A., et al. Science 1991. 252(5009); p. 1162-1164 を参照されたい）。ＨＲ、ＨＲ様及びＨＲ類縁ドメインを同定するための更なる方法は米国特許第６，８２４，７８３号明細書、同第７，２７３，６１４号明細書、同第５，４６４，９３３号明細書及び同第７，１２２，１９０号明細書に記載されており、これら全ては参照によりその全てが本明細書に取り込まれている。
一実施態様では、本発明の改変ポリペプチドは、配列番号２〜２２に記載の、又は図１〜３に示されているようなアミノ酸配列と相互作用面で７０％又はそれ以上類似している。ＭＰＥＲの相互作用面は膜相互作用面（例えば、宿主又はウィルス）であってよい。α螺旋の「相互作用面」は、別のタンパク質上及び／又は別の螺旋内の別のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基のようなものを包含する。例えば、ＨＩＶｇｐ４１ ＨＲ−２
ドメインでは、相互作用面は「ａ」及び「ｄ」位のアミノ酸を包含し（図３）、一方、ＨＩＶｇｐ４１ ＨＲ１ドメインは、例えば、ＨＲ−２と相互作用する位置の及びＨＲ１−
ＨＲ１相互作用に関わるａ及びｄ位のアミノ酸を包含する（図３を参照されたい）。７個繰り返し及び相互作用面残基を同定する方法は当該技術分野で周知であって本明細書に記載されている。
「ＨＩＶのＨＲ−１ドメイン」又は「ＨＩＶの７個繰り返し１ドメイン」は適切に折り畳まれたときにα螺旋を形成するＨＩＶのｇｐ４１タンパク質のＮ末端部分（ＨＩＶエンベロープの膜貫通サブユニット）である。ＨＩＶｇｐ４１のＨＲ−１ドメインは５〜５５個のアミノ酸残基、又はその間の何れかの数のアミノ酸を包含でき、そしてＨＩＶｇｐ４１の天然ＨＲ−１ドメインの配列、又はその組み合わせ或いはキメラに基づいている。ＨＩＶのＨＲ−１ドメインは、ＨＩＶ−１Ｅｎｖのアミノ酸残基５４６〜５８１を含むＮ３６ドメインを包含することができる（例えば、Bewley et al., J. Biol. Chem. 277:14238-14245 (2002) を参照されたい）。ＨＲ−１ドメインポリペプチドは当該技術分野で公
知であって本明細書に記載されている。一実施態様では、ＨＲ−１ドメインは配列番号３〜９に記載の配列と３０％又はそれ以上同一のアミノ酸配列を有している。
「ＨＩＶのＨＲ−２ドメイン」又はＨＩＶの７個繰り返し２ドメインは、ＨＩＶのｇｐ４１タンパク質のＣ末端部分内に位置して（図１Ａ）、適切に折り畳むとα螺旋を形成する。ＨＩＶのＨＲ−２ドメインは、ＨＩＶ−１Ｅｎｖのアミノ酸残基６２８〜６６１を含むＣ３４ドメインを包含することができる（図２を参照されたい）。ＨＲ−２ドメインポリペプチドは当該技術分野で公知であって本明細書に記載されている。一実施態様では、ＨＲ−２ドメインは、配列番号１０、２６〜４０、４５〜４８、５８〜６３、及び７１〜７４に記載の配列、並びに配列番号１７〜２４、４９〜５７、６４〜７０、及び７５〜８９のＨＲ−２部分と４０％又はそれ以上同一のアミノ酸配列を有している。
本明細書で用いられる「ＨＩＶ」は、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２並びにＳＩＶを包含するように意図されている。「ＨＩＶ−１」は、ヒト免疫不全ウィルス・タイプ−１を意味する。ＨＩＶ−１は、これに限定されないが、細胞外ウィルス粒子及びＨＩＶ−１感染細胞に関連するＨＩＶ−１の形態を包含する。「ＨＩＶ−２」は、ヒト免疫不全ウィルス・タイプ−２を意味する。ＨＩＶ−２は、これに限定されないが、細胞外ウィルス粒子及びＨＩＶ−２感染細胞に関連するＨＩＶ−２の形態を包含する。用語「ＳＩＶ」は、サル、チンパンジー、及びその他の非ヒト霊長類に感染するＨＩＶ様ウィルスである、サル免疫不全ウィルスを示す。ＳＩＶは、これに限定されないが、細胞外ウィルス粒子及びＳＩＶ感染細胞に関連するＳＩＶの形態を包含する。
本明細書で用いられる、臨床的な「ＨＩＶ感染」は、当業者に公知のＨＩＶ試験（例えば、ＨＩＶ ＥＩＡ、ウェスタンブロット、ＰＣＲテスト）を用いるウィルスの存在の検
出によって明らかにされるように、ヒト対象中にＨＩＶ抗体、ＨＩＶ抗原、及び／又はＨＩＶ核酸が明らかに存在することと理解される。
本明細書で用いられる「ＨＩＶ暴露」は、ＨＩＶ感染又はＡＩＤＳを有していない対象の、ＨＩＶ感染又はＡＩＤＳを有している対象との接触、或いはそのようなＨＩＶ感染対象の体液との接触であると理解され、ここで、そのようなＨＩＶ感染対象からの体液が、非感染対象の粘液、組織内の傷口又は擦り傷（例えば、注射針、無防備な性交渉）、又はその他の表面に接触して、感染対象又は感染対象の体液から非感染対象にウィルスが感染する。
本明細書で用いられる用語「炭化水素架橋」は、ポリペプチドの天然二次構造を配座的に与えるのに役立つ、少なくとも２個の改変アミノ酸を有するポリペプチドを安定に架橋するプロセスを示す。炭化水素架橋は、螺旋二次構造、例えばα螺旋二次構造を持ちやすいペプチドの螺旋二次構造を促進又は保持して、その天然のα螺旋配座をもたらすか或いは保持する。この二次構造はポリペプチドのタンパク分解的切断又は熱に対する耐性を増大して、疎水性も増大できる。
炭化水素架橋されたポリペプチドは、２つの非天然アミノ酸の間に１つ又はそれ以上の鎖（連鎖）を包含し、この鎖はポリペプチドの螺旋二次構造（例えば、α螺旋、３１０螺旋）を有意に強化する。一般に、螺旋構造を促進するために、鎖が１又は２螺旋回転（すなわち、約３〜３．６及び７アミノ酸）の長さに渡っている。従って、ｉとｉ＋３；ｉとｉ＋４；又はｉとｉ＋７に位置するアミノ酸は化学修飾及び架橋のための理想的な候補である。従って、例えば、ペプチドが配列 ．．．Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、
Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９．．．を有し、アミノ酸Ｘがそれぞれの位置において独立して選ばれる場合、Ｘ１とＸ４の間、又はＸ１とＸ５の間、又はＸ１とＸ８の間の架橋は、Ｘ２とＸ５の間、又はＸ２とＸ６の間、又はＸ２とＸ９の間等の架橋のように有用である。複数の架橋（例えば２、３、４又はそれ以上）の使用も意図される。複数の架橋の使用は安定化、ペプチドの最適化、特に幾つかのｇｐ４１融合ペプチドの場合として、ペプチドの長さを増大するために有効である。従って、本発明は、ポリペプチド配列内に１つ以上の架橋を組み込むことを包含する。複数の架橋の使用は安定化、ペプチドの最適化、特に幾つかのｇｐ４１融合ペプチドの場合として、ペプチドの長さを増大するために有効である。従って、本発明は、ポリペプチド配列内に１つ以上の架橋を組み込むことを包含する。
本明細書で用いられる用語「同一性」又は「同一性％」は、２つの重合分子、例えば２つのポリヌクレオチド又は２つのポリペプチド、の間のサブユニット配列の類似性を示す。２つの分子の両方のサブユニット位置が同じ単量サブユニットで占められるとき、例えば、２つのペプチドのそれぞれにおける位置がセリンで占められているなら、これらはその位置で同一である。２つの配列の間の同一性は、マッチした或いは同一位置の数の一次関数である。例えば、２つのペプチド又は化合物配列において位置の半分（例えば長さが１０サブユニットのポリマーの５位置）が同一なら２つの配列は５０％同一であり；位置の９０％、例えば１０のうちの９がマッチしているなら、２つの配列は９０％配列同一性を共有している。２つの配列の間の同一性はマッチングした又は同一の位置の数の一次関数である。従って、特定のペプチド中で参照配列の一部分が欠失している場合は、配列同一性を算定する目的では欠失部分をカウントしない。同一性は多くの場合、配列分析ソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴＮ又はＢＬＡＳＴＰ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴで入手可能）を用いて測定される。２つの配列を比較するためのデフォルトパラメータ（例えば、２つの配列を互いに対して「ブラスト」すること）は、ＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列用）によって、マッチ＝１、ミスマッチに対するペナルティー＝−２、オープンギャップ＝５、エクステンションギャップ＝２を与える。タンパク質配列のためにＢＬＡＳＴＰを用いる場合、デフォルトパラメータは、マッチ＝０、ミスマッチに対するペナルティー＝０、オープンギャップ＝１１、及びエクステンションギャップ＝１を与える。更なる、同一性を確認するコンピュータプログラムは当該技術分野で公知である。
本明細書で用いられる「免疫原性薬剤」、例えば、「免疫原性ペプチド」は、薬剤を投与した対象において、適応免疫応答、例えば、細胞性（Ｔｈ１）及び／又は体液性（Ｔｈ２）免疫応答を促進する薬剤又はペプチドであると理解される。この応答は、送達ルート（例えば、経口／粘膜投与、又は筋肉内、皮下或いは静脈内投与）に応じて、粘膜応答又は全身性応答であってよい。適応免疫応答は、この免疫原性薬剤を特異的に結合する抗体（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ）の存在により検出できる。好ましい実施態様では、免疫原性薬剤は十分に適応免疫応答を刺激して、免疫原性薬剤のエピトープを含んでいる病原菌に対する免疫した対象の少なくともある程度の保護をもたらす。保護は免疫原性薬剤の単回投与でもたらされなくてもよい。長い間隔（例えば、１年〜１０年）「追加免疫（booster）」投与の必要可能性をもって、比較的互いに近接している（数週間〜数ヶ月
の間隔）複数ラウンド投与が十分な免疫応答の生成に必要であってよい。
ウィルス感染に関連して本明細書で用いられる用語「阻害する」は、本明細書で提供される構造化ペプチド又は本明細書で提供される構造化ペプチドに対して作成した或いはこれを用いて選択した抗体を用いる、ウィルス感染の減少、ウィルスの細胞標的への結合の減少、又は疾患の減少を示す。例えば、本発明のポリペプチドはウィルス感染、合胞体形成、及びウィルスに関連する疾患（例えば、ＡＩＤＳ）を阻害するために用いる。本発明の化合物は、当該技術分野で公知で、本明細書に記載されている多くのアッセイでスクリーニングして化合物がウィルスを阻害するか否か（感染性、伝染等）を確認する。例えば、本発明の化合物は、ウィルスと培養している細胞培養物を試験化合物と接触してウィルス感染性を阻害するその能力についてアッセイできる。適切な対照（阻害剤に付されていない細胞群）と比較して、試験化合物の存在中で、ウィルス感染性が９０％、８０％、７５％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％又はそれ以下である場合に、化合物がウィルス感染性を阻害することが認められる。
本明細書で用いられる用語「感染を阻害する」は、例えば、細胞−細胞融合又はウィルス無感染によって、細胞のウィルス感染を阻害する薬剤の能力を示す。このような感染はエンベロープウィルスの場合に生じるような、膜融合、又はウィルス構造及び細胞構造に関連する幾つかのその他の融合事象を包含する。
本明細書で用いられる用語「合胞体形成を阻害する」は、２つ又はそれ以上の部分の間の膜融合事象のレベルを、薬剤が存在していない当該部分の間で生じる膜融合事象のレベルと比較して、阻害又は減少する薬剤の能力を示す。その部分は、例えば、細胞膜又はウィルスエンベロープのようなウィルス構造であってよい。
ポリペプチドに関連して用いるときの、本明細書で用いられる「単離された」又は「精製された」は、天然のポリペプチド又はタンパク質がその通常の生理的環境から除去されていること（例えば、血漿又は組織から単離されたタンパク質）又は非天然環境で合成されること（例えば、インビトロ翻訳系で、或いは化学合成を用いて人為的に合成された）を意味する。従って、「単離された」又は「精製された」ポリペプチドは無細胞溶液中にあるか又は異なった細胞環境（例えば、異種細胞型中で発現された）に置くことができる。用語「精製された」は、そのポリペプチドが存在する唯一のポリペプチドであることを意味しないが、天然にそれと結合している細胞又は生物物質が実質的に含まれていない（約９０〜９５％、最大９９〜１００％純粋）ので、天然のポリペプチドと区別されることを意味する。同様に、単離された核酸はその通常の生理的環境から除去されている。「単離された」は細胞に関連して用いられると、細胞は、初代細胞又は細胞株の、細胞培養又は臓器培養の何れかの、培養液中にある（すなわち、動物内にはない）ことを意味する。
細胞は正常動物、形質転換動物、自発的に生じる遺伝子変化を有する動物、並びに／又は遺伝性及び／又は誘発性疾患或いは病気を有している動物から単離できる。
本明細書で用いられる「キット」は、本発明の方法に用いるための非基準実験試薬を少なくとも１つ含有していると理解される。例えば、キットは、改変のための少なくとも１つのペプチドの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、ペプチドの改変のための１つ又はそれ以上のアルデヒド分子、及び使用説明書の、全てを適切に包装して含有することができる。キットは更に、乾燥粉末、濃縮溶液、又はすぐに使える溶液のような、本発明の方法を実施するのに必要なその他の構成要素の何れかを包含することができる。ある実施態様では、キットは、本発明の方法で使用するための試薬を収容する１つ又はそれ以上の容器を含有しており；このような容器は箱、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、袋、ポーチ、ブリスターパック、又は当該技術分野で公知の適切な容器形態であってよい。このような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、又は試薬を入れるのに適切なその他の素材で作成することができる。
本明細書で用いられる「膜近位外部／細胞外ドメイン領域」又は「ＭＰＥＲ」は、疎水性芳香族及び疎水性残基の混合物を有する配列であると理解される。ＭＰＥＲの一般的な特徴は、５Ｔｒｐ残基の４個さらに必須Ｐｈｅ６７３残基を含有する疎水性膜結合面、及び３個の親水性Ａｓｎからなる溶媒暴露面を有していることである。ＭＰＥＲは、短い螺旋、非構造化部分、及び３１０螺旋を、連続して順に含有している（例えば、図８を参照されたい）、特異的な構造特性を包含している。ＭＰＥＲ配列は、例えば、図２、９、及び１０、配列番号４１〜４３及び部分的に１７〜２５、４９〜５７、６４〜７０、及び７５〜８９に示されている。ＭＰＥＲは、例えば、アミノ酸鎖の挿入、又は天然又は非天然アミノ酸の包含が非構造化部分に構造化をもたらすことを可能にするために、表又は図に提供されている配列と比べて、１、２、３、４、５、６、７個又はそれ以上のアミノ酸修飾を包含できる。
「非必須」アミノ酸残基は、ポリペプチド（例えば、ＨＲ−１、ＨＲ−２、ＭＰＥＲドメイン）の野生型配列から、その活性／二次構造（α螺旋構造）を無効にせず又は実質的に改変せずに、改変できる残基である。
「得ること」は、製造する、購入する、又はその他の方法で手に入れることであると本明細書では理解される。
本明細書で用いられる「操作可能に連結した」は、好ましくは共有結合により、結合したと理解され、例えば、一方のペプチドのアミノ末端を他方のペプチドのカルボキシ末端と、操作可能に連結した２つ又はそれ以上の成分を、それらの元来の活性を保持するか、又は結合によって活性を得るかの方法で、結合することであって、操作可能に結合した部分の活性は、実施例に提供されている方法の少なくとも１つを用いてアッセイでき、そして検出可能な活性を有するようにする。
語句「薬学的に許容される担体」は当該技術分野で認められていて、本発明の化合物を動物に投与するために適している、薬学的に許容される物質、組成物又は賦形剤を包含する。担体は、対象薬剤を身体の１つの臓器又は部分から、身体の別の臓器又は部分へ運搬又は輸送することに関わる、液体又は固体の充填剤、希釈剤、添加剤、溶媒又は封入剤を包含する。それぞれの担体は、製剤の別の成分と適合性があって、患者に無害であるという意味で「許容される」でなければならない。例えば、細胞を投与するための薬学的に許容される担体は一般に、注射による送達に許容される担体であって、送達すべき細胞を損傷する洗浄剤又はその他の化合物のような試薬を包含していない。薬学的に許容される担体として機能する物質の幾つかの例は、糖、例えば、乳糖、ブドウ糖及び蔗糖など；澱粉、例えば、トウモロコシ澱粉及びジャガイモ澱粉など；セルロース及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロースなど；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えば、ココアバター及び坐剤用ワックス；油類、例えば、落花生油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及び大豆油など；グリコール類、例えば、プロピレングリコールなど；多価アルコール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなど；エステル、例えば、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなど；寒天；緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなど；アルギン酸；発熱性物質を含んでいない水；生理食塩水；リンゲル溶液；エチルアルコール；リン酸緩衝溶液；及び医薬製剤で用いられるその他の非毒性適合性物質を包含する。
湿潤剤、乳化剤及び滑沢剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムなど、さらに、着色剤、放出剤、被覆剤、甘味料、着香剤及び香料、保存剤及び抗酸化剤も組成物中に含まれていてもよい。
薬学的に許容される抗酸化剤の例は、水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；油溶性抗酸化剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レクチン、没食子酸プロピル、αトコフェロールなど；及び金属キレート試薬、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などを包含する。
本発明の製剤は、経口、経鼻、局所、経皮、口腔、舌下、筋肉内、腹腔内、直腸、膣及び／又は非経口投与に適しているものを包含する。製剤は単回剤形で都合良く提供され、そして薬学の技術分野で周知の何れかの方法で製造することができる。単回剤形を製造するために担体物質と混合できる活性成分の量が一般に、治療効果を引き起こす化合物の量である。
本明細書で用いられる「複数」は１以上を意味すると理解される。例えば、複数は少なくとも２、３、４、５、又はそれ以上を示す。
本明細書で用いられる「ポリペプチド」又は「ペプチド」は、２つ又はそれ以上の独立して選ばれた共有結合（例えば、ペプチド結合）で結合している天然又は非天然アミノ酸として理解される。ペプチドは、ペプチド結合で結合している２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個又はそれ以上の天然又は非天然のアミノ酸を包含する。本明細書に記載されているようなポリペプチドは全長のタンパク質（例えば、全長の処理タンパク質）を、更により短いアミノ酸配列（例えば、天然のタンパク質の断片、又は合成ポリペプチド断片）も包含する。
本明細書で用いられる「予防」は、発病を制限する、発病の速度又は程度を減少する、或いは疾患又は病気の少なくとも１つのサイン又は兆候の進展を阻害すると理解される。
例えば、サハラ以南のアフリカに住んでいる対象、静注薬物乱用者、同性愛の男性、及びその他の個人は、一般住民よりＨＩＶ感染及びＡＩＤＳに感受性がある。予防は、ＨＩＶ感染又はＡＩＤＳの典型的な発病年齢又はその増大する活性危険性の開始後時間の延長を包含できる。予防は、ＨＩＶ感染からＡＩＤＳへの進行を遅延することも包含する。予防は、ＨＩＶ感染又はＡＩＤＳを予防するための本発明の化合物の投与後に全ての対象におけるＨＩＶ感染又はＡＩＤＳの進行が除去されることを必要としていない。予防は薬剤又は治療薬の１用量以上の投与を必要とする。
本明細書で用いられる「試料」は、その環境（例えば、動物由来の血液又は組織、細胞或いは組織培養物由来の馴化培地）から単離されて、ウィルス、抗体、又はレポーター構築物由来の産物のような被分析物の含有が考えられるか、含有していることが知られている生体材料を示す。試料は組織又は体液の部分的に精製された画分であってもよい。参照試料は、病気又は疾患の体液を有していない提供者由来の、又は病気又は疾患を有する対象の正常組織（例えば、感染組織に対する非感染組織）由来の「正常」試料でよい。参照試料は治療されていない提供者又は活性薬剤で処理されていない細胞培養物（例えば、処置されていないか又は賦形剤のみの投与）由来であってもよい。参照試料は細胞又は対象を試験する薬剤と接触させる前の「０時点」で採取することもできる。
２つ又はそれ以上のポリペプチド配列に関連して、「類似性」又は「％類似性」は、以下の配列比較アルゴリズムを用いるか又は目視検査で測定すると、比較して最大一致に対して整列させたときに、同一であるか又は同一である特定パーセントのアミノ酸残基又はそれらの同類置換を有している、２つ又はそれ以上の配列又は部分配列を示す。例を挙げると、当該技術分野で公知で本明細書に記載されているコンピュータ相同性プログラムで整列して、第１ポリペプチドに含まれている数と同一数のアミノ酸の何れかの配列と比較したときに、第１ポリペプチドのアミノ酸配列が、ＨＩＶ−１ＨＲ−１ドメインの領域と少なくとも２０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、若しくは９５％までも又はそれ以上同一又は同類置換である場合に、第１ポリペプチドはＨＩＶ−１ＨＲ−１ドメインと相同であると考えられる。第１タンパク質と第２タンパク質のポリペプチド領域が１つ又はそれ以上の同類アミノ酸残基を包含していることが好ましい。
ポリペプチドに関連して本明細書で用いられる用語「安定な」又は「安定化した」は、螺旋構造を促進及び／又は保持するために、そして／或いはプロテアーゼ耐性を改善するために、そして／或いは酸安定性を改善するために、そして／或いは熱安定性を改善するために、そして／或いは薬理学的特性を改善するために、炭化水素架橋化されているポリペプチドを示す。安定化したポリペプチドは構造的に拘束されたポリペプチドの一種である。
本明細書で用いられる「構造的に拘束されたペプチド」などは、構造的に拘束されたペプチドが非修飾ペプチドより限定された数の構造を採用するように、幾らかの（即ち、少なくとも１つの）化学修飾、例えば、元の又は天然の配列の天然又は非天然のアミノ酸による突然変異；分子鎖を組み込む化学修飾；ジスルフィド架橋の形成を促進する化学修飾；などを有する修飾されたペプチドを包含すると理解される。構造的に拘束されたペプチドは、天然の野生型配列と比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又はそれ以上の突然変異を含有することができる。例えば、分子鎖は、安定な螺旋構造、特にα螺旋及び３１０構造、又は鎖の終端の位置及び鎖の長さに依存するねじれの形成を促進する炭化水素架橋を包含できる。ねじれ（例えば、２つの隣接する構造間の可変角度によって定義されるような構造中の屈曲）又はその他の好ましい配座を促進するために、天然又は非天然のアミノ酸を利用することができる。例えば、天然アミノ酸プロリンはアミノ酸Ｒ基の構造及び水素結合ドナーの欠落に起因してペプチドにねじれを誘導することができる。非天然アミノ酸、特に、大きな及び／又は荷電したＲ基を有するもの、又はＮ−メチル化アミド、Ｎ−置換グリシン、環状α，α−ジ置換、環状Ｎ，Ｎ−ジ置換、及びβアミノ酸は特定の、望ましい配座を促進できる。溶液中の「構造的に拘束された」ペプチドの集団は、全てが常に望ましい配座を有していなくてよいことが理解される。むしろ、溶液中の構造的に拘束されたペプチドの集団では、望ましい配座は、化学修飾前の溶液中の天然又は元のペプチドより少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又はそれ以上多い時間に存在している。溶液中のペプチド集団の構造は、これに限定されないが、円偏光二色性及びＮＭＲスペクトルを包含する、当業者に公知の多数の方法で確認できる。Ｘ線結晶学を、結晶の形態に圧縮して拘束されたペプチドの構造を確認するために適用できる。
本明細書で用いられる「小分子」は、わずか約１５００Ｄａ、１０００Ｄａ、７５０Ｄａ、又は５００Ｄａの分子量を有する、通常は有機化合物である、化合物と理解される。
一実施態様では、小分子は天然のアミノ酸及び／又はヌクレオチドのみを含有しているポリペプチド又は核酸を包含しない。
薬剤、抗体、ポリペプチド、核酸、又はその他の化合物は、標的分子が、非特異的化合物又は非特異的化合物のプールと比較して、少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも５００倍、好ましくは少なくとも１０００倍、好ましくは少なくとも５０００倍、好ましくは少なくとも１０，０００倍優先的に結合されるとき、標的分子を、例えば、抗原、ポリペプチド、核酸、又はその他の化合物を「特異的に結合する」。特異的に結合するは、物理的に関連している構造を有する２つ又はそれ以上の関連する化合物の１つを結合することに関連して用いられる。絶対的の又は比較的の、結合優先性及び親和性は、例えば、それぞれの対に対して別々に親和性を確認することによって、又は競合アッセイを或いは当業者に周知のその他の方法を用いることによって確認することができる。
本明細書で用いられる「対象」は生命体を示す。ある特定の実施態様では、生命体は動物である。ある特定の好ましい実施態様では、対象は哺乳動物である。ある特定の実施態様では、対象は家畜である。対象の例は、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヤギ、及びヒツジを包含する。ヒト対象を患者と称してもよい。
特定の病気、疾患又は症候群を「患っている又は患っていることが疑われる」対象は、専門家が、対象は病気、疾患又は症候群を患っていたということを診断又は疑うような、十分な数の危険因子を有しているか又は病気、疾患又は症状のサイン又は兆候の十分な数又は組み合わせを提示する。ＨＩＶ感染のような疾患を患っているか又は患っていることが疑われる対象を確認する方法は、当業者の能力範囲である。特定の病気、疾患、又は症候群を患っている対象と患っている疑いのある対象は、必ずしも２つの異なったグループではない。
本明細書で用いられる「治療有効量」は、細胞又は対象に単回又は複数回投与すると、このような疾患を有する患者の生存性を延長すること、疾患の１つ又はそれ以上のサイン又は兆候を減少すること、感染を予防又は遅延すること、病気又は疾患の進展（例えば、ＨＩＶ感染からＡＩＤＳへの進展）を予防又は遅延すること、及びこのような治療無しで期待できることを越えるようなことにおいて有効である薬剤の量を示す。
薬剤は対象に、単独或いは１つ又はそれ以上の治療薬剤と組み合わせて、従来の賦形剤、例えば薬学的に許容される担体又は治療との混合物である医薬組成物として投与できる。
医薬品は単回剤形で便利に投与でき、医薬技術分野で周知の方法、例えば、Remington
’s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1985) に記載されているような何れかの方法で製造できる。非経口投与のための製剤は、一般的な賦形剤として、例えば、滅菌水又は食塩水、ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコール、植物起源の油、水素化ナフタレン糖を含有できる。特に、生物適合性、生物分解性のラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコーポリマー、又はポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコーポリマーは、ある特定の薬剤の放出を調節するために有用な賦形剤である。
通常、ワクチンは、一般にアジュバントと呼ばれる、１つ又はそれ以上の薬剤と共に投与されて、ワクチンの効果を増強し、或いはワクチンの治療有効量をもたらすのに必要な抗原の量を減少することが理解される。アジュバントは、これに限定されないが、無機塩（例えば、水酸化アルミニウム、及びリン酸アルミニウム又はカルシウムのゲル）；油乳剤及び洗浄剤からなる製剤（例えば、ＭＦ５９（ミクロ流動洗浄剤で安定化した水中油型乳剤）、ＱＳ２１（精製サポニン）、ＡＳ０２［ＳＢＡＳ２］（水中油型乳剤＋ＭＰＬ＋ＱＳ２１）、モンタナイドＩＳＡ−５１及びＩＳＡ７２０（安定化油中水型乳剤））；微粒子アジュバント（例えば、ビロソーム（インフルエンザ赤血球凝集素を組み込んでいる単層リポソーム賦形剤）、ＡＳ０４（［ＳＢＡＳ４］ＭＰＬとのＡｌ塩）、ＩＳＣＯＭＳ（サポニンと脂質の構造化複合体）、ポリラクチドコグリコリド（ＰＬＧ）））；微生物誘導体（天然及び合成：例えば、モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ）、デトックス（Detox；ＭＰＬ＋M.Phlei細胞壁骨格）、ＡＧＰ［ＲＣ−５２９］（合成アシル化モノサッカリド）、ＤＣ＿Ｃｈｏｌ（リポゾーム内に自身で組み込める脂質免疫刺激因子）、ＯＭ−１７４（リピッドＡ誘導体）、ＣｐＧモチーフ（免疫刺激性ＣｐＧモチーフを含有している合成オリゴヌクレオチド）、修飾ＬＴ及びＣＴ（非毒性アジュバント効果をもたらすために遺伝子的に修飾した細菌性毒素））；内因性ヒト免疫賦活剤（例えば、ｈＧＭ−ＣＳＦ又はｈＩＬ−１２（タンパク質又はコードされたプラスミドの何れかとして投与できるサイトカイン）、イムダプチン（Immudaptin：Ｃ３ｄタンデムアレイ）を包含する。アジュバントは、例えば光の所定波長の投与のような、非化学的アジュバントも包含する。
当然のことながら、所定の治療に用いられる活性化合物の好ましい実際の量は、例えば、用いられる特定の化合物、製剤化した特定の組成物、投与の方法及び対象の特徴、例えば、対象の種、性別、体重、全身状態によって変化するだろう。投与の所定手順についての最適な投与速度は前記のガイドラインに関して実施される通常の用量決定試験を用いて当業者によって容易に確認できる。
本明細書で用いられる、特定の病気又は疾患「に罹りやすい」又は「になりやすい」又は「に罹る傾向がある」などは、遺伝、環境、健康及び／又はその他の危険因子に基づき、一般集団よりも病気又は疾患をより発症しやすい個体を示す。疾患の発症可能性の増大は、約１０％、２０％、５０％、１００％、１５０％、２００％、又はそれ以上の増大であってよい。
用語「アルケニル」は、１つ又はそれ以上の炭素−炭素二重結合を有する直鎖又は分岐鎖であってよい炭化水素鎖を示す。アルケニル部分は表示された数の炭素原子を含有している。例えば、Ｃ２−Ｃ１０は、その基がその中に２〜１０個（合計）の炭素原子を有していてよいということを示す。用語「低級アルケニル」はＣ２−Ｃ８アルケニル鎖を示す。数字表示が何もない場合、「アルケニル」は、その中に２〜２０個（合計）の炭素原子を有している鎖（直鎖又は分岐鎖）である。
用語「アルキニル」は、１つ又はそれ以上の炭素−炭素三重結合を有する直鎖又は分岐鎖であってよい炭化水素鎖を示す。アルキニル部分は表示された数の炭素原子を含有している。例えば、Ｃ２−Ｃ１０は、その基がその中に２〜１０個（合計）の炭素原子を有していてよいということを示す。用語「低級アルキニル」はＣ２−Ｃ８アルキニル鎖を示す。数字表示が何もない場合、「アルキニル」は、その中に２〜２０個（合計）の炭素原子を有している鎖（直鎖又は分岐鎖）である。
用語「アリール」は炭素６個の単環式又は炭素１０個の二環式芳香環系を示し、ここでそれぞれの環の０、１、２、３、又は４原子は置換基で置換されていてよい。アリール基の例は、フェニルナフチル等を包含する。用語「アリールアルキル」又は用語「アラルキル」は、アリールで置換さているアルキルを示す。用語「アリールアルコキシ」は、アリールで置換されているアルコキシを示す。
本明細書で用いられる用語「シクロアルキル」は、３〜１２個の炭素、好ましくは３〜８個の炭素、そしてより好ましくは３〜６個の炭素を有している飽和又は部分的に不飽和の環式炭化水素基を包含し、ここでシクロアルキル基は更に置換されていてもよい。好ましいシクロアルキル基は、これに限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、及びシクロオクチルを包含する。
用語「ハロ」は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素の何れかの基を示す。
用語「アルキル」は、表示された数の炭素原子を含有している、直鎖又は分岐鎖であってよい炭化水素鎖を示す。例えば、Ｃ１−Ｃ１０は、この基がその中に１〜１０個（合計）の炭素原子を有していてよいということを示す。数字表示が何もない場合、「アルキル」は、その中に１〜２０個（合計、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個）の炭素原子を有している鎖（直鎖又は分岐鎖）である。用語「アルキレン」は、二価のアルキル（すなわち、−−Ｒ−−）を示す。
用語「ヘテロアリール」は、単環式の場合は１〜３個のヘテロ原子、二環式の場合は１〜６個のヘテロ原子、又は三環式の場合は１〜９個のヘテロ原子を有している、芳香族の５〜８員の単環式、８〜１２員の二環式、又は１１〜１４員の三環式環系を示し、当該ヘテロ原子はＯ、Ｎ、又はＳから選ばれ（例えば、炭素原子と、単環式、二環式、又は三環式の場合は、それぞれ、１〜３個、１〜６個、又は１〜９個のＮ、Ｏ、又はＳのヘテロ原子）、ここでそれぞれの環の０、１、２、３、又は４個の原子は置換基で置換されていてもよい。ヘテロアリール基の例は、ピリジル、フリル又はフラニル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、ピリミジニル、チオフェニル又はチエニル、キノリニル、インドリル、チアゾリル等を包含する。用語「ヘテロアリールアルキル」又は「ヘテロアラルキル」はヘテロアリールで置換されているアルキルを示す。用語「ヘテロアリールアルコキシ」はヘテロアリールで置換されているアルコキシを示す。
用語「ヘテロシクリル」は、単環式の場合は１〜３個のヘテロ原子、二環式の場合は１〜６個のヘテロ原子、又は三環式の場合は１〜９個のヘテロ原子を有している、非芳香族の５〜８員の単環式、８〜１２員の二環式、又は１１〜１４員の三環式環系を示し、当該ヘテロ原子はＯ、Ｎ、又はＳから選ばれ（例えば、炭素原子と、単環式、二環式、又は三環式の場合は、それぞれ、１〜３個、１〜６個、又は１〜９個のＮ、Ｏ、又はＳのヘテロ原子）、ここでそれぞれの環の０、１、２、又は３個の原子は置換基で置換されていてもよい。ヘテロシクリル基の例は、ピペラジニル、ピロリジニル、ジオキサニル、モルホリニル、テトラヒドロフラニル等を包含する。
用語「置換基」は、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、又はヘテロアリール基上でその基の何れかの原子に「置換されている」基を示す。適切な置換基は、これに限定されないが、ハロ、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルカリール、アリール、アラルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アルコキシカルボニル、アミド、カルボキシ、アルカンスルホニル、アルキルカルボニル、及びシアノ基を包含する。
本明細書に示されている範囲は、範囲内の全ての値の省略表現であると理解される。配列番号の範囲が示されている場合、これは個々の配列全てを包含している。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０よりなる群からの何れかの数、数の組み合わせ、又は下位範囲を包含していると理解される。
特に言明するか或いは文脈から明瞭な場合を除き、本明細書で用いられる用語「又は」は、包括していると理解される。
特に言明するか或いは文脈から明瞭な場合を除き、本明細書で用いられる用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は単数又は複数であると理解される。
特に言明するか或いは文脈から明瞭な場合を除き、本明細書で用いられる用語「約」は、当該技術分野における通常の許容範囲内として、例えば、平均値の２標準偏差内であると理解される。約は、述べられている値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％以内であると理解できる。文脈から明らかな場合を除き、本明細書中に提示される数値は、この用語、約で修飾されてよい。
本明細書中の可変基の定義の何れかでの化学基の列挙の記述は、単一の基又は列挙されている基の組み合わせの何れかとしての可変基の定義を包含する。可変基についての実施態様又は本明細書の態様の記述は、単一の実施態様、又はその他の何れかの実施態様或いはそれらの部分との組み合わせの何れかとしての実施態様を包含する。
記号
Figure 0005908832
は、分子構造の部分として用いる場合に、単結合又はシス又はトランス二重結合を示す。
本明細書で提供されている何れかの組成物又は方法は、本明細書で提供されている１つ又はそれ以上のその他の何れかの組成物及び方法と組み合わせることができる。
ポリペプチド
一態様では、本発明は、安定化ウィルスα螺旋７個繰り返しドメイン（例えば、ＨＲ−１、ＨＲ−２、ＨＲ様、又はＨＲ類縁体、例えば、配列番号３〜１６、２６〜４０、４５〜４８、５６〜６３、及び７１〜７４、並びに部分的な１７〜２５、４９〜５７、６４〜７０、７５〜８９に記載の配列）を有している構造的に拘束されたペプチド又はこれらの活性断片；又は少なくとも１つの安定化α螺旋、安定化ねじれ部分、及び安定化３１０螺旋を有する膜近接外領域（ＭＰＥＲ、配列番号１７〜２５、４１〜４３、４９〜５７、６４〜７０及び７５〜８９の１部分に記載の配列）又はこれらの活性断片；又はＭＰＥＲ、或いはそれらの少なくとも１つの活性断片に連結している、安定化ウィルスα螺旋７個繰り返し２ドメインを有するペプチド又はこれらの活性断片に関する。
一実施態様では、ＨＲ−２ ７個繰り返しドメイン部分のカルボキシ（Ｃ）末端は、同
じウィルス由来が好ましいが、随意に異なったウィルス由来でもよい、ＭＰＥＲ部分のＮ−末端と結合している。
一実施態様では、ＭＰＥＲに隣接している７個繰り返しドメインα螺旋は、プロリン又はその他の螺旋破壊残基の挿入によってＨＲ／ＭＰＥＲ接合部で終結する。この修飾ポリペプチドはＨＲドメイン及び／又はＭＰＥＲドメインのキメラを含有していてもよい。適切なウィルスα螺旋７個繰り返しドメイン及びＭＰＥＲドメインは、細胞接着又は侵入の直接的に又は間接的に関わっている螺旋ドメインを有するウィルスから得ることができる。
一態様では、本発明は、安定化ＨＩＶｇｐ４１ ７個繰り返しドメイン（例えば、ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２の７個繰り返しドメイン１又は２）、又はＨＩＶ−１のＭＰＥＲドメイン、又はＨＩＶ−１のＨＲ２ドメイン及びＭＰＥＲドメインを横断するドメイン（例えば、図７を参照されたい）を有している修飾ポリペプチドに関する。７個繰り返し−１及び７個繰り返し−２ドメインは当該技術分野において周知であって、図２Ａ及び２Ｂで表されるものを包含する。ＭＰＥＲドメインは当該技術分野において周知であって、図２Ｃで表されるものを包含する。一実施態様では、７個繰り返しドメインは、配列番号３〜１６、２６〜４０、４５〜４８、５８〜６３、７１〜７４の何れかに記載のアミノ酸配列と、又は配列番号１７〜２５、４９〜５７、６４〜７０、及び７５〜８９に記載の配列のＨＲ部分と、好ましくは配列番号３又は配列番号１０に記載の配列と３０％又はそれ以上同一であって、α螺旋を形成する。一実施態様では、ＭＰＥＲは、配列番号１７〜２５、４１〜４３、及び７５〜８９に記載の配列、好ましくは配列番号１７に記載の配列のＭＰＥＲ部分の何れかのアミノ酸配列と３０％又はそれ以上同一であって、少なくとも部分的に、α螺旋又は３１０螺旋を形成する。あるいは、修飾ポリペプチドの７個繰り返しドメイン又はＭＰＥＲは、相互作用面の残基が配列番号３、１０、又は１７のそれと同一であるか、又はそれらの同類置換である限り、３０％を越えて異なっていてもよい。７個繰り返しの相互作用面残基を同定する方法は当該技術分野において周知であって本明細書に記載されている。
別の実施態様では、７個繰り返しドメイン２は配列番号１０〜１６に記載のアミノ酸配列と３０％又はそれ以上同一であって、α螺旋を形成する。あるいは、修飾ポリペプチドの７個繰り返しドメイン２は、相互作用面の残基が配列番号１０〜１６のうちの１つのそれと同一であるか、又はその同類置換を有する限り、３０％を越えて異なっていてもよい。７個繰り返しの相互作用面残基を同定する方法は当該技術分野において周知であって本明細書に記載されている。
一実施態様では、本発明の修飾ポリペプチドは、面、例えば配列番号３〜８９のアミノ酸配列の相互作用面；又はその活性断片と同じアミノ酸配列又はその同類置換を有している。７個繰り返しドメインに関しては、α螺旋の「相互作用面」は、コイルドコイル構造中の他のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基のようなものであり、そこでは相互作用螺旋が同じタンパク質上又は異なったタンパク質内に存在している。例えば、ＨＩＶｇｐ４１ＨＲ−２ドメインでは、相互作用面は「ａ」及び「ｄ」位のアミノ酸を包含している。（図３を参照されたい）一方、ＨＩＶｇｐ４１ＨＲ−１ドメインはＨＲ−２と相互作用するｅ、ｇ位及びＨＲ１−ＨＲ１相互作用に関与するａ、ｄ位のアミノ酸を包含する（図３を参照されたい）。７個繰り返し及び相互作用面残基を同定する方法は当該技術分野において周知であって、本明細書に記載されている。
α螺旋７個繰り返し又はＭＰＥＲドメインを少なくとも１つの炭化水素架橋で安定化することが好ましい（例えば、図４、５、６、７及び１０を参照されたい）。何れかの修飾ポリペプチドに用いるのに適している炭化水素架橋は本明細書及び、その全てが参照により組み込まれている、米国特許公開第２００５／０２５０６８０号に記載されている。炭化水素架橋は、螺旋二次構造を有する傾向にある、ポリペプチドが、元の螺旋配座を保持し、そしてその安定性及び効果を増大するようにする。一実施態様では、修飾ポリペプチドは、円偏光二色性分析によって確認すると、水溶液において、少なくとも１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％又はそれ以上の螺旋性を有している。円偏光二色性を測定するアッセイは当該技術分野で公知であって本明細書に記載されている。
炭化水素架橋したポリペプチドは２個のアミノ酸の間に鎖（連鎖）を包含し、この鎖はポリペプチドの螺旋二次構造を有意に増強する。一般に、鎖は１回又は２回の螺旋回転の長さに渡って伸びている（すなわち、約３．４又は約７アミノ酸）。従って、ｉ及びｉ＋３；ｉ及びｉ＋４；又はｉ及びｉ＋７に位置するアミノ酸は化学修飾及び架橋について理想的な候補である。それ故、本発明の修飾ポリペプチドの何れかのアミノ酸残基を、上記に準拠して鎖で繋ぐ（例えば架橋して）ことができる。適切な鎖は、本明細書及び米国特許公開第２００５／０２５０６８０号に記載されている。炭化水素架橋のような鎖を別の間隔に位置付けて螺旋変異（例えば、異なったピッチ、角度、又は１回転当りの残基及びその断片）又は螺旋以外の構造を促進することができる。
更なる実施態様では、炭化水素架橋を、第１アミノ酸（ｉ）と第１アミノ酸のアミノ酸３個下流の第２アミノ酸（ｉ＋３）を結び付けるように位置付ける。別の実施態様では、炭化水素架橋を、第１アミノ酸（ｉ）と第１アミノ酸のアミノ酸４個下流の第２アミノ酸（ｉ＋４）を結び付ける。更に別の実施態様では、炭化水素架橋を、第１アミノ酸（ｉ）と第１アミノ酸のアミノ酸７個下流の第２アミノ酸（ｉ＋７）を結び付ける。
一実施態様では、修飾した、構造的に拘束されたペプチドは、配列番号５９〜８０に記載の配列を有する７個繰り返しドメインを包含し、そこでＸは何れかのアミノ酸で、更に炭化水素架橋で結合しているアミノ酸残基を識別し、そしてＢはメチオニン又はノルロイシンである。修飾ポリペプチドは一般に、本明細書に記載されているような、式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の構造を有するだろう。
本発明は、とりわけ、ウィルスの細胞との接着及び／又は融合に直接又は間接的に関連しているか、或いは１つ又はそれ以上のＢＮＡｂの産生を刺激するためのウィルス抗原として有用である、α螺旋ドメイン又はＭＰＥＲドメインを有する他のウィルスに由来する修飾した構造的に拘束されたペプチドに関する。例えば、一態様では本発明は、安定化ウィルスα螺旋（例えば、７個繰り返しドメイン）又は呼吸器合胞体ウィルス由来であるＭＰＥＲドメインを有している修飾ポリペプチドに関する。ＨＲ及びＭＰＥＲドメインはウィルス感染性に関与するＲＳＶ由来の何れかのα螺旋ドメインを包含してもよい。適切なＲＳＶα螺旋ドメインは配列番号８、１５、及び９０〜９３に記載の配列と３０％又はそれ以上同一であるものを包含し、α螺旋を形成し、そして相互作用面のような選択面の少なくとも２つの残基が配列番号８、１５、及び９０〜９３に記載の配列のそれと同一であるか、又はその同類置換である。７個繰り返し又はＭＰＥＲドメインの面を同定する方法は当該技術分野において周知であって、本明細書に記載されている。
更に別の態様では、本発明は、パラインフルエンザウィルス由来の安定化ウィルスα螺旋７個繰り返しドメイン又はＭＰＥＲドメインを有している修飾ポリペプチドに関する。
適切なパラインフルエンザウィルス７個繰り返し及びＭＰＥＲドメインは、配列番号７、１４、及び９４に記載の配列と３０％又はそれ以上同一であるものを包含し、α螺旋を形成して、相互作用面のような選択面の少なくとも２つの残基が配列番号７、１４、及び９４に記載の配列のそれと同一であるか又はその同類置換である。７個繰り返しの面を同定する方法は当該技術分野において周知であって、本明細書に記載さている。
別の態様では、本発明は、パラミクソウィルス、オルトミクソウィルス、コロナウィルス及びフィロウィルス由来の安定化ウィルスα螺旋７個繰り返しドメインを有する修飾ポリペプチドに関する。
コロナウィルスα螺旋７個繰り返し及びＭＰＥＲドメインは当該技術分野において公知であって、配列番号９、１６、２５、及び９５に記載の配列と３０％又はそれ以上同一であるアミノ酸配列を有するものを包含し、そしてα螺旋を形成する。あるいは、修飾コロナウィルスポリペプチドの７個繰り返し又はＭＰＥＲドメインは、少なくとも１つの面、例えば相互作用面の少なくとも２つの残基が配列番号９、１６、２５、及び９５に記載の配列のそれと同一であるか、又はその同類置換である限り、３０％を越えて異なっていてもよい。７個繰り繰り返しの面を同定する方法は当該技術分野で周知であって、本明細書に記載されている。
同様に、フィロウィルスα螺旋７個繰り返し及びＭＰＥＲドメインは当該技術分野において公知であって、配列番号４、５、１１、１２、９７、及び９８に記載の配列と３０％又はそれ以上同一のものを包含して、α螺旋を形成する。あるいは、修飾フィロウィルスポリペプチドの７個繰返しドメインは、面、例えば、相互作用面の残基が配列番号５又は１２に記載の配列のそれと同一であるか又はその同類置換である限り、３０％を越えて異なっていてもよい。７個繰り繰り返しの面を同定する方法は当該技術分野で周知であって、本明細書に記載されている。
レトロウィルス７個繰り返し及びＭＰＥＲドメインも当該技術分野で公知であって、例えば、パラインフルエンザウィルス配列は配列番号７、１４、及び９４に示されている。
更に、インフルエンザＡウィルス（Ａ／Ａｉｃｈｉ２／６８株）の７個繰り返しドメインは、残基３７９〜４３６、３８７〜４５３、及び３８０〜４５６に生じる。同様に、３８３〜４７１残基は酸性のｐＨ下で伸張したコイルドコイルであることが Carr 及び Kim
によって示された（Carr and Kim, 1993, Cell 73:823-832）。本発明の方法で用いるた
めのペプチドの配列は配列番号７、１４、及び９４に記載の配列と３０％又はそれ以上同一であるものを包含して、α螺旋を形成する。あるいは、修飾フィロウィルスペプチド７個繰り返しドメインは、面、例えば、相互作用面の残基が配列番号７、１４、及び９４に記載の配列のそれと同一であるか、又はその同類置換である限り、３０％を越えて異なっていてもよい。７個繰り繰り返しの面を同定する方法は当該技術分野で周知であって、本明細書に記載されている。
本発明の修飾ポリペプチドは一般に以下に示されている式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の構造を包含しているだろう。
本明細書に記載されている何れの修飾ペプチドも組成物（例えば医薬組成物）又はキット内に存在させることができる。本発明の幾つかの実施態様では、組成物又はキットは２つ又はそれ以上の修飾ポリペプチドを含有している。例えば、組成物は、安定化ＨＩＶｇｐ４１７個繰り返しドメイン及び／又はｇｐ４１ＭＰＥＲドメインを有している２つ又はそれ以上の修飾ポリペプチドを包含することができる。
検討を明確にするために、本発明は更に、ＨＩＶのＨＲ−１、ＨＲ−２、及びＭＰＥＲ修飾ポリペプチドについて主に記載する。しかしながら、本質は、他のウィルス、エンベロープを有しているウィルス、及び有していないウィルスの両方、そしてその他の非ウィルスス生命体に同様に適用できる。本明細書で用いられる用語「７個繰り返し」はＨＲ−１及びＨＲ−２ペプチドを包含する。
ＨＲ−２及びＨＲ−２ペプチド
本発明の修飾ポリペプチドは、ＨＩＶ−１（配列番号１）由来のｇｐ１６０のアミノ酸残基６３８〜６７３及び６２６及び６６２にそれぞれ対応して、
ＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦ 及び
ＭＴＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥ
の（アミノからカルボキシ末端へ読んで）、それぞれ３６個及び３７個のアミノ酸配列を有している、ＨＲ−２ペプチド（配列番号１のアミノ酸６３８〜６６１）を包含する。
本発明で用いるためのその他の有用なＨＲ−２ポリペプチドは、米国特許第７，２７３，６１４号明細書に記載されており、これは参照によりその全てが本明細書に取り込まれている。
３６及び３７ｍｅｒの全長のＨＲ−２及びＨＩＶ−１株及び変異株の様々な種類で見いだされる対応する配列及びその変異形に加えて、本発明のペプチドは、ＨＲ−２ペプチドの切断部分、ＨＲ−２ドメインに隣接する（すなわち、すぐ上流又は下流の配列）ｇｐ４１ポリペプチド配列、又は抗融合活性及び抗ウィルス活性を示すキメラを包含できる。ＨＲ−２ペプチドの切断型はＣ末端、又はＮ末端、或いは両方からの切断型を包含して、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、又は３７個の、連続アミノ酸、好ましくは少なくとも７個の連続アミノ酸残基、又は配列番号１０〜１６、２６〜４０、４５〜４８、５８〜６３、又は７１〜７４に記載の配列、又は配列番号１７〜２５、４９〜５７、６４〜７０、及び７５〜８９に記載の配列の部分配列の螺旋の面の少なくとも２残基、好ましくは３、４、５、６、７、８、又はそれ以上の残基を包含する。
本発明の修飾ペプチドはＨＲ−２様ペプチドも包含する。本明細書で用いられる「ＨＲ−２様」又は「７個繰り返し様」は、１個又はそれ以上のアミノ酸置換、挿入及び／又は欠失を含んでいる全長及び切断型及びキメラＨＲ−２ポリペプチドを、更に相同性検索によって同定又は確認されたペプチド配列も示す。代表的なＨＲ−２様ポリペプチドは、配列番号１０〜１６、２６〜４０、４５〜４８、５８〜６３、又は７１〜７４に示されるものを包含する。本発明の修飾ＨＲ−２様ペプチドは、抗融合活性及び抗ウィルス活性を示すことができる。一実施態様では、７個繰り返しドメイン２は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、又は３７個の、連続アミノ酸、好ましくは少なくとも７個の連続アミノ酸、又は配列番号１０〜１６、２６〜４０、４５〜４８、５８〜６３、又は７１〜７４に記載の配列の螺旋の面の少なくとも２残基、好ましくは３、４、５、６、７、８、又はそれ以上の残基と３０％又はそれ以上同一であって、α螺旋を形成する。あるいは、修飾ポリペプチドの７個繰り返しドメイン２は、面、例えば相互作用面の少なくとも２つの残基が配列番号１０〜１６、２６〜４０、４５〜４８、５８〜６３又は７１〜７４に記載の配列のそれと同一であるか、又はその同類置換であり限り、３０％を越えて異なっていてよい。７個繰り繰り返しの面を同定する方法は当該技術分野で周知であって、本明細書に記載されている。
ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２エンベロープタンパク質は構造的に異なっているが、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２のＨＲ−２領域内に著しいアミノ酸保存が存在する。アミノ酸保存は周期的な性質であって、構造及び／又は機能のいくらかの保存を示唆している。従って、アミノ酸置換の１つの可能性がある種類は、本発明のＨＲ−２ペプチドの構造を安定化すると予測されるアミノ酸交換を包含するだろう。本明細書に記載されているＨＲ−２及びＨＲ−２類縁配列を用いて、当業者は容易にＨＲ−２コンセンサス配列を作り上げて、好ましいアミノ酸置換を示す同類アミノ酸残基を、これらから突き止めることができる。
ＨＲ−１及びＨＲ−１ペプチド
更に、本発明の修飾ペプチドは、ＨＲ−１類縁体に対応するアミノ酸配列を有しているペプチドを包含する。ＨＲ−１は強力な抗ウィルス活性を示す３８−及び５１−アミノ酸のペプチドを包含し、そして配列番号１に記載の配列のＨＩＶ−１膜貫通（ＴＭ）ｇｐ４１の、それぞれ残基５５３〜５９０及び５４２〜５９２に対応する。
３８ｍｅｒの全長ＨＲ−１に加えて、本発明の修飾ペプチドは抗融合活性又は抗ウィルス活性を示すＨＲ−１ペプチドの切断部分を包含する。ＨＲ−１ペプチドの切断部分はＣ末端又はＮ−末端、或いは両方から作成することができる。ＨＲ−１ペプチドは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、又は３８アミノ酸の長さでよい。
本発明の修飾ペプチドは、ＨＲ−１様ペプチドも包含する。本明細書で用いられる「ＨＲ−１様」又は「７個繰り返し様」は、１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、挿入及び／又は欠失を含有し、そして抗融合又は抗ウィルス活性を示す全長及び切断されたＨＲ−１ポリペプチドを示す。一実施態様では、７個繰り返しドメイン１は、配列番号３〜９に記載の配列のうちの１つのアミノ酸配列と、又は配列番号３〜９に記載の配列のうちの１つの螺旋の面の少なくとも２残基と、好ましくは３、４、５、６、７、８、又はそれ以上の残基と３０％又はそれ以上同一であり、そしてα螺旋を形成する。あるいは、修飾ポリペプチドの７個繰り返しドメイン１は、少なくとも１つの面、例えば相互作用面の残基が配列番号３〜９に記載の配列のそれと同一であるか又はその同類置換である限り、３０％を越えて異なっていてもよい。７個繰り返しの相互作用面残基を同定する方法は当該技術分野において周知であって本明細書に記載されている。
ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２エンベロープタンパク質は構造的に異なっているが、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２のＨＲ−１対応領域内に著しいアミノ酸保存が存在する。このアミノ酸保存は、構造及び／又は機能の幾らかの保存を示唆する、周期的性質のものである。従って、アミノ酸置換の可能性がある種類は、本発明のＨＲ−１ペプチドの構造を安定化することが予測されるアミノ酸変更のようなものを包含する。本明細書に記載されているＨＲ−１及びＨＲ−１類縁配列を用いて、当業者は容易にＨＲ−１コンセンサス配列を作り上げて、好ましいアミノ酸置換を示す同類アミノ酸残基を、これらから突き止めることができる。
ＭＰＥＲ及びＭＰＥＲペプチド
ＭＰＥＲペプチドは非エンベロープウィルスによって保存される。多様なＨＩＶ株由来のＨＲ−２／ＭＰＥＲドメインの複数配列を図２Ｃに示す。ＨＩＶ及びＳＡＲＳ ＭＰＥ
Ｒドメインの配列配置も図２Ｃに示す。ＭＰＥＲは、ＨＲ−２螺旋、ねじれ、及び３１０螺旋ドメインと接続しているα螺旋を包含している構造を有することが可能なアミノ酸配列を有していると特徴付けられている。しかしながら、ＭＰＥＲドメインは感染の過程で実質的な構造変化を受けることが知られている。従って、感染の過程でペプチドが経験する構造変化は、中和抗体、例えば、広範囲中和抗体を作成するのに有用である異なったエピトープを示すことができる。
ＨＲ及びＭＰＥＲペプチドの突然変異、切断、及び延長
アミノ酸置換は、保存特性又は非保存特性のものであってよい。保存（同類）アミノ酸置換は、ＨＲ−１ペプチド配列の１つ又はそれ以上のアミノ酸を、類似した電荷、大きさ、及び／又は疎水性特性のアミノ酸で置換すること、例えば、グルタミン酸（Ｅ）をアスパラギン酸（Ｄ）に、アスパラギン酸（Ｄ）をアスパラギン（Ｎ）に、及びグルタミン酸（Ｅ）のグルタミン（Ｑ）にするアミノ酸置換から成っている。非保存（非同類）置換は、ＨＲ−１ペプチド配列の１つ又はそれ以上のアミノ酸を、非類似の電荷、大きさ、及び／又は疎水性特性を有するアミノ酸で置換すること、例えば、グルタミン酸（Ｅ）をバリン（Ｖ）にする置換から成っている。置換は、同類又は非同類の非天然アミノ酸の使用も包含できる。
アミノ酸挿入は、単一アミノ酸残基又は一連の残基から成っていてよい。挿入は全長の又は切断したＨＲ−１、ＨＲ−２、又はＭＰＥＲペプチドのカルボキシ又はアミノ末端で、更にはペプチドの内部の位置で、行うことができる。このような挿入は一般に、長さが２〜１５アミノ酸の範囲である。当該ペプチドのカルボキシ或いはアミノ末端に行う挿入は、好ましくは約２〜約５０アミノ酸である、広範囲であってよいと考えられる。そのような挿入によっても抗融合又は抗ウィルス活性を未だに示す修飾ペプチドがもたらされる限り、このような挿入の１つ又はそれ以上を全長の又は切断したＨＲ−１、ＨＲ−２、又はＭＰＥＲペプチドに導入することができる。
好ましいアミノ又はカルボキシ末端挿入物は、長さが約２〜約５０アミノ酸残基の範囲で、実際のＨＲ−１、ＨＲ−２、又はＭＰＥＲｇｐ４１アミノ酸配列のそれぞれのアミノ或いはカルボキシ末端ｇｐ４１タンパク質領域に対応している、ペプチドである。従って、好ましいアミノ末端又はカルボキシ末端アミノ酸挿入は、ｇｐ４１タンパク質のＨＲ−１、ＨＲ−２、又はＭＰＥＲ領域のアミノ又はカルボキ末端のそれぞれを直ちに見いだせるｇｐ４１アミノ酸配列を含有している。
全長の又は切断したＨＲ−１、ＨＲ−２、又はＭＰＥＲペプチドの欠失も本発明の範囲内である。このような欠失は、ＨＲ−１、ＨＲ−２、又はＭＰＥＲペプチド；又はＨＲ−１、ＨＲ−２、又はＭＰＥＲ様ペプチド配列からの、得られるペプチド配列が４、５、又は６アミノ酸である下限の長さでの、１つ又はそれ以上のアミノ酸の除去で構成される。
このような欠失は、ペプチド配列の単一の連続した部分又は１つ以上の分離した部分を含む。そのような欠失によっても抗融合又は抗ウィルス活性を未だに示すペプチドがもたらされる限り、１つ又はそれ以上のこのような欠失を全長の又は切断したＨＲ−１、ＨＲ−２、又はＭＰＥＲペプチドに導入することができる。
ＨＲ−１、ＨＲ−２、及びＭＰＥＲ類縁体
上記の全長の及び切断したＨＲ−１、ＨＲ−２、又はＭＰＥＲペプチドの類縁体に対応するペプチドは、他のエンベロープした又は非エンベロープのウィルス中で見い出すことができる。本明細書で用いられる用語「ＨＲ−１、ＨＲ−２、又はＭＰＥＲ類縁体」は、非ＨＩＶウィルス中で、７個繰り返し類縁ドメイン又はＭＰＥＲドメインを有していると確認又は同定されたペプチドを示す。７個繰り返し類縁ポリペプチドを同定する方法は当該技術分野において公知である。例えば、タンパク質配列及びそれらの構造モデルからコイルドコイルを認識する能力を有する、対合残基相関に基づく生物情報プログラム（例えば、ch.embnet.org/software/COILS_form.htmlのワールドワイドウェブ上）である（参照により本明細書に取り込まれている、Lupas, A., et al. Science 1991. 252: 1162-1164 を参照されたい）。更に、このような修飾ペプチドは抗融合又は抗ウィルス活性を示す
。ＭＰＥＲドメインを同定する方法は当該技術分野において公知であって、本明細書に説明されている基準を用いて実施することができる。
このようなＨＲ−２及びＨＲ−１類縁体は、例えば、他のエンベロープ又は非エンベロープウィルス中に存在するペプチド配列と対応できる。このようなペプチドは抗融合活性又は抗ウィルス活性を示し、そしてこれらのアミノ酸配列は、例えば、ＨＲ１及びＨＲ２ペプチド（配列番号１に記載の配列のａａ５５３〜５９０及び５４２〜５９２；及び配列番号１に記載の配列のａａ６２６〜６６１）の由来であるｇｐ４１ペプチド領域に相同するペプチド領域を含有しているその他のウィルスのペプチド領域のアミノ酸配列に対応している。配列は、それがα螺旋を形成し、少なくとも３０％ＨＩＶ−１ＨＲ２と同一で、そしてウィルス融合及び感染機構の一部であるときは、ＨＲ−２配列に対応している。ＨＲ−２類縁体は、これに限定されないが、その他のＨＩＶ−１分離株、ＨＩＶ−２分離株、ＳＩＶ分離株、インフルエンザ、パラインフルエンザウィルス、コロナウィルス、ＲＳＶ、等を包含するウィルス中に存在できる。配列は、それがα螺旋を形成し、少なくとも３０％ＨＩＶ−１ＨＲ−２と同一であり、そしてウィルス融合及び感染機構の一部であるときは、ＨＲ−１配列に対応している。ＨＲ−２類縁体は、これに限定されないが、その他のＨＩＶ−１分離株、ＨＩＶ−２分離株、ＳＩＶ分離株、インフルエンザ、パラインフルエンザウィルス、コロナウィルス、ＲＳＶ、等を包含するウィルス中に存在できる。
ＭＰＥＲ類縁体は，そのアミノ酸配列が、例えば、ＭＰＥＲペプチド（配列番号１に記載の配列のａａ６６２〜６８３）の由来であるｇｐ４１ペプチド領域に対応しているペプチド領域を含有しているその他のウィルスのペプチド領域のアミノ酸配列に対応しているＨＩＶ及び非ＨＩＶウィルスのペプチドである。配列は、それが典型的な膜状況で、Ｎ−末端からＣ末端へ順番に、３１０螺旋、ねじれ、及びα螺旋を形成するときに、ＭＰＥＲ配列に対応する。しかしながら、ＭＰＥＲドメインは柔軟性があって全長タンパク質という状況ではＭＰＥＲドメインの部分は動的な立体配座の変化を受けるので、この領域は広げることができる。ＭＰＥＲ類縁体は少なくとも３０％ＨＩＶ−１ＭＰＥＲと同一で、ウィルス融合及び感染機構の一部である。ＭＰＥＲ類縁体は、これに限定されないが、その他のＨＩＶ−１単離株、ＨＩＶ−２単離株、ＳＩＶ単離株、インフルエンザ、パラインフルエンザウィルス、コロナウィルス、ＲＳＶ、等を包含するウィルス中に存在できる。
ＨＲ−１及びＨＲ−２類縁体又はその他の７個繰り返しポリペプチドは、そのアミノ酸配列が、例えば、ＨＲ−１（配列番号３）及びＨＲ−２（配列番号７）ペプチドの由来であるｇｐ４１ペプチド領域に対応している、ペプチド領域を含有している他のウィルスの、ペプチド領域のアミノ酸配列から成っているペプチドを包含する。これらのポリペプチドは、配列番号３〜１６、２６〜４０、４５〜４８、５８〜６３、７１〜７４に記載の配列を包含し、そして配列番号１７〜２５，４９〜５７、６４〜７０及び７５〜８９に記載の配列を部分的に包含する。
ＲＳＶ７個繰り返しドメインは、配列番号８、１５、及び９０〜９３に記載の配列のペプチドによって形成されたα螺旋と３０％又はそれ以上同一で、この少なくとも３個の同類アミノ酸を包含するか、又はこれの面の少なくとも２個のアミノ酸を共有して、α螺旋を形成する。
パラインフルエンザ７個繰り返しドメインは、配列番号７、１４、及び９４に記載の配列のペプチドによって形成されたα螺旋と３０％又はそれ以上同一で、この少なくとも３個の同類アミノ酸を包含するか、又はこれの面の少なくとも２個のアミノ酸を共有して、α螺旋を形成する。
コロナウィルスα螺旋７個繰り返しドメインは、配列番号９、１６、２５、及び９５に記載の配列のペプチドによって形成されたα螺旋と３０％又はそれ以上同一で、この少なくとも３個の同類アミノ酸を包含するか又はこの面の少なくとも２個のアミノ酸を共有して、α螺旋を形成する。
フィロウィルスα螺旋７個繰り返しドメインは、配列番号４、５、１１、１２、９７及び９８に記載の配列のペプチドによって形成されたα螺旋と３０％又はそれ以上同一で、この少なくとも３個の同類アミノ酸を包含するか、又はこの面の少なくとも２個のアミノ酸を共有して、α螺旋を形成する。
レトロウィルスα螺旋７個繰り返しドメインは、配列番号６及び１３に記載の配列のペプチドによって形成されたα螺旋と３０％又はそれ以上同一で、この少なくとも３個の同類アミノ酸を包含するか、又はこの面の少なくとも２個のアミノ酸を共有して、α螺旋を形成する。
本発明の修飾ポリペプチドはインフルエンザ７個繰り返しドメインの使用も意図している。
７個繰り返し体又は７個繰り返し類縁体は、例えば、当該技術分野で公知のコンピュータアシスト検索戦略法を用いて認識又は同定される。例えば、タンパク質配列及びそれらの構造モデルからコイルドコイルを認識する能力を有する、対合残基相関に基づく生物情報プログラム（例えば、ch.embnet.org/software/COILS_form.htmlのワールドワイドウェブ上）（Lupas, A., et al. Science 1991. 252(5009); p. 1162-1164 及び米国特許第７，２７３，６１４号明細書を参照されたい、これら両方はその全てが、参照により本明細書に取り込まれている）。この検索戦略法は、ＨＲ−１及び／又はＨＲ−２及び／又はＭＰＥＲのそれと類似した構造及び／又はアミノ酸配列特性を有していると予測されるさらなるペプチド領域を同定できる。
７個繰り返しポリペプチド及びＭＰＥＲペプチドの安定化
本発明の修飾ポリペプチドは構造的に拘束された（例えば、安定化、架橋化）螺旋及び／又はねじれドメインであり、そして／又は生理的条件から取り出すと生物活性形態を失う天然配列と比較して、ペプチドの構造柔軟性を限定するために天然の及び／又は非天然のアミノ酸を組み込む、天然の（すなわち、野生型又はその他の天然に生じる）配列と比べて１つ又はそれ以上のアミノ酸配列修飾を含有している。ポリペプチドは炭化水素架橋のような少なくとも１つの分子鎖を含有していることが好ましい。炭化水素架橋化は米国特許出願公開第２００５／０２５０６８０号明細書に記載されていて、これはその全てが参照により本明細書に取り込まれている。
ペプチドα螺旋は、比較的大きい接触表面積上に順序よく正確に整列された特定のアミノ酸残基の提示による非常に重要なタンパク質相互作用に関与する（Chittenden, T., et al., Embo Journal, 1995. 14(22): p. 5589-5596; Kussie, P.H., et al. Science, 1996. 274(5289): p. 948-953; Ellenberger, T.E., et al., Cell, 1992. 71(7): p. 1223-1237）。α螺旋ドメイン及びその他のタンパク質構造特性はしばしば、残りのタンパク
質中の骨格配列によって安定化されて、それが螺旋構造、例えばα螺旋構造の形成及び／又は保持を促進する。文脈から切り離した解釈をすると、α螺旋ペプチドモチーフは、広げることができて、生物活性の損失をもたらす。重要な課題は、その天然のα螺旋構造を促進及び／又は保持を含むα螺旋ペプチドを開発すること、及びタンパク質分解、酸及び熱分解に抵抗できて、インビボで原形を保つ、ペプチドを製造することである。
炭化水素架橋化は、ポリペプチドの天然二次構造を配座的に与えるのに役立つ少なくとも２個の置換アミノ酸を介してポリペプチドを安定に架橋するための過程を示す。炭化水素架橋化は、熱力学的にα螺旋構造を好むペプチドのα螺旋二次構造を促進及び保持する。この二次構造は、ポリペプチドのタンパク質分解及び熱に対する耐性を増大して、疎水性も増大できる。従って、本明細書に記載されている炭化水素架橋された（構造的に拘束された、例えば架橋された）ポリペプチドは、対応する非炭化水素架橋の（構造的に拘束されていない）ポリペプチドと比較して改善された生物活性を有している。例えば、構造的に拘束されたペプチドは、ＨＩＶポリペプチド（例えば、ＨＲ−１、ＨＲ−２、又はＭＰＥＲドメイン）のα螺旋ドメインを包含でき、これは細胞の接着、融合、及び感染を妨げ、或いはウィルスの接着、侵入、又は感染に必須であるウィルス構造に対する免疫応答を促進する。ある場合は、構造的に拘束したペプチドを細胞へのウィルス侵入を阻害するために用いるこができる。本明細書に記載されている架橋ペプチドは、治療的に、例えばＨＩＶを治療するために用いることができる。
炭化水素架橋ポリペプチドは、２個のアミノ酸の間の鎖（架橋）を包含し、この鎖はポリペプチドの螺旋二次構造を有意に増強する。一般に、鎖は螺旋回転の１又は２つの長さ（すなわち、約３〜３．６個、又は約７個のアミノ酸）にわたり伸びている。従って、ｉ及びｉ＋３；ｉ及びｉ＋４；又はｉ及びｉ＋７に位置するアミノ酸は、化学修飾及び架橋に対する理想的な候補である。よって、例えば、ペプチドが配列．．．Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９．．．を有している場合は、Ｘ１とＸ４の間、又はＸ１とＸ５の間、又はＸ１とＸ８の間の架橋は、Ｘ２とＸ５の間、又はＸ２とＸ６の間、又はＸ２とＸ９の間の架橋のように有用である。多数の架橋（例えば、２、３、４又はそれ以上）の使用も、個々の架橋付加物の効果（例えば、改善された螺旋性及び活性；改善された螺旋性及び熱安定性；改善された螺旋性及び酸安定性；改善された螺旋性及び薬理学的特性）を組み合わせることを達成できる。従って、本発明は、更に配列を安定化するか或いは構造安定化、タンパク質分解耐性、熱安定性、酸安定性、薬理学的特性及び生物活性を促進する、或いはより長いポリペプチド延性を増強するためにポリペプチド配列内の１つ以上の架橋の組み込みを包含する。
本発明の幾つかの実施態様では、鎖、例えば、炭化水素架橋は螺旋以外の構造を安定化するために用いられる。そのような場合は、ｉ、ｉ＋３、ｉ＋４、及びｉ＋７以外の間隔で鎖の端部を位置付けることができる。例えば、分子鎖を、ＭＰＥＲドメインのねじれ領域を安定化して、螺旋と同様に、平らな連続面ではなく湾曲した表面を作り出すために用いることできる。アミノ酸配列及び鎖端部の位置付けは、鎖によって架けられているアミノ酸の数を決定するだろう。このような判断は当業者によく理解される。
一実施態様では、本発明の修飾ポリペプチドは式（Ｉ）を有している。
Figure 0005908832
式中の、それぞれのＲ１及びＲ２は独立して、Ｈ又はＣ１〜Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、又はヘテロシクリルアルキルである。
Ｒ３は、アルキル、アルケニル、アルキニル、［Ｒ４--Ｋ--Ｒ４］ｎ（それぞれは０〜６個のＲ５で置換されている）である。
Ｒ４は、アルキル、アルケニル、又はアルキニルである。
Ｒ５は、ハロ、アルキル、ＯＲ６、Ｎ（Ｒ６）２、ＳＲ６、ＳＯＲ６、ＳＯ２Ｒ６、ＣＯ２Ｒ６、Ｒ６、蛍光部分、又は放射性同位元素である。
Ｋは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＯＮＲ６、又は
Figure 0005908832
である。
Ｒ６は、Ｈ、アルキル、又は治療薬剤である。
ｎは、１〜４の整数である。
ｘは、２〜１０の整数である。
それぞれのｙは独立して、０〜１００の整数である。
ｚは、１〜１０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の整数である。
それぞれのＸａａは独立してアミノ酸である。
修飾ポリペプチドは、α螺旋を形成して、配列番号２〜２３又は配列番号３９〜８０に記載のアミノ酸配列と３０％又はそれ以上同一であるか、又はこの配列由来の少なくとも７連続アミノ酸を含有しているアミノ酸配列を含有してよく；ここでＸは何れかのアミノ酸であって、更に炭化水素架橋で結合しているアミノ酸残基を特定し；そしてＢはメチオニン又はノルロイシンである。
鎖は、アルキル、アルケニル、又はアルキニル部分（例えば、Ｃ５、Ｃ８又はＣ１１アルキル、或いはＣ５、Ｃ８又はＣ１１アルケニル、或いはＣ５、Ｃ８又はＣ１１アルキニル）を包含できる。連結アミノ酸はαジ置換（例えば、Ｃ１〜Ｃ３又はメチル）されていてもよい。
ある場合は、Ｘが２、３、又は６である。
ある場合は、ｙが独立して、３と１５の間の整数である。
ある場合は、ｙが独立して、１と１５の間の整数である。
ある場合は、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立して、Ｈ又はＣ１〜Ｃ６アルキルである。
ある場合は、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立して、Ｃ１〜Ｃ３アルキルである。
ある場合は、少なくとも１つのＲ１及びＲ２がメチルである。例えば、Ｒ１及びＲ２の両方がメチルである。
ある場合は、Ｒ３がアルキル（例えば、Ｃ８アルキル）であって、ｘが３である。
ある場合は、Ｒ３がＣ１１アルキルであって、ｘが６である。
ある場合は、Ｒ３がアルケニル（例えば、Ｃ８アルケニル）であって、ｘが３である。
ある場合は、ｘが６であって、Ｒ３がＣ１１アルケニルである。
ある場合は、Ｒ３が直鎖のアルキル、アルケニル、又はアルキニルである。
ある場合は、Ｒ３が、--ＣＨ２--ＣＨ２--ＣＨ２--ＣＨ＝ＣＨ--ＣＨ２--ＣＨ２--ＣＨ２--である。
ある特定の実施態様では、２つのα、αジ置換立体異性体は、両方がＲ配置又はＳ配置（例えば、ｉ、ｉ＋４架橋）であるか、一方の立体中心がＲで他方がＳ（例えば、ｉ、ｉ＋７架橋）である。従って、ここでは式（Ｉ）を以下のように示せる。
Figure 0005908832
例えば、ｘが３のときは、Ｃ’及びＣ”ジ置換立体中心は両方がＲ配置でよく或いは両方がＳ配置よい。ｘが６のときは、Ｃ’ジ置換立体中心はＲ配置で、Ｃ”ジ置換立体中心がＳ配置である。Ｒ３二重結合はＥ又はＺの立体化学配置でよい。
ある場合は、Ｒ３が［Ｒ４--Ｋ--Ｒ４］ｎであり；Ｒ４は直鎖のアルキル、アルケニル、又はアルキニルである。
ある実施態様では、修飾ポリペプチドが、７個繰り返し又は７個繰り返し様ドメイン、例えば、ＨＩＶ−１ ＨＲ−１又はＨＲ−２ドメインの少なくとも３、４、５、６、７、
８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、又はそれ以上の連続アミノ酸を含有する。それぞれの［Ｘａａ］ｙは、７個繰り返し又は７個繰り返し様ドメイン、例えば、ＨＩＶ−１ ＨＲ−１又はＨＲ−２ドメイン、例えば、図５及び６の何れかに示されている
ポリペプチドの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５又はそれ以上の連続アミノ酸を独立して含有できるペプチドである。［Ｘａａ］Ｘは、７個繰り返し又は７個繰り返し様ドメイン、例えば、ＨＩＶ−１ ＨＲ−１ドメイン又はＨＲ−２、例えば、配列番号１〜１４に記載の配列、
或いは図５又は６のアミノ酸配列を有しているポリペプチドの３又は６連続アミノ酸を含有してよいペプチドである。
修飾ポリペプチドは、７個繰り返し又は７個繰り返し様ドメイン、例えば、ＨＩＶ−１ ＨＲ−１ドメイン又はＨＲ−２ドメイン；又はＭＰＥＲドメイン、例えば、配列番号２
〜２３又は３９〜１４０に記載の配列のアミノ酸配列を有しているポリペプチドの３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０連続アミノ酸を含有でき、ここで２、３、又は６個のアミノ酸で隔てられている２個のアミノ酸は、Ｒ３を介して結合しているアミノ酸置換基で置換されている。従って、少なくとも２個のアミノ酸は連結アミノ酸又は連結アミノ酸置換基で置換できる。
従って、式（Ｉ）を
Figure 0005908832
で示すと、［Ｘａａ］ｙ’及び［Ｘａａ］ｙ”は、同一又は異なった７個繰り返し又は７個繰り返し様ドメイン由来の連続ポリペプチド配列を含有することができる。
本発明は、７個繰り返し又は７個繰り返し様ドメイン、例えば、ＨＩＶ−１ ＨＲ−１
ドメイン又はＨＲ−２ドメイン；又はＭＰＥＲドメイン、例えば、配列番号１０〜１６、２６〜４０、４５〜４８、５８〜６３、及び７１〜７４に記載のアミノ酸配列、並びに１７〜２５、４９〜５７、６４〜７０、及び７５〜１４０に記載の部分アミノ酸配列を有するポリペプチドの１０（１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又はそれ以上）連続アミノ酸を含有している架橋ポリペプチドを特徴としていて、ここで２、３、又は６個のアミノ酸で隔てられている２個のアミノ酸のα炭素はＲ３を介して結合していて、２個のα炭素のうちの１個はＲ１で置換され、他方はＲ２で置換され、そしてそれぞれがペプチド結合を介して更なるアミノ酸に結合している。
別の実施態様では、本発明の修飾ポリペプチドは式（ＩＩ）を有している。
Figure 0005908832
式中の、それぞれのＲ１及びＲ２は独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、又はヘテロシクリルアルキルである。
それぞれのｎは独立して、１〜５の整数である。
ｘは、２、３、又は６である。
それぞれのｙは独立して、０〜１００の整数である。
ｚは、１〜１０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の整数である。
それぞれのＸａａは独立してアミノ酸である。
修飾ポリペプチドはα螺旋を形成し、そしてアミノ酸配列を有することができ、それはα螺旋を形成して、配列番号１０〜１６、２６〜４０、４５〜４８、５８〜６３、及び７１〜７４に記載のアミノ酸配列、並びに配列番号１７〜２５、４９〜５７、６４〜７０、及び７５〜１４０に記載の配列の部分アミノ酸配列と３０％又はそれ以上同一であるか、又はこの配列由来の少なくとも７連続アミノ酸を含有している；ここでＸは何れかのアミノ酸であって、更に炭化水素架橋で結合しているアミノ酸残基を特定し；そしてＢはメチオニン又はノルロイシンである。修飾ポリペプチドは、α螺旋を形成して、配列番号１０〜１６、２６〜４０、４５〜４８、５８〜６３、及び７１〜７４に記載の配列、並びに配列番号１７〜２５、４９〜５７、６４〜７０、及び７５〜１４０に記載の配列の部分配列と３０％又はそれ以上同一であるか、又はこの配列由来の少なくとも３、好ましくは７連続するアミノ酸、或いはこの配列を有しているペプチドによって形成される螺旋の面に由来する少なくとも２つのアミノ酸を含有している、アミノ酸配列を包含でき、ここでＸは何れかのアミノ酸であって、更に炭化水素架橋で結合しているアミノ酸残基を特定し；そしてＢはメチオニン又はノルロイシンである。
更に別の実施態様では、本発明の修飾ポリペプチドは式（ＩＩＩ）を有する。
Figure 0005908832
式中の、それぞれのＲ１及びＲ２は独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、又はヘテロシクリルアルキルである。
Ｒ３は、アルキル、アルケニル、アルキニル；［Ｒ４--Ｋ--Ｒ４］ｎ、又は天然アミノ酸の側鎖であり、それぞれは０〜６個のＲ５で置換されている。
Ｒ４は、アルキル、アルケニル、又はアルキニルである。
Ｒ５は、ハロ、アルキル、ＯＲ６、Ｎ（Ｒ６）２、ＳＲ６、ＳＯＲ６、ＳＯ２Ｒ６、ＣＯ２Ｒ６、Ｒ６、蛍光部分、又は放射性同位元素である。
Ｋは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＯＮＲ６、又は
Figure 0005908832
である。
Ｒ６は、Ｈ、アルキル、又は治療薬剤である。
Ｒ７は、アルキル、アルケニル、アルキニル；［Ｒ４--Ｋ--Ｒ４］ｎ、又は天然アミノ酸の側鎖であり、それぞれは０〜６個のＲ５で置換されている。
ｎは、１〜４の整数である。
ｘは、２〜１０の整数である。
それぞれのｙは独立して、０〜１００の整数である。
ｚは、１〜１０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の整数である。
それぞれのＸａａは独立して、アミノ酸である。
修飾ポリペプチドは、α螺旋を形成して、配列番号１０〜１６、２６〜４０、４５〜４８、５８〜６３、及び７１〜７４に記載の配列、並びに配列番号１７〜２５、４９〜５７、６４〜７０、及び７５〜１４０に記載配列の部分配列と３０％又はそれ以上同一であるか、又はアミノ酸配列由来の少なくとも７連続アミノ酸を、或いはこの配列を有しているペプチドによって形成される螺旋の面に由来する少なくとも２つのアミノ酸を含有している、アミノ酸配列を包含でき、ここでＸは何れかのアミノ酸であって、更に炭化水素架橋で結合しているアミノ酸残基を特定し；そしてＢはメチオニン又はノルロイシンである。
炭化水素鎖が記載されているが、その他の鎖も想定される。例えば、鎖は１つ又はそれ以上のエーテル、チオエーテル、エステル、アミン又はアミド部分を包含できる。ある場合は、天然アミノ酸側鎖を鎖に組み込むことができる。例えば、鎖を官能基と、例えばセリンのヒドロキシル、システインのチオール、リジンの１級アミン、アスパラギン酸或いはグルタミン酸の酸、又はアスパラギン或いはグルタミンのアミドなどと結合することができる。従って、２つの非天然アミノ酸を結合して作成した鎖を用いるのではなくて、天然のアミノ酸を用いて鎖を作成することが可能である。単一の非天然アミノ酸を天然アミノ酸と一緒に用いることもできる。
鎖の長さを変動できることも更に想定される。例えば、二次構造に比較的高度の拘束を与えることが望ましい場合はより短い鎖を用いることができ、それに対して、ある場合は、二次構造に低い拘束を与えることが望ましく、よってより長い鎖が望ましいだろう。アミノ酸配列が螺旋を形成する傾向を有していない場合に、側面での又はアミノ酸配列内への鎖の挿入は螺旋形成をもたらさないだろう。
更に、主にα螺旋の単一面上にある鎖を提供するために、アミノ酸ｉからｉ＋３、ｉからｉ＋４；及びｉからｉ＋７を架橋する鎖の例を記載したが、α螺旋以外の構造を促進及び／又は保持するために多数のアミノ酸の何れかの組み合わせを架橋するために鎖を合成することができる。
当業者に理解されるように、本明細書に記載されている化合物を合成する方法は当業者にとって明らかであろう。従って、所望の化合物を得るために、多様の合成工程を代替的並びで又は順番に実施することができる。本明細書に記載されている化合物の合成に有用な合成化学変換及び保護基方法論（保護及び脱保護）は当該技術分野において公知であって、例えば、以下に記載されているものを包含する。R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2d. Ed., John Wiley and Sons (1991); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); and L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995) 及びこれらの続版。ペプチドを合成する特定の方法
は本発明を限定しない。
ペプチドの合成
本発明のペプチドは化学合成方法によって作成することができ、これらは当業者に周知であって本明細書に記載されている。例えば、Fields et al., Chapter 3 in Synthetic Peptides: A User’s Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Co., New York, N.Y., 1992, p. 77 を参照されたい。従って、例えば、Applied Biosystems Peptide Synthesizer Model 430A or 431 又は AAPPTEC multichannel synthesizer APEX 396 上で側鎖保護アミ
ノ酸を用いる、ｔ−Ｂｏｃ或いはＦ−ｍｏｃ化学の何れかで保護したα−ＮＨ２と固相合成の自動化メリフィールド（Merrifield）技術を用いてペプチドを合成できる。
本明細書に記載されているペプチドの作成の１つの方法は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を用いている。Ｃ末端アミノ酸を、リンカー分子を用いて酸に不安定な結合を介して、架橋ポリスチレン樹脂に付着する。この樹脂は合成に用いる溶媒に不溶であり、比較的単純に迅速に、過剰な試薬及び副生成物を洗い流す。Ｎ末端を、酸に安定でであるが、塩基で除去できる、Ｆｍｏｃ基で保護する。何れの側鎖官能基も塩基に安定で酸に不安定な基で保護する。
より長いペプチドも天然の化学連結反応を用いて個々の合成ペプチドを結合して作成できる。あるいは、より長い合成ペプチドを周知の組み替えＤＮＡ技術によって合成できる。このような技術は詳細なプロトコルと共に周知の標準マニュアルに記述されている。本発明のペプチドをコードするコード配列を構築するために、アミノ酸配列を逆翻訳して、好ましくはその中の遺伝子が発現すべきものである有機体に最適なコドンを用いて、アミノ酸配列をコードする核酸配列を得る。次に、通常、ペプチド及び、必要により何れかの調節エレメントをコードするオリゴヌクレオチドを合成することによりコード配列を作成する。コード配列を適切なクローニングベクターに挿入して宿主細胞に導入する。更に、炭化水素架橋のための非天然アミノ酸を組み込めるように、宿主細胞に遺伝子組み換えを行う。次いで、選択発現系及び宿主に相応しい適切な条件下でペプチドを発現する。Liu et al. Proc. Nat. Acad. Sci (USA), 94:10092-10097 (1997) を参照されたい。標準的
な方法によってペプチドを精製して特徴付ける。
ハイスループットで、コンビナトリアルな手法、例えば、Advanced Chemtech/APPTTEC から入手可能なような、ハイスループット多チャンネルコンビナトリアルシンセサイザーを用いてペプチドを作成することができる。
抗ウィルス活性のアッセイ
本発明の構造的に拘束されたペプチドの、又は本発明の構造的に拘束されたペプチドに対して産生された抗体の、インビトロ或いはインビボで、又は好ましくは両方で、膜融合を阻害する及び／又は抗ウィルス活性を示す能力を評価する方法が、本明細書に記載されている。特に、このようなアッセイが以下に及び実施例中に記載されている。抗ウィルス活性を評価するための更なるアッセイは当業者に周知である。抗ウィルス活性を確認する方法は本発明を限定しない。
拘束されたペプチド又は本発明のペプチドに対して産生された抗体によって示される抗ウィルス活性は、例えば、容易に実施できるインビトロアッセイ、合胞体形成を阻害するペプチドの能力、又は無細胞ウィルスによる感染を阻害するそれらの能力を試験できる、本明細書に記載されていて当業者に公知のものなどによって測定できる（Madani, N., et al., Journal of Virology, 2007. 81(2): p. 532-538; Si, Z.H., M. Cayabyab, and J. Sodroski, Journal of Virology, 2001. 75(9): p. 4208-4218; Si, Z.H., et al., PNAS USA, 2004. 101(14): p. 5036-5041）。
これらのアッセイを用いて、ペプチド又はそれから誘導される抗体の、所定のウィルス株に対して示す、相対抗ウィルス活性としての及び／又はペプチド又は誘導された抗ペプチド抗体の株特異的阻害活性としてのそのようなパラメータを確認することができる。本発明のペプチド及び抗体の阻害活性を、構造的に拘束されていない（例えば、天然の配列を有している）対照ペプチド、又は対照抗体（例えば、免疫前抗体、非特異的免疫グロブリン）と、それぞれ比較することができる。
ペプチドの又は抗体の抗ウィルス能力を試験するアッセイは本発明で意図されている。
ＨＩＶを例にとってみると、無細胞ＨＩＶによるＣＤ−４＋細胞の感染を阻害するペプチドの又は抗体の能力を試験するために、逆転写酵素（ＲＴ）アッセイを用いることができる。このようなアッセイは、適切な濃度（すなわち、組織培養５０％感染用量（ＩＤ５０））のウィルス及びＣＤ−４＋細胞を、試験するペプチド又は誘導抗体の存在下で培養することを含有できる。当該技術分野で周知の培養条件を用いる。ペプチド又は抗体を加えていない対照培養に加えて、広範囲濃度のペプチド又は抗体を用いることができる。適切な培養期間（例えば、７日間）培養した後、標準的な手法を用いて無細胞上澄液を調製して、成功裏の感染を測定値としてＲＴ活性の存在について試験する。ＲＴ活性は標準的な技術、例えば、Goff et al. (Goff, S. et al., 1981, J. Virol. 38:239-248) 及び／又は Willey et al. (Willey, R. et al., 1988, J. Virol. 62:139-147) に記載されてい
るもの等を用いて試験できる。これらの参考文献はその全てが参照により本明細書に取り込まれている。
当業者に周知の標準的な方法を、非レトロウィルス活性をアッセイするために用いることができる。呼吸器合胞体ウィルス及びパラインフルエンザ活性のアッセイ技術の検討に関して、例えば、Pringle et al. (Pringle, C. R. et al., 1985, J. Medical Virology 17:377-386) を参照されたい。更に、このような技術の総説として、例えば、“Zinsser Microbiology”, 1988, Joklik, W. K. et al., eds., Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 19th ed. を参照されたい。これらの参考文献はその全てが参照により本明細書に取り込まれている。
本発明の構造的に拘束されたペプチド、及びそれらを標的にする適切な抗体は、エンフビルチド耐性ＨＩＶ株において感染及び合胞体形成を阻害できる。修飾ポリペプチドのこれらエンフビルチド耐性ＨＩＶ株を処置する能力をアッセイするための１つの適切な方法は、Root, M.J., M.S. Kay, and P.S. Kim, Science, 2001. 291(5505): p. 884-888 に
記載されているような５−螺旋バンドルアッセイである。
つまり、５−螺旋バンドルアッセイは、耐性突然変異体を組み込んでいる螺旋バンドルペプチドを包含するだろう。ＦＩＴＣで標識した構造的に拘束されたｇｐ４１化合物又はそこに生じた抗体をこれらの変異５−螺旋バンドルタンパク質に対してスクリーニングして、何れかの構造的に拘束されたｇｐ４１化合物が耐性ウィルス株中でＨＲドメイン変異にもかかわらず、活性を保持しているか否かを確認する。ＦＩＴＣで標識した変異体である構造的に拘束されたｇｐ４１ペプチド（例えば、図７、９、及び１０にあるｍＳＡＨ−ｇｐ４１化合物）化合物又は標的抗体を、突然変異５−螺旋バンドルタンパク質に対する結合親和性、及び初期耐性株を用いるＨＩＶ感染性の抑制についてスクリーニングすることができる。
一態様では、本発明の構造的に拘束されたペプチド及びそこに生じた抗体を、ＨＩＶ分離株における耐性の漸進的変化をモニタリングするために用いることができる。構造的に拘束されたｇｐ４１化合物又はそれを標的とする抗体への潜在的な耐性の漸進的変化を調べるために、ＨＩＶ株を、細胞培養中で構造的に拘束されたｇｐ４１化合物又はそれを標的とする抗体の漸増する濃度の存在下で培養できる。耐性株の遺伝子型を同定して耐性の漸進的変化をモニタリングする（Dwyer et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 104:12772 (2007)を参照されたい）。本発明の１つの修飾ペプチドに対する耐性は別の変異体に対する
感受性に影響を及ぼさないので（Ray, N., et al., Journal of Virology, 2007. 81(7): p. 3240-3250）、処置にはＨＩＶの耐性株の進展を治療又は阻止できる、異なる構造的
に拘束されたｇｐ４１ポリペプチド又はそれを標的とする抗体の組み合わせを包含できることが意図されている。
インビボアッセイも、例えば、本発明のペプチド及びそこに生ずる抗体の抗ウィルス活性を試験するために用いることができる。インビボアッセイは、本発明の構造的に拘束されたペプチドの抗原性を確認するためにも用いることができる。抗ＨＩＶ活性を試験するために、例えば、Barnett et al. (Barnett, S. W. et al., 1994, Science 266:642-646、参照により本明細書に組み込まれている）に記載されているインビボモデルを用いることができる。
さらに、抗ＲＳＶ活性を、ＲＳＶプラークアッセイを用いてインビトロで、そして周知のマウスモデル（Kong et al., Virology J. 2:3 (2005)）を介してインビボでアッセイ
することができる。例えば、ＲＳＶを多種の近交系マウスに経鼻的に投与できる。全ての系の肺の中にウィルスが再現するが、Ｐ／Ｎ、Ｃ５７Ｌ／Ｎ及びＤＢＡ／２Ｎマウスにおいて最も高い力価が得られる。ＢＡＬＢ／ｃマウスの感染は、リンパ球浸潤によって特徴つけられる無症候性細気管支炎及び肺組織の１０４〜１０５ｐｆｕ／ｇの肺ウィルス力価をもたらす（Taylor, G. et al., 1984, Infect. Immun. 43:649-655）。ＲＳＶのコットン（Cotton）ラットモデルも周知である。コットンラットの鼻及び肺にウィルスが高力価で再現するが、あるとしてもごく僅かの炎症の兆候を引き起こす。修飾ウィルス性ペプチドの有効性を評価するための更なるアッセイは当業者に周知であって、例えば、合胞体形成又はウィルス感染の阻害を確認するアッセイを用いることである。
医薬組成物及び投与経路
１つ又はそれ以上の本発明の構造的に拘束されたペプチドをＨＩＶ感染及びＡＩＤＳの予防及び／又は治療のための医薬組成物中で用いることができる。医薬用薬剤の組み合わせは、複雑で危険な疾患、例えば、ＨＩＶ感染及びＡＩＤＳ等の治療によく用いられている（プロテアーゼ阻害剤カクテル）。本明細書に提供されている治療及び予防方法は、構造的に拘束されたペプチドの組み合わせを用いて実施でき、これらは耐性の進展を予防するように選択及び組み合わせることができるか、或いは特定の株又は対象に感染しているウィルスの株に基づいて選択及び組み合わせることができる。同様に、ウィルスの高い変異頻度、及び多数の株に起因して、ペプチドの組み合わせはしばしば、ワクチンの製造のために用いられる。例えば、本発明の医薬組成物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又はそれ以上の構造的に拘束されたペプチドを包含できる。構造的に拘束されたペプチドは、他の薬剤、例えば、抗ウィルス剤、ワクチンのアジュバント、ＤＮＡワクチンと組み合わせることができる。
本発明の構造的に拘束されたペプチドの１つ又はそれ以上に対して生じた１つ又はそれ以上の抗体（例えば、ポリクローナル、モノクローナル）をＨＩＶ感染又はＡＩＤＳの予防及び／又は治療のために用いることができる。本明細書に提供されている治療及び予防方法を、耐性の進展を阻止するように選択して組み合わせることができるか、或いは特定の株又は対象に感染しているウィルスの株に基づいて選択して組み合わることができる。
例えば、本発明の医薬組成物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又はそれ以上の抗体を包含できる。構造的に拘束されたペプチドに対して産生した抗体は、他の薬剤、例えば、抗ウィルス剤、ワクチンと組み合わせることもできる。
本明細書で用いられる、本発明の化合物は、それらの薬学的に許容される誘導体を包含すると定義されている。「薬学的に許容される誘導体」は、薬学的に許容される塩、エステル、エステルの塩、又は被投与者に投与すると、本発明の化合物を提供できる（直接的、又は間接的に）本発明の化合物のその他の誘導体を意味する。特に好適な誘導体は、このような化合物を哺乳動物に投与すると本発明の化合物のバイオアベラビリティーを増大するもの（例えば、経口投与された化合物がより容易に血液に吸収されること、血清安定性を増大し、或いは化合物の除去速度を減少することを可能にして）、又はその親の種と比較して、親化合物の生体領域（例えば、脳又はリンパ系）への送達を増強するものである。誘導体は、水溶性又は腸膜を介する能動輸送を増大する基を本明細書に記載されている式の構造に適用した誘導体を包含する。
本発明の化合物は、選択的な生物学的特性を増強するために適切な機能性を付加して修飾することができる、このような修飾は当該技術分野において公知であって、目的の生体領域（例えば、血液、リンパ系、中枢神経系）内への生物学的な透過を増大するもの、経口アベイラビリティーを増大するもの、注射投与を可能にする溶解性を増大するもの、代謝を変えるもの、そして排泄速度を変えるようなものを包含する。本発明の化合物の薬学的に許容される塩は、薬学的に許容される無機及び有機の酸並びに塩基から誘導されるものを包含する。適切な酸塩の例は、酢酸塩、アジピン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、パルモ酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩及びウンデカン酸塩を包含する。適切な塩基から誘導される塩は、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）、アンモニウム及びＮ−（アルキル）４＋塩を包含する。本発明は本明細書に開示されている化合物の何れかの塩基性窒素含有基の４級化も意図している。水溶性又は油溶性或いは分散性産物をこのような４級化によって得ることができる。
本発明の化合物は、例えば、注射、静脈内、動脈内、真皮下、腹腔内、筋肉内、又は皮下注射で；又は経口で、経口腔で、経鼻で、系粘膜で、膣内に、子宮頸部内に、局所的に、点眼用製剤で、又は吸入で、約０．００１〜約１００ｍｇ／体重ｋｇの用量範囲で、又は特定薬剤の要件に従って、そしてより好ましくは０．５〜１０ｍｇ／体重ｋｇを投与できる。本明細書に記載の方法は、所望の或いは定められた効果を達成するための化合物又は化合物組成物の有効量の投与を意図している。
化合物がワクチン接種／免疫付与のために用いられる場合は、担体タンパク質（複数も）と結合して当該技術分野で公知のワクチン組成物を用いるアジュバントと組み合わせた、構造化ポリペプチド化合物を極めてまれに投与することが望ましい。ある特定の実施態様では、化合物を注射、例えば、筋肉内、皮下、又は腹腔内注射で送達して全身応答を引き起こす。或いは、または更に、免疫付与のために構造化ペプチドを粘膜経路、例えば、経口で、口腔に、膣内に、直腸内に、鼻内に、吸入で送達すべきである。好ましい実施態様では、化合物を生涯に１回、約２０年毎に１回、約１５年毎に１回、約１０年毎に１回、約５年毎に１回、約２年毎に１回、約１年毎に１回投与する。ある特定の実施態様では、化合物を比較的短い期間にわたって（例えば、１年以内、９ヶ月以内、６ヶ月以内、４ヶ月以内、３ヶ月以内、２ヶ月以内、１ヶ月以内に）複数回、例えば、２、３、４、５、６回又はそれ以上投与すると、その後、その間に化合物の更なる投与を必要としない免疫力の持続期間（例えば、５年、１０年、２０年、又はそれ以上）が続く。
投与する組成物が、本発明の構造化ペプチドのうちの１つで免疫した対象のＢ細胞を用いて作成したハイブリドーマ細胞により作成されたモノクローナル抗体を含む、本発明の構造化ペプチドの１つ又はそれ以上に対して作成した抗体である場合は、投与回数は免疫付与の場合より高い頻度であるだろう。更に、治療用又は予防用としての使用、ウィルス量、慢性又は急性の治療としての使用かによって、同じ対象に対して抗体の用量を徐々に変えることができる。例えば、抗体を１日当り１回又はそれ以上；１週間当り１回又はそれ以上；１ヶ月当り１回又はそれ以上；１年当り１回又はそれ以上投与することができる。投薬は、感染のモニタリングと組合せて、ウィルス紅斑に応答して等で確認できる。
単回剤形を作成するために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は治療される宿主及び特定の投与方法に基づいて変化するだろう。典型定期な製剤は約１％〜約９５％（ｗ／ｗ）の活性化合物を含有しているだろう。或いは、そのような製剤は約２０％〜約８０％の活性化合物を含有している。
上で挙げたものより低い或いは高い用量も必要とされるだろう。何れかの特定患者に対する特定の用量及び治療計画は、使用される特定化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食習慣、投与時期、排泄速度、薬剤の組み合わせ、疾患の重症度及び経過、状態又は症状、患者の病気への罹りやすさ、状態又は症状、及び治療医の判断を含む、多種の要因によって決まる。
必要であれば、本発明の化合物、組成物又は組み合わせの維持用量を、患者の状態の改善によって、或いは感染を予防するために、投与することができる。続いて、症状の機能として、改善された症状が保持されているレベルまで、投与の用量又は頻度、或いはその両方を減少することができる。しかしながら、患者は何れかの病徴の再発（例えば、ＨＩＶウィルス量の増大）に基づき長期に渡って間欠的な治療を必要とする。
本発明の医薬組成物は、本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩；追加の薬剤、例えば、これに限定されないが、ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤（ＮＡＲＴＩｓ又はＮＲＴＩｓ）、プロテアーゼ阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤、のそれぞれの１つ、２つ、又はそれ以上の何れかの組み合わせを包含する、ウィルス感染の予防及び／又は治療、特にＨＩＶ感染の予防及び／又は治療のための１つ又はそれ以上の治療薬剤；及び薬学的に許容される担体、アジュバント又は賦形剤の何れかを含有している。本発明の別の組成物は、本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩；及び薬学的に許容される担体、アジュバント又は賦形剤を含有している。本明細書で説明されている組成物は、本明細書で説明されている本発明の化合物を、更に追加の治療薬剤（例えば、薬剤、ワクチン、抗体）も、存在するなら、ＨＩＶが介在する疾患又はその症状を含む、疾患又は症状の調節を達成するのに有効な量で、包含する。
用語「薬学的に許容される担体又はアジュバント」は、本発明の化合物と共に患者に投与できて、その薬理活性を失わせず、そして化合物の治療量を送達するのに十分な用量を投与したときに非毒性である担体又はアジュバントを示す。
本発明の医薬組成物中で用いることができる担体、アジュバント及び賦形剤は、これに限定されないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、自己乳化型送達システム（ＳＥＤＤＳ）（例えば、ｄ−α−トコフェロールポリエチレングリコール１０００コハク酸エステルなど）、医薬剤形中で用いられる界面活性剤（例えば、ツイーン（登録商標）又はその他の類似ポリマー送達マトリックス）、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミンなど）、緩衝物質（例えば、リン酸など）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリン混合物、水、塩又は電解質（例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩など）、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースからなる物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロック重合体、ポリエチレングリコール、及び羊毛脂を包含する。シクロデキストリン、例えばα−、β−、及びγ−シクロデキストリンなども本明細書に記載されている式の化合物の送達を増強するために有利に用いられる。
本発明の医薬組成物は経腸的に、例えば、経口投与で、非経口で、吸引スプレーで、局所的に、経直腸で、経鼻で、経口腔で、膣内に、又は移植リザーバーを介して、好ましくは経口又は経膣投与で又は注射による投与で、投与することができる。本発明の医薬組成物は、何れかの従来型の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバント又は賦形剤を含有することができる。ある場合は、製剤のｐＨを、製剤化した化合物又はその送達形態の安定性を増大するように薬学的に許容される酸、塩基又は緩衝剤を用いて調節できる。本明細書で用いられる用語、非経口は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、基質内（intrastemal）、鞘内、病巣内及び頭蓋内注射又は輸液手法を包含する
。
剤形の例は、これに限定されないが、錠剤；カプレット；カプセル剤、例えば、軟カプセル剤など；カシェー剤；トローチ剤；分散剤；懸濁剤；軟膏剤；パップ剤（湿布剤）；ペースト剤；粉剤；包袋剤；クリーム剤；膏肓；溶液；パッチ剤；エアゾール（例えば、経鼻スプレー又は吸入剤）；ゲル剤；懸濁液（例えば、水性又は非水性液体懸濁液、水中油型乳剤、油中水型乳剤）、溶液、及びエリキシルを包含する、患者への経口又は経粘膜投与に適している液体剤形；患者への非経口投与に適している液体剤形；及び患者への非経口投与に適している液体剤形をもたらすように再構成できる無菌の固体剤（例えば、結晶形の又は無晶形の固体）を包含する。
医薬組成物は無菌の注射製剤の形態、例えば、無菌注射用水性又は油性懸濁液としての形態にできる。この懸濁液は、適当な分散又は湿潤剤（例えば、ツイーン（登録商標）８０など）及び懸濁化剤を用いる当該技術分野で公知の技術に従って製剤化できる。無菌注射用製剤は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中で、例えば、１，３−ブタンジオールの溶液としての、無菌注射用溶液又は懸濁液であってもよい。利用可能な許容される賦形剤及び溶媒は、マンニトール、水、リンゲル溶液及び生理食塩水である。また、無菌、固定油は溶媒または懸濁媒体として通常に用いられる。この目的のために、合成モノ−又はジ−グリセリドを包含する、何れかの無菌性固定油を使用できる。脂肪酸、例えば、オレイン酸及びそのグリセリド誘導体などは、天然の薬学的に許容される油類、例えば、オリーブ油又はヒマシ油、特にそのポリオキシエチレン化型などのように、注射剤の製造に有用である。これらの油溶液又は懸濁液は、薬学的に許容される剤形、例えば、乳剤及び／又は懸濁剤の製剤化に通常用いられている、長鎖アルコール希釈剤又は分散剤、又はカルボキシメチルセルロース或いは類似の分散剤も含有することができる。その他の通常用いられている界面活性剤、例えば、ツイーン又はスパンなど及び／又は薬学的に許容される固体、液体、又はその他の剤形の製造に通常用いられているその他の類似乳化剤又はバイオアベイラビリティー増強剤も製剤化の目的で用いられてもよい。
本発明の医薬組成物は、これに限定されないが、カプセル剤、錠剤、乳剤及び水性懸濁剤、分散剤、及び溶液を包含する、経口に許容される何れかの剤形で、経口投与することができる。経口使用のための錠剤の場合に、通常用いられる担体は、乳糖及びトウモロコシ澱粉を包含する。滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムなども通常添加される。
カプセル形態における経口投与のために、有用な希釈剤は乳糖及び乾燥トウモロコシ澱粉を包含する。水性懸濁液及び／又は乳剤を経口で投与する場合は、活性成分を油層に懸濁又は溶解でき、これを乳化剤又は懸濁化剤と混合する。所望により、特定の甘味剤及び／又は着香料及び/又は着色剤を添加することができる。
本発明の医薬組成物を、経直腸投与用の坐剤の形態で投与することもできる。これらの組成物は、本発明の化合物を、室温では固体であるが、直腸の温度では液体であるので直腸内で溶解して活性成分を放出する非刺激性の賦形剤、と混合して製造できる。このような物質は、これに限定されないが、ココアバター、蜜蝋及びポリエチレングリコールを包含する。
本発明の医薬組成物は局所的に又は膣内に投与できる。この医薬組成物は、担体に懸濁又は溶解した活性成分を含有している適切な軟膏を用いて製剤化される。本発明の化合物の局所投与のための担体は、これに限定されないが、鉱物油、液化石油、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワック
ス及び水を包含する。あるいは、医薬組成物は、担体に懸濁又は分散させた活性化合物を含有している適切なローション又はクリームと製剤化できる。更に別の実施態様では、医薬組成物は膣リングとして製剤化される。適切な担体は、これに限定されないが、鉱物油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール及び水を包含する。本発明の医薬組成物は、直腸坐薬製剤によって、又は適切な浣腸製剤で下部腸管に局所的に適用することもできる。局所用経皮パッチ及びイオントフォレティック投与も本発明に含まれる。一実施態様では、本発明の化合物を、性感染症、例えば、ＨＩＶの予防的治療として、膣内に投与する。
本発明の医薬組成物は経鼻エアゾール又は吸入によって投与することができる。このような組成物は、医薬製剤の技術分野で周知の技術に従って製造され、そしてベンジルアルコール又はその他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティーを増強する吸収促進剤、フッ化炭素、及び／又は当該技術分野で公知の溶解又は分散剤を用いて、生理食塩水の溶液として製剤化できる。
本発明の医薬組成物が本明細書に記載されている式の化合物と１つ又はそれ以上の追加の治療又は予防薬との組み合わせを含有している場合は、化合物及び追加の薬剤の両方を、単独治療計画で通常投与される用量の約１〜１００％の間の、より好ましくは約５〜９５の間の用量レベルで存在させるべきである。追加の薬剤を多剤投与計画の一部として、本発明の化合物と、別々に投与できる。あるいは、これらの薬剤を、単一組成物中で本発明の化合物と共に混合して単一剤形の一部とすることができる。
ＨＩＶに関しては、本発明の本明細書で標的としているペプチド又は抗体をＨＩＶ感染及び／又はＡＩＤＳの治療における治療剤として用いることができる。また、本明細書で標的としているペプチド又は抗体は、ＨＩＶウィルスへの急性暴露後の、以前は感染していなかった個人における予防手段（例えば、暴露後予防）として用いることができる。本明細書で標的としているペプチド又は抗体のこのような予防的使用の例は、これに限定されないが、母から乳児へのウィルス感染及び、ＨＩＶ感染が存在する可能性があるその他の状況、例えば、性的感染など、又は従業者がＨＩＶ含有血液製剤に暴露される医療の場における事故、の予防を包含する。
投与される本発明の明細書で標的にしているペプチド又は抗体の有効用量は、生物学的半減期、バイオアベイラビリティー、及び毒性のようなパラメータを扱っている、当業者に周知の手段を介して決定できる。
治療有効量は、患者における症状の改善又は生存の延長を十分にもたらす化合物又は抗体の量を示す。このような化合物又は抗体の毒性及び治療効果は、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬剤手順によって（例えば、ＬＤ５０（群の５０％が致死する用量）及びＥＤ５０（群の５０％に治療効果がある用量）を測定して、確認できる。毒性と治療効果の間の用量比は、治療指数であって、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表される。大きい治療係数を示す化合物又は抗体が好ましい。これらの細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータはヒトで使用する用量の範囲を策定するために用いることができる。このような化合物又は抗体の用量は毒性が殆ど無いＥＤ５０を包含している血中濃度の範囲内に存在していることが好ましい。この用量は用いられる剤形及び用いられる投与経路に基づいてこの範囲内で変化してよい。本発明の方法で用いられる何れかの化合物又は抗体に関しては、治療有効用量は最初に細胞培養アッセイから推定される。用量は動物モデルにおいて、細胞培養で測定されたようなＩＣ５０（例えば、融合事象の阻害を最大の半数もたらす、例えば、試験化合物が存在していない事象の量と比較して、ウィルス感染を最大の半数阻害するなどの、試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度をもたらすように策定される。このような情報を、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために用いることができる。血漿中の濃度は、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又は質量分析（ＭＳ）で測定できる。
予防ワクチン
本発明のペプチドは、ＨＩＶ感染の前及び、感染の初期段階による免疫系が全く未変化（例えば、十分に高いＣＤ＋４細胞数）であるか又は抗ウィルス剤での治療が成功しているＨＩＶ感染を有している可能性がある対象の両方で、ここにおいて宿主が本発明のペプチドに対して抗体を産生し、次いでウィルス（例えば、ＨＩＶ、ＲＳＶ、インフルエンザ、パラインフルエンザ、コロナウィルス、エボラウィルス）を、例えば、更なる感染を阻害し或いはウィルスに感染した細胞を取り除いて、中和するのに役立つ、ワクチンとして用いることができる。予防ワクチンとしての本発明のペプチドの投与は、従って、例えば細胞へ感染するウィルスの能力を阻害して、ウィルスを十分に中和する免疫応答を高めるのに有効な１つ又はそれ以上のペプチドの濃度を宿主に投与することを含んでいる。正確な濃度は投与すべき特定のペプチドによって決まるが、当業者に周知である、免疫応答の進展をアッセイする標準的な技術を用いて確認できる。ワクチンとして用いられるペプチドは通常筋肉内に投与される。しかしながら、抗ウィルスワクチンは、粘液の表面、例えば経口で、膣内に、直腸内に、経鼻で、経肺等でも投与でき、ウィルス侵入の通常部位に粘膜免疫応答を産生する。
ペプチドを担体及び／又は免疫応答を増強するためのアジュバントとともに製剤化することができる。アジュバントは、これに限定されないが、鉱物ゲル、例えば、水酸化アルミニウムなど；界面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン；その他のペプチド；油乳剤；及び潜在的に有用性のあるヒトアジュバント、例えば、ＢＣＧ及びコリネバクテリウム・パルバムなどを包含する。本明細書に記載されているワクチン製剤をもたらすために多くの方法を用いることができる。これらの方法は、これに限定されないが、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、及び鼻内経路を包含する。
あるいは、本発明のペプチドに対して産生したポリクローナル又はモノクローナル抗体の有効濃度を、非感染細胞がウィルスに感染しないように、宿主に投与することができる。このような抗体の正確な濃度は、それぞれの特定の抗体製剤によって変化するが、当業者に周知の標準的な技術を用いて確認することができる。抗体の投与は、これに限定されないが、本明細書に記載されているものを含む、多種の技術を用いて実施できる。
一態様では、本発明は、本発明の構造的に拘束されたペプチドに対する抗体を作成する方法に関する。方法は、構造的に拘束されたポリペプチドに対する抗体を作成するように、本発明の修飾ポリペプチドを対象に投与することを包含している。
本発明の構造的に拘束されたペプチドによる対象への免疫付与の後に、周知の方法を用いて、中和抗体又はＢＮＡｂが作成されているか否かを確認するために対象を試験することができる。例えば、血液試料を対象から得て、インビトロアッセイにおいて血清中に存在する抗体がウィルス感染又は融合を阻害することができるか否かを確認するために試験する。このようなアッセイは、１つ以上のウィルス株を用いて、又は薬剤耐性ウィルス株、例えば、エンフビルチド耐性ＨＩＶ株に対して実施することができる。中和抗体又はＢＮＡｂを生成した免疫応答を有する対象（ヒト又は非ヒト対象）を同定した上で、Ｂ細胞をその対象から採取して、モノクローナル抗体を産生するためのハイブリドーマ細胞の作成に用いることができる。モノクローナル抗体は中和抗体又はＢＮＡｂとしてのそれらの活性を試験でき、そして中和抗体又はＢＮＡｂを更に特徴付けることができる。
別の実施態様では、対象が中和抗体又はＢＮＡｂを生成しているかを確認する前に、免疫化した対象からＢ細胞を採取し、そして融合してハイブリドーマ細胞を生成することができる。次いで、本明細書に提供されている何れかの方法を用いて、モノクローナル抗体が中和抗体又はＢＮＡｂを有しているか否かを確認するためにそれらを試験することができる。
中和抗体又はＢＮＡｂが非ヒト動物中で生じた場合は、ＣＤＲを非ヒトのフレームワークからヒトのフレームワークへ転写して、ヒトへ投与するために適している抗体を生成することができる。抗体をヒト化してヒト投与にふさわしい抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。フレームワークは、天然のヒト抗体フレームワーク（例えば、ＩｇＧ）、又は人工のフレームワーク、例えば、治療又はその他の所望目的に用いるためのｓｃＦｖなどを包含できる。
更に別の態様では、本発明は、構造的に拘束されたポリペプチドを特異的に結合する抗体に関していて、ここでこの修飾ポリペプチドは、配列番号３９〜８０（ここで、Ｘは何れかのアミノ酸であって、更に炭化水素架橋で連結されているアミノ酸残基を特定し、そしてＢはメチオニン又はノルロイシンである）の何れかに記載の配列を有する本明細書で提供されている構造的に拘束されたペプチドの少なくとも３、好ましくは７連続アミノ酸を含有する何れかの配列のアミノ酸配列を有している。
キット
本発明は、完成した、包装した、そしてラベル付の医薬品又は実験試薬も包含する。製品は適当な瓶又は容器、例えば、密封されているガラス瓶又はその他の容器などの中に適切な使用説明書を包含している。医薬品は、例えば、第１容器内に単位剤形の本発明化合物、及び第２容器内に無菌水又は注射用アジュバントを含有できる。あるいは、単位剤形は、経口、経皮、経鼻、膣内、子宮頸部リング、又は局所送達に適している固体であってよい。
特定の実施態様では、単位剤形は静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻内、経口、膣内、子宮頸部、局所又は皮下送達に適している。従って、本発明は、好ましくは無菌で、それぞれの送達経路に適している溶液、固体、発泡体、ゲルを包含する。
何れかの医薬品と同様に、包装材料及び容器は保管中又は輸送中に製品の安定性を保護するように設計されている。更に、本発明の製品は、医師、技術者、又は患者に問題の病気又は疾患を如何に適切に予防又は治療するかをアドバイスする使用説明書又はその他の情報資料を包含する。つまり、製品は、これに限定されないが、実際の用量、モニタリング手法（例えば、感染の検出及び定量）、及びその他のモニタリング情報を包含している、投与計画を明示又は示唆する説明書を包含している。
特に、本発明は、包装材料、例えば、箱、ボトル、筒、バイアル、容器、噴霧器、吸入器、静注（ｉ．ｖ．）バッグ、包装袋など；及び当該包装材料中に含有されている医薬品の少なくと１つの単位剤形を包含している製品を提供し、ここで、当該医薬品は本発明の化合物を含有し、そして当該包装材料は、本明細書に記載されているように特定の用量で投与し特定の投与計画を用いることによって、ウィルス性疾患に関連する１つ又はそれ以上の症状を予防、管理、治療、及び／又は改善するか、又はウィルス性疾患を予防するための免疫応答を刺激するために当該化合物を用いることができることを明示する使用説明手段を包含している。
以下の実施例は、本発明の各種態様の説明としてのみ提供されていて、決して本発明を限定することを意図していない。
実施例１．材料及び方法
炭化水素架橋α螺旋ポリペプチドの合成
構造分析と化学合成の組み合わせ戦略を、修飾された、構造的に拘束されたペプチドを構築するために適用した。α，α−ジ置換アミノ酸の不斉合成を既に報告されているように実施した（Schafmeister, C.E., J. Po, and G.L. Verdine, Journal of the American Chemical Society, 2000. 122(24): p. 5891-5892; Walensky, L.D., et al., Science, 2004. 305(5689): p. 1466-1470）。２、３又は６アミノ酸を隣接する分離する位置、
すなわち、それぞれ「ｉ、ｉ＋３」、「ｉ、ｉ＋４」又は「ｉ、ｉ＋７」位置で少なくとも２個の天然アミノ酸をα，α−ジ置換非天然アミノ酸で置換して、修飾ポリペプチド化合物を生成した。
非天然アミノ酸及びその後の炭化水素架橋（複数も）の位置をＮ３６相互作用を妨げないように注意深く選択した（Chan, D.C., et al.,. Cell, 1997. 89(2): p. 263-273）。
位置ａ及びｄにある残基はＮ３６と直接相互作用するのに対して、残基ｅ及びｇは６螺旋バンドルの距離によってＮ３６コアに接触する。残基ｂ、ｆ、及びｃはα螺旋の反対面に限局しているので炭化水素架橋（複数も）で置換するために理想的に位置している。ＭＰＥＲドメインにおける炭化水素架橋の位置決めについても同様な選択を行った。
固相Ｆｍｏｃ化学及びルテニウム触媒オレフィンメタセシスを用い、次いでペプチド脱保護及び開裂、逆相高速液体クロマトグラフィーによる精製、及びＬＣ／ＭＳ質量分析及びアミノ酸分析を用いる化学的特徴付けによって、修飾ポリペプチドを生成した。
あるいは、確立されている断片を用いる手法を遂行できる（[Bray, B.L.. Nature Reviews Drug Discovery, 2003. 2(7): p. 587-593; MYUNG-CHOL KANG, B.B., et al., Methods and compositions for peptide synthesis, U.S.P.a.T. Office, Editor. January 18, 2000 USA）。この戦略では、ペプチドを３つの断片に分けて、Ｎ末端、中央、及びＣ
末端部分を別々に合成する。これらのポリペプチド断片は、超酸開裂樹脂上で、固相Ｆｍｏｃ化学及びルテニウム触媒オレフィンメタセシスを用いて生成するべきであり、これはＮ末端にＦｍｏｃを有し、及びＣ末端アミド（Ｃ末端断片について）或いは遊離カルボン酸（中央及びＮ末端断片について）の何れかを有する完全に保護されたペプチドを生じる。これらの完全に保護された断片を逆相高速液体クロマトグラフィーで精製し、次いで、逐次的脱保護、カップリング、及び精製して全長の完全に保護されたポリペプチドを生成する。全体的な脱保護、次いで逆相高速液体クロマトグラフィーによって最終産物が生成し、これはＬＣ／ＭＳ質量分析及びアミノ酸分析によって特徴付けられるだろう。
架橋ペプチドの合成。ＲｉｎｋアミドＡＭＬＬ樹脂（EMD Biosciences、０．２ミリモ
ル／樹脂ｇ）を５０ミリモルスケールで用いて、Ａｐｅｘ３９６（Aapptec）自動ペプチ
ドシンセサイザー上でペプチドを産生した。標準的なＦｍｏｃプロトコルを用いて２０％ピペリジン／ＮＭＰ中の脱保護を２×１０分間行い、次いで連続してメタノールとジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）でペア洗浄を実施した。組み込まれた非天然アミノ酸を２０％ピペリジン／ＮＭＰ中で４×１０分の培養処理を行って完全な脱保護を達成した。アミノ酸カップリングをＦｍｏｃ保護化アミノ酸の０．４Ｍストック液、０．６７Ｍの２−（６−クロロ−１Ｈ−ベンソトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウム・ヘキサフルオロリン酸（ＨＣＴＵ）、及び２ＭのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を用いて実施すると、０．２Ｍ活性エステルが１ｍＬ（４当量）得られた。カップリング回数及び培養時間は、標準的な残基については２×３０分で、オレフィンの非天然アミノ酸については２×４５分で、そして非天然アミノ酸に続く残基については３×４５分であった。オレフィンメタセシス工程は、最初に樹脂を１，２−ジクロロエタンで膨張させ、次いで１，２−ジクロロメタン（樹脂置換に基づいて０．２０モル％）中のビス（トリシクロヘキシルホスフィン）−ベンジリデンルテニウム（ＩＶ）ジクロライド（第１世代グラブス触媒）の１０ｍＭ溶液に２時間暴露する。架橋化反応を２回実施した。次いで、樹脂に結合したペプチドを１，２−ジクロロエタンで３回洗浄して窒素気流下で乾燥する。完成したペプチドを樹脂から開裂して、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に基づく開裂カクテル、例えば、ＴＦＡ／トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）／水（９５％、２．５％、２．５％）などに暴露して、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテルで沈殿させ、次いで凍結乾燥する。凍結乾燥したＳＡＨＢペプチドをＣ１８カラムを用いて逆相ＨＰＬＣで精製する。化合物を、陽イオンモードで電気スプレーして得られる質量分析を用いる、ＬＣ／ＭＳで特徴付ける。定量は、ベックマン（Beckman）６３００高性能アミノ
酸分析器上でアミノ酸分析により達成する。
修飾ポリペプチドの二次構造及びタンパク質分解安定性の確認
架橋化して修飾したポリペプチドのα螺旋をそれらの非修飾対照物と円偏光二色性によって比較した。Ａｖｉｖ分光偏光計上２０℃で、以下の標準測定パラメータを用いて、ＣＤスペクトルを得た：波長、１９０〜２６０ｎｍ；ステップ分解能（step resolution）
、０．５ｎｍ；速度、２０ｎｍ／秒；累積（accumulations）、１０；応答、１秒；帯域
幅、１ｍｍ；路長、０．１ｃｍ。各ペプチドのα螺旋含量を、平均残基楕円率［θ］２２２ｏｂｓをモデル螺旋ペプチドについて報告されている［θ］２２２ｏｂｓで割って算出するか（Forood, B., E.J. Feliciano, and K.P. Nambiar, PNAS, 1993. 90(3): p. 838-842; J. Martin Scholtz, Biopolymers, 1991. 31(13): p. 1463-1470; Lawless, M.K., et al., Biochemistry, 1996. 35(42): p. 13697-13708）、或いは、例えば、異なった５つの二次構造比率（螺旋、平行及び逆平行βシート、β回転、及びランダムコイル）を推測するために Brohm によって開発されたＣＤＮＮソフトウェアを用いるＡｖｉｖマシン
を用いて算出した。Protein Engineering, 1992. 5(3); p. 191-195。
ハイスループット方法で合成された多種の修飾ペプチドライブラリーを評価することによる、修飾ポリペプチドの生物物理学的及び生物化学的特性の最適化
細胞及びインビボ検討用に修飾ポリペプチドの活性を最適化するためにハイスループット技術を用いた。例えば、Ａｐｅｘ３９６多チャンネルシンセサイザー（AAPPTEC; Louisville, Kentucky）を生物学的評価のためのポリペプチドライブラリーを作るために用い
た。ポリペプチド化合物を伸張、切断、又は天然及び選択非天然アミノ酸にわたるアミノ酸置換によって多様化して、識別的な架橋局在化を行って所望の生物物理学的及び生物化学的特性を最大化した。ライブラリーは、ハイスループットな固相Ｆｍｏｃ化学及びルテニウム触媒オレフィンメタセシス、並びにペプチド脱保護及び開裂を用いて生成した。ペプチドの精製は、逆相Ｃ１８ＨＰＬＣによって実施して生成物をＬＣ／ＭＳ質量分析及びアミノ酸分析で特徴付けた。
構造的に拘束されたペプチド又はそれを標的にしている抗体のＨＩＶ融合を標的にする及び阻害する能力の評価
構造的に拘束されたＨＩＶ−１ｇｐ４１ペプチドの結合活性及び機能的効果を、蛍光偏光、合胞体融合、及びＨＩＶ感染性アッセイ（ＦＰＡ）で評価した。平衡結合定数を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識化修飾ポリペプチド及び滴定された組み替え５螺旋バンドルタンパク質を用いる蛍光偏光アッセイで測定した。ＦＰＡ実験を、BMG Labtech FLUOstar 最適マイクロプレートリーダー又は SpectraMax マイクロプレー
トリーダー（Molecular Devices）、及び GraphPad ソフトウェア（Prism）を用いる非線形回帰分析で測定された解離定数を用いて実施した。最初に Root et al. によって開発
された、組み替え５螺旋バンドルタンパク質は、短いペプチドリンカーによって連結している、ｇｐ４１ヘアピンの三量体の核を含有する６つの螺旋のうちの５つを含有している（Root, M.J., M.S. Kay, and P.S. Kim, Science, 2001. 291(5505): p. 884-888）。５螺旋バンドルは第３番目のＣペプチド螺旋を欠失していて、実験条件下で溶解性で、安定で、そして螺旋性であるので、ＦＩＴＣ−修飾ポリペプチドの形態に６番目のＣペプチドを組み込むことが、結合活性の直接測定を提供した。この方法で、ペプチド配列、架橋位置、及び架橋数が異なっている修飾ポリペプチドを、構造忠実度に代わるものとして最大結合活性についてスクリーニングすることができ、それによってＢＮＡｂを産生する免疫応答の刺激のために選択することができる。結合活性は、５螺旋バンドルをＦＩＴＣ標識化非修飾ＨＩＶ融合阻害性ペプチドと結合して、次いで非標識化架橋ｇｐ４１ペプチドを漸増濃度で添加した後、蛍光偏光を測定し、次いで上記のような、非線形回帰分析によってＫｉを算出する競合アッセイによって間接的に測定することもできる。
Frey et al.文献 の「ｇｐ４１−５」構築物に基づいて別の結合アッセイを採用できる。ｇｐ４１−５は、欠けているＣＨＲの全て又は一部を含有している添加されたペプチドと高い親和性で結合する。例えば、ｇｐ４１−５と蛍光標識化Ｃ３８（残基１１７〜１５４）を用いて、Frey et al.文献 は３．６ｎＭのＫｄを明らかにしたＦＰＡ結合曲線を作成するのに成功した（Frey, G., et al.,. PNAS, 2006. 103(38): p. 13938-13943）。
産生した抗体の活性を評価するために機能アッセイを用いることができる。培養液中でで、ＨＩＶ−１感染及び非感染ＣＤ４陽性細胞の間の直接細胞−細胞融合の結果として多核巨大細胞又は「合胞体」を形成する。合胞体形成アッセイでは、ＣＤ４受容体を発現する指標細胞株、及びＣＤ４受容体を欠如しているが表面にＨＩＶ−１タンパク質を含有している融合原性細胞株を融合して、４８時間以内に培養液中に７０〜１００の多核巨大細胞を生成する。次いで、倒立顕微鏡を用いて合胞体を集計する。構造化ｇｐ４１ペプチド又はそれを標的とする抗体の合胞体形成を阻害する用量依存性の能力を融合阻害についての機能的基準として用い、これについてＩＣ５０を決定して、そしてＴ２０及びＴ６４９、又は確立された中和抗体と比較できる（Brenner, T.J., et al. The Lancet, 1991. 337(8748): p. 1001-1005; Madani, N., et al., Journal of Virology, 2007. 81(2): p. 532-538）。
修飾ポリペプチド及びそれを標的とする抗体の直接阻害活性も、ＣＤ４陽性及びＣＣＲ５発現イヌ胸腺細胞のＨＩＶ感染を直接阻害するそれらの能力に基づいて定量できる。蛍ルシフェラーゼを発現して、示されたエンベロープグリコタンパク質を含有している、組み替えＨＩＶウィルス（例えば、ＨＸＢｃ２、ＹＵ２、及び NIH AIDS Research and Reference Reagent Program を解して入手できる更なる株）を、連続的に希釈したＨＩＶ−
１ｇｐ４１ポリペプチド又はそれを標的とする抗体の存在下でＣｆ２Ｔｈ−ＣＤ４−ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４細胞に感染させるために用いることができる。４８時間後に、細胞を溶解してルシフェラーゼ活性を定量する（Si, Z.H., M. Cayabyab, and J. Sodroski,. Journal of Virology, 2001. 75(9): p. 4208-4218 Si, Z.H., et al., PNAS, 2004. 101(14): p. 5036-5041）。同様な実験を両種性ネズミ白血病ウィルス（ＡＭＬＶ）を用いて実
施して、修飾ポリペプチド又は抗体の非特異的効果の何れかをモニターする。類似した対照アッセイを、本発明の非修飾又は非ＨＩＶポリペプチド、或いは対照抗体を用いて実施でき、これは当該技術分野で公知である。
タンパク分解酵素耐性アッセイ
ＨＩＶ−１ｇｐ４１構造化ペプチドのインビトロでのタンパク分解を、以下のパラメータを用いてＬＣ／ＭＳ（Aglient 1200）で測定した：２０μＬの注入；０．６ｍＬの流速；１０分にわたるの水（０．１％のギ酸）から２０〜８０％のアセトニトリル（０．０７５％ギ酸）への勾配からなる１５分の実行時間；４分の洗浄から開始勾配条件に戻る、及び０．５分の後時間。ＤＡＤ信号を８ｎｍの帯域幅で２８０ｎｍにセットして、ＭＳＤは、スキャンモードを一方のチャンネルを（Ｍ＋２Ｈ）／２、＋１質量ユニットに、他方を（Ｍ＋３Ｈ）／３、＋１質量ユニットにセットした。それぞれのＭＳＤ信号の積分は＞１０８カウントの曲線下領域を得た。反応試料は、ＤＭＳＯ（１ｍＭのストック）中の５μＬのペプチド、及び２ｍＭのＣａＣｌ２を含有している５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）からなる１９５μＬの緩衝液で構成されていた。０時間時点で試料を注入した後、５０ｎｇ／μＬキモトリプシン（Sigma）の２μＬを添加して、時間をかけて連続注入し
て正常なペプチドの量を定量した。アセチル化トリプトファンカルボキサミドの内部対照を１００μＭ濃度で、各ＭＳＤデータ点を正規化するために用いた。時間に対するＭＳＤ領域のプロットが指数関数的減衰曲線を生じ、Prism ソフトウェア（GraphPad）を用いる非線回帰分析で半減期を測定した。これらのアッセイは、トリプシン及びペプシンを用いてそれらの適切な緩衝条件において実施することもできた。
血漿安定性及び薬物動態
ペプチドをマウスの血漿と３７℃で培養（５〜１０μｇ）するか、又は雄生Ｃ５７／ＢＬ６マウスの尾静脈内に注射（１０、２０ｍｇ／ｋｇ）した。様々な時間間隔（例えば、０．５、１、２、４、８、１２時間；各時点当りｎ＝３）で、エクスビボ及びインビボ試料（後眼窩出血によって吸引）を定量のために処理した。エクスビボの血清安定性検討のために、ペプチドの半減期を、Prism ソフトウェア（GraphPad）を用いてプロットされた指数関数的減衰曲線の非線回帰分析で算出した。指示された時点におけるインビボ血漿濃度を、血漿半減期、ピーク血漿濃度、総血漿クリアランス、及び非コンパートメント解析を用いる分布の見掛け容量を算出するために用いた。誘導されたタンパク分解酵素耐性及びＰＫ（薬物動態）プロファィルは、インビボ適用について最も安定な構造化ＨＩＶ−１ｇｐ４１ペプチドを選択するための基準として役立つ。提案された中和能を有する構造を繰り返し、機能的な結合活性を保持し、そして安定性試験で分解耐性プロファィルを示すペプチド構築物を、中和免疫原性試験へと進める。
蛍光偏光アッセイ（ＦＰＡ）
異なった構造化ＨＩＶ−１ｇｐ４１ペプチド構築物の、中和抗体４Ｅ１０、２Ｆ５、及びＺ１３ｅ１（NIH AIDS Research and Reference Reagents Program）に対する相対親和性を直接測定して比較するためにＦＰＡを用いた。抗体を、９６ウェルのブラックコスター（black Costar）プレート中で結合緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、１００ｍＭのＮａＣｌ）中に連続希釈した後、ＦＩＴＣ誘導体化されたペプチド（２５ｎＭ）を添加した。結合活性が安定化するまで経時的に３通りの試料の結合等温線をモニタリングして平衡時間を最初に確認した。蛍光偏光（ｍＰユニット）をBMG POLARstar Optima 又
は SpectraMax プレートリーダー（Moleculer Devices）上で測定し、そして Prism ソフトウェア（GraphPad）を用いて用量応答曲線の非線形回帰分析でＫｄ値を算出した。対照ＭＰＥＲペプチドであるＦＩＴＣ−
ＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦＮＩＴＮＷＬＷＹＩＫ−ＮＨ２ と結合している４Ｅ１０抗体
のＦＰＡを図１２に示す。
ＥＬＩＳＡによる競合的４Ｅ１０抗体結合
一定濃度のビオチン化ペプチド及び４Ｅ１０−ＩｇＧを可変濃度のｇｐ４１ペプチドと共に用い、競合的酵素結合アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって半数最大阻害濃度（ＩＣ５０）を測定した。マイクロウェルを、４℃で１晩ニュートラアビジン（４μｇ／ｍｌ）を含有している５０μＬのＰＢＳでコーティングした。ウェルを０．０５％のツイーン２０を含有しているＰＢＳで２回洗浄して、ＰＢＳ中の４％脱脂粉乳（ＮＦＤＭ）で４５分間３７℃でブロックした。一方、ビオチン化４Ｅ１０ペプチドエピトープ、ビオチン−ＰＥＧ２−
ＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦＮＩＴＮＷＬＷＹＩＫ、（２０ｎＭ）、ＩｇＧ４Ｅ１０（０．２ｎＭ）、及び競合ペプチド類縁体（１０μＭから始まる３倍希釈系列）の混合物を０．４％のＮＦＤＭ、０．０２％のツイーン及びＰＢＳ中で、別の９６ウェルプレートで２時間３７℃で培養した。ブロックしたプレートを洗浄した後、４Ｅ１０、ビオチン化ペプチド及び競合構造化ＨＩＶ−１ｇｐ４１ペプチドの混合物をウェルに添加した。室温で２０分後、ウェルを５回洗浄して、１：５００希釈のヒツジ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２、ペルオキシダーゼ抱合体を添加した。室温で４０分間培養した後、ウェルを５回洗浄して、製造会社の指示に従って５０μｌのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液を添加して展開した。２０分後、ＴＭＢ溶液を含有しているウェルに５０μｌのＨ２ＳＯ４（２Ｍ）を添加して停止させて、４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（Molecular Devices）上で読み取った。半最大シグナル（ＩＣ５０）に対応する競合ペプチドの
濃度を GraphPad Prism を用いて得られる結合曲線の内挿によって確認した。それぞれのペプチド競合体を、少なくとも２つの異なる実験で２通り試験した。
ＨＩＶ−１感染性アッセイ
ＨＩＶ−１感染性アッセイを公知の方法（Madani et al., 2007 Inhibition of human immunodeficiency virus envelope glycoprotein- mediated single cell lysis by low-molecular-weight antagonists of viral entry. J Virol, 81: 532-538;及び Si et al., 2001 Envelope glycoprotein determinants of neutralization resistance in a simian-human immunodeficiency virus (SHIV-HXBc2P 3.2) derived by passage in monkeys. J Virol, 75:4208-4218; 両者は参照により本明細書に取り込まれている）を用いて実施した。すなわち、ＨＥＫ２３９Ｔ細胞を、ＨＩＶ−１Ｇａｇ−Ｐｏｌパッケージングタンパク質を発現するｐＣＭＶΔＰ１ΔｅｎｖｐＡプラスミド、エンベロープグリコタンパク質（例えば、ＨＸＢｃ２、ＡＤＡ、ＨＸＢｃ２Ｐ３．２、ＹＵ２ ＨＩＶ−１単離体又は対照Ａ−ＭＬＶウィルス）を発現するプラスミド、及び蛍ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有しているベクター（ＤＮＡ比１：１：３μｇ）で同時にトランスフェクトした。
トランスフェクト後２４〜３０時間にウィルスを含有している上澄液を採取し、ろ過し、等分して、−８０℃で保存した。標的細胞を感染前２４時間に６×１０３の密度で９６ウェルプレートに蒔種した。Ｃｆ２Ｔｈ−ＣＤ４−ＣＣＲ５細胞を、ＡＤＡ、ＹＵ２、及びＡ−ＭＬＶエンベロープグリコタンパク質を有するウィルスによる感染に用い、そしてＣｆ２Ｔｈ−ＣＤ４−ＣＸＣＲ４細胞をＨＸＢｃ２、ＨＸＢｃ２Ｐ３．２、及びＡ−ＭＬＶのために用いた。感染の日に構造化ペプチド（０〜３μＭ）を組み替えウィルス（１０，０００ＲＴユニット）に最終容量５０μＬで添加して、３７℃で３０分間培養した。次いで、培地を取り出して、標的細胞をウィルス−ペプチド混合物と３７℃で４８時間培養した。再び培地を取り出し、細胞を３０μＬの受動溶解緩衝液（Promega）及び３回の凍結
−解凍サイクルで溶解した。次いで、Ｄ−ルシフェリン（ルシフェリン緩衝液１００μＬに１ｍＭ保存したもの５０μＬ）を各ウェルに添加し、ルシノメータ（EG&G Berthold）
を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。
免疫原性
構造的に拘束されたｇｐ４１ペプチドをタンパク質担体（例えば、ＫＬＨ）と結合させた後、ウサギを免疫化し、抗血清を採取して、ＥＬＩＳＡによる免疫原性試験を行った。
所定の構造的に拘束されたｇｐ４１構築物に対して、非修飾テンプレートペプチド及び３種の代替的に結合している架橋類縁体を、中和免疫原性検討で比較する。第１日目に、前採血（〜５ｍＬ、血清）してすぐに、免疫原当り２兎のＮＺＷ雌性ウサギ（６〜８週齢）に一次筋肉内（ＩＭ）注射（フロインド完全、ＣｐＧ−ＯＤＮ、又はRibi アジュバント
と共に２５０μｇ）を、その後ＩＭブースト（対応するアジュバント共に１００μｇ）を２１、４２、６３、８４、及び１０５日目に、そして５２、７３、９４、及び１１２日目に産生血液の採取を行う。特異的抗体産生力価をモニターリング及び比較するためにそれぞれの産生採血について直接ＥＬＩＳＡアッセイを行う。すなわち、９６ウェルのマイクロタイタープレートを個々のｇｐ４１免疫原（５μｇ／ｍＬ）で１晩４℃でコーティングする。ウェルを０．０５％のツイーン２０を含有しているＰＢＳで２回洗浄して、３７℃で４５分間３％ＢＳＡでブロックする。次いで、ウサギ抗血清の連続希釈を３通りのプレートに添加して、３７℃で２時間培養する。３回洗浄した後、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中のアルカリホスファターゼで標識したヒツジ抗ウサギＩｇＧの１：５００希釈液を加えて、プレートを室温で４０分間培養する。ウェルを洗浄し、アルカリホスファターゼ基質に３０分間暴露して、マイクロプレートリーダーによって４０５ｎｍで分析する。
ｇｐ１２０ＤＮＡプライムタンパク質ブースト免疫化戦略法は最近、ＨＩＶ−１中和抗体を産生するためにタンパク質単独又はＤＮＡ単独ワクチン化より効果的であることが示されている。この手法は、主要な構造化ＨＩＶ−１ｇｐ４１複合体を用いて、公表された免疫化手順に従って時限タンパク質ブーストを構造化ペプチドブーストに置き換えることによって試験することができる。
中和抗体の応答
構造的に拘束されたｇｐ４１ペプチドによって誘発された高力価抗体の中和応答を評価するために、抗血清を中和アッセイで評価する。単一ラウンドの感染アッセイについて、Ｅｎｖ−偽型ウィルス（ｐＳＧ３ΔＥｎｖ骨格で皮膜されているｇｐ１６０）のストックを２３９Ｔ細胞のトランスフェクションによって作成して、公知の方法を用いてＴＺＭ−ｂｌ細胞中で滴定する（Li et al. 2005. Human immunodeficiency virus type 1 env clones from acute and early subtype B infections for standardized assessments of vaccine-elicited neutralizing antibodies. J Virol, 79:10108-10125; Montefiori, 2005. Evaluating neutralizing antibodies against HIV, SIV, and SHIV in luciferase reporter gene assays. Curr Protoc Immunol, Chapter 12, Unit 12.11；両方は参照に
より、本明細書に取り込まれている）。ウィルス（２００ＴＣＩＤ５０）を総容量１５０μＬで３通りの血清試料の連続３倍希釈液と、９６ウェル平底培養プレート中、３７℃で１時間培養する。新たにトリプシン処理した細胞（７５μｇ／ｍＬのＤＥＡＥデキストランを含有している生育培地の１００μＬ中に１０，０００細胞）を各ウェルに添加する。
バックグラウンド対照のウェルは細胞のみを中に入れているのに対して、陽性対照ウェルは血清なしの細胞とウィルスを中に入れている。４８時間培養した後、１００μＬの細胞を、Britelite Luminescence Reporter Gene Assay System (Perkin Elmer) を用いる蛍
光測定のために、９６ウェルのブラックコスタープレートに移す。中和は、免疫前血清の存在下でウィルスによって誘発されるルシフェラーゼ活性と比較した、ウサギ抗血清の存在下でのルシフェラーゼ活性の減少パーセントとして算出する。特異性対照として、ウィルスの添加前に、抗血清を３０μｇ／ｍＬのペプチド免疫原と３７℃で１時間培養して、ペプチド吸着による抗血清反応停止に起因する中和の減少パーセントを記載の通りに算出する（Vaine et al. 2008. Improved induction of antibodies against key neutralizing epitopes by human immunodeficiency virus type 1 gp120 DNA prime-protein boost vaccination compared to gp120 protein-only vaccination. J Virol, 82: 7369-7378
）。
担体結合のためのペプチド誘導体化
構造化ＨＩＶ−１ｇｐ４１ペプチドの直接Ｎ末端結合（例えば、導入したシステインのチオールを介して）に加えて、炭化水素架橋のオレフィン誘導体化を実施して、構築物の提案された「中和面」を外に向けて、タンパク質又は脂質複合体（例えば、ＫＬＨ１４、ウシ血清アルブミン、コレラ毒素、ミセル）に対して隠れている非中和面を保持できるようにする（図１４）。最初にオレフィンをジヒドロキシル化するために触媒的に四酸化オスミウムを用いた後、塩化チオニル又はカルボニルジイミダゾールを用いて環化した。次いで、求電子的な環状亜流酸塩又は炭酸塩をアジ化ナトリウムと反応させて、これをホスフィンを用いてアミンに還元する。次いで、チオールを導入する二官能性試薬３−チオプロピオン酸による反応を、担体（例えば、マレイミド−ＫＬＨ）を結合するために用いる。別のアプローチとして、ペプチドを、中和抗体の認識を促進できる、脂質膜に関連して存在させることができる。例えば、ペプチドは１，３−ジパルミトイル−グリセロ−２−ホスホエタノールアミンに特異的に結合でき、これは次いでドデシルホスホコリン（ＣＰＣ）と結合して免疫原連結ミセルを生成する。
４Ｅ１０の拡張ＣＤＲ Ｈ３領域は脂質認識モチーフを含有していて、これは変異又は
欠失すると、ＨＩＶ−１を中和するのに不十分なＭＰＥＲペプチド結合活性を残存できる。従って、脂質機能性をＭＰＥＲペプチドに組み込んで中和免疫原性を増強することができる。脂質特性を本発明者らの合成ＭＰＥＲ抗原設計に導入するために、（１）ＭＰＥＲペプチドの１，３−ジパルミトイル−グリセロ−２−ホシホエタノールアミンへの特異的な結合、次いでこれをドデシルホスホコリン（ＤＰＣ）と結合して免疫原連結ミセルを生成すること、（２）ＭＰＥＲペプチドのＣ末端へのミリストイル化リジン及びその他のリポペプチド複合体の組み込み、（３）疎水性及び脂質部分として炭化水素架橋自体を拡張すること［例えば、（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）アラニン及び（Ｒ）−２−（４’−オクテニル）アラニンを用いて１１−炭素鎖（ｉ，ｉ＋７）架橋を組み込んで誘導体化する］、及び（４）脂質−ＮＴＡ−Ｎｉ−含有リポソームに結合するために、ヘキサ−ヒスチジンモチーフをＳＡＨ−ＭＰＥＲ構築物のＣ末端に組み込んでＭＰＥＲ被覆リポソームを生成すること（図１８Ｂ〜Ｄ）を包含する、幾つかの化学的手法を実施する。それぞれの場合に、ＳＡＨ−ＭＰＥＲペプチドは脂質機能性に関連して存在していて、４Ｅ１０に類似した特徴を有して抗体を引き出すように設計されている。
蛍光偏光アッセイ
フルオレセイン化ペプチド（２５ｎＭ）をＨＩＶ−１ｇｐ４１ＨＲ−１及びＨＲ−２ドメイン（又はＲＳＶ中の対応する配列）から誘導した５−螺旋タンパク質と示された濃度で、室温の結合緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中で培養した。
１０分における結合活性を、POLARstar OPTIMA マイクロプレートリーダー(BMG Labtech）を用いる蛍光偏光で測定した。結合アッセイは３通りに実施して、Prism ソフトウェ
ア（GraphPad）を用いて結合等温線の非線形回帰分析によってＫＤｓを確認した。
（Ｒ）−Ｆｍｏｃ−（２’−プロペニル）アラニンの合成
（Ｒ）−プロリン及びＫＯＨのイソプロパノール溶液を調製し、そこに塩化ベンジルを加えて室温で３時間撹拌した。酸性を高めると収率８９％で沈殿が単離できた。生成物を氷冷した塩化メチレンに溶解し、反応混合物に塩化チオニル及び２−アミノベンゾフェノンを加えて、１０時間を超えて撹拌して室温まで温めた。塩基性を高めると収率８１％で（Ｒ）−２−［Ｎ−（Ｎ’−ベンジルプロピル）アミノ］ベンゾフェノン（ＢＰＢ）が得られた。ＫＯＨのＭｅＯＨ溶液を、ＭｅＯＨ中のＢＰＢ、Ｎｉ（ＮＯ３）２−６Ｈ２Ｏ、アラニン混合物に、撹拌下、不活性ガス雰囲気下、４０℃で滴下した。得られた混合物を２時間撹拌して、酸性を高めるとＡｌａ−Ｎｉ（ＩＩ）−ＢＰＢ−複合体が収率９１％で得られた。（Tetrahedron:Asymmetry 9(1998) 4249-4252）
Ａｌａ−Ｎｉ（ＩＩ）−ＢＰＢ−複合体を３−ブロモ−１−プロペンとアセトン中、塩基性条件下で反応すると（Ｒ）−ＢＰＢ−（Ｒ）−トランス−（２’−プロペニル）アラニン［（Ｒ）−２］のシッフ塩基のＮｉ（ＩＩ）複合体と（Ｓ）−ＢＰＢ−（Ｓ）−トランス−（２’−プロペニル）アラニン［（Ｓ）−２］のシッフ塩基のＮｉ（ＩＩ）複合体の混合物が６：１の比で得られた。
シリカゲルカラムで分離した後、ジアステレオ純粋な（Ｒ）−２複合体を収率４４％で得た。（Ｒ）−２複合体を３ＮのＨＣｌ／ＭｅＯＨで分解すると（Ｒ）−（２’−プロペニル）アラニンが得られ、更にキラルリガンドも得られるが、これはＤＣＭで抽出した。
処理した後、（Ｒ）−（２’−プロペニル）アラニンをＦｍｏｃ−ＯＳｕで保護すると、（Ｒ）−Ｆｍｏｃ−（２’−プロペニル）アラニンが９３％の収率で得られた（２工程）。（Tetrahedron 56(2000)2577-2582）
実施例２．切断型Ｃ末端７個繰り返しペプチドは、全炭化水素架橋の組み込みによって増強したα螺旋性を示す
ＨＩＶｇｐ４１−ＨＲ−２ペプチドの生物化学的特性を改善するために、Ｔ６４９ｖペプチドを切断して残基６２６〜６４５からなる２０−ｍｅｒを得た（図４）。切断型安定化α螺旋（Stabilized Alpha Helix；ＳＡＨ）−ｇｐ４１化合物、ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６〜６４５）（Ａ）、を高収率で成功裏に合成した。競合ＣＤスペクトルの分析は、ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６〜６４５）（Ａ）化合物について、その非架橋対応物と比較して、α螺旋含有量の著しい増大を明らかにした（４８％対２０％）。ＨＩＶ合胞体形成アッセイにおける化合物の評価は、その非架橋誘導体と比較して、ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６〜６４５）（Ａ）の著しく増大した阻害活性を明らかにした。従って、Ｔ６４９ｖの残基の４０％を越える消去にもかかわらず、炭化水素架橋されたペプチドは、α螺旋性が殆ど無くて限られた抗合胞活性を有している２０−ｍｅｒ ｇｐ４１切断型を、有意な構造安
定性及び強力な抗合胞活性（ＩＣ９０〜１００ｎＭ）を有するα螺旋化合物に成功裏に変換した。
ＨＸＢｃ２株を用いるＨＩＶ感染性アッセイにおいてＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６〜６４５）（Ａ）ペプチドの活性を臨床的に承認されたＴ２０ペプチドと比較した。ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６〜６４５）（Ａ）は、特に著しく短縮された構築物を考慮すると、有意な抗ＨＸＢｃ２活性を示した。
実施例３．構造的に拘束されたｇｐ４１化合物は天然のペプチド比較して著しいα螺旋安定化を示す
ＳＡＨ−ｇｐ４１ペプチドの活性を最適化するために、全長ｇｐ４１−ＨＲ−２構築物に１つ又はそれ以上の炭化水素架橋を挿入することに基づく別の戦略を実行した（図１０Ａ及び１０Ｂ）。非修飾エンフビルチド及びＴ６４９ｖはｐＨ７の水性溶液中で、２０％未満のα螺旋性を示し、主に非構造化体であった。架橋化誘導体の全ては、最大４．７倍の構造安定化を有し、相対的に増大したα螺旋含量を示した。１つ或いは２つの炭化水素架橋の挿入は一貫して円二色性スペクトルを、主に２０４ｎｍに一重最大値を有するランダムコイルパターンから２０８及び２２ｎｍに二重最大値を有するα螺旋曲線に変換した。ペプチドテンプレート選択のために、一重Ｃ末端架橋は、一重Ｎ末端架橋より高度のα螺旋安定化をもたらした。選択した二重架橋ＳＡＨ−ｇｐ４１化合物は、Ｎ及びＣ末端一重架橋ペプチドの中間にあるα螺旋構造の増強を示した。ペプチドα螺旋性の増強はｐＨ２で同様に観察され、そして多くの場合は、ＳＡＨ−ｇｐ４１化合物はｐＨ７におけるより、ｐＨ２において更により螺旋性であった（図１４も参照されたい）。

化合物 ｐＨ２における螺旋性％ ｐＨ７における螺旋性％
SAH-gp41(626-662) 37 13
SAH-gp41(626-662)(F) 82 63
SAH-gp41(626-662)(C、F) 55 41
SAH-gp41(638-673) 49 19
SAH-gp41(638-673)(D) 79 23
SAH-gp41(638-673)(F) 57 30
SAH-gp41(638-673)(G) 61 48
SAH-gp41(638-673)(H) 66 26
本発明の化合物は本明細書に記載されているように５螺旋結合アッセイでもそれらのｇｐ４１への親和性を測定した。修飾化合物はエンフビルチドより実質的によく結合した。
実施例４．構造的に拘束されたｇｐ４１化合物は天然のペプチドと比較して著しい熱安定性を示す
ＳＡＨ−ｇｐ４１ペプチドの熱変性に対する耐性を評価するために、１〜９１℃の温度範囲にわたって円二色性試験を実施した。ＨＩＶ−１融合阻害ペプチドの選択した一重及び二重架橋は、９１℃においてでさえ最大２．３倍のα螺旋性の増強を維持している、卓越した熱耐性であったα螺旋安定化をもたらしたことが観察された。
実施例５．構造的に拘束されたｇｐ４１化合物は天然のペプチドと比較して著しいタンパク質分解安定性を示す
ペプチドの治療剤としての主な限界は、急速なタンパク質分解に対するそれらの感受性である。生物学的に活性なペプチド、エンフビチルドなどは、例えば、冗長で、広げられていて、プロテアーゼ部位が豊富であって特に脆弱である。ペプチドのα螺旋性を強化する共有結合架橋戦略の１つの重要な利点は、脆弱のアミノ結合をタンパク質分解から遮蔽することである。タンパク分解酵素は、ペプチドがアミドを加水分解するために伸張した配座をとることを必要としているので、炭化水素架橋によって生じる構造的な拘束は架橋したペプチドにタンパク分解酵素耐性をもたらすことができる。炭化水素架橋、特に二重架橋が３６〜３７ｍｅｒＨＩＶ−１融合ペプチドをタンパク質分解から保護できるか否かを確認するために、エンフビルチド、Ｔ６４９ｖ、及びＳＡＨ−ｇｐ４１ペプチドをインビトロでタンパク分解酵素に直接暴露した。特に架橋したペプチドに挑戦するために、ｇｐ４１Ｈｒ−２ペプチドを、ＳＡＨ−ｇｐ４１（６３８〜６７３）については９〜１１位そしてＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６〜６６２）については７位を含む、多数のコンセンサス開裂部位を開裂できるキモトリプシンを選択した。
０．５ｎｇ／μＬのキモトリプシンの存在下で、エンフビルチド及びＴ６４９ｖ（２５μＭ）は、それぞれ１２分及び１４分の半減期で、急速な分解を示した。それに比べて、一重架橋ＳＡＨ−ｇｐ４１化合物は２１〜２００分の範囲のより長い半減期を示した。二重架橋化合物の大部分は、選択した二重架橋ペプチドが最大１２７５分の半減期を実現して、それらの一重架橋対応物を遙かに上回った。多くの場合、選択した二重架橋ペプチドが選択した一重架橋ペプチドより低いα螺旋性を有しているが、優れたタンパク分解酵素耐性を示したので、二重架橋は総体的なペプチドα螺旋性より、タンパク分解安定性に強く影響する。殆ど全ての架橋ペプチドは対応する非修飾ペプチドと同数のキモトリプシン開裂部位を有していて、観察されたタンパク分解酵素耐性は、開裂部位の消去よりむしろ、ペプチド架橋自体に由来していることを強調する（図１７も参照されたい）。

化合物 半減期（分）
ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２） １４
ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２）（Ｆ） １０２
ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２）（Ａ） ７９
ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２）（Ａ、Ｆ） ３０１
ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２）（Ｂ、Ｆ） １２７５
ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２）（Ｃ、Ｆ） ４９４
ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２）（Ｄ、Ｆ） １８１
ＳＡＨ−ｇｐ４１（６３８−６７３） １５
ＳＡＨ−ｇｐ４１（６３８−６７３）（Ｄ） ３２
ＳＡＨ−ｇｐ４１（６３８−６７３）（Ｆ） ２１
ＳＡＨ−ｇｐ４１（６３８−６７３）（Ｇ） １２８
ＳＡＨ−ｇｐ４１（６３８−６７３）（Ｈ） ２０１
ＳＡＨ−ｇｐ４１（６３８−６７３）（Ｄ、Ｈ） ５１０
ＳＡＨ−ｇｐ４１（６３８−６７３）（Ｄ、Ｇ） １７１０
ＳＡＨ−ｇｐ４１（６３８−６７３）（Ｆ、Ｈ） １３２
ＳＡＨ−ｇｐ４１（６３８−６７３）（Ｄ、Ｆ） ６５２
ＳＡＨ−ｇｐ４１（６３８−６７３）（Ｅ、Ｇ） ４８３
ペプチドは、近位消化管における急速な酸加水分解に部分的に起因して経口バイオアベラビリティーが低い。中性ｐＨでの二重架橋ＳＡＨ−ｇｐ４１化合物の強力なタンパク分解酵素耐性により、それらの酸条件下での安定性を試験することを促された。それぞれの場合で、ペプチド溶液の酸性化はＣＤで測定して、それらのα螺旋含量を有意に増大した。０．５ｎｇ／μＬでペプシンに暴露すると、エンフビルチド及びＴ６４９ｖ（２５μＭ）は、それぞれ４分及び１１分の半減期で、急速な分解を示した。選択した二重架橋ＳＡＨ−ｇｐ４１化合物は、非修飾ペプチドよりおおよそ８０〜８００倍の長い範囲の半減期を示し、そして一貫してそれらの一重架橋対応物を上回った。注目すべきは、選択した二重架橋ＳＡＨ−ｇｐ４１ペプチドは、ｐＨ２のペプシンに暴露した後に１２時間以上の間、８０％が無傷のままであった。キモトリプシン耐性について観察されたように、総体的なペプチド螺旋性或いは開裂部位の数よりむしろ、二重架橋自体が、ペプシン加水分解に対する優れた耐性と相関していた。これらの検討は、二重架橋が、中性及び酸性のｐＨの両方におけるタンパク分解酵素による加水分解に対して前代未聞の耐性を有するＨＩＶ−１融合阻害性を生成する能力を強調した。

化合物 半減期（分）
ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２） １１
ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２）（Ｆ） １２９
ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２）（Ａ） １１８
ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２）（Ａ、Ｆ） ２０４０
ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２）（Ｂ、Ｆ） ９３０
ＳＡＨ−ｇｐ４１（６３８−６７３） ４
ＳＡＨ−ｇｐ４１（６３８−６７３）（Ｄ） ３
ＳＡＨ−ｇｐ４１（６３８−６７３）（Ｇ） ２２７
ＳＡＨ−ｇｐ４１（６３８−６７３）（Ｄ、Ｇ） ３３２０
ＳＡＨ−ｇｐ４１（６３８−６７３）（Ｆ、Ｈ） ９２０
実施例６．構造的に拘束されたｇｐ４１ペプチドは天然のペプチドと比較してインビボ安定性及びバイオアベイラビリティーの著しい増大を示す
雄生Ｃ５７／ＢＬ６マウスに二重架橋ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６〜６６２）（Ａ、Ｆ）或いは対応する非修飾ペプチドのどちらかの１０ｍｇ／ｋｇを静脈内投与又は経口強制投与した。３０分時点に後眼窩出血によって採血した血液試料を、ＬＣ／ＭＳによる血液検査を用いて定量した。血液中で測定したＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６〜６６２）（Ａ、Ｆ）の濃度は、対応する非修飾ペプチドの測定濃度より６倍を越えて高かった。連続採血に基づく非コンパーティメント薬理学的分析は、エンフビルチドと比較して、ＳＡＨ−ｇｐ４１の１０倍増大した曲線下面積を明らかにした。顕著に、経口投与後３０分に、無傷のＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６〜６６２）（Ａ、Ｆ）が血液中に測定可能濃度及び用量応答性濃度で検出されたのに対して、非修飾ペプチドは検出不能であった。両方のＡＵＣは増大してクリアランスは約１０倍減少した。
これらのデータは炭化水素架橋がｇｐ４１に基づく融合ペプチド配列に、それらのインビボ安定性を増大して、且つ測定可能な経口バイオアベイラビリティーさえももたらす、固有の薬理学的特性を授けるということを強調している。この実験は更に、ＳＡＨ−ｇｐ４１ペプチドの等量の経口用量が非修飾ペプチド（すなわち、エンフビルチド）の静脈内用量からもたらされるものに匹敵する血清濃度を生じることができることを明らかにし、ＳＡＨ−ｇｐ４１ペプチドの治療有効用量を経口で投与できることを示唆している（図１７を参照されたい）。
実施例７．ｉ、ｉ＋３架橋、ｉ、ｉ＋４架橋、又は（ｉ、ｉ＋３）及び（ｉ、ｉ＋４）二重架橋を含有している架橋ＭＰＥＲペプチドは、ｇｐ４１ペプチドとの結合に効果的に競合する
ｉ、ｉ＋３架橋及び／又はｉ、ｉ＋４架橋を包含しているＭＰＥＲペプチドを、ＥＬＩＳＡアッセイによって、ｇｐ４１ペプチドへの結合について競合する能力を試験した。図２１Ａに示したように、ｉ、ｉ＋３架橋ペプチドは、類似した位置に架橋されている（例えば、配列番号１３６と配列番号１３５を比較されたい）ｉ、ｉ＋４架橋ペプチドより、より効果的に結合について競合したが、両方の架橋誘導体は野生型ＭＰＥＲペプチドより優れていた。図２１Ａ及びＢに示したｉ、ｉ＋３架橋及びｉ、ｉ＋４架橋の両方を含有しているペプチドを用いて更なる検討を実施した。これらの検討は、ｉ、ｉ＋３架橋及びｉ、ｉ＋４架橋の両方を包含しているペプチドを用いる効果的な競合を明らかにした。
図２２は、Ｒ３−Ｓ５及びＲ３−Ｓ６（ｉ、ｉ＋３）架橋を含有している短縮したＳＡＨ−ＭＰＥＲペプチドの野生型Ａｃ−ＭＰＥＲペプチドより効果的に４Ｅ１０抗体結合について競合する能力を示す。これらのデータも、異なった成分（すなわち、炭素鎖の長さ）のｉ、ｉ＋３架橋も機能的に優れた構造化ペプチドをもたらすことを強調している。
強力な４Ｅ１０結合ＳＡＨ−ＭＰＥＲペプチドの１つは、ＭＰＥＲドメインのＣ末端領域内に（ｉ、ｉ＋３）架橋を含有していて、これは構造検討に基づく３１０螺旋であると推測される。本発明者らの（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）アラニン（「Ｓ５」）非天然アミノ酸を用いて（ｉ、ｉ＋３）架橋は成功裏に作成されたが、高温及び長期にわたる反応条件が二重架橋（ｉ、ｉ＋３）、（ｉ、ｉ＋４）ペプチドの高収率産生を妨げた。実際に、８炭素鎖架橋は、（ｉ、ｉ＋３）架橋には長すぎるかもしれない。従って、Ｒ３−Ｓ６、Ｒ６−Ｓ３、Ｒ３−Ｓ５、及びＲ５−Ｓ３を包含する、別の非天然アミノ酸対を合成して７及び６炭素鎖架橋を作成した（図９Ａ−Ｂ、図１２Ｄ、図２２）。図９Ａに説明した合成スキームに従って新規な非天然アミノ酸を作成した。（Ｒ）−２−（４’−アリル）（「Ｒ３」）及び（Ｓ）−２−（４’−ヘキセニル）（「Ｓ６］）アラニン誘導体を合成し、これらを組み込んでＳＡＨ−ＭＰＥＲペプチド（配列番号９９）にｉ、ｉ＋３架橋を形成して、多様な条件に渡ってオレフィンメタセシス反応を実施した。Ｒ３−Ｓ５の組み合わせを用いてＳＡＨ−ＭＰＥＲ（配列番号１００）内にもｉ、ｉ＋３架橋を組み込んだ。反応は、本発明者らのプロタイプＳ５−Ｓ５（ｉ、ｉ＋４）に用いた高効率の室温／２時間メタセシス反応条件をほぼ繰り返してわずか３時間の培養の後に室温で完了した。
実施例８．構造的に拘束されたｇｐ４１ペプチドは、非構造化ペプチド治療剤エンフビルチドと比較して著しく増強した抗ウィルス能を明らかにする
ｇｐ４１による融合阻害活性に対する炭化水素架橋の機能的影響を評価するために、ルシフェラーゼに基づくＨＩＶ−１感染性アッセイで、ＳＡＨ−ｇｐ４１ペプチドを試験して、それらの非修飾対照物と比較した。３つの異なったＨＩＶ−１株、ＨＸＢｃ２、ＡＤＡ、及びＨＸＢｃ２Ｐ３．２由来のエンベロープグリコタンパク質を有する組み替えＨＩＶ−１、及び両種性ネズミ白血病ウィルス（Ａ−ＭＬＶ）エンベロープグリコタンパク質を有する陰性対照ウィルスを評価した。エンフビルチドと比較して、ＳＡＨ−ｇｐ４１（６３８−６７３）（Ｄ）及びＳＡＨ−ｇｐ４１（６３８−６７３）（Ｄ、Ｈ）は３つのＨＩＶ−１株の全てにわたり３〜１５倍増強された阻害活性を示した（図１５）。エンフビルチドのＣ−末端上流１１残基を終端させている３７アミノ酸断片を包含しているＨＲ−２ペプチド（図１０Ａ）である、Ｔ６４９ｖは、これらのアッセイでエンフビルチドより有意に高い抗ＨＩＶ−１活性を示す。Ｔ６４９ｖに基づく架橋ペプチドの間の異なった抗ウィルス能を立証するために、初期Ｒ５耐性分離株（ＹＵ２）由来のエンベロープグリコタンパク質を有するウィルスに対して化合物をスクリーニングした。Ｔ６４９ｖと比較すると、ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２）（Ａ）、ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２）（Ｆ）、及びＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２）（Ａ、Ｆ）は増強した抗−ＹＵ２活性を明らかにした（図１６Ｂ）。
まとめると、これらの機能的データは、一重及び二重架橋が強力で広範な抗ＨＩＶ−１活性を有するＳＡＨｇｐ４１ペプチドを産生することができることを明らかにした。注目すべきは、試験したペプチドはどれもＡ−ＭＬＶエンベロープグリコタンパク質を有するウィルスに対して何ら活性を示さず（図１２及び１３）、ＳＡＨ−ｇｐ４１ペプチドの特異性を強調した。α螺旋安定化、タンパク分解安定性、及び抗ウィルス活性の間のバランスをとることの重要性について、もっとも優れたα螺旋性及びタンパク分解安定性を有する２つの二重架橋化合物、ＳＡＨ−ｇｐ４１（６３８−６７３）（Ｄ、Ｇ）及びＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２）（Ｂ、Ｄ）の相対的に低下した抗ウィルス活性から分かるように、過剰な安定化によりもたらされる機能的な不利益によって強調された。実際、中等度のα螺旋安定化、二重架橋の固有の抗タンパク分解特性、及び強力な抗ウィルス活性を組み合わせた、二重架橋ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２）（Ａ、Ｆ）（図１７）は、ＨＩＶ−１融合阻害ペプチドの構造、安定性、及び機能的活性を最適化する炭化水素架橋の顕著な潜在的可能性を強調している。重要なことに、ＳＡＨｇｐ４１ペプチドの間の構造的及び機能的相違が、免疫原をＨＩＶ−１ワクチン接種のために正確に構造化するためのスクリーニングにおいて間違いなく重要な利点である、三次元空間に特異的にサンプリングする多様のペプチドを生じさせる炭化水素架橋の能力を強調している。
次に、ペプチド及びＨＲ１二重突然変異体、Ｖ３８Ａ／Ｎ４２Ｔ及びＶ３８Ｅ／Ｎ４２Ｓ（He, Y., et al. PNAS (2008)）を有する組み替えＨＩＶ−１ＨＸＢｃ２ウィルスを用いる、複合体集合及びＨＩＶ−１感染性アッセイで、エンフビルチド、Ｔ６４９ｖ、及びＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２）（Ａ、Ｆ）の機能的活性を比較した。両方の突然変異はＨＩＶの特異的効果を有する侵入を支持するが、野生型ウィルスに匹敵したままであった。これらの耐性の基本メカニズムは、エンフビルチド結合の妨害に由来するのではなく、ｇｐ４１の６螺旋バンドル集合を阻止するペプチドの優性阻害活性を必要としている。ＦＩＴＣ−ＨＲ２及び変異ＨＲ１ペプチドが相互作用して安定な高次複合体を形成する能力をモニタリングするように設計されている天然のＰＡＧＥによるアッセイを最初に実施した（He, Y., et al. PNAS(2008)）。ＦＩＴＣ標識エンフビルチドが二重突然変異Ｈ
Ｒ−１ペプチドとの相互作用を示さなかったのに対して、ＦＩＴＣ−Ｔ６４９ｖ及びＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２）（Ａ、Ｆ）はそれぞれの突然変異ＨＲ１ペプチドと高次複合体を形成した（図１６Ｃ〜Ｅ）。蛍光スキャン及び対応する濃度分析で明らかなように、ＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２）（Ａ、Ｆ）は、ＦＴＩＣ−Ｔ６４９ｖと比較して結合活性が最大２倍までも増大して、二重突然変異ＨＲ１ペプチドに効果的に結合した。対応するｇｐ４１ＨＲ１突然変異を有するＨＩＶ−１ＨＸＢｃ２エンベロープ構築物を用いる感染性アッセイにおいて、エンフビルチドは再び機能活性を示さなかったのに対して、Ｔ６４９ｖ及びＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２）（Ａ、Ｆ）はＨＩＶ感染性を用量応答的に抑制した（図１６Ｆ〜Ｇ）。天然ＰＡＧＥ結合分析と一致して、ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２）（Ａ、Ｆ）は、ヒトにおけるエンフビルチド活性を一様に無効にする変異に打ち勝って、Ｔ６４９ｖの１．５〜２．８倍の改善を示して、ウィルス感染を効果的に妨害した。
まとめると、これらの機能的データは、一重及び二重架橋が強力で広範な抗ＨＩＶ−１活性を有するＳＡＨｇｐ４１ペプチドを産生することができることを明らかにした。注目すべきは、試験したペプチドはどれもＡ−ＭＬＶエンベロープグリコタンパク質を有するウィルスに対して何ら活性を示さず（図１２及び１３）、ＳＡＨ−ｇｐ４１ペプチドの特異性を強調した。α螺旋安定化、タンパク分解安定性、及び抗ウィルス活性の間のバランスをとることの重要性について、もっとも優れたα螺旋性及びタンパク分解安定性を有する２つの二重架橋化合物、ＳＡＨ−ｇｐ４１（６３８−６７３）（Ｄ、Ｇ）及びＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２）（Ｂ、Ｄ）の相対的に低下した抗ウィルス活性から分かるように、過剰な安定化によりもたらされる機能的な不利益によって強調された。実際、中等度のα螺旋安定化、二重架橋の固有の抗タンパク分解特性、及び強力な抗ウィルス活性を組み合わせた、二重架橋ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２）（Ａ、Ｆ）（図１７）は、ＨＩＶ−１融合阻害ペプチドの構造、安定性、及び機能的活性を最適化する炭化水素架橋の顕著な潜在的可能性を強調している。重要なことに、ＳＡＨｇｐ４１ペプチドの間の構造的及び機能的相違が、免疫原をＨＩＶ−１ワクチン接種のために正確に構造化するためのスクリーニングにおいて間違いなく重要な利点である、三次元空間に特異的にサンプリングする多様のペプチドを生じさせる炭化水素架橋の能力を強調している。
実施例９．蛍光偏光アッセイ（ＦＰＡ）はＢＮＡｂ４Ｅ１０の構造的に拘束されたＭＰＥＲペプチドへの特異的結合を明らかにする
上記の方法を用いるＦＰＡを実施して、ｇｐ４１の明確な安定化抗原構造（ＳＡＳ−ｇｐ４１）構築物の中和抗体４Ｅ１０、２Ｆ５、及びＺ１３ｅｌ（NIH AIDS Research and Reference Reagent Program）に対する相対的親和性を直接測定して比較した。蛍光偏光
（ｍＰ単位）をBMG POLARstar Optima or SpectraMax プレートリーダー (Molecular Devices) 上で測定して、Ｋｄ値をPrism ソフトウェア（Graphpad）を用いて用量応答曲線の非線形回帰分析によって算出した。対照ＭＰＥＲペプチドＦＩＴＣ−ＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦＮＩＴＮＷＬＷＹＩＫ−ＮＨ２に結合している４Ｅ１０抗体のＦＰＡ分析の結果を図２０に示す。
実施例１０．構造的に拘束されたペプチドを含有しているＭＰＥＲドメインの生物物理学的及び生物学的特性
図７、１０、及び１２に示されているような、ペプチドを含有している構造的に拘束されたＭＰＥＲドメインを上記のように、合成して、多種の方法を用いて分析した。構造的に拘束されたペプチドは、皆無かそれに近い螺旋構造を示す天然のペプチドと比較すると、α螺旋又は３１０螺旋のどちらかの螺旋構造を、ペプチドの適切な位置に有する傾向がより高い。構造的に拘束されたＭＰＥＲペプチドは、競合的抗体結合ＥＬＩＳＡアッセイで明らかにされたように、１つ又はそれ以上のＢＮＡｂ、例えば２Ｆ５，Ｚ１３ｅｌ、及び４Ｅ１０などに対するより高い相対的親和性も有している（図２１〜２２）。
実施例１１．構造的に拘束されたペプチドを含有しているＭＰＥＲドメインの構造決定
効果的なＭＰＥＲに基づく免疫原を開発するための炭化水素架橋の適用は、中和能力のある構造の合成的再構築に依存している。そのようなものとして、ＳＡＳ−ｇｐ４１ペプチドの構造（複数も）を特徴つける多種の手法は、円二色性、Ｘ線結晶学、及び核磁気共鳴分光法を包含する。
炭化水素架橋ペプチドの二次構造改善を評価するために、上記のように、Aviv Biomedicaｌ分光計（モデル４１０）上で、円二色性（ＣＤ）スペクトルを記録して分析した。ＣＤ検討用の標的ペプチド濃度は５０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．５）又は Mili-Q 脱イオン水中で２５〜５０μＭであり、そして正確な濃度は２つのＣＤ試料希釈の定量アミノ酸分析によって確認する。ＣＤスペクトルは最初に波長対ミリ度としてプロットする。
正確なペプチド濃度が確認されたら、ｃｍ２／ｄｍｏｌ／残基の単位で平均残基楕円率［θ］を式、［θ］＝ミリ度／モル濃度／アミノ酸残基の数 から誘導する。平均残基楕円率に変換した後、式、螺旋％＝１００×［θ］２２２／ｍａｘ［θ］２２２（ここで、ｍａｘ［θ］２２２＝−４０，０００×［１−（２．５／アミノ酸残基の数］である）を用いてα螺旋％を算出することができる。我々の分光計とセットになっている曲線適合ＣＤＤＮソフトウェアを用いて、α螺旋、平行及び非平行βシート、β回転及びランダムコイルを包含する二次構造の相対比も算出した。
Ｆａｂに結合して脂質を組み込んだＭＰＥＲペプチドと比較するためのＳＡＳ−ｇｐ４１ペプチドの正確な構造を定義付けるために、Ｘ線結晶学及びＮＭＲ方法を記載されているように適用できるだろう（Cardoso, R. M. et al. Immunity, 2005. 22L p. 163-173; Ofek et al. J Virol, 2004. 78: p 10724-10737; Sun, Z. Y. et al. Immunity, 2008. 28: p. 52-63; Cardoso, R. M., et al. J Mol Biol, 2007. 365: 1533-1544.）。ＳＡ
Ｓ−ｇｐ４１ペプチドの結晶化条件は、Phoenix 結晶化ロボットを用いて組み立てた９６ウェル蒸気拡散(sitting-drop)プレート（Crystal Quick, Hampton Research）を用いて
スクリーニングする。初期条件は、 HT Index Screen (Hampton Research)、JSCG+ Suite (Qiagen) 及び Pro-Complex Suite (Qiagen) を包含する。ｐＨ及び塩の変動並びに界面活性剤の濃度を含む、最適合に近いもののスクリーニングを、結晶生育の最適条件を決定するために実施する。結晶は、生成すると、取り出し、結晶化緩衝液で洗浄して、質量分析にかけて結晶内にペプチドが存在していることを確認する。次いで結晶を抗凍結剤に浸し、瞬間凍結して液体窒素中で保存する。適切な結晶をArgonne National Laboratory シンクロトロン施設で実験する。分子置換によって相を得た後、データ分析及び精密化を行う（Phaser, Phenix, and Coots ソフトウェア）。Ｆａｂ／ＳＡＳ−ｇｐ４１の共複合体も公開されている条件（Cardoso, R. M. et al. Immunity, 2005. 22L p. 163-173; Ofek et al. J Virol, 2004. 78: p 10724-10737）に基づいて最初にスリーニングして同様な方法で試験できる。
構造分析のための別のそして補完的な手法は１Ｈ−ＮＭＲ分析を用いる。溶液中のＳ
ＡＳ−ｇｐ４１ペプチドのスペクトルは、ｚ−シールドグラジエント及び三重共鳴クリオプローブを備えたBruker Avance DRX 上６００ＭＨＺで得られる。二次元のＤＱＦ−ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、及びＮＯＥＳＹスペクトルを１００％Ｄ２Ｏ及び９０％Ｈ２Ｏ／１０％Ｄ２Ｏ中で測定する。ＴＯＣＳＹデータセットは、４０及び８０分の混合時間で、ＮＯＥＳＹスペクトルは、７５、１００、１２５、及び２００分の混合時間で得られる。ＮＭＲデータセットはＮＭＲＰｉｐｅスペクトル分析パッケージで処理して、プロトン共鳴の割り当てはCara を用いて実施する。構造計算は標準的なプロトコールを用いるプログラ
ムＣＹＡＮＡで実施する。最終構造群は、最も低い標的機能、及びプログラムＷＨＡＴＣＨＥＣＫ及びＰＲＯＣＨＥＣＫ＿ＮＭＲを用いて測定したキラリティー及び立体化学に関して最も優れた総合値を有している、２０の構造からなっている。構造はプログラムＰＹＭＯＬ及びＭＯＬＭＯＬを用いて表示及び分析する。
構造データは、（１）Ｆａｂ結合及び脂質を組み込んだＭＰＥＲ構造を最も密に反映する免疫を付与するためにＳＡＳ−ｇｐ４１ペプチドを選択する、及び（２）本明細書に記載されているアッセイで評価したように、ＳＡＳ−ｇｐ４１構造を機能的活性と相関付ける、ために用いられる。
実施例１２．構造的に拘束されたｇｐ４１ペプチドの免疫原性試験
構造的に拘束されたｇｐ４１ペプチド、とりわけ結合アッセイにおいて、及び／又はウィルス融合及び感染性阻害検討において最も有効であると確認されたもの、をワクチン接種用の医薬製剤（例えば、担体タンパク質と組合せてアジュバントと共に投与される）を作成するために用いた。注射による投与（例えば、アジュバントと共に）、又は粘膜表面に投与のための製剤を従来の方法を用いて調製した。ワクチン接種前及び最初のワクチン接種後適切な間隔で、そして免疫原性試験のための追加免疫のワクチン接種の後に、動物から採血した。この方法のフローチャートが図６及び１９Ａに示される。血清を調製して１つ又はそれ以上の構造的に拘束されたペプチドに特異的に結合する抗体の存在について試験した。
図１９は、免疫原性試験の結果を示し、ここで試験はＳＡＨ−ＨＲ２（Ａ，Ｆ）及びその対応する非修飾ペプチドをＫＬＨとの結合について拡大し、次いで（Ａ）で示したスケジュールに従う時限追加免疫を用いるウサギ免疫付与プロトコールに展開した。その後、対応する抗原に対して誘導した抗血清のＥＬＩＳＡ分析（Ｂ）及び交差抗原分析（Ｃ）を行った。第１群の動物（ｎ＝３）はＳＡＨ−ＨＲ２−ＫＬＨ抗原を投与されて、全てが第１回接種後わずか２週間である、２週目に行ったＥＬＩＳＡアッセイにより、ＳＡＨ−ＨＲ２結合に陽性であった（図１９Ｂ）。力価は、第３回接種後２週間である、１０週目まで３００，０００より高く上昇した。第２群の動物は野生型ＨＲ−２ＫＬＨ抗原を投与されて、全てが第３回接種後２週間である、１０週目まで野生型ＨＲ２結合に対して陽性にならなかった。野生型ＨＲ２−ＫＬＨを投与された動物のわずか１匹が２週間後にいくらかの力価を示し、２番目の動物が４週目に陽性になった。１４週目までに、全ての第２群の動物に関して力価が８９，０００より高く上昇したが、わずか１匹の動物が３００，０００より高い力価に到達した。これらのデータは、ＳＡＨ−ＨＲ２−ＫＬＨに暴露されたウサギが、有意により速くより強力な抗体応答を達成することを明らかにしている。次に、１つの免疫原から作成した抗血清が別のものを認識できたか否かを試験した。この検討は、野生型ＨＲ２−ＫＬＨで免役したマウスから誘導した抗血清が構造化ＳＡＨ−ＨＲ２抗原の認識を殆ど又は全く示さなかったという刺激的な知見をもたらした（図１９Ｃ）。
最大力価は１５，０００未満でピークに達して、第４回接種後２週間である、１４週まででさえ達成できなかった。これらのデータは、ｇｐ４１ＨＲ２ドメインの天然α螺旋配座を反映する、ＳＡＨ−ＨＲ２の形態が、相対的に構造化されていない野生型ＨＲ２ペプチドで免疫付与された後に検出できなかったことを示唆している。ＳＡＨ−ＨＲ２−ＫＬＨ応答が、ｇｐ４１モチーフ自体ではなく炭化水素架橋の認識に由来する結果であるということを排除するために、ＳＡＨ−ＨＲ２−ＫＬＨ由来抗血清が野生型ＨＲ２ペプチドを認識するか否かをＥＬＩＳＡアッセイで試験した。実際に、ＳＡＨ−ＨＲ２−ＫＬＨ由来抗体の野生型ＨＲ２ペプチドによる交差免疫反応性が存在して、ＳＡＨ−ＨＲ２−ＫＬＨによって誘発された応答がｇｐ４１ペプチド配列に特異的であったことを提示した（図１９Ｃ）。４５８０〜５４７０００範囲の最大力価が、第４回接種の２週間後である、１４週目までに達成された。ＳＡＨ−ＨＲ２−ＫＬＨで免役した動物のうち２匹に関しては、その力価は、野生型ＨＲ２−ＫＬＨで免役したウサギ由来の最大力価さえ越えて、野生型ＨＲ２認識を達成した。従って本発明者らのウサギ免疫付与検討は、その天然の三次元形態内にペプチドモチーフを固定している構造化抗原が、より強力な抗体応答を生じさせるばかりではなく、この構造安定化なしに、得られる抗血清が天然ｇｐ４１構造を本質的に認識できないことを示唆している。
Ｂ細胞をＢＮＡｂを産生する動物から採取でき、ハイブリドーマ細胞株を公知の方法を用いて産生できる。個々の細胞を同様にクローン化してＢＮＡｂ活性を有するモノクローナル抗体を更に特徴付けることができる。
Ｂ細胞をＢＮＡｂを産生する動物から採取でき、ハイブリドーマ細胞株を公知の方法を用いて産生できる。個々の細胞を同様にクローン化してＢＮＡｂ活性を有するモノクローナル抗体を更に特徴付けることができる。
実施例１３．ウィルス接種を用いるインビボにおけるＳＡＳ−ｇｐ４１ワクチンの有効性及び試験
ＨＩＶ感染の動物モデルを、（１）ＳＡＳ−ｇｐ４１ペプチドワクチン及び（２）ＳＡＳ−ｇｐ４１免疫付加に由来するＢＮａｂ及び抗体産生の、感染の予防、抑制、或いは除去における治療有効性を評価するために用いた。このような動物モデル及び有効性検討の設計、実行並びに分析は当該技術分野で周知であって、ＨＩＶ−１に感染したヒト化Ｒａｇ２−／−ガンマｃ−／−（ＲＡＧ−ｈｕ）マウス（Choudhary, S.K et al J Virol, 2009. Epub June 3; Berges et al. Retrovirol, 2006. 3: p 76）及びＳＩＶに感染しているアカゲザル（Keele, B.F. et al. J Exp Med, 2009, 206: p 1117-1134; Gardner, M.B. et al J Med Primatol, 1989. 18: p. 321-328; Gardner, M.B. Adv Exp Med Biol, 1989. 251: 279-293; Ruprecht, R.M. Methods Mol Biol, 2009. 525: 559-566）の使用を
包含している。アカゲザルとヒトの間の密接な進化類似性によって、これらは、アカゲザル伝染性類似サル免疫不全ウィルス（ＳＩＶ）及び著名な日和見感染疾患モデルのその他の例を臨床適用に用いる、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）感染の免疫学を検討するために、特に適した動物モデルになる。特に、ＳＩＶとＨＩＶの両者は、ＣＤ４タンパク質を一次受容体としてそしてケモカイン受容体を細胞侵入のコレセプターとして用いる霊長類のレンチウィルスである。ＳＩＶによる感染の後、殆どのアカゲザルはＨＩＶ誘発ＡＩＤＳに類似した疾患を発症する；従って最近、アカゲザルのＳＩＶ感染はヒトＨＩＶ感染に対する最善の動物モデルであると考えられている。アカゲザルはＳＩＶ接種を用いるＨＩＶ／ＡＩＤＳワクチン開発の前臨床標準と考えられている。ワクチン接種又は受動免疫療法用のＢＮａｂの開発のための主要なＳＡＳ−ｇｐ４１抗原を、連邦規格及び承認された臨床試験プロトコール（例えば、Harro, C.D. et al, AIDS Res Hum Retroviruses, 2009. 25: p. 103-114; Gudmundsdotter, L. et al. Vaccine, 2009. May 29 epub ahead of print）に従ってヒト試験へ進めることができるだろう。
実施例１４．構造的に拘束されたＲＳＶペプチドは、ＲＳＶ５螺旋バンドルタンパク質との結合について効果的に競合する
図２３Ａ〜Ｂは、ｉ、ｉ＋４架橋を含有している典型的な炭化水素架橋ＲＳＶ ＨＲ２
ドメインペプチド（Ａ）及びＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＲＳＶペプチド及び組み替えＲＳＶ５螺旋バンドルを用いる蛍光偏光結合分析の結果（Ｂ）を示す。これは、配列のどちらかの端の特定位置に架橋を加えても、重要な６螺旋バンドル形成を妨害しないことを裏付けている。実際に、架橋が、ＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ＲＳＶ及び５螺旋バンドルタンパク質の融合原性６螺旋バンドルに結合する能力を増大するものと考えられる。
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本明細書で引用された全ての特許、特許出願、ＧｅｎＢａｎｋナンバー、及び刊行された参考文献は、これらが個々に組み込まれているように、その全てが参照により本明細書に取り込まれている。本発明は具体的に示されていてその好ましい実施態様に準拠して記載されているが、形式及び詳細における多種の変更を、添付の特許請求の範囲によって包含される発明の範囲から逸脱することなく行うことができるということは当業者に理解されるだろう。

Claims (19)

  1. ６α−螺旋バンドルモチーフを有するウィルスのＨＲ−２ドメイン由来及び／又はＭＰＥＲドメイン由来のアミノ酸配列を含む構造的に拘束されたペプチドであって、
    少なくとも下記の（１）〜（４）から選択されたいずれかのアミノ酸配列を含有しており、
    （１）６２６〜６７３の領域又はその部分領域に対応するアミノ酸配列であって、６２６〜６６２の領域又は６３８〜６７３の領域に対応するアミノ酸配列を含み、かつ当該領域内の６２９と６３３（Ａ）、６３２と６３６（Ｂ）、６３６と６４０（Ｃ）、６４０と６４４（Ｄ）、６４７と６５１（Ｅ）、６５３と６５７（Ｆ）、６６４と６６８（Ｇ）、６６６と６７０（Ｈ）、６４２と６４６（Ｉ）、６５４と６５８（Ｊ）、６５８と６６２（Ｋ）、６３０と６３４（Ａ’）もしくは６５２と６５６（Ｆ’ｓ）の少なくともいずれかの（ｉ，ｉ＋４）の位置において炭化水素架橋されているアミノ酸配列、
    （２）６２６〜６６２の領域の部分領域に対応するアミノ酸配列であって、６２６〜６４５の領域に対応するアミノ酸配列を含み、かつ当該領域内の少なくとも６２９と６３３（Ａ）の（ｉ，ｉ＋４）の位置において炭化水素架橋されているアミノ酸配列、
    （３）６６２〜６８３の領域又はその部分領域に対応するアミノ酸配列であって、６６２〜６８１の領域に対応するアミノ酸配列を含み、かつ当該領域内の６６７と６７１、６６６と６７０、６６５と６６９、６６４と６６８、６６３と６６７、６６２と６６６、６７４と６７８、６７０と６７４、もしくは６７８と６８２の少なくともいずれかの（ｉ，ｉ＋４）の位置、又は同６８０と６８３、６７９と６８２、６７８と６８１、６７７と６８０、６７６と６７９、６７５と６７８、もしくは６７４と６７７の少なくともいずれかの（ｉ，ｉ＋３）の位置において炭化水素架橋されているアミノ酸配列、
    （４）６６２〜６８３の領域の部分領域に対応するアミノ酸配列であって、６７１〜６８３の領域に対応するアミノ酸配列を含み、かつ当該領域内の少なくとも６７８と６８１の（ｉ，ｉ＋３）の位置において炭化水素架橋がなされているアミノ酸配列、
    ここで、前記ＨＲ−２ドメインとは、配列番号１に示されるＨＩＶｇｐ−１６０のアミノ酸配列の６２６〜６６１の領域に対応するアミノ酸配列からなる領域であり、前記ＭＰＥＲドメインとは、同６６２〜６８３の領域に対応するアミノ酸配列からなる領域であると定義される、
    構造的に拘束されたペプチド。
  2. 前記（１）のアミノ酸配列が、６２６〜６６２の領域に対応するアミノ酸配列を含み、かつ当該領域内の６２９と６３３（Ａ）もしくは６５３と６５７（Ｆ）の少なくともいずれかの（ｉ，ｉ＋４）の位置において炭化水素架橋されているアミノ酸配列である、請求項１に記載の構造的に拘束されたペプチド。
  3. 前記（１）のアミノ酸配列が、６３８〜６７３の領域に対応するアミノ酸配列を含み、かつ当該領域内の６４０と６４４（Ｄ）及び６６６と６７０（Ｈ）の少なくともいずれかの（ｉ，ｉ＋４）の位置において炭化水素架橋されているアミノ酸配列である、請求項１に記載の構造的に拘束されたペプチド。
  4. 前記（１）〜（４）から選択されたアミノ酸配列からなる領域が、前記１箇所の炭化水素架橋に加え、さらに他の（ｉ，ｉ＋３）もしくは（ｉ，ｉ＋４）の位置において炭化水素架橋されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の構造的に拘束されたペプチド。
  5. 前記（３）で選択されたアミノ酸配列からなる領域が、（ｉ，ｉ＋３）及び（ｉ，ｉ＋４）の両方の位置において炭化水素架橋されていることを特徴とする、請求項４に記載の構造的に拘束されたペプチド。
  6. 前記（４）で選択されたアミノ酸配列のＣ末端に１以上のリジン（Ｋ）残基が付加されたアミノ酸配列を含有することを特徴とする、請求項１に記載の構造的に拘束されたペプチド。
  7. 前記炭化水素架橋の少なくとも１箇所がＲ３−Ｓ６対合、Ｒ６−Ｓ３対合、Ｒ３−Ｓ５対合及びＲ５−Ｓ３対合よりなる群から選ばれる対合を含有してなる、請求項１〜６のいずれかに記載の構造的に拘束されたペプチド。
  8. 前記ウィルスが、ＨＩＶ−１もしくはその変異株，ＳＩＶ又はＲＳＶから選択されたウィルスである、請求項１に記載の構造的に拘束されたペプチド。
  9. 前記（１）のアミノ酸配列が、配列番号４６〜４８，５０〜５７，５８〜６３，６４〜７０，７１〜７４、１４１〜１４６に示されたいずれかのアミノ酸配列を含有してなる、請求項１〜８のいずれかに記載の構造的に拘束されたペプチド。
  10. 前記（２）のアミノ酸配列が、配列番号２７のアミノ酸配列を含有してなる、請求項１〜８のいずれかに記載の構造的に拘束されたペプチド。
  11. 前記（３）のアミノ酸配列が、配列番号７５〜８９，９０〜９７，１０１〜１０５，１３５〜１３６に示されたいずれかのアミノ酸配列を含有してなる、請求項１〜８のいずれかに記載の構造的に拘束されたペプチド。
  12. 前記（４）のアミノ酸配列が、配列番号９８〜１００，１３８〜１４０に示されたいずれかのアミノ酸配列を含有してなる、請求項１〜８のいずれかに記載の構造的に拘束されたペプチド。
  13. 前記構造的に拘束されたペプチドが、前記ＨＲ−２ドメイン由来配列を含有する構造的に拘束されたペプチドと共に、前記ＭＰＥＲドメイン由来配列を含有する構造的に拘束されたペプチドのいずれをも含有しており、かつ、前者のＣ末側に後者が結合された構造を有していることを特徴とする、請求項１〜１２の何れか一項に記載の構造的に拘束されたペプチド。
  14. 請求項１〜１３の何れか一項に記載の構造的に拘束されたペプチドが、担体タンパク質と機能的に結合していることを特徴とする融合タンパク質。
  15. 請求項１〜１３の何れか一項に記載の構造的に拘束されたペプチド又は請求項１４に記載の融合タンパク質を含有する医薬組成物。
  16. 請求項１〜１３の何れか一項に記載の構造的に拘束されたペプチド又は請求項１４に記載の融合タンパク質を、免疫応答を促進するのに有効な用量で対象（ヒトを除く）に投与することを含有してなる、請求項１〜１３の何れか一項に記載の構造的に拘束されたペプチドの何れかと特異的に結合する抗体を製造する方法。
  17. 請求項１〜１３の何れか一項に記載の構造的に拘束されたペプチド又は、請求項１４に記載の融合タンパク質を含有してなる、ウィルス感染の予防、改善又は治療のための医薬組成物。
  18. ウィルス感染がＨＩＶ感染を含有してなる、請求項１７に記載の医薬組成物。
  19. 医薬組成物が、ウィルス融合又はウィルス感染性を阻害又は抑制する、請求項１７又は１８に記載の医薬組成物。
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