JP2003533175A - Ｎｙ−ｅｓｏ−１ペプチド誘導体およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＨＬＡ分子に結合し、細胞溶解性Ｔ細胞株を介する細胞の溶解に導く変異体ペプチドに関する。前記変異体は、ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドに基づくものである。前記ペプチドは、Ｔ細胞選別器として有用な免疫四量体に取り込まれうる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （関連出願） 本願は、特許出願第０８／７２５，１８２号（１９９６年１０月３日出願、現
米国特許第５，８０４，３８１号）の一部継続出願である特許出願第０８／９３
７，２６３号（１９９７年９月１５日出願）の一部継続出願である特許出願第０
９／０６２，４２２号（１９９８年４月１７日出願）の一部継続出願である特許
出願第０９／１６５，５４６号（１９９８年１０月２日出願）の一部継続出願で
ある特許出願第０９／４４０，６２１号（１９９９年１１月１５日出願）の一部
継続出願である特許出願第０９／５１４，０３６号（２０００年２月５日出願）
の一部継続出願である。これらの出願は全て、参考文献として本明細書の一部を
構成する。また本願は、特許出願第０９／０４９，８５０号（１９９８年３月２
７日出願）の一部継続出願である特許出願第０９／２７５，９９３号（１９９９
年３月２５日出願）の一部継続出願でもある。

【０００２】 （技術分野） 本発明は、癌関連抗原由来のＨＬＡ結合ペプチドに関する。これらのペプチド
はクラスＩ分子に結合し、これらのペプチドが結合した細胞の細胞溶解性Ｔリン
パ球による溶解を誘発する。

【０００３】 （背景技術および従来技術） 例えば感染症、癌、自己免疫疾患などといった多くの病理学的状態が、一定の
分子の不適切な発現を特徴とすることは、かなり確立された事実である。したが
ってこれらの分子は、特定の病理学的状態または異常状態の「マーカー」として
役立つ。これらの分子は、診断上の「ターゲット」（すなわちこれらの異常状態
を診断するために同定されるべき物質）として使用される他、診断薬および／ま
たは治療薬を創出するために使用できる試薬としても役立つ。癌マーカーを使っ
て特定のマーカーに特異的な抗体を産生させることはその一例であるが、決して
これに限るわけではない。また、ＭＨＣ分子と複合体を形成するペプチドを使っ
て、異常細胞に対する細胞溶解性Ｔ細胞を生成させることも、その限定されない
一例である。

【０００４】 このような物質の製造は、もちろん、それら物質の製造に使用される試薬の供
給源を前提としている。細胞からの精製は面倒で確実というには程遠い方法であ
る。もう一つの好ましい方法は、特定のマーカーをコードする核酸分子を単離し
た後、単離されたコード分子を使って所望の分子を発現させることである。

【０００５】 今までのところ、例えばヒト腫瘍中のような抗原の検出には、２つの戦略が使
用されてきた。以下、これらの戦略を遺伝子的アプローチおよび生化学的アプロ
ーチと呼ぶことにする。遺伝子的アプローチは、例えば参考文献として本明細書
の一部を構成するｄｅＰｌａｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
５：２２７５（１９８８）などに、その例を見ることができる。このアプローチ
では、腫瘍から得たｃＤＮＡライブラリーのプラスミド数百プールをＣＯＳ細胞
などの受容細胞または腫瘍細胞系の抗原陰性変異株にトランスフェクトし、それ
らの細胞を特異的抗原の発現について調べる。生物学的アプローチは、例えば参
考文献として本明細書の一部を構成するＯ．Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍら，Ｎａｔｕ
ｒｅ ３６９：６９（１９９４）などにその例を見ることができるが、このアプ
ローチは、腫瘍細胞のＭＨＣクラスＩ分子に結合しているペプチドを酸溶出した
後、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行うことに基づいている。
抗原ペプチドは、抗原処理能力が欠損した突然変異細胞株の空のＭＨＣクラスＩ
分子に抗原ペプチドが結合し、細胞傷害性Ｔリンパ球との特異的反応を誘発する
ことによって同定される。これらの特異的反応には、ＭＴＴアッセイや⁵¹Ｃｒ放
出アッセイで測定することができる例えばＣＴＬ増殖の誘導、ＴＮＦ放出および
ターゲット細胞の溶解などがある。

【０００６】 抗原の分子的定義を目的とする上記２つのアプローチには次の欠点がある。第
１に、これらの方法は著しく煩雑であり、時間と費用を要する。第２に、これら
の方法は、所定の特異性を持つ細胞傷害性Ｔ細胞株（ＣＴＬ）の樹立に依存して
いる。

【０００７】 抗原の同定および分子的定義を目的とする２つの既知のアプローチが本質的に
抱えている課題は、どちらの方法でもヒト腫瘍中の新規抗原を今までにごく少数
しか定義づけることに成功していないという事実が如実に物語っている。例えば
ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１６４３−１６
４７（１９９１）、Ｂｒｉｃｈａｒｄら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：４８９
−４９５（１９９３）、Ｃｏｕｌｉｅら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：３５−
４２（１９９４）、Ｋａｗａｋａｍｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ９１：３５１５−３５１９（１９９４）などを参照されたい。

【０００８】 さらにまた上記の方法論は、問題にしている癌タイプの樹立永久細胞株が入手
できることを前提としている。癌タイプによっては細胞株を樹立することが極め
て困難であることは、例えばＯｅｔｔｇｅｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ａｌｌｅｒｇ
．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ．Ａｍ．１０：６０７−６３７（１９９０）などに示さ
れているとおりである。また、一部の上皮細胞タイプの癌はインビトロでＣＴＬ
に対する感受性に乏しいため、常法による分析は不可能であることも知られてい
る。これらの課題に触発されて、当技術分野では、癌関連抗原の新たな同定方法
の開発が行われてきた。

【０００９】 重要な方法論の一つは、参考文献として本明細書の一部を構成するＳａｈｉｎ
ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１１８１０−１１
９１３（１９９５）に記載されている。また米国特許第５，６９８，３９６号お
よび米国特許出願第０８／４７９，３２８号（１９９６年１月３日出願）も参照
されたい。これら３つの参考文献はいずれも本明細書の一部を構成する。要約す
ると、この方法ではｃＤＮＡライブラリーを原核宿主中で発現させる。（ライブ
ラリーは腫瘍試料から取得される）。次に、高力価の体液性応答を惹起する抗原
を検出するために、発現させたライブラリーを希釈吸収血清によるイムノスクリ
ーニングにかける。この方法論はＳＥＲＥＸ法（「Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｉ
ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｂｙ Ｒｅｃｏｍｂｉ
ｎａｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ（組換え発現クローニングに
よる抗原の血清学的同定）」）と呼ばれている。この方法論は、新しい腫瘍関連
抗原の検出に使用されていると共に、先に同定された腫瘍関連抗原の発現を確認
するためにも使用されている。上記特許出願およびＳａｈｉｎら（前掲）ならび
にＣｒｅｗら，ＥＭＢＯ Ｊ １４４：２３３３−２３４０（１９９５）を参照
されたい。

【００１０】 ＳＥＲＥＸ法は食道癌試料に応用されて現在一つの抗原が同定されており、そ
れをコードする核酸分子が単離、クローニングされている。例えば、前掲の米国
特許第５，８０４，３８１号を参照されたい。この抗原とその切断型は、癌患者
の血清中の抗体と反応することが見出されている。また、この分子に由来するペ
プチドはＭＨＣ分子と結合して、細胞溶解性Ｔ細胞応答とヘルパーＴ細胞応答の
両方を誘発することも見出されている。これらのペプチドの変異体も同様に使用
できることがわかっている。

【００１１】 癌免疫学分野における問題点の１つは、インビボの細胞溶解性Ｔリンパ球応答
を同定し定量するために使用することができる確かなプロトコールがないことで
ある。そのため、免疫応答を特徴づけ、ワクチン試験を監視することは困難であ
る。細胞溶解性Ｔ細胞の解析は、複数のＴ細胞ターゲットを含む複合体を使用す
ることによって著しく容易になることが見いだされた。より具体的に述べると、
これらの複合体は２つの結合パートナー、例えばアビジンまたはストレプトアビ
ジンとビオチン間の既知のアビディティーに基づいている。各アビジン／ストレ
プトアビジンの分子が４つのビオチン分子に結合できることはよく知られている
。アビジン／ストレプトアビジン−ビオチン系を使って複数の細胞溶解性Ｔ細胞
ターゲット、すなわちＨＬＡ分子などのＭＨＣ分子、β２−ミクログロブリンお
よびＨＬＡ分子に結合するペプチドを含んでなる複数の免疫複合体を含む複合体
が形成される構築物は、参考文献として本明細書の一部を構成する特許出願第０
９／０４９，８５０号（１９９８年３月２７日出願）などに教示されている。こ
の複合体を標識して、試料中の目的とする細胞溶解性Ｔ細胞を単離または決定す
るために使用することができる。以下に説明する発明ではこのような複合体を利
用した。

【００１２】 （好ましい態様の詳細な説明） 実施例１ 例えば米国特許第５，８０４，３８１号などに論じられているＮＹ−ＥＳＯ−
１の解析により、この抗原を提示する分子はＨＬＡ−Ａ２であることがわかった
。そこで、参考文献として本明細書の一部を構成するＤ’Ａｍａｒｏら，Ｈｕｍ
ａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：１３−１８（１９９５）およびＤｒｉｊｆｈｏｕ
ｔら，Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：１−１２（１９９５）に記載のモデ
ルを使って、このＨＬＡ−Ａ２結合モチーフを満たすペプチドを全て同定するた
めに、ＮＹ−ＥＳＯ−１アミノ酸配列のスクリーニングを行った。これによって
推定されたアミノ酸配列に相当するペプチドを全て標準的方法で合成し、参考文
献として本明細書の一部を構成するＫｎｕｔｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３５１１−３５１５（１９８４）にならって、それ
らのペプチドを細胞傷害性アッセイに使用した。具体的に述べると、細胞株ＣＥ
ＭＸ７２１．１７４．Ｔ２（以下「Ｔ２」という）を使用した。なぜなら、この
細胞株はＨＬＡ−Ａ２を発現させるが、抗原をＭＨＣ複合体化ペプチドにはプロ
セシングしないため、ここに述べるタイプの実験には理想的だからである。Ｔ２
細胞の試料を標準的方法により１００μＣｉのＮａ（⁵¹Ｃｒ）Ｏ₄ で標識した後
、３回洗浄し、次に１０μｇ／ｍｌのペプチドおよび２．５μｇ／ｍｌのβ２−
ミクログロブリンと共にインキュベートした。インキュベーションは室温で１時
間行った。次に、９０：１のエフェクター／ターゲット比でレスポンダー細胞（
ＣＴＬ ＮＷ３８−ＩＶＳ−１の懸濁液１００μｌ）を加え、５％ＣＯ₂ の水飽
和雰囲気下に３７℃で４時間インキュベートした。次に、プレートを２００×ｇ
で５分間遠心分離し、上清１００μｌを取り出し、放射能を測定した。⁵¹Ｃｒ放
出率を既知の方法で決定したところ、ペプチドＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬ（配列番
号１）、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号２）およびＱＬＳＬＬＭＷＩＴ（配列番
号３）の３つが、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＴＬのもっとも
よい刺激因子であることがわかった。ＮＷ−ＭＥＬ−３８ならびに細胞株ＳＫ−
ＭＥＬ−３７およびＭＺ−ＭＥＬ−１９をターゲットとして使用した場合も、同
様の結果を得た。

【００１３】 実施例２ 次の実験群では、ＨＬＡ−Ａ２分子に結合し、ＣＴＬ溶解を誘発する配列番号
１、２および３の能力を確認した。

【００１４】 同じ脊椎傍領域に局在した再発性転移を伴う緩徐進行性メラノーマを呈する患
者から、リンパ節または転移巣の試料を採取した。被験者の腫瘍から採取したＲ
ＮＡの逆転写により、その腫瘍はＮＹ−ＥＳＯ−１を発現させることがわかった
。さらに患者の血清は、高力価の抗ＮＹ−ＥＳＯ−１抗体を示した。

【００１５】 外科的に切除したリンパ節または転移巣を、１０％ウシ胎仔血清を補足した滅
菌ＲＰＭＩ１６４０培地中で、細断した。０．２４ｍＭ Ａｓｎ、０．５５ｍＭ
Ａｒｇ、１．５ｍＭ Ｇｌｎ、１０％ヒトＡ＋プール血清、１００Ｕ／ｍｌ
ＩＬ−２および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７を補足したイスコフ（Ｉｓｃｏｖｅ）
のダルベッコ培地２ｍｌが入っている２４穴組織培養プレートに、細胞の懸濁液
を入れた。細胞を２〜３週間培養した後、参考文献として本明細書の一部を構成
するＣｚｅｒｋｉｎｓｋｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ １１０：２９（
１９９８）に従って、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴによるアッセイを行った。簡単
に述べると、短期培養物２×１０³ 細胞／ウェルを５×１０⁴ 細胞／ウェルのＴ
２細胞または同じ数のＴ２細胞＋１μＭの配列番号１〜３の一つと混合した。各
培養は二連で行った。

【００１６】 平均スポット数は、対照培養では１９スポット、配列番号２では４２４スポッ
ト、配列番号３では３５８スポット、配列番号１では３９６スポットだった。上
昇したこれらの数値は、腫瘍浸潤リンパ球２０個につきＮＹ−ＥＳＯ−１特異的
Ｔ細胞約１個の頻度に相当する。次に、参考文献として本明細書の一部を構成す
るＶａｌｍｏｒｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １６１：６９５６（１９９８）に従
って反応性Ｔ細胞を培養して、単クローン性にした。ＴＩＬに由来する２４個の
ＴＩＬ由来クローンのうち５個のクローンは、上記のＣＴＬアッセイで試験する
と、ＮＹ−ＥＳＯ−１由来ペプチドと反応することがわかった。

【００１７】 実施例３ 本実施例の実験では、ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現させるＡ２⁺ 細胞またはＮＹ−
ＥＳＯ−１を発現させないＡ２⁺ 細胞を溶解する能力について、上記ＣＴＬ Ｅ
ＳＯ５を調べた。上述した⁵¹Ｃｒ放出アッセイで細胞株ＮＡ８−ＭＥＬ（Ａ２⁺
，ＮＹ−ＥＳＯ−１^- ）、ＳＫ−ＭＥＬ３７（Ａ２⁺ ，ＮＹ−ＥＳＯ−１⁺ ）お
よびＭｅ２７５（Ａ２⁺ ，ＮＹ−ＥＳＯ−１⁺ ）を試験した。

【００１８】 その結果、ＮＡ８−ＭｅｌはＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチド配列番号２を加えると
溶解されるが、配列番号２が存在しないと溶解されないことがわかった。配列番
号２の有無はＳＫ−ＭＥＬ３７とＭｅ２７５の溶解とは無関係であり、これらの
細胞株はどちらも全ての条件で溶解された。これらの結果は、外から加えられた
配列番号２または内在する配列番号２をＣＴＬ ＥＳＯ５が認識することを示し
ている。

【００１９】 実施例４ 次に、配列番号１、２および３のうちのどれがＣＴＬによる認識に最適なＴ細
胞エピトープを構成するかを決定するための実験を行った。この決定を行うため
に、配列番号１、２および３に相当する合成ペプチドを機能競合結合アッセイで
試験し、次に特異的ＣＴＬによる認識について試験した。

【００２０】 使用した機能競合結合アッセイは、参考文献として本明細書の一部を構成する
Ｖａｌｍｏｒｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：６９５６−６９６２（１９９
８）に教示されているものであるが、本明細書でも詳しく説明する。

【００２１】 ペプチドＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号４）はＨＬＡ−Ａ^* ０２０１分子に結
合し、ＬＡＵ １３２／２として知られるＨＬＡ−Ａ^* ０２０１拘束性ＣＴＬク
ローンによる溶解を誘発することが知られている。Ｖａｌｍｏｒｉら，Ｃａｎｃ
．Ｒｅｓ．５９：２１６７（１９９９）を参照されたい。Ｔ２細胞を抗クラスＩ
モノクローナル抗体Ｗ６／３２の存在下に⁵¹Ｃｒで標識した。様々な濃度の配列
番号１、２または３（５０μｌ）を標識細胞の試料５０μｌ（１０００細胞／ウ
ェル）と共に室温で１５分間インキュベートした。次に、最適用量未満（１ｎＭ
）の配列番号４（５０μｌ）を５０μｌのＴ細胞（５０００細胞／ウェル）と共
に加えた。３７℃で４時間のインキュベーション後に⁵¹Ｃｒ放出を測定した。次
に、ターゲット細胞溶解の５０％阻害を達成するのに必要な各ペプチドの濃度を
［ｎＭ］５０％として決定した。比較を容易にするために、既知の高親和性ＨＬ
Ａ−Ａ^* ０２０１結合剤である基準ペプチドＦｌｕＭＡ５８−６６（配列番号５
：ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ）の［ｎＭ］５０％を、試験ペプチドに関して決定された
［ｎＭ］５０％値で割った値として、各ペプチドの相対的競合活性を計算した。

【００２２】 その結果、配列番号３は競合剤として配列番号４の１／１００の効力を持つこ
とがわかった。また配列番号２の効力は１／２５０だった。意外なことに、それ
ぞれのペプチド長を考えると、配列番号１は配列番号２より１０倍強い競合性を
持っていた。

【００２３】 これらの結果から、配列番号２のカルボキシ末端にあるシステインは、ＨＬＡ
−Ａ２分子に対する弱い結合の原因であることが示唆された。この点を調べるた
めに、アラニン、ロイシンまたはバリンなどの非極性側鎖を持つ様々な疎水性ア
ミノ酸（それぞれ配列番号６〜８）でカルボキシ末端システインを置換すること
により、配列番号２の誘導体を３つ作製した。これらのペプチドのそれぞれを使
って上記の機能競合アッセイを行った。結果を下記表１に示す。置換は全てペプ
チド結合を明確かつ劇的に増大させたことから、これら３つの置換ペプチドの全
てに関して、この位置の疎水残基はいずれも同様の効果を持つことがわかる。

【００２４】

【表１】 ─────────────────────────────────── ペプチド 配列 相対的競合活性 ─────────────────────────────────── Ａ型インフルエンザマトリックス ５８−６６ ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ １ ＮＹ−ＥＳＯ−１： １５５−１６３ ＱＬＳＬＬＭＷＩＴ ０．０１ １５７−１６７ ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬ ０．０４ １５７−１６５ ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ ０．００４ １５７−Ｃ１６５Ａ ＳＬＬＭＷＩＴＱＡ ０．４ １５７−Ｃ１６５Ｌ ＳＬＬＭＷＩＴＱＬ ０．５ １５７−Ｃ１６５Ｖ ＳＬＬＭＷＩＴＱＶ １０ ─────────────────────────────────── 実施例５ 上記のように、本明細書に記載のペプチドを特異的ＣＴＬによる認識に関して
試験した。これらの実験では、ターゲットＴ２細胞を３７℃にて１時間⁵¹Ｃｒで
標識した後、２回洗浄した。次に試料（５０μｌ中に１０００標識細胞）を様々
な濃度のペプチドと共に１５分間インキュベートした。次にエフェクター細胞（
５０μｌ）を加えた。加えたエフェクター細胞はＥＳＯ１特異的ＣＴＬクローン
ＥＳＯ５である。リンパ球：ターゲット比は３０：１とした。３７℃で４時間の
インキュベーション後に、１００μｌの上澄み試料を調べることによってクロム
放出を測定した。

【００２５】 特異的溶解率は次式のように計算した： １００×［（実験値−自発的放出）］／（総量−自発的放出） 結果を、５０％最大活性を与えるペプチドのナノモル濃度として、下記の表２に
記載する。また表２には、ペプチド配列番号２の［ｎＭ］５０％を試験ペプチド
の［ｎＭ］５０％で割った値として計算される「相対的抗原活性」も記載する。
ＣＴＬによる類似体ペプチドの認識は親ペプチドと同等以上だった。これらの結
果は、天然ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドのなかでは配列番号２が最適に認識される
抗原ペプチドであることを示している。また、置換ペプチドの中では、配列番号
８が配列番号２と同じ程度に効率よく認識され、他の置換ペプチドは配列番号２
より効率よく認識された。配列番号６は配列番号２よりも１０００倍効率よく認
識された。

【００２６】

【表２】 ─────────────────────────────────── ペプチド配列 ペプチド（［nM］50％） 相対的抗原活性 ─────────────────────────────────── ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ ０．６ １ ＳＬＬＭＷＩＴＱＡ ０．０００５ １，２００ ＳＬＬＭＷＩＴＱＬ ０．０１ ６０ ＳＬＬＭＷＩＴＱＶ １ ０．６ ＱＬＳＬＬＭＷＩＴ ５０ ０．０１２ ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬ ５０ ０．０１２ ─────────────────────────────────── 実施例６ 本実施例の実験では、後述の実施例で使用する抗原の四量化複合体を作製する
ための基本的技術を説明する。所望の四量体を作製するには、最初に、改変ＨＬ
Ａ−Ａ^* ０２０１分子をコードする構築物を作製する必要があった。これを行う
ために、ＨＬＡ−Ａ^* ０２０１陽性細胞から全ＲＮＡを抽出し、次に同分子に特
異的なプライマーと逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、Ｈ
ＬＡ−Ａ^* ０２０１をクローン化した。参考文献として本明細書の一部を構成す
るＡｌｔｍａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９４−９６（１９９６年１０月４
日）に従った。ただし新しい３’プライマー、すなわち５’−ＧＣＡＧＧＡＴＣ
ＣＣＧＧＣＴＣＣＣＡＴＣＣＴＣＡ ＧＧＧＴＧＡＧＧＧＧＣ−３’（配列番号
９）を使用した。ＲＴ−ＰＣＲと同時に、使用するベクターでのタンパク質発現
を最適化するために、アミノ末端ヌクレオチド配列を改変した。参考文献として
本明細書の一部を構成するＧａｒｂｏｃｚｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：３４２９（１９９２）を参照されたい。これを終えて
から、当該分子の細胞外コード部分を、再び特異的プライマーを用いて増幅した
。得られた構築物を、ＨＬＡ−Ａ^* ０２０１重鎖の３’末端にＢｉｒＡビオチン
化認識部位をインフレームに生成するベクターに再クローニングした。改変ＨＬ
Ａ−Ａ^* ０２０１とβ２−ミクログロブリンを別個の大腸菌培養物で過剰発現さ
せた。得られた封入体を精製し、ＨＬＡ組換えタンパク質とβ２−ミクログロブ
リン組換えタンパク質を尿素溶液に可溶化した後、リフォールディング溶液中、
４℃でリフォールディングさせることにより、複合体を形成させた。（リフォー
ルディング溶液は１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、Ｌ−アルギニン４００
ｍＭ、ＥＤＴＡ２ｍＭ、還元型グルタチオン５ｍＭ、酸化型グルタチオン０．５
ｍＭ、ＰＭＳＦ０．１ｍＭ、ＨＬＡ重鎖およびβ２−ミクログロブリン１μＭな
らびに対象ペプチド１０μＭを含んだ。）リフォールディング溶液を標準的技術
で７．５ｍｌに濃縮した。次に、リフォールディング緩衝液をＢｉｒＡ反応緩衝
液（Ｔｒｉｓ １００ｍＭ（ｐＨ７．５）、ＮａＣｌ ２００ｍＭ、ＭｇＣｌ₂
５ｍＭ、ＰＭＳＦ １００μＭ、ロイペプチン１μＭおよびペプスタチン１μ
Ｍ）と交換した（最後の３つは使用直前に加えた）。

【００２７】 次に、ＨＬＡ−Ａ２複合体を含むリフォールディング混合物を酵素５０μＭ、
２００ｍＭ Ｔｒｉｓ中の１００ｍＭビオチンおよび１００ｍＭアデノシン三リ
ン酸と混合することにより、複合体をビオチンホロ酵素シンターゼ（ＢｉｒＡ酵
素）でビオチン化した。混合物を一晩、室温でインキュベートした。次に、ビオ
チン化複合体を精製し、フィコエリトリン標識ストレプトアビジンと混合して、
四量体構造を形成させた。これらを単離し、１ｍｇ／ｍｌの濃度で少量ずつ再構
成した。

【００２８】 実施例７ 本実施例の実験は、ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的Ｔ細胞の頻度を評価するために計
画した。ビオチン、ＨＬＡ−Ａ２およびペプチドの蛍光四量体は、特許出願第０
９／２７５，９９３号（１９９９年３月２５日出願）および第０９／０４９，８
５０号（１９９８年３月２７日出願）（どちらも参考文献として本明細書の一部
を構成する）と同様に上記実施例６に記載のＲｏｍｅｒｏら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．１８８：６４１（１９９８）およびＡｌｔｍａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７４
：９４（１９９６）に従って調製した。抗原ペプチドとして、Ｆｌｕ Ｍａ ５
８−６６（配列番号５）と、アラニンをカルボキシ末端とするＥＳＯ−１誘導体
（配列番号６）を使用した。この誘導体を選択した理由は、その親和性が高いか
らである。というのも、ＨＬＡ−Ａ２への結合親和性が高ければ、安定な四量体
の作製が容易になるからである。

【００２９】 四量体を組み立てた後、各ペプチドに特異的なＣＴＬクローンを２％ＦＣＳを
含む２０μｌのＰＢＳ中で適当な四量体と混合し、室温で１時間インキュベート
した後、ＦＩＴＣで標識した抗ＣＤ８抗体またはＦＩＴＣで標識した抗ＣＤ８抗
体と「ＣＹＣ」で標識した抗ＣＤ４５ＲＡ抗体との混合物２０μｌを加えた。そ
の混合物を４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を上記と同じ緩衝液で洗
浄し、次にフローサイトメトリーによって解析した。

【００３０】 ＮＹ−ＥＳＯ−１誘導体（配列番号６）の四量体はＥＳＯ５を特異的に染色し
たが、ＦｌｕＭａに特異的なＴ細胞は染色せず、逆もまた同様だった。

【００３１】 実施例８ 本実施例の実験は、ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドを含む四量体を使ったＮＹ−Ｅ
ＳＯ−１特異的Ｔ細胞の検出および単離を検証するために計画した。

【００３２】 配列番号２またはアラニン末端置換体（配列番号６）で刺激した濃縮ＣＤ８⁺
Ｔ細胞試料。（刺激は、自家抗原提示細胞に対象ペプチドを負荷することによっ
て行った。） 上記のように四量体を作製し、それを使って、刺激の１４日後にＣＤ８⁺ 細胞
を染色した。細胞を選別し、上記のようにＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴで試験した
。

【００３３】 ＣＤ８⁺ 四量体⁺ 細胞だけがＩＦＮ−γ産生細胞を含むことがわかった。

【００３４】 選別したＣＤ８⁺ 四量体⁺ 細胞とＣＤ８⁺ 四量体^- 細胞をＰＨＡ刺激によって
２週間増殖させ、両細胞集団を、配列番号２をパルスしたまたは配列番号２をパ
ルスしていないＭｅ２７５およびＴ２細胞での⁵¹Ｃｒ放出アッセイ法で、上述の
ようにアッセイした。

【００３５】 ＣＤ８⁺ 四量体⁺ 細胞だけが、配列番号２をパルスした細胞とアラニン類似体
をパルスした細胞の両方を効果的に殺滅した。

【００３６】 実施例９ 本実施例の実験は、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原が細胞内でプロセシングされて、Ｈ
ＬＡ−Ａ２分子によって提示されるペプチドを生成し、その結果としてＣＴＬに
よる溶解を刺激するかどうかを決定するために計画した。

【００３７】 上記実施例６に記載の四量体を、配列番号２のペプチドを使って調製した。次
に、これらの四量体を使って、ＮＹ−ＥＳＯ−１陽性メラノーマを持つと以前に
診断されたことがある患者から採取した細胞の試料を染色した。詳しくは、参考
文献として本明細書の一部を構成するＤｕｎｂａｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １
６２（１２）：６９５９−６２（１９９９）および特許出願第０９／０４９，８
５０号（１９９８年３月２７日）を参照されたいが、簡単に述べると、四量体を
使って末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）試料を３７℃で１５分間染色した後、３７
℃のＰＢＳ／１％ＦＣＳ中で洗浄し、次に標識抗ＣＤ８抗体と共に氷上で３０分
間インキュベートした。次に細胞を氷冷ＰＢＳ／１％ＦＣＳ中で３回洗浄した後
、フローサイトメトリーによって解析した。陽性細胞に１０μＭの配列番号２の
ペプチドをパルスし、ＩＬ−２（２００ｕ／ｍｌ）中で５日間培養することによ
り、陽性細胞をクローン化した。

【００３８】 これらの陽性ＣＴＬのうち、４つを増殖させ、下記の実験で試験した。

【００３９】 実施例１０ 次に、上記ＣＴＬを殺細胞特異性について試験した。この試験を行うために、
先にＮＹ−ＥＳＯ−１陽性と型別されている細胞株、先にＮＹ−ＥＳＯ−１陰性
と型別されている細胞株、１μＭの配列番号２のペプチドをパルスしたＴ２細胞
の試料、およびパルスを行っていないＴ２細胞の試料を、ＣＴＬと１：１および
０．３：１のエフェクター／ターゲット比で混合した。細胞の殺滅は上記の⁵¹Ｃ
ｒ放出アッセイ法で決定した。

【００４０】 その結果、ＮＹ−ＥＳＯ−１陽性細胞と配列番号２をパルスしたＴ２細胞はど
ちらも殺滅され、他の細胞は殺滅されないことがわかった。このことから、ＮＹ
−ＥＳＯ−１の細胞内プロセシングは、配列番号２特異的ＣＴＬによって認識さ
れるペプチドの生成をもたらすことが実証された。

【００４１】 実施例１１ この実施例に記載する実験は、異なるＣＴＬの混合物が配列番号１、２および
３で得られた陽性結果の原因であるかどうか、または単一のＣＴＬクローンが全
てのペプチドを認識するかどうかを決定するために計画した。これらの実験では
、配列番号２、配列番号１、またはＮＹ−ＥＳＯ−１アミノ酸１５７〜１６６か
らなるペプチド、すなわちＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦ（配列番号１１）のいずれか一
つをＴ２細胞にパルスした。配列番号１の最初の８アミノ酸から構成されるペプ
チドなので、配列番号３も試験した。様々な濃度のペプチドをＴ２細胞へのパル
ス添加に使用した。対照として配列番号５を使用した。上記と同じ⁵¹Ｃｒ放出ア
ッセイを使用した。ＣＴＬを試験する前に、それらがそれぞれ単一のＴ細胞受容
体を発現させているかどうかを決定するためのアッセイを行った。

【００４２】 その結果、全てのＴ細胞は配列番号２、３および１１を認識するが、配列番号
１または切断型ペプチド１５７〜１６４、すなわち配列番号１１の最初の８アミ
ノ酸から構成されるペプチドは認識できないことがわかった。これらは、３つの
ペプチドは全てクローンＣＴＬによって認識されたことを示している。

【００４３】 実施例１２ この実施例に記載する実験は、配列番号２のペプチドを生成させるために必要
な細胞内プロセシングの条件を決定するために計画した。

【００４４】 Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏら，Ｎａｔｕｒｅ ３４５（６２７４）：４４９−５２（
１９９０）には、ＭＨＣ Ｉプロセシング経路に明確な遮断点を持つことを特徴
とする突然変異型プロセシング細胞が記載されている。これらの実験ではこれら
の細胞を使用した。具体的に述べると、親細胞株すなわち「細胞株４５」、ＴＡ
Ｐ、ＬＭＰ２およびＬＭＰ７陰性である「細胞株１７４」、ＴＡＰ１およびＴＡ
Ｐ２をコードするベクターがトランスフェクトされている細胞株１７４のトラン
スフェクタント、ならびにＴＡＰ１、ＴＡＰ２およびＬＭＰ７をコードするベク
ターがトランスフェクトされている細胞株１７４のトランスフェクタントを使用
した。（「ＴＡＰ」という略号は「ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ａｓｓｏｃｉａｔ
ｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ（抗原プロセシング関
連輸送タンパク質）」を表し、「ＬＭＰ」という略号は「ｌｏｗ ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ ｍａｓｓ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ（低分子量ポリプロテイン）」を表
す）。

【００４５】 上述したトランスフェクタントの他に、ＮＹ−ＥＳＯ−１をコードするワクシ
ニアウイルス構築物を、全ての細胞に感染多重度（Ｍ．Ｏ．Ｉ．）５で９０分間
トランスフェクトした。

【００４６】 対照として、ワクシニアウイルス構築物を添加する１時間前に、１００μＭの
ラクタシスチンを含む５０μｌの培地に同数の細胞（１０⁶ 細胞）を懸濁した。
９０分の感染期間後に細胞を洗浄し、１μＭのラクタシスチンを含む５ｍｌの培
地に懸濁し、一晩生育してワクシニアベクターの発現を許した。ＬＭＰ２とＬＭ
Ｐ７はプロテアソームサブユニットである。

【００４７】 次に、上述したタイプの⁵¹Ｃｒ放出アッセイで、細胞をＣＴＬと混合した。

【００４８】 その結果、ＮＹ−ＥＳＯ−１をコードするワクシニアをＴＡＰ欠損細胞で発現
させても、それらの細胞はＣＴＬ溶解感受性にならないことがわかった。一方、
プロテアソームサブユニットＬＭＰ２およびＬＭＰ７の有無はＣＴＬによって認
識されるエピトープの提示を損なわなかった。このことは使用した対照によって
裏付けられる。なぜなら、１７４／ＴＡＰ細胞は、ＬＭＰ７に依存して提示され
ることがわかっている配列番号５のペプチドを提示せず、一方、ＬＭＰ７をコー
ドするベクターのトランスフェクションまたはラクタシスチンの添加により、提
示に関する遮断は排除されたからである。

【００４９】 これらの結果から、ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープの提示には非プロテアソーム
プロテアーゼが関与することが極めて強く示唆される。

【００５０】 実施例１３ 本実施例の実験は、Ｃ末端システイン残基の改変によって調製した配列番号２
のペプチド類似体が変化した免疫原性を持つかどうかを決定するために計画した
。上述したタイプの⁵¹Ｃｒ放出アッセイを行った。このアッセイでは、ペプチド
（配列番号２）およびターゲット細胞を２００μＭのジチオスレイタール（ＤＴ
Ｔ）またはＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシメチル）ホスフィン）と混合した
。

【００５１】 その結果、還元剤の存在下で配列番号２の抗原性は１０倍増大することがわか
った。配列番号８を使って並行実験を行ったが、抗原性の増大はみられなかった
。

【００５２】 実施例１４ 上記実施例１３で観察された結果を見て、改変ペプチドを試験することにした
。配列番号７および８の他に、式： ＳＬＬＭＷＩＴＱＩ （配列番号１２）を合成し、以下の１０ｍｅｒも同様に合成した： ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＶ（配列番号１３） ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦ（配列番号１１（上記）） ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＩ（配列番号１４） ＳＬＬＭＷＩＴＱＡＬ（配列番号１５） ＳＬＬＭＷＩＴＱＡＩ（配列番号１６） ＳＬＬＭＷＩＴＱＡＦ（配列番号１７）。 さらに、Ｃ末端システインが−ＮＨ₂ −ＣＯ−ＣＨ₂ 側鎖で修飾されている配列
番号２も調製した。これらのペプチドは全て上述したタイプのＣＴＬアッセイで
試験した。配列番号７、８および１２のペプチドは全て、ＮＹ−ＥＳＯ−１ １
５７−１６５特異的ＣＴＬによる認識を、配列番号２と比較して約１０００倍増
大させる。配列番号１４のペプチドも配列番号２より効率よく認識された。

【００５３】 実施例１５ 本実施例の実験では、ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＴＬの増殖を刺激する能力を
様々なペプチド類似体について調べた。

【００５４】 簡単に述べると、一般的なアッセイ方法で高力価のＮＹ−ＥＳＯ−１特異抗体
を示す２人のメラノーマ患者からＰＢＬを採取した。次に、標準的なプロトコー
ルに従って、これらのＰＢＬを１００ｎＭまたは１０ｎＭの配列番号２または配
列番号８で刺激した。配列番号８は２週間で１４倍大きいＮＹ−ＥＳＯ−１特異
的ＣＴＬの増殖をもたらした。３週間では増殖は配列番号２を使った場合の５４
倍に達した。これらのＣＴＬを、配列番号２を使って、上述したタイプの四量体
で染色したところ、染色は陽性であったことから、上記ＣＴＬは問題のＮＹ−Ｅ
ＳＯ−１エピトープを認識することがわかった。

【００５５】 １０ｎＭの配列番号８がＣＴＬを刺激したこと、そして天然ペプチドの必要量
が実際にこれより高かったことは、注目に値する。さらに、標準的な方法論によ
る追加実験では、この実施例に記載の増殖ＣＴＬがＮＹ−ＥＳＯ−１陽性腫瘍細
胞を殺滅する能力を持つことが確認された。

【００５６】 実施例１６ 本実施例の実験は、上記ＮＹ−ＥＳＯ−１由来ペプチドを使った四量体の反応
性を評価するために計画した。

【００５７】 配列番号２または配列番号６のペプチドを使って、実施例６および７に記載し
た四量体を調製した。次にこれらを、ＨＬＡ−Ａ２とＮＹ−ＥＳＯ−１由来ペプ
チドとの複合体と反応することがわかっているＣＴＬクローンを染色する能力に
ついて調べた。例えば参考文献として本明細書の一部を構成するＶａｌｍｏｒｉ
ら，Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．（２０００）を参照されたい。染色は上述のように行っ
た。

【００５８】 その結果、どちらの四量体もＣＴＬクローンを用量依存的に染色することがわ
かった。試験した最高のペプチド用量（１００μｇ／ｍｌ）では、蛍光強度はバ
ックグラウンドより１０³ 高かった。中間強度の蛍光シグナルに必要な四量体の
濃度は、配列番号２を使った四量体では約１２μｇ／ｍｌ、配列番号６では３μ
ｇ／ｍｌだった。

【００５９】 さらに、上述のように配列番号２で刺激した後、末梢血リンパ球を１４日間バ
ルク培養した物の染色を検討した。数個の異なるポリクローナル集団に対して、
２つの四量体による平均蛍光強度は同等だった。以下の説明で言及する四量体は
配列番号２を使った四量体である。

【００６０】 実施例１７ この実施例では、ＨＬＡ−Ａ２分子と配列番号２との複合体に特異的なさらな
る細胞溶解性Ｔリンパ球の単離について説明する。

【００６１】 末梢血単核細胞（「ＰＢＭＣ」）を、ＨＬＡ−Ａ^* ０２０１陽性である２人の
メラノーマ患者から単離した。ＣＤ８特異抗体で被覆した磁気ビーズを用いる磁
気細胞選別法によって、ＣＤ８⁺ 細胞を分離した。ＣＤ８^- 細胞を放射線照射（
３０００ラド）した後、抗原提示細胞（「ＡＰＣ」）として使用した。ＣＤ８⁺
細胞の刺激は、約１×１０⁸ 細胞／ウェルを２〜４×１０⁶ 個のＡＰＣおよび１
μＭの配列番号２のペプチドと混合することによって行った。０．２４ｍＭ Ａ
ｓｎ、０．５５ｍＭ Ａｒｇ、１．５ｍＭ Ｇｌｎ、８％ヒトＡ⁺ プール血清、
ヒト組換えＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）およびヒト組換えＩＬ−７（１０ｎｇ／
ｍｌ）を補足した２ｍｌのイスコフのダルベッコ培地で、細胞とペプチドを培養
した。細胞は毎週刺激した。週に一度の刺激を２ラウンド行った後、試験した２
つの培養物は９．８％および２．５％のＣＤ８⁺ ＨＬＡ−Ａ２／ＮＹ−ＥＳＯ−
１四量体陽性リンパ球を示した。

【００６２】 次に、配列番号２および配列番号６を含む四量化複合体に対して陽性なＣＴＬ
を見いだすために、陽性培養物を試験した。両者に対して陽性なものを選別し、
限界希釈法によってクローン化した。２つのクローンを全集団の代表として選択
した。以下、これらのクローンをＬＡＵ１５５／１８およびＬＡＵ５０／１３と
呼ぶことにする。下記の実験では、これらのクローンをＶａｌｍｏｒｉら（前掲
）に記載の細胞株ＬＡＵ１５６／５と共に使用する。

【００６３】 実施例１８ 上記実施例に記載した３つのＨＬＡ−Ａ２／ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＴＬク
ローンを、そのターゲット細胞溶解能力について、上記実施例１および３に記載
した⁵¹Ｃｒ放出アッセイで試験した。３つの細胞株は全て、飽和濃度の配列番号
２でパルスされた上記ＴＡＰ欠損Ｔ２細胞を効率よく溶解することができた。半
最大溶解は３：１のリンパ球／ターゲット細胞比で観察された。

【００６４】 上記３つのクローンはメラノーマ細胞株Ｍｅ２７５も効率よく溶解することが
できた。この細胞株は３つのＣＴＬ株の一つを得た患者と同じ患者から採取した
リンパ節転移巣から得られた。すなわちこの細胞株は３つのＣＴＬ株の１つにと
って自家細胞である。このメラノーマ細胞株は十分なレベルのＮＹ−ＥＳＯ−１
タンパク質、ｍＲＮＡを発現させると共に、参考文献として本明細書の一部を構
成するＬｅｔｈｅらの米国特許第５，８１１，５１９号に記載されている相同遺
伝子ＬＡＧＥ−１も発現させる。

【００６５】 これらのＣＴＬはいずれも、同様に上述した同種異系細胞株Ｍｅ２４２を認識
しなかった。この細胞株もＮＹ−ＥＳＯ−１とＬＡＧＥを発現させるが、ＨＬＡ
−Ａ２陰性である。

【００６６】 総合すると、これらのデータは、上記３つのＣＴＬクローンがＮＹ−ＥＳＯ−
１／ＨＬＡ−Ａ２特異的であり、腫瘍反応性であることを示している。

【００６７】 実施例１９ 本実施例の実験では、ＨＬＡ−Ａ２分子に対するペプチド結合を評価するため
に使用した機能競合アッセイを説明する。このアッセイは参考文献として本明細
書の一部を構成するValmori ら，J. Immunol 160:1750-1758（1998）に記載され
ている。このアッセイは、上記実施例４で説明したように配列番号４の認識の阻
害に基づいている。下記のペプチドを試験した。競合アッセイの結果を記載する
。

【００６８】 ─────────────────────────────────── 配列番号 アミノ酸配列 競合活性[mM] 配列番号２に対する ５０％ 相対的競合活性 ─────────────────────────────────── ２ ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ ０．２７ １ ３ ＱＬＳＬＬＭＷＩＴ ０．０３ ９ １ ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬ ０．０２ １３ ６ ＳＬＬＭＷＩＴＱＡ ０．０００３ ９００ ７ ＳＬＬＭＷＩＴＱＬ ０．００２ １３０ １９ ＳＬＬＭＷＩＴＱＳ ０．０２ １３ ８ ＳＬＬＭＷＩＴＱＶ ０．００００６ ４５００ ２０ ＡＬＬＭＷＩＴＱＡ ０．００１３ ２０８ ２１ ＳＡＬＭＷＩＴＱＡ ０．０１ ２７ ２２ ＳＬＡＭＷＩＴＱＡ ０．００１ ２７０ ２３ ＳＬＬＡＷＩＴＱＡ ＜０．０００１ ＞２７００ ２４ ＳＬＬＭＡＩＴＱＡ ０．００４ ６８ ２５ ＳＬＬＭＷＡＴＱＡ ０．０１ ２７ ２６ ＳＬＬＭＷＩＡＱＡ ０．０００２ １３５０ ２７ ＳＬＬＭＷＩＴＡＡ ０．０００１８ １５００ ─────────────────────────────────── これらの結果は、５０％競合活性には約０．３μＭの配列番号２が必要である
のに対して、配列番号３および１ではそれぞれ１／９および１／１３の量しか必
要でないことを示している。配列番号６および７のペプチドはペプチド結合の著
しい増加をもたらし、配列番号８および１９も同様であることはわかるだろう。

【００６９】 ＭＨＣ分子への結合およびＴ細胞受容体相互作用における単一アミノ酸の役割
を決定する第一段階として、配列番号２０〜２７の単一Ａｌａ置換ペプチドを合
成した。Ｃ末端システインが結合にとって不利であることは上に示した通りなの
で、Ａｌａ置換ムテイン配列番号６を基本ペプチドとして使用した。その結果を
上に示した。２位の置換は予想通りペプチド結合を１／１００に低下させた。５
位および６位の置換も結合をかなり低下させた。意外にも、配列番号２３のペプ
チドは格段に高い結合能力を持っていた。

【００７０】 実施例２０ 本実施例の実験は、ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＴＬによる抗原認識の効率を評
価するために計画した。これを行うために、上述したタイプの４時間⁵¹Ｃｒ放出
アッセイを使用し、同様に上述したＴ２細胞株を使って、ペプチド滴定を行った
。測定の基準は、配列番号２によって達成される５０％最大溶解とした。５０％
溶解に必要な配列番号２の量は試験した３つのＣＴＬクローン、すなわち上述し
たクローンＬＡＵ５０／１３、ＬＡＵ１５５／１８および１５６／５によって異
なった（７ｎＭ、１２ｎＭおよび３ｎＭ）。この結果を図１に示す。図１から、
配列番号１および３は、３つのクローンのいずれに対しても、抗原として効率が
低いことがわかる。１つのクローン（ＬＡＵ１５６／５）は配列番号３を検出さ
えしなかった。

【００７１】 Ｃ末端に変異を持つ類似体は、概して配列番号２より良い抗原だった。配列番
号６は最も効率的な抗原ペプチドであるようだった。最大溶解の５０％を得るの
に必要な濃度は、これら３つのクローンのいずれについても、配列番号２より３
〜４桁低かった。配列番号７および１９も配列番号２よりも高い効率で認識され
たが、抗原活性の増加率は様々だった。ある例では、配列番号７によって相対的
抗原活性は１０⁵ 倍増加したが、別のＣＴＬにはわずかな効果しかなかった。

【００７２】 配列番号８は、３つのクローンのうちの２つによって、より効率よく認識され
た。

【００７３】 配列番号２０〜２７の単一アラニン置換に関して、各クローンは認識の微細特
異性を示した。配列番号２７はこれを最も明確に示した。クローンのうちの２つ
は配列番号２７を配列番号２と同程度かそれ以上に認識し、クローンのうちの１
つは配列番号２７を全く認識しなかった。クローンのうちの２つは、同様の認識
パターンを示した。３〜７位のペプチドは全てどのＣＴＬクローンによる認識に
とっても極めて重要であるらしかった。

【００７４】 実施例２１ 本実施例の実験は、様々なペプチドの特異的応答誘発能力を評価するために行
った。メラノーマ患者のＰＢＭＣから取得した高濃縮ＣＤ８⁺ 細胞を、先の実施
例で説明したように配列番号１、２、３、６、７、８または１９の一つを使って
インビトロで刺激した。刺激の１週間後に、それらの細胞を、上述のように配列
番号２を含有する四量体と抗ＣＤ８抗体とを使って染色した。

【００７５】 １週間後、培養物中のＣＤ８⁺ リンパ球の約０．１〜０．２％は四量体陽性だ
った。配列番号３は弱い刺激因子だったが、配列番号１および全てのカルボキシ
置換誘導体は、この細胞集団を、配列番号２よりも増殖させた。これらの結果を
図２Ａに示す。

【００７６】 追加実験では、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、製造者の使用説明
書に従って、培養物を試験した。簡単に述べると、プレートをＩＦＮ−γ特異抗
体で一晩コーティングし、６回洗浄した。Ｔ２細胞（５×１０⁴ 細胞／ウェル）
をレスポンダーＴ細胞（２×１０⁴ 細胞／ウェル）および１μＭペプチドと一緒
に加えた。正副一対の培養物を調製し、３７℃で２０時間インキュベートした。
次に細胞を除去し、第２のビオチン化ＩＦＮ−γ抗体およびストレプトアビジン
−アルカリホスファターゼ複合体を使ってプレートを発色させた。立体顕微鏡を
使用してスポット数を数えた。このアッセイを行った理由は、四量体を使用して
ペプチド類似体によるＴ細胞増殖を試験する方法では、親配列と交差反応しない
特異的Ｔ細胞を検出できないかもしれないからである。

【００７７】 図２Ｂにこれらの結果を示す。配列番号２を使ってもペプチド類似体を使って
も、同等な数の特異的細胞が得られた。この結果から、配列番号３は免疫原性に
乏しいこと、およびカルボキシ置換ペプチドで誘発された特異的Ｔ細胞の大半は
配列番号２と完全に交差反応することが裏付けられる。

【００７８】 上記の説明からわかるように、本発明は、 ＳＬＬＭＷＩＴＱＸ（配列番号１０） ［ここに、Ｘはシステイン以外の任意のアミノ酸であり、好ましくは非極性側鎖
を持つ疎水性アミノ酸、例えばＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈ
ｅ、Ｍｅｔ、ＴｒｐまたはＧｌｙであるか、または非荷電極性側鎖を持つアミノ
酸、例えばＳｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＴｈｒまたはＴｙｒであり、最も好ましく
はＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＳｅｒである］という配列を持つペプ
チドに関する。これらのペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２陽性であり病変を伴ってＮＹ
−ＥＳＯ−１を発現させる患者への投与によって治療的に使用することができ、
また診断的に、すなわちＨＬＡ−Ａ２陽性細胞が存在するかどうか、関連ＣＴＬ
が存在するかどうかなどを決定するために使用することもできる。

【００７９】 もう一つの態様では、Ｘは２つのアミノ酸であって、その第１アミノ酸はシス
テインまたはアラニンであり、かつ第２アミノ酸は任意のアミノ酸である。第２
アミノ酸はＰｈｅ、Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＬｅｕであることが好ましい。この態
様では、配列番号１１または１４の場合のように、第１アミノ酸がシステインで
あり、第２アミノ酸がＰｈｅまたはＩｌｅであることが最も好ましい。

【００８０】 本発明のさらにもう一つの態様は、配列番号６に記載のペプチドの類似体、す
なわち配列番号６中のアミノ酸のうちＣ末端アミノ酸以外の少なくとも１つがア
ラニンで置換されているペプチドである。配列番号２７は特に好ましいが、配列
番号２０〜２６に記載の他のペプチドも本発明の一部である。

【００８１】 ＨＬＡ−Ａ２分子はＭＨＣクラスＩ分子であり、ペプチドとクラスＩ分子との
複合体に応答するＴ細胞は一般にＣＤ８⁺ 細胞である。

【００８２】 配列番号６によって定義されるペプチドは、配列番号１０のコア配列によって
定義されるペプチドの典型例である。このペプチドは、上述のようにＨＬＡ−Ａ
２分子に結合する。したがって、これはＨＬＡ−Ａ２の「マーカー」であると共
に、上述のようにＣＴＬの増殖を刺激するペプチド／ＭＨＣ複合体の一成分でも
ある。同様に、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＶａｌが配列番号１０の構造におけるカル
ボキシ末端であるペプチドも使用することができる。

【００８３】 ペプチドを佐剤と混合することにより、治療用組成物を形成させることができ
る。また、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子（
いわゆる「ミニ遺伝子」）も本発明の一部である。これらのミニ遺伝子は、プロ
モーターと作動可能に連結した状態で発現ベクター中に組み込むことができる。
１または複数のペプチドの多重コピーを含む２以上の本発明ペプチドをコードす
る構築物も本発明の一部である。これらの構築物は、例えば組換えベクターまた
はいわゆる「裸のＤＮＡ」、すなわち１または複数の所望のペプチドをコードす
る小さい核酸分子などの形をとることができる。同様に、ＤＮＡまたはベクター
を含む真核細胞または原核細胞などの組換え細胞も、本発明の一部である。

【００８４】 これらのペプチドはＨＬＡ分子に結合する能力を持つので、本ペプチドが試料
中の細胞に結合するかどうかを決定することによってＨＬＡ−Ａ２陽性細胞（Ｈ
ＬＡ−Ａ^* ０２０１陽性細胞など）の有無を決定するための試薬として役立つ。
この「リガンド／受容体」タイプの反応は当技術分野ではよく知られており、そ
の決定には様々な方法論を利用することができる。

【００８５】 本発明のさらなる一側面は、トランスフェクトされた細胞によるペプチドの合
成を指図するのに必要な情報を保持している、いわゆる「ミニ遺伝子」である。
１または複数の抗原ペプチドをコードするミニ遺伝子を設計し、それをプラスミ
ドを使ったトランスフェクションまたはワクシニアもしくはアデノウイルスへの
クローニングによって、宿主細胞ゲノムに導入することができる。例えば参考文
献として本明細書の一部を構成するＺａｊａｃら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ
７１：４９６（１９９７）を参照されたい。組換えワクシニアウイルスベクター
などのこれらの組換えベクターは、融合タンパク質が生成するように構築するこ
とができる。例えば上記のように、融合タンパク質の一部分が望ましい腫瘍拒絶
抗原前駆体または腫瘍拒絶抗原である融合タンパク質を構築することができ、こ
れに追加のタンパク質またはペプチドセグメントを含めることができる。融合タ
ンパク質に加えることができる追加タンパク質またはペプチドセグメントの典型
例は、決してこのタイプに限るわけではないが、レポータータンパク質またはレ
ポーターペプチド、すなわち発現が起こったことがわかるように観察可能なシグ
ナルを与えるタンパク質またはペプチド、例えば緑色蛍光タンパク質である。他
のレポータータンパク質には、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、ｄｈｆ
ｒ、および参考文献として本明細書の一部を構成するＣｈｅｎｇら，Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：６０６（１９９６）に記載の「ｅＧＦ
Ｐ」すなわち強化緑色蛍光タンパク質などがあるが、これらに限らない。当業者
が入手できる様々なレポータータンパク質は様々な方法で使用することができ、
また実際、様々な方法で使用されている。例えば「ＧＦＰ」および「ｅＧＦＰ」
を使って感染細胞を可視化することにより、フローサイトメトリーを使った場合
の追跡と感染細胞の単離を容易にすることができる。ウェスタンブロッティング
、免疫沈降などの方法を使用する場合は、他のレポータータンパク質が役立つ。
これらの技術は当技術分野では標準的な技術であり、ここに繰り返して説明する
必要はない。融合ペプチドからの腫瘍拒絶抗原前駆体または腫瘍拒絶抗原の切断
を容易にするタンパク質またはペプチドセグメントも、含めることができる。融
合タンパク質は上述のように２以上の腫瘍拒絶抗原を含むことができ、１または
複数の腫瘍拒絶抗原の関連ＭＨＣ分子への送達を促進するタンパク質またはペプ
チドを含むこともできる。そのようなタンパク質およびペプチドは当技術分野で
はよく知られており、ここで詳しく説明する必要はない。

【００８６】 本明細書に記載の組換えレポーターベクターをトランスフェクトした組換え細
胞も本発明の一部である。これらの細胞は例えば任意のタイプの真核細胞である
ことができ、ヒト細胞は特に好ましい。これらの細胞は、例えば腫瘍拒絶抗原前
駆体または腫瘍拒絶抗原の製造などに使用することができる。また、これらの細
胞はエクスビボで、特定のＭＨＣ分子と腫瘍拒絶抗原との複合体に特異的な細胞
溶解性Ｔ細胞を生成させるためにも使用することができる。これは、融合タンパ
ク質の発現およびＴＲＡ（すなわち腫瘍拒絶抗原）のプロセシング後に生成する
ＭＨＣ分子とＴＲＡとの複合体に特異的な試料中の細胞の増殖が誘発されるよう
に、トランスフェクト細胞をＴ細胞の供給源（例えば血液試料）に接触させるだ
けで行うことができる。これらの細胞は、本明細書に示すようにその表面に適当
な複合体を提示しインビボで同じタイプのＴ細胞応答を誘発するので、非増殖性
にした場合はワクチン物質として使用することもできる。同様に、ベクターをワ
クチン物質そのものとして使用して、細胞表面上のＭＨＣ分子とペプチドとの複
合体に対するＴ細胞応答を必要とする患者に投与することもできる。もちろんエ
クスビボで生成させたＴ細胞を患者の処置に使用することもできる。

【００８７】 上記のペプチドを他の腫瘍拒絶抗原に由来するペプチドと組み合わせて「ポリ
トープ」を形成させることができる。代表的なペプチドには、いずれも参考文献
として本明細書の一部を構成する米国特許出願第０８／６７２，３５１号、第０
８／７１８，９６４号（現米国特許第 号）、第０８／４８７，１３５号（現
米国特許第 号）、第０８／５３０，５６９号および第０８／８８０，９６３
号に記載されているものがある。

【００８８】 使用することができる他のペプチドには、いずれも参考文献として本明細書の
一部を構成する次の文献に記載されているものがある：米国特許第５，４０５，
９４０号、第５，４８７，９７４号、第５，５１９，１１７号、第５，５３０，
０９６号、第５，５５４，５０６号、第５，５５４，７２４号、第５，５５８，
９９５号、第５，５８５，４６１号、第５，５８９，３３４号、第５，６４８，
２２６号および第５，６８３，８８６号、ＰＣＴ国際公開第９２／２０３５６号
、第９４／１４４５９号、第９６／１０５７７号、第９６／２１６７３号、第９
７／１０８３７号、第９７／２６５３５号および第９７／３１０１７号ならびに
係属中の米国特許出願第０８／７１３，３５４号。

【００８９】 ポリトープは、このタイプの分子が免疫応答を刺激しかつ／または誘発するこ
とができるかどうかを決定するために様々な方法で一つに連結することができる
、２以上の潜在的に免疫原性または免疫刺激性のペプチド群である。

【００９０】 これらのペプチドは直接連結することもできるし、隣接配列を使って連結する
こともできる。関連エピトープ配列の直接結合を教示しているＴｈｏｍｐｓｏｎ
ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２（１３）：５８４５
−５８４９（１９９５）を参照されたい。ポリトープのワクチンとしての使用は
よく知られている。例えばＧｉｌｂｅｒｔら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
１５（１２）：１２８０−１２８４（１９９７）、Ｔｈｏｍｓｏｎら（前掲）、
Ｔｈｏｍｓｏｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７（２）：８２２−８２６（１９
９６）、Ｔａｍら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１（１）：２９９−３０６（１９
９０）（いずれも参考文献として本明細書の一部を構成する）を参照されたい。
特に前記Ｔａｍの文献は、マウスモデルで使用した場合にポリトープが抗体およ
び防御免疫の両方の生成に有用であることを示している。さらにこの文献は、ポ
リトープが消化されると、ＭＨＣによって提示されることが可能であり実際にＭ
ＨＣによって提示されるペプチドが生成することを示している。Ｔａｍは、ポリ
トープ「ストリング」からプロセシングされた個々のエピトープがＣＴＬによっ
て認識されることを示すことによって、これを示している。このアプローチは、
例えばどのくらいの数のエピトープであれば１つのポリトープに連結しても認識
を誘発することができるかを決定する際に、また様々な組合わせのエピトープの
効力を決定するためなどに使用することができる。様々な組合わせは腫瘍拒絶抗
原の特定のサブセットを発現させる患者に合わせて「テーラーメード」すること
ができる。これらのポリトープは、ポリペプチド構造として導入するか、核酸送
達システムを使って導入することができる。詳しく述べると、当技術分野では、
個々のエピトープまたは上述したようなポリトープをコードするＤＮＡを導入す
るために数多くの様々な方法を利用することができる。例えば参考文献として本
明細書の一部を構成するＡｌｌｓｏｐｐら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６
（８）：１９５１−１９５９（１９９６）を参照されたい。アデノウイルス、ポ
ックスウイルス、Ｔｙウイルス様粒子、プラスミド、細菌などを使用することが
できる。これらのシステムは、ある与えられた同様の状況下でヒトにはどのシス
テムが最も適当であるかを決定するために、マウスモデルで試験することができ
る。またヒト臨床試験で試験することもできる。

【００９１】 また、試料中の細胞溶解性Ｔ細胞の有無を決定するために上記のペプチドを使
用することも、本発明の特徴である。上述したように、試料中のＣＴＬはペプチ
ド／ＭＨＣ複合体と反応する。したがって試料中にＣＴＬが存在することがわか
っている場合は、本発明のペプチドをＨＬＡ−Ａ２陽性細胞、例えばＨＬＡ−Ａ^* ０２０１陽性細胞に加え、次に例えば放射活性クロム放出、ＴＮＦ産生などを
決定するか、またはＴ細胞活性を決定する他の任意の方法を実施することにより
、ＨＬＡ−Ａ２陽性細胞を「溶解」することができる。同様に、本発明ペプチド
の１つをＨＬＡ−Ａ２陽性細胞と共に試料に加え、ＨＬＡ−Ａ２陽性細胞の溶解
を、例えば⁵¹Ｃｒ放出、ＴＮＦの存在などによって決定することにより、試料中
に特異的腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）が存在するかどうかを決定することができ
る。また、ＣＴＬはＥＬＩＳＰＯＴ解析によって検出することもできる。例えば
Ｓｃｈｍｉｔｔｅｌら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２１０
：１６７−１７４およびＬａｌｖａｎｉら（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１
２６：８５９を、またはＭＨＣクラスＩ／ペプチドの蛍光原性四量化複合体のＦ
ＡＣＳ解析（Ｄｕｎｂａｒら（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８
：４１３−４１６、Ｒｏｍｅｒｏら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：１６４１−
１６５０（１９９８））（前記の文献は全て本明細書の一部を構成する）参照さ
れたい。詳しく述べると、前記複合体は第１結合パートナーと第２結合パートナ
ーを含み、第１および第２結合パートナーは互いに特異的である。これらは、例
えばアビジンまたはストレプトアビジンとビオチン、ビオチンに特異的な抗体ま
たはその結合部分などであることができる。重要な特徴は第２結合パートナーが
、ＭＨＣ分子、β２−ミクログロブリン分子および前記ＭＨＣ分子に特異的に結
合するペプチドから構成される複数の複合体に結合されなければならず、前記多
成分複合体が標識されなければならないということである。ＭＨＣ分子はＨＬＡ
−Ａ２分子であることが好ましいが、任意のＨＬＡ分子を使用できることは当業
者には理解されるだろう。

【００９２】 第２結合パートナーはビオチンであることが好ましいが、例えばＨＬＡ／β２
−ミクログロブリン／ペプチド複合体の一成分に特異的な抗体、例えばＨＬＡ特
異抗体、β２−ミクログロブリン特異抗体などであってもよい。同様に、第１結
合パートナーは例えば組換えまたは天然プロテインＬ、組換えまたは天然プロテ
インＡ、さらには第２の抗体であることができる。複合体は可溶型であるか、ま
たは除去可能な固相、例えば磁気ビーズに結合した形をとることができる。

【００９３】 本発明の大分子中のＨＬＡ／β２−ミクログロブリン／ペプチド複合体の数は
様々である。これは少なくとも２つの複合体を含み、好ましくは少なくとも４つ
の複合体を含むが、それ以上の複合体が存在してもよい。

【００９４】 結合パートナーとＨＬＡ／β２−ミクログロブリン／ペプチドとの複合体は、
当技術分野で知られている任意のラベルを使って標識することができる。蛍光ラ
ベルの例は上述した。アルカリホスファターゼなどの酵素ラベル、金属粒子、合
成物質製の着色プラスチック、放射性ラベルなどは、全て使用することができる
。

【００９５】 第１結合パートナーに特異的に結合する第３結合パートナーを使用してもよい
。例えば第１結合パートナーがストレプトアビジンであり、かつ第２結合パート
ナーがビオチンである場合、第３結合パートナーはストレプトアビジン特異抗体
であることができる。３以上の結合パートナーを使用する場合は、ＨＬＡ／β２
−ミクログロブリン／ペプチド複合体との結合が妨害されない限り、上記のラベ
ルはどの結合パートナーに結合させてもよい。

【００９６】 上記複合体は、例えば試料中に存在する、ＨＬＡ／β２−ミクログロブリン／
ペプチド複合体に特異的な細胞溶解性Ｔ細胞を同定または単離するために使用す
ることができる。このような細胞溶解性Ｔ細胞は、本発明の免疫複合体に結合す
る。好ましい一態様では、被験試料を細胞溶解性Ｔ細胞に特異的に結合する反応
物で処理する。この場合、前記ラベルは検出可能なシグナルを与える。次に、標
識されたＣＴＬを含む試料を上記複合体と接触させ、結合させる。標識されたＣ
ＴＬは周知の標準的細胞分離法によって分離することができる。好ましくはＦＡ
ＣＳを使用するが、他の分離方法も当業者には同様に知られている。使用するペ
プチドは当業者の必要に応じて選択され、問題にしている特定のＭＨＣ系の性質
などに依存するだろう。

【００９７】 また、本方法は、ワクチンなどの特定の治療薬を投与した後の腫瘍の状態を監
視するためにも使用することができる。さらに本方法論は、上述のように細胞溶
解性Ｔ細胞前駆体を同定するためにも使用することができるので、考えうる治療
法の候補者を、彼らが適当なＴ細胞前駆体を持つかどうかを決定することによっ
て同定することもできる。

【００９８】 もちろん、本ペプチドはＣＴＬの産生を誘発するために使用することもできる
。上述のように、ＣＴＬ前駆体は適当な複合体に直面するとＣＴＬになる。この
ようないわば「直面」を引き起すことにより、ＣＴＬを生成させることができる
。これは、このようなＣＴＬを生成させるためにインビボでもエクスビボでも有
用である。

【００９９】 複数の異なるペプチドを含みそのうちの少なくとも１つが本発明のペプチドで
あるいわゆる「カクテル」ならびに「ポリトープ」分子およびそれらをコードす
る核酸分子も本発明の一部である。本明細書で使用する「ポリトープ」という用
語は、細胞内プロセシング後にＭＨＣ分子によって提示される複数のペプチド配
列を含有するように設計された組換え分子を指す。このようなポリトープは、例
えば１つのエピトープの繰返しからなったり、いくつかの異なるエピトープから
なったりすることができる。

【０１００】 本発明の他の特徴と応用は当業者には明らかであり、本明細書に記載する必要
はないだろう。

【０１０１】 本明細書で使用した用語および表現は、限定ではなく説明のために使用されて
いる。これらの用語および表現の使用に、本明細書に示し説明した特徴またはそ
の一部の等価物を排除する意図はなく、本発明の範囲内で様々な変更態様が可能
であると理解される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＮＹ−ＥＳＯ−１に関連するペプチドおよびペプチド類似体の抗原性に関する
データ。

【図２】 図２Ａおよび図２Ｂはそれぞれ、ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドおよび同類似体の
インビトロ免疫原性に関する結果（２Ａ）およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果
（２Ｂ）を示す。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｍ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ａ (31)優先権主張番号 ０９／６７６，００５ (32)優先日 平成12年９月29日(2000．9．29) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＡＵ，Ｃ Ａ，ＣＮ，ＪＰ，ＫＲ (72)発明者 ベルモーリ、ダニーラ スイス国 ローザンヌ エパリンゲス シ ーエイチ−1066 ユニバーシティ オブ ローザンヌ、ルードヴィッヒ インスティ チュート フォー キャンサー リサー チ、ローザンヌ ブランチ（番地なし) (72)発明者 セロッティーニ、ジャン−チャールズ スイス国 ローザンヌ エパリンゲス シ ーエイチ−1066 ユニバーシティ オブ ローザンヌ、ルードヴィッヒ インスティ チュート フォー キャンサー リサー チ、ローザンヌ ブランチ（番地なし) (72)発明者 ロメロ、ペドロ スイス国 ローザンヌ エパリンゲス シ ーエイチ−1066 ユニバーシティ オブ ローザンヌ、ルードヴィッヒ インスティ チュート フォー キャンサー リサー チ、ローザンヌ ブランチ（番地なし) (72)発明者 セルンドロ、ビンセンゾ イギリス国 オックスフォード オーエッ クス３ ３ディーユー ヘディントン 、 ジョン ラドクリフ ホスピタル（番地な し) Ｆターム(参考） 2G045 BB01 BB10 BB20 BB50 CB01 FB03 FB08 4B024 AA11 BA36 CA01 DA02 DA06 EA04 GA11 GA18 GA19 HA03 HA11 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ03 QQ08 QQ79 QR48 QR50 QR77 QS12 QS20 QS36 QX01 QX07 4B065 AA26X AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA46 4H045 AA10 AA30 BA10 BA15 BA41 CA40 DA50 EA50 FA10 FA74

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＨＬＡ分子に結合し細胞溶解性Ｔ細胞による溶解を誘発する
   、式：ＳＬＬＭＷＩＴＱＸ（配列番号１０）［式中、Ｘは非荷電極性側鎖を持つ
   アミノ酸である］の単離されたノナペプチド。
2. 【請求項２】 前記アミノ酸がＳｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＴｈｒまたはＴｙ
   ｒである請求項１の単離されたノナペプチド。
3. 【請求項３】 前記アミノ酸がＳｅｒである請求項１の単離されたノナペプ
   チド。
4. 【請求項４】 互いに特異的な第１および第２結合パートナーを含む、細胞
   溶解性Ｔ細胞の単離に役立つ単離された複合体であって、前記第２結合パートナ
   ーがＨＬＡ−Ａ２分子、β２−ミクログロブリン分子および請求項１のノナペプ
   チドから構成される複数の複合体に結合される複合体。
5. 【請求項５】 前記複合体が四量体である請求項４の単離された複合体。
6. 【請求項６】 配列番号１０のＸがＳｅｒ（配列番号１９）である請求項５
   の単離された複合体。
7. 【請求項７】 請求項１の単離されたノナペプチドおよび佐剤を含む、細胞
   溶解性Ｔ細胞応答の誘発に役立つ組成物。
8. 【請求項８】 請求項１のノナペプチドをコードするヌクレオチド配列から
   なる単離された核酸分子。
9. 【請求項９】 前記ノナペプチドが配列番号１９に記載のアミノ酸配列から
   なる請求項８の単離された核酸分子。
10. 【請求項１０】 ＭＨＣ分子に結合するペプチドをコードする複数のヌクレ
    オチド配列を含む発現ベクターであって、前記ペプチドの少なくとも１つが請求
    項１のペプチドである発現ベクター。
11. 【請求項１１】 前記ペプチドの少なくとも１つが配列番号１９のアミノ酸
    配列からなる請求項１０の発現ベクター。
12. 【請求項１２】 請求項８の単離された核酸分子で形質転換またはトランス
    フェクトされた組換え細胞。
13. 【請求項１３】 請求項１０の発現ベクターで形質転換またはトランスフェ
    クトされた組換え細胞。
14. 【請求項１４】 ある細胞がＨＬＡ−Ａ２分子をその表面に提示するかどう
    かを決定する方法であって、前記細胞を含む試料を請求項１のペプチドと接触さ
    せて、それらの間の結合を決定することを含み、前記結合が前記細胞の表面上の
    ＨＬＡ−Ａ２の指標である方法。
15. 【請求項１５】 さらに少なくとも１つの追加ペプチドを含む請求項７の組
    成物。
16. 【請求項１６】 少なくとも一部分が請求項１のアミノ酸配列を含む単離さ
    れたポリトープ分子。
17. 【請求項１７】 ＨＬＡ−Ａ２分子およびペプチドの複合体に特異的な細胞
    溶解性Ｔ細胞が試料中に存在するかどうかを決定する方法であって、前記試料を
    ＨＬＡ−Ａ２分子および請求項１のノナペプチドと混合し、前記細胞溶解性Ｔ細
    胞の特異性を決定するために、前記細胞溶解性Ｔ細胞と、ＨＬＡ−Ａ２分子およ
    び前記ペプチドの複合体との間の相互作用を決定することを含む方法。
18. 【請求項１８】 さらにラベルを含む請求項４の単離された複合体。
19. 【請求項１９】 前記第1 結合パートナーがアビジンであり、前記第2 結合
    パートナーがビオチンである請求項１８の単離された複合体。
20. 【請求項２０】 ＭＨＣ分子、β２−ミクログロブリンおよびペプチドの複
    合体を含む請求項１９の単離された複合体。
21. 【請求項２１】 試料中の細胞溶解性Ｔ細胞を同定または単離する方法であ
    って、前記試料を請求項４の複合体と混合し、それに結合する細胞溶解性Ｔ細胞
    を同定または単離することを含む方法。
22. 【請求項２２】 腫瘍の状態を監視する方法であって、腫瘍を持つ患者から
    採取した試料を請求項４の単離された複合体と接触させることによって、前記試
    料中の細胞溶解性Ｔ細胞を決定し、得られた値を先に決定した値と比較すること
    によって、前記腫瘍の状態を決定することを含む方法。
23. 【請求項２３】 配列番号６中のＣ末端アミノ酸以外の１アミノ酸がアラニ
    ンで置換されている、配列番号６の類似体である単離されたノナペプチド。
24. 【請求項２４】 配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６およ
    び２７からなる群より選択される請求項２３の単離されたノナペプチド。
25. 【請求項２５】 配列番号２７からなる請求項２４の単離されたノナペプチ
    ド。
26. 【請求項２６】 請求項２３のノナペプチドをコードする単離された核酸分
    子。
27. 【請求項２７】 少なくとも１つが請求項２６のヌクレオチド配列である複
    数のヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
28. 【請求項２８】 請求項２６の単離された核酸分子で形質転換またはトラン
    スフェクトされた組換え細胞。
29. 【請求項２９】 請求項２７の発現ベクターで形質転換またはトランスフェ
    クトされた組換え細胞。
30. 【請求項３０】 ある細胞がＨＬＡ−Ａ２分子をその表面に提示するかどう
    かを決定する方法であって、前記細胞を含む試料を請求項２３のペプチドと接触
    させて、それらの間の結合を決定することを含み、前記結合が前記細胞の表面上
    のＨＬＡ−Ａ２の指標である方法。
31. 【請求項３１】 請求項２３の単離されたノナペプチドおよび佐剤を含む、
    細胞溶解性Ｔ細胞応答の提供に役立つ組成物。
32. 【請求項３２】 少なくとも１つの追加ペプチドを含む請求項３１の組成物
    。
33. 【請求項３３】 少なくとも一部分が請求項２３のアミノ酸配列を含む単離
    されたポリトープ分子。
34. 【請求項３４】 ＨＬＡ−Ａ２分子およびペプチドの複合体に特異的な細胞
    溶解性Ｔ細胞が試料中に存在するかどうかを決定する方法であって、前記試料を
    ＨＬＡ−Ａ２分子および請求項２３のノナペプチドと混合し、前記細胞溶解性Ｔ
    細胞の特異性を決定するために、前記細胞溶解性Ｔ細胞と、ＨＬＡ−Ａ２分子お
    よび前記ペプチドの複合体との間の相互作用を決定することを含む方法。
35. 【請求項３５】 互いに特異的な第１および第２結合パートナーを含む、細
    胞溶解性Ｔ細胞の単離に役立つ単離された複合体であって、前記第２結合パート
    ナーがＨＬＡ−Ａ２分子、β２−ミクログロブリン分子および請求項２３のノナ
    ペプチドから構成される複数の複合体に結合される複合体。
36. 【請求項３６】 前記ノナペプチドが配列番号２０、２１、２２、２３、２
    ４、２５、２６または２７である請求項３５の単離された複合体。
37. 【請求項３７】 第１結合パートナーがアビジンであり、第２結合パートナ
    ーがビオチンである請求項３５の単離された複合体。
38. 【請求項３８】 試料中の細胞溶解性Ｔ細胞を同定または単離する方法であ
    って、前記試料を請求項３５の単離された複合体と混合し、それに結合する細胞
    溶解性Ｔ細胞を同定または単離することを含む方法。