JP2002526110A - Ｈｌａクラスｉｉ分子により提示されるｍａｇｅ−ａ３ペプチド - Google Patents

Ｈｌａクラスｉｉ分子により提示されるｍａｇｅ−ａ３ペプチド

Info

Publication number
JP2002526110A
JP2002526110A JP2000574676A JP2000574676A JP2002526110A JP 2002526110 A JP2002526110 A JP 2002526110A JP 2000574676 A JP2000574676 A JP 2000574676A JP 2000574676 A JP2000574676 A JP 2000574676A JP 2002526110 A JP2002526110 A JP 2002526110A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
mage
hla class
peptide
binding peptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2000574676A
Other languages
English (en)
Other versions
JP4102027B2 (ja
Inventor
ショー，パスカル
シュトローバント，ヴィンセント
ブーン−ファロイア，ティエリー
デル ブリュッゲン，ピエール ファン
シュルツ，エルヴィン，エス．
ファン，スニック
レテ，ベルナルド
ティーレマンス，クリス
コルタルス，ユルゲン
ヘアーマン，カルロ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ludwig Institute for Cancer Research New York
Original Assignee
Ludwig Institute for Cancer Research Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ludwig Institute for Cancer Research Ltd filed Critical Ludwig Institute for Cancer Research Ltd
Publication of JP2002526110A publication Critical patent/JP2002526110A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4102027B2 publication Critical patent/JP4102027B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4612—B-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4622—Antigen presenting cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464484—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A61K39/464486—MAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明はＭＡＧＥ−Ａ３腫瘍関連遺伝子によってコードされるＨＬＡクラスII結合ペプチド、ならびにかかるペプチドをコードしている核酸、およびそれらに関連する抗体について述べる。このペプチドはＣＤ４＋Ｔリンパ球の活性および増殖を刺激する。またＭＡＧＥ−Ａ３遺伝子の発現により特徴づけられる症状を診断および治療するための方法ならびに製品が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は腫瘍関連遺伝子の産物ＭＡＧＥ−Ａ３のフラグメントであって、 Ｈ
ＬＡクラスII分子によりＴリンパ球に対して結合および提示されるフラグメント
に関する。このペプチド、かかるペプチドをコードする核酸分子、ならびに関連
する抗体およびＣＤ４＋リンパ球は、特に診断および治療の面において重要であ
る。
【０００２】 （発明の背景） 哺乳類の免疫系が外来性または異質の物質を認識し、かつ反応する過程は複雑
である。この系の重要な一面はＴ細胞の応答であり、一部はＣＤ４またはＣＤ８
細胞表面タンパク質のいずれかについて陽性である成熟したＴリンパ球を含む。
Ｔ細胞は、他の細胞上のヒト白血球抗原（「ＨＬＡ」）または主要組織適合性遺
伝子複合体（「ＭＨＣ」）と呼ばれるペプチドおよび分子から成る細胞表面複合
体を介して他の細胞を認識し相互作用することができる。当該ペプチドはさらに
長い分子に由来するが、それらはＨＬＡ／ＭＨＣ分子の提示も行なう細胞によっ
てプロセスされる。Male ら、Advanced Immunology（J. P. Lipincott Company,
1987）、特に第６〜１０章参照のこと。Ｔ細胞とＨＬＡ／ペプチドの複合体と
の相互作用は制限されており、ＨＬＡ分子とペプチドとの特異的な複合体には特
異的なＴ細胞が必要である。もし特異的なＴ細胞が存在しなければ、たとえその
相手の複合体が存在してもＴ細胞の応答はない。同様に、もし特異的な複合体が
なければ、Ｔ細胞が存在しても反応はない。上記のメカニズムは外来タンパク質
に対する免疫系の応答に、自己免疫の病理学に、また細胞異常に対する応答に関
わっている。
【０００３】 外来抗原に対するＴ細胞の応答は、細胞溶解性Ｔリンパ球とヘルパーＴリンパ
球の双方を含む。ＣＤ８＋細胞傷害性または細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、活
性化された時、ＨＬＡクラスI分子によって提示される適当な抗原を提示してい
る細胞を溶解するＴ細胞である。ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞はサイトカインを分泌
するＴ細胞であって、表面上のＨＬＡクラスII分子により適当な抗原を提示する
マクロファージおよび抗原産生B細胞を刺激する。
【０００４】 Ｔ細胞が異質な物質を認識する機構もまた癌と関係づけられてきた。自己由来
のメラノーマに対して指示された細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の数多くのク
ローンが記述されてきた。いくつかの例では、このようなクローンによって認識
される抗原が特徴づけされてきた。Plaen ら、Immunogenetics 40 : 360 - 369
（1994）には、腫瘍特異抗原をコードしている遺伝子ファミリー、「ＭＡＧＥ」
が述べられている（１９９２年１１月２６日刊行のＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ９
２／０４３５４も参照のこと）。これらの遺伝子の発現産物はプロセスされてペ
プチドとなり、次いでそれは細胞表面上に発現される。このことは、特異的なＣ
ＴＬによる腫瘍細胞の溶解を導くことが可能である。これらの遺伝子は「腫瘍拒
絶抗原先駆体」または「ＴＲＡＰ」分子をコードしているといわれ、それらに由
来するペプチドは「腫瘍拒絶抗原」または「ＴＲＡ」と呼ばれる。この遺伝子フ
ァミリーについてのさらなる情報は、Traversariら、Immunogenetics 35 : 145
（1992）；van der Bruggenら、Science 254 : 1643 ( 1991 )を参照のこと。ま
た米国特許第５,３４２,７７４号も参照のこと。
【０００５】 米国特許第５,４０５,９４０号には、ＨＬＡ−Ａ１分子によって提示されるＭ
ＡＧＥノナペプチドが教示されている。特定のＨＬＡ分子についての特定のペプ
チドという既知の特異性があるとすれば、ある特定のペプチドは一つのＨＬＡ分
子に結合し、他とは結合しないことが期待されるだろう。異なる個体は異なるＨ
ＬＡ表現型をもっているため、このことは重要である。その結果として、ある特
定のＨＬＡ分子の相手となるべき特定のペプチドの同定に診断上および治療上の
効果があるとしても、それは当該特定のＨＬＡ表現型をもつ個体にしか関係がな
い。細胞の異常は一つの特定のＨＬＡ表現型に限定されず、また標的とされた治
療法は治療中の異常細胞の表現型についてのいくつかの知識を必要とするため、
この領域においてはさらなる研究の必要性がある。
【０００６】 米国特許第５,５９１,４３０号においては、単離された付加的なＭＧＥ−Ａ３
ペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２分子によって提示されるものとして教示されている。
したがって、所与のＴＲＡＰは複数のＴＲＡを生じることができる。 上述の参考文献は、ＨＬＡクラスI分子によって提示される腫瘍拒絶抗原の単
離および／または特徴づけを記載する。このようなＴＲＡは、ＴＲＡをコードす
る腫瘍関連遺伝子（たとえばＭＡＧＥ遺伝子）を発現する腫瘍細胞を認識するＣ
Ｄ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性化および増殖を誘導することがで
きる。
【０００７】 抗腫瘍免疫性におけるＣＤ４＋Ｔリンパ球（ヘルパーＴ細胞）の重要性は動物
モデルにおいて説明されており、その中ではこれらの細胞は協力的なエフェクタ
ー機能を務めるばかりでなく、免疫記憶の維持においても重要である（Topalian
による総説、Curr. Opin. Immunol. 6 : 741 -745, 1994）。さらに、いくつか
の研究は、腫瘍に特異的な免疫性の乏しさがＴヘルパー細胞の不適切な活性化に
よるものであるという主張を支持している。
【０００８】 最近、チロシナーゼ遺伝子が、ＨＬＡクラスII分子によりＣＤ４＋Ｔリンパ球
を刺激するべく提示されることが証明された（Topalianら、1994；Yeeら、J. Im
munol. 157 : 4079 - 4086, 1996；Topalianら、 J. Exp. Med. 183 : 1965 - 1
971, 1996）。 多くの癌関連抗原と同様に、チロシナーゼは限られたパーセントの腫瘍および
限られた型の腫瘍に発現される。さらに、二つの同定されたＭＨＣクラスII結合
性チロシナーゼペプチドはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１制限ペプチドであり、こ
の特定のＨＬＡ分子を発現する細胞によってのみ認識される。 したがって、対象の腫瘍がチロシナーゼを発現しないため、または対象が適当
なＨＬＡ分子を発現しないために、チロシナーゼペプチドによるヘルパーＴ細胞
の刺激を含む治療から何ら利益を得ない多くの対象が存在する。したがって、Ｍ
ＨＣクラスII分子によって提示されかつＣＤ４＋リンパ球によって認識されるエ
ピトープを含む、さらなる腫瘍関連抗原を同定する必要がある。
【０００９】 （発明の概要） ＭＡＧＥ−Ａ３遺伝子が、ＨＬＡクラスII結合ペプチドである、さらなる腫瘍
拒絶抗原をコードしていることが今や見出された。これらのペプチドは、ＨＬＡ
クラスII分子を有する抗原提示細胞により提示された場合、ＣＤ４＋Ｔリンパ球
の活性化および増殖を効果的に誘導する。
【００１０】 本発明はＨＬＡクラスII分子に結合する単離されたＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドお
よび、かかるペプチドの機能的変異体であって、ＭＡＧＥ−Ａ３ペプチド配列に
対する一つまたはそれより多いアミノ酸の付加、置換、または欠失を含んでいる
変異体を提供する。本発明はまた、かかるペプチドをコードしている単離された
核酸分子、それらの核酸分子を含んでいる発現ベクター、それらの核酸分子を用
いてトランスフェクトされた宿主細胞、およびそれらのペプチドおよびペプチド
とＨＬＡクラスII抗原提示分子との複合体に対する抗体も提供する。ペプチドと
ＨＬＡクラスII抗原提示分子との複合体を認識するＴリンパ球も提供される。前
述の分子を付加的に含んでいるキットおよびワクチン組成物が提供される。前述
のものは、ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特徴づけられる症状の診断または治療
に使用されることが可能である。ＭＡＧＥファミリーのポリペプチドおよび核酸
のメンバーが、有意な配列の一致および機能上の相同関係を共有すること（たと
えば腫瘍抗原および先駆体）が知られているため、本発明はまたＭＡＧＥ−Ａ３
以外のＭＡＧＥファミリーのメンバーに由来するＨＬＡ結合ペプチドも含む。し
たがって、本明細書に含まれているＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチ
ド、かかるペプチドを含んでいる組成物、およびかかるペプチドを同定および使
用する方法についての開示は、ＭＡＧＥ腫瘍関連抗原ファミリーの他のメンバー
に対しても適用されるものと理解される。
【００１１】 本発明の一つの局面によれば、配列番号：２のアミノ酸のフラグメントを含ん
でおり、ＨＬＡクラスII分子か、またはそれらの一つまたはそれより多いアミノ
酸の付加、置換、または欠失を含んでいる機能上の変異体と結合する単離された
ＭＡＧＥ−Ａ３クラスII結合ペプチドが提供される。一つの態様においては、単
離された当該ペプチドは、配列番号：４１、配列番号：４２、または配列番号：
８６のアミノ酸配列、またはそれらの機能的変異体を含む。ある態様においては
、単離された当該ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号２４、配列番号：２
５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列
番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３
４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列
番号：８３および配列番号：８４から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む
。好ましい態様においては、単離された当該ペプチドは前述のアミノ酸配列の一
つから成る。さらに好ましくは、単離された当該ペプチドは配列番号：２３、配
列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８、および配列番号：８６より選
択されるアミノ酸配列から成る単離されたペプチドである。ある態様においては
、単離された当該ペプチドはエンドソーム標的化シグナル(endosomal targeting
signal)、好ましくはヒトの不変鎖Iｉのエンドソーム標的化部分を含む。本発
明の他の態様においては、単離された当該ＨＬＡクラスII結合タンパク質は加水
分解不能である。好ましい加水分解不能のペプチドは、Ｄ−アミノ酸を含んでい
るペプチド、−psi［ＣＨ２ＮＨ］−還元アミドペプチド結合を含んでいるペプ
チド、−psi［ＣＯＣＨ２］−ケトメチレンペプチド結合を含んでいるペプチド
、−psi［ＣＨ（ＣＮ）ＮＨ］−(シアノメチレン）アミノペプチド結合を含んで
いるペプチド、−psi［ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ） ］−ヒドロキシエチレンペプチド結
合を含んでいるペプチド、−psi［ＣＨ２Ｏ］−ペプチド結合を含んでいるペプ
チド、−psi［ＣＨ２Ｓ］−ペプチド結合を含んでいるペプチド、から成る群よ
り選ばれる。
【００１２】 本発明のもう一つの局面によれば、単離されたＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラス
I結合ペプチドおよびＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドが提供され
る。ある態様においては、 当該ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスI結合ペプチドと
当該ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドとは、ポリトープポリペプチ
ドとして結合されている。他の態様においては、当該組成物中の単離されたＭＡ
ＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：４１、配列番号：４２
、配列番号：８６のアミノ酸配列、またはそれらの機能的変異体を含む。好まし
くは、当該組成物中の単離されたＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチド
は、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列
番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２
３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列
番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４
２、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６から成る群より選ば
れるアミノ酸配列から成る。さらに好ましくは、当該ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡク
ラスII結合ペプチドは、配列番号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配
列番号：３８、および配列番号：８６から成る群より選ばれるアミノ酸配列から
成る。上記の組成物のある態様においては、単離されたＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡ
クラスII結合ペプチドはエンドソーム標的化シグナルを含む。好ましくは当該エ
ンドソーム標的化シグナルは、ヒトの不変鎖Iｉのエンドソーム標的化部分を含
む。
【００１３】 本発明のもう一つの局面によれば、前述のＨＬＡクラスII結合タンパク質のい
ずれかをコードしている単離された核酸が提供される。好ましくは、当該核酸は
配列番号：４３、配列番号：４４、または配列番号：８７を含む。 本発明のさらに別の局面によれば、発現ベクターが提供される。当該発現ベク
ターは、作動可能に(operably)プロモーターに連結された前述の単離された核酸
のいずれかを含む。好ましい態様においては、当該核酸は配列番号：４３、配列
番号：４４、または配列番号：８７を含む。他の態様においては、当該発現ベク
ターは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１分子をコードする
核酸をさらに含む。 本発明のさらにもう一つの局面によれば、前述の発現ベクターのいずれかを用
いてトランスフェクトまたは形質転換される宿主細胞が提供される。 またＨＬ
Ａ−ＤＲＢ１／１３分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１分子を発現し、さらに前述の発
現ベクターのいずれかを用いてトランスフェクトまたは形質転換される宿主細胞
も提供される。
【００１４】 本発明の別の局面によれば、ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドに
特異的なＣＤ４−Ｔリンパ球を用いてＴリンパ球の集団を選択的に豊富にする方
法が提供される。この方法は、ある単離されたＴリンパ球集団を、ＭＡＧＥ−Ａ
３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドとＨＬＡクラスII分子との複合体を提示する薬
剤と、当該単離されたＴリンパ球集団をＣＤ４＋Ｔリンパ球について選択的に豊
富にするに充分な量において接触させることを含む。ある態様においては、当該
薬剤はＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質またはそのＨＬＡクラスII結合フラグメントと
接触した抗原提示細胞である。好ましい態様においては、当該ＨＬＡクラスII分
子はＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１分子であって、当該Ｍ
ＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：２４、配列番号：２
５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列
番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３
４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列
番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号
：８６のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドである。さらに好ましくは、
当該ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：２３、配列番
号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８、または配列番号：８６のアミノ酸
配列を含む。前述の方法ほある態様においては、当該単離されたＭＡＧＥ−Ａ３
タンパク質またはそのＨＬＡクラスII結合ペプチドは、エンドソーム標的化シグ
ナルを含む。好ましくは当該エンドソーム標的化シグナルは、ヒトの不変鎖Iｉ
のエンドソーム標的化部分を含む。
【００１５】 本発明のさらなる局面によれば、ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特徴づけられ
る疾患の診断法が提供される。この方法は、対象からの生物学的試料を、ＭＡＧ
Ｅ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドに特異的な薬剤と接触させることと、当
該薬剤と、ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドとの間の相互作用を、
疾患の決定として測定することを含む。いくつかの態様においては、当該生物学
的試料はたとえば腫瘍細胞の溶解物をロードされた樹状細胞である。ある態様に
おいては、当該ペプチドは配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：８６、
のアミノ酸配列またはそれらの機能的変異体を含む。好ましい態様においては、
当該ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：２４、配列番
号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９
、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番
号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９
、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列番号：８４および配
列番号：８６のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドである。
【００１６】 本発明のもう一つの局面によれば、ＨＬＡクラスII分子と複合体を形成するＭ
ＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドの発現によって特徴づけられる疾患
の診断法が提供される。この方法は、対象から単離された生物学的試料を、当該
複合体と結合する薬剤と接触させること；および当該複合体と当該薬剤の間の結
合を、当該疾患の決定として測定することを含む。いくつかの態様においては、
当該ＨＬＡクラスII分子は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０１またはＨＬＡ−ＤＲＢ
１／１３０２などのＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０
４０１などのＨＬＡ−ＤＰＢ１分子であり、またＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラス
II結合ペプチドは配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：８６のアミノ酸
配列か、またはその機能的変異体を含む。好ましくは、当該ＭＡＧＥ−Ａ３ Ｈ
ＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２
６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列
番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３
５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列
番号：４１、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６のアミノ酸
配列を有するペプチドである。さらに好ましくは、当該ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡ
クラスII結合ペプチドは、配列番号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、
配列番号：３８、または配列番号：８６のアミノ酸配列を含む。
【００１７】 ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特徴づけられる疾患を有する対象の治療法が、
本発明のもう一つの局面において提供される。この方法は、この疾患を改善させ
るに充分な量のＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドを対象に投与する
ことを含む。いくつかの態様においては、当該ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII
結合ペプチドは、配列番号：４１、配列番号：４２、または配列番号：８６のア
ミノ酸配列か、それらの機能的変異体を含む。好ましくは、当該ＭＡＧＥ−Ａ３
ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号
：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、
配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号
：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、
配列番号：４１、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６のいず
れかのアミノ酸配列を有するペプチドである。さらに好ましくは、当該ＭＡＧＥ
−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：２３、配列番号：３４、配
列番号：３７、配列番号：３８または配列番号：８６のアミノ酸配列を含む。い
くつかの態様においては、当該ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドは
エンドソーム標的化シグナル、好ましくはヒトの不変鎖Iｉのエンドソーム標的
化部分を含む。
【００１８】 本発明のさらにもう一つの局面においては、ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特
徴づけられる疾患を有する対象の治療法が提供される。この方法は当該対象に、
この疾患を改善させるに充分な量のＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスI結合タンパ
ク質とＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合タンパク質とを投与することを含む
。いくつかの態様においては、当該ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合タンパ
ク質は、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：８６、のアミノ酸配列か
、またはそれらの機能的変異体を含む。好ましくは、当該ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬ
ＡクラスII結合タンパク質は、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２
６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列
番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３
５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列
番号：４１、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６のアミノ酸
配列を有するペプチドである。さらに好ましくは、当該ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡ
クラスII結合タンパク質は、配列番号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７
、配列番号：３８または配列番号：８６のアミノ酸配列を含む。前述の方法のい
くつかの態様においては、当該ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスI結合ペプチドと
、ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合タンパク質とは、ポリトープポリペプチ
ドとして結合される。さらに別の態様においては、当該ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡ
クラスII結合タンパク質はエンドソーム標的化シグナル、好ましくはヒトの不変
鎖Iｉのエンドソーム標的化部分を含む。
【００１９】 本発明のもう一つの局面によれば、ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特徴づけら
れる疾患を有する対象の治療法が提供される。この方法は、当該疾患を改善させ
るに充分な、ＨＬＡクラスII分子とＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチ
ドとの複合体の存在を、当該対象において選択的に豊富にする薬剤を、対象に投
与することを含む。好ましくは、 当該ＨＬＡクラスII分子はＨＬＡ−ＤＲＢ１
／１３０１またはＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０２などのＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分
子か、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０４０１などのＨＬＡ−ＤＰＢ１分子である。
いくつかの態様においては、当該ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチド
は、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：８６のアミノ酸配列か、また
はそれらの機能的変異体を含む。好ましくは、ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII
結合ペプチドは、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号
：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、
配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号
：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、
配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６のいずれかのアミノ酸配
列を有するペプチドである。さらに好ましくは、当該ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡク
ラスII結合ペプチドは、配列番号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配
列番号：３８、または配列番号：８６のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様に
おいては、当該薬剤はＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドを含む。好
ましくは、当該ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドはエンドソーム標
的化シグナルを含む。好ましいエンドソーム標的化シグナルは、ヒトの不変鎖I
ｉのエンドソーム標的化部分を含む。
【００２０】 ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特徴づけられる疾患を有する対象を治療するた
めのさらなる方法が、本発明のもう一つの局面において提供される。この方法は
、対象に、当該疾患を改善させるに充分な量の自己由来のＣＤ４＋Ｔリンパ球で
あって、当該ＣＤ４＋Ｔリンパ球がＨＬＡクラスII分子とＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬ
ＡクラスII結合ペプチドとの複合体に特異的であるＴリンパを投与することを含
む。好ましくは、当該ＨＬＡクラスII分子はＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０１または
ＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０２などのＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子か、またはＨＬ
Ａ−ＤＰＢ１＊０４０１などのＨＬＡ−ＤＰＢ１分子である。ある態様において
は、当該ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：４１、配
列番号：４２、配列番号：８６のアミノ酸配列か、またはそれらの機能的変異体
を含む。好ましくは、当該ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配
列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：
２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配
列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：
３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配
列番号：８４および配列番号：８６のアミノ酸配列を有するペプチドである。さ
らに好ましくは、当該ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番
号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８または配列番号：
８６のアミノ酸配列を含む。
【００２１】 ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドの機能的変異体の同定法は、本
発明のもう一つの局面により提供される。この方法によれば、ＭＡＧＥ−Ａ３
ＨＬＡクラスII結合ペプチド、当該ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチ
ドと結合するＨＬＡクラスII結合分子、および当該ＨＬＡクラスII結合分子によ
り提示されるＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドによって刺激される
Ｔ細胞が選択される。当該ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドの第一
アミノ酸が、変異体ペプチドを調製するべく突然変異される。次いで、当該変異
体ペプチドのＨＬＡクラスII結合分子に対する結合と、Ｔ細胞の刺激とが測定さ
れるが、この場合当該変異体ペプチドの当該ＨＬＡクラスII結合分子に対する結
合と、当該ＨＬＡクラスII結合分子によって提示される当該変異体ペプチドによ
るＴ細胞の刺激とは、当該変異体が機能的変異体であることを示す。好ましい態
様においては、ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：４
１、配列番号：４２、または配列番号：８６のアミノ酸配列を含む。さらに好ま
しくは、当該ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：２４
、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番
号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２
、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番
号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列番号：８４
および配列番号：８６のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドである。さら
に好ましくは、当該ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号
：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８、または配列番号：
８６のアミノ酸配列を含む。ある態様においては、この方法はさらに、当該ＭＡ
ＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドによるＴ細胞の刺激と、当該機能的変
異体によるＴ細胞の刺激とを、当該機能的変異体によるＴ細胞の刺激の有効性を
決定するものとして比較する工程を含む。
【００２２】 本発明のもう一つの局面によれば、単離されたポリペプチドが提供される。単
離されたこのペプチドは、単離された当該ペプチドがＨＬＡクラスII分子ではな
い場合、選択的にＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドと結合する。あ
る態様においては、単離された当該ペプチドは抗体であり、好ましくはモノクロ
ーナル抗体である。他の態様においては、単離された当該ペプチドは、 ＭＡＧ
Ｅ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドに選択的な、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（
ａｂ）２フラグメント、またはＣＤＲ３領域を含んでいるフラグメントから成る
群より選ばれる抗体フラグメントである。
【００２３】 本発明のさらにもう一つの局面によれば、単離されたＣＤ４＋Ｔリンパ球が提
供される。単離された当該ＣＤ４＋Ｔリンパ球は、ＨＬＡクラスII分子と、ＭＡ
ＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドとの複合体に対し、選択的に結合する
。好ましくは、当該ＨＬＡクラスII分子は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０１または
ＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０２などのＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子か、またはＨＬ
Ａ−ＤＰＢ１＊０４０１などのＨＬＡ−ＤＰＢ１分子である。いくつかの態様に
おいては、当該ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：４
１、配列番号：４２、または配列番号：８６のアミノ酸配列か、またはそれらの
機能的変異体を含む。好ましいＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドは
、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番
号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３
、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番
号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３
、配列番号：８４および配列番号：８６のいずれかのアミノ酸配列を有するペプ
チドである。さらに好ましくは、当該ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプ
チドは、配列番号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８、
または配列番号：８６のアミノ酸配列を含むペプチドと結合する。
【００２４】 本発明のなおもう一つの局面によれば、単離された抗原提示細胞が提供される
。当該抗原提示細胞は、ＨＬＡクラスII分子と、ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラス
II結合ペプチドとの複合体を含む。好ましくは、当該ＨＬＡクラスII分子は、Ｈ
ＬＡ−ＤＲＢ１／１３０１またはＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０２などのＨＬＡ−Ｄ
ＲＢ１／１３分子か、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０４０１などのＨＬＡ−ＤＰＢ
１分子である。ある態様においては、当該ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合
ペプチドは、配列番号：４１、配列番号：４２、または配列番号：８６のアミノ
酸配列か、またはそれらの機能的変異体を含む。好ましくは当該ＭＡＧＥ−Ａ３
ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号
：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、
配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号
：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、
配列番号：４１、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６のいず
れかのアミノ酸配列を有するペプチドである。さらに好ましくは、当該ＭＡＧＥ
−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列番号：２３、配列番号：３４、配
列番号：３７、配列番号：３８、または配列番号：８６のアミノ酸配列を含む。
【００２５】 本発明はまた前述の、または本明細書全体を通して述べられた１または２以上
の薬物を含んでいる製剤を提供する。かかる製剤は、薬学的に許容され得る希釈
剤の担体を含むことができる。 薬物、特に癌の治療のための薬物の調製における、前記の組成物、ペプチドお
よび核酸の使用もまた提供される。 本発明のこれらの、また他の目的は、本発明についての詳細な説明を参照して
さらに述べられるだろう。
【００２６】 （発明の詳細な説明） 本発明はＨＬＡクラスII分子により提示される単離されたＭＡＧＥ−Ａ３ペプ
チドであって、ＣＤ４＋Ｔリンパ球の増殖および活性化を刺激するペプチドを提
供する。かかるペプチドは本明細書において、「ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラス
II結合タンパク質」、「ＨＬＡクラスII結合ペプチド」、および「ＭＨＣクラス
II結合タンパク質」と呼ばれる。したがって、本発明の一つの局面は、配列番号
：４１、配列番号：４２、または配列番号：８６のアミノ酸配列を含む単離され
たペプチドである。
【００２７】 以下の例は、ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドであるペプチドの
単離を示している。これらの代表的なペプチドは、配列番号：１の核酸のプロセ
スされた翻訳産物である。そのように、ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペ
プチドがそこから提示用の最終的な形状にプロセスされる翻訳産物は、それらが
当該ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドを包含する限り、いかなる長
さまたは配列であってもよいことが当業者には理解されるであろう。以下の例に
おいて証明されるように、１０アミノ酸程の小ささでも、またＭＡＧＥ−Ａ３タ
ンパク質（配列番号：２）のような大きさでも、ペプチドまたはタンパク質は適
切にプロセスされ、ＨＬＡクラスII分子によって提示され、かつＣＤ４＋Ｔリン
パ球を刺激することにおいて有効である。配列番号：４１、配列番号：４２、ま
たは配列番号：８６のペプチドといったＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合タ
ンパク質は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個
、またはそれより多いアミノ酸が一端または両端に付加されてよい。このような
ペプチドの抗原性部分は、生理的な条件下ではＨＬＡクラスII分子による提示用
に切断される。この技術においては、ＨＬＡクラスIIペプチドの長さが約１０ア
ミノ酸と約３０アミノ酸の間で可変であることも知られている（Engelhard, Ann
. Rev. Immunol. 12 : 181 - 201, 1994）。当該ＨＬＡクラスII結合ペプチドの
ほとんどは、１２〜１９アミノ酸長の範囲に入る。ペプチドがコア配列を共有し
ているが、アミノおよび／カルボキシ末端においては異なるアミノ酸を有するＨ
ＬＡクラスII結合ペプチドの入れ子のセット（nested sets）が同定されている
（たとえば、Chiczら、J. Exp. Med. 178 : 27 - 47, 1993参照のこと）。この
ように、付加的なＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチド、ならびにＭＡ
ＧＥ−Ａ３ファミリーＨＬＡクラスII結合ペプチドが、本明細書に開示された手
順に従って当業者によって同定されることが可能であろう。
【００２８】 例において記述された手順は、ＭＡＧＥファミリーＨＬＡクラスII結合ペプチ
ドを同定するべく使用されることが可能である。したがって、たとえば正常な血
液ドナーの樹状細胞などの抗原提示細胞を、当該細胞をＭＡＧＥポリペプチドと
接触させることにより、あるいは注目のＭＡＧＥタンパク質の発現を指示する核
酸分子を細胞内に導入することにより、組換えＭＡＧＥタンパク質（またはその
フラグメント）を用いてロードすることができる。当該抗原提示細胞は次いで、
ＭＡＧＥ ＨＬＡクラスII結合ペプチドを認識する特異的なＣＤ４リンパ球のイ
ンビトロの活性化および増殖を誘導するべく用いられることが可能である。次い
で当該ペプチドの配列は、例において記述されているように、たとえばＣＤ４リ
ンパ球の活性化および増殖を刺激するべく用いられたＭＡＧＥタンパク質のペプ
チドフラグメントを用いて細胞を刺激することにより決定されることが可能であ
る。別法として、ＭＡＧＥタンパク質由来のペプチドを用いて抗原提示細胞をロ
ードすることもできる。たとえば、結合性ＨＬＡクラスII分子についてのアミノ
酸のコンセンサス配列に基づき、ＨＬＡクラスII結合ペプチドの候補者であるＭ
ＡＧＥファミリータンパク質由来のペプチド配列を予測することが可能である。
この点については、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０３１８２およびＰＣＴ／ＵＳ
９８／０１３７３を参照のこと。かくして選ばれたペプチドは、特異的なＣＤ４
リンパ球の誘導およびペプチドの同定のための本明細書に述べられた検定におい
て使用されることが可能である。ＨＬＡクラスII結合ペプチドの選択および検査
のための付加的な方法は、この技術において周知である。
【００２９】 前文に記したように、本発明はＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチド
の機能的変異体を含む。本明細書に用いられているように、ＨＬＡクラスII結合
ペプチドの「機能的変異体」または「変異体」は、あるＨＬＡクラスII結合ペプ
チドの一次アミノ酸配列の一つまたはそれより多い修飾を含み、かつ本明細書に
開示されたＨＬＡクラスIIおよびＴ細胞受容体結合特性を保持しているペプチド
である。
【００３０】 ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドの変異体を生じる修飾は、たとえ
ば、１）発現系におけるペプチドの安定性、またはＨＬＡ−ペプチド結合などの
タンパク質−タンパク質結合の安定性といった、ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラス
II結合ペプチドの特性を強化するため；２）抗原性エピトープの付加、または検
出可能な成分の付加といった、ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドに
対する新規な活性または特性を提供するため；または３）同一または同様のＴ細
胞刺激特性を生じる異なるアミノ酸配列を提供するため作製されることが可能で
ある。ＭＡＧＥ−Ａ３（ならびにＭＡＧＥファミリー）ＨＬＡクラスII結合ペプ
チドの修飾は、当該ペプチドをコードしている核酸に対して行なわれることが可
能であり、欠失、点突然変異、アミノ酸置換、およびアミノ酸付加を含むことが
できる。別法として、切断、リンカー分子の付加、ビオチンなどの検出可能な成
分の付加、脂肪酸の付加、１アミノ酸の他への置換、その他によるなどの修飾が
、当該ポリペプチドに対して直接に行なわれることが可能である。変異体はまた
ランダムペプチドか、または一つまたはそれより多い部分における置換を含むＭ
ＡＧＥペプチドの置換に基づく、ペプチドのライブラリーから選ばれることが可
能である。たとえば、ペプチドライブラリーはＨＬＡクラスII分子に結合したＭ
ＡＧＥペプチドの複合体（たとえばＭＡＧＥタンパク質を付加された樹状細胞）
を用いた競合性の検定に使用されることができる。ＨＬＡクラスII分子に対する
ＭＡＧＥペプチドの結合について競合するペプチドは、配列決定されることが可
能であり、ＭＡＧＥペプチドの機能的変異体を決定するべく、他の検定（たとえ
ば、ＣＤ４リンパ球の増殖）に使用される。
【００３１】 修飾はまた、本明細書に述べられた不変鎖−ＭＡＧＥ−Ａ３融合タンパク質な
どの、ＭＡＧＥ ＨＬＡクラスII結合ペプチドのアミノ酸配列のすべてまたは一
部を含んでいる融合タンパク質を含む。したがって本発明は、ＭＡＧＥ−Ａ３
ＨＬＡクラスII結合ペプチドと、ヒト不変鎖（Iｉ）などのエンドソーム標的化
部分とを含んでいる融合タンパク質を含む。以下に開示されるように、ヒト不変
鎖のエンドソーム標的化部分のＭＡＧＥ−Ａ３に対する融合の結果、ＨＬＡクラ
スIIペプチド提示経路に対するＭＡＧＥ−Ａ３の効果的な標的化を生じた。ヒト
不変鎖または他の標的化ポリペプチドの「エンドソーム標的化部分」は、第２の
ポリペプチドに対して融合または結合された時、当該第２のポリペプチドのエン
ドソームの局在性を亢進する分子部分である。したがって、エンドソーム標的化
部分は、全配列かまたはヒト不変鎖Iｉなどの標的化ポリペプチドのごく小さな
部分を含むことが可能である。当業者は、標的化分子のエンドソーム標的化部分
を容易に決定することができる。
【００３２】 驚いたことに、ＬＡＭＰ−１タンパク質の融合は、ＨＬＡクラスII結合ペプチ
ド提示経路へのＭＡＧＥ−Ａ３の標的化を有意に亢進しなかった。したがって、
本発明はＭＡＧＥ−Ａ３およびヒト不変鎖Iｉの融合タンパク質はＨＬＡクラスI
I結合ペプチド提示経路に対して効果的に標的化されるが、ＬＡＭＰ−１はそう
ではないという意外な発見を含む。さらなるエンドソーム標的化シグナルが当業
者により同定され、ＭＡＧＥ−Ａ３またはそのＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII
結合部分に融合され、さらにＨＬＡクラスIIペプチド提示経路に対する標的化に
ついて、日常の実験法のみを用いて検査されることが可能である。
【００３３】 ＭＡＧＥ ＨＬＡクラスII結合ペプチドのアミノ酸配列は、天然または非天然
由来であってよく、すなわち、それらは天然のＭＡＧＥ ＨＬＡクラスII結合ペ
プチド分子を含むか、または提示された際に当該アミノ酸配列がヘルパーＴ細胞
を刺激する能力を保持し、かつＨＬＡＤＲＢ１／１３分子またはＨＬＡＤＰＢ１
分子などのＨＬＡクラスII分子に結合する特性を保持している限り、修飾された
配列を含んでよい。たとえば、このような状況にあるＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡク
ラスII結合ペプチドは、ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドと、無関
係なアミノ酸配列、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番
号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１
、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番
号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１
、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６に示されるアミノ酸配
列の合成ペプチド、標識されたペプチド、ＭＡＧＥ−Ａ３を発現している癌対象
から単離されたペプチド、ＭＡＧＥ−Ａ３を発現する培養細胞から単離されたペ
プチド、非ペプチド分子に結合されたペプチド（たとえばある薬剤のデリバリー
システムにおいて）、および配列番号：４１、配列番号：４２、または配列番号
：８６のアミノ酸配列を含んでいる他の分子、を含んでいる融合タンパク質であ
ってよい。
【００３４】 好ましくは、ＭＡＧＥ ＨＬＡクラスII結合ペプチドは非加水分解性である。
かかるペプチドを提供するため、ＭＡＧＥ ＨＬＡクラスII結合ペプチドは一つ
またはそれより多いＤ−アミノ酸を含んでいるペプチド、または一つまたはそれ
より多い非加水分解性ペプチド結合アミノ酸を含んでいるペプチドなどの、非加
水分解性ペプチドのライブラリーから選択されてよい。別法として、ＣＤ４＋Ｔ
リンパ球の誘導に最適なペプチドを選択し、次いでプロテアーゼによる加水分解
の可能性を減じるために必要とされるように、当該ペプチドを修飾することもで
きる。たとえば、タンパク質分解に対する感受性を測定するべくペプチドが標識
され、さらに細胞抽出物または精製されたプロテアーゼと共にインキュベートさ
れ、次いでどのペプチド結合がタンパク質分解に対して感受性であるのかを、た
とえばペプチドおよびタンパク質分解によるフラグメントの配列決定により決定
するべく単離されてもよい。別法として、ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合
ペプチドのアミノ酸配列を、一団のプロテアーゼの既知の切断特異性と比較する
ことにより、可能性のある感受性ペプチド結合が同定されることも可能である。
このような分析結果に基づき、タンパク質分解に対して感受性である個々のペプ
チド結合が、インビトロのペプチド合成により非加水分解性ペプチド結合に置き
換えられることが可能である。
【００３５】 この技術においては、多くの非加水分解性ペプチド結合が、かかる結合を含ん
でいるペプチドの合成法と共に周知である。非加水分解性結合は、−psi［ＣＨ
２ＮＨ］−還元アミドペプチド結合、−psi［ＣＯＣＨ２］−ケトメチレンペプ
チド結合、−psi［ＣＨ（ＣＮ）ＮＨ］−（シアノメチレン）アミノペプチド結
合、−psi［ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）］−ヒドロキシエチレンペプチド結合、−psi［
ＣＨ２Ｏ］−ペプチド結合、および−psi［ＣＨ２Ｓ］−チオメチレンペプチド
結合を含む。 非ペプチドであるペプチド類似体、たとえば安定化された構造または減じられ
た生物分解を提供するものもまた考えられる。ペプチド模倣性類似体(mimetic a
nalogs)は、選ばれたＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドを主成分と
し、非ペプチド成分による一つまたはそれより多い残基の置換により調製される
ことができる。好ましくは、当該非ペプチド成分は当該ペプチドがその天然の構
造を保持することか、または好ましい、たとえば生物活性のある確証（confirma
tion）を安定化させることを可能にする。かかるペプチドは、構造および／また
は活性についての置換の影響を査定するための、分子または細胞を基盤とする結
合分析において検査されることが可能である。ペプチドからの非ペプチド模倣性
類似体の調製法は、Nachmanら、Regul. Pept. 57 : 359 - 370（1995）に記述さ
れている。本明細書において使用されたようなペプチドは前述のすべてを含む。
【００３６】 変異体が、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２
７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列
番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３
７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列
番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６の一つのアミノ酸についての
変化を含む場合、保存性のアミノ酸の置換を有するＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラ
スII結合ペプチドの機能的変異体、すなわちもとのアミノ酸の電荷、疎水性、構
造、その他といった特性を保持する置換が、典型的には好ましいであろう。アミ
ノ酸の保存性の置換の実例は、以下のグループ内でのアミノ酸の間で行なわれる
置換を含む：（ａ）Ｍ、I、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（
ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。
【００３７】 ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドの機能的変異体を同定するため
の他の方法は、Strominger ＆ Wucherpfenningの刊行されたＰＣＴ出願（ＰＣＴ
／ＵＳ９６／０３１８２）に提供されている。これらの方法は、可能性のあるエ
ピトープがそれについて比較されてよいアミノ酸配列モチーフの開発に依存して
いる。各々のモチーフはある有限のアミノ酸配列のセットを記述しており、各々
の（相対的な）位置は（ａ）一つの残基に限定されるか、（ｂ）限定された残基
のセットの中で変化するようにされるか、または（ｃ）すべての可能な残基の中
で変化するようにされてよい。たとえば、一つのモチーフは第１の位置の残基が
バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、またはフェニルアラニンの残基
のうちのどの一つであってもよく；第２の位置の残基はヒスチジンでなけらばな
らず；第３の位置の残基はどのアミノ酸残基でもよく；第４の位置の残基はバリ
ン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、また
はトリプトファンの残っ基のどの一つであってもよく；さらに第５の位置の残基
はリジンでなけらばならないことを明示している。
【００３８】 ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドの機能的変異体についての配列
モチーフは、本明細書において開示されたＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合
ペプチドの、主要組織適合性複合体ＨＬＡ−ＤＲタンパク質および／またはＴ細
胞受容体（「ＴＣＲ」）接触点の結合ドメインまたは結合ポケットの分析により
開発されることが可能性である。 ＨＬＡクラスII結合ポケットの形成に関わる残基についての詳細な構造分析を
提供することにより、いかなるＨＬＡクラスIIタンパク質に対してもＭＡＧＥペ
プチドを結合するための配列モチーフを予測することが可能となる。
【００３９】 このような配列モチーフを研究、評価、または設計の基準として用いることに
より、特定のＨＬＡ分子に対して結合すること、およびＴ細胞の応答を誘導する
べくＴ細胞受容体と相互作用することについての正当な可能性をもつペプチド（
たとえばＭＡＧＥ ＨＬＡクラスII結合ペプチド、特に本明細書において開示さ
れたＭＡＧＥ−Ａ３ペプチド、およびそれらの機能的変異体）の種類を同定する
ことが可能となる。このようなペプチドは、本明細書に記述されたように合成さ
れ、活性について検査されることが可能である。純粋な配列の相同性（抗原性と
しては同様であるが全く配列の異なる多くのペプチドを除外する）、または制限
されない「保存性」の置換のある配列の相同性（高度に保存された決定的な部位
が異なる多くのペプチドを認める）に反してこれらのモチーフを用いることは、
それによって当業者がペプチドを、疾患の治療における可能性のある適用につい
て評価することができる方法を表している。
【００４０】 Strominger ＆ WucherpfenningのＰＣＴ出願および、そのすべてが参考文献と
して取込まれており、それに引用された参考文献は、ＨＬＡクラスIIと、ＨＬＡ
クラスIIペプチドの残基と接触するＴＣＲ結合ポケットについて記述している。
ＨＬＡクラスIIおよび／またはＴＣＲ結合ポケットににおいて結合しやすい残基
を一定に保持することにより、あるいはわずかに指定された置換のみを許すこと
により、ＨＬＡクラスIIおよびＴ細胞受容体に対する結合性を保持しているＭＡ
ＧＥ ＨＬＡクラスII結合ペプチドの機能的変異体を調製することができる。
【００４１】 このように、付加的なＭＡＧＥファミリーＨＬＡクラスIIペプチド、特にＭＡ
ＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチド、およびそれらの機能性当該変異体ペ
プチドのの変異体を同定するための方法が提供される。一般に、どのようなＭＡ
ＧＥタンパク質も上記の分析を受けることが可能であり、ペプチド配列は本明細
書に記述されたように選択され、かつ検査される。たとえばＭＡＧＥ−Ａ３につ
いては、当該方法は、ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチド、当該ＭＡ
ＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドと結合するＨＬＡクラスII結合分子、
およびＨＬＡクラスII結合分子によって提示された当該ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡ
クラスII結合ペプチドによって刺激されるＴ細胞を選択することを含む。好まし
い態様においては、当該ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、配列
番号：４１、配列番号：４２、または配列番号：８６のアミノ酸配列を含む。さ
らに好ましくは、当該ペプチドは、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号
：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、
配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号
：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、
配列番号：４１、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６のアミ
ノ酸配列から成る。当該ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドの一つの
第一アミノ酸残基が、変異体ペプチドを調製するべく突然変異される。当該アミ
ノ酸残基は、上記のStrominger ＆ WucherpfenningのＰＣＴ出願に述べられたＨ
ＬＡとＴ細胞受容体の接触点についての原理に従って突然変異されることが可能
である。変異体ペプチドの合成、突然変異した核酸分子を用いた変異体ペプチド
の組換えによる産生、その他といった変異体ペプチドを調製するためのどのよう
な方法も用いられることが可能である。
【００４２】 次いで当該変異体ペプチドの、ＨＬＡクラスII結合分子に対する結合とＴ細胞
の刺激とが、標準的な方法に従って測定される。たとえば、以下において例証さ
れるように、当該変異体ペプチドは、ＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドと結合して当該変
異体と抗原提示細胞との複合体を形成する当該ＨＬＡクラスII分子を含む、抗原
提示細胞と接触することができる。次いでこの複合体は、当該ＨＬＡクラスII結
合分子によって提示された当該ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドを
認識するＴ細胞と接触することが可能である。Ｔ細胞は、ＭＡＧＥ−Ａ３の発現
によって特徴づけられる症状を有する患者から取得されることが可能である。当
該Ｔ細胞による変異体ペプチドの認識は、ＴＮＦまたはIＦＮγ産生といったＴ
細胞刺激の指標を測定することにより決定されることが可能である。他のＭＡＧ
ＥファミリーＨＬＡクラスII結合ペプチドの同定および特徴づけのため、同様の
方法が行なわれることが可能である。
【００４３】 ＨＬＡクラスII結合分子に対する変異体ペプチドの結合と、当該ＨＬＡクラス
II結合分子によって提示された当該変異体ペプチドによるＴ細胞の刺激とは、当
該変異体ペプチドが機能的変異体であることを示唆している。この方法はまた、
機能的変異体によるＴ細胞の刺激の有効性の測定として、ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬ
ＡクラスII結合ペプチドによるＴ細胞の刺激と、当該機能的変異体によるＴ細胞
の刺激とを比較することの工程を含むことができる。機能的変異体をＭＡＧＥ−
Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドと比較することにより、Ｔ細胞刺激特性の亢
進されたペプチドの調製が可能となる。 前記のどの方法によって調製されたＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプ
チドの変異体でも、もし必要であれば、アミノ酸配列を決定するべく、したがっ
てかかる変異体をコードしている核酸配列を演繹するべく、配列決定されること
が可能である。
【００４４】 また本発明の一部はＭＡＧＥ ＨＬＡクラスII結合ペプチドまたはその変異体
をコードしている核酸配列および、ストリンジェントな条件下に上記のヌクレオ
チド配列から成る核酸分子とハイブリッド形成する他の核酸配列である。本明細
書において用いられたような「ストリンジェントな条件」という用語は、この技
術において知られたパラメーターである。核酸のハイブリッド形成のパラメータ
ーは、かかる方法を集めた参考文献、たとえばMolecular Cloning：A Laborator
y Manual, J. Sambrook ら編、第２版、コールドスプリングハーバー・ラボラト
リープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、コールドスプリングハ
ーバー、ニューヨーク、1989、またはCurrent Protokols in Molecular Biology
, F. M. Ausubeiら編、ジョン・ウィリー＆サンズ（John Wiley & Sons ）社、
ニューヨーク、に見出されるであろう。さらに具体的には、本明細書において用
いられたようなストリンジェントな条件は、６５℃においての、ハイブリッド形
成緩衝液（３．５xＳＳＣ、０．０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロ
リドン（pyrolidone）、０．０２％ウシ血清アルブミン、２５ｍＭ ＮａＨ２Ｐ
Ｏ４（ｐＨ７）、０．０５％ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）におけるハイブリッド
形成を指す。ＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウ
ム、ｐＨ７であり；ＳＤＳはドデシル硫酸ナトリウムであり；またＥＤＴＡはエ
チレンジアミン四酢酸である。ハイブリッド形成後、ＤＮＡが移された膜は、２
xＳＳＣにて室温において、次いで０．１〜０．５ｘＳＳＣ／０．１ｘＳＤＳに
て６５℃までの温度において洗浄される。
【００４５】 同程度の緊縮(stringency)を生じる結果となる使用可能な他の条件、試薬、そ
の他がある。熟練した技術者はかかる条件に通じていると思われるため、それら
はここに記されていない。しかしながら熟練した技術者は、本発明のＭＡＧＥ
ＨＬＡクラスII結合ペプチドをコードしている核酸の相同物または対立遺伝子の
明確な同定を可能にする方式で、条件を操作することが可能であることが理解さ
れよう。また熟練した技術者は、かかる分子の発現のための細胞およびライブラ
リーのスクリーニングについての方法論にも通じており、それらの分子は次いで
慣例的に単離され、続いて関連する核酸分子が単離され配列決定される。
【００４６】 一般的に相同物および対立遺伝子は、典型的には少なくとも５０％のアミノ酸
の同一性、および／または少なくとも４０％のヌクレオチドの同一性を（配列番
号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８
、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番
号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８
、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列番
号：８４および配列番号：８６などの）ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペ
プチドのアミノ酸配列に対して、またはかかるペプチドをコードしている核酸に
対して各々共有するであろう。いくつかの実例においては、相同物および対立遺
伝子は、少なくとも９０％のヌクレオチドの同一性および／または少なくとも９
５％のアミノ酸の同一性を共有するであろうし、さらに別の実例では、少なくと
も９５％のヌクレオチドの同一性および／または少なくとも９９％のアミノ酸の
同一性を共有するであろう。上記の核酸の相補体もまた本発明に含まれる。
【００４７】 ＭＡＧＥ ＨＬＡクラスII結合ペプチドをコードしている核酸についてのスク
リーニングでは、サザンブロットまたはノーザンブロットなどの核酸のハイブリ
ッド形成は、上記の条件を３２Pプローブと共に用いて行なってよい。ＭＡＧＥ
ＨＬＡクラスII結合ペプチドをコードしているＤＮＡが最終的に移された膜の
洗浄後、放射性シグナルを検出するべく、X線フィルムに対し当該膜を設置する
ことができる。
【００４８】 本発明はまた、当該ＭＡＧＥ ＨＬＡクラスII結合ペプチドと同一のアミノ酸
配列をコードする代替コドンを含む核酸配列の使用を含む。たとえば、本明細書
に開示されているように、ペプチドＲＫＶＡＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲＡ（配列番
号：３）はＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドである。ロイシン残基
（配列番号：３のアミノ酸番号６、１０、１１、および１２）はコドンＣＵＡ、
ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵＵ、ＵＵＡ、およびＵＵＧによりコードされることが可能
である。６個のコドンの各々はロイシン残基をコードする目的については同等で
ある。したがって、ロイシンをコードしているヌクレオチドトリプレットのいず
れもが、ロイシン残基を取込むため、インビトロまたはインビボのタンパク質合
成装置を指示するべく用いられてよいことが当業者には明らかであろう。同様に
、配列番号：３のＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドを含む他のアミ
ノ酸残基をコードするヌクレオチド配列のトリプレットは：ＣＧＡ、ＣＧＣ、Ｃ
ＧＧ、ＣＧＴ、ＡＧＡ、およびＡＧＧ（アルギニンコドン）；ＡＡＡおよびＡＡ
Ｇ（リジンコドン）；ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、およびＧＵＵ（バリンコドン）
；ＧＡＡおよびＧＡＧ（グルタミンコドン）；ＣＡＣおよびＣＡＵ（ヒスチジン
コドン）；ＵＵＣおよびＵＵＵ（フェニルアラニンコドン）、およびＵＡＣおよ
びＵＡＵ（チロシンコドン）を含む。他のアミノ酸残基も同様に複数のヌクレオ
チド配列によってコードされてよい。したがって本発明は、遺伝子コードの縮重
のため、コドンの配列において天然のＭＡＧＥ ＨＬＡクラスII結合ペプチドを
コードしている核酸とは異なる縮重された核酸を含む。
【００４９】 また本発明が、当該配列の発現ベクターにおける、ならびに原核性（たとえば
大腸菌）または真核性（たとえば樹状細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、酵母の発
現系、および昆虫細胞における組換えバキュロウイルスの発現）である、宿主細
胞または細胞系をトランスフェクトするための使用を含むことも理解されよう。
発現ベクターは、関係する配列、すなわち前述のものが、プロモーターに対し作
動可能に連結されていることを必要とする。ヒトＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０２分
子がＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドを提示することが判っている
ため、当該発現ベクターもまたＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子をコードしている核
酸配列を含んでもよい。（他のＭＡＧＥ ＨＬＡクラスII結合ペプチドのために
は、ＨＬＡ−ＤＰＢ１などの異なるＨＬＡ分子、特にＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０４０
１が使用されることが可能である）。ベクターが、コードしている配列の双方を
含む状況においては、それはいずれの一つも正常には発現しない細胞をトランス
フェクトすべく用いられることが可能である。ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII
結合ペプチドをコードしている配列は、たとえば宿主細胞がすでにＨＬＡ−ＤＲ
Ｂ１／１３分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１分子を発現している場合には、単独で用
いられてよい。もちろん、当該二つのコードしている配列を含むベクターが、所
望であればＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１分子を発現しな
い宿主細胞において用いられてよく、またＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合
ペプチドをコードしている核酸が、 ＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子またはＨＬＡ
−ＤＰＢ１分子を発現する抗原提示細胞において使用されることが可能であるこ
とから、使用可能な宿主細胞については何ら制限はない。
【００５０】 本明細書に用いられているように、「ＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子」は、
【外１】 のサブタイプを含む。ＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子はまたBodmerらのTissue Ant
igens 49: 297, 1996に見られるサブタイプを含む。
【００５１】 本明細書に用いられているように、「ＨＬＡ−ＤＰＢ１分子」は、
【外２】 のサブタイプ、および当業者には周知の他のサブタイプを含む。 好ましくは、
ＨＬＡ−ＤＰＢ１分子はＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０４分子、特にＨＬＡ−ＤＰＢ１＊ ０４０１分子である。
【００５２】 本明細書に用いられているように、「ベクター」は、異なる遺伝的環境の間の
移送のため、または宿主細胞における発現のために、制限または連結によって所
望の配列が挿入されてよい多数の核酸のどれでもよい。ベクターは典型的にはＤ
ＮＡから構成されるが、ＲＮＡベクターもまた利用できる。ベクターはプラスミ
ド、ファージミド、およびウイルスゲノムを含むがこれに制限されない。クロー
ニングベクターは、自律的に、あるいはゲノムへの組込みの後に、宿主細胞にお
いて複製することができるものであり、それはさらに一つまたはそれより多いエ
ンドヌクレアーゼ制限部位によって特徴づけられ、その場所で当該ベクターは測
定可能な様式で切断されてよく、そこに所望のＤＮＡ配列が連結されてよく、新
規な組換えベクターが宿主におけるその複製能を保持するようにする。プラスミ
ドの場合には、宿主細菌内のプラスミドのコピー数が増えるにつれて所望の配列
の複製が何度も起きてよく、あるいは細胞分裂によって宿主が再生される前に宿
主あたり１回だけでもよい。ファージの場合には、複製は溶菌相の間は積極的に
、あるいは溶原相の間は受動的に起きてよい。発現ベクターは、その中に所望の
ＤＮＡ配列が制限および連結により挿入され、それが調節配列に対して作動可能
に連結されて、ＲＮＡ転写物として発現されようにするものである。ベクターは
さらに、当該ベクターによって形質転換またはトランスフェクトされたか、また
はされない細胞を同定することにおける使用に適した一つまたはそれより多いマ
ーカー配列を含んでもよい。マーカーは、たとえば抗生物質または他の化合物に
対する抵抗性または感受性のどちらかを亢進または低下させるタンパク質をコー
ドしている遺伝子、その活性がこの技術における標準的な分析法によって検出可
能な酵素（たとえば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、またはアルカリ
性ホスファターゼ）をコードする遺伝子、および形質転換またはトランスフェク
トされた細胞、宿主、コロニー、またはプラークの表現型に視覚的に影響する遺
伝子を含む。好ましいベクターは自律的な複製と、それに対してベクターが作動
可能に連結されているＤＮＡセグメントに存在する構造遺伝子産物の発現が可能
なベクターである。
【００５３】 好ましくは、当該発現ベクターはＭＡＧＥファミリーポリペプチド、たとえば
ＭＡＧＥ−Ａ３、またはそれに由来するＨＬＡクラスII結合ペプチドを、当該タ
ンパク質が発現される細胞のエンドソームに対して標的化する配列を含む。ＨＬ
ＡクラスII分子は、当該ＨＬＡクラスII分子に対する他の分子の結合を妨げる不
変鎖（Iｉ）を含む。この不変鎖はエンドソームにおいて切断され、それにより
ＨＬＡクラスII分子によるペプチドの結合が許される。したがって、ＭＡＧＥ−
Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドおよびその先駆体（たとえばＭＡＧＥ−Ａ３
）はエンドソームに対して標的化され、それによりＨＬＡクラスII分子に結合す
るＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドが増大する。エンドソームに向
けて分子を指向させるための標的化シグナルはこの技術において周知であり、こ
れらのシグナルは発現ベクターに都合よく取込まれ、エンドソーム標的化シグナ
ルを含む融合タンパク質が産生されるようにする。Sandersonら（Proc. Nat’l.
Acad. Sci. USA 92 ; 7217 - 7221, 1995）、Wuら（Proc. Nat’l. Acad. Sci.
USA 92 ; 11671 - 11675, 1995）、およびThomsonら（J. Virol. 72 : 2246 -
2252, 1998）は、エンドソーム標的化シグナル（不変鎖（Iｉ）およびリソゾー
ム結合性膜タンパク質ＬＡＭＰ−１を含む）と、エンドソームおよび／またはリ
ソゾーム性の細胞区画へ抗原を指向させることにおけるそれらの使用について述
べている。例に示したように、不変鎖−ＭＡＧＥ−Ａ３融合タンパク質が好まし
い。
【００５４】 不変鎖などのエンドソーム標的化シグナルもまた、特異的にＭＡＧＥ−Ａ３を
標的化することができる結合体を調製するべく、非ペプチド結合により（すなわ
ち非融合タンパク質）、ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質またはペプチドに結合される
ことが可能である。共有結合の具体例は、二価性架橋分子が用いられているもの
を含む。この架橋分子は結合されるべき分子の性質に依存して、ホモの二価性（
homobifunctional）か、またはヘテロの二価性（heterobifunctional）であって
よい。ホモの二価性架橋剤は二つの同等の反応基を有する。へテロの二価性架橋
剤は、連続的な結合反応を可能にする二つの異なる反応基を有するものとして定
義される。市販の種々の架橋剤は、以下の一つまたはそれより多い基と反応性で
ある；第一級アミン、第二級アミン、スルフヒドリル、カルボキシル、カルボニ
ル、および炭水化物。当業者は、結合されるべき分子の化学的特性と、結合また
は複数の結合についての好ましい性質とに基づき、エンドソーム標的化成分とＭ
ＡＧＥ−Ａ３ペプチドまたはタンパク質との連結のために好ましい分子を、過度
の実験をすることなく確認することができるであろう。
【００５５】 本明細書に用いられたように、コーディング配列および調節配列は、当該コー
ディング配列の発現または転写が、当該調節配列の影響または支配下にあるよう
に位置される様式において共有結合されている場合、「作動可能に」結合されて
いるといわれる。もし当該コーディング配列が機能タンパク質に翻訳されること
が望まれる場合には、二つのＤＮＡ配列は、もし５´調節配列におけるプロモー
ターの誘導の結果当該コーディング配列の転写を生じ、またもし当該二つのＤＮ
Ａ配列の間の連結の性質が、（１）フレームシフト突然変異を誘導する結果とな
らず、（２）当該コーディング配列の転写を指示するための当該プロモーターの
能力を妨害せず、あるいは（３）タンパク質に翻訳されるべき対応するＲＮＡ転
写物の能力を妨害しない場合には、「作動可能に」連結されているといわれる。
したがってプロモーター領域は、もし当該プロモーター領域が、結果として得ら
れる転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳されるように、そのＤ
ＮＡ配列の転写を果たすことができれば、作動可能にコーディング配列に結合さ
れていることになる。
【００５６】 遺伝子発現に必要な調節配列の詳細な性質は、種または細胞型の間で異なって
よいが、一般的には、必要なこととして、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列
、ＣＡＡＴ配列、その他といった各々転写および翻訳の開始に関与する５´非転
写、および５´非翻訳配列を含むであろう。特に、かかる５´非転写調節配列は
、作動可能に結合された遺伝子の転写調節のためのプロモーター配列を含むプロ
モーター領域を含むであろう。調節配列はまたエンハンサー配列か、または所望
の上流のアクチベーター配列を含んでもよい。本発明のベクターは、任意に５´
リーダーまたはシグナル配列を含んでもよい。適当なベクターの選択および設計
は、当業者の能力および自由裁量の範囲内にある。 発現に必要な要素のすべてを含んでいる発現ベクターが市販されており、当業
者らには周知である。 たとえば、 Sambrookらの、Molecular Cloning : A Labo
ratory Manual、第２版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリープレス（C
old Spring Harbor Laboratory Press）、1989参照のこと。細胞は、ＭＡＧＥ−
Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドをコードしている異種ＤＮＡ（ＲＮＡ）を当
該細胞に導入することにより遺伝子操作される。その異種ＤＮＡ（ＲＮＡ）は、
宿主細胞における異種ＤＮＡの発現を可能にするための転写エレメントの作動可
能な支配下に置かれる。本明細書に述べたように、かかる発現構築物はまた、任
意にエンドソーム標的化シグナル、好ましくはヒトの不変鎖またはその標的化フ
ラグメントをコードしているヌクレオチド配列を含む。
【００５７】 哺乳類細胞におけるｍＲＮＡ発現についての好ましいシステムは、ｐＲｃ／Ｃ
ＭＶ（インビトロジェン（Invitrogen）、カールズバード、カリフォルニア州よ
り市販）などの、Ｇ４１８抵抗性を与える遺伝子（安定にトランスフェクトされ
た細胞系の選択を容易にする）などの選択可能なマーカーと、ヒトサイトメガロ
ウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー−プロモーター配列を含む。さらに、霊長類ま
たはイヌの細胞系における発現に適したものはｐＣＥＰ４ベクター（インビトロ
ジェン）であり、これは多コピー染色体外エレメントとしてのプラスミドの維持
を容易にするＥＢ−ウイルス（ＥＢＶ）の複製起点を含む。もう一つの発現ベク
ターはポリペプチド伸長因子１αのプロモーターを含んでいるｐＥＦ−ＢＯＳプ
ラスミドであって、それはインビトロの転写を効果的に刺激する。当該プラスミ
ドはMishizuma & Nagata（Nuc. Acids Res. 18 : 5322, 1990）によって記述さ
れ、トランスフェクション実験におけるその使用は、たとえばDemoulin（Mol. C
ell. Biol. 16 : 4710 - 4716, 1996）によって開示されている。さらにもう一
つの好ましい発現ベクターは、Stratford-Perricaudetにより記述されたアデノ
ウイルスであり、それはＥ１およびＥ３タンパク質が欠失している（J. Clin. I
nvest. 90 : 626 - 630, 1992）。Ａｄｅｎｏ．Ｐ１Ａ組換え体のようなアデノ
ウイルスの使用は、WarnierらによりＰ１Ａに対する免疫化のためのマウスへの
皮内注射において開示されている（Int. J. Cancer, 67 : 303 - 310, 1996）。 本発明はまた、技術者に所望の発現ベクターまたは複数のベクターの調製を可
能にするいわゆる発現キットも含む。かかる発現キットは、先に議論した物質の
少なくとも二つについての、少なくとも別々の部分を含む。所望の、他の成分が
加えられてもよい。
【００５８】 本明細書に記述された本発明には多くの用途があり、それらのいくつかは本明
細書に述べられている。以下の用途はＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプ
チドについて述べられたものであるが、他のＭＡＧＥファミリーＨＬＡクラスII
結合ペプチドの使用に対しても同様に適用することができる。第１に、本発明は
技術者が、ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドの発現によって特徴づ
けられる疾患を診断することができるようにする。これらの方法は、生物学的試
料におけるＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドか、またはＭＡＧＥ−
Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドとＨＬＡクラスII分子との複合体の発現を測
定することを含む。ペプチドか、またはペプチドとＨＬＡクラスII分子との複合
体の発現は、抗体などの、当該ペプチドまたは複合体に対する結合相手を用いた
検定により測定されることが可能である。
【００５９】 本発明はまた、技術者がＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドの発現
によって特徴づけられる疾患を有する対象を治療できるようにする。治療は、Ｍ
ＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドとＨＬＡクラスII分子との複合体を
対象の中で強化させる薬剤を投与すること、およびかかる複合体に特異的なＣＤ
４＋Ｔリンパ球を投与することを含む。上記の治療において有用な薬剤は、ＭＡ
ＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドと、それらの機能的変異体、かかるＭ
ＡＧＥ−Ａ３ペプチドを含むエンドソーム標的化融合タンパク質、かかるタンパ
ク質およびペプチドを発現する核酸（当該核酸を含んでいるウイルスを含めて）
、かかるペプチドとＨＬＡクラスII結合ペプチド（たとえばＨＬＡＤＲＢ１／１
３０２、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０４０１）との複合体，ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡク
ラスII結合ペプチドとＨＬＡクラスII結合分子との複合体を運んでいる抗原提示
細胞、その他を含む。本発明はまた、技術者があるＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラ
スII結合ペプチドに特異的なＣＤ４＋Ｔリンパ球のための一つのＴリンパ球集団
を選択的に豊富にすることができるようにする。
【００６０】 また、ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドの単離は、当該ＭＡＧＥ
−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドをコードしている核酸の単離を可能にする
。核酸は、インビトロか、または原核性または真核性の宿主細胞において、ＭＡ
ＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドを産生するべく用いられることが可能
である。熟練した開業医には周知の種々の方法が、単離されたＭＡＧＥ−Ａ３
ＨＬＡクラスII結合ペプチドを取得するべく利用されることが可能である。たと
えば、ある発現ベクターが当該ペプチドの産生を引起こすべく細胞内に導入され
てよい。もう一つの方法においては、ｍＲＮＡ転写物は、そのコードされたペプ
チドの産生を引起こすべく細胞内にマイクロインジェクションされるかまたは他
の方法で注入されてよい。網状赤血球溶解産物系などの無細胞抽出物におけるｍ
ＲＮＡの翻訳はもまたペプチドを産生するべく用いられてよい。また本発明のＭ
ＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドを含んでいるペプチドは、インビト
ロにおいて合成されてよい。当業者らはまた、単離されたＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬ
ＡクラスII結合ペプチドを取得するため、既知のペプチド単離法に容易に従うこ
とができる。これらは免疫クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマト
グラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および免疫親和性クロマトグラフ
ィーを含むが、これに制限されない。
【００６１】 これらの単離されたＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチド、かかるペ
プチドを含むタンパク質、または当該ペプチドと、ＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子
またはＨＬＡ−ＤＰＢ１分子といったＨＬＡクラスII分子との複合体は、当該Ｍ
ＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドの発現によって特徴づけられる疾患
の治療に有用なワクチンを製造するべく、アジュバントなどの物質と結合されて
よい。さらに、ワクチンは樹状細胞、B細胞、非増殖性のトランスフェクタント
などの、当該ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチド／ＨＬＡ複合体を表
面上に提示する細胞から調製することができる。細胞がワクチンとして用いられ
る場合にはすべて、それらの細胞はＣＤ４＋Ｔリンパ球を刺激するために必要な
成分の一つまたは双方をコードしている配列を用いてトランスフェクトされるこ
とが可能であるか、またはトランスフェクションの必要なくしてすでに双方の分
子を発現している細胞である。たとえば、自己由来の抗原提示細胞が対象から単
離され、ＨＬＡクラスIおよびＨＬＡクラスII分子との結合においてＭＡＧＥ−
Ａ３エピトープを提示する細胞を取得するべく処理することが可能である。これ
らの細菌は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞応答の双方を刺激し得る。かかる抗原
提示細胞は、Iｉ．ＭＡＧＥ−Ａ３融合タンパク質をコードしている組換えウイ
ルスを用いて樹状細胞を感染させることにより取得することができる。樹状細胞
はまたＨＬＡクラスIおよびＨＬＡクラスIIエピトープを用いてロードされるこ
とが可能である。
【００６２】 ワクチンはまたＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドまたはその先駆
体をコードしている裸のＤＮＡまたはＲＮＡ含んでおり、それらはインビトロに
おいて製造されてよく、注射、粒子衝撃、鼻からの吸入、および他の方法により
投与される。「裸の核酸」型のワクチンは、当該裸の核酸によってコードされる
ペプチドに特異的なＣＴＬの発生を誘導する免疫学的応答を引起こすことが証明
されている（Science 259 : 1745 - 1748, 1993）。またワクチンは、ウイルス
、リポソーム、または薬剤のデリバリーに有用なポリマー粒子を含む他の粒子に
パッケージされた核酸を含む。
【００６３】 本明細書に述べられた処理のいずれかによって発生または亢進された免疫応答
は、この技術において知られた種々の方法によって監視されることが可能である
。たとえば、所与の抗原に特異的なＴ細胞の存在は、抗原性ペプチドを提示する
可溶性の蛍光性ＭＨＣ分子４量体を用いたＴ細胞受容体の直接的な標識により検
出されることが可能である（Altmanら、Science 274 : 94 - 96, 1996；Dunbar
ら、Curr. Biol. 8 : 413 - 416, 1998）。要すれば、可溶性のＭＨＣクラスI分
子が、βミクログロブリンおよびクラスI分子と結合するペプチド抗原の存在下
に、インビトロにおいて折りたたまれる。精製後、ＭＨＣ／ペプチド複合体が精
製され、ビオチンを用いて標識される。４量体は、ビオチニル化されたペプチド
−ＭＨＣ複合体を、標識されたアビジン（たとえばフィコエリトリン）と共に４
：１のモル比において混合することにより形成される。次いで４量体を、末梢血
またはリンパ節などのＣＴＬの供給源と接触させる。当該４量体は、ペプチド抗
原／ＭＨＣクラスI複合体を認識するＣＴＬと結合する。当該４量体に結合され
た細胞は、反応性のＣＴＬを単離するべく、蛍光活性化セルソーティングにより
分類されることができる。単離されたＣＴＬは次いで本明細書に記述された用途
のためにインビトロにおいて拡大されることが可能である。４量体としてのＭＨ
ＣクラスII分子の用途は、最近Crawfordら（Immunity 8 ; 675 - 682, 1998）に
より証明された。可溶性のＭＨＣクラスII分子の多量体が、共有結合により結合
されたペプチドと複合体形成された。クラスII４量体は、適当な特異性と親和性
とを以って特異的なＴ細胞に結合することが示されている。したがって４量体は
、ワクチン接種に対するＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の双方を監視するべく使用
されることが可能である。
【００６４】 ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチド、ならびにＭＡＧＥ−Ａ３ Ｈ
ＬＡクラスII結合ペプチドとＨＬＡ分子との複合体もまた、この技術に周知の標
準的な技術を用いて抗体を産生するべく用いられてよい。抗体産生についての一
般原理を記述している参考となる標準的な研究は、Catty, D., Antibodies. A P
ractical approach, 第１巻、IRL 出版、ワシントン（1998）；Klein, J., Immu
nology: The Science of Cell-Non-Cell Discrimination, ジョン・ウィリー・
アンド・サンズ（John Wiley and Sons）、ニューヨーク（1982）；Kennett, R.
,ら、Monoclonal Antibodies, Hybridoma. A New Dimension In Biological Ana
lysis, プレナム（Plenum）出版、ニューヨーク（1980）；Campbell, A., Labor
atory Techniques and Biochenistry and Molecular Biology、第１３巻のMonoc
lonal Antibody Technology, （Burdon, R.ら編）、エルセヴィア（Elsevier）
アムステルダム（1984）；およびEisen, H. N., Microbiology,第３版、Davis,
B. D. ら編（ハーパー＆ロウ（Harper & Rowe）、フィファデルフィア（1980）
を含む。
【００６５】 本発明の抗体はしたがって、タンパク質、タンパク質のフラグメント、当該タ
ンパク質またはそのフラグメントを発現している細胞、および適当なＨＬＡクラ
スII分子、その他を、ポリクローナル抗体を誘導するべく動物に投与することを
含む。モノクローナル抗体の製造は、この技術において周知の技術に従う。本明
細書に詳述したように、かかる抗体はたとえば、タンパク質を発現している組織
を同定するため、またはタンパク質を精製するために用いられてよい。抗体もま
た、イメージングのための特異的な標識薬剤に対し、またはメトトレキセート、
放射性ヨウ素標識化合物、リシンなどの毒素、他の細胞増殖抑制性または細胞溶
解性薬剤などを含むがこれに制限されない抗腫瘍薬剤に対し、結合されてよい。
本発明により調製された抗体もまた、好ましくは本明細書に記したペプチド／Ｈ
ＬＡ複合体に特異的である。
【００６６】 本明細書において「疾患」または「症状」が用いられる場合、それはＭＡＧＥ
−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドが発現されているいかなる病的状態も指す
。かかる疾患は、メラノーマ、頭部、頚部、肺、または食道の扁平上皮癌、結腸
直腸癌、骨肉腫、神経芽腫、頭部または頚部の非偏平上皮癌、卵巣腫瘍、リンパ
球性白血病、膀胱癌、前立腺癌、その他などの癌を含む。
【００６７】 この開示に基づくいくつかの治療用アプローチは、ＭＡＧＥ ＨＬＡクラスII
結合ペプチド提示細胞に対しての、対象の免疫系による応答の誘導を前提として
いる。かかるアプローチの一つは、ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチ
ドとＨＬＡクラスII分子との複合体に特異的な自己由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を、論
争中の表現型をもつ異常細胞のある対象に投与することである。かかるＣＤ４＋ Ｔ細胞をインビトロにおいて発生させることは、技術者の技術の範囲内にある。
一般的に、対象から採取された血液細胞などの検体は、当該複合体を提示してお
り、かつＣＤ４＋Ｔリンパ球を増殖させるべく刺激することができる細胞と接触
せられる。ターゲット細胞は、ＣＯＳ細胞か、または樹状細胞またはB細胞など
のＨＬＡクラスII分子を運んでいる抗原提示細胞といった、トランスファクタン
トであることが可能である。このような標的細胞は、その表面上の所望の複合体
を提示しており、興味のＣＤ４＋Ｔリンパ球と結びつけられると、その増殖を刺
激する。ＣＯＳ細胞は、他の適当な宿主細胞と同様に、広く市販されている。Ｃ
Ｄ４＋Ｔリンパ球の特異的な産生については、下文に記述されている。次いで、
クローンにより拡大された自己由来のＣＤ４＋Ｔリンパ球が対象へ投与される。 ＣＤ４＋Ｔリンパ球は次いで当該対象の免疫応答を刺激し、それにより所望の
治療上のゴールが達成される。
【００６８】 ＣＴＬの増殖は、Ｔ細胞の培養物におけるトリプトファンの濃度を、インドー
ルアミン２,３-ジオキシゲナーゼ（IＤＯ）などの、トリプトファンを異化する
酵素を阻害することによるか、または当該培養物にトリプトファンを添加するこ
とにより増加させることにより、亢進されることが可能である（たとえば、ＰＣ
Ｔ出願ＷＯ９９／２９３１０を参照のこと）。Ｔ細胞の増殖は、増殖の速度を増
すことおよび／または培養物中のＴ細胞の分裂数を増すことによって亢進される
。
【００６９】 上記の治療は、対象の異常細胞の少なくともいくらかが、関連するＨＬＡ／ペ
プチド複合体を提示するものと仮定している。このことは、この技術が特定のＨ
ＬＡ分子を発現している細胞を同定する方法について、ならびに関係する配列、
この場合にはＭＡＧＥ−Ａ３配列、のＤＮＡを発現している細胞をいかにして同
定するかについて熟知しているため、非常に容易に測定できる。
【００７０】 上記の治療は、本発明に従って取得できる唯一の治療形態ではない。 またＣ
Ｄ４＋Ｔリンパ球も、多くのアプローチを用いてインビボにおいて刺激されるこ
とが可能である。一つのアプローチは、当該複合体を発現している非増殖性の細
胞の使用である。このアプローチに用いられる細胞は、樹状細胞などの当該複合
体を正常に発現しているものか、あるいは当該複合体の提示に必要な遺伝子の一
つまたは双方を用いてトランスフェクトされた細胞であってよい。Chenら（Proc
. Natl. Acad. Sci. USA 88: 110 - 114, 1991）は、このアプローチを例示し、
ＨＰＶ−Ｅ７ペプチドを発現しているトランスフェクタント細胞の治療用プログ
ラムにおける使用について示している。種々の細胞型が用いられてよい。同様に
、興味の遺伝子の一つまたは双方を運んでいるベクターが使用されてよい。ウイ
ルス性または細菌性のベクターが特に好ましい。たとえば、ＭＡＧＥ−Ａ３ Ｈ
ＬＡクラスII結合ペプチドをコードしている核酸は、ある組織または細胞型にお
いて当該ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドの発現を指示するプロモ
ーターおよびエンハンサー配列に、作動可能に連結されてよい。当該核酸は発現
ベクターに取込まれてよい。発現ベクターは、未修飾の染色体外核酸、プラスミ
ド、または、ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドをコードしているよ
うな外来性の核酸の挿入を可能にするべく構築または修飾されたウイルスゲノム
であってよい。ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドをコードしている
核酸はまた、レトロウイルスゲノムにも挿入されてよく、それにより当該核酸の
、標的組織または細胞型のゲノムへの組込みが容易となる。このような系におい
ては、注目の遺伝子は、たとえばワクシニアウイルス、ポックスウイルス全般、
アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レトロウイルス、または細菌ＢＣＧな
どの微生物によって運ばれ、この物質は宿主細胞に事実上「感染する」。結果と
して得られた細胞は興味の複合体を提示し、自己由来のＣＤ４＋Ｔリンパ球によ
り認識され、次にそれらは増殖する。
【００７１】 同様な効果は、ＭＡＧＥ ＨＬＡクラスII結合ペプチドを、ＨＬＡクラスII提
示細胞への取込みをインビボにおいて促進するためのアジュバントと結合させる
ことにより、成遂げられることが可能である。もしＨＬＡクラスII結合性の部分
より大きい場合には、ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドは必要であ
ればＨＬＡ分子に対するペプチドのパートナーを生じるべくプロセスされると共
に、ＴＲＡはさらなるプロセシングを必要とせずに提示されるようにすることが
できる。一般的に対象は、有効量のＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチ
ドの皮内注射を受けることができる。この技術において標準的な免疫化のプロト
コールに従って、初回量にブースター投与量が続くことが可能である。 ＨＬＡクラスII提示細胞へのＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドの
取込みを促進するための好ましい方法は、当該クラスII結合ペプチドを含むＭＡ
ＧＥ−Ａ３ポリペプチドに融合されたエンドソーム標的化シグナルを含むポリペ
プチドを、当該提示細胞に発現させることによる。特に好ましいのはヒト不変鎖
Iｉを含むＭＡＧＥ−Ａ３融合タンパク質である。
【００７２】 上記のいかなる組成物またはプロトコールもまた、細胞溶解性Ｔリンパ球の応
答の誘導のため、ＭＡＧＥ ＨＬＡクラスI結合ペプチドを含むことができる。
たとえば、以下において論証されるように、ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質は細胞内
においてプロセスされ、ＨＬＡクラスIおよびＨＬＡクラスIIの双方の応答を生
じることができる。かかるペプチドのいくつかは、米国特許第５,５８５,４６１
号および５,５９１,４３０号と、刊行されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０３
６５７，ならびにGauglerら（J. Exp. Med. 179 : 921 - 930, 1994）、van der
Bruggenら（Eur. J. Immunol. 24 : 3038 - 3043, 1994）、およびHermanら（I
mmunogenetics 43 : 377 - 383, 1996）によって述べられている。ＨＬＡクラス
IIおよびクラスII分子と結合しているＭＡＧＥ−Ａ３ペプチド（またはかかるペ
プチドをコードしている核酸）を投与することで、Ｔヘルパー細胞およびＴキラ
ー細胞の双方を誘導することにより、改善された免疫応答が提供されてよい。
【００７３】 さらに、非ＭＡＧＥ−Ａ３腫瘍関連ペプチドもまた、ＨＬＡクラスIおよび／
またはクラスIIによる免疫応答を亢進するべく投与されることが可能である。癌
細胞が一つ以上の腫瘍関連遺伝子を発現することができることはよく確立されて
いる。ある特定の対象が、付加的な腫瘍関連抗原を発現しているかどうか、した
がってかかる遺伝子の発現産物に由来するＨＬＡクラスIおよび／またはＨＬＡ
クラスII結合ペプチドを上記のＭＡＧＥ−Ａ３組成物およびワクチンの中に含む
かどうかを決定することは、当業者には日常の実験の範囲内にある。
【００７４】 特に好ましいのは、「ポリトープ」として知られる一連のエピトープをコード
している核酸である。エピトープは連続的に、あるいは重なりあう様式で、天然
のフランキング配列を伴って、または伴わずに配列されることが可能であり（た
とえば、Thomsonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 : 5854 - 5849, 1995；Gi
lbertら、Nature Biotechnol. 15 : 1280 - 1284, 1997参照）、所望であれば無
関係なリンカー配列により分離されることが可能である。ポリトープは生成され
た個々のエピトープにプロセスされ、それらは免疫系によって、免疫応答の発生
のために認識される。
【００７５】 したがって、たとえばＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドは、他の
腫瘍拒絶抗原からのペプチドと（たとえば、ハイブリッド核酸またはポリペプチ
ドの調製による）、またＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスI結合ペプチド（これら
のいくつかは以下にリストされている）と共に、「ポリトープ」を形成するべく
結合される。免疫応答を誘導または亢進するべく投与されることが可能な代表的
な腫瘍関連ペプチドは、腫瘍関連遺伝子に由来し、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−
Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、Ｍ
ＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ
−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ａ１３、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２
、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、
ＧＡＧＥ−８、ＢＡＧＥ−１、ＲＡＧＥ−１、ＬＢ３３／ＭＵＭ−１、ＰＲＡＭ
Ｅ、ＮＡＧ、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧ
Ｅ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、チロシナーゼ、脳グリコゲ
ンホスホリラーゼ、Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＮＹ−
ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）
、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１、およびＣＴ−７を含むタ
ンパク質をコードしていた。たとえば、腫瘍に特徴的な抗原性ペプチドは以下の
表１にリストされたものを含む。
【００７６】
【表１】
【表２】
【００７７】 他のＨＬＡクラスIおよびクラスII結合ペプチドの実例は、当業者に周知であろ
うし（たとえば、Coulie、Stem Cells 13 : 393 - 403, 1995参照）、また本明
細書に開示されたものと同様の方法で本発明に使用されることが可能である。当
業者は、一つまたはそれより多いＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドと、一つまたはそれよ
り多い上記の腫瘍拒絶抗原ペプチドを含んでいるポリペプチドか、またはかかる
ポリペプチドをコードしている核酸を、分子生物学の標準的な方法に従って調製
することができる。
【００７８】 このように、ポリトープは二つまたはそれより多い潜在的な免疫原性または、
免疫応答刺激性ペプチドのグループであり、それらは種々の配置でつなぎあわさ
れることが可能である（たとえば連鎖状、重複）。ポリトープ（または当該ポリ
トープをコードしている核酸）は、免疫応答の刺激、亢進、および／または誘発
における当該ポリトープの有効性を検査するべく、たとえば動物に対し、標準的
な免疫化のプロトコールによって投与されることが可能である。
【００７９】 ペプチドは直接か、またはフランキング配列の使用により、ポリトープを形成
するべく結合されることが可能であり、またポリトープのワクチンとしての使用
はこの技術において周知である（Thomsonら、Proc. Acad. Natl. Acad. Sci. US
A 92（13）: 5845 - 5849, 1995；Gilbertら、Nature Biotechnol. 15（12 ) :
1280 - 1284, 1997：Thomsonら、J. Immunol. 157 (2 ) : 822 - 826, 1996；Ta
mら、J. Exp. Med. 171（1）:299 - 306, 1990参照のこと ）。たとえば、Tamは
ＭＨＣクラスIおよびクラスII結合エピトープの双方から成るポリトープが、マ
ウスモデルにおいて抗体および防御免疫を成功裏に生じたことを示した。Tamは
また、エピトープの「紐(strings)」がプロセスされて個々のエピトープを生じ
、それらがＭＨＣ分子により提示され、さらにＣＴＬにより認識されることを証
明した。このように、様々な数および組合わせのエピトープを含むポリトープの
調製が可能であり、ＣＴＬによる認識について、また免疫応答の亢進における有
効性について検査されることが可能である。
【００８０】 腫瘍が、あるセットの腫瘍抗原を発現しており、そのうちのあるサブセットの
みがどのような所与の患者の腫瘍にも発現されてよいことは周知である。ポリト
ープは、特定の患者において発現された腫瘍拒絶抗原のサブセットを表している
、エピトープの異なる組み合わせに対応するべく調製されることができる。また
エピトープは、ある腫瘍型によって発現されることが知られている腫瘍拒絶抗原
のより広い範囲を反映するべく調製されることが可能である。ポリトープは、か
かる治療を必要としている患者に対し、ポリペプチド構造物として、あるいはこ
の技術において周知の核酸デリバリーシステムを用いることにより、導入される
ことが可能である（Allsoppら、Eur. J. Immunol. 26（8）: 1951 - 1959, 1996
参照）。アデノウイルス、ポックスウイルス、Ｔｙ−ウイルス様粒子、アデノ随
伴ウイルス、プラスミド、細菌、その他は、かかるデリバリーにおいて使用され
ることが可能である。ポリトープのデリバリーシステムは、当該デリバリーシス
テムの有効性を測定するべく、マウスモデルにおいて検査することができる。ま
たこのシステムは、ヒトの臨床試験においても検査されることが可能である。
【００８１】 免疫化のプロトコールの一部として、癌ワクチンの核酸またはペプチド成分と
共に、免疫応答を強化する物質が投与されてよい。かかる免疫応答強化化合物は
、アジュバントかまたはサイトカインのいずれかに分類されてよい。ジュバント
は、抗原の保有体を提供すること（細胞外に、またはマクロファージ内に）、マ
クロファージを活性化すること、および特定のリンパ球のセットを刺激すること
により、免疫学的応答を亢進させてよい。多くの種類のアジュバントがこの技術
において周知であり；具体的な実例は、ＭＰＬ（スミスクライン・ビーチャム（
SmithKline Beecham））、サルモネラ・ミネソタ（Salmonella minnesota）Ｒｅ
５９５リポ多糖の精製および酸加水分解後に取得された同種のもの、ＱＳ２１（
スミスクライン・ビーチャム）、シャボンノキ（Quillja saponiria）抽出物か
ら精製された純粋なＱＡ−２１、ＤＱＳ２１（スミスクライン・ビーチャム）、
ＰＣＴ出願ＷＯ９６／３３７３９に述べられている、ビタミンＥ、およびスクア
レンおよび／またはトコフェロールなどの生体分解性油剤から調製された種々の
油中水型乳剤を含む。サイトカインもまた、リンパ球刺激特性の結果としてワク
チン接種プロトコールにおいて有用である。かかる目的のために有用な多くのサ
イトカインは、当業者には、ワクチンの防護効果を亢進することが示されている
インターロイキン−１２（IＬ−１２）（Science268 : 1432 - 1434, 1995）、
ＧＭ−ＣＦＳ、およびIＬ−１８を含めて周知であろう。
【００８２】 ワクチン接種プロトコールにおいて用いられることが可能な多数のさらなる免
疫応答強化化合物がある。これらは、タンパク質または核酸のどちらかの形状で
提供される補助的刺激分子を含む。かかる補助的刺激分子はＢ７−１およびＢ７
−２（各々ＣＤ８０およびＣＤ８６）分子を含んでおり、それらは樹状細胞（Ｄ
Ｃ）上に発現され、またＴ細胞上に発現されたＣＤ２８分子と相互作用する。こ
の相互作用は、抗原／ＭＨＣ／ＴＣＲ刺激された（シグナル１）Ｔ細胞に対し、
補助刺激（シグナル２）を提供し、Ｔ細胞の増殖、およびエフェクター機能を亢
進する。Ｂ７もまたＴ細胞上のＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）と反応し、ＣＴＬＡ４
およびＢ７リガンドに関係している研究は、Ｂ７-ＣＴＬＡ４相互作用が抗腫瘍
免疫およびＣＴＬの増殖を亢進することができることを示している（Zhengら、P
roc Nat’l Acad. Sci. USA 95 : 6284 - 6289, 1998）。
【００８３】 Ｂ７は典型的には腫瘍細胞上に発現されず、したがってそれらはＴ細胞のため
の効率的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）ではない。B７発現の誘導は、腫瘍細胞がよ
り効果的にＣＴＬの増殖およびエフェクター機能を刺激することができるように
する。Ｂ７／IＬ−６／IＬ−１２補助刺激の組合せは、Ｔ細胞におけるIＦＮ−
γおよびＴｈ１サイトカインプロフィールを、Ｔ細胞活性のさらなる亢進に導く
ことが示されている（Gajewskiら、J. Immunol. 154 : 5637 - 5648, 1995）。 B７を用いた腫瘍細胞のトランスフェクションは、Wangら、（J. Immunother.
19 : 1 - 8, 1996）により、養子移入免疫療法のためのインビトロでのＣＴＬの
拡大に関連して議論されてきた。B７分子のための他のデリバリーメカニズムは
、核酸（裸のＤＮＡ）、免疫化（Kimら、Nature Biotechnol. 15 : 7 : 641 - 6
46, 1997）、およびアデノおよびポックスなどの組換えウイルス（Wendtnerら、
Gene Ther. 4: 726 - 735, 1997）を含むであろう。これらのシステムはすべて
、Ｂ７と、本明細書において議論された抗原または抗原フラグメント（ポリトー
プを含む）、あるいはサイトカインといった他の選択分子との同時発現のための
発現カセットの構築および使用に従う。このようなデリバリーシステムは、イン
ビトロにおける適当な分子の誘導のため、およびインビボにおけるワクチン接種
状況のために使用されることが可能である。インビトロおよびインビボにおいて
Ｔ細胞を直接刺激するべく抗ＣＤ２８抗体を用いることについても考慮すること
ができた。同様に、外来性抗原に対してＴ細胞の応答を誘導する誘導可能な補助
的刺激分子、IＣＯＳ分子が、たとえば抗IＣＯＳ抗体の使用により調節できた（
Hutloffら、Nature 397 : 263 - 266, 1999）。
【００８４】 リンパ球機能関連抗原−３（ＬＦＡ−３）はＡＰＣおよびいくつかの腫瘍細胞
上に発現され、Ｔ細胞上に発現されたＣＤ２と相互作用する。この相互作用はＴ
細胞にIＬ−２およびIＦＮ−γの産生を誘導し、したがってＢ７／ＣＤ２８補助
的刺激相互作用を補足することはできるが、代替えすることはできない（Parra
ら、J. Immunol., 158 : 637 - 642, 1997；Fentonら、J. Immunother. , 21 :
95 - 108, 1998）。 リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）は白血球上に発現され、ＡＰＣおよ
びいくつかの腫瘍細胞上に発現されたIＣＡＭ−１と相互作用する。この相互作
用はＴ細胞にIＬ−２およびIＦＮ−γの産生を誘導し、したがってＢ７／ＣＤ２
８補助的刺激相互作用を補足することはできるが、代替えすることはできない（
Fentonら、1998）。したがってＬＦＡ−１は、Ｂ７について前文に議論された種
々の方法における、ワクチン接種プロトコールにおいて提供されることが可能な
補助的刺激分子のさらなる実例である。
【００８５】 完全なＣＴＬの活性化およびエフェクター機能は、Ｔｈ細胞ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ
４０リガンド）分子と、ＤＣによって発現されるＣＤ４０分子との間の相互作用
を通したＴｈ細胞の助けを必要とする（Ridgeら、Nature 393 : 474, 1998；Ben
nettら、Nature 393 : 478, 1998；Schoenbergerら、Nature 393 : 480, 1998）
。この補助的刺激シグナルの機構は、Ｂ７と、ＤＣ（ＡＰＣ）によって産生され
る、関連するIＬ−６／IＬ−１２とのアップレギュレーションを含むだろう。従
って、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用は、シグナル１（抗原／ＭＨＣ−ＴＣＲ）
およびシグナル２（Ｂ７−ＣＤ２８）の相互作用を補足する。
【００８６】 ＤＣ細胞を直接刺激するべく抗ＣＤ−４０抗体を使用することは、正常には炎
症性の環境の外側で遭遇するか、または専門でないＡＰＣ（腫瘍細胞）によって
提示される腫瘍関連抗原に対する応答を亢進するものと期待される。たとえばＣ
Ｄ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用によるか、またはＤＣを、ＣｐＧを含んでいるオリ
ゴデオキシヌクレオチドかまたは細胞外マトリックスからの刺激性の糖成分と接
触させることによる、樹状細胞の成熟を誘導するための他の方法は、この技術に
おいて周知である。このような状況においては、Ｔｈの助けおよびＢ７補助的刺
激シグナルは提供されない。このメカニズムは、抗原パルスされたＤＣを主体と
する治療という状況において、あるいはＴｈエピトープが既知の腫瘍関連抗原先
駆体の中では定義されていない状況において有用であろう。
【００８７】 投与に際しては、本発明の治療用組成物は、薬学的に許容され得る製剤におい
て投与される。かかる製剤は、薬学的に許容され得る濃度の塩、緩衝薬、保存料
、適合性のキャリア、アジュバントおよびサイトカインなどの補足的な免疫強化
薬剤、および任意に他の治療用薬剤を慣例的に含んでよい。
【００８８】 本発明は有効な量において投与される。有効量は、ある薬学的製剤が、単独で
、あるいは付加的な用量と共に、所望の応答を刺激する量である。癌の治療の場
合には、所望の応答は癌の進行を阻止することである。このことは、この疾患の
進行を一時的に遅くすることを含んでよいが、さらに好ましくは当該疾患の進行
を永久に止めることを含む。免疫応答を誘導する場合には、所望の応答は、用い
られたＭＡＧＥ−Ａ３免疫原に特異的な抗体またはＴリンパ球の増加である。こ
のような所望の応答は、慣例的な方法により監視されるか、または本明細書に議
論した本発明の診断法に従って監視されることが可能である。
【００８９】 本発明の治療用組成物を用いて免疫応答を刺激することが所望される場合には
、血清中の抗体力価を増加させる結果となる液性抗体の応答、細胞傷害性リンパ
球のクローン拡大、または他の所望の免疫学的応答に対する刺激を含んでよい。
免疫原の用量は、投与の様式に応じて、１ナノグラム／キログラムから１００ミ
リグラム／キログラムまでの範囲が効果的であると信じられている。好ましい範
囲は、キログラムあたり５００ナノグラムと５００マイクログラムの間であると
信じられている。絶対量は、投与のために選択された物質、単回での投与かまた
は複数の用量か、および年齢、身体の状況、大きさ、体重、および病期を含む個
々の対象のパラメーターを含めた種々の因子に依存するであろう。これらの因子
は当業者には周知であり、慣例的な実験法を超えることなく扱われることが可能
である。
【００９０】 （例） 本発明者らは遺伝子ＭＡＧＥ−Ａ３によってコードされ、ＨＬＡクラスII分子
に関連してＴ細胞に対して提示された抗原性ペプチドを同定した。この戦略には
正常血液ドナーの樹状細胞に組換え体ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質を与えること、
およびこれらの抗原提示細胞をインビトロで特定のＣＤ４リンパ球の活性化およ
び増殖を誘導するために使用することが含まれる。プロトコールを以下（Ａ、Ｂ
、Ｃ）および図１に記述する。 Ａ．ヒト血液の処理 末梢血を標準のバフィーコート調製品としてローカル血液バンク(the local b
lood banl)（非癌対象、たとえばヘモクロマトーシス対象ではない）より得た。
末梢血単球（ＰＢＭＣ）をリンフォプレップ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、Ｎｙｃｏ
ｍｅｄ ｐｈａｒｍａ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）での遠心にて単離された。血
小板によるＰＢＭＣの混入を最小化するために、調製品をまず２０分間／１００
０ｒｐｍで室温にて遠心した。ほとんどの血小板を含んでいる上部２０−２５ｍ
ｌを取り除いた後、チューブを室温にて２０分間／１５００ｒｐｍにて遠心した
。ＰＢＭＣを２−アミノエチルイソチオウロニウム（Ｓｉｇｍａ）処理ヒツジ赤
血球にてロゼット形成することによってＴ細胞を枯渇させた。リンパ球枯渇ＰＢ
ＭＣを、Ｌ−アスパラギン（０．２４ｍＭ）、Ｌ−アルギニン（０．５５ｍＭ）
、Ｌ−グルタミン（１．５ｍＭ）および１％自己血清を含むＲＰＭI １６４０
培地（完全培地）中２×１０６細胞／ｍｌの濃度で培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ
）内で３７℃にて２時間接着させたままにした。接着しなかった細胞を捨て、接
着細胞を完全培地中IＬ−４（１００Ｕ／ｍｌ）およびＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎ
ｇ／ｍｌ）の存在下で培養した。培養に、培地５ｍｌを取り除き、IＬ−４（１
００Ｕ／ｍｌ）およびＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む新鮮な培地を加
えなおすことによって第２日および第４日に栄養を与えた。第５日に非接着細胞
集団を豊富な樹状細胞の供給源として使用した。 ロゼット形成したＴ細胞をＮＨ４Ｃｌ（１６０ｍＭ）で処理し、ヒツジ赤血球
を溶解し、洗浄した。ＣＤ４＋ Ｔリンパ球を、磁気マイクロビーズと共役した
抗ＣＤ８モノクローナル抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｇｅｒｍａ
ｎｙ）を使用して、製造業者によって推奨されたようにＭＡＣＳ磁石を通して分
類することによるネガティブ選別によりロゼット形成したＴ細胞より単離された
。
【００９１】 Ｂ．細胞株、サイトカイン ＥＢＶ−形質転換Ｂ（ＥＢＶ−Ｂ）細胞株を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）
（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、０．２４ｍＭ Ｌ−アスパラギン、０．５５ｍＭ Ｌ
−アルギニン、1１．５ｍＭ Ｌ−グルタミン（ＡＡＧ）、１００Ｕ／ｍｌ ペ
ニシリンおよび１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを含むイスコブ（Iｓｃ
ｏｖｅ）改変ダルベッコ培地（IＭＤＭ）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅ
ｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）中で培養した。ヒト組換え体IＬ−１２はバイオ
ゲン（Ｂｉｏｇｅｎ：Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって寄贈さ
れたか、またはチロン（Ｃｈｉｒｏｎ：Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）より購入
した。ヒト組換え体IＬ−４、IＬ−６およびIＬ−１２は我々の実験室で得た。
ヒト組換え体IＬ−７はゲンザム（Ｇｅｎｚｙｍｅ：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ
）より購入した。ヒト組換え体ＧＭ−ＣＳＦはサンドッツ（Ｓａｎｄｏｚ：Ｓａ
ｎｄｏｚ Ｐｈａｒｍａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により寄贈さ
れたか、またはシェリングプロウ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ：Ｂｒｉｎ
ｎｙ，Iｒｅｌａｎｄ）より購入した。ヒト組換え体ＴＮＦ−αはＲ＆Ｄシステ
ムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ：Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）より購入した。
【００９２】 Ｃ．タンパク質または細胞溶解物の供給および混合リンパ球−樹状細胞培養 組換え体Ｈｉｓ−ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質（ＨｉｓタグのついたＭＡＧＥ−
Ａ３）およびＬｉｐｏＤ−ＭＡＧＥ−Ａ３−Ｈｉｓタンパク質は大腸菌（Ｅ．ｃ
ｏｌｉ）中でスミスクラインコーポレーションファーマシューティカルカンパニ
ー（Ｓｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ
ｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）より生産さ
れ、標準のクロマトグラフィー手順によって精製した。ＬｉｐｏＤ−ＭＡＧＥ−
Ａ３−ＨｉｓはそのＮ−末端残基の位置にヘモフィラスインフルエンザ（Ｈａｅ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質の脂質形態の３分の１、
およびそのＣ−末端残基の位置にポリヒスチジンマーカーを含む。
【００９３】 自己樹状細胞（５×１０５）を、組換え体Ｈｉｓ−ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質
（２０μｇ／ｍｌ）の存在下、１％自己血清、IＬ−４（１００Ｕ／ｍｌ）、Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＴＮＦ−α（１ｎｇ／ｍｌ）を含むＲＰ
ＭI培地中で１８−２０時間３７℃、５％ ＣＯ２にてインキュベートした。Ｈ
ｉｓ−ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質をパルスした樹状細胞を洗浄し、IＬ−６（１
０００Ｕ／ｍｌ）およびIＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、１０％ヒト血
清、Ｌ−アスパラギン（０．２４ｍＭ）、Ｌ−アルギニン（０．５５ｍＭ）、Ｌ
−グルタミン（１．５ｍＭ）を含む２００μｌのイスコブ培地中の１０５ ＣＤ
４＋Ｔリンパ球へ丸底マイクロウェル毎に１０４加えた。ＣＤ４＋リンパ球を、
Ｈｉｓ−ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質で新たにパルスした自己樹状細胞で週毎に刺
激し、IＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ）およびIＬ−７（５ｎｇ／ｍｌ）を含む完全イス
コブ培地中で増殖させた。メラノーマ対象７００２に対する樹状細胞の短期補充
のために、１０４の代わりに６×１０３の樹状細胞を使用し、刺激を１０日目、
２０日目および３０日目に行った。
【００９４】 樹状細胞をＭＡＧＥ−Ａ３を発現している２９３−ＥＢＮＡ細胞の溶解物の提
示のために使用した。発現ベクターｐＣＥＰ−４内にクローン化したＭＡＧＥ−
Ａ３配列をリポフェクトアミン（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭIＮＥ（登録商標）：ＧI
ＢＣＯ／ＢＲＬ）によって２９３−ＥＢＮＡ細胞株内に一過性にトランスフェク
トした。簡単に記すと、平底マイクロウェルあたり５×１０４の２９３−ＥＢＮ
Ａ細胞にＯｐｔｉＭＥＭ培地（ＧIＢＣＯ／ＢＲＬ）中、６、１８、５３または
１６０ｎｇのプラスミドｐＣＥＰ４−ＭＡＧＥ−Ａ３および１μｌのＬｉｐｏｆ
ｅｃｔＡＭIＮＥ（登録商標）をトランスフェクトした。２４時間後、トランス
フェクトした２９３−ＥＢＮＡ細胞を３サイクルの急速凍結−融解によって５０
μｌの完全ＲＰＭI培地中で溶解した。次いでＨＬＡ−ＤＲ１３分子を発現して
いる単球由来樹状細胞を、トランスフェクトした２９３−ＥＢＮＡ細胞の溶解物
上に加え（１．５×１０４細胞／ウェル）、２４時間３７℃にて保持した。次い
で樹状細胞をＣＤ４−クローンを加える前に洗浄した。上清を２０時間後回収し
、IＦＮ−γ分泌について査定した。
【００９５】 例１：ＣＤ４ Ｔ細胞株およびＭＡＧＥ−Ａ３に特異的なクローンの入手 増殖しているＣＤ４＋ Ｔ細胞を含むマイクロ培養液を培養の開始後約３５日
間、Ｈｉｓ−ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質でパルスした自己ＥＢＶ−Ｂ細胞で刺激
したときにＴＮＦおよび／またはIＦＮ−γを産生するその能力に関して査定し
た。自己ＥＢＶ−Ｂ細胞（５００，０００／ｍｌ）を２０μｇ／ｍｌのＨｉｓ−
ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質、またはネガティブ対照としてオバルブミン（Ｏｖａ
ｌｂｕｍｉｎｅ：Ｓｉｇｍａ）の存在下、３７℃にて１８−２０時間インキュベ
ートした。本明細書でい及したＥＢＶ−Ｂ細胞はエプスタイン‐バーウイルス（
Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒウイルス）で不死化させたＢ細胞である。ＥＶＢ−Ｂ
細胞は本技術分野で標準の手順に従って調製した。タンパク質パルスしたＥＢＶ
−Ｂ細胞を洗浄し、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、１０
％ヒト血清およびIＬ−１２（２５Ｕ／ｍｌ）を含む１５０μｌの完全イスコブ
培地中、２，５００ ＣＤ４＋ Ｔリンパ球へ丸底マイクロウェルあたり５，０
００加えた。１８−２０時間後、上清を回収し、すでに記述されたような（Ｈａ
ｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Iｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １１９：２０
３−２１０，１９８９；Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Iｍｍｕｎｏｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ，３５：１４５−１５２，１９９２）ＭＴＴ比色定量アッセイに
て、すでに記述されたように（Ｅｓｐｅｖｉｋ ａｎｄ Ｎｉｓｓｅｎ−Ｍｅｙ
ｅｒ，Ｊ．Iｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ９５：９９−１０５，１９８６）
ＴＮＦ−感受性ＷＥＨI １６４クローン１３細胞における上清の細胞傷害性効
果を試験することでＴＮＦ含量について査定した。IＦＮ−γ産生を、メドジェ
ニックスダイアゴノスティックス−バイオソース（Ｍｅｄｇｅｎｉｘ Ｄｉａｇ
ｎｏｓｔｉｃｓ−Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ：Ｆｌｅｕｒｕｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）から
の試薬により我々の実験室で開発した（以下を参照のこと）ＥＬIＳＡアッセイ
を使用して測定した。ｍＡｂｓ Ｗ６／３２（抗ＨＬＡクラスI）または２Ｂ６
（抗ＨＬＡ−ＤＲ）による阻害を実験中腹水の１／２０希釈の添加によって行っ
た。ＭＡＧＥ−Ａ３によってパルスした自己ＥＢＶ−Ｂ細胞への応答におけるサ
イトカイン分泌は、オバルブミンでパルスしたＥＢＶ−Ｂ細胞へのＴ細胞のバッ
クグラウンド応答より少なくとも２倍である場合、およびｍｌあたり５００ｐｇ
のIＦＮ−γまたは５０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦを超える場合、有意であると見なし
た。
【００９６】 特異的にＴＮＦを産生しているＣＤ４＋ Ｔ細胞株（図２）、すなわちＭＡＧ
Ｅ−Ａ３タンパク質を認識するものを、刺激細胞として外因性Ｈｉｓ−ＭＡＧＥ
−Ａ３タンパク質またはＬｉｐｏＤ−ＭＡＧＥ−Ａ３−Ｈｉｓタンパク質でパル
スした自己ＥＢＶ−Ｂ細胞株および供給細胞として同種ＥＢＶ−Ｂ細胞（ＬＧ２
−ＥＢＶ）を使用して、限界希釈にてクローン化した。ＣＤ４＋ Ｔ細胞クロー
ンをIＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）、IＬ−７（５ｎｇ／ｍｌ）および０．５μｇ／ｍ
ｌ精製ＰＨＡ（ムレックスダイアゴノスティックス（Ｍｕｒｅｘ Ｄｉａｇｎｏ
ｓｔｉｃｓ，Ｄａｒｔｆｏｒｄ，ＧＢ）を含む完全イスコブ培地内で増殖させた
。このクローンを一週間に一回新鮮な培養培地で補充し、１−２週間の間隔で供
給細胞（２４ウェルプレートあたり１．５×１０６同種ＰＢＬ＋５×１０５ Ｌ
Ｇ２−ＥＢＶ形質転換細胞）を接種させた。いくつかの例において、クローンを
２４ウェルプレートあたり２×１０５刺激細胞＋１０６ ＬＧ２ ＥＢＶ−Ｂ形
質転換細胞を使用し、Iｉ．ＭＡＧＥ−Ａ３で再形質導入した自己ＥＢＶ−Ｂ細
胞株を使用し再刺激した。
【００９７】 次いで確立したＣＤ４＋ Ｔ細胞クローンを、上述したように外因性Ｈｉｓ−
ＭＡＧＥ−Ａ３またはＬｉｐｏＤ−ＭＡＧＥ−Ａ３−Ｈｉｓタンパク質でパルス
した自己ＥＢＶ−Ｂ細胞での刺激におけるＴＮＦおよび／またはIＮＦ−γ分泌
について試験した。簡単に記すと、アッセイは細胞上清とのインキュベーション
の前にIＮＦ−γ抗体をプラスチックマイクロタイタープレートのウェル上にコ
ートし、産生されたIＦＮ−γの量を決定する標準ＥＬIＳＡであった。IＦＮ−
γ ＥＬIＳＡアッセイは産生されたIＦＮ−γの測定に使用できた。いくつかの
ＭＡＧＥ−３特異的クローンをＢ６株から得た（図３）。
【００９８】 ＭＡＧＥ−Ａ３エピトープはＨＬＡ−ＤＲ分子（図３）によってＣＤ４クロー
ンに提示される。ＭＡＧＥ−Ａ３−パルスＥＢＶ−Ｂ細胞を、１／２０希釈にて
使用した保存剤を含まないモノクローナル抗体の連続的な存在下で、ＭＡＧＥ−
Ａ３特異的ＣＤ４＋クローンとともに８％ＣＯ２下３７℃にて２４時間共培養し
た。モノクローナル抗体２Ｂ６（抗ＨＬＡ−ＤＲ）は認識をなくし、一方認識は
モノクローナル抗体Ｗ６／３２（抗ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ）の存在下で変化しない
。 例２：ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡ−ＤＲ制限ペプチドの同定 これらのＣＤ４＋クローンによって認識されるＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドを同定
するために、ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質配列の部分に相当する１６アミノ酸ペプ
チドを合成し、自己ＥＢＶ−Ｂ細胞上に加え、認識について試験した（図４およ
び５）。ペプチドを一過性のＮＨ２−末端保護のためにＦ−ｍｏｃを使用して合
成し、質量分光計を使用して特性化した。すべてのペプチドは、解析的ＨＰＬＣ
によって示したように＞８０％純粋であった。凍結乾燥した合成ペプチドをＤＭ
ＳＯ（メルク、Ｍｅｒｃｋ）中に溶解し、最終濃度５００μＭ、５０μＭまたは
５μｇ／ｍｌで使用した。ＥＢＶ−Ｂ細胞（丸底マイクロウェルあたり５，００
０）を異なるペプチド、インキュベーション工程の間ペプチドの濃度を表してい
る示した濃度の存在下で、８％ ＣＯ２、３７℃にて２時間インキュベートした
。ついでＣＤ４＋クローンをウェルあたり２，５００細胞加えた。アッセイ培地
はＬ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、１０％ ヒト血清およ
びIＬ−１２（２５Ｕ／ｍｌ）を含むイスコブ培地であった。１８−２０時間後
、上清を回収し、ＴＮＦ−αおよび／またはIＦＮ−γ分泌について査定した。I
ＦＮ−γ産生をＭｅｄｇｅｎｉｘ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ−Ｂｉｏｓｏｕｒｃ
ｅ（Ｆｌｅｕｒｕｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）からの試薬を用いて実験室で展開したＥ
ＬIＳＡ試験（２０−４０００ｐｇ／ｍｌ）を使用して測定した。
【００９９】 １つの実験の組において、ペプチドを５００μＭの非生理学的濃度にて調べた
。ペプチドの非生理学的濃度はＴ細胞クローンの非特異的活性を引き起こす可能
性がある。実際に、５００μＭで使用したときに、ペプチドＭＡＧＥ−Ａ３１５ ９−１７４ （図４−ペプチド３５５；配列番号：６）はクローン４３６／Ｂ６．
３４（Ｂ６／３４）および４３６／Ｂ６．３７（Ｂ６／３７）の活性化を誘導す
るが、このペプチドは５０μＭで使用したときにはこれらのクローンの活性化に
効果的ではなかった（図５）。一方ペプチドＲＫＶＡＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲＡ
（ＭＡＧＥ−Ａ３１１１−１２６−図４−ペプチド３２３；配列番号：３）およ
びＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲＡＲＥＰＶ（ＭＡＧＥ−Ａ３１１５−１３０−−図４
−ペプチド３２４；配列番号：４）はより生理学的な濃度、または好ましくはよ
り低い濃度で使用したときにクローンＢ６／３４およびＢ６／３７によるＴＮＦ
−αおよびIＦＮ−γ産生を特異的に刺激した。これらの２つのペプチドはまた
Ｂ６クローンの増殖を誘導できた（図６）。
【０１００】 図３−６で示したように、クローンＦ３／４０およびＦ３／３７はＭＡＧＥ−
Ａ３ペプチドを認識せず、ＭＡＧＥ−Ａ３を提示している細胞を認識した。した
がって、これらの２つのクローンはＭＡＧＥ−Ａ３よりも細胞成分を認識してい
ると信じられている。 例３：ＭＡＧＥ−Ａ３特異的ＣＤ４＋クローンＢ６／３７によって使用されるＨ
ＬＡ制限部位の決定 Ｈｉｓ−ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質でパルスした自己ＥＢＶ−Ｂ細胞に対する
応答でのこれらのＣＤ４＋クローンによるサイトカイン分泌はＨＬＡ−ＤＲに制
限される。クローンＢ６／３７によって使用されたＨＬＡ−制限部位をさらに定
義するために、さらなるＥＢＶ−Ｂ細胞株を上述したようにペプチド提示のため
に使用した（図７）。ＡＵＭＡ−ＥＢＶ（ＬＢ１６２２−ＥＢＶ）のＨＬＡ血清
型、ＬＢ １５５５−ＥＢＶ、ＧＥＲＬ−ＥＢＶ（ＭＺ２−ＥＢＶ）は、すべて
の３つの細胞型によって共有されるクラスII分子がＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０２
に限定されたことを明らかにした。さらにＡＤＥＴ−ＥＢＶ（ＬＢ１１１８−Ｅ
ＢＶ）はＭＡＧＥ−Ａ３１１５−１３０ペプチドを効果的に発現していることが
明らかになり、これらの細胞のＨＬＡ血清型がＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０１であ
ることが明らかになった。上述したようないくつかの他のＥＢＶ−Ｂ細胞株の、
ペプチドＭＡＧＥ−Ａ３１１１−１２６およびＭＡＧＥ−Ａ３１１５−１３０で
パルスしたときのクローンＢ６／３７を刺激するその能力に対するスクリーニン
グを行い、ＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０１およびＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０２両方
がこれらのペプチドを提示できることを確認した（表II）。
【０１０１】
【表３】
【０１０２】 上述したような他のＥＢＶ−Ｂ細胞株の、ペプチドＭＡＧＥ−Ａ３１１１−１ ２６ および／またはＭＡＧＥ−３１１５−１３０でパルスしたときにクローンＢ
６／３４および／またはＢ６／３７を刺激する能力に対するスクリーニングを行
い、他のＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３提示分子を定義した。
【０１０３】 例４：Ｂ６／３７クローンを刺激することができる最小ペプチドの決定 ＨＬＡ−クラスI−制限ペプチドと違い、クラスII−制限ペプチドは長さにお
いて相当変化し、アミノ末端およびカルボキシ末端両方において伸張を許容する
ことができる。ペプチドＭＡＧＥ−Ａ３１１１−１２６およびＭＡＧＥ−Ａ３１ １５−１３０ 両方がクローンＢ６／３４およびＢ６／３７を特異的に刺激する一
方、ペプチドＭＡＧＥ−Ａ３１０７−１２２およびＭＡＧＥ−Ａ３１１９−１３ ４ はこれらのクローンを活性化できないことが明らかにされた。したがって、Ｍ
ＡＧＥ−Ａ３１１５−１２６ペプチド（ＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲＡ；配列番号９
）がＢ６／３４およびＢ６／３７クローンの活性化に必要な最小１２アミノ酸モ
チーフでありうる。予想したように、ペプチドＭＡＧＥ−Ａ３１１５−１２６は
クローンＢ６／３７によるIＦＮ−γの有意な産生を誘導した（図８）。１つの
残基またはそれ以上の欠失を持つ短くしたペプチドをまた調製した。短くしたペ
プチドのいくつか、たとえばＭＡＧＥ−Ａ３１１１６−１２６（配列番号：１０
）およびＭＡＧＥ−Ａ３１１７−１２６（配列番号：１１）はまた、IＦＮ−γ
の量を減少させたが、クローンＢ６／３７（図８）によるIＦＮ−γ産生を誘導
した。ＭＡＧＥ−Ａ３１１８−１２６（配列番号：１２）はIＦＮ−γの有意な
量の産生を誘導しなかった。
【０１０４】 例５：樹状細胞による外因性ＭＡＧＥ−Ａ３の提示 クローン３７をＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質を多量に加えた自己樹状細胞で得た
。２，３のＭＡＧＥ−Ａ３＋細胞によって放出された多数のＭＡＧＥ−Ａ３タン
パク質を捕獲する樹状細胞の、ＣＤ４＋ Ｔ細胞を刺激する能力を決定するため
に、ＨＬＡ−ＤＲ１３樹状細胞を（図９Ａ）で図示したようにＭＡＧＥ−Ａ３の
希釈系列濃度と共に２４時間インキュベートした。クローン３７の刺激を、細胞
を洗浄すること、丸底マイクロウェル中に細胞を分配すること、および２５００
のクローン３７細胞を加えることによって試験した。IＦＮ−γ分泌を２０時間
の共培養後、ＥＬIＳＡによって測定した。実験を三重に行った。IＦＮ−γの半
最大産生が、１００μｌの容量中の１０４樹状細胞を３０ｎｇのＭＡＧＥ−Ａ３
といっしょにプリインキュベートしたときに得られ、多量のＭＡＧＥ−Ａ３がお
よそ２×１０４ ＭＺ２−ＭＥＬ．４３腫瘍細胞で存在する。この結果は、ＭＡ
ＧＥ−Ａ３を発現しているとても少数の腫瘍細胞のエンドサイトーシス残骸がク
ローン３７を刺激することができることを示唆する。
【０１０５】 もう一つのアッセイをＭＡＧＥ−Ａ３＋細胞の残骸を処理する樹状細胞の能力
を試験するために行った。ＭＡＧＥ−Ａ３を一過性に２９３−ＥＢＮＡ細胞内に
トランスフェクトし、後に融解した。ＨＬＡ−ＤＲ１３樹状細胞をまず２４時間
溶解物と共にインキュベートし、次いでクローン３７を刺激するのに使用した。
３つの個別の実験において、クローン３７を、IＦＮ−γ放出による判定として
、ｐＣＥＰ４−ＭＡＧＥ−Ａ３でトランスフェクトした２９３−ＥＢＮＡ細胞の
融解物でインキュベートした樹状細胞によって刺激した（図９Ｂ）。２９３−Ｅ
ＢＮＡ細胞（ウェルあたり５×１０５細胞）をｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭIＮ（登録
商標）と混合した異なる用量のｐＣＥＰ４−ＭＡＧＥ−Ａ３でトランスフェクト
し、トランスフェクトした２４時間後に溶解した。ＨＬＡ−ＤＲ１３樹状細胞を
２９３−ＥＢＮＡ溶解物と共に２４時間培養した（樹状細胞あたり５細胞と等し
い）。次いで樹状細胞を洗浄し、丸底マイクロウェル中に分配し、２５００細胞
のクローン３７を加えた。IＦＮ−γ分泌を共培養の２０時間後にＥＬIＳＡによ
って測定した。実験を３重で行った。
【０１０６】 例６：ＭＡＧＥ−Ａ３融合タンパク質の調製および使用 ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質を、短くした不変鎖（Iｉ）を持つか、リソソーム
関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ−１）を持つ融合タンパク質としてＥＢＶ Ｂ細胞
株ＭＺ２ ＥＢＶ（ＨＬＡ Ａ１ＤＲ１３）内に発現させ、ＨＬＡクラスII分子
内でのＭＡＧＥ−Ａ３誘導ペプチドの提示を標的にした（図１４の略図を参照の
こと）。Iｉ ＭＡＧＥ−Ａ３の形質導入は ＭＡＧＥ−Ａ３．ＤＲ１３エピト
ープと反応するＣＤ４ Ｔ細胞クローンＬＢ１５５５ ＣＤ４ ４３６／Ｂ６．
３７による認識によって測定したようにＨＬＡクラスIIでのペプチド提示を産生
する。さらに、ＥＢＶ Ｂ細胞でのIｉ ＭＡＧＥ−Ａ３の発現は結果としてＨ
ＬＡクラスIでのペプチド提示となり、ＭＡＧＥ−Ａ３．Ａ１特異的ＣＴＬのク
ローンＬＢ７０５ ４３４／１の活性化によって測定した。反対にＭＡＧＥ−Ａ
３−ＬＡＭＰ−１融合タンパク質の発現は、ＨＬＡ分子でのＭＡＧＥ−Ａ３ペプ
チドの発現をただわずかに増加した。したがってIｉとＭＡＧＥ−Ａ３の連結は
ＨＬＡクラスIおよびクラスIIでのＭＡＧＥ−Ａ３由来ペプチドの発見を誘導す
るためのワクチンとして使用できる。
【０１０７】プラスミドおよび融合構築物のクローニング ＭＡＧＥ−Ａ３：ＭＡＧＥ−Ａ３ ｃＤＮＡおよびポリペプチドはそれぞれ配
列番号１および配列番号２として列記する。 ヒト不変鎖：ｃＤＮＡをコードしているヒト不変鎖を含むIｉｐＳＶ５１Ｌと
名付けたプラスミドはＪ．ピータース（Ｊ．Ｐｉｅｔｅｒｓ）博士（Ｂａｓｅｌ
Iｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Iｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚ
ｅｒｌａｎｄ；Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １０６：８３１−８４６，１９
９３）より親切にも提供された。 ＬＡＭＰ１：プラスミドｐＣＭＶ−ｓｉｇＥ７−ＬＡＭＰ１はＴ．ウー（Ｔ．
Ｗｕ）博士（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂａｌｔｉ
ｍｏｒｅ，ＭＤ，ＵＳＡ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９
２：１１６７１−１１６７５，１９９５）によって親切にも提供された。 ｐＭＦＧ：プラスミドｐＭＦＧはＯ．ダノス（Ｏ．Ｄａｎｏｓ）博士（Ｓｏｍ
ａｔｉｘ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ，
ＵＳＡ）より親切にも提供された。
【０１０８】ｐＭＦＧ−ＭＡＧＥ−Ａ３の構築 ＭＡＧＥ−Ａ３ ｃＤＮＡを、コードしている配列の５’および３’末端での
好ましい制限酵素認識部位の導入の後にｐＭＦＧへ挿入した。ＮｃｏI部位を５
’末端に、ＢｇｌII部位を３’末端に、プライマー：ＮｃｏI−センス：
【外３】 （配列番号：１４）およびＢｇｌII−アンチセンス：
【外４】 （配列番号：１５）［ＮｃｏIおよびＢｇｌIIに対する認識部位はイタリック体
である］を用いたＰＣＲによって導入した。ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１内にクロ
ーン化し、標準の方法に従って配列決定した。ＮｃｏI−ＢｇｌII増幅産物を酵
素ＮｃｏIおよびＢａｍＨIによって開裂したｐＭＦＧ内にクローン化した。
【０１０９】ｐＭＦＧ−Iｉ．ＭＡＧＥ−Ａ３の構築 ヒト不変鎖ポリペプチド（ｈｕ−Iｉ；残基１−８０）のアミノ末端（すなわ
ち細胞質末端および膜貫通領域）をコードしているｃＤＮＡ、を鋳型としてIｉ
ｐＳＶ５１Ｌを使用したＰＣＲによって増幅した。以下のプライマーを使用した
。ｈｕ−Iｉセンス：
【外５】 （配列番号：１６）およびｈｕ−Iｉアンチセンス：
【外６】 （配列番号：１７）［ＮｃｏIおよびＢａｍＨIに対する認識部位はイタリック体
である］。ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１内にクローン化し、標準の方法に従って配
列決定した。ＮｃｏI−ＢａｍＨI増幅産物を、結果としてｐＭＦＧ−Iｉとなる
よう酵素ＮｃｏIおよびＢａｍＨIで開裂したｐＭＦＧ内にクローン化した。
【０１１０】 短くしたIｉ−ｃＤＮＡの３’末端におけるＢａｍＨI部位とインフレームに、
ＡＴＧコドンと置き換えた、ＢｇｌII認識部位を、プライマー：ＢｇｌII−セン
ス：
【外７】 （配列番号：１８）およびＢｇｌII−アンチセンス（配列番号：１５）［Ｂｇｌ
IIに対する認識部位はイタリック体である］を用いたＰＣＲによってＭＡＧＥ−
Ａ３ ｃＤＮＡの５’末端に導入した。ＰＣＲ産物（ＢｇｌII．ＭＡＧＥ−Ａ３
．ＢｇｌII）をｐＣＲ２．１内にクローン化し、標準の方法に従って配列決定し
た。 組換え体プラスミドｐＭＦＧ−IｉをＢａｍＨIで再開裂し、ＢｇｌII．ＭＡＧ
Ｅ−３．ＢｇｌII増幅産物を互換性末端とでライゲーションした。インフレーム
で、そして正しい方向でＭＡＧＥ−Ａ３ ｃＤＮＡを含む組換え体プラスミドを
制限断片解析によって同定した。
【０１１１】ｐＭＦＧ−Ｓｉｇ．MAＧＥ−Ａ３．ＬＡＭＰ−１の構築 ＬＡＭＰ−１タンパク質のシグナルペプチドおよびＬＡＭＰ−１の膜貫通領域
および細胞質内末端をコードしているｃＤＮＡｓを、鋳型としてｐＣＭＶ−ｓｉ
ｇＥ７−ＬＡＭＰ１を使用したＰＣＲによって増幅した。ＬＡＭＰ−１のシグナ
ルペプチドに対するプライマーの組は以下である。Ｓｉｇセンス：
【外８】 （配列番号：１９）およびＳｉｇアンチセンス：
【外９】 （配列番号：２０）［ＮｃｏIおよびＢａｍＨに対する認識部位はイタリック体
である］。このｃＤＮＡの３’末端でのＢａｍＨI部位は、ＢｇｌII．ＭＡＧＥ
−Ａ３．ＢｇｌII 断片の５’末端のＢｇｌII部位とインフレームである。この
増幅産物をｐＭＦＧ内にクローン化し、ｐＭＦＧ−Ｓｉｇを調製した。
【０１１２】 ＬＡＭＰ１膜貫通ドメインおよび細胞質内末端に対するプライマーの組は以下
である。ＬＡＭＰ−１センス：
【外１０】 （配列番号：２１）およびＬＡＭＰ−１アンチセンス：
【外１１】 （配列番号：２２）［ＢａｍＨIおよびＢｇｌIIに対する認識部位はイタリック
体である］。この増幅産物を標準の方法に従って配列決定し、ｐＭＦＧ−Ｓｉｇ
内にクローン化し、結果としてシグナルペプチドと膜貫通配列の境目に特徴的な
ＢａｍＨI部位をもつプラスミドｐＭＦＧ−Ｓｉｇ．ＬＡＭＰ−１を得た。プラ
スミドｐＭＦＧ−Ｓｉｇ．ＭＡＧＥ−Ａ３．ＬＡＭＰ−１を合成するために、Ｂ
ｇｌII．ＭＡＧＥ−Ａ３．ＢｇｌII断片より単離されたＢｇｌII−ＢａｍＨI断
片をｃＤＮＡをＢａｍＨIで開裂したｐＭＦＧ−Ｓｉｇ。ＬＡＭＰ−１内にクロ
ーン化した。このクローニング工程により、アミノ酸２４０−３１４をコードし
ているＭＡＧＥ−Ａ３の３’末端を削除した。
【０１１３】細胞株、培地および試薬 ＰｈｏｅｎｉｘＡＭＰＨＯ細胞株（ノラン（Ｎｏｌａｎ）博士、Ｓｔａｎｆｏ
ｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＣＡ，
ＵＳＡより親切にも提供された）はＲＳＶプロモーターおよびｐＰＧＫハイグロ
選択可能マーカーをもつＭｏｌｏｎｅｙ ＧａｇＰｏｌ−IＲＥＳ−Ｌｙｔ２構
造での２９３Ｔ細胞の安定トランスフェクションによって生成された高タイター
両栄養性レトロウイルス産生細胞株である。ここでこれらの細胞を、ＣＭＶプロ
モーターによって駆動するモロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）両栄養性エンベロープ遺
伝子で安定にトランスフェクトし、ジフテリア毒素抵抗性遺伝子（ｐＨＥＤ−７
）で共選択した。このプロデューサー細胞株はヘルパーウイルスを必要としない
。 ＰｈｏｅｎｉｘＡＭＰＨＯ細胞を培養し、１０％熱不活性化ＦＣＳ、２ｍＭ
Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌ ストレプ
トマイシンを含むＤＭＥＭ（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ，Ｇｈｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）中、１７５ｃｍ２フラスコ内に継代
した。
【０１１４】 ＭＺ２−ＥＢＶ Ｂ細胞株をＥＢＶを感染させることでメラノーマ対象ＭＺ２
（ＨＬＡ Ａ１ Ａ２９ ＤＲ０１０１ ＤＲ１３０２）のＢ細胞より作製した
。同様にＬＧ２−ＥＢＶ Ｂ細胞株を非癌対象ＬＧ２（ＨＬＡ Ａ２４ Ａ３２
ＤＲ７ ＤＲ１４）から作製した。ＭＺ２−ＭＥＬ．４３は対象ＭＺ２からの
メラノーマ細胞株である。ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株およびＭＺ２−ＭＥＬ．４３
を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、０．２４ｍＭ Ｌ−アスパラギン、０．５５
ｍＭ Ｌ−アルギニンおよび１．５ｍＭ グルタミン（ＡＡＧ）を含むイスコブ
改変ダルベッコ（IＤ）培地中で培養した。
【０１１５】 細胞傷害性Ｔ細胞クローンＬＢ ７０５ ＣＴＬ ４３４／１はＭＡＧＥ−Ａ
３．Ａ１エピトープを相手とし、非癌対象ＬＢ７０５（ＨＬＡ Ａ１ Ａ２）か
らのＣＤ８＋ Ｔ細胞の初代培養で作製し、ＭＡＧＥ−Ａ３．Ａ１ペプチドでパ
ルスした自己ＰＢＬ（末梢血リンパ球）を照射した。ＣＤ４ Ｔ細胞クローンＬ
Ｂ １５５５ ＣＤ４ ４３６／Ｂ６．３７はＭＡＧＥ−Ａ３．ＤＲ１３エピト
ープを認識し、対象ＬＢ １５５５ ＤＥＳＡ（ＨＬＡ ＤＲ３ ＤＲ１３０２
）のＴ細胞の初代培養および精製ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質と共にプレインキュ
ベートした自己単球由来樹状細胞によって同定した。このＴ細胞クローンを、曝
露供給細胞（ＬＧ２−ＥＢＶ、貯留ヒトＰＢＬ）および特異的刺激細胞（ＣＴＬ
４３４／１に対するＭＺ２−ＭＥＬ−４３、またはＣＤ４ Ｔ細胞クローン４
３６／Ｂ６．３７に対するＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質とともにプレインキュベー
トしたＤＥＳＡ−ＥＢＶ）の存在下、１０％熱不活性化ヒト血清（ＨＳ）、ＡＡ
Ｇおよび５０Ｕ／ｍｌ組換え体ヒトIＬ−２（ｒｈ IＬ−２）を含むIＤ中で培
養した。
【０１１６】高タイターＭＡＧＥ３コード組換え体レトロウイルスの生成 ＭＡＧＥ−Ａ３コードレトロウイルスベクタープラスミド、ＭＦＧ−ＭＡＧＥ
−Ａ３、ＭＦＧ−Iｉ．ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＦＧ−Ｓｉｇ．ＭＡＧＥ−ＬＡＭＰ
および（増幅緑色蛍光タンパク質レポーターをコードしている）ＭＦＧ−ＥＧＦ
ＰをトランスフェクションによってＰｈｏｅｎｉｘＡＭＰＨＯパッケージング細
胞内に導入した。ＭＦＧレトロウイルスベクターはモロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）
マウス白血病ウイルスより由来し、薬剤耐性マーカーを欠いており、挿入された
ｃＤＮＡ以外他の潜在的な抗原性タンパク質を発現していない（Ｒｉｖｉｅｒｅ
，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：６７３３−６７３７
，１９９５）。トランスフェクションの手順は、グラハム（Ｇｒａｈａｍ）およ
びファンデルＥｂ（ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ）（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５４：５３６
−５３９）のリン酸カルシウム媒介トランスフェクションプロトコールの改良で
ある。
【０１１７】 トランスフェクションの２４時間前、１０．８×１０６ＰｈｏｅｎｉｘＡＭＰ
ＨＯ細胞を７５ｃｍ２組織培養フラスコ（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ））内で１
４ｍｌ細胞増殖培地中にプレートした。細胞を加えた後、このフラスコを穏やか
に前後に揺すり、フラスコの底あちこちに均等に分配した。細胞を３７℃および
５％ＣＯ２にてインキュベートした。トランスフェクションの時、細胞が７０−
８０％のコンフレントに達していなければならなないが、培地を取り除き、２５
ｍＭクロロキニン（シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．
，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含む新鮮な１４ｍｌのＰｈｏｅｎｉｘＡ
ＭＰＨＯ細胞増殖培地で置換した。トランスフェクションカクテルを、４０μｇ
レトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡを水に加え、１５７５μｌの最終容量
まで希釈することで５０ｍｌチューブ内に調製した。このＤＮＡ溶液に２２５μ
ｌの２Ｍ ＣａＣｌ２（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を加えた。次いで１８００μｌ
の２×ＨｅＢＳ（滅菌水中に５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＫＣｌ、１２ｍ
Ｍ デキストラン、２８０ｍＭ ＮａＣｌおよび１．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４を
溶解し、０．２μフィルターで濾過し、−２０℃で保存した）を、自動ピペット
で１５秒間勢いよくバブリングすることでＤＮＡ／ＣａＣｌ２溶液に滴下して加
えた。ＤＮＡ／ＣａＣｌ２／ＨｅＢＳ混合液をすぐに加えて細胞上に滴下し、フ
ラスコを緩やかに攪拌し、ＤＮＡ／ＣａＰＯ４粒子を均一混合させた。細胞を３
７℃／５％ＣＯ２にて７から９時間インキュベートし、クロロキニン含有培地を
新鮮なＰｈｏｅｎｉｘＡＭＰＨＯ細胞増殖培地に交換した。レトロウイルス上清
の回収のおよそ２４時間前に、ＰｈｏｅｎｉｘＡＭＰＨＯ培地を取り除き、ゆっ
くりと２．５％ＦＣＳのみを含む９ｍｌのＥＢＶ細胞増殖培地（イスコブ）で置
換した。レトロウイルス上清を、培地を細胞から取り除き、０．４５μフィルタ
ーを通して濾過して細胞残骸を取り除くことでトランスフェクション４８時間後
に回収した。回収および濾過後、ウイルス含有培地を氷上におき、１５ｍｌのポ
リプロピレンチューブ内で望ましい容量に分液し、−８０℃で保存した。ＭＦＧ
−ＥＧＦＰトランスフェクトＰｈｏｅｎｉｘＡＭＰＨＯ細胞をＦＡＣＳ解析によ
ってトランスフェクション効率に関してアッセイした。
【０１１８】ＥＢＶ細胞株のレトロウイルス導入 ＥＢＶ形質転換細胞を、細胞を感染カクテル中で再懸濁させ、遠心することで
感染させた。標的細胞を６０ｍｍ組織培養プレート（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ
））内で４ｍｌの感染カクテル中１．０×１０６細胞の濃度で再懸濁させた。プ
レートをIＥＣ遠心器、ローター型２２８内で２時間、３２℃、１２００ｒｃｆ
で遠心した。それぞれの導入すべきプレートに対して、４ｍｌの感染カクテルを
、ＥＢＶ細胞増殖培地中でウイルス上清１：２に希釈し、最終濃度６μｇ／ｍｌ
まで硫酸プロタミンを加えることで調製した。さらに２時間の加湿インキュベー
ター内で３７℃でのインキュベーション後に遠心をし、細胞を４ｍｌの標的細胞
増殖培地へ移した。この導入サイクルを細胞をプレーティングした直後に行い、
２４および４８時間の時点で繰り返した。感染ＥＢＶ細胞をＥＧＦＰレポーター
遺伝子発現に関してＦＡＣＳ解析にて第３回の感染サイクル後２４−４８時間ア
ッセイした。
【０１１９】インターフェロン−γ産生アッセイ ＬＢ７０５ ＣＴＬ ４３４／１の５０００のＴ細胞またはクローンＬＢ１５
５５ ＣＤ４ ４３６／Ｂ６．３７の３０００のＴ細胞を洗浄し、５０００のＭ
Ｚ２−ＥＢＶのレトロウイルス導入ＥＢＶ Ｂ細胞またはＬＧ２−ＥＢＶ Ｂ細
胞の存在下、丸底９６ウェルプレート内で１０％ＨＳ、ＡＡＧおよび５０Ｕ／ｍ
ｌ ｒｈ IＬ−２を含む１００μｌのIＤ培地中で一晩培養した。すべての培養
を三重で行った。５０μｌの培養上清をＥＬIＳＡ（IＦＮ−γ ＥＬIＳＡ，バ
イオソース（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ））によってIＦＮ−γの存在に関してアッセ
イした。簡単に記すと、抗ヒトIＦＮ−γ ＡｂをプレコートしたＥＬIＳＡプレ
ートを洗浄し、５０μｌの培養上清および５０μｌのビオチン化抗ヒトIＦＮ−
γ Ａｂ（IＤ、１０％ＨＳ、ＡＡＧ中１：１２５０）とともに２時間、室温（
ＲＴ）にてインキュベートした。３回の洗浄の後、プレートをウェルあたり５０
μｌのホースラディッシュペルオキシダーゼ共役ストレプトアビジン（ＰＢＳ／
０．５％ ＢＳＡ中１：３０００）を加えて３０分間ＲＴにてインキュベートし
、ＴＭＢ基質で検出し、Ｈ２ＳＯ４で反応を止めた。最適濃度は４５０ｎｍで読
んだ。４０００ｐｇ／ｍｌのIＦＮ−γを含む試料および１：２希釈液を標準と
して使用した。
【０１２０】細胞傷害性アッセイ １×１０６ＥＢＶ Ｂ細胞を２５μＣｉ Ｎａ２ ５１ＣｒＯ４で３７℃にて６
０−９０分間標識した。細胞を洗浄し、１×１０４／ｍｌで再懸濁させた。対照
アッセイにおいて、ＭＡＧＥ−Ａ３．Ａ１ペプチドを細胞懸濁液に１μＭの濃度
で加えた。ＬＢ７０５ ＣＴＬ ４３４／１ Ｔ細胞を、Ｖ型９６ウェルプレー
ト中で、対標的細胞比３０から１および１０倍希釈の効果器にて、３７℃でウェ
ルあたり１０００の標識化標的細胞ととも培養した。４時間後、クロミウム放出
（ＥＲ）を１００μｌ上清のアリコートで測定した。培地のみまたは１％Ｔｒｉ
ｔｏｎ中でインキュベートした標的細胞をそれぞれ最小（ＳＲ）および最大（Ｍ
Ｒ）５１Ｃｒ放出としてとった。試料中のパーセンテージ実験的５１Ｃｒ放出を
（ＥＲ−ＳＲ／ＭＲ−ＳＲ）×１００％として計算した。 Ｔ細胞クローンＬＢ１５５５ ＣＤ４ ４３６／Ｂ６．３７による導入ＥＢＶ
【０１２１】Ｂ細胞株の認識 ＭＺ２ ＥＢＶにＭＦＧ Iｉ ＭＡＧＥ−Ａ３（ＭＺ２ ＥＢＶ−Iｉ ＭＡ
ＧＥ−Ａ３）、ＭＦＧ−ＳｉｇＭＡＧＥ−Ａ３ ＬＡＭＰ（ＭＺ２ ＥＢＶ−Ｓ
ｉｇＭＡＧＥ−Ａ３ ＬＡＭＰ）、ＭＦＧ ＭＡＧＥ−Ａ３（ＭＺ２ ＥＢＶ−
ＭＡＧＥ−Ａ３）またはＭＦＧ ＥＧＦＰ（ＭＺ２ ＥＢＶ−ＥＦＧＰ）を導入
した。導入細胞を、ＭＡＧＥ−３．ＤＲ１３エピトープと反応するＣＤ４− Ｔ
細胞クローンＬＢ１５５５ ＣＤ４ ４３６／Ｂ６．３７の存在下で一晩培養し
た。Ｔ細胞クローンは、ＥＬIＳＡによって測定した培養上清中のIＦＮ−γの放
出によって決定したように（図１０）、ＭＺ２−ＥＢＶ−Iｉ ＭＡＧＥ−Ａ３
を認識した。反対に、Ｍ２ ＥＢＶ−ＳｉｇＭＡＧＥ−Ａ３ ＬＡＭＰのみはI
ＦＮ−γの弱い産生を誘導した。対照トランスフェクションであるＭＺ２ ＥＢ
Ｖ−ＭＡＧＥ−Ａ３およびＭＺ２ ＥＢＶ−ＥＧＦＰおよびＬＧ２ ＥＢＶ（示
していない）はＣＤ４ Ｔ細胞にて認識されなかった。これらの結果は、Iｉ−
ＭＡＧＥ−Ａ３融合タンパク質がＨＬＡクラスIIによる発現に関して処理され、
一方ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質のみはＨＬＡクラスII抗原提示経路に到達しない
ことを示している。
【０１２２】ＬＢ ７０５ ＣＴＬ ４３４／１による導入ＥＢＶ Ｂ細胞株の認識 ＭＺ２ ＥＢＶ−Iｉ ＭＡＧＥ−Ａ３およびＭＺ２ ＥＢＶ−ＳｉｇＭＡＧ
Ｅ−Ａ３ ＬＡＭＰ両方とも一晩の共培養後にＭＡＧＥ−Ａ３．Ａ１特異的ＣＴ
ＬクローンＬＢ ７０５ ＣＴＬ ４３４／１によって同程度認識された（図１
１）。培養上清中のIＦＮ−γ放出をＥＬIＳＡによって測定した。ＭＺ２ ＥＢ
Ｖ−Iｉ ＭＡＧＥ−Ａ３はＣＴＬクローンによる高IＦＮ−γ産生を顕在化させ
、このことはIｉに融合したＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質の発現がまだＨＬＡクラ
ス一経路での処理を導くことができることを示唆している。 ＭＡＧＥ−Ａ３、Iｉ ＭＡＧＥ−３Ａ、ＳｉｇＭＡＧＥ−Ａ３ ＬＡＭＰま
たはＧＦＰをレトロウイルス的に導入したＭＺ２−ＥＢＶのＬＢ７０５ ＣＴＬ
４３４／１による溶解物を、標的細胞に対するさまざまな効果器比（Ｅ／Ｔ）
での４時間５１Ｃｒ放出アッセイで試験した。平行して、ＭＡＧＥ−Ａ３．Ａ１
ペプチドをＴ細胞活性化の陽性対照として加えた。ＭＺ２ ＥＢＶ−Iｉ ＭＡ
ＧＥ−Ａ３およびＭＺ２ ＥＢＶ−ＳｉｇＭＡＧＥ−Ａ３ ＬＡＭＰ両方を、Ｍ
Ｚ２ ＥＢＶ−ＭＡＧＥ−Ａ３と同様にＬＢ７０５ ＣＴＬ ４３４／１にて溶
解した。溶解のパーセンテージはＭＡＧＥ−Ａ３．Ａ１ペプチドの存在下での標
的細胞溶解物と同等であった（図１２）。
【０１２３】ＭＺ２−ＭＥＬ．４３によるＨＬＡクラスIIでのＭＡＧＥ−Ａ３由来ペプチドの
提示 ＨＬＡクラスII分子でのＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドの提示に対するIｉの寄与を
さらに確かめるために、メラノーマ細胞株ＭＺ２−ＭＥＬ．４３にＭＦＧ Iｉ
ＭＡＧＡ−Ａ３（ＭＺ２−ＭＥＬ．４３−Iｉ ＭＡＧＥ−Ａ３）またはＭＦ
Ｇ ＥＧＦＰ（ＭＺ２−ＭＥＬ．４３−ＥＧＦＰ）を導入した。ＭＦＧ ＥＧＦ
Ｐを導入した１ヶ月後、９０％のＭＺ２−ＭＥＬ．４３細胞が高レベルのＥＧＦ
Ｐを発現した（示していない）。ＭＺ２−ＭＥＬ．４３は内因的にＭＡＧＥ−Ａ
３タンパク質を発現するが、しかしＨＬＡクラスIIでのＭＡＧＥ−Ａ３由来ペプ
チドは発現しない。しかしながら、ＭＺ２−ＭＥＬ．４３へのＭＦＧ−Iｉ Ｍ
ＡＧＥ−Ａ３の導入後、一晩の共培養の後にＣＤ４ Ｔ細胞クローンＬＢ１５５
５ ＣＤ４ ４３６／Ｂ６．３７によって認識された（図１３Ａ）。培養上清中
のIＦＮ−γ放出をＥＬIＳＡによって測定した。これは、内因的に発現したＭＡ
ＧＥ−Ａ３と対照的に、Iｉ ＭＡＧＥ−Ａ３がＨＬＡクラスIIでの発現に対し
て処理されうることを示唆する。親および導入ＭＺ２−ＭＥＬ．４３両方がＣＴ
ＬクローンＬＢ７０５ ＣＴＬ ４３４／１を活性化した（図１３Ｂ）。
【０１２４】 例７：２つの他のＣＤ４＋クローンは第二のＭＡＧＥ−Ａ３エピトープを認識し
た このプロトコールの効力を確かめるために、上述の条件を使用して樹状細胞に
ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質を供給し、ヘモクロマトーシス対象ＬＢ１１５８から
の、またはメラノーマ対象７００２からの自己ＣＤ４＋ Ｔリンパ球を刺激した
。４回の再刺激後、それぞれのＭＡＧＥ−Ａ３をロードした自己ＥＢＶ−Ｂ細胞
で刺激したマイクロ培養液のアリコートによるIＦＮ−γの特異的産生を、対象
ＬＢ１１５８に対しては３５日目に、対象７００２に対しては３７日目に試験し
た。それぞれの個人に対して、１つの陽性マイクロ培養を、刺激細胞として自己
ＥＢＶ−Ｂ細胞を使用してクローン化し、ＬＢ１１５８に対してＭＦＧ Iｉ
ＭＡＧＥ−Ａ３を再導入するか、または対象７００２に対してタンパク質ＭＡＧ
Ｅ−Ａ３を供給した。ＬＢ１１５８ ＣＤ４＋クローン２２および７００２ Ｃ
Ｄ４＋クローン２を得た。両方のクローンはＭＡＧＥ−Ａ３を与えた、またはＭ
ＦＧ Iｉ ＭＡＧＥ−Ａ３を導入した自己ＥＢＶ−Ｂ細胞での刺激によってIＦ
Ｎ−γを分泌し、このことはこのクローンがＭＡＧＥ−Ａ３に特異的であり、タ
ンパク質のバッチでの混在物に対して結合したのではないことを証明している。
クローン２２について、IＦＮ−γ放出はＨＬＡ−ＤＲ分子を認識するｍＡｂ
２Ｂ６によって阻害された。とりわけ、自己ＥＢＶ−Ｂ細胞を２０μｇ／ｍｌの
組換え体Ｈｉｓ−ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質の存在下、２０時間インキュベート
した。クローン２２（２５００細胞）を一晩、５０００個のＭＡＧＥ−Ａ３をロ
ードしたＥＢＶ−Ｂ細胞とともに、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ（Ｗ６／３２）またはＨ
ＬＡ−ＤＲ（２Ｂ６）を認識するモノクローナル抗体の存在下または非存在下で
、丸底マイクロウェル中で一晩インキュベートした。IＦＮ−γ分泌をＥＬIＳＡ
によって２０時間後に測定した（図１５Ａ）。
【０１２５】 ＭＡＧＥ−Ａ３の部分に相当するペプチド（たとえば、ＭＡＧＥ１０７−１２ ２ 、ＭＡＧＥ１１１−１２６、ＭＡＧＥ１１５−１３０、ＭＡＧＥ１１９−１３ ４ ）をクローン２および２２による認識について試験した。ＨＬＡ−ＤＲ１３
ＥＢＶ−Ｂ細胞を２時間、異なる濃度のこれらのペプチドでパルスした。クロー
ン２および３７（２５００細胞）を丸底マイクロウェル中で２０時間、５０００
のペプチドでパルスした細胞とともにインキュベートし、IＦＮ−γ産生につい
てアッセイした。ペプチドＭＡＧＥ−Ａ３１１９−１３４（ＦＬＬＬＫＹＲＡＲ
ＥＰＶＴＫＡＥ；配列番号：２３）は陽性を記録した。このペプチドは１０ｎｇ
／ｍｌの濃度にてクローン２によるIＦＮ−γの分泌を刺激し、一方でクローン
３７は同様の条件下でこのペプチドにより刺激されなかった（図１５Ｂ）。クロ
ーン２２はまた、同様の実験においてペプチドＭＡＧＥ−Ａ３１１９−１３４（
配列番号：２３）によって刺激された。 ドナーＬＢ１１５８はＤＲＢ１＊０１０１、ＤＢＲ１＊１３０１およびＤＢＲ
３＊０２０２対立遺伝子を発現し、一方対象７００２はＤＲＢ１＊０１０１、Ｄ
ＲＢ１＊１３０２およびＤＲＢ３＊０３０１を発現している。多くのさらなるＥ
ＢＶ−Ｂ細胞を試験し、ＤＲ１３を提示しているこれらのみがクローン２および
２２に対してペプチドを発現できたことを明らかにした（表III）。自己のまた
は同種のＥＢＶ−Ｂ細胞を２時間、１μｇ／ｍｌのＭＡＧＥ−Ａ３１１９−１３ ４ ペプチドでパルスし、次いで洗浄した。クローン２または２２を５０００のペ
プチドパルスしたＥＢＶ−Ｂ細胞と共に２０時間、丸底マイクロウェル中でイン
キュベートし、クローンのＥＶＢ−Ｂ細胞への反応性をIＦＮ−γ分泌としてＥ
ＬIＳＡにて測定した。実験は三重に行った。
【０１２６】
【表４】
【０１２７】 例８：最小ＭＡＧＥ−Ａ３抗原性ペプチドの定義 ＨＬＡ−クラスI−制限ペプチドと違い、溝内でそれらの末端によって固定さ
れないことから、クラスII−制限ペプチドは通常長さがさまざまであり、アミノ
末端およびカルボキシ末端両方における伸張を許容する。したがって、抗原性ペ
プチドの長さを正確に定義することは難しい。したがって、多くのＭＡＧＥ−Ａ
３ペプチドを異なる濃度で試験した（表IVおよびV）。表IVに示すように、自己
ＬＢ１５５５ ＲＢＶ−Ｂ細胞を異なるＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドと共に２時間イ
ンキュベートした。次いでクローン３７の２５００細胞を５０００ペプチドパル
ス細胞と共に丸底マイクロウェル内で２０時間共培養した。共培養上清中に放出
されたIＦＮ−γをＥＬIＳＡアッセイにて測定した。実験は三重に行った。表V
に示したように、ＨＬＡ−ＤＲ１３ ＥＢＶ−Ｂ細胞を異なるＭＡＧＥ−Ａ３ペ
プチドと共に２時間インキュベートした。次いでクローン２および２２（２５０
０細胞）を５０００ペプチドパルス細胞と共に丸底マイクロウェル内で２０時間
共培養した。共培養上清中に放出されたIＦＮ−γをＥＬIＳＡアッセイにて測定
した。実験は三重に２回行った。これらの実験より、クローン３７によってよく
認識された短いペプチドはＡＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲＡＲ（ＭＡＧＥ−Ａ３１１ ４−１２７ ；配列番号：２８）であり、一方クローン２および２２によってよく
認識された短いペプチドはＦＬＬＬＫＹＲＡＲＥＰＶＴ（ＭＡＧＥ−Ａ３１１９ −１３１ ；配列番号：３４）およびＬＬＫＹＲＡＲＥＰＶＴＫＡＥ（ＭＡＧＥ−
Ａ３１２１−１３４；配列番号：３８）であったと結論づけた。
【０１２８】 ＨＬＡ−クラスI−制限ペプチドに関する限り、ＨＬＡ−クラスII−制限ペプ
チドは９から１０アミノ酸のＨＬＡ結合コア内でのアンカー残基が好ましい。Ｈ
ＬＡ−ＤＲＢａ＊１３０１およびＢ１＊１３０２に結合しているほとんどのペプ
チドは、結合コア内のＰ１部位でのI、ＬまたはＶ、Ｐ４部位でのＬ、Ｖ、Ｍ、
Ａ、ＷまたはＹ、Ｐ６部位でのＲまたはＫ、Ｐ９または１０部位でのＹ、Ｆ、Ａ
、ＳまたはＴによって特徴づけられる（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍ
ＨＣ Ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｏｔｉｅｆｓ，Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Iｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ Ｕｎｉｔ，Ｓｐｒｉｎ
ｇｅｒ，１９９７）。先の結果は、（クローン３７によって認識された）第一の
抗原性ペプチドに対して、１０アミノ酸ペプチドＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲ（ＭＡＧ
Ｅ−Ａ３１１６−１２５；配列番号４１）は、それぞれＰ１およびＰ９／１０ア
ンカーとして保存されているＨＬＡ−ＤＲ１３、Ｌ１１６およびＹ１２５残基に
対する結合コアであることを示唆している（表IV）。あるいは、クローン３７認
識に対して、１０アミノ酸ペプチドＶＨＦＬＬＬＫＹＲＡ（ＭＡＧＥ−Ａ３１１ ７−１２６ ；配列番号１１）がそれぞれＰ１およびＰ９アンカーとして保存され
ているＶ１１７およびＡ１２６を持つ、ＨＬＡ−ＤＲ１３に対する結合コアであ
り得る。（クローン２および２２によって認識された）第二の抗原性ペプチドに
対して、結果は、１０アミノ酸ペプチドＬＫＹＲＡＲＥＰＶＴ（ＭＡＧＥ−Ａ３ １２２−１３１ ；配列番号：４２）が、それぞれＰ１、Ｐ６およびＰ１０アンカ
ーとして保存されている残基Ｌ１２２、Ｒ１２７およびＴ１３１を持つＨＬＡ−
ＤＲ１３に対する結合コアであることを示唆している（表V）。したがって結合
クローン３７、２または２２について本明細書で記述したペプチドはヌクレオチ
ド配列、クローン３７に対してはＧＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴＧＣＴＣＣＴＣＡＡＧ
ＴＡＴＣＧＡＧＣＣ（配列番号：１３）またはＴＴＧＧＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴＧ
ＣＴＣＣＴＣＡＡＧＴＡＴＣＧＡ（配列番号：４３）、クローン２または２２に
対してはＣＴＣＡＡＧＴＡＴＣＧＡＧＣＣＡＧＧＧＡＧＣＣＧＧＴＣＡＣＡ（配
列番号：４４）を含む核酸によってコードされる。
【０１２９】
【表５】
【０１３０】
【表６】
【０１３１】
【表７】
【０１３２】 例９：クローン２および２２による他のＭＡＧＥタンパク質の認識 ペプチドＭＡＧＥ−Ａ３１１９−１３４（ＦＬＬＬＫＹＲＡＲＥＰＶＴＫＡＥ
；配列番号：２３）はＭＡＧＥ−Ａ１（アミノ酸１１２−１２７）、ＭＡＧＥ−
Ａ２（アミノ酸１１９−１３４）およびＭＡＧＥ−Ａ６（アミノ酸１１９−１３
４）に同一に存在する。クローン３７ではなく、クローン２および２２を、上述
したアッセイに従ってＭＡＧＥ−Ａ１組換え体タンパク質をロードした自己ＥＢ
Ｖ−Ｂ細胞によって刺激した。クローン３７によって認識されたペプチドはまた
他のＭＡＧＥタンパク質によってもコードされている。配列番号：２８はＭＡＧ
Ｅ−Ａ１２に存在し、配列番号：１１および４１はＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−
Ａ６にも存在する。したがって、２つのＭＡＧＥ−Ａ３．ＤＲ１３エピトープは
他のＭＡＧＥ産物での臨床試験に有用である。
【０１３３】 相同性ペプチド配列が、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ８、
ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｂ２、ＭＡ
ＧＥ−Ｃ１を含む他の癌抗原で発見されている。ＣＤ４＋ Ｔ細胞クローンがこ
れらのさらなる癌関連抗原を認識するかどうかを決定するために、組換え体タン
パク質またはこれらのタンパク質の相同性領域に相関している合成ペプチドを、
上述したアッセイに従ってクローン２、２２または３７による認識について試験
するために抗原提示細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞など）をロードするのに使用する。ク
ローン２、２２または３７によって認識される相同性ペプチドは本明細書で記述
したＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドの機能的な変異体として見なすことができる。
【０１３４】 例１０：ＨＬＡ−ＤＰ分子によって提示されたＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドの同定 I．細胞株、サイトカイン 上述した物と同様 II．組換え体ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質の産生 Ａ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのＨｉｓ−ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質の産生 組換え体Ｈｉｓ−ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質を上述のように産生した。大腸菌
内（バッチ９７Ａ２１／１ａ）で産生した組換え体タンパク質を本明細書では以
後、タンパク質ＭＡＧＥ−Ａ３（バクテリア）とした。
【０１３５】 Ｂ．Ｓｆ９昆虫細胞でのＨｉｓ−ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質の産生 他の組換え体ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質をバキュロウイルス発現系（Ｐｈａｒ
Ｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてスポドプテラ フ
ルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９）内で、
我々の研究所で作製した。ＭＡＧＥ−Ａ３のコード配列をバキュロウイルス導入
ベクター（ｐＡｃＧＰ６７−Ａ；ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）の、バキュロウイルス
の一種であるオートグラファ カリフォルニア（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌ
ｉｆｏｒｎｉｃａ）核酸多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）のｇｐ６７表面タンパ
ク質のシグナル配列の下流内にクローン化した。精製をより簡単にするために、
ヒスチジン末端をコードしている配列をＭＡＧＥ−Ａ３配列のＣ−末端に加えた
。この構造はＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質の昆虫細胞による分泌を可能にし、本明
細書以下でＭＡＧＥ−Ａ３（昆虫）とした。組換え体プラスミドのＤＮＡをＳｆ
９昆虫細胞内への致死遺伝子的に変異したＡｃＮＰＶのＤＮＡと共トランスフェ
クトした。共トランスフェクションにより、プラスミドおよびウイルスの相同性
領域間の組換えが可能になり、ベクターからの外来遺伝子をＡｃＮＰＶ ＤＮＡ
へ送達する。Ｓｆ９昆虫細胞培養液の上清に含まれるタンパク質の精製には濾過
、陽イオン交換樹脂ＤＥＡＥ−セファデックスクロマトグラフィー、ＮｉＣｌ２ で飽和したＨｉｇｈＴｒａｐキレーティングカラム上のクロマトグラフィー、固
定化抗ＭＡＧＥ−モノクローナル抗体（ｍＡｂ ５７ｂ、ギウリオ シパグノリ
ー（Ｇｉｕｌｉｏ Ｓｐａｇｎｏｌｉ）博士、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ Ｃｈｉｒ
ｕｒｇｉｅ，Ｋａｎｔｏｎｓｓｐｉｔａｌ．ＣＨ−４０３１ Ｂａｓｅｌ，Ｓｗ
ｉｔｚｅｒｌａｎｄよりいただいた）でのアフィニティクロマトグラフィー、濃
縮および透析が含まれる。
【０１３６】 III．レトロウイルスの構築 組換え体レトロウイルス、ｐＭＦＧ−Iｉ８０−ＭＡＧＥ−Ａ３−（IＲＥＳ）
−ｔＮＧＦＲを構築した。神経増殖因子に対する低アフィニティーレセプターの
細胞外および膜貫通領域をコードしているｔＮＧＦＲ遺伝子断片を、親切にもＣ
．トラバーサリー（Ｃ．Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ）博士より提供されたプラスミド
ｐＵＣ１９−ｔＮＧＦＲより増幅した。ＰＣＴを以下のプライマーを使用して行
った。センス：５’−ＣＣＣＴＣＡＴＧＡＧＧＧＣＡＧＧＴＧＣＣＡＣＣＧ−３
’（配列番号：８８）、アンチセンス：５’−ＣＣＣＡＧＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧ
ＧＡＴＴＣＣＣＣＴＧＴＴＣＣＡＣ−３’（配列番号：８９）。 このＰＣＲにより開始コドン部位にＢｓｐＨ１部位および終止コドンの下流に
Ｂｇｌ２部位が導入される。３’末端付近のＢａｍＨ１部位は削除された。この
ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１内にクローン化し、配列決定した。ｔＮＧＦＲ遺伝子
断片をＢｓｐＨ１−Ｎｏｔ１（ｐＣＲ２．１ポリリンカーより）断片としてこの
ベクターより単離された。
【０１３７】 脳心筋炎ウイルス由来のIＲＥＳ配列をｐＧＥＭ−ＥＭＣ２（Ｊ．−Ｃ．レナ
ルド（Ｊ．−Ｃ．Ｒｅｎａｕｌｄ）博士、Ｃａｔｈｏｌｉｃ Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ ｏｆ Ｌｏｕｖａｉｎ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍより親切にも
いただいた）よりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内へ送達した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔ−IＲＥＳからのＥｃｏＲ１−Ｎｏｔ１断片をさらなる構築に使用した。 両方のＤＮＡ断片を一緒にｐＣＲ２．１ ＥｃｏＲ１−Ｎｏｔ１内へライゲー
ションした。この３つの断片ライゲーションにより、結果としてｐＣＲ２．１−
IＲＥＳ−ｔＮＧＦＲと命名したプラスミドができる。 IＲＥＳ−ｔＮＧＦＲ配列を含むｐＣＲ２．１−IＲＥＳ−ｔＮＧＦＲからのＢ
ａｍＨ１−Ｂｇｌ２断片をＢａｍＨ１によって開裂したｐＭＦＧ−Iｉ８０（ｐ
ＭＦＧ−Iｉ８０は例６で記述したｐＭＦＧ−Iｉの別名である）内にライゲーシ
ョンした。このことにより、Iｉ８０遺伝子断片の３’末端部に特徴的なＢａｍ
Ｈ１部位を持つｐＭＦＧ−Iｉ８０−IＲＥＳ−ｔＮＧＦＲができる。 Iｉ８０の３’境界にあるＢａｍＨ１部位とインフレームで、５’Ｂｇｌ２部
位を持つ全長ＭＡＧＥ−Ａ３ ｃＤＮＡを含むＢｇｌ２−Ｂｇｌ２断片をｐＣＲ
２．１ ＭＡＧＥ−Ａ３（Ｂｇｌ２）より単離し、ＢａｍＨ１で開裂したｐＭＦ
Ｇ−Iｉ８０−IＲＥＳ−ｔＮＧＦＲ内へ挿入した。得られたプラスミドｐＭＦＧ
−Iｉ８０−ＭＡＧＥ−３−IＲＥＳ−ｔＮＧＦＲはIｉ８０−ＭＡＧＥ−Ａ３融
合タンパク質と膜挿入ｔＮＧＦＲ両方の刺激性発現を可能にする。 高タイターＭＡＧＥ３コード組換え体レトロウイルスストックを、上述のよう
にトランスフェクションによってプラスミドｐＭＦＧ−Iｉ８０−ＭＡＧＥ−Ａ
３−IＲＥＳ−ｔＮＧＦＲをＰｈｏｅｎｉｘＡＭＰＨＯパッケージング細胞内へ
導入することで作製した。レトロウイルスストックを回収し、上述したような導
入に使用した。
【０１３８】 IV．ヒト血液の処理 血液を、若干の改良をして上述のように処理した。自己血清の調製のためにＬ
ｙｍｐｈｐｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ Ｐｈｒａｍ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）上
での遠心の後、上清の上部分（血清希釈１／３）を回収し、５００ｇにて１０分
間遠心し血小板を取り除いた。この上清を５６℃にて３０分間インキュベートし
、−２０℃にて保存した。
【０１３９】 V．混合リンパ球／樹状細胞培養 樹状細胞（５００マイクロリットルあたり５×１０５）を３７℃、５％ＣＯ２ にて、１０マイクログラムのＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質（昆虫）の存在下で、０
．２４ｍＭ Ｌ−アスパラギン、０．５５ｍＭ Ｌ−アルギニン、１．５ｍＭ
Ｌ−グルタミン（ＡＡＧ）、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリンおよび１００μｇ／ｍ
ｌ ストレプトマイシン、IＬ−４（１００Ｕ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（１００
ｎｇ／ｍｌ）およびＴＮＦ−α（５ｎｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭI１６４０培地内
で１８−２０時間インキュベートした。細胞を洗浄し、IＬ−６（１，０００Ｕ
／ｍｌ）およびIＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、丸底マイクロウェルあ
たり１０４個、ＡＡＧ（本明細書で以下、完全IＭＤＭ培地と表記する）および
１％ 自己血清を含むIＭＤＭ培地２００マイクロリットル中の１０５個の自己
ＣＤ４＋ リンパ球へ加えた（図１６）。ＣＤ４＋リンパ球をタンパク質ＭＡＧ
Ｅ−Ａ３（昆虫）をあらたにロードした自己樹状細胞で第７日、１４日、２１日
および３０日で再刺激し（上記を参照のこと）、１０％ヒト血清、IＬ−１２（
１０Ｕ／ｍｌ）およびIＬ−７（５ｎｇ／ｍｌ）を含む完全イスコル培地内で増
殖させた。増殖しているＣＤ４＋Ｔ細胞を含んでいるマイクロ培養液を、タンパ
ク質ＭＡＧＥ−Ａ３（バクテリア）をロードした自己ＥＢＶ−Ｂ細胞で刺激した
場合のそのIＦＮ−γ産生の能力について３６日目に査定した。他のタンパク質
を使用することの理由は、樹状刺激細胞をロードするのに使用したタンパク質の
バッチ内に含まれた交雑物に対して反応するＣＤ４＋Ｔ細胞を考慮に入れること
をさけるためである。タンパク質パルスＥＢＶ−Ｂ細胞を洗浄し、１０％ヒト血
清およびIＬ−２（２５Ｕ／ｍｌ）を含む完全IＭＤＭ培地１００μｌ中で〜４，
０００のＣＤ４＋ Ｔリンパ球と一緒に、丸底マイクロウェルあたり〜１０，０
００細胞に希釈した。２０時間後、上清を回収し、そのIＦＮ−γ含量を、Ｍｅ
ｄｇｅｎｉｘ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ−Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（Ｆｌｅｕｒｕｓ，
Ｂｅｌｇｉｕｍ）からの試薬を使用したＥＬIＳＡによって測定した。タンパク
質ＭＡＧＥ−Ａ３（バクテリア）での刺激後、高レベルのIＦＮ−γを産生した
マイクロ培養Ｃ３を限界希釈法にてクローン化した（図１７）。
【０１４０】 VI．ＣＤ４＋ Ｔ細胞クローンはＭＡＧＥ−Ａ３抗原に反応する タンパク質ＭＡＧＥ−Ａ３（バクテリア）（２０マイクログラム／ｍｌ）をロ
ードした自己ＥＢＶ−Ｂ細胞を最初の２回の刺激に関して刺激細胞として使用し
た（マイクロウェルあたり６×１０３から１０×１０３細胞）。精製ＰＨＡ（０
．２μｇ／ｍｌ、ＨＡ １６、ＭＵＲＥＡＸ ＤIＡＧＮＯＳＴIＣＳ，Ｄａｒｔ
ｆｏｒｄ，ＵＫ）を次の刺激に使用した。同種ＬＧ２−ＥＢＶ−Ｂ細胞（マイク
ロウェルあたり５×１０３から１０×１０４細胞）を添加細胞として加えた。Ｃ
Ｄ４＋ Ｔ細胞を週に１回再刺激し、１０％ヒト血清、IＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ
）および０．５μｇ／ｍｌ精製ＰＨＡ（ＨＡ １６、ＭＵＲＥＸ ＤIＡＧＮＯ
ＳＴIＣＳ，Ｄａｒｔｆｏｒｄ，ＵＫ）またはタンパク質ＭＡＧＥ−Ａ３（バク
テリア）をロードしたＥＢＶ−Ｂ細胞を含む完全IＭＤＭ培地内で増殖させた。
時折、IＬ−４（５Ｕ／ｍｌ）、１−メチル−ＤＬ−トリプトファン（１００μ
Ｍ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）または
ＭＲＡ（マイコプラズマ除去剤、５００ｎｇ／ｍｌ、IＣＮ）もまた加えた。
【０１４１】 ヘモクロマトーシス対象ＬＢ１９８１からのＥＢＶ−Ｂ細胞（ＬＢ−１９８１
−ＥＢＶ）を２０μｇ／ｍｌのオバルブミン（ＯＶＡ）またはＭＡＧＥ−Ａ３タ
ンパク質（バクテリア）と共に２０時間インキュベートした。１００００細胞を
、マイクロ培養液Ｃ３（〜４，０００効果細胞のアリコートを加えたマイクロウ
ェル中に分配した。いくつかのクローンをマイクロ培養液Ｃ３より、とりわけＣ
Ｄ４＋クローンＬＢ１９８１−ＣＤ４ ５２７／Ｃ３．２２（本明細書で以下、
クローンＣ３．２２と記す）およびＬＢ１９８１−ＣＤ４ ５２７／Ｃ３．４３
（本明細書で以下、クローンＣ３．４３と記す）を得た。クローンＣ３．２２お
よびＣ３．４３（〜３，０００細胞）を２０μｇ／ｍｌのＭＡＧＥ−Ａ３ととも
にインキュベートしたＬＢ−１９８１−ＥＢＶ（〜１６，０００細胞）、または
融合タンパク質Iｉ−ＭＡＧＥ−Ａ３についてコードしているレトロウイルスを
導入したＬＢ−１９８１−ＥＢＶ（〜２０，０００細胞）で刺激した。上清中で
のIＦＮ−γ産生をＥＬIＳＡによって一晩培養後に見積もった。これらは両方と
もタンパク質ＭＡＧＥ−Ａ３（バクテリア）をロードした、または短くした不変
鎖（Iｉ）−ＭＡＧＥ−Ａ３融合タンパク質をコードしているレトロウイルスを
導入した自己ＥＢＶ−Ｂ細胞を認識した（図１７）。これらの（もっとも可能性
のある２つの）クローンは外因性にIｉ−ＭＡＧＥ−Ａ３を発現している細胞を
認識し、したがって、これらはＭＡＧＥ−Ａ３由来の抗原に対して反応し、タン
パク質のバッチ内の夾雑物には反応しない。
【０１４２】 VI．ＣＤ４クローンＣ３．２２はＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０４０１上のＭＡＧＥ−Ａ
３ペプチドＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹ（配列番号：８６）を認識する 抗原性ペプチドを、ペプチドを１μｇ／ｍｌの濃度にて試験したことと、試験
を１００μｌ中で行ったことを除いて、上述のように同定した。ペプチドＬＧＤ
ＰＫＫＬＬＴＱＨＦＶＱＥＮ（配列番号：８２）、ＫＫＬＬＴＱＨＦＶＱＥＮＹ
ＬＥＹ（配列番号：８３）、ＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹＲＱＶＰ（配列番号：８
４）およびＶＱＥＮＹＬＥＹＲＱＶＰＧＳＤＰ（配列番号：８５）を試験した。
自己ＥＢＶ−Ｂ細胞を１時間、１μｇ／ｍｌのそれぞれのペプチドと共にインキ
ュベートした。ついでクローンＣ３．４３（３，０００細胞）を２０時間、２０
，０００ペプチドパルス細胞と共に共培養した。上清中のIＦＮ−γ産生をＥＬI
ＳＡによって測定した。２つのペプチド、すなわちＫＫＬＬＴＱＨＦＶＱＥＮＹ
ＬＥＹ（アミノ酸２４３−２５８；配列番号：８３）およびＴＱＨＦＶＱＥＮＹ
ＬＥＹＲＱＶＰ（アミノ酸２４７−２６２；配列番号：８４）がＣ３．４３と陽
性を示した（図１８Ａ）。その配列が２つの陽性１６アミノ酸ペプチドに含まれ
るような１２アミノ酸ペプチドの他の組を試験した。クローンＣ３．２２（４，
０００細胞）を２０時間１０，０００ペプチドパルス細胞と共培養した。ペプチ
ドＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹ（アミノ酸２４７−２５８；配列番号：８６）はク
ローンＣ３．２２によって認識された。明らかな認識がおよそ１０ｍＭではやく
も得られた（図１８Ｂ）。
【０１４３】 ペプチドＫＫＬＬＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹ（アミノ酸２４３−２５８；配列
番号８３）をロードした細胞のクローンＣ３．２２による認識は、抗ＨＬＡ−Ｄ
Ｐ抗体によって消滅した。自己ＥＢＶ−Ｂ細胞（２０，０００細胞）を１時間１
μｇ／ｍｌのペプチドＫＫＬＬＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹ（配列番号：８３）と
共にインキュベートし、洗浄した。次いでこのペプチドパルス細胞を、モノクロ
ーナル抗体２Ｂ６（抗ＨＬＡ−ＤＲ；１／２０）、Ｂ７．２１（抗ＨＬＡ−ＤＰ
；１／１００）またはＳＰＶＬ３（抗ＨＬＡ−ＤＱ；１／１００）（Ａ．ムルダ
ー（Ａ．Ｍｕｌｄｅｒ）博士，Ｂｌｏｏｄｂａｎｋ，Ｌｅｉｄｅｎより提供され
た）の連続的な存在下（または非存在下）でクローンＣ３．２２（３，０００細
胞）と共に２４時間、８％ＣＯ２下３７℃にてインキュベートした。上清中のI
ＦＮ−γ産生をＥＬIＳＡによって測定した。モノクローナル抗体Ｂ７．２１は
この認識を消滅させ、一方この認識はモノクローナル抗体２Ｂ６、またはＳＰＶ
Ｌ３の存在下で変化はなく（図１９）、提示分子がＨＬＡ−ＤＰ分子であったこ
とを指し示している。
【０１４４】 対象ＬＢ１９８１はＤＰＢ１＊０４０１に分類された。ＤＰＢ１＊０４０１が
提示ＨＬＡ−ＤＰ分子であったことを確かめるために、さらなるＥＢＶ−Ｂ細胞
株を試験した。自己ＬＢ１９８１−ＥＢＶまたは同種−ＥＢＶ−Ｂ細胞を１時間
、１μｇ／ｍｌのペプチドと共にインキュベートし、洗浄した。次いでＣＤ４ク
ローン（３，０００細胞）を２０，０００ペプチドパルスＥＢＶ−Ｂ細胞と共に
２０時間インキュベートした。上清中に放出されたIＦＮ−γをＥＬIＳＡによっ
て測定した。ＤＰＢ１＊０４０１を発現しているこれらのＥＢＶ−Ｂ細胞株はク
ローンＣ３．２２に対してＭＡＧＥ−Ａ３２４３−２５８を提示できた（表VII
）。ＤＰＮ１＊０４０１はおよそ６４％のカフカス人で発現している。
【０１４５】
【表８】
【０１４６】 VII．腫瘍細胞株の直接認識 以上で、ＭＡＧＥタンパク質の細胞質または核局在にしたがって、ＨＬＡ−Ｄ
Ｒ１３上で認識されたＭＡＧＥ−Ａ３抗原は腫瘍細胞の表面で発現され得ないと
結論づけられた。もしこれがＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０４０１によって提示されたＭ
ＡＧＥ−Ａ３抗原の場合でもあったかどうかを決定するために、IＦＮ−γ（１
００Ｕ／ｍｌ）で４８時間前処理したまたはしない、ＭＡＧＥ−Ａ３（刺激細胞
；２０，０００）を発現しているＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０４０１腫瘍細胞を３，０
００のクローンＣ３．２２またはＣ．３．４３のＴ細胞と共に２０時間共培養し
た。上清中に放出されたIＦＮ−γをＥＬIＳＡによって測定した。図２０に示す
ように、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０４０１によって提示されたＭＡＧＥ−Ａ３エピト
ープはＭＡＧＥ−Ａ３を発現しているいくつかのＤＰＢ１＊０４０４腫瘍細胞株
の表面にて認識される（図２０）。
【０１４７】 クローンＣ３．２２をまたその溶解活性について試験した。標的細胞を１時間 ５１ Ｃｒ−標識し、さまざまな効果器対標的比でＣＤ４クローンＣ３．２２と共
にインキュベートした。クロミウム放出を４時間後測定した。ＭＥＬはメラノー
マを意味する。自己ＥＢＶ−Ｂ細胞にまた融合タンパク質Iｉ−ＭＡＧＥ−Ａ３
をコードしているレトロウイルスを導入した。クローンＣ３．２２は融合タンパ
ク質Iｉ−ＭＡＧＥ−Ａ３をコードしているレトロウイルスを導入した自己ＥＢ
Ｖ−Ｂ細胞およびＭＡＧＥ−Ａ３を発現しているＨＬＡ−ＤＰ４メラノーマ細胞
株（ＬＢ１６２２−ＭＥＬ）両方を溶解した（図２１）。 本発明の他の観点は当業者に対して明らかになるであろうので、ここで繰り返
す必要ない。本明細書で引用したそれぞれの参考文献はそのすべてを参考文献と
して組み入れる。 使用した語句および表現は記述の語句として使用し、限定の語と使用したので
はなく、示され、記述された特徴の同等物またはその部分を除外したこのような
語および表現の使用を意図するものではなく、さまざまな改変が本発明の範囲内
で可能であることが認識されている。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＭＡＧＥ−Ａ３に特異的なＣＤ４Ｔ細胞系を取得するために用いられたプロト
コールの概略説明図である。
【図２】 ＣＤ４Ｔ細胞系Ｂ６およびＦ３が、プロセスされた組換えＨｉｓ−ＭＡＧＥ−
Ａ３タンパク質を有する自己由来のＥＢＶ−Ｂ細胞を認識したことを示している
グラフである。
【図３】 ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンによる、外来性のＨｉｓ−ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質
を用いてパルスされた自己由来のＥＢＶ−Ｂ細胞の認識が、抗ＨＬＡ ＤＲモノ
クローナル抗体により阻害されることを示しているグラフである。
【図４】 ＣＤ４＋クローン４３６／Ｂ６．３４（Ｂ６／３４）、４３６／Ｂ６．３７（
Ｂ６／３７）、Ｆ３／３７、およびＦ３／４０による認識についての、ＭＡＧＥ
−Ａ３ペプチドのスクリーニングを詳しく述べているグラフ。
【図５】 ペプチドＲＫＶＡＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲＡ（ＭＡＧＥ−Ａ３１１１〜１２６ 、配列番号：３）または、ＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲＡＲＥＰＶ（ＭＡＧＥ−Ａ３ １１５〜１３０ 、配列番号：４）を用いてパルスされたＣＤ４＋クローン４３６
／Ｂ６．３４（Ｂ６／３４）、４３６／Ｂ６．３７（Ｂ６／３７）ＥＢＶ−Ｂ細
胞によるＴＮＦおよびIＦＮ−γ産生の刺激を描いているグラフである。
【図６】 ＭＡＧＥ−Ａ３１１１〜１２６またはＭＡＧＥ−Ａ３１１５〜１３０を用いて
パルスされた自己由来のＥＢＶ−Ｂ細胞が、クローン４３６／Ｂ６．３４（Ｂ６
／３４）、４３６／Ｂ６．３７（Ｂ６／３７）の増殖を誘導したことを示すグラ
フである。
【図７】 ＣＤ４＋クローン４３６／Ｂ６．３７（Ｂ６／３７）のペプチドＭＡＧＥ−Ａ
３１１５〜１３０に対する応答がＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３０２に制限されること
を証明するグラフである。
【図８】 ＭＡＧＥ−Ａ３１１５〜１３０に由来する切断されたペプチドを用いてパルス
された自己由来のＥＢＶ−Ｂ細胞に対する、クローン４３６／Ｂ６．３７（Ｂ６
／３７の反応性を示すグラフである。
【図９Ａ】 樹状細胞によりプロセスされた外来性のＭＡＧＥ−Ａ３の、クローン３７に対
する提示を描いている。
【図９Ｂ】 樹状細胞によりプロセスされた外来性のＭＡＧＥ−Ａ３の、クローン３７に対
する提示を描いている。
【図１０】 ＣＤ４ Ｔ細胞クローン４３６／Ｂ６．３７による、形質導入されたＭＺ２Ｅ
ＢＶの認識を示す（抗ＭＡＧＥ−Ａ３．ＤＲ１３）。
【図１１】 ＣＴＬクローン４３４／１（抗ＭＡＧＥ−Ａ３．Ａ１）による、形質導入され
たＭＺ２ＥＢＶの認識を示す。
【図１２】 ＣＴＬ４３４／１（抗ＭＡＧＥ−Ａ３．Ａ１）による、形質導入されたＭＺ２
ＥＢＶの溶解を示す。
【図１３Ａ】 ＣＤ４ Ｔ細胞クローン４３６／Ｂ６．３７（抗ＭＡＧＥ−Ａ３．ＤＲ１３）
による、形質導入されたＭＺ２ＥＢＶの認識を示す。
【図１３Ｂ】 ＣＴＬクローン４３４／１（抗ＭＡＧＥ−Ａ３．Ａ１）による、形質導入され
たＭＺ２ＥＢＶの認識を示す。
【図１４】 不変鎖（Iｉ）とＬＡＭＰ−１ ＭＡＧＥ−Ａ３の融合タンパク質のレトロウイ
ルス性構築物の概略図である。
【図１５Ａ】 クローン２および２２がＨＬＡ−ＤＲとの関連においてＭＡＧＥ−Ａ３由来の
ペプチドを認識したことを示す。
【図１５Ｂ】 クローン２および２２がＨＬＡ−ＤＲとの関連においてＭＡＧＥ−Ａ３由来の
ペプチドを認識したことを示す。
【図１６】 ＭＡＧＥ−Ａ３（昆虫）およびＭＡＧＥ−Ａ３（細菌）タンパク質を用いて抗
ＭＡＧＥ−Ａ３ＣＤ４＋細胞クローンを取得するために用いられた方法の大要を
示す。
【図１７】 タンパク質ＭＡＧＥ−Ａ３と共にインキュベートされた自己由来のＥＢＶ−Ｂ
細胞を用いて刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞によるIＦＮ−γの産生を描いている。
【図１８Ａ】 ＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドがＣＤ４クローン４３および２２によって認識された
ことを証明している。（Ａ）二つの重複するＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドによるクロ
ーンＣ３．４３の刺激。
【図１８Ｂ】 ＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドがＣＤ４クローン４３および２２によって認識された
ことを証明している。（Ｂ）クローンＣ３．２２（ＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹ；
配列番号：８６）により認識される最も短いペプチドの滴定。
【図１９】 ＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドがＨＬＡ−ＤＰ分子によりクローンＣ３．２２へ提示
されることを示す。
【図２０】 ＭＡＧＥ−Ａ３を発現しているＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０４０１腫瘍細胞が、ＣＤ
４クローンＣ３．２２およびＣ３．４３により認識されることを証明する。
【図２１】 ＣＤ４クローンＣ３．２２の溶解活性を示す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年１月４日（２００１．１．４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【請求項６３】 ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが配列番
号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８および配列番号：
８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項６１に記載の単離
された抗原提示細胞。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年８月１０日（２００１．８．１０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１３６】 III．レトロウイルスの構築 組換え体レトロウイルス、ｐＭＦＧ−Iｉ８０−ＭＡＧＥ−Ａ３−（IＲＥＳ）
−ｔＮＧＦＲを構築した。神経増殖因子に対する低アフィニティーレセプターの
細胞外および膜貫通領域をコードしているｔＮＧＦＲ遺伝子断片を、親切にもＣ
．トラバーサリー（Ｃ．Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ）博士より提供されたプラスミド
ｐＵＣ１９−ｔＮＧＦＲより増幅した。ＰＣＲを以下のプライマーを使用して行
った。センス：５’−ＣＣＣＴＣＡＴＧＡＧＧＧＣＡＧＧＴＧＣＣＡＣＣＧ−３
’（配列番号：８８）、アンチセンス：５’−ＣＣＣＡＧＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧ
ＧＡＴＴＣＣＣＣＴＧＴＴＣＣＡＣ−３’（配列番号：８９）。 このＰＣＲにより開始コドン部位にＢｓｐＨ１部位および終止コドンの下流に
Ｂｇｌ２部位が導入される。３’末端付近のＢａｍＨ１部位は削除された。この
ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１内にクローン化し、配列決定した。ｔＮＧＦＲ遺伝子
断片をＢｓｐＨ１−Ｎｏｔ１（ｐＣＲ２．１ポリリンカーより）断片としてこの
ベクターより単離された。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１４２】 VII．ＣＤ４クローンＣ３．２２はＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０４０１上のＭＡＧＥ−
Ａ３ペプチドＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹ（配列番号：８６）を認識する 抗原性ペプチドを、ペプチドを１μｇ／ｍｌの濃度にて試験したことと、試験
を１００μｌ中で行ったことを除いて、上述のように同定した。ペプチドＬＧＤ
ＰＫＫＬＬＴＱＨＦＶＱＥＮ（配列番号：８２）、ＫＫＬＬＴＱＨＦＶＱＥＮＹ
ＬＥＹ（配列番号：８３）、ＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹＲＱＶＰ（配列番号：８
４）およびＶＱＥＮＹＬＥＹＲＱＶＰＧＳＤＰ（配列番号：８５）を試験した。
自己ＥＢＶ−Ｂ細胞を１時間、１μｇ／ｍｌのそれぞれのペプチドと共にインキ
ュベートした。ついでクローンＣ３．４３（３，０００細胞）を２０時間、２０
，０００ペプチドパルス細胞と共に共培養した。上清中のIＦＮ−γ産生をＥＬI
ＳＡによって測定した。２つのペプチド、すなわちＫＫＬＬＴＱＨＦＶＱＥＮＹ
ＬＥＹ（アミノ酸２４３−２５８；配列番号：８３）およびＴＱＨＦＶＱＥＮＹ
ＬＥＹＲＱＶＰ（アミノ酸２４７−２６２；配列番号：８４）がＣ３．４３と陽
性を示した（図１８Ａ）。その配列が２つの陽性１６アミノ酸ペプチドに含まれ
るような１２アミノ酸ペプチドの他の組を試験した。クローンＣ３．２２（４，
０００細胞）を２０時間１０，０００ペプチドパルス細胞と共培養した。ペプチ
ドＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹ（アミノ酸２４７−２５８；配列番号：８６）はク
ローンＣ３．２２によって認識された。明らかな認識がおよそ１０ｍＭではやく
も得られた（図１８Ｂ）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１４６】 VIII．腫瘍細胞株の直接認識 以上で、ＭＡＧＥタンパク質の細胞質または核局在にしたがって、ＨＬＡ−Ｄ
Ｒ１３上で認識されたＭＡＧＥ−Ａ３抗原は腫瘍細胞の表面で発現され得ないと
結論づけられた。もしこれがＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０４０１によって提示されたＭ
ＡＧＥ−Ａ３抗原の場合でもあったかどうかを決定するために、IＦＮ−γ（１
００Ｕ／ｍｌ）で４８時間前処理したまたはしない、ＭＡＧＥ−Ａ３（刺激細胞
；２０，０００）を発現しているＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０４０１腫瘍細胞を３，０
００のクローンＣ３．２２またはＣ．３．４３のＴ細胞と共に２０時間共培養し
た。上清中に放出されたIＦＮ−γをＥＬIＳＡによって測定した。図２０に示す
ように、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０４０１によって提示されたＭＡＧＥ−Ａ３エピト
ープはＭＡＧＥ−Ａ３を発現しているいくつかのＤＰＢ１＊０４０４腫瘍細胞株
の表面にて認識される（図２０）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/04 Ｃ０７Ｋ 7/08 ４Ｃ０８７ Ｃ０７Ｋ 7/06 14/82 ４Ｈ０４５ 7/08 16/32 14/82 Ｃ１２Ｑ 1/02 16/32 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ｅ (Ｃ１２Ｎ 5/06 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 シュトローバント，ヴィンセント ベルギー王国 ビー−1200ブリュッセル、 アベニュー ヒッポクラート 7459 (72)発明者 ブーン−ファロイア，ティエリー ベルギー王国 ビー−1200ブリュッセル、 アベニュー ヒッポクラート 7459 (72)発明者 ファン デル ブリュッゲン，ピエール ベルギー王国 ビー−1200ブリュッセル、 アベニュー ヒッポクラート 7459 (72)発明者 シュルツ，エルヴィン，エス． ベルギー王国 ビー−1200ブリュッセル、 アベニュー ヒッポクラート 7459 (72)発明者 ファン，スニック ベルギー王国 ビー−1200ブリュッセル、 アベニュー ヒッポクラート 7459 (72)発明者 レテ，ベルナルド ベルギー王国 ビー−1200ブリュッセル、 アベニュー ヒッポクラート 7459 (72)発明者 ティーレマンス，クリス ベルギー王国 ビー−1090ブリュッセル、 ラールビークラーン 103 (72)発明者 コルタルス，ユルゲン ベルギー王国 ビー−1090ブリュッセル、 ラールビークラーン 103 (72)発明者 ヘアーマン，カルロ ベルギー王国 ビー−1090ブリュッセル、 ラールビークラーン 103 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 BA36 BA44 CA04 CA07 DA02 DA03 DA06 EA02 EA04 FA02 GA11 GA13 HA01 HA03 4B063 QA01 QA19 QQ08 QQ13 QR33 QR48 QR60 QR72 QR80 QS05 QS36 QX02 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA05 DA14 4B065 AA94X AB01 BA02 BA05 BB19 CA24 CA25 4C084 AA02 AA07 AA17 AA19 BA02 BA08 BA09 CA62 DC50 ZB09 ZB26 4C087 AA01 BB37 ZB09 ZB26 4H045 AA11 AA20 AA30 BA01 BA15 BA16 BA17 CA40 DA76 DA86 EA28 EA51 FA72 FA74 GA26 【要約の続き】

Claims (63)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号：４１、配列番号：４２および配列番号：８６から
    なる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡク
    ラスII−結合ペプチド、または１つまたはそれ以上のアミノ酸の付加、置換また
    は欠失を含むその機能的な変異体。
  2. 【請求項２】 単離されたペプチドが、配列番号：２４、配列番号：２５、
    配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号
    ：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、
    配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号
    ：８３および配列番号：８４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請
    求項１に記載の単離されたＨＬＡクラスII−結合ペプチド。
  3. 【請求項３】 単離されたペプチドが、配列番号：２４、配列番号：２５、
    配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号
    ：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番号：３２、配列番号：３４、
    配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号
    ：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８
    ６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の単離され
    たＨＬＡクラスII−結合ペプチド。
  4. 【請求項４】 単離されたペプチドが、配列番号：２３、配列番号：３４、
    配列番号；３７、配列番号：３８および配列番号：８６からなる群より選択され
    るアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の単離されたＨＬＡクラスII−結合ペ
    プチド。
  5. 【請求項５】 単離されたペプチドがエンドソーム標的化シグナルを含む、
    請求項１に記載の単離されたＨＬＡクラスII−結合ペプチド。
  6. 【請求項６】 エンドソーム標的化シグナルが、ヒト不変鎖Ｉｉのエンドソ
    ーム標的化部分を含む、請求項５に記載の単離されたＨＬＡクラスII−結合ペプ
    チド。
  7. 【請求項７】 単離されたペプチドが加水分解されない、請求項１に記載の
    単離されたＨＬＡクラスII−結合ペプチド。
  8. 【請求項８】 単離されたペプチドが、Ｄ−アミノ酸を含むペプチド、−ｐ
    ｓｉ［ＣＨ２ＮＨ］−還元アミドペプチド結合を含むペプチド、−ｐｓｉ［ＣＯ
    ＣＨ２］−ケトメチレンペプチド結合を含むペプチド、−ｐｓｉ［ＣＨ（ＣＮ）
    ＮＨ］−（シアノメチレン）アミノペプチド結合を含むペプチド、−ｐｓｉ［Ｃ
    Ｈ２ＣＨ（ＯＨ）］−ヒドロキシエチレンペプチド結合を含むペプチド、−ｐｓ
    ｉ［ＣＨ２Ｏ］−ペプチド結合を含むペプチド、−ｐｓｉ［ＣＨ２Ｓ］−チオメ
    チレンペプチド結合を含むペプチドからなる群から選択される、請求項７に記載
    の単離されたＨＬＡクラスII−結合ペプチド。
  9. 【請求項９】 単離されたＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＡＬクラスI−結合ペプチド
    および単離されたＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドを含む組成物
    であって、単離されたＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが配列番
    号：４１、配列番号：４２および配列番号：８６からなる群から選択されるアミ
    ノ酸配列またはその機能的変異体を含む、組成物。
  10. 【請求項１０】 ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスI−結合ペプチドおよびＭ
    ＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドがポリトープポリペプチドとして
    結合する、請求項９に記載の組成物。
  11. 【請求項１１】 ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが、配列
    番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２
    ８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列
    番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３
    ８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列
    番号：８３、配列番号：８４および配列番号：８６からなる群より選択されるア
    ミノ酸配列からなる、請求項９に記載の組成物。
  12. 【請求項１２】 単離されたＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチ
    ドが、配列番号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８、配
    列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項９に記載
    の組成物。
  13. 【請求項１３】 単離されたＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチ
    ドがエンドソーム標的化シグナルを含む、請求項９に記載の組成物。
  14. 【請求項１４】 エンドソーム標的化シグナルがヒト不変鎖Ｉｉのエンドソ
    ーム標的化部分を含む、請求項１３に記載の組成物。
  15. 【請求項１５】 請求項１に記載のペプチド、請求項２に記載のペプチド、
    請求項３に記載のペプチド、請求項５に記載のペプチドからなる群より選択され
    るペプチドをコードしている単離された核酸。
  16. 【請求項１６】 核酸が配列番号：４３、配列番号：４４および配列番号：
    ８７からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項１５に記載の単離された
    核酸。
  17. 【請求項１７】 作動可能にプロモーターと連結した請求項１５に記載の単
    離された核酸を含んでいる発現ベクター。
  18. 【請求項１８】 核酸が配列番号：４３、配列番号：４４および配列番号：
    ８７からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１７に記載の発
    現ベクター。
  19. 【請求項１９】 ＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１分子
    をコードしている核酸をさらに含んでいる、請求項１７または１８に記載の発現
    ベクター。
  20. 【請求項２０】 請求項１７に記載の発現ベクター、請求項１８に記載の発
    現ベクター、および請求項１９に記載の発現ベクターからなる群より選択される
    発現ベクターでトランスフェクトまたは形質転換した宿主細胞。
  21. 【請求項２１】 請求項１７に記載の発現ベクター、請求項１８に記載の発
    現ベクターの群より選択される発現ベクターでトランスフェクトまたは、形質転
    換した宿主細胞であって、ＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１
    分子を発現している宿主細胞。
  22. 【請求項２２】 ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドに対して
    特異的なＣＤ４＋Ｔリンパ球でＴリンパ球の集団を選択的に豊富にする方法であ
    って、 Ｔリンパ球の単離された集団を、ＣＤ４＋Ｔリンパ球でＴリンパ球の単離され
    た集団を選択的に豊富にするのに充分な量でＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−
    結合ペプチドとＨＬＡクラスII分子との複合体を提示している試薬と接触させる
    ことを含み、ＨＬＡクラスII分子がＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子またはＨＬＡ−
    ＤＰＢ１分子であり、ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが配列番
    号：４１、配列番号：４２および配列番号：８６からなる群より選択されるアミ
    ノ酸配列を含む、前記方法。
  23. 【請求項２３】 ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが、配列
    番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２
    ８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列
    番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３
    ８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列
    番号：８４および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からな
    る、請求項２２に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが配列番
    号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８および配列番号：
    ８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項２２に記載の方法
    。
  25. 【請求項２５】 ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドがヒト不変
    鎖Ｉｉのエンドソーム標的化部分を含む、請求項２２に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特徴づけられる疾患の診断
    のための方法であって、 対象より単離された生物学的試料を、ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペ
    プチドに特異的である薬剤と接触させること、 疾患の決定として、薬剤とＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチド間の
    相互作用を測定することを含み、そこでＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合
    ペプチドが、配列番号：４１、配列番号：４２および配列番号：８６からなる群
    より選択されるアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む、方法。
  27. 【請求項２７】 ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが、配列
    番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２
    ８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列
    番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３
    ８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列
    番号：８４および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からな
    る、請求項２６に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが配列番
    号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８および配列番号：
    ８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項２６に記載の方法
    。
  29. 【請求項２９】 ＨＬＡクラスII分子と複合体を形成するＭＡＧＥ−Ａ３
    ＨＬＡクラスII結合ペプチドの発現によって特徴づけられる疾患の診断のための
    方法であって、 対象より単離された生物学的試料を、複合体に特異的である薬剤と接触させる
    こと、 疾患の決定として、薬剤とＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチド間の
    相互作用を測定すること を含み、そこでＨＬＡクラスII分子はＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子またはＨＬＡ
    −ＤＰＢ１分子であり、ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドは、配
    列番号：４１、配列番号：４２および配列番号：８６からなる群より選択される
    アミノ酸配列またはその機能的変異体を含む、前記方法。
  30. 【請求項３０】 ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが、配列
    番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２
    ８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列
    番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３
    ８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列
    番号：８４および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からな
    る、請求項２９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが配列番
    号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８および配列番号：
    ８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項２９に記載の方法
    。
  32. 【請求項３２】 ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特徴づけられる疾患を有す
    る対象を処置するための方法であって、 対象に、疾患を改善するのに充分な量のＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結
    合ペプチドを投与することを含み、ここでＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結
    合ペプチドが、配列番号：４１、配列番号：４２および配列番号：８６からなる
    群より選択されるアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む、前記方法。
  33. 【請求項３３】 ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドがエンドソ
    ーム標的化シグナルを含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 エンドソーム標的化シグナルが、ヒト不変鎖Ｉｉのエンド
    ソーム標的化部分を含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが、配列
    番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２
    ８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列
    番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３
    ８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列
    番号：８４および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からな
    る、請求項３２に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが配列番
    号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８および配列番号：
    ８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項３２に記載の方法
    。
  37. 【請求項３７】 ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特徴づけられる疾患を有す
    る対象を処置するための方法であって、 対象に、疾患を改善するのに充分な量のＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスI−結
    合ペプチドおよびＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドを投与するこ
    とを含み、 ここでＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが、配列番号：４１、
    配列番号：４２および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列ま
    たはその機能的変異体を含む、前記方法。
  38. 【請求項３８】 ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスI−結合ペプチドおよびＭ
    ＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドがポリトープポリペプチドとして
    結合する、請求項３７に記載の組成物。
  39. 【請求項３９】 ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドがエンドソ
    ーム標的化シグナルを含む、請求項３７に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 エンドソーム標的化シグナルが、ヒト不変鎖Ｉｉのエンド
    ソーム標的化部分を含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが、配列
    番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２
    ８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列
    番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３
    ８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列
    番号：８４および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からな
    る、請求項３７に記載の方法。
  42. 【請求項４２】 ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが配列番
    号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８および配列番号：
    ８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項３７に記載の方法
    。
  43. 【請求項４３】 ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特徴づけられる疾患を有す
    る対象を処置するための方法であって、 対象に、疾患を改善するのに充分な量の、対象内で選択的にＨＬＡクラスII分
    子とＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドの複合体の存在を豊富にす
    る薬剤を投与することを含み、 ここでＨＬＡクラスII分子はＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子またはＨＬＡ−ＤＰ
    Ｂ１分子であり、ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが、配列番号
    ：４１、配列番号：４２および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ
    酸配列またはその機能的変異体を含む、前記方法。
  44. 【請求項４４】 ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが、配列
    番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２
    ８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列
    番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３
    ８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列
    番号：８４および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からな
    る、請求項４３に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが配列番
    号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８および配列番号：
    ８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項４３に記載の方法
    。
  46. 【請求項４６】 薬剤がＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドを含
    む、請求項４３に記載の方法。
  47. 【請求項４７】 ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドが、エンド
    ソーム標的化シグナルを含む、請求項４６に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 エンドソーム標的化シグナルが、ヒト不変鎖Ｉｉのエンド
    ソーム標的化部分を含む、請求項４７に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特徴づけられる疾患を有す
    る対象を処置するための方法であって、 対象に、疾患を改善するのに充分な量の自己ＣＤ４＋Ｔリンパ球を投与するこ
    とを含み、ここでＣＤ４＋Ｔリンパ球がＨＬＡクラスII分子とＭＡＧＥ−Ａ３
    ＨＬＡクラスII−結合ペプチドの複合体に特異的であり、 ＨＬＡクラスII分子がＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１分
    子であり、ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが、配列番号：４１
    、配列番号：４２および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列
    またはその機能的変異体を含む、前記方法。
  50. 【請求項５０】 ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが、配列
    番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２
    ８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列
    番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３
    ８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列
    番号：８４および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からな
    る、請求項４９に記載の方法。
  51. 【請求項５１】 ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが配列番
    号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８および配列番号：
    ８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項４９に記載の方法
    。
  52. 【請求項５２】 ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドの機能的変
    異体を同定するために方法であって、 配列番号：４１、配列番号：４２および配列番号：８６からなる群より選択さ
    れるアミノ酸配列を含むＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチド、ＭＡＧ
    Ｅ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドと結合するＨＬＡクラスII結合分子およ
    びＨＬＡクラスII結合分子によって提示されたＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII
    結合ペプチドによって刺激されるＴ細胞を選択することを含み、 変異体ペプチドを調製するために、ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプ
    チドの第一アミノ酸残基を変異させること、 ＨＬＡクラスII結合分子に対する変異体ペプチドの結合およびＴ細胞の刺激を
    測定することを含み、ＨＬＡクラスII結合分子に対する変異体ペプチドの結合お
    よびＨＬＡクラスII結合分子によって提示された変異体ペプチドによるＴ細胞の
    刺激が、変異体ペプチドが機能的変異体であること示している、前記方法。
  53. 【請求項５３】 機能的変異体によるＴ細胞の刺激の効力の決定として、Ｍ
    ＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII結合ペプチドによるＴ細胞の刺激と、機能的変異
    体によるＴ細胞の刺激を比較する工程をさらに含む、請求項５２に記載の方法。
  54. 【請求項５４】 単離されたポリペプチドがＨＬＡクラスII分子である場合
    の、選択的に請求項３に記載のポリペプチドに結合する単離されたポリペプチド
    。
  55. 【請求項５５】 単離されたポリペプチドが抗体である、請求項５４に記載
    の単離されたポリペプチド。
  56. 【請求項５６】 抗体がモノクローナル抗体である、請求項５５に記載の抗
    体。
  57. 【請求項５７】 単離されたポリペプチドがＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ）２断片
    、またはＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドに選択的であるＣＤＲ
    ３領域を含む断片からなる群より選択される抗体断片である、請求項５４に記載
    の単離されたポリペプチド。
  58. 【請求項５８】 ＨＬＡクラスII分子およびＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラス
    II−結合ペプチドに選択的に結合する単離されたＣＤ４＋Ｔリンパ球であって、 ここでＨＬＡクラスII分子がＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子またはＨＬＡ−ＤＰ
    Ｂ１分子であり、ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが、配列番号
    ：４１、配列番号：４２および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ
    酸配列またはその機能的変異体を含む、前記単離されたＣＤ４＋Ｔリンパ球。
  59. 【請求項５９】 ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが配列番
    号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８
    、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番
    号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８
    、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列番
    号：８４および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる
    、請求項５８に記載の単離されたＣＤ４＋Ｔリンパ球。
  60. 【請求項６０】 ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが配列番
    号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８および配列番号：
    ８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項５８に記載の単離
    されたＣＤ４＋Ｔリンパ球。
  61. 【請求項６１】 ＨＬＡクラスII分子とＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−
    結合ペプチドの複合体を含む単離された抗原提示細胞であって、 ここでＨＬＡクラスII分子がＨＬＡ−ＤＲＢ１／１３分子またはＨＬＡ−ＤＰ
    Ｂ１分子であり、ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが、配列番号
    ：４１、配列番号：４２および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ
    酸配列またはその機能的変異体を含む、前記単離された抗原提示細胞。
  62. 【請求項６２】 ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが配列番
    号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８
    、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：２３、配列番
    号：３２、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８
    、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：８３、配列番
    号：８４および配列番号：８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる
    、請求項６１に記載の単離された抗原提示細胞。
  63. 【請求項６３】 ＭＡＧＥ−Ａ３ ＨＬＡクラスII−結合ペプチドが配列番
    号：２３、配列番号：３４、配列番号：３７、配列番号：３８および配列番号：
    ８６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項６１に記載の単離
    された抗原提示細胞。
JP2000574676A 1998-10-05 1999-09-15 Ｈｌａクラスｉｉ分子により提示されるｍａｇｅ−ａ３ペプチド Expired - Fee Related JP4102027B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/166,448 1998-10-05
US09/166,448 US6291430B1 (en) 1997-09-12 1998-10-05 Mage-3 peptides presented by HLA class II molecules
PCT/US1999/021230 WO2000020581A1 (en) 1998-10-05 1999-09-15 Mage-a3 peptides presented by hla class ii molecules

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2002526110A true JP2002526110A (ja) 2002-08-20
JP4102027B2 JP4102027B2 (ja) 2008-06-18

Family

ID=22603350

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000574676A Expired - Fee Related JP4102027B2 (ja) 1998-10-05 1999-09-15 Ｈｌａクラスｉｉ分子により提示されるｍａｇｅ−ａ３ペプチド

Country Status (7)

Country Link
US (3) US6291430B1 (ja)
EP (1) EP1119623B1 (ja)
JP (1) JP4102027B2 (ja)
AT (1) ATE427354T1 (ja)
AU (1) AU772720B2 (ja)
DE (1) DE69940671D1 (ja)
WO (1) WO2000020581A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010538633A (ja) * 2007-09-17 2010-12-16 オンコメチローム サイエンシズ ソシエテ アノニム Ｍａｇｅ−ａ発現の改良された検出
JP2017517260A (ja) * 2014-05-30 2017-06-29 アカデミア シニカＡｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ Ｍａｇｅ−ａ３ペプチド標的アプタマー及びその使用
JP2018519243A (ja) * 2015-03-27 2018-07-19 イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー 様々な腫瘍に対する免疫療法で使用される新規ペプチドおよびペプチドの組み合わせ
JP2020188764A (ja) * 2015-03-27 2020-11-26 イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー 様々な腫瘍に対する免疫療法で使用される新規ペプチドおよびペプチドの組み合わせ

Families Citing this family (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69533295T3 (de) * 1994-02-16 2009-07-16 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, The Department Of Health And Human Services Melanoma-assoziierte Antigene, Epitope davon und Impstoffe gegen Melanoma
US20040156861A1 (en) * 1996-07-11 2004-08-12 Figdor Carl Gustav Melanoma associated peptide analogues and vaccines against melanoma
US7888100B2 (en) * 1996-10-03 2011-02-15 Memorial Sloan-Kettering Cancer Research Isolated nucleic acid molecules which encode immunogenic portions of NY-ESO-1 protein
HU228467B1 (en) * 1998-02-05 2013-03-28 Smithkline Beecham Biolog Tumor-associated antigen derivatives from the mage family, and nucleic acid sequences encoding them, used for the preparation of fusion proteins and of compositions for vaccination
US20030138808A1 (en) * 1998-02-19 2003-07-24 Simard John J.L. Expression vectors encoding epitopes of target-associated antigens
IT1312568B1 (it) * 1999-05-21 2002-04-22 Genera Spa Peptidi immunogenici e loro uso.
US7429639B2 (en) 1999-09-29 2008-09-30 Ludwig Institute For Cancer Research SSX-2 peptides presented by HLA class II molecules
US20030215425A1 (en) * 2001-12-07 2003-11-20 Simard John J. L. Epitope synchronization in antigen presenting cells
DE60124899T2 (de) * 2000-05-10 2007-08-16 Sanofi Pasteur Ltd., Toronto Durch mage minigene kodierte immunogene polypeptide und ihre verwendungen
US7049413B2 (en) * 2001-05-18 2006-05-23 Ludwig Institute For Cancer Research MAGE-A3 peptides presented by HLA class II molecules
US20030113919A1 (en) * 2001-08-17 2003-06-19 Aventis Pasteur, Ltd. Immunogenic targets for melanoma
US20030232013A1 (en) * 2002-02-22 2003-12-18 Gary Sieckman Therapeutic and diagnostic targeting of cancers cells with tumor homing peptides
DE10213493A1 (de) * 2002-03-26 2003-10-16 Stephan Grabbe Verfahren zur Aktivierung von dendritischen Zellen
FR2837837B1 (fr) * 2002-03-28 2006-09-29 Roussy Inst Gustave Epitopes peptidiques communs a des antigenes d'une meme famille multigenique
US20030206916A1 (en) * 2002-05-03 2003-11-06 Rush-Presbyterian-St. Luke's Medical Center Immunogenic peptides
US7041502B2 (en) * 2002-06-05 2006-05-09 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated peptides which bind to HLA-B18 molecules and uses thereof
US7812116B2 (en) * 2003-07-03 2010-10-12 Rush University Medical Center Immunogenic peptides
WO2005010190A1 (en) 2003-07-22 2005-02-03 Ludwig Institute For Cancer Research Ssx-2 peptides presented by hla class ii molucules
GB0323968D0 (en) * 2003-10-13 2003-11-19 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic compositions
EP1677820B1 (en) * 2003-10-15 2012-04-04 Istituto Superiore Di Sanita' Colorectal cancer antigen
US20070154889A1 (en) * 2004-06-25 2007-07-05 Veridex, Llc Methods and reagents for the detection of melanoma
US20090169573A1 (en) * 2004-10-20 2009-07-02 Erwin Schultz T-Cell Stimulatory Peptides From The Melanoma-Associated Chondroitin Sulfate Proteoglycan And Their Use
CA2523032A1 (en) * 2005-10-07 2007-04-07 Immunovaccine Technologies Inc. Vaccines for cancer therapy
WO2008053573A1 (fr) 2006-10-30 2008-05-08 National University Corporation Hokkaido University Remède pour néoplasme malin
AU2008303023B2 (en) 2007-09-27 2014-01-09 Immunovaccine Technologies Inc. Use of liposomes in a carrier comprising a continuous hydrophobic phase for delivery of polynucleotides in vivo
US20100209452A1 (en) * 2007-10-03 2010-08-19 Immunovaccine Technologies, Inc Compositions comprising an antigen, an amphipathic compound and a hydrophobic carrier, and uses thereof
US20110070298A1 (en) * 2008-06-05 2011-03-24 Immunovaccine Technologies Inc. Compositions Comprising Liposomes, An Antigen, A Polynucleotide and A Carrier Comprising a Continuous Phase of a Hydrophobic Substance
WO2012088414A1 (en) 2010-12-23 2012-06-28 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Liposomal formulation of nonglycosidic ceramides and uses thereof
CA2850857C (en) 2011-10-06 2022-07-26 Immunovaccine Technologies Inc. Liposome compositions comprising an adjuvant that activates or increases the activity of tlr2 and uses thereof
PT2785683T (pt) 2011-11-30 2020-04-16 Ludwig Inst For Cancer Res Ltd Moduladores de célula inkt e métodos para o seu uso
ES2694203T3 (es) 2012-03-08 2018-12-19 Ludwig Institute For Cancer Research Limited Anticuerpos específicos del Tgf-1 y métodos y usos de los mismos
EP2822871A4 (en) 2012-03-08 2015-12-09 Selig Sealing Products Inc RECEIVER SEALING ELEMENT WITH PROTECTED SECURITY COMPONENT AND OPENING TAB
US9895549B2 (en) 2012-11-06 2018-02-20 The Florida International University Board Of Trustees On-demand drug release using magneto-electric nanoparticles
WO2014074584A1 (en) 2012-11-06 2014-05-15 Sakhrat Khizroev On-demand drug release using magneto-electric nanoparticles
WO2016094309A1 (en) 2014-12-10 2016-06-16 Myosotis Inhibition of tnf signaling in cancer immunotherapy
WO2016201282A2 (en) 2015-06-12 2016-12-15 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd TGF-β3 SPECIFIC ANTIBODIES AND METHODS AND USES THEREOF
EP3943098A3 (en) 2015-07-16 2022-05-11 Biokine Therapeutics Ltd. Compositions and methods for treating cancer
GB201519340D0 (en) 2015-11-02 2015-12-16 Cambridge Entpr Ltd Methods of T-lymphocyte expansion
GB201519481D0 (en) 2015-11-04 2015-12-16 Cancer Rec Tech Ltd Immunomodulatory antibodies
GB201616238D0 (en) 2016-09-23 2016-11-09 Adaptimmune Ltd Modified T cells
AU2018205890B2 (en) 2017-01-05 2021-09-02 Kahr Medical Ltd. A sirpalpha-41BBL fusion protein and methods of use thereof
GB201700345D0 (en) 2017-01-09 2017-02-22 F-Star Beta Ltd Conditional agonists of immune responses
IL250916A0 (en) 2017-03-02 2017-06-29 Geiger Benjamin Methods for growing t cells in culture and their use
WO2018226931A1 (en) * 2017-06-07 2018-12-13 David Weiner Mage-a vaccines and methods of treatment using the same
US20210187023A1 (en) 2017-06-27 2021-06-24 The Trustees Of Princeton University Compositions And Methods For Enhancing Immunotherapy
GB201713078D0 (en) 2017-08-15 2017-09-27 Adaptimmune Ltd T Cell Modification
CA3081479A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd Method for expansion of lymphocytes
JP2021515588A (ja) 2018-01-26 2021-06-24 ケンブリッジ エンタープライズ リミティッド ペプチド交換蛋白質
JP7491495B2 (ja) 2018-07-11 2024-05-28 カール メディカル リミテッド ＳＩＲＰα－４－１ＢＢＬバリアント融合タンパク質及びその使用方法
GB201811408D0 (en) 2018-07-12 2018-08-29 F Star Beta Ltd CD137 Binding Molecules
GB201811404D0 (en) 2018-07-12 2018-08-29 F Star Beta Ltd Anti-CD137 Antibodies
GB201811410D0 (en) 2018-07-12 2018-08-29 F Star Beta Ltd OX40 Binding molecules
CN109081873B (zh) * 2018-08-10 2022-04-22 固安鼎泰海规生物科技有限公司 一种抗肿瘤重组nmm融合抗原质粒dna疫苗
CN108949662A (zh) * 2018-08-10 2018-12-07 固安鼎泰海规生物科技有限公司 一种用于裸质粒pSFVK1-NMM生产的大肠杆菌发酵培养基
US20210379109A1 (en) 2018-08-24 2021-12-09 The Trustees Of Princeton University Immunotherapy with metabolic enzyme expression
EP3877053A1 (en) 2018-11-05 2021-09-15 Ludwig Institute for Cancer Research Ltd Humanized and variant tgf-beta3 specific antibodies and methods and uses thereof
WO2020095113A1 (en) 2018-11-05 2020-05-14 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd Humanized and variant tgf-beta1 specific antibodies and methods and uses thereof
GB201820444D0 (en) 2018-12-14 2019-01-30 Adaptimmune Ltd Marker for T cell expansion
EP3997114A1 (en) 2019-07-11 2022-05-18 KAHR Medical Ltd. Heterodimers and methods of use thereof
GB201911954D0 (en) 2019-08-20 2019-10-02 Adaptimmune Ltd Lentiviral transduction methods
US20230048361A1 (en) 2019-12-31 2023-02-16 Kahr Medical Ltd. Methods of culturing t cells and uses of same
US20230048719A1 (en) 2019-12-31 2023-02-16 Kahr Medical Ltd. Methods of culturing t cells with a 4-1bbl fusion polypeptide and uses of same
IL276599A (en) 2020-08-09 2022-03-01 Yeda Res & Dev T cell receptor unique to mage-a1 and its uses
WO2023222829A1 (en) 2022-05-17 2023-11-23 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois Designed biosensors for enhanced t cell therapy

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9019409D0 (en) 1990-09-05 1990-10-17 Pfizer Ltd Therapeutic agents
US5342774A (en) 1991-05-23 1994-08-30 Ludwig Institute For Cancer Research Nucleotide sequence encoding the tumor rejection antigen precursor, MAGE-1
US6235525B1 (en) 1991-05-23 2001-05-22 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecules coding for tumor rejection antigen precursor MAGE-3 and uses thereof
US5405940A (en) 1992-08-31 1995-04-11 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nonapeptides derived from MAGE genes and uses thereof
EP0703783B1 (en) 1993-03-05 2010-05-05 Epimmune Inc. Methods of making immunogenic hla-a2.1 binding peptides
US5851523A (en) 1994-03-24 1998-12-22 Ludwig Institute For Cancer Research. Isolated, peptides derived from MAGE tumor rejection antigen precursors which complex with HLA-A2 molecules and uses thereof
US5585461A (en) 1994-03-24 1996-12-17 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated, MAGE-3 derived peptides which complex with HLA-A2 molecules and uses thereof
US5686068A (en) 1994-03-24 1997-11-11 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated peptides derived from MAGE-2, cytolytic T cells specific to complexes of peptide and HLA-A2 molecules, and uses thereof
AU723355B2 (en) * 1996-05-23 2000-08-24 Scripps Research Institute, The MHC class II antigen presenting systems and methods for activating CD4+ T cells
US5965535A (en) 1997-09-12 1999-10-12 Ludwig Institute For Cancer Research Mage-3 peptides presented by HLA class II molecules
AU6465598A (en) 1998-03-13 1999-09-27 Epimmune, Inc. Hla-binding peptides and their uses

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010538633A (ja) * 2007-09-17 2010-12-16 オンコメチローム サイエンシズ ソシエテ アノニム Ｍａｇｅ−ａ発現の改良された検出
JP2017517260A (ja) * 2014-05-30 2017-06-29 アカデミア シニカＡｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ Ｍａｇｅ−ａ３ペプチド標的アプタマー及びその使用
JP2018519243A (ja) * 2015-03-27 2018-07-19 イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー 様々な腫瘍に対する免疫療法で使用される新規ペプチドおよびペプチドの組み合わせ
JP2020188764A (ja) * 2015-03-27 2020-11-26 イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー 様々な腫瘍に対する免疫療法で使用される新規ペプチドおよびペプチドの組み合わせ
JP7217981B2 (ja) 2015-03-27 2023-02-06 イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー 様々な腫瘍に対する免疫療法で使用される新規ペプチドおよびペプチドの組み合わせ

Also Published As

Publication number Publication date
US20030170792A1 (en) 2003-09-11
JP4102027B2 (ja) 2008-06-18
US6426217B1 (en) 2002-07-30
WO2000020581A1 (en) 2000-04-13
ATE427354T1 (de) 2009-04-15
DE69940671D1 (de) 2009-05-14
EP1119623B1 (en) 2009-04-01
US6291430B1 (en) 2001-09-18
AU6042099A (en) 2000-04-26
US7252825B2 (en) 2007-08-07
AU772720B2 (en) 2004-05-06
EP1119623A1 (en) 2001-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4102027B2 (ja) Ｈｌａクラスｉｉ分子により提示されるｍａｇｅ−ａ３ペプチド
JP4106179B2 (ja) Ｈｌａクラスｉｉ分子により提示されるｍａｇｅ−３ペプチド
JP4652390B2 (ja) Ｈｌａクラスｉｉ分子により提示されるｍａｇｅ−ａ１ペプチド
US7371845B2 (en) MAGE-A3 peptides presented by HLA class II molecules
US7311914B2 (en) MAGE-A4 antigenic peptides and uses thereof
JP2003512057A (ja) Ｍａｇｅ−ａ１２抗原ペプチド及びその利用
US6716809B1 (en) Mage-A3 peptides presented by HLA class molecules
AU3237300A (en) Tyrosine kinase receptor epha3 antigenic peptides
AU2002339748A1 (en) MAGE-A3 peptides presented by HLA class II molecules

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20031202

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20040302

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20040309

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20040525

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20060829

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20061129

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20061206

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20070228

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20070731

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20071029

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20071105

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20080129

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20080304

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20080321

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110328

Year of fee payment: 3

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130328

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140328

Year of fee payment: 6

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees