JP2005515754A - タンパク質アレイ、ならびにそれらを生産する方法およびシステム - Google Patents
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Abstract
Description
米国政府は、Naval Medical Research CenterによりCRADA NCRADA−NMR−01−1037の条件により提供されるように政府により、または政府の利益になるように世界中で本発明を実施するか、あるいは実施された本発明を有する非独占的取消不能払込済みライセンスを有する。
、約210個、約220個、約230個、約240個、約250個、約260個、約266個、約300個、約350個、約400個、約450個、約500個、約550個、約600個、約650個、約700個、約750個、約800個、約850個、約900個、約950個、約1,000個、約1,050個、約1,100個、約1,150個、約1,200個、約1,250個、約1,300個、約1,350個、約1,400個、約1,450個、約1,500個、約1,600個、約1,700個、約1,800個、約1,900個、約2,000個、約2,500個、約3,000個、約3,500個、約4,000個、約4,500個、約5,000個、約6,000個、約7,000個、約8,000個、約9,000個、約10,000個、約15,000個、約20,000個、約25,000個、約30,000個またはそれ以上のポリペプチドを固体支持体に固定化すること、および上記標的生物由来の1つまたは複数の抗原で免疫化した動物からの少なくとも1つの抗体を用いて上記ポリペプチドをアッセイすることであって、それにより体液性免疫応答を誘発することが可能な標的生物抗原を同定することを含むことができる。
。本方法は、体液性免疫応答を誘発することが可能であると同定された標的生物抗原を操作可能にコードする核酸配列を提供すること、該核酸配列を、単独であるいは標的生物抗原を発現することが可能である少なくとも1つの他の核酸と組み合わせて被験体に導入すること、および該被験体における該核酸または核酸の組合せに対する免疫応答の発生をモニタリングすることを含む。
個、約180個、約190個、約200個、約210個、約220個、約230個、約240個、約250個、約260個、約266個、約300個、約350個、約400個、約450個、約500個、約550個、約600個、約650個、約700個、約750個、約800個、約850個、約900個、約950個、約1,000個、約1,050個、約1,100個、約1,150個、約1,200個、約1,250個、約1,300個、約1,350個、約1,400個、約1,450個、約1,500個、約1,600個、約1,700個、約1,800個、約1,900個、約2,000個、約2,500個、約3,000個、約3,500個、約4,000個、約4,500個、約5,000個、約6,000個、約7,000個、約8,000個、約9,000個、約10,000個、約15,000個、約20,000個、約25,000個、約30,000個またはそれ以上の標的生物ポリペプチドのアレイに関する。上記アレイは、体液性免疫応答を誘発することが可能である標的生物抗原を同定するために、標的生物ポリペプチドをスクリーニングするのに使用することができる。上記方法は、リンカー分子に結合された標的生物ポリペプチドのアレイを提供すること、少なくとも10個の標的生物ポリペプチドを固体支持体に固定化すること、および上記標的生物由来の1つまたは複数の抗原で免疫化した動物からの少なくとも1つの抗体を用いて上記ポリペプチドをアッセイすることであって、それにより体液性免疫応答を誘発することが可能な標的生物抗原を同定することを含むことができる。
Tickborne encephalitis viruses)、多剤耐性TB、狂犬病ウイルス(Rabies virus)、リフトバレー熱ウイルス(Rift Valley Fever virus)、ラッサ熱ウイルス(Lassa Fever virus)、インフルエンザウイルス(Influenza virus)、ならびに黄熱病ウイルス(Yellow fever
virus)等を含む病原体であり得る。アレイ中のポリペプチドは、無数の様式(例えば、溶液中に懸濁されているか、またはアレイに結合されている)で配置させることができる。さらに、配置されるポリペプチドは、例えば6×、7×、8×、9×または10×ヒスチジンタグ、GSTタグ、蛍光タンパク質タグ、またはFlagタグからなる群から選択されるリンカー分子に結合され得る。リンカー分子を伴い配置されたポリペプチドは、アレイに結合され得る。
、ニパウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、多剤耐性TB、狂犬病ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ラッサ熱ウイルス、インフルエンザウイルス、ならびに黄熱病ウイルス等を含む病原体であり得る。
標的生物
「標的生物」という用語は広く解釈されるべきであり、ヒトおよび他の霊長類または家畜のような哺乳類、細菌、真菌、原生動物、ウイルス等を含む任意の原核もしくは真核生物または細胞を包含する。ある特定の実施形態では、標的生物は、比較的大きなゲノムを有する病原体であり得る。標的生物の例としては、ワクシニアウイルス、炭疽菌、ボツリヌス菌、ペスト菌、大痘瘡、野兎病菌、熱帯熱マラリア原虫、連鎖球菌属、ライム病菌、トラコーマクラミジア、ヘリコバクター・ピロリ、結核菌、ウイルス性出血熱の原因となる病原体、エボラ、マールブルグ、ポックスウイルス、アレナウイルス、LCM、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ブンヤウイルス、ハンタウイルス、フラビウイルス、デング熱ウイルス、フィロウイルス、Q熱リケッチア、ブルセラ種、鼻疽菌、トウゴマ、ウェルシュ菌、ブドウ球菌属、発疹チフスリケッチアおよび他のリケッチア属、食物および水媒介性病原体、下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ属、赤痢菌属種、サルモネラ属、リステリア菌、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリティカ、カリチウイルス、A型肝炎原生動物、クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カヤタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラスマ属、微胞子虫類、ウイルス性脳炎、西ナイルウイルス、ラクロセウイルス、VEE、EEE、WEE、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林ウイルス、ニパウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、多剤耐性TB、狂犬病ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ラッサ熱ウイルス、インフルエンザウイルス、ならびに黄熱病ウイルス等が挙げられる。
本発明のある特定の方法は、転写的に活性なポリメラーゼ連鎖反応(「TAP」)の使用によりポリペプチドライブラリーを迅速に作製するのに有用である。TAP技術を用いると、例えば1日未満で所定の特定の遺伝子を転写的に活性にさせ、発現の準備を完了させることができる。TAP断片は、転写的に活性なコード配列を包含し、2つの用語は交換可能に使用することができる。TAP断片は発現ベクターへのサブクローニングおよび細菌由来のプラスミドDNAの精製を必要とせずに、任意の核酸トランスフェクション技法により動物細胞または組織に容易にトランスフェクトすることができるポリヌクレオチド断片を包含する。転写的に活性なDNA断片は、ネスト化したオリゴヌクレオチドプライマーおよび2つのDNA断片を用いて、任意の所定の遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅により合成することができ、2つのDNA断片のうち1つは、活性な転写プロモーター配列を含み、もう1つは基本的な転写ターミネーター要素を含む。
レオチドはまた、mRNAのより効率的な翻訳のために、開始コドン周辺にコザックコンセンサス配列(A/GCCAUGG)を組み込んでもよい。一実施形態では、開始コドンATGが、カスタム5’−オリゴヌクレオチドに含まれ得る。別の実施形態では、所定のペプチドをコードする配列はその5’末端に開始メチオニンコドンを欠如する場合、開始コドンATGがカスタム5’−オリゴヌクレオチドに包含され得る。
上述するように、TAP技術を用いて、プロモーター配列、ターミネーター配列、転写因子用の結合部位、TATAボックス配列、およびエンハンサー等の追加要素を有した形で、遺伝子を増幅することができる。さらに、遺伝子がコードするポリペプチドのより迅速なスクリーニング、特性化、精製および研究を可能にすることができる追加の要素有した形をで、遺伝子を増幅することができる。これらの追加要素としては、例えば、レポーター遺伝子、親和性タグ、抗体タグ、PNA結合部位、ヒスチジンタグ、分泌シグナル、
レポーター遺伝子等が挙げられる。TAP一次断片またはTAP発現断片に付加することができる他のかかる追加要素の1つは、リンカー分子をコードするポリヌクレオチドである。「リンカー分子」という用語は、ポリペプチドを固体支持体に固定化することが可能である任意の分子を包含する。
多くの遺伝子療法およびDNAワクチン適用に関して、遺伝子産物がトランスフェクト細胞から分泌されることが有益である。この理由により、TAP系および方法の1つのバージョンは、遺伝子産物が分泌シグナルを含有するように設計され得る。一般に使用されるシグナルペプチドは、以下に示す:ATG GAT GCA ATG AAG AGA
GGG CTC TGC TGT GTG CTG CTG CTG TGT GGA
GCA GTC TTC GTT TCG CCC AGC(配列番号1)のようなコード配列を有するヒト組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)由来の最初の23個のアミノ酸である。この配列は、TAPプロモーター断片に組み込まれることができ、上述のタグ付けポリペプチドの構築と同様の様式で新規TAP断片を創出することができる。
遺伝子の機能または免疫原性がTAP expressを用いることでいったん同定されれば、遺伝子をプラスミドベクターにクローニングすることに関心がもたれ得る。TAP expressは、Gene Therapy Systems, San Diego, Californiaから入手可能である。TAPクローニングは、これを達成する迅速かつ利便性のよい方法である。
Electro−Comp細胞に直接エレクトロポレートすると、内因性細菌リコンビナーゼ活性が2つのDNA断片を組換えて、挿入TAP Express断片を有するプラスミドを生じる。このプロセスは、従来のクローニングを2つの簡素なPCR工程で置き換えることができる。幾つかの実施形態では、上記プロセスは、DNA断片の切断、ペースティングおよび連結を必要としない。さらに、このプロセスは、制限酵素、DNAリガーゼ、トポイソメラーゼ、または他のDNA修飾酵素に頼ることなく、TAP PCR断片の迅速かつ利便性のよいクローニングに非常に適し得る。すべての「TAP」系、ベクターおよび細胞は、Gene Therapy Systems, San Diego, Californiaから容易に入手可能である。
本発明の実施形態では、標的生物由来のTAP断片の生成に関与したあらゆる工程を実施するためのシステムを使用することができる。さらに、各個々の工程は、システムにより制御され得る。例えば、システムは、カスタマイズされたPCRプライマーを設計し、上記プライマーを獲得し、TAP技術を利用してPCR反応を実施し、プロモーターおよびターミネーターを結合し、リンカー分子をコードする配列を一次断片または発現断片に結合することができる。上記システムは、自動化され得るか、または自動化され得ない。
転写的に活性な状態で増幅されたDNA断片は、ゲノムで各遺伝子に関して相当するポリペプチドを獲得するために、各種発現系で直接使用することができる。本発明は、任意の核酸トランスフェクション技法により、動物細胞または組織に容易にトランスフェクトされ得る転写的に活性なDNA断片を生成する簡素で効率的な方法を提供する。上記方法は、発現ベクターへのサブクローニングおよび細菌からのプラスミドDNAの精製の必要性を回避することができる。当業者が理解できることであるが、TAP断片は、in vivoまたはin vitro(例えば、無細胞)発現系を用いて迅速に発現させることができる。例えば、増幅断片は、発現用の真核細胞または原核細胞に直接トランスフェク
トすることができる。発現に使用され得る真核細胞の例としては、哺乳類、昆虫(例えば、バキュロウイルス発現系)、酵母(例えば、ピキア・パストリス)等が挙げられる。原核細胞発現系の例としては、大腸菌が挙げられる。
90個、約200個、約210個、約220個、約230個、約240個、約250個、約260個、約266個、約300個、約350個、約400個、約450個、約500個、約550個、約600個、約650個、約700個、約750個、約800個、約850個、約900個、約950個、約1,000個、約1,050個、約1,100個、約1,150個、約1,200個、約1,250個、約1,300個、約1,350個、約1,400個、約1,450個、約1,500個、約1,600個、約1,700個、約1,800個、約1,900個、約2,000個、約2,500個、約3,000個、約3,500個、約4,000個、約4,500個、約5,000個、約6,000個、約7,000個、約8,000個、約9,000個、約10,000個、約15,000個、約20,000個、約25,000個、約30,000個またはそれ以上の異なるポリペプチドを包含してもよい。さらに、本発明は、ポリペプチドの少なくとも1つが少なくとも1つのリンカー分子に結合されたアレイを包含する。
一実施形態では、完全ヒトプロテオームまたは複数のヒトポリペプチドは、例えば抗体ライブラリーをスクリーニングために迅速に獲得および利用され得る。完全ヒトプロテオームは、非常に短期間で生成することができる。この企画は、4工程に分けることができる。例えば、ヒトゲノムの配列は、公的遺伝子データベースから当業者により容易に獲得され得る。配列情報に基づいて、ヒトゲノム中の各遺伝子または複数のヒト遺伝子をコードする、およそ27,000個の転写的に活性なPCR(TAP)一次断片が生成され得る。これらのおよそ27,000個の断片が必ずしも選択的スプライシングにより産生された追加的な産物の原因となるとは限らないことに留意すべきである。これらの産物用のヌクレオチドコード配列もまた、増幅および発現され得る。
えば抗体スクリーニングアッセイで使用するためのさらなる精製を必要としない。プロテオームはマイクロチップ上に表示され、組換え抗体ライブラリーをスクリーニングするのに使用され得る。プロテオームは、例えば細胞スクリーニングアッセイで使用され得る。続いて、抗体は、例えば試薬を開発するのに使用され得る。あるいは、抗体を用いて、どのポリペプチドがそこで発現されるかを確認するために各種細胞および組織(例えば、ヒト腫瘍組織のような)におけるポリペプチド発現を確認することができる。このアプローチは、任意の組織でポリペプチドを局在化させるのに使用することができる。ポリペプチドは、例えば免疫疾患のようなヒト疾患に関与したポリペプチドに関してスクリーニングすることができる。
TAP技術を用いて所定の遺伝子を増幅する以外に、本発明はまた、「アダプター技術」を用いて遺伝子を増幅することを包含する。幾つかの実施形態では、アダプター技術は、1工程のPCR反応を利用することができる。本明細書中に記載する場合、「アダプター技術」という用語は、所望の核酸配列、例えば所定の遺伝子を、第1および第2のアダプター配列と隣接させることにより、所望の核酸断片をベクターにクローニングする方法に関する。得られた断片は、宿主細胞における核酸断片がin vivoでの相同組換えによりベクターに組み込まれるような条件下で第1および第2のアダプター配列に相同的な配列を有するベクターと接触させることができる。したがって、アダプター技術は、ベクターへの核酸断片の迅速かつ無酵素クローニングを可能とし、首尾よい形質転換用の強制クローニング選択に使用することもできる。アダプター技術は、「核酸断片の迅速かつ無酵素クローニング(Fast and Enzymeless Cloning of Nucleic Acid Fragments)」という表題の米国特許出願第09/836,436号、「核酸断片の迅速かつ無酵素クローニング(Rapid and Enzymeless Cloning of Nucleic Acid Fragments)」という表題の米国特許出願第10/125789号、およびPCT出願第PCTUS 02/12334号にさらに詳述されている。
るほとんどの実施形態がTAP技術に関して議論されるが、以下のアッセイはすべて、同様にアダプター技術発現産物で使用することができる。いったん適切なアッセイがアダプター技術発現産物で実施されれば、ワクチンを開発する方法が利用され得る。以下に記載するワクチンを開発することに関する実施形態のほとんどがTAP技術に関係するが、ワクチン実施形態のすべてはまた、アダプター技術から生じるポリペプチドライブラリーおよびアレイとともに使用することができる。
TAPまたはアダプター技術、および続く発現により調製されるポリペプチドのライブラリーおよびアレイは、ポリペプチドまたは核酸サブユニットワクチンの開発に有用であり得る。DNAワクチンは、製造するのに安価な有効ワクチンであり、広く分布させることができる。DNAワクチン(または任意の組換えサブユニットワクチン)を開発する際の最も困難な作業の1つは、特に生物のゲノムが大きい場合に、病原体に対して最も有効な免疫応答を刺激することができる抗原の同定である。
本発明の一実施形態は、体液性および細胞媒介性免疫応答を引き起こすワクシニアウイルスにおける抗原すべてを系統的にスクリーニングおよび同定することが可能であるTAP Expressを用いた迅速なハイスループットワクチン抗原スキャニングアプローチを取り入れる。上記ワクシニア抗原の同定により、高特異的サブユニットワクチンの開発が可能となる。図2は、TAP技術を用いて多数の遺伝子を増幅し、上記遺伝子産物を
発現させ、得られたポリペプチドを精製および定量化する方法を示す。図2はさらに、細胞媒介性または体液性免疫応答を誘起するポリペプチドの能力を同定するためにアッセイされ得るポリペプチドを調製する方法を示す。
る。さらに、遺伝子特異的プライマー配列を、オリゴヌクレオチド合成供給者(例えば、MWG Biotech, Inc, High Point, NC.)に送ることができ、そこでプライマーが合成され得る。合成プライマーは、100pmole/μlの濃度でバーコード付きプレートに構築および分取され、凍結され、実施者へと輸送され得る。一実施形態では、266個のワクシニアウイルス遺伝子それぞれを増幅することが可能である524個の遺伝子特異的PCRプライマーが設計され、生成され、注文され、構築される。
ができる。一実施形態では、384スポットの「アンカーチップ」標的プレート(Bruker Daltonics, Billerica, MA)が使用され得る。プレートは、Brucker Autoflex MALDI−TOF質量分析計の試料段へと移行させることができる。分析計は、自動的にプレートをスキャンし、インターネットを介してMascotポリペプチドデータベースを検索するように設定することができる。したがって、非常に迅速な確証システムは、ポリペプチドの量に応じて、例えば1日未満で純度、同定および量を確証することができる。精製ポリペプチドは、ライブラリーに配置され得るか、または続く試験および分析用のアレイへと構築され得る。
例えば上記方法に従って(例えば、TAPまたはアダプター技術を用いて)調製されるワクシニアウイルスポリペプチドライブラリーおよびアレイの使用は、ワクシニアでワクチン接種した動物における体液性免疫性の抗原性標的を同定するのに使用され得る。体液性免疫応答は、抗体の生成および特定の抗原に結合する抗体の能力に関する。概して、体液性免疫系は白血球細胞を使用し、これは抗原を認識する能力を有し、抗原に結合することが可能である抗体を生成する。
ことができる。また、当業者は、結合されているポリペプチド特異的抗体の量を測定するための酵素アッセイを開発することができる。一実施形態では、アッセイからの読み出しは、96ウェルそれぞれにおける異なるレベルの抗体の存在を示すことができる。例えば、いかなる血清抗体をも生成することができないワクシニアウイルスポリペプチドがある一方で、中間レベルの抗体を生成することができるポリペプチドもあれば、高抗体レベルを生成することができるものもある。一実施形態では、高抗体力価を生成するポリペプチドは、どのポリペプチドがウイルスの表面上に存在するかを測定するためにさらに研究され得る。特定の実施形態では、高抗体力価を生成し、ウイルスの表面に位置するポリペプチドは、サブユニット天然痘ワクチンの開発で使用するための良好な候補物であり得る。
上記方法に従って(例えば、TAPまたはアダプター技術を用いて)調製されるワクシニアウイルスポリペプチドライブラリーおよびアレイの使用はまた、ワクシニアでワクチン接種した動物における細胞媒介性免疫性の抗原性標的を同定するのに使用され得る。抗体が抗原への結合を直接結合する体液性免疫応答と対比して、細胞媒介性免疫応答は、抗原を表示する他の細胞の表面上へのT細胞結合に関する。ある特定のT細胞が提示抗原と接触すると、T細胞はインターフェロン−γ(IFN−γ)または腫瘍壊死因子−α(TNF−α)のようなサイトカインを産生および放出する。サイトカインは、別の細胞の挙動または特性を変更させることができる細胞性シグナルである。例えば、サイトカインは、ウイルス複製を阻害し得るか、感染細胞におけるMHCクラスIおよびペプチド輸送体分子の発現の増加を誘導し得るか、またはマクロファージを活性化し得る。したがって、抗原への結合に関連したT細胞より放出されるサイトカインは、T細胞/抗原相互作用を同定および検出するのに使用することができる。
T細胞を包含するCD4+T細胞は、クラスII MHC分子の一部であるエピトープを結合する。特殊抗原提示細胞のみが、クラスII分子を発現する。
とができるが、マクロファージおよびB細胞は、感染により適切に活性化される場合のみ、それらの分子を発現する。
できるかどうかが測定され得る。例えば、EliSpotアッセイを実施して、抗原特異的T細胞を同定することができる。同様の免疫アッセイを実施して、ワクシニアで免疫化した個体由来のT細胞を刺激するワクシニア抗原(抗原提示細胞により提示される)を同定することができる。
ワクシニアの実施形態と同様に、以下の熱帯熱マラリア原虫の実施形態に開示される方法および装置は、任意の所定の標的生物または細胞に適用可能である。したがって、この実施形態は、本発明の限定として提供されるのではなく、特定の標的生物の実用的な例として提供されるものである。
およびスクリーニングする時間および費用は、本発明の方法を使用して大いに低減される。今やDNAまたはポリペプチドワクチンに関して最も有効な抗原を同定し、ならびにこれらの抗原の段階特異的発現ならびに細胞下局在化および機能的活性を確立するための基盤を提供することが可能である。
ペプチドに対して誘導される防御的抗体の標的である別のサブセットが存在することである。本発明の目標は、人における防御的細胞性および体液性免疫応答を生成することを担うマラリアポリペプチドすべてを同定およびカタログ作製し、また照射スポロゾイト免疫化により誘発される応答をマラリアへの自然暴露により誘発される応答と比較するための迅速なハイスループットアプローチを開発することである。
smodium)プロテオームは、96ウェルマイクロタイタープレートの表面上に表示され得る。HisTAP方法、システム、およびキットは、HA−EpiTAPアプローチの代わりに使用され得る。また、in vitro転写/翻訳アプローチにおけるT7は、細胞ベースのシステム、あるいはそれらと連動したものよりむしろ、遺伝子を発現するためのシステムおよび方法の一例である。
ゾイトで免疫化した免疫ボランティアまたはマラリアに自然に暴露された半免疫個体からの試料の使用に依存し得る。混合培養中のIFN−γレベルは、ワクシニアウイルスに関して実施例3に開示するアッセイと同様のElispotアッセイを用いることで測定され得る。
体液性または細胞媒介性免疫応答のいずれかを誘発すると同定された特定のポリペプチドは、サブユニットワクチン、薬学的組成物または免疫原性組成物で使用されるその能力を確定するためにさらに調査され得る。「サブユニットワクチン」、「薬学的組成物」および「免疫原性組成物」という用語は、ポリペプチド、核酸、またはその両方の組合せから構成されるワクチンを包含する。ポリペプチド候補物のさらなる調査には、高率の患者におけるポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸の試験が含まれる。特定の実施形態では、表面抗原は、それらがウイルス感染性を抑制し得る見込みのために綿密に研究され得る。一実施形態では、ワクシニアゲノムによりコードされるあらゆるポリペプチドは、その免疫原性効果を測定するためにアッセイされる。細胞媒介性であろうと体液性であろうと、免疫応答を誘発するポリペプチドは、サブユニットワクチン、薬学的組成物、または免疫原性組成物として、単独での、あるいは他のポリペプチドおよび遺伝子と併用した潜在的使用を測定するためにより綿密に研究され得る。免疫応答を選択および研究するための適切な方法論は、当該技術分野で十分に確立されている。
上記実施形態は、ワクシニアポリペプチドの免疫原性応答を検出し、その結果に基づいてサブユニットワクチンを開発するための詳細な説明を提供するが、任意の特定の標的生物に関して同様の方法が利用され得ることを当業者は理解することができる。
タグ付けT7−TAP Express断片を生産するのに使用された詳細な手順は、以下の通りである:96個の異なる遺伝子をプラスミド鋳型の混合物から増幅した。第1のPCR反応は、カスタマイズされた5’および3’プライマーを用いて実行した。5’プライマーは、43〜48塩基を含有していた。特に、T7−His TAP末端は28塩基を含有していた一方で、遺伝子特異的構成成分は15〜20塩基を含有していた。3’プライマーは45〜50塩基を含有していた。具体的には、T7−ターミネーターTAP末端は30塩基を含有していた一方で、遺伝子特異的構成成分は15〜20塩基を含有していた。第1のPCR反応に関する反応温度および時間は、94℃で2分間、続いて94℃で20秒間、58℃で35秒間、および70℃で2分間(2kb以上を含有する遺伝子に関しては、各kbについて1分を追加)を28サイクルであった。
断片は74塩基オリゴヌクレオチドであった。第2のPCR反応に関する反応時間および温度は、94℃で2分間、続いて94℃で20秒間、60℃で35秒間、および70℃で2分間(2kb以上を含有する遺伝子に関しては、各kbについて1分を追加)を30サイクルであった。
防御的体液性免疫応答を引き起こすワクシニアウイルスにおける抗原すべてを系統的にスクリーニングおよび同定するのに使用される方法は以下の通りである。TAP技術の使用により、ワクシニアゲノムのあらゆる遺伝子が増幅される。PCR反応は、HAエピトープをコードするヌクレオチド配列がこれらの増幅された転写的に活性な遺伝子に結合されるように実施される。生じたHAタグ付けTAP断片を、HAエピトープタグを含有する266個のワクシニアウイルスポリペプチドすべてを産生するように発現させる。266個のHAタグ付けポリペプチドを、96ウェルプレート中の異なるHA抗体でコーティングしたウェルに入れる。ワクシニアで免疫化したヒト由来の血清を266個の異なるウェルそれぞれに添加する。反応をインキュベートして、洗浄して、未結合の血清ポリペプチドを除去する。プレートに結合したポリペプチドに特異的な抗体は、依然としてプレートに結合したままである。酵素結合抗ヒト抗体(ヒト血清由来のポリペプチド特異的抗体の検出用)を各ウェルに添加する。ウェルをインキュベートして、洗浄して、未結合の抗体を除去する。基質を添加して、プレートに結合しているポリペプチド特異的抗体を定量化する。
防御的細胞媒介性免疫応答を引き起こすワクシニアウイルスにおける抗原すべてを系統的にスクリーニングおよび同定するのに使用される方法は以下の通りである。TAP技術の使用により、ワクシニアゲノムのあらゆる遺伝子が増幅される。PCR反応は、あらゆる遺伝子が転写的に活性となるように実施される。生じたTAP断片を、266個のワクシニアウイルスポリペプチドすべてを産生するように発現させる。ポリペプチドそれぞれを、ポリペプチド供給試薬を用いて96ウェルプレート中に配置される樹状細胞へと供給する。ワクシニアで免疫化したヒト由来の血清を266個の異なるウェルそれぞれに添加する。
Millipore96ウェルマルチスクリーンフィルトレーションプレート(Millopore #MAIP S45−10)(Millipore, Bedford, MA)
抗IFN−g精製MAb(クローン1−D1K)(MABTECH #3420−3)(Mabtech, Naka, Sweden)
抗IFN−gビオチン化MAb(クローン7−B6−1)(MABTECH #3420−6)(Mabtech, Naka, Sweden)
ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ(MABTECH #3310−8)(Mabtech, Naka, Sweden)
アルカリホスファターゼ基質キット(BIO−RAD #170−6432)(Bio-Rad, Hercules, CA)
カーボーネート緩衝液pH9.6(0.2μM滅菌濾過)
PRMI−1640培地(GIBCO #22400−089)(Gibco, Grand Island
, N.Y.)
ウシ胎児血清(Sigma #F4135−500mL)(Sigma, St. Louis, MO)
1×PBS(10×PBS DIGENE #3400−1010から調製)(DIGENE,
Gaithersburg, MD)
Tween(R)20(J.T.Baker #X251−07(J.T.Baker, Phillipsburg, NJ)
96ウェルプレートは、10〜15μg/mL(100μL/ウェル)でコーティング抗体(抗IFN−gクローン1−D1K)でコーティングし、4℃で一晩インキュベートする。無菌技法を用いて、プレートを軽くはじいてコーティング抗体を除去して、RPMI−1640で6回洗浄する。プレートを、RPMI−1640+10%FBS(またはヒトAB血清)100μL/ウェルで室温にて1〜2時間ブロックする。プレートを軽くはじいてブロッキング緩衝液を除去して、抗原特異的ペプチドまたは対照ペプチド100μL/ウェルを、最終濃度10μg/ウェルで添加する。末梢血リンパ球(PBL)を4×105/ウェルおよび1×105/ウェルで添加する。プレートを37℃/5%CO2で36時間インキュベートする。プレートを軽くはじいて細胞を除去して、200〜250μL/ウェルでPBS+0.05%Tween(R)20を用いて6回洗浄する。プレートをペーパータオル上でブロット乾燥する。
ヒトボランティアを、マラリアの原因である感染性作用物質である熱帯熱マラリア原虫由来の照射スポロゾイトで免疫化した。ボランティア由来の樹状細胞を単離および培養する。熱帯熱マラリア原虫由来の組換えCSPポリペプチドを、「細胞内タンパク質供給試薬(Intracellular Protein Delivery reagents)」という表題の米国特許出願第09/738046号に記載されるポリペプチド供給試薬を用いてまたは用いずに、樹状細胞へ供給した。免疫化ボランティアから単離したT細胞を培養物に添加した。EliSpotア
ッセイにより、CSPが上記供給試薬と一緒に培養物に添加された場合に培養物に添加された250,000個のT細胞から120個のCSP抗原特異的T細胞が同定された。CPSが上記供給試薬なしで添加された場合、シグナルはかろうじてバックグラウンドを超えた。
1つの実験当たり40匹の動物を平均とし、4週齢のBALB/c雌マウスから構成される1群当たり5匹の動物で実験を設定する。これらのマウスを、選択したワクシニアウイルス抗原をコードするプラスミドDNAまたは転写的に活性なPCR断片50μgで、各前脛骨筋に、3週間隔で3回筋内に免疫化する。
ワクシニアビリオンDNAをPCR鋳型として使用する。粗製ストックワクシニアを用いて、HeLA細胞攪拌培養物10リットルを感染させる。感染の2〜3日後に、遠心分離により細胞を収集し、氷上で10mM トリスHCl(pH9.0)中で少しずつ破壊する。核をペレット化して、洗浄して、再ペレット化して、その後上清を組み合わせて、トリプシン処理して、36%スクロースクッション上に置いた。遠心分離後、ペレット化したウイルスを分散させて、トリプシン処理して、5〜40%スクロース勾配上へ載せる。バンドを収集し、希釈して、ウイルスを洗浄する。精製ビリオンのデオキシコレート抽出物を遠心分離して、細片を除去して、ペレットを再抽出し、組み合わせた上清をDEAEセルロースカラムにかけて、0.1M KCl、トリスHCl(pH8.4)で平衡化する。250mM KClでカラムを洗浄した後、ワクシニアDNAを0.7M KClで溶出させ、エタノール沈殿し、TE緩衝液に再溶解させる。
樹状細胞を、Allcells:カタログ番号PB002(NPB−単核細胞)から注文した。細胞は50mL緩衝液中に存在していた。細胞をすぐに計数し、総数は312.5×106個であった。細胞をペレット化して、DNアーゼを含有する25mL RPMI−1640中に再懸濁させた。この溶液(30μg/mL)を室温で5分間インキュベートした。完全培地で細胞を二度洗浄した。細胞を10×106個の細胞/3mLで再懸濁させた。皿それぞれに完全培地10mLを含有する12個の10mm皿を使用した。細胞を37℃で3時間インキュベートした。プレートを穏やかに振とうし、上清を吸引することにより、非接着細胞を除去した。その後、接着細胞を含有する皿を、2%ヒト血清を含有するRPMI−1640 10mLで3回洗浄した。50ng/mLのGM−CSFおよび500ng/mL IL−4を含有する培養培地10mLを、プレートそれぞれに添加した。この培養培地は4日目まで添加した。4日後、GM−CSFおよびIL−4の入っていない培養培地を添加した。トランスフェクションは5日目に行われた。完全培地は、RPMI−1640(455mL)、5%ヒトAB血清(25mL)、非必須アミノ酸(5m
L)、ピルビン酸ナトリウム(5mL)、L−グルタミン(5mL)、およびペニシリン−ストレプトマイシン(5mL)から構成されていた。
1匹のマウスの骨(マクロファージを除去していない大腿骨2つおよび脛骨2つ)から細胞を採取した。骨髄から赤血球を獲得して、溶解した。細胞を計数し(51×106個の細胞、総数)、トランスフェクション前に、成長培地中で8日間培養した(2.5×106個の細胞/プレート、10mL/プレート)。4日目に、成長培地をもう10mL添加した。6日目に、古い培地10mLを各プレートから採取して、細胞をペレット化した。10ng/mLのGM−CSFおよび2.5ng/mL IL−4を有する培地10mL中に細胞を再懸濁させた。細胞を培養に戻した。8日目にトランスフェクトするまで細胞を培養した。トランスフェクションの日に、2.5×106個の細胞を各皿から収集した。mbmDC用の成長培地は、DMEM/Iscove、10% FCS、50μM β−メルカプトエタノール、1×ペニシリン/ストレプトマイシン、2mM L−グルタミン、10mM ヘペス、1×非必須アミノ酸、20ng/mL rmGM−CSF、および5ng/mL rmIL−4を含有していた。
オリゴは、それぞれpCMVmおよびpTP−SV40からのTAPプロモーターおよびターミネーター断片を用いて、HAエピトープタグをコードするヌクレオチド配列を付加して設計される。コード配列の5’末端へのHAエピトープの付加に関して、以下の配列を使用する:
プロモーター5’:CCGCCATGTTGACATTG(配列番号2)
プロモーター3’:GGCAGATCTGGGAGGCTAGCGTAATCCGGAACATCGTATGGGTACATTGTTAAGTCGACGGTGC(配列番号3)
コード配列の3’末端へのHAエピトープの付加に関して、以下の配列を使用する:
ターミネーター5’:GATCCCGGGTACCCATACGATGTTCCGGATTACGCTTAGGGGAGATCTCAGACATG(配列番号4)
ターミネーター3’:CAGGATATCATGCCTGCAGGACGACTCTAGAG(配列番号5)
PCRを用いて、鋳型としてpCMVmを利用して新規HAプロモータを、および鋳型としてpTP−SV40を利用して新規HAターミネーターを増幅する。得られたPCR産物を、QIAGEN QIAquickゲル抽出キット(Qiagen, Seattle, WA)を用いてゲル精製する。PCR産物および両方のプラスミド(pCMVmおよびpTP−SV40)をEcoRVおよびBglII制限酵素で消化する。消化産物すべてを、QIAquickゲル抽出キットを用いてゲル精製する。HAプロモーターおよびHAターミネーターを、消化pCMVmおよびpTP−SV40プラスミドに個々に連結する。これらのプラスミドをDH5に形質転換して、カナマイシンを含有するLBプレート上で一晩成長させ、コロニーを選択して、カナマイシンを含有するLB培地中で成長させる。QIAGEN QIAprepスピンミニプレップキットを用いて、プラスミドを単離する。EcoRVおよびBglIIを用いてプラスミドを消化する。消化物をゲル上に流して、正しいサイズの挿入物を有するプラスミドを含有するコロニーを同定する。プラスミドをシーケンシングして、挿入物が正しいことを確認する。プレップ培養を成長させ、プラスミドを単離して、プラスミドをEcoRVおよびBglIIで消化して、プロモーターおよびターミネーター断片をゲル精製する。Epi−TAP−5’HAおよびEpi−TAP−3
’HAキットを使用する。
Claims (80)
- 標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法であって、以下の:
(a)転写的に活性でない増幅コード配列を提供する為に、前記標的生物由来の所望のポリヌクレオチド配列を増幅することが可能な第1のプライマー対を用いて第1のPCR反応を実施する工程、
(b)前記増幅コード配列に転写活性を付与する少なくとも1つのヌクレオチド配列を付加することが可能な第2のPCRヌクレオチドプライマー対を提供する工程、
(c)転写的に活性なコード配列の増幅をもたらす為に、前記第2のプライマー対および前記増幅コード配列を用いて第2のPCR反応を実施する工程、
(d)前記転写的に活性なコード配列のポリペプチドを発現させる工程、
(e)前記標的生物の異なるポリペプチドを発現するための異なる第1のプライマー対を用いて、工程(a)〜工程(d)を少なくとも10回繰り返す工程、
を含む標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。 - 前記工程(a)〜工程(d)は少なくとも20回繰り返される、請求項1に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
- 前記工程(a)〜工程(d)は少なくとも100回繰り返される、請求項1に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
- 前記工程(a)〜工程(d)は約266回繰り返される、請求項1に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
- 前記標的生物はワクシニアウイルスである、請求項1に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
- リンカー分子を操作可能にコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列を、前記増幅コード配列または前記転写的に活性なコード配列に付加することをさらに含む方法であって、前記リンカー分子は前記ポリヌクレオチドを固体支持体に固定化する、請求項1に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
- 前記転写的に活性なコード配列およびリンカー分子を操作可能にコードするポリヌクレオチド配列を発現させることにより、リンカー分子に結合された標的生物ポリペプチドを生じさせる、請求項6に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
- 前記リンカー分子はエピトープである、請求項7に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
- 前記リンカー分子は、6×、7×、8×、9×および10×his−タグ、GSTタグ、蛍光タンパク質タグ、Flagタグ、ならびにHAタグからなる群から選択される、請求項7に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
- 前記転写活性を付与する少なくとも1つの配列はプロモーター配列である、請求項1に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
- 前記転写活性を付与する少なくとも1つの配列はターミネーター配列である、請求項1に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
- 自動化システムを用いて前記第1のプライマー対を設計することをさらに含む、請求項
1に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。 - 前記第1のPCR反応は自動化システムを用いて実施される、請求項1に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
- 前記第2のPCR反応は自動化システムを用いて実施される、請求項1に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
- 前記転写的に活性なコード配列は自動化システムを用いて発現される、請求項1に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
- 体液性免疫応答を誘発することが可能である標的生物抗原を同定するために、標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法であって、以下の:
請求項7に記載の方法により調製されるリンカー分子に結合された標的生物ポリペプチドのライブラリーを提供する工程、
少なくとも10個の前記標的生物ポリペプチドを固体支持体に固定化する工程、および
体液性免疫応答を誘発することが可能な標的生物抗原を同定する為に、前記標的生物由来の1つまたは複数の抗原で免疫化した動物からの少なくとも1つの抗体を用いて前記ポリペプチドをアッセイする工程、
を含む標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。 - 前記標的生物はワクシニアウイルスである、請求項16に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。
- 細胞媒介性免疫応答を誘発することが可能である標的生物抗原を同定するために、標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法であって、以下の:
請求項1に記載の方法により標的生物ポリペプチドのライブラリーを提供する工程、
少なくとも10個の前記標的生物ポリペプチドを複数の抗原提示細胞に供給する工程、および
細胞媒介性免疫応答を誘発することが可能な標的生物抗原を同定する為に、前記標的生物由来の1つまたは複数の抗原で免疫化した動物からの少なくとも1つのT細胞を用いて前記抗原提示細胞をアッセイする工程、
を含む標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。 - 前記標的生物はワクシニアウイルスである、請求項18に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。
- 前記抗原提示細胞はB細胞である、請求項18に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。
- 前記抗原提示細胞はマクロファージである、請求項18に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。
- 前記抗原提示細胞は樹状細胞である、請求項18に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。
- 標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法であって、以下の:
請求項16に記載の方法により同定される、免疫応答を誘発することが可能である標的生物抗原を提供する工程、
前記抗原を、単独であるいは免疫応答を誘発することが可能である少なくとも1つの他
の標的生物抗原と組み合わせて被験体に投与する工程、および
前記被験体における前記抗原または該抗原の組合せに対する免疫応答の発生をモニタリングする工程、
を含む標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法。 - 前記標的生物はワクシニアウイルスである、請求項23に記載の標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法。
- 標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法であって、以下の:
請求項18に記載の方法により同定される免疫応答を誘発することが可能である標的生物抗原を提供する工程、
前記抗原を、単独であるいは免疫応答を誘発することが可能である少なくとも1つの他の標的生物抗原と組み合わせて被験体に投与する工程、および
前記被験体における前記抗原または該抗原の組合せに対する免疫応答の発生をモニタリングする工程、
を含む標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法。 - 前記標的生物はワクシニアウイルスである、請求項25に記載の標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法。
- 標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法であって、以下の:
請求項16に記載の方法により免疫応答を誘発することが可能であると同定された標的生物抗原を操作可能にコードする核酸配列を提供する工程、
前記核酸配列を、単独であるいは標的生物抗原を発現することが可能である少なくとも1つの他の核酸と組み合わせて被験体に導入する工程、および
前記被験体における前記核酸または該核酸の組合せに対する免疫応答の発生をモニタリングする工程、
を含む標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法。 - 前記標的生物はワクシニアウイルスである、請求項27に記載の標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法。
- 標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法であって、以下の:
請求項18に記載の方法により免疫応答を誘発することが可能であると同定された標的生物抗原を操作可能にコードする核酸配列を提供する工程、
前記核酸配列を、単独であるいは標的生物抗原を発現することが可能である少なくとも1つの他の核酸と組み合わせて被験体に導入する工程、および
前記被験体における前記核酸または核酸の組合せに対する免疫応答の発生をモニタリングする工程、
を含む標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法。 - 前記標的生物はワクシニアウイルスである、請求項29に記載の標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法。
- 請求項1により調製される少なくとも20個の標的生物ポリペプチドのアレイ。
- 細胞媒介性免疫応答を誘発することが可能である標的生物抗原を同定するために、標的生物ポリペプチドのアレイをスクリーニングする方法であって、以下の:
請求項31に記載の標的生物ポリペプチドの前記アレイを提供する工程、
少なくとも10個の前記標的生物ポリペプチドを複数の抗原提示細胞に供給する工程、
および
細胞媒介性免疫応答を誘発することが可能な標的生物抗原を同定する為に、前記標的生物由来の1つまたは複数の抗原で免疫化した動物からの少なくとも1つのT細胞を用いて前記抗原提示細胞をアッセイする工程、
を含む標的生物ポリペプチドのアレイをスクリーニングする方法。 - 前記標的生物はワクシニアウイルスである、請求項32に記載の標的生物ポリペプチドのアレイをスクリーニングする方法。
- 前記抗原提示細胞はB細胞である、請求項32に記載の標的生物ポリペプチドのアレイをスクリーニングする方法。
- 前記抗原提示細胞はマクロファージである、請求項32に記載の標的生物ポリペプチドのアレイをスクリーニングする方法。
- 前記抗原提示細胞は樹状細胞である、請求項32に記載の標的生物ポリペプチドのアレイをスクリーニングする方法。
- 標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法であって、以下の:
請求項32に記載の方法により同定される、免疫応答を誘発することが可能である標的生物抗原を提供する工程、
前記抗原を、単独であるいは免疫応答を誘発することが可能である少なくとも1つの他の標的生物抗原と組み合わせて被験体に投与する工程、および
前記被験体における前記抗原または前記抗原の組合せに対する免疫応答の発生をモニタリングする工程、
を含む標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法。 - 前記標的生物はワクシニアウイルスである、請求項37に記載の標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法。
- 標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法であって、以下の:
請求項32に記載の方法により免疫応答を誘発することが可能であると同定された標的生物抗原を操作可能にコードする核酸配列を提供する工程、
前記核酸配列を、単独であるいは標的生物抗原を発現することが可能である少なくとも1つの他の核酸と組み合わせて被験体に導入する工程、および
前記被験体における前記核酸または前記核酸の組合せに対する免疫応答の発生をモニタリングする工程、
を含む標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法。 - 前記標的生物はワクシニアウイルスである、請求項39に記載の標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法。
- 請求項7により調製されるリンカー分子に結合された少なくとも20個の標的生物ポリペプチドのアレイ。
- 体液性免疫応答を誘発することが可能である標的生物抗原を同定するために、標的生物ポリペプチドのアレイをスクリーニングする方法であって、以下の:
請求項41に記載の方法により調製されるリンカー分子に結合された標的生物ウイルスポリペプチドのアレイを提供する工程、
少なくとも10個の前記標的生物ポリペプチドを固体支持体に固定化する工程、および
体液性免疫応答を誘発することが可能な標的生物抗原を同定する為に、前記標的生物由来の1つまたは複数の抗原で免疫化した動物からの少なくとも1つの抗体を用いて前記ポリペプチドをアッセイする工程、
を含む標的生物ポリペプチドのアレイをスクリーニングする方法。 - 前記標的生物はワクシニアウイルスである、請求項42に記載の標的生物ポリペプチドのアレイをスクリーニングする方法。
- 標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法であって、以下の:
請求項42に記載の方法により同定される、免疫応答を誘発することが可能である標的生物抗原を提供する工程、
前記抗原を、単独であるいは免疫応答を誘発することが可能である少なくとも1つの他の標的生物抗原と組み合わせて被験体に投与する工程、および
前記被験体における前記抗原または前記抗原の組合せに対する免疫応答の発生をモニタリングする工程、
を含む標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法。 - 前記標的生物はワクシニアウイルスである、請求項44に記載の標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法。
- 標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法であって、以下の:
請求項42に記載の方法により免疫応答を誘発することが可能であると同定された標的生物抗原を操作可能にコードする核酸配列を提供する工程、
前記核酸配列を、単独であるいは標的生物抗原を発現することが可能である少なくとも1つの他の核酸と組み合わせて被験体に導入する工程、および
前記被験体における前記核酸または前記核酸の組合せに対する免疫応答の発生をモニタリングする工程、
を含む標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法。 - 前記標的生物はワクシニアウイルスである、請求項46に記載の標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法。
- 請求項1に記載の方法を実施することが可能な自動化システム。
- 複数の別個の位置を含むアレイであって、標的生物由来の異なるポリペプチドが各位置に配置され、前記標的生物由来の発現ポリペプチド全体の少なくとも約50%が前記アレイ上に配置されるアレイ。
- 前記標的生物由来の発現ポリペプチド全体の少なくとも約75%が前記アレイ上に配置される、請求項49に記載のアレイ。
- 前記標的生物由来の発現ポリペプチド全体の約100%が前記アレイ上に配置される、請求項49に記載のアレイ。
- 前記標的生物はワクシニアウイルスである、請求項49に記載のアレイ。
- 前記配置されるポリペプチドは、6×、7×、8×、9×または10×ヒスチジンタグ、GSTタグ、蛍光タンパク質タグ、ならびにFlagタグからなる群から選択されるリンカー分子に結合される、請求項49に記載のアレイ。
- 前記配置されるポリペプチドは前記別個の位置に結合される、請求項53に記載のアレイ。
- 前記アレイは複数のサブアレイを含む、請求項49に記載のアレイ。
- 前記サブアレイはマイクロタイタープレートである、請求項55に記載のアレイ。
- 前記マイクロタイタープレートは96ウェルプレートである、請求項56に記載のアレイ。
- 標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法であって、以下の:
(a)前記標的生物由来の所望の核酸コード配列を、該コード配列を第1のアダプター配列および第2のアダプター配列と隣接させることによりベクターにPCRクローニングする工程であって、前記第1のアダプター配列および前記第2のアダプター配列はPCRにより付加されることを特徴とし、
(b)宿主細胞においてin vivoでの組換えにより、前記コード配列が、前記ベクターに組み込まれるような条件下で、前記宿主細胞内の前記第1のアダプター配列および前記第2のアダプター配列に相同的な配列を有する前記ベクターと前記コード配列とを接触させる工程と、
(c)前記コード配列によりコードされる前記ポリペプチドを発現させる工程と、
(d)前記標的生物の異なるポリペプチドを発現するための異なるコード配列を用いて、工程(a)〜工程(c)を少なくとも10回繰り返す工程と、
を含む標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。 - 工程(a)〜工程(d)は約266回繰り返される、請求項58に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
- 前記標的生物はワクシニアウイルスである、請求項58に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
- 前記標的生物は炭疽菌(B. anthracis)である、請求項58に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
- 前記標的生物は野兎病菌(Francisella tularensis)である、請求項58に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
- 前記標的生物は熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)である、請求項58に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
- 前記標的生物は結核菌(Mycobacterium tuberculosis)である、請求項58に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
- リンカー分子を操作可能にコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列を、前記標的生物由来の前記核酸コード配列に付加することをさらに含む方法であって、前記リンカー分子は前記発現されるポリヌクレオチドを固体支持体に固定化する、請求項58に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
- 前記所望の核酸コード配列およびリンカー分子を操作可能にコードするポリヌクレオチド配列を発現させることにより、リンカー分子に結合された標的生物ポリペプチドを生じさせる、請求項65に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
- 体液性免疫応答を誘発することが可能である標的生物抗原を同定するために、標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法であって、以下の:
請求項66に記載の方法により調製されるリンカー分子に結合された標的生物ポリペプチドのライブラリーを提供する工程、
少なくとも10個の前記標的生物ポリペプチドを固体支持体に固定化する工程、および
体液性免疫応答を誘発することが可能な標的生物抗原を同定する為に、前記標的生物由来の1つまたは複数の抗原で免疫化した動物からの少なくとも1つの抗体を用いて前記ポリペプチドをアッセイする工程、
を含む標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。 - 前記標的生物はワクシニアウイルスである、請求項67に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。
- 前記標的生物は炭疽菌(B. anthracis)である、請求項67に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。
- 前記標的生物は野兎病菌(Francisella tularensis)である、請求項67に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。
- 前記標的生物は熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)である、請求項67に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。
- 前記標的生物は結核菌(Mycobacterium tuberulosis)である、請求項67に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。
- 細胞媒介性免疫応答を誘発することが可能である標的生物抗原を同定するために、標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法であって、以下の:
請求項58に記載の方法により標的生物ポリペプチドのライブラリーを提供する工程、
少なくとも10個の前記標的生物ポリペプチドを複数の抗原提示細胞に供給する工程、および
細胞媒介性免疫応答を誘発することが可能な標的生物抗原を同定する為に、前記標的生物由来の1つまたは複数の抗原で免疫化した動物からの少なくとも1つのT細胞を用いて前記抗原提示細胞をアッセイする工程、
を含む標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。 - 前記標的生物はワクシニアウイルスである、請求項73に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。
- 前記標的生物は炭疽菌(B. anthracis)である、請求項73に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。
- 前記標的生物は野兎病菌(Francisella tularensis)である、請求項73に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。
- 前記標的生物は熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)である、請求項73に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。
- 前記標的生物はマイコバクテリウム属である、請求項73に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。
- 標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法であって、以下の:
(a)所望のポリヌクレオチドコード配列を増幅することが可能な第1のプライマー対を用いてPCRを実施することにより、前記標的生物由来の前記所望のポリヌクレオチドコード配列を増幅する工程、
(b)前記増幅ポリヌクレオチドコード配列を発現させる工程、
(c)前記標的生物の異なるポリペプチドを発現するための異なる第1のプライマー対を用いて、工程(a)〜工程(b)を少なくとも10回繰り返す工程、
を含む標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。 - 前記PCR反応は、以下の:
(a)転写的に活性でない増幅コード配列を提供する為に、前記標的生物由来の所望のポリヌクレオチド配列を増幅することが可能な第1のプライマー対を用いて第1のPCR反応を実施する工程、
(b)前記増幅コード配列に転写活性を付与する少なくとも1つのヌクレオチド配列を付加することが可能な第2のPCRヌクレオチドプライマー対を提供する工程、
(c)転写的に活性なコード配列の増幅をもたらす為に、前記第2のプライマー対および前記増幅コード配列を用いて第2のPCR反応を実施する工程、
を含む、請求項79に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
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US6043045A (en) * | 1996-09-12 | 2000-03-28 | The Scripps Research Institute | Screening methods for the identification of novel antibiotics |
DE19637339A1 (de) * | 1996-09-13 | 1998-03-19 | Hoechst Ag | Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren |
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DE10108626A1 (de) * | 2001-02-22 | 2002-09-05 | Sahin Ugur | Verfahren zur Identifizierung biologisch aktiver Strukturen mikrobieller Erreger |
US20020165175A1 (en) * | 2001-04-17 | 2002-11-07 | Xiaowu Liang | Fast and enzymeless cloning of nucleic acid fragments |
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Cited By (2)
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