ES2694203T3 - Anticuerpos específicos del Tgf-1 y métodos y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Una molécula de anticuerpo aislado o fragmento del mismo que reconoce el factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-ß1) humano y de ratón, no reacciona con el TGF-ß2 o TGF-ß3, y neutraliza la actividad del TGF-ß1; y que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias de dominio CDR CDR1 GYTFTNYW (SEQ ID NO: 11)_o GYTFTNYWMH (SEQ ID NO: 3), CDR2 IYPGNSDT (SEQ ID NO: 12) o TIYPGNSDTN (SEQ ID NO: 4)_ y CDR3 EDSRSLYYNGWDYFDY (SEQ ID NO: 5) y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de dominio CDR CDR1 ESVDNYGISF (SEQ ID NO: 6), CDR2 YAAS (SEQ ID NO: 7) y CDR3 QQSKEVPRT (SEQ ID NO: 8).

Description

DESCRIPCION

Anticuerpos especfficos del Tgf-1 y metodos y usos de los mismos

5 La presente invencion se refiere a anticuerpos y fragmentos de los mismos, que se unen al factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-p1), en particular, que reconocen el TGF-p1 humano y de raton y no reconocen o unen el TGF-p2 o TGF-p3. Se proporcionan anticuerpos concretos que reconocen y neutralizan especfficamente el TGF-p1. Estos anticuerpos son utiles en el diagnostico y tratamiento de afecciones asociadas a TGF-p1 activado o elevado, incluyendo el cancer, y para modular los inmunocitos y la respuesta inmune, incluyendo la respuesta inmune al cancer 10 o los antfgenos cancerosos. Los anticuerpos, regiones variables o secuencias de dominio CDR de los mismos, y fragmentos de los mismos de la presente invencion tambien se pueden usar en terapia en combinacion con quimioterapeuticos, inmunomoduladores, vacunas contra el cancer, antfgenos cancerosos o agentes anticancerfgenos y/o con otros anticuerpos o fragmentos de los mismos.

15 ANTECEDENTES DE LA INVENCION

El factor de crecimiento transformante beta (TGFp) regula procesos celulares normales tales como la proliferacion, diferenciacion y apoptosis, asf como la capacidad de invasion y la diseminacion metastasica de las celulas cancerosas. La familia TGF Beta incluye los factores de crecimiento transformante beta 1,2, y 3 (TGF-p1, TGF-p2 y TGF-p3), que 20 son citoquinas sumamente pleiotropicas que segregan virtualmente todas las celulas. Las moleculas de TGF-p actuan como interruptores celulares que regulan procesos tales como la funcion inmune, la proliferacion y la transicion epitelio- mesenquima. El TGF-p1 juega un papel importante en el control del sistema inmune. El TGF-p1 es liberado por algunas celulas T, las celulas T reguladoras (Treg), para inhibir las acciones de otras celulas T. El TGF-p1 impide la activacion de las celulas T auxiliares y las celulas T citotoxicas quiescentes y puede inhibir la secrecion y actividad de 25 citoquinas tales como el IFN-y, la IL-2 y el TNF-a (Wahl S y col. (1988) J Immunol 140(9):3026-3032; Tiemessen M y col. (2003) Int Immunol 15(12):1495-1504; Wahl S y col. (2006) Immunol Rev 213:213-227).

TGFp en el cancer

30 El TGF-p es tanto un supresor tumoral como un promotor tumoral. De hecho, la perdida o atenuacion de la senalizacion del TGF-p en las celulas epiteliales y el estroma permite la transformacion de las celulas epiteliales (Siegel, P.M. y Massague, J. (2003) Nat Rev Cancer 3:807-820; Bierie, B. and Moses, H.L. (2006) Nat Rev Cancer 6:506-520). Por otro lado, la introduccion de receptores dominantes negativos del TGF-p en celulas cancerosas metastasicas ha demostrado inhibir la transdiferenciacion epitelio-mesenquima, motilidad, capacidad de invasion y supervivencia, lo 35 que respalda el papel de promotor tumoral del TGF-p en celulas totalmente transformadas (examinado por Dumont, N. y Arteaga, C.L. (2003) Cancer Cell 3:531-536). Ademas, la produccion y/o activacion excesiva del TGF-p por las celulas cancerosas puede contribuir a la progresion tumoral mediante mecanismos que implican la modulacion del microentorno tumoral (Siegel, P.M. y Massague, J. (2003) Nat Rev Cancer 3:807-820; Wakefield, L.M., y Roberts, A.B. (2002) Curr Opin Genet Dev 12:22-29; Arteaga, C.L. (2006) Curr Opin Genet Dev 16:30-37). Estos datos han 40 proporcionado una justificacion logica del bloqueo de la senalizacion autocrina/paracrina del TGF-p en los canceres humanos con un proposito terapeutico. Algunos tumores resistentes a la quimioterapia anticancerfgena convencional sobreexpresan los TGF-p (Lui, P y col. (2000) Int J Oncol 16:599-610; Teicher, B.A. y col. (1997) In Vivo 11:453-461), y los inhibidores de los TGF-p han demostrado revertir esta resistencia (Teicher, B.A. Y col. (1997) In Vivo 11:463472). Ademas, se ha notificado sobreexpresion de ligandos del TGF-p en la mayorfa de los canceres, y los altos niveles 45 de estos en los tejidos tumorales y/o el suero estan asociados a recidiva metastasica temprana y/o mala evolucion del paciente (Wojtowicz-Praga, S. (2003) Invest New Drugs 21:21-32; Ito, N., y col. (1995) Cancer Lett 89:45-48; Shariat, S.F. y col. (2001) Cancer 92:2985-2992; Shariat, S.F. Y col. (2001) J Clin Oncol 19:2856-2864; Tsushima, H. y col. (2001) Clin Cancer Res 7:1258-1262; Rich, J.N. (2003) Front Biosci 8:e245-e260). Los estudios en animales con anticuerpo pan-TGF-p han demostrado inhibicion de la recidiva o metastasis tumoral en el fibrosarcoma, cancer de 50 colon y cancer de mama (Terabe M y col. (2003) J Exp Med 198:1741-1752; Nam J-S y col. (2008) Cancer Res 68(10):3835-3843) y reducida aceleracion inducida por la radiacion del cancer de mama metastasico (Biswas S y col. (2007) 117:1305-1313). Cabe destacar que, en estudios de radiacion, la radiacion toracica y la quimioterapia en modelos de cancer de mama metastasico inducfan especfficamente niveles de TGF-p1 plasmaticos (Biswas S y col. (2007) 117:1305-1313).

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TGF-p e inmunomodulacion

El tratamiento de inmunoterapia contra el cancer efectivo depende de la induccion de una respuesta integrada y duradera a los antfgenos cancerosos. Las pruebas indican que esto se puede conseguir superando el medio 60 inmunosupresor presente en el microentorno tumoral atribuido a la inmunosupresion mediada por TGFp. Por ejemplo,

el TGFp suprime tanto el brazo innato como el adaptativo de la respuesta inmune. En lo que respecta a la respuesta inmune innata, el TGFp modula la actividad citolftica de las celulas NK. Asimismo, el TGFp tambien inhibe la maduracion de las CD y la produccion de citoquinas, favoreciendo de ese modo un entorno tolerogenico. Ademas, el TGFp producido por las CD tolerogenicos contribuye a la diferenciacion de las celulas Treg. El TGFp tambien puede 5 favorecer la diferenciacion del linaje macrofago, una celula M2, que produce altos niveles de TGFp. El macrofago M2 compite con las CD por el antfgeno, pero no las presenta. En lo que respecta a la respuesta inmune adaptativa, el TGFp mitiga la funcion de las celulas CD8 y CD4 efectoras inhibiendo la actividad de las T auxiliares y los CTL y favoreciendo la apoptosis de las celulas T efectoras. Se ha demostrado que la sobreproduccion de TGF-p por las celulas tumorales y las celulas supresoras derivadas de mieloides Gr1+CD11b+ lleva a la evasion de la vigilancia 10 inmune del huesped y a la progresion tumoral (Yang L y col. (2010) J Bone Miner Res 25(8):1701-1706). El TGF-p1 asociado a la membrana contribuye al bloqueo de la activacion de las celulas T de memoria que existen en un estado anergico en el interior del microentorno tumoral (Broderick L. y col. Banket RB (2006) J Immunol 177:3082-3088). La inhibicion de los CTL mediada por TGF durante la inmunidad antitumoral funciona mediante diversos mecanismos. Por ejemplo, el TGFp inhibe directamente la funcion de los CTL suprimiendo la expresion de varios genes citoltticos, 15 incluyendo los genes que codifican la granzima A, granzima B, el iFNG y el ligando FAS. El TGFp tambien atenua la funcion efectora de las celulas T CD8 de memoria espedficas de antfgeno y bloquea la senalizacion por TCR de los linfocitos infiltrantes de tumor y altera la produccion de citoquinas en las celulas T CD8 (Ahmadzadeh, M. y Rosenberg, S. A. (2005) J. Immunol. 174:5215-5223, diBari, M. G. y col. (2009) Cancer Immunol Immunother 58:1809-1818).

20 Ademas de desactivar la respuesta inmune, el TGFp favorece la diferenciacion de las celulas T reguladoras (Treg) y recluta su migracion al sitio tumoral. En los canceres humanos, los datos recogidos demuestran que las Treg CD4+FOXP3+ estan presentes en sitios tumorales locales. Sato y col. han demostrado que la proporcion de celulas T CD8+ a Treg CD4+CD25+FOXP3+ es un indicador pronostico importante, con una proporcion baja asociada a una mala evolucion en pacientes con cancer ovarico, lo que indica el papel esencial de las Treg en las respuestas inmunes 25 antitumorales protectoras (Sato, E y col. (2005) PNAS 102(51):18538-18543). Teniendo en cuenta la importancia de las Treg en la supresion de las respuestas inmunes antitumorales, el control de las Treg es un objetivo importante y clmicamente relevante. El TGF beta induce el desarrollo de las celulas Treg. Como las Treg suprimen la inmunidad antitumoral, se evalua una reduccion en el porcentaje de Treg en la sangre periferica y el sitio tumoral como biomarcador para una terapia inmune efectiva.

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El bloqueo de la senalizacion del TGFp lleva a la mejora de la actividad antitumoral mediada por NK y CTL (Arteaga CL y col. (1993) J Clin Invest 92:2569-76; Bollard CM y col. (2002) Blood 99:1379-87). En estudios en ratones, se ha demostrado que la transferencia adoptiva de celulas T CD8+ insensibles al TGF-p reactivas a tumor, que se hicieron insensibles mediante terapia genica mediada por retrovirales con un receptor de TGF-p dominante negativo, a ratones 35 inmunocompetentes era capaz de erradicar la metastasis al pulmon del cancer de prostata en raton (Zhang Q, y col. (2005) Cancer Res 65:1761-9; Zhang, Q y col. (2006) Mol Cancer Ther 5:1733-1743). El bloqueo generico de la respuesta del TGF-p en ratones inhibio la metastasis en el cancer de prostata, pero llevo a enfermedad inflamatoria generalizada en los animales (Shah AH y col. (2002) J Immunol 169:3485-91).

40 Direccionamiento al TGFp con anticuerpos neutralizantes para mejorar la inmunoterapia contra el cancer

La evidencia de produccion de TGFp por las celulas tumorales y las celulas supresoras derivadas de mieloides (MDSC) presentes en el sitio tumoral junto con la actividad inmunosupresora del TGFp en el sitio tumoral respaldan claramente el hecho de que el bloqueo del TGFp puede mejorar la captacion, presentacion y activacion de la respuesta inmune 45 antitumoral al antfgeno mediada por las vacunas terapeuticas. De hecho, estudios recientes han demostrado que el bloqueo del TGF-p, usando anticuerpo generico de TGF-p de raton 1D11 (que reconoce el TGF-p1, TGF-p2 y TGF- p3), mejora sinergicamente las vacunas tumorales en modelos animales a traves de las celulas T CD8+ (Terabe M y col. (2009) Clin Cancer Res 15:6560-6569; Takaku S y col. (2010) Int J Cancer 126(7):1666). La evaluacion de indicadores inmunologicos tales como una activacion de las celulas T efectoras en el interior del compartimento tumoral 50 en pacientes que reciben estas terapias puede servir como biomarcador o biofirma para monitorizar la muerte inmunomediada de celulas tumorales y la respuesta a la terapia.

Las isoformas del TGFP (p1, p2 y p3) estan implicadas en muchos procesos biologicos; por lo tanto, los anticuerpos que unen las tres isoformas del TGFp pueden potenciar la toxicidad autoinmune. Para minimizar la toxicidad, los 55 anticuerpos que se unen espedficamente al TGFp1 pueden ser mejor tolerados. El tratamiento del cancer u otros trastornos mediados por TGFp se puede mejorar mediante el uso de un anticuerpo de neutralizacion que solo se una al TGFp-1.

Por consiguiente, sena deseable desarrollar anticuerpos espedficos del TGFp-1, en particular, anticuerpos que se 60 puedan utilizar en modelos animales de raton y que muestren una mayor eficacia y aplicabilidad en el diagnostico y la

terapia, y la presente invencion esta dirigida al logro de ese objetivo. El documento WO 2006/116002 hace algun progreso hacia este objetivo, ya que se refiere a anticuerpos que se unen preferentemente al TGFp1, en comparacion con el TGFp1 y TGFp3 latentes.

5 La mencion de referencias en el presente documento no se debe interpretar como una admision de que tales sean tecnica anterior a la presente invencion.

RESUMEN DE LA INVENCION

10 En un aspecto general, la presente invencion proporciona una molecula de anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que reconoce el factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-p1) humano y de raton, no reacciona con el TGF-p2 o TGF-p3 y neutraliza la actividad del TGF-p1; y que comprende una region variable de cadena pesada que comprende las secuencias de dominio CDR CDR1 GYTFTNYW (SEQ ID NO: 11)_o GYTFTNYWMH (SEQ ID NO: 3), CDR2 IYPGNSDT (SEQ ID NO: 12) o TIYPGNSDTN (SEQ ID NO: 4)_ y CDR3 EDSRSLYYNGWDYFDY (SEQ ID NO: 15 5) y una region variable de cadena ligera que comprende las secuencias de dominio CDR CDR1 ESVDNYGISF (SEQ ID NO: 6), CDR2 YAAS (SEQ ID NO: 7) y CDR3 QQSKEVPRT (SEQ ID NO: 8).

La invencion proporciona anticuerpos dirigidos especfficamente contra el factor de crecimiento transformante (TGF) beta 1 (TGFp1) para fines diagnosticos y terapeuticos. Los anticuerpos de la presente invencion tienen uso diagnostico 20 y terapeutico en el cancer y la inmunomodulacion, incluyendo la modulacion de la respuesta inmune al cancer, y en vacunas contra el cancer. Los anticuerpos de la invencion son aplicables en la caracterizacion y modulacion de la actividad del TGF-p1, en particular, en la neutralizacion de la actividad del TGF-p1.

En un aspecto concreto, los anticuerpos de la invencion son aplicables en el tratamiento, la gestion y/o la prevencion 25 de canceres, incluyendo en la recidiva y metastasis del cancer. Los anticuerpos son aplicables para usos relativos al cancer, incluyendo carcinoma adrenocortical, canceres relacionados con el SIDA, linfoma relacionado con el SIDA, cancer anal, cancer anorrectal, cancer del canal anal, cancer de apendice, astrocitoma cerebeloso infantil, astrocitoma cerebral infantil, cancer de celulas basales, cancer de piel (no melanoma), cancer biliar, cancer del conducto biliar extrahepatico, cancer del conducto biliar intrahepatico, cancer de vejiga, cancer de la vejiga urinaria, cancer de hueso 30 y articulaciones, osteosarcoma e histiocitoma fibroso maligno, cancer de cerebro, tumor cerebral, cancer del tronco encefalico, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral/glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodermicos primitivos supratentoriales, glioma hipotalamico y de las vfas opticas centrales, cancer de mama, adenomas/carcinoides bronquiales, tumor carcinoide, gastrointestinal, cancer del sistema nervioso, linfoma del sistema nervioso, cancer del sistema nervioso central, linfoma del sistema nervioso central, cancer cervical, canceres 35 infantiles, leucemia linfocftica cronica, leucemia mielogena cronica, trastornos mieloproliferativos cronicos, cancer de colon, cancer colorrectal, linfoma de celulas T cutaneo, neoplasia linfoide, micosis fungoide, sfndrome de Seziary, cancer endometrial, cancer esofagico, tumor de celulas germinales extracraneal, tumor de celulas germinales extragonadal, cancer del conducto biliar extrahepatico, cancer de ojo, melanoma intraocular, retinoblastoma, cancer de la vesfcula biliar, cancer gastrico (estomago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumor de estroma gastrointestinal 40 (TEGI), tumor de celulas germinales, tumor de celulas germinales del ovario, tumor trofoblastico gestacional, glioma, cancer de cabeza y cuello, cancer hepatocelular (hfgado), linfoma de Hodgkin, cancer hipofarfngeo, melanoma intraocular, cancer ocular, tumores de las celulas de los islotes (pancreas endocrino), sarcoma de Kaposi, cancer de rinon, cancer renal, cancer de rinon, cancer de laringe, leucemia linfoblastica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocftica cronica, leucemia mielogena cronica, leucemia de celulas pilosas, cancer de labio y cavidad oral, 45 cancer de hfgado, cancer de pulmon, cancer de pulmon de celulas no pequenas, cancer de pulmon de celulas pequenas, linfoma relacionado con el SIDA, linfoma no Hodgkiniano, linfoma primario del sistema nervioso central, macroglobulinemia de Waldenstram, meduloblastoma, melanoma, melanoma intraocular (ojo), carcinoma de las celulas de Merkel, mesotelioma maligno, mesotelioma, cancer escamoso metastasico de cuello, cancer de boca, cancer de lengua, sfndrome de neoplasia endocrina multiple, micosis fungoide, sfndromes mielodisplasicos, 50 enfermedades mielodisplasicas/mieloproliferativas, leucemia mielogena cronica, leucemia mieloide aguda, mieloma multiple, trastornos mieloproliferativos cronicos, cancer nasofarfngeo, neuroblastoma, cancer oral, cancer de la cavidad oral, cancer orofarfngeo, cancer ovarico, cancer epitelial de ovario, tumor ovarico de bajo potencial de malignidad, cancer pancreatico, cancer pancreatico de los islotes, cancer de seno paranasal y de la cavidad nasal, cancer paratiroideo, cancer de pene, cancer farfngeo, feocromocitoma, pineoblastoma y tumores neuroectodermicos 55 primitivos supratentoriales, tumor pituitario, neoplasia de celulas plasmaticas/mieloma multiple, blastoma pleuropulmonar, cancer de prostata, cancer rectal, cancer de celulas transicionales de pelvis renal y ureter, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cancer de las glandulas salivares, tumores de la familia del sarcoma de Ewing, sarcoma de Kaposi, sarcoma de tejidos blandos, cancer uterino, sarcoma uterino, cancer de piel (no melanoma), cancer de piel (melanoma), carcinoma cutaneo de celulas de Merkel, cancer del intestino delgado, sarcoma de tejidos 60 blandos, carcinoma de celulas escamosas, cancer de estomago (gastrico), tumores neuroectodermicos primitivos

supratentoriales, cancer testicular, cancer de garganta, timoma, timoma y carcinoma tfmico, cancer de tiroides, cancer de celulas transicionales de pelvis renal y ureter y otros organos urinarios, tumor trofoblastico gestacional, cancer de uretra, cancer uterino endometrial, sarcoma uterino, cancer del cuerpo uterino, cancer vaginal, cancer vulvar y tumor de Wilms. Los anticuerpos tienen aplicabilidad en el tratamiento o la gestion terapeutica del cancer. Los anticuerpos 5 tienen aplicabilidad en la mejora de la respuesta inmune anticancerfgena y en la mejora de las vacunas contra el cancer.

En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo que reconoce el TGF-p1 y se selecciona de entre los anticuerpos 4C3.7, 8D6, 19D8, 4A11, 19H11,21C11, 13A1 y 4G9. En un aspecto 10 concreto, la invencion proporciona un anticuerpo o fragmento activo del mismo que reconoce y neutraliza el TGF-p1 y se selecciona de entre los anticuerpos 4C3.7, 19D8, 13A1 y 4G9.

En un aspecto concreto, la invencion proporciona el anticuerpo especffico anti-TGF-p1 13A1. En un aspecto concreto adicional, la invencion proporciona un anticuerpo especffico del TGF-p1 capaz de unir especfficamente y neutralizar 15 el TGF-p1 que comprende la secuencia de aminoacidos de cadena pesada (SEQ ID NO: 1) como se presenta en la Figura 1. En tal aspecto, la invencion proporciona un anticuerpo del TGF-p1 que comprende las secuencias CDR de la region variable de cadena pesada presentadas en la Figura 1. En un aspecto del mismo se proporciona anticuerpo especffico del TGF-p1 que tiene una region variable de cadena pesada que comprende las secuencias de aminoacidos de dominio CDR 1, CDR2 y CDR3 de GYTFTNYWMH (SEQ ID NO: 3), TIYPGNSDTN (SEQ ID NO: 4) y 20 EDSRSLYYNGWDYFDY (SEQ ID NO: 5), respectivamente. En un aspecto, se proporciona el anticuerpo especffico del TGF-p1 que tiene una region variable de cadena pesada que comprende las secuencias de aminoacidos de dominio CDR 1, CDR2 y CDR3 de GYTFTNYW (SEQ ID NO: 11), IYPGNSDT (SEQ ID NO: 12) y EDSRSLYYNGWDYFDY (SEQ ID NO: 5), respectivamente, donde se especifica una secuencia de aminoacidos de dominio CDR1 y CDR2 aceptada mas corta.

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El anticuerpo de la invencion puede comprender la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena pesada presentada en la Figura 1 o las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de la region de dominio CDR de cadena pesada de la Figura 1 y una region variable de cadena ligera. En un aspecto, la secuencia de la region variable de cadena ligera es una secuencia que comprende la secuencia de aminoacidos de la secuencia de cadena ligera de la Figura 1. En 30 un aspecto, el anticuerpo del TGF-p1 comprende la secuencia de aminoacidos de cadena ligera (SEQ ID NO: 2) como se presenta en la Figura 1. En tal aspecto, la invencion proporciona un anticuerpo del TGF-p1 que comprende las secuencias CDR de la region variable de cadena ligera presentadas en la Figura 1. Se proporciona el anticuerpo especffico del TGF-p1 que tiene una region variable de cadena ligera que comprende las

secuencias de aminoacidos de dominio CDR 1, CDR2 y CDR3 de ESVDNYGISF (SEQ ID NO: 6), YAAS (SEQ ID NO: 35 7) y QQSKEVPRT (SEQ ID NO: 8), respectivamente.

En un aspecto concreto, se proporciona anticuerpo especffico del TGF-p1 donde dicho anticuerpo comprende las secuencias CDR de cadena pesada de la Figura 1 (SEQ ID NO: 3, 4 y 5) y las secuencias CDR de cadena ligera de la Figura 1 (SEQ ID NO: 6, 7 y 8). En tal aspecto, el anticuerpo del TGF-p1 de la invencion comprende la secuencia 40 de aminoacidos de la region variable de cadena pesada como se presenta en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1) y la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena ligera como se presenta en la Figura 1 (SEQ ID NO: 2). En un aspecto, el anticuerpo especffico del TGF-p1 de la invencion que comprende una region variable de cadena pesada que comprende las secuencias de aminoacidos de dominio CDR 1, CDR2 y CDR3 de GYTFTNYW (SEQ ID NO: 11), IYPGNSDT (SEQ ID NO: 12) y EDSRSLYYNGWDYFDY (SEQ ID NO: 5), respectivamente, donde se especifica una 45 secuencia de aminoacidos de dominio CDR1 y CDR2 aceptada mas corta. Un anticuerpo del TGF-p1 de la invencion, capaz de unir especfficamente el TGF-p1 y que no une el TGF-p2 o TGF-p3, puede comprender una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 90 % de identidad de aminoacidos con la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 1) y la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 2) como se presenta en la Figura 1.

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En un aspecto de la invencion, el anticuerpo o fragmento de la invencion neutraliza el TGF-p1 y, en particular, neutraliza especfficamente el TGF-p1 y no neutraliza el TGF-p2 o TGF-p3. En un aspecto concreto, el anticuerpo o fragmento activo del mismo de la presente invencion neutraliza el TGF-p1 humano y de raton. En un aspecto, el anticuerpo de la invencion neutraliza y bloquea la senalizacion medida por el TGF-p1 in vivo en un mamffero, en 55 particular, en un humano o en un raton.

La union de un anticuerpo a su antfgeno diana es mediada a traves de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de sus cadenas pesadas y ligeras. Por consiguiente, los miembros de union especifica basados en las regiones CDR de la cadena pesada o ligera, y preferiblemente de ambas, de los anticuerpos de la 60 invencion, en particular, del anticuerpo 13A1, seran miembros de union especifica utiles para terapia y/o diagnostico.

La secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena pesada y las CDR del anticuerpo 13A1 se representan en la Figura 1. El anticuerpo 13A1 comprende las secuencias CDR de cadena pesada CDR1 GYTFTNYWMH (SEQ ID NO: 3), CDR2 TIYPGNSDTN (SEQ ID NO: 4) y CDR3 EDSRSLYYNGWDYFDY (SEQ ID NO: 5). La secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena ligera del anticuerpo 13A, incluyendo la secuencia de las secuencias 5 CDR de cadena ligera, se proporciona en la Figura 1. En un aspecto, se proporciona el miembro de union o anticuerpo, incluyendo el anticuerpo 13A1, que tiene una region variable de cadena pesada que comprende las secuencias de aminoacidos de dominio CDR 1, CDR2 y CDR3 de GYTFTNYW (SEQ ID NO: 11), IYPGNSDT (SEQ ID NO: 12) y EDSRSLYYNGWDYFDY (SEQ ID NO: 5), respectivamente, donde se especifica una secuencia de aminoacidos de dominio CDR1 y CDR2 aceptada mas corta. El anticuerpo 13A1 comprende las secuencias CDR de cadena ligera 10 CDR1 ESVDNYGISF (SEQ ID NO: 6), CDR2 YAAS (SEQ ID NO: 7) y CDR3 QQSKEVPRT (SEQ ID NO: 8).

Por consiguiente, las protefnas de union especifica, tales como anticuerpos, que estan basadas en las CDR del uno o mas anticuerpos, en particular, incluyendo las CDR de cadena pesada identificadas en el presente documento, sera utiles para el direccionamiento al TGF-p1, en particular, a celulas que expresan el TGF-p1, o a la actividad del TGF- 15 p1 en la respuesta inmune, en enfermedades o en canceres. Como la diana de los anticuerpos de la invencion es especificamente el TGF-p1, y no el TGF-p2 y/o TGF-p3, los anticuerpos de la invencion no se unen significativamente a formas del TGF-p o miembros de la familia distintos del TGF-p y se preve que habra menos toxicidad y respuesta inflamatoria o respuesta inflamatoria o reaccion adversa en las dianas celulares o en los animales con los presentes anticuerpos especificos del TGF-p1, en particular, en comparacion con un anticuerpo pan-TGF-p que reconozca mas 20 de una o todas las formas de TGF-p.

En otros aspectos, la invencion proporciona un acido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un miembro de union especifica o anticuerpo como se ha definido anteriormente y metodos de preparar miembros de union especifica o anticuerpos de la invencion que comprenden expresar dichos acidos nucleicos en condiciones 25 adecuadas para lograr la expresion de dicho miembro de union o anticuerpo y recuperar el miembro de union o anticuerpo. En tal aspecto, se proporciona un acido nucleico que codifica una secuencia de region variable de anticuerpo que tiene las secuencias de aminoacidos de cadena pesada como se presentan en la Figura 1 o se proporciona un anticuerpo que tiene las secuencias de dominio CDR de cadena pesada como se presentan en la Figura 1. En un aspecto, se proporciona un acido nucleico que codifica una region variable de cadena ligera de 30 anticuerpo que tiene una secuencia de aminoacidos que comprende una secuencia de cadena ligera de la Figura 1. La presente invencion tambien se refiere a una molecula de ADN recombinante o un gen clonado, o una variante degenerada de los mismos, que codifica un anticuerpo de la presente invencion, preferiblemente una molecula de acido nucleico, en particular, una molecula de ADN recombinante o un gen clonado, que codifica la VH de anticuerpo, en particular, las secuencias de la region CDR, que es capaz de codificar una secuencia mostrada en la Figura 1.

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La exclusiva especificidad y afinidad de los anticuerpos y fragmentos de la invencion permite su uso diagnostico y terapeutico para identificar, caracterizar y dirigirse a afecciones asociadas a la expresion, actividad o activacion del TGF-p1. En particular, los anticuerpos de la invencion que se dirigen al TGF-p1 son utiles en la modulacion de la respuesta inmune. En un aspecto de la misma, los anticuerpos de la invencion que se dirigen al TGF-p1 son utiles en 40 la modulacion de la respuesta inmune contra el cancer, celulas cancerosas o tumorales y antfgenos cancerosos o tumorales. Las afecciones correspondientes incluyen enfermedad infecciosa, canceres, respuesta inmune del huesped, incluyendo en trasplantes e injertos de tejidos, y enfermedades o trastornos inmunes, tales como enfermedades autoinmune o afecciones inflamatorias. Los canceres aplicables incluyen carcinoma adrenocortical, canceres relacionados con el SIDA, linfoma relacionado con el SIDA, cancer anal, cancer anorrectal, cancer del canal 45 anal, cancer de apendice, astrocitoma cerebeloso infantil, astrocitoma cerebral infantil, carcinoma de celulas basales, cancer de piel (no melanoma), cancer biliar, cancer del conducto biliar extrahepatico, cancer del conducto biliar intrahepatico, cancer de vejiga, cancer de la vejiga urinaria, cancer de hueso y articulaciones, osteosarcoma e histiocitoma fibroso maligno, cancer de cerebro, tumor cerebral, glioma del tronco encefalico, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral/glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodermicos primitivos 50 supratentoriales, glioma hipotalamico y de las vfas opticas centrales, cancer de mama, adenomas/carcinoides bronquiales, tumor carcinoide, gastrointestinal, cancer del sistema nervioso, linfoma del sistema nervioso, cancer del sistema nervioso central, linfoma del sistema nervioso central, cancer cervical, canceres infantiles, leucemia linfocftica cronica, leucemia mielogena cronica, trastornos mieloproliferativos cronicos, cancer de colon, cancer colorrectal, linfoma de celulas T cutaneo, neoplasia linfoide, micosis fungoide, sfndrome de Seziary, cancer endometrial, cancer 55 esofagico, tumor de celulas germinales extracraneal, tumor de celulas germinales extragonadal, cancer del conducto biliar extrahepatico, cancer de ojo, melanoma intraocular, retinoblastoma, cancer de la vesfcula biliar, cancer gastrico (estomago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumor de estroma gastrointestinal (TEGI), tumor de celulas germinales, tumor de celulas germinales de ovario, tumor trofoblastico gestacional, glioma, cancer de cabeza y cuello, cancer hepatocelular (hfgado), linfoma de Hodgkin, cancer hipofarfngeo, melanoma intraocular, cancer ocular, tumores de las 60 celulas de los islotes (pancreas endocrino), sarcoma de Kaposi, cancer de rinon, cancer renal, cancer de rinon, cancer

de laringe, leucemia linfoblastica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocftica cronica, leucemia mielogena cronica, leucemia de celulas pilosas, cancer de labio y cavidad oral, cancer de hfgado, cancer de pulmon, cancer de pulmon de celulas no pequenas, cancer de pulmon de celulas pequenas, linfoma relacionado con el SIDA, linfoma no Hodgkiniano, linfoma primario del sistema nervioso central, macroglobulinemia de Waldenstram, meduloblastoma, 5 melanoma, melanoma intraocular (ojo), carcinoma de las celulas de Merkel, mesotelioma maligno, mesotelioma, cancer escamoso metastasico de cuello, cancer de boca, cancer de lengua, sfndrome de neoplasia endocrina multiple, micosis fungoide, sfndromes mielodisplasicos, enfermedades mielodisplasicas/mieloproliferativas, leucemia mielogena cronica, leucemia mieloide aguda, mieloma multiple, trastornos mieloproliferativos cronicos, cancer nasofarfngeo, neuroblastoma, cancer oral, cancer de la cavidad oral, cancer orofarfngeo, cancer ovarico, cancer 10 epitelial de ovario, tumor ovarico de bajo potencial de malignidad, cancer pancreatico, cancer pancreatico de los islotes, cancer de seno paranasal y de la cavidad nasal, cancer paratiroideo, cancer de pene, cancer farfngeo, feocromocitoma, pineoblastoma y tumores neuroectodermicos primitivos supratentoriales, tumor pituitario, neoplasia de celulas plasmaticas/mieloma multiple, blastoma pleuropulmonar, cancer de prostata, cancer rectal, cancer de celulas transicionales de pelvis renal y ureter, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cancer de las glandulas salivares, 15 tumores de la familia del sarcoma de Ewing, sarcoma de Kaposi, sarcoma de tejidos blandos, cancer uterino, sarcoma uterino, cancer de piel (no melanoma), cancer de piel (melanoma), carcinoma cutaneo de celulas de Merkel, cancer del intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, carcinoma de celulas escamosas, cancer de estomago (gastrico), tumores neuroectodermicos primitivos supratentoriales, cancer testicular, cancer de garganta, timoma, timoma y carcinoma tfmico, cancer de tiroides, cancer de celulas transicionales de pelvis renal y ureter y otros organos urinarios, 20 tumor trofoblastico gestacional, cancer de uretra, cancer uterino endometrial, sarcoma uterino, cancer del cuerpo uterino, cancer vaginal, cancer vulvar y tumor de Wilms.

La evidencia de produccion de TGFp por las celulas tumorales y las celulas supresoras derivadas de mieloides junto con la actividad inmunosupresora del TGFp en el sitio tumoral respaldan claramente el hecho de que el bloqueo del 25 TGFp, en particular, el bloqueo especffico del TGFpl, puede mejorar la captacion, presentacion y activacion de la respuesta inmune antitumoral al antfgeno mediada por las vacunas terapeuticas. Por tanto, en un aspecto de la invencion, el uno o mas anticuerpos del TGFpl, en particular, el uno o mas anticuerpos neutralizantes del TGFpl, pueden administrarse en combinacion con, o en una composicion de, uno o mas antfgenos y adyuvantes, incluyendo a pacientes para favorecer un cebado y una activacion mas robustos de la respuesta antitumoral para mejorar las 30 terapias inmunes dirigidas a los canceres. Tambien se pueden usar inhibidores de la actividad del TGFp adicionales, tales como moleculas pequenas, antisentido o aptameros, para inhibir la actividad del TGFp.

La evidencia de inmunidad antitumoral potente requiere modular multiples brazos de la respuesta inmune del huesped y las vfas de direccionamiento que contribuyen al crecimiento y la supervivencia de las celulas tumorales. Los agentes 35 combinados que modulan la respuesta inmune y detienen el crecimiento y la progresion tumoral pueden generar inmunidad anticancerfgena y detener el crecimiento tumoral para mejorar los resultados clfnicos (Vanneman, M (2012) Nature Reviews Cancer (12):237-251). Por tanto, en un aspecto de la invencion, el uno o mas anticuerpos anti-TGFpl pueden administrarse solos o en combinacion con otros tratamientos, terapeuticos o agentes simultaneamente o secuencialmente dependiendo de la afeccion a tratar. Pueden incluirse inmunomoduladores en una composicion con, 40 o administrarse con, uno o mas anticuerpos del TGFp1 y/o en un momento diferente al que se administran el uno o mas anticuerpos del TGFp1 para mejorar la inmunomodulacion y/o terapia contra el cancer, incluyendo las terapias inmunes dirigidas contra el cancer. Los inmunomoduladores procedentes incluyen IDO, TDO (Platten M (2012) Cancer Research 72(21):5435-40), a-galactosilceramida y analogos de los mismos tales como IMM47, ligandos de TLR tales como poli I:C (TLR3), MPL (TLR4), imiquimod (TLR7), R848 (TLR8) o CpG (TLR9), iCOS, CTLA-4, PD1, ligando de 45 PD1, OX40 y ligando de OX40, Lag3, GITR, ligando de GITR, interleuquinas, factor de necrosis tumoral (TNF) u otros factores de crecimiento, factores estimulantes de colonias, moduladores de celulas T, incluyendo moduladores de celulas T CD8+, citoquinas u hormonas tales como dexametasona que estimulan la respuesta inmune o la reduccion o eliminacion de celulas cancerosas o tumores (Mellman I (2011) Nature (480):480-489). Los inmunomoduladores adicionales son moleculas pequenas, anticuerpos antagonistas o anticuerpos agonistas que se dirigen a los 50 correspondientes inmunomoduladores incluyendo IDO, TDO, la familia de receptores de tipo Toll o iCOS, CTLA-4, PD1, ligando de PD1, OX40 y ligando de OX40, interleuquinas, el factor de necrosis tumoral (TNF) u otros factores de crecimiento, factores estimulantes de colonias, moduladores de celulas T, incluyendo moduladores de celulas T CD8+, citoquinas que estimulan la respuesta inmune o la reduccion o eliminacion de celulas cancerosas o tumores.

55 Los inmunomoduladores adicionales, incluyendo ligandos de TLR tales como poli I:C (TLR3), MPL (TLR4), imiquimod (TLR7), R848 (TLR8) o CpG (TLR9) pueden usarse en combinacion con anticuerpo neutralizante especffico del TGF- p1 para producir una estimulacion inmune y proteccion resultante mejoradas de afecciones en las que es deseable que el sistema inmune responda eficazmente tales como una enfermedad infecciosa o cancer.

60 El uno o mas anticuerpos especfficos del TGF-p1 tambien pueden usarse como inmunoestimulantes o adyuvantes en

uso combinado con materiales antigenicos tales como, sin limitacion, protefnas, peptidos, o acidos nucleicos, etc., con el fin de producir una respuesta inmune protectora, tal como una respuesta de los linfocitos B y el anticuerpo IgG al antfgeno administrado. El uno o mas anticuerpos especfficos del TGF-p1 tambien pueden usarse como inmunoestimulantes o adyuvantes en uso combinado con materiales antigenicos tales como, sin limitacion, protefnas, 5 peptidos, o acidos nucleicos, etc., con el fin de producir una respuesta inmune protectora, tal como una respuesta de los linfocitos T o CTL al antfgeno administrado.

Tales materiales antigenicos podrfan ser, y pueden incluir, cualquier material adecuado para la prevencion o terapia de una/la enfermedad concreta. Especfficamente, en lo que respecta al cancer, los ejemplos de antfgenos protefnicos 10 o peptfdicos asociados a tumores que pueden administrarse para inducir o mejorar una respuesta inmune derivan de genes y protefnas codificadas asociadas a tumores que incluyen MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE- A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-A13, GAGE-1, GAGE- 2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, BAGE-1, RAGE-1, LB33/MUM-1, PRAME, NAG, MAGE- Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), tirosinasa, glucogeno fosforilasa del cerebro, 15 Melan-A, MAGE-C1, MAGE-C2, NY-ESO-1, LAGE-1, SSX-1, SSX-2(HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 y CT-7. Por ejemplo, los peptido antigenicos caracterfsticos de tumores incluyen los listados en la solicitud PCT WO00/20581 (PCT/US99/21230).

Como se ha demostrado, los anticuerpos especfficos del TGF-p1 son eficaces tanto in vitro como in vivo. Por tanto, 20 un aspecto de la invencion se refiere a estimular una respuesta inmune en un sujeto administrando anticuerpo especffico del TGF-p1 con o sin una molecula antigenica en una cantidad suficiente para estimular una respuesta inmunologica favorable en tal sujeto.

La invencion incluye composiciones y/o kits que comprenden uno o mas anticuerpos especfficos del TGF-p1 junto con 25 una o mas protefnas o peptidos antigenicos. Las composiciones incluyen composiciones farmaceuticas y composiciones inmunologicas.

Los anticuerpos, fragmentos de los mismos y anticuerpos recombinantes que comprenden los dominios CDR segun la invencion pueden usarse en un metodo de tratamiento o diagnostico del cuerpo humano o animal, tal como un 30 metodo de tratamiento de un tumor en un paciente humano que comprende administrar a dicho paciente una cantidad efectiva de los anticuerpos, fragmentos de los mismos y anticuerpos recombinantes de la invencion. Los anticuerpos, fragmentos de los mismos y anticuerpos recombinantes que comprenden los dominios CDR segun la invencion pueden usarse en un metodo de estimular o mejorar una respuesta inmune al cancer, las celulas tumorales o uno o mas antfgenos cancerosos o tumorales en un mamffero, en particular, en un humano, que comprende administrar a dicho 35 mamffero una cantidad efectiva de los anticuerpos, fragmentos de los mismos y anticuerpos recombinantes de la invencion. Los anticuerpos, fragmentos de los mismos y anticuerpos recombinantes que comprenden los dominios CDR segun la invencion pueden usarse en un metodo de inhibir o reducir la recidiva o metastasis del cancer en un mamffero, en particular en un humano, que comprende administrar a dicho mamffero una cantidad efectiva de los anticuerpos, fragmentos de los mismos y anticuerpos recombinantes de la invencion. Los anticuerpos, fragmentos de 40 los mismos y anticuerpos recombinantes que comprenden los dominios CDR segun la invencion pueden usarse en un metodo de inhibir o bloquear la estimulacion del TGF-p, en particular, del TGF-p1, en respuesta a la radiacion o terapia contra el cancer en un mamffero, en particular, en un humano, que comprende administrar a dicho mamffero una cantidad efectiva de los anticuerpos, fragmentos de los mismos y anticuerpos recombinantes de la invencion.

45 Un metodo terapeutico se asocia a la prevencion o el tratamiento del cancer, o la estimulacion o mejora de la respuesta inmune al cancer, que incluye, pero no se limita a carcinoma adrenocortical, canceres relacionados con el SIDA, linfoma relacionado con el SIDA, cancer anal, cancer anorrectal, cancer del canal anal, cancer de apendice, astrocitoma cerebeloso infantil, astrocitoma cerebral infantil, carcinoma de celulas basales, cancer de piel (no melanoma), cancer biliar, cancer del conducto biliar extrahepatico, cancer del conducto biliar intrahepatico, cancer de 50 vejiga, cancer de la vejiga urinaria, cancer de hueso y articulaciones, osteosarcoma e histiocitoma fibroso maligno, cancer de cerebro, tumor cerebral, glioma del tronco encefalico, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral/glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodermicos primitivos supratentoriales, glioma hipotalamico y de las vfas opticas centrales, cancer de mama, adenomas/carcinoides bronquiales, tumor carcinoide, gastrointestinal, cancer del sistema nervioso, linfoma del sistema nervioso, cancer del sistema nervioso central, linfoma del sistema 55 nervioso central, cancer cervical, canceres infantiles, leucemia linfocftica cronica, leucemia mielogena cronica, trastornos mieloproliferativos cronicos, cancer de colon, cancer colorrectal, linfoma de celulas T cutaneo, neoplasia linfoide, micosis fungoide, sfndrome de Seziary, cancer endometrial, cancer esofagico, tumor de celulas germinales extracraneal, tumor de celulas germinales extragonadal, cancer del conducto biliar extrahepatico, cancer de ojo, melanoma intraocular, retinoblastoma, cancer de la vesfcula biliar, cancer gastrico (estomago), tumor carcinoide 60 gastrointestinal, tumor de estroma gastrointestinal (TEGI), tumor de celulas germinales, tumor de celulas germinales

de ovario, tumor trofoblastico gestacional, glioma, cancer de cabeza y cuello, cancer hepatocelular (hfgado), linfoma de Hodgkin, cancer hipofarfngeo, melanoma intraocular, cancer ocular, tumores de las celulas de los islotes (pancreas endocrino), sarcoma de Kaposi, cancer de rinon, cancer renal, cancer de rinon, cancer de laringe, leucemia linfoblastica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocftica cronica, leucemia mielogena cronica, leucemia de 5 celulas pilosas, cancer de labio y cavidad oral, cancer de hfgado, cancer de pulmon, cancer de pulmon de celulas no pequenas, cancer de pulmon de celulas pequenas, linfoma relacionado con el SIDA, linfoma no Hodgkiniano, linfoma primario del sistema nervioso central, macroglobulinemia de Waldenstram, meduloblastoma, melanoma, melanoma intraocular (ojo), carcinoma de las celulas de Merkel, mesotelioma maligno, mesotelioma, cancer escamoso metastasico de cuello, cancer de boca, cancer de lengua, sfndrome de neoplasia endocrina multiple, micosis fungoide, 10 sfndromes mielodisplasicos, enfermedades mielodisplasicas/mieloproliferativas, leucemia mielogena cronica, leucemia mieloide aguda, mieloma multiple, trastornos mieloproliferativos cronicos, cancer nasofarfngeo, neuroblastoma, cancer oral, cancer de la cavidad oral, cancer orofarfngeo, cancer ovarico, cancer epitelial de ovario, tumor ovarico de bajo potencial de malignidad, cancer pancreatico, cancer pancreatico de los islotes, cancer de seno paranasal y de la cavidad nasal, cancer paratiroideo, cancer de pene, cancer farfngeo, feocromocitoma, pineoblastoma 15 y tumores neuroectodermicos primitivos supratentoriales, tumor pituitario, neoplasia de celulas plasmaticas/mieloma multiple, blastoma pleuropulmonar, cancer de prostata, cancer rectal, cancer de celulas transicionales de pelvis renal y ureter, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cancer de las glandulas salivares, tumores de la familia del sarcoma de Ewing, sarcoma de Kaposi, sarcoma de tejidos blandos, cancer uterino, sarcoma uterino, cancer de piel (no melanoma), cancer de piel (melanoma), carcinoma cutaneo de celulas de Merkel, cancer del intestino delgado, 20 sarcoma de tejidos blandos, carcinoma de celulas escamosas, cancer de estomago (gastrico), tumores neuroectodermicos primitivos supratentoriales, cancer testicular, cancer de garganta, timoma, timoma y carcinoma tfmico, cancer de tiroides, cancer de celulas transicionales de pelvis renal y ureter y otros organos urinarios, tumor trofoblastico gestacional, cancer de uretra, cancer uterino endometrial, sarcoma uterino, cancer del cuerpo uterino, cancer vaginal, cancer vulvar y tumor de Wilms.

25

Los miembros de union y anticuerpos de la presente invencion y, en una forma de realizacion concreta, el anticuerpo que tiene la secuencia representada en la Figura 1, o fragmentos de los mismos, y los anticuerpos de cadena sencilla, recombinantes o sinteticos derivados de los mismos que comprenden, en particular, las secuencias de la region CDR de cadena pesada y las secuencias de la region CDR de cadena ligera representadas en la Figura 1, pueden 30 prepararse en composiciones farmaceuticas, que incluyen un vehfculo, excipiente o diluyente adecuado, o que incluyen un adyuvante y/o inmunomodulador, para administracion en casos donde la terapia es apropiada, tal como para tratar el cancer o estimular o mejorar la respuesta inmune, incluyendo la respuesta inmune contra el cancer. Tales composiciones farmaceuticas tambien pueden incluir medios para modular la semivida de los miembros de union, anticuerpos o fragmentos mediante metodos conocidos en la tecnica tales como la pegilacion. Tales 35 composiciones farmaceuticas pueden comprender ademas anticuerpos o agentes terapeuticos adicionales.

Una composicion de la presente invencion puede administrarse sola o en combinacion con otros tratamientos, terapeuticos o agentes, simultaneamente o secuencialmente dependiendo de la afeccion a tratar. Ademas, la presente invencion contempla e incluye composiciones que comprenden el miembro de union, en particular, el anticuerpo o 40 fragmento del mismo, descritos en el presente documento y otros agentes o terapeuticos tales como agentes o terapeuticos anticancerfgenos, agentes antimitoticos, agentes o anticuerpos apoptoticos, o inmunomoduladores, o inhibidores de molecula pequena de los inmunomoduladores. En terminos mas generales, estos agentes anticancerfgenos pueden ser inhibidores de la tirosina quinasa o inhibidores de la cascada de fosforilacion, moduladores postraduccionales, inhibidores del crecimiento o la division celular (p. ej., antimitoticos), inhibidores o 45 inhibidores de la transduccion de senal. Otros tratamientos o terapeuticos pueden incluir la administracion de dosis adecuadas de farmacos analgesicos tales como farmacos antiinflamatorios no esteroideos (p. ej., aspirina, paracetamol, ibuprofeno o ketoprofeno) u opiaceos tales como morfina, o antihemeticos. Ademas, la composicion puede administrarse con inmunomoduladores, tales como a-galactosilceramida, interleuquinas, el factor de necrosis tumoral (TNF) u otros factores de crecimiento, factores estimulantes de colonias, citoquinas u hormonas tales como 50 dexametasona que estimulan la respuesta inmune y la reduccion o eliminacion de celulas cancerosas o tumores. La composicion tambien puede administrarse con, o puede incluir, combinaciones con otros anticuerpos anti-TGFp, otros anticuerpos inmunomoduladores u otros anticuerpos antigenicos antitumorales.

La presente invencion tambien incluye anticuerpos y fragmentos de los mismos que estan covalentemente unidos a, 55 o asociados de otra forma con, otras moleculas o agentes. Estas otras moleculas o agentes incluyen, pero no se limitan a, moleculas (incluyendo anticuerpos o fragmentos de anticuerpo) con caracterfsticas de reconocimiento definidas, toxinas, ligandos y agentes quimioterapeuticos. En un aspecto adicional, los anticuerpos o fragmentos de la invencion pueden usarse para dirigir o direccionar moleculas u otros agentes terapeuticos, por ejemplo para dirigir moleculas o agentes a celulas que expresan el TGFp, o celulas sensibles al TGFp, por ejemplo, celulas en sitios de 60 heridas, sitios tumorales, areas inflamatorias o lesiones cancerosas.

La utilidad diagnostica de la presente invencion se extiende al uso de los anticuerpos de la presente invencion en ensayos para caracterizar tumores o muestras celulares o para cribar tumores o cancer, incluyendo ensayos diagnosticos in vitro e in vivo. En un inmunoensayo, puede prepararse una cantidad de anticuerpos de control o 5 similares y marcarse con una enzima, un ligando especffico y/o un elemento radioactivo y, a continuacion, puede introducirse en una muestra celular. Una vez que el material marcado o su uno o mas ligandos han tenido oportunidad de reaccionar con sitios en el interior de la muestra, la masa resultante puede examinarse mediante tecnicas conocidas, que pueden variar con la naturaleza del marcador unido.

10 Los miembros de union especffica de la invencion pueden llevar un marcador detectable o funcional. Los miembros de union especffica pueden llevar un marcador radioactivo, tal como los isotopos 3H,14C,32P,35S,36Cl, 51Cr,57Co,58Co,59Fe,90Y,121I,124I,125I,131I,111In,117Lu,211At,198Au,67Cu,225Ac,213Bi,99Tc y 186Re. Cuando se usan marcadores radioactivos, pueden utilizarse procedimientos de recuento actualmente comercializados conocidos para identificar y cuantificar los miembros de union especfficos. En el caso de que el marcador sea una enzima, la deteccion 15 se puede lograr mediante cualquiera de las tecnicas colorimetricas, espectrofotometricas, fluoroespectrofotometricas, amperometricas o gasometricas utilizadas en la actualidad conocidas en la tecnica.

Los miembros de union especffica radiomarcados, en particular, anticuerpos y fragmentos de los mismos, son utiles en tecnicas diagnosticas in vitro y en tecnicas de radiodiagnostico in vivo. En otro aspecto de la invencion, los 20 miembros de union especffica radiomarcados, en particular, anticuerpos y fragmentos de los mismos, en particular, radioinmunoconjugados, son utiles en radioinmunoterapia, en particular, como anticuerpos radiomarcados para terapia contra el cancer. En otro aspecto adicional, los miembros de union especifica radiomarcados, en particular, anticuerpos y fragmentos de los mismos, son utiles en tecnicas de cirugfa radioinmunoguiada, donde pueden identificar e indicar la presencia y/o ubicacion de celulas cancerosas, celulas precancerosas y celulas hiperproliferativas antes de, durante, 25 o despues de la cirugfa para retirar tales celulas.

Los inmunoconjugados o protefnas de fusion de anticuerpos de la presente invencion, donde los miembros de union especffica, en particular, anticuerpos y fragmentos de los mismos, de la presente invencion estan conjugados o unidos a otras moleculas o agentes, incluyen ademas, pero no se limitan a, miembros de union conjugados a un agente de 30 ablacion qufmica, toxina, inmunomodulador, citoquina, agente citotoxico, agente quimioterapeutico o farmaco.

La presente invencion incluye un sistema de ensayo que puede prepararse en forma de un kit de ensayo para el analisis cuantitativo del grado de presencia de, por ejemplo, TGFp1. El sistema o kit de ensayo puede comprender un componente marcado preparado mediante una de las tecnicas radioactivas y/o enzimaticas comentadas en el presente 35 documento, acoplando un marcador al anticuerpo, y uno o mas reactivos inmunoqufmicos adicionales, al menos uno de los cuales es un componente libre o inmovilizado a determinar o su uno o mas ligandos.

Otros objetivos y ventajas resultaran evidentes para los expertos en la materia a partir de una revision de la subsiguiente descripcion detallada, que procede haciendo referencia a los dibujos ilustrativos siguientes, y las 40 consiguientes reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

FIGURA 1A y 1B: (A) proporciona la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena pesada del anticuerpo 45 de TGF-beta 13A1 (SEq ID NO: 1) y la secuencia de cadena ligera (SEQ ID NO: 2); (B) proporciona las secuencias de los dominios CDR de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 (SEQ ID NO: 3-5) y las secuencias de los dominios CDR de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 (SEQ ID NO: 6-8) para el anticuerpo 13a1.

La FIGURA 2A representa la union de los anticuerpos de TGF-beta a los isotipos de TGF-beta humano p1, p2 y p3. La FIGURA 3 proporciona datos para la deteccion de TGF-beta humano mediante ELISA. La concentracion de TGF- 50 beta en ng/ml se representa graficamente frente a la absorbancia a 40 mm2. Se utilizo el anticuerpo 21C11 para recubrir las placas de ELISA, se detecto el TGF-beta usando el anticuerpo 8D6.H5.

La FIGURA 4 muestra la neutralizacion del TGF-beta humano en celulas TMLEC, como se evalua mediante la expresion inducida por el TGF-beta aguas abajo del gen PAI-1, a partir de un constructo de luciferasa-PAI-1. Se muestra la neutralizacion mediante los anticuerpos 1D11, 13A1, 4C3.7, 4G9.1 y 19D8.

55 LA FIGURA 5 muestra la inhibicion del TGF-beta de raton (mTGF-p1) por el anticuerpo 13A1 in vivo.

La FIGURA 6A y B muestra la exacerbacion de la EICH en animales tratados con anticuerpo del TGF-p1 13A1. (A) grafica del porcentaje de supervivencia en animales a lo largo de 50 dfas. (B) grafica del cambio de peso (%) a lo largo de 50 dfas. En cada grafica, se comparan los datos de animales tratados con anticuerpo del TGF-beta frente a animales a los que se ha administrado anticuerpo de control de isotipo IgG1.

60 La FIGURA 7 representa las caracterfsticas de union del anticuerpo del TGF-p1 como se evaluan en ensayos de union

competitiva con anticuerpo1D11 y anticuerpo 13A1. DESCRIPCION DETALLADA

5 Segun la presente invencion, pueden emplearse tecnicas de biologfa molecular, microbiologfa y ADN recombinante dentro del ambito de la tecnica. Tales tecnicas se explican fntegramente en la bibliograffa. Vease, p. ej., Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989); «Current Protocols in Molecular Biology» Volumenes I-III [Ausubel, R. M., ed. (1994)]; «Cell Biology: A Laboratory Handbook» Volumenes I-III [J. E. Celis, ed. (1994))]; «Current Protocols in Immunology» Volumenes I-III [Coligan, J. E., ed. (1994)]; "Oligonucleotide Synthesis» (M.J. Gait ed. 1984); 10 «Nucleic Acid Hybridization» [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; «Transcription And Translation» [B.D. Hames & S.J. Higgins, ed. (1984)]; «Animal Cell Culture» [R.I. Freshney, ed. (1986)]; «Immobilized Cells And Enzymes» [IRL Press, (1986)];B. Perbal, «A Practical Guide To Molecular Cloning» (1984).

Por lo tanto, de aparecer en el presente documento, los terminos siguientes tendran las definiciones presentadas a 15 continuacion.

A. TERMINOLOGIA

El termino «miembro de union especffica» describe un miembro de un par de moleculas que tiene especificidad de 20 union por el otro. Los miembros de un par de union especffica pueden ser de origen natural o producirse total o parcialmente de forma sintetica. Un miembro del par de moleculas tiene un area en su superficie, o una cavidad, que se une especfficamente y, por lo tanto, es complementario a una organizacion espacial y polar concreta del otro miembro del par de moleculas. Por tanto, los miembros del par tienen la propiedad de unirse especfficamente entre si. Ejemplos de tipos de pares de union especffica son antfgeno-anticuerpo, biotina-avidina, hormona-receptor de 25 hormona, receptor-ligando, enzima-sustrato. Esta solicitud trata de las reacciones de tipo antfgeno-anticuerpo.

El termino «anticuerpo» describe una inmunoglobulina, ya sea natural o producida parcial o totalmente por sfntesis. El termino tambien abarca cualquier polipeptido o protefna que tiene un dominio de union que es un dominio de union de anticuerpo o es homologo al mismo. Este termino tambien contempla anticuerpos injertados con CDR. Un «anticuerpo» 30 es cualquier inmunoglobulina, incluyendo anticuerpos y fragmentos de las mismas, que se une a un epftopo especffico. El termino abarca anticuerpos policlonales, monoclonales y quimericos, estos ultimos descritos en mayor detalle en las patentes de EE. UU. n.° 4.816.397 y 4.816.567. El termino «anticuerpo(s)» incluye una molecula de inmunoglobulina (lg) de tipo silvestre, que comprende generalmente cuatro cadenas polipeptfdicas de longitud completa, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L), o un homologo de lg equivalente de la misma (p. ej., 35 un nanoanticuerpo de camelido, que comprende solo una cadena pesada); incluyendo mutantes, variantes o derivados funcionales de longitud completa de los mismos, que retienen las caracterfsticas esenciales de union de epftopo de una molecula de lg, e incluyendo anticuerpos de doble especificidad, biespecfficos, multiespecfficos y de doble dominio variable; las moleculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier clase (p. ej., lgG, lgE, lgM, lgD, lgA e lgY), o subclase (p. ej., lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2). El significado del termino «anticuerpo» tambien incluye cualquier 40 «fragmento de anticuerpo».

Un «fragmento de anticuerpo» significa una molecula que comprende al menos una cadena polipeptfdica que no es de longitud completa, incluyendo (i) un fragmento Fab, que es un fragmento monovalente que consiste en los dominios ligero variable (VL), pesado variable (VH), ligero constante (CL) y pesado constante 1 (CH1); (ii) un fragmento F(ab')2, 45 que es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab conectados por un puente disulfuro en la region bisagra; (iii) una porcion de cadena pesada de un fragmento Fab (Fd), que consiste en los dominios VH y CH1 ; (iv) un fragmento variable (Fv), que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento de anticuerpo de dominio (dAc), que comprende un unico dominio variable (Ward, E.S. y col., Nature 341, 544-546 (1989)); (vi) un anticuerpo de camelido; (vii) una region determinante de complementariedad (CDR) aislada; (viii) un 50 fragmento Fv de cadena sencilla donde un dominio VH y un dominio VL estan conectados mediante un conector peptfdico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de union de antfgeno (Bird y col., Science, 242, 423-426, 1988;Huston y col., PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988); (ix) un dianticuerpo, que es un anticuerpo bivalente biespecffico en el que los dominios VH y VL son expresados en una sola cadena polipeptfdica, pero usando un conector que es demasiado corto para permitir el apareamiento de los dos dominios en la misma cadena, forzando 55 de ese modo a que los dominios se apareen con los dominios de complementariedad de otra cadena y creen dos sitios de union de antfgeno (WO94/13804; P. Holliger y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, (1993)); y (x) un anticuerpo lineal, que comprende un par de segmentos Fv en tandem (VH-CH1-VH-CH1 ) que, junto con polipeptidos de cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de union de antfgeno; (xi) fragmentos de anticuerpo multivalentes (dfmeros, trfmeros y/o tetrameros de scFv (Power and Hudson, J Immunol. Methods 242: 193-204 9 60 (2000)); (xii) un minianticuerpo, que es una molecula bivalente compuesta por un scFv fusionado a dominios

constantes de inmunoglobulina, CH3 o CH4, donde los dominios constantes CH3 o CH4 funcionan como dominios de dimerizacion (Olafsen T y col. (2004) Prot Eng Des Sel 17(4):315-323;Hollinger P and Hudson PJ (2005) Nature Biotech 23(9):1126-1136); y (xiii) otras porciones de longitud no completa de cadenas pesadas y/o ligeras, o mutantes, variantes, o derivados de las mismas, solas o en cualquier combinacion.

5

Como los anticuerpos se pueden modificar de varias maneras, se debe considerar que el termino «anticuerpo» cubre cualquier miembro de union especffico o sustancia que tiene un dominio de union con la especificidad requerida. De esta manera, este termino abarca fragmentos de anticuerpo, derivados, equivalentes funcionales y homologos de anticuerpos, incluyendo cualquier polipeptido compuesto por un dominio de union de inmunoglobulina, ya sean 10 naturales o parcial o totalmente sinteticos. Por lo tanto, se incluyen moleculas quimericas que comprenden un dominio de union de inmunoglobulina, o equivalente, fusionado a otro polipeptido. La clonacion y expresion de anticuerpos quimericos se describe en los documentos EP-A-0120694 y EP-A-0125023 y en las patentes de EE. UU. n.° 4.816.397 y 4.816.567.

15 Un «sitio de combinacion de anticuerpo» es aquella porcion estructural de una molecula de anticuerpo compuesta por regiones variables e hipervariables de cadena ligera o cadena pesada y ligera que se unen especfficamente al antfgeno.

La expresion «molecula de anticuerpo» en sus diversas formas gramaticales, como se usa en el presente documento, 20 contempla tanto una molecula de inmunoglobulina intacta como una porcion inmunologicamente activa de una molecula de inmunoglobulina.

Las moleculas de anticuerpo ejemplares son moleculas de inmunoglobulina intactas, moleculas de inmunoglobulina sustancialmente intactas y las porciones de una molecula de inmunoglobulina que contienen el paratopo, incluyendo 25 las porciones conocidas en la tecnica como Fab, Fab', F(ab')2 y F(v); dichas porciones son preferidas para su uso en los metodos terapeuticos descritos en el presente documento.

Los anticuerpos tambien pueden ser biespecfficos, donde un dominio de union del anticuerpo es un miembro de union especffica de la invencion y el otro dominio de union tiene una especificidad diferente, p. ej., para conseguir una funcion 30 efectora o similares. Los anticuerpos biespecfficos de la presente invencion incluyen aquellos donde un dominio de union del anticuerpo es un miembro de union especffica de la presente invencion, incluyendo un fragmento del mismo, y el otro dominio de union es un anticuerpo o fragmento del mismo diferente, incluyendo el de un anticuerpo anticancerfgeno o antitumoral especffico diferente. El otro dominio de union puede ser un anticuerpo que reconoce o se dirige a un tipo de celula concreto, como en un anticuerpo especffico de las celulas neurales o gliales. En los 35 anticuerpos biespecfficos de la presente invencion, el dominio de union del anticuerpo de la invencion puede combinarse con otros dominios de union o moleculas que reconocen receptores celulares concretos y/o modulan de una forma concreta como, por ejemplo, un inmunomodulador (p. ej., interleuquina(s), un modulador de crecimiento o citoquina o una toxina (p. ej., ricina) o un agente o factor antimitotico o apoptotico. Por tanto, los anticuerpos del TGFbeta-1 de la invencion pueden utilizarse para dirigir o direccionar agentes, marcadores, otras moleculas o 40 compuestos o anticuerpos en indicaciones tales como curacion de heridas, inflamacion, cancer o tumores.

La expresion «anticuerpo monoclonal» en sus diversas formas gramaticales se refiere a un anticuerpo que tiene solo un sitio de combinacion de una especie de anticuerpo capaz de reaccionar inmunologicamente con un antfgeno concreto. Por tanto, un anticuerpo monoclonal habitualmente presenta una unica afinidad de union por cualquier 45 antfgeno con el que inmunoreacciona. Un anticuerpo monoclonal tambien puede contener una molecula de anticuerpo que tenga una pluralidad de sitios de combinacion de anticuerpo, cada uno inmunoespecffico para un antfgeno diferente; p. ej., un anticuerpo monoclonal biespecffico (quimerico).

El termino «dominio de union de antfgeno» describe la parte de un anticuerpo que comprende el area que se une 50 especfficamente y es complementaria a parte de un antfgeno o a su totalidad. Cuando un antfgeno es grande, un anticuerpo puede unirse solo a una parte concreta del antfgeno, dicha parte se denomina un epftopo. Un dominio de union de antfgeno puede ser proporcionado por uno o mas dominios variables de anticuerpo. Preferiblemente, un dominio de union de antfgeno comprende una region variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo y una region variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo.

55

Los inmunoconjugados o protefnas de fusion de anticuerpos de la presente invencion, donde los anticuerpos, moleculas de anticuerpo, o fragmentos de los mismos, para uso en la presente invencion estan conjugados o unidos a otras moleculas o agentes incluyen ademas, pero no se limitan a, tales anticuerpos, moleculas o fragmentos conjugados a un agente de ablacion qufmica, toxina, inmunomodulador, citoquina, agente citotoxico, agente 60 quimioterapeutico, agente o peptido antimicrobiano, disruptor de la pared celular y/o la membrana celular, o farmaco.

El termino «adyuvante(s)» describe una sustancia, compuesto, agente o material util para mejorar una respuesta immune o la estimulacion de un inmunocito o componente y, en algunos casos, puede combinarse con cualquier antfgeno concreto en una composicion farmaceutica o de vacuna inmunologica. Los adyuvantes pueden usarse para 5 aumentar la cantidad de anticuerpo y celulas T efectoras producida y para reducir la cantidad de antfgeno o inmunoestimulante o inmunomodulador y la frecuencia de inyeccion. Aunque algunos antfgenos se administran sin un adyuvante, hay muchos antfgenos que carecen de inmunogenicidad suficiente para estimular una respuesta inmune util en ausencia de un adyuvante efectivo. Los adyuvantes tambien mejoran la respuesta inmune de los antfgenos «autosuficientes», en los que puede aumentarse la respuesta inmune obtenida o puede reducirse la cantidad de 10 antfgeno administrada. Un adyuvante puede funcionar como un deposito tisular que libera lentamente el antfgeno y tambien como un activador del sistema linfatico que mejora no especfficamente la respuesta inmune (Hood y col., Immunology, Segunda ed., 1984, Benjamin/Cummings: Menlo Park, California, p. 384). En un aspecto preferido, un adyuvante es fisiologicamente y/o farmaceuticamente aceptable en un mamffero, en particular, un humano. El adyuvante estandar para uso en animales de laboratorio es el adyuvante de Freund. El adyuvante completo de Freund 15 (FCA) es una emulsion que contiene aceite mineral y micobacterias muertas en solucion salina. El adyuvante incompleto de Freund (FlA) omite las micobacterias. Tanto el FIA como el FCA inducen buena inmunidad humoral (anticuerpo), y el FCA induce ademas altos niveles de inmunidad mediada por celulas. Sin embargo, ni el FCA ni el FIA son aceptables para su uso clfnico debido a los efectos secundarios. En particular, se sabe que el aceite mineral causa granulomas y abscesos y la Mycobacterium tuberculosis es el agente responsable de la tuberculosis. Los 20 adyuvantes ya conocidos y utilizados incluyen, pero no se limitan a, adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, saponina, geles minerales tales como hidroxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles pluronicos, polianiones, polipeptidos, emulsiones de aceite o hidrocarburos, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente utiles tales como BCG (bacilo de Calmette- Guerin) y Corynebacterium parvum. Los adyuvantes de sales minerales incluyen, pero no se limitan a: hidroxido de 25 aluminio, fosfato de aluminio, fosfato de calcio, hidroxido de zinc e hidroxido de calcio. Preferiblemente, la composicion adyuvante comprende ademas una emulsion lipfdica o grasa que comprende aproximadamente un 10 % (en peso) de aceite vegetal y aproximadamente un 1-2 % (en peso) de fosfolfpidos. Preferiblemente, la composicion adyuvante comprende opcionalmente ademas una forma de emulsion que tiene partfculas oleosas dispersas en una fase acuosa continua, que tiene un poliol formador de emulsion en una cantidad de aproximadamente un 0,2 % (en peso) a 30 aproximadamente un 49 % (en peso), opcionalmente, un aceite metabolizable en una cantidad formadora de emulsion de hasta un 15 % (en peso) y, opcionalmente, un tensioactivo a base de eter glicolico en una cantidad estabilizante de emulsion de hasta aproximadamente un 5 % (en peso). Ha habido muchas sustancias que se han intentado usar como adyuvantes, tales como la porcion de lfpido A de endotoxinas bacterianas gram negativas y el dimicolato de trehalosa micobacteriano. El fosfolfpido lisolecitina exhibio actividad adyuvante (Arnold y col., Eur. J Immunol. 9:36335 366, 1979). Algunos tensioactivos sinteticos exhibieron actividad adyuvante, incluyendo el bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA) y ciertos polfmeros de bloque de polioxipropileno-polioxietileno (POP-POE) (Snippe y col., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 65:390-398, 1981 y Hunter y col., J. Immunol. 127:1244-1250, 1981).

El termino «especffico/a» se puede usar para hacer referencia a la situacion en la que un miembro de un par de union 40 especffica no mostrara union significativa a moleculas diferentes de su uno o mas ligandos de union especfficos. El termino tambien es aplicable cuando, p. ej., un dominio de union de antfgeno es especffico para un epftopo concreto portado por varios antfgenos, en cuyo caso, el miembro de union especffico que porta el dominio de union de antfgeno sera capaz de unirse a los diversos antfgenos que portan el epftopo.

45 El termino «comprende» se usa generalmente en el sentido de incluir, es decir, permitir la presencia de una o mas caracterfsticas o componentes.

El termino «que consiste esencialmente en» se refiere a un producto, en particular, una secuencia peptfdica, de un numero definido de residuos que no estan unidos covalentemente a un producto mas grande. En el caso del peptido 50 de la invencion antes mencionado, los expertos en la materia comprenderan que se pueden contemplar modificaciones menores del extremo N- o C-terminal del peptido, tales como la modificacion qufmica del extremo terminal para anadir un grupo protector o similares, p. ej., la amidacion del extremo C-terminal.

El termino «aislado» se refiere al estado en el que estaran los miembros de union especffica de la invencion, o el acido 55 nucleico que codifica tales miembros de union, segun la presente invencion. Los miembros y acidos nucleicos estaran libres o sustancialmente libres del material con el que estan asociados naturalmente, tal como otros polipeptidos o acidos nucleicos con los que se encuentran en su medio natural, o el medio en el que se preparan (p. ej., un cultivo celular) cuando tal preparacion es mediante tecnologfa de ADN recombinante practicada in vitro o in vivo. Los miembros y acidos nucleicos pueden formularse con diluyentes o adyuvantes e incluso, a efectos practicos, aislarse, 60 por ejemplo, los miembros normalmente se mezclaran con gelatina u otros vehfculos si se usan para recubrir placas

de microtitulacion para uso en inmunoensayos, o se mezclaran con vehfculos o diluyentes farmaceuticamente aceptables cuando se usan en diagnostico o terapia.

Como se usa en el presente documento, «pg» significa picogramo, «ng» significa nanogramo, «ug» o «pg» significa 5 microgramo, «mg» significa miligramo, «ul» o «pl» significa microlitro, «ml» significa mililitro y «l» significa litro.

Los terminos «anticuerpo», «anticuerpo anti-TGFp1», «anticuerpo del TGFbeta1», «anticuerpo del TGF-p1", «anticuerpo del TGFpl humano/de raton» y cualquier variante no mencionada especfficamente pueden usarse indistintamente en el presente documento y, como se usan a lo largo de la presente solicitud y reivindicaciones, se 10 refieren al material proteinaceo que incluye protefnas unicas o multiples, y se extienden a aquellas protefnas que tienen los datos de secuencia de aminoacidos descritos en el presente documento y presentados en la Figura 1 y el perfil de actividades expuesto en el presente documento y en las reivindicaciones. Tales anticuerpos del TGFp1 ejemplares proporcionados en el presente documento incluyen los anticuerpos 4C3.7, 8D6, 19D8, 4A11, 19H11, 21C11, 13A1 y 4G9 como se proporcionan y caracterizan en el presente documento. En el presente documento se 15 caracteriza, en particular, el anticuerpo ejemplar 13A1 y se extiende a los anticuerpos o protefnas, incluyendo fragmentos de anticuerpo, que tienen los datos de secuencia de aminoacidos descritos en el presente documento y presentados en la Figura 1 y el perfil de actividades expuesto en el presente documento y en las reivindicaciones. Por consiguiente, se contemplan asimismo las protefnas que presentan actividad sustancialmente equivalente o alterada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, por ejemplo, tal como modificaciones obtenidas por medio de 20 mutagenesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tal como las obtenidas por medio de mutaciones en los huespedes que son productores del complejo o sus subunidades mencionadas. Los terminos «anticuerpo», «anticuerpo anti-TGFp1», «anticuerpo del TGFbeta1», «anticuerpo del TGF-p1», «anticuerpo del TGFp1 humano/de raton» y los anticuerpos ejemplares 4C3.7, 8D6, 19D8, 4A11, 19H11,21C11, 13A1 y 4G9, en particular, incluyendo el anticuerpo 13A1, tambien estan destinados a incluir en su alcance protefnas especfficamente citadas en el presente 25 documento, asf como todos sus analogos y variaciones alelicas sustancialmente homologas.

Los residuos de aminoacido descritos en el presente documento se prefiere que esten en la forma isomerica «L». Sin embargo, los residuos en la forma isomerica «D» pueden ser sustituidos por cualquier residuo de L-aminoacido, siempre y cuando la propiedad funcional deseada de union de inmunoglobulina sea retenida por el polipeptido. NH2 30 se refiere al grupo amino libre presente en el extremo terminal amino de un polipeptido COOH se refiere al grupo carboxilo libre presente el extremo terminal carboxilo de un polipeptido. De acuerdo con la nomenclatura estandar de los polipeptidos, J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969), las abreviaturas de residuos de aminoacidos se muestran en la siguiente Tabla de Correspondencia:

35 TABLA DE CORRESPONDENCIA

SIMBOLO

AMINOACIDO

Una letra

T res letras

Y

Tyr tirosina

G

Gly glicina

F

Phe fenilalanina

M

Met metionina

A

Ala alanina

S

Ser serina

I

Ile isoleucina

L

Leu leucina

T

Thr treonina

V

Val valina

P

Pro prolina

K

Lys lisina

H

His histidina

Q

Gln glutamina

E

Glu acido glutamico

W

Trp triptofano

R

Arg arginina

D

Asp acido aspartico

N

Asn asparagina

C

Cys cistefna

Cabe senalar que todas las secuencias de residuos de aminoacido estan representadas en el presente documento

mediante formulas cuya orientacion izquierda y derecha esta en la direccion convencional de extremo terminal amino a extremo terminal carboxilo. Asimismo, cabe senalar que un guion al principio o al final de una secuencia de residuos de aminoacido indica un enlace peptfdico a una secuencia adicional de uno o mas residuos de aminoacido. La Tabla anterior se presenta para correlacionar las notaciones de tres letras y una letra que pueden aparecer alternativamente 5 en este documento.

Un «replicon» es cualquier elemento genetico (p. ej., plasmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad autonoma de replicacion de ADN in vivo; es decir, capaz de replicacion bajo su propio control.

10 Un «vector» es un replicon, tal como un plasmido, fago o cosmido, al que se puede unir otro segmento de ADN con el fin de lograr la replicacion del segmento unido.

Una «molecula de ADN» se refiere a la forma polimerica de los desoxirribonucleotidos (adenina, guanina, timina o citosina) en su forma monocatenaria o de una helice bicatenaria. Este termino se refiere unicamente a la estructura 15 primaria y secundaria de la molecula y no se limita a cualquier forma terciaria concreta. Por tanto, este termino incluye ADN bicatenario encontrado, entre otros, en moleculas de ADN lineales (p. ej., fragmentos de restriccion), virus, plasmidos y cromosomas. Al comentar la estructura de moleculas de ADN bicatenarias concretas, las secuencias pueden describirse en el presente documento segun la convencion normal de dar unicamente la secuencia en la direccion 5' a 3' a lo largo de la cadena de ADN no transcrita (es decir, la cadena que tiene una secuencia homologa 20 al ARNm).

Un «origen de replicacion» se refiere a aquellas secuencias de ADN que participan en la sfntesis de ADN.

Una «secuencia codificadora» de ADN es una secuencia de ADN bicatenario que es transcrita y traducida a un 25 polipeptido in vivo cuando se pone bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los lfmites de la secuencia codificadora son determinados por un codon de iniciacion en el extremo 5' (amino) y un codon de detencion de la traduccion en el extremo 3' (carboxilo). Una secuencia codificadora puede incluir, pero no se limita a, secuencias procariotas, ADNc de ARNm eucariota, secuencias de ADN genomico de ADN eucariota (p. ej., de mamffero), e incluso a secuencias de ADN sinteticas. Una senal de poliadenilacion y una secuencia de terminacion de la transcripcion 30 normalmente estaran ubicadas en direccion 3' a la secuencia codificadora.

Las secuencias de control transcripcional y traduccional son secuencias reguladoras de ADN, tales como promotores, potenciadores, senales de poliadenilacion, terminadores y similares, que posibilitan la expresion de una secuencia codificadora en una celula huesped.

35

Una «secuencia promotora» es una region reguladora de ADN capaz de unir ARN polimerasa en una celula e iniciar la transcripcion de una secuencia codificadora aguas abajo (direccion 3'). A efectos de definicion de la presente invencion, la secuencia promotora esta unida en su extremo 3' por el sitio de iniciacion de la transcripcion y se extiende aguas arriba (direccion 5') para incluir el numero mfnimo de bases o elementos necesario para iniciar la transcripcion 40 a niveles detectables por encima del nivel de fondo. Dentro de la secuencia promotora se encontrara un sitio de iniciacion de la transcripcion (definido convenientemente mapeando con nucleasa S1), asf como dominios de union de protefna (secuencias de consenso) responsables de la union de ARN polimerasa. Los promotores eucariotas frecuentemente, pero no siempre, contendran cajas «TATA» y cajas «CAT». Los promotores procariotas contienen secuencias de Shine-Dalgarno ademas de las secuencias de consenso -10 y -35.

45

Una «secuencia de control de la expresion» es una secuencia de ADN que controla y regula la transcripcion y traduccion de otra secuencia de ADN. Una secuencia codificadora esta «bajo el control» de secuencias de control transcripcional y traduccional en una celula cuando la ARN polimerasa transcribe la secuencia codificadora en ARNm, que es traducido, a continuacion, en la protefna codificada por la secuencia codificadora.

50

Se puede incluir una «secuencia senal» antes de la secuencia codificadora. Esta secuencia codifica un peptido senal, N-terminal al polipeptido, que se comunica con la celula huesped para dirigir al polipeptido a la superficie celular o secretar el polipeptido en el medio, y este peptido senal es cortado por la celula huesped antes de que la protefna deje la celula. Las secuencias senal pueden encontrarse asociadas a una variedad de protefnas nativas para procariotas y 55 eucariotas.

El termino «oligonucleotido», como se usa en el presente documento al hacer referencia a la sonda de la presente invencion, se define como una molecula compuesta por dos o mas ribonucleotidos, preferiblemente mas de tres. Su tamano exacto dependera de muchos factores que, a su vez, dependen de la funcion y uso final del oligonucleotido.

El termino «cebador», como se usa en el presente documento, se refiere a un oligonucleotido, ya sea natural como en un producto de la digestion con enzimas de restriccion purificado o producido sinteticamente, que es capaz de actuar como un punto de inicio de la sfntesis cuando se pone en condiciones en las que se induce la sfntesis de un producto de extension de cebador, que es complementario a una cadena de acido nucleico, es decir, en presencia de 5 nucleotidos y un agente inductor tal como ADN polimerasa y a una temperatura y pH adecuados. El cebador puede ser monocatenario o bicatenario y debe ser lo suficientemente largo para cebar la sfntesis del producto de extension deseado en presencia del agente inductor. La longitud exacta del cebador dependera de muchos factores, que incluyen la temperatura, la fuente del cebador y el uso del metodo. Por ejemplo, para aplicaciones diagnosticas, dependiendo de la complejidad de la secuencia diana, el oligonucleotido cebador habitualmente contiene 15-25 nucleotidos o mas, 10 aunque puede contener menos nucleotidos.

Los cebadores del presente documento se seleccionan para que sean «sustancialmente» complementarios a diferentes cadenas de una secuencia de ADN diana concreta. Esto significa que los cebadores deben ser lo suficientemente complementarios para hibridarse con sus respectivas cadenas. Por lo tanto, la secuencia de cebador 15 no necesita reflejar la secuencia exacta del molde. Por ejemplo, se puede unir un fragmento de nucleotido no complementario al extremo 5' del cebador, siendo el resto de la secuencia del cebador complementaria a la cadena. Como alternativa, se pueden intercalar bases no complementarias o secuencias mas largas en el cebador, siempre y cuando la secuencia del cebador tenga la suficiente complementariedad con la secuencia de la cadena para hibridarse con la misma y, de ese modo, formar el molde para la sfntesis del producto de extension.

20

Tal como se usan en el presente documento, los terminos «endonucleasas de restriccion» y «enzimas de restriccion» se refieren a enzimas bacterianas, cada una de las cuales corta el ADN bicatenario en, o cerca de, una secuencia de nucleotidos especffica.

25 Una celula ha sido «transformada» por ADN exogeno o heterologo cuando tal ADN ha sido introducido en la celula. El ADN transformante puede o no ser integrado (conectado covalentemente) en el ADN cromosomico que constituye el genoma de la celula. En procariotas, levaduras y celulas de mamffero, por ejemplo, el ADN transformante se puede mantener sobre un elemento episomal tal como un plasmido. Con respecto a las celulas eucariotas, una celula transformada establemente es aquella en la que el ADN transformante se ha integrado en un cromosoma de tal forma 30 que es heredado por las celulas hijas por medio de replicacion del cromosoma. Esta estabilidad es demostrada por la capacidad de la celula eucariota para establecer lfneas celulares o clones compuestos por una poblacion de celulas hijas que contienen el ADN transformante. Un «clon» es una poblacion de celulas derivadas de una sola celula o ancestro comun mediante mitosis. Una «lfnea celular» es un clon de una celula primaria que es capaz de tener un crecimiento estable in vitro durante muchas generaciones.

35

Dos secuencias de ADN son «sustancialmente homologas» cuando al menos aproximadamente el 75 % (preferiblemente al menos aproximadamente el 80 %, y lo mas preferiblemente al menos aproximadamente el 90 o 95 %) de los nucleotidos concuerdan sobre la longitud definida de las secuencias de ADN. Las secuencias que son sustancialmente homologas pueden identificarse comparando las secuencias con software convencional disponible 40 en los bancos de datos de secuencias, o en un experimento de hibridacion Southern en, por ejemplo, condiciones estrictas como las definidas para ese sistema concreto. La definicion de las condiciones de hibridacion apropiadas es del dominio del experto en la materia. Vease, p. ej., Maniatis y col., arriba; DNA Cloning, Vol. I y II, arriba; Nucleic Acid Hybridization, arriba.

45 Se entendera que tambien se encuentran dentro del alcance de la presente invencion las secuencias de ADN que codifican miembros de union especffica (anticuerpos) de la invencion que codifican para, p. ej., un anticuerpo que tiene la secuencia de aminoacidos como se proporciona en la Figura 1, o que comprenden las secuencias de la region de domino CDR presentadas en el presente documento o en la Figura 1 pero que estan degeneradas para la misma. Por «degeneradas» se entiende que se usa un codon de tres letras diferente para especificar un aminoacido concreto. Es 50 bien sabido en la tecnica que los codones siguientes pueden usarse indistintamente pata codificar para cada aminoacido especffico:

Fenilalanina (Phe o F)

UUU o UUC

Leucina (Leu o L)

UUA o UUG o CUU o CUC o CUA o CUG

Isoleucina (Ile o I)

AUU o AUC o AUA

Metionina (Met o M)

AUG

Valina (Val o V)

GUU o GUC o GUA o GUG

Serina (Ser o S)

UCU o UCC o UCA o UCG o AGU o AGC

Prolina (Pro o P)

CCU o CCC o CCA o CCG

Treonina (Thr o T)

ACU o ACC o ACA o ACG

Alanina (Ala o A)

GCU o GCG o GCA o GCG

Tirosina (Tyr o Y)

UAU o UAC

Histidina (His o H)

CAU o CAC

Glutamina (Gln o Q)

CAA o CAG

Asparagina (Asn o N)

AAU o AAC

Lisina (Lys o K)

AAA o AAG

Acido aspartico (Asp o D)

GAU o GAC

Acido glutamico (Glu o E)

GAA o GAG

Cistefna (Cys o C)

UGU o UGC

Arginina (Arg o R)

CGU o CGC o CGA o CGG o AGA o AGG

Glicina (Gly o G)

GGU o GGC o GGA o GGG

Triptofano (Trp o W)

UGG

Codon de terminacion

UAA (ocre) o UAG (ambar) o UGA (opalo)

Se entendera que los codones especificados anteriormente son para secuencias de ARN. Los codones correspondientes para ADN tienen una T sustituida por U.

5 Pueden hacerse mutaciones en las secuencias que codifican los aminoacidos, fragmentos de anticuerpo y secuencias de region CDR presentadas en la Figura 1 y en las SEQ ID NO: 1-8 y 11-12, de tal forma que un codon concreto se cambia por un codon que codifica para un aminoacido diferente. Tal mutacion generalmente se realiza haciendo los menos cambios posibles de nucleotidos. Se puede hacer una mutacion de sustitucion de este tipo para cambiar un aminoacido de la protefna resultante de manera no conservadora (por ejemplo, cambiando el codon de un aminoacido 10 que pertenece a un grupo de aminoacidos que tienen un tamano o caracterfstica concreta por un aminoacido que pertenece a otro grupo), o de manera conservadora (por ejemplo, cambiando el codon de un aminoacido que pertenece a un grupo de aminoacidos que tienen un tamano o caracterfstica concreta por un aminoacido que pertenece al mismo grupo). Tal cambio conservador generalmente lleva a un cambio menor en la estructura y funcion de la protefna resultante. Un cambio no conservador es mas probable que altere la estructura, actividad o funcion de la protefna 15 resultante. Se debe considerar que la presente invencion incluye secuencias que contienen cambios conservadores que no alteran significativamente la actividad o caracterfsticas de union de la protefna resultante.

El siguiente es un ejemplo de diversos grupos de aminoacidos:

20 Aminoacidos con grupos R no polares

Alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, triptofano, metionina

Aminoacidos con grupos R polares no cargados

25

Glicina, serina, treonina, cistefna, tirosina, asparagina, glutamina

Aminoacidos con grupos R polares cargados (cargados negativamente a pH 6,0)

30 Acido aspartico, acido glutamico

Aminoacidos basicos (cargados positivamente a pH 6,0)

Lisina, arginina, histidina (a pH 6,0)

35

Otros grupos pueden ser los aminoacidos con grupos fenilo: fenilalanina, triptofano, tirosina

Otro grupo puede ser segun su peso molecular (es decir, el tamano de los grupos R):

40

Glicina

75 Alanina 89

Serina

105 Prolina 115

Valina

117 Treonina 119

Cistefna

121 Leucina 131

Isoleucina

131 Asparagina 132

Acido aspartico

133 Glutamina 146

Lisina

146 Acido glutamico 147

Metionina

149 Histidina (con pH de 6,0) 155

Fenilalanina

165 Arginina 174

Tirosina

181 Triptofano 204

Las sustituciones particularmente preferidas son:

• Lys por Arg y viceversa, de tal forma que se pueda mantener una carga positiva;

5 • Glu por Asp y viceversa, de tal forma que se pueda mantener una carga negativa;

• Ser por Thr, de tal forma que se pueda mantener un -OH libre; y

• Gln por Asn, de tal forma que se pueda mantener un NH2 libre.

Las sustituciones conservadoras de aminoacidos ejemplares y preferidas incluyen cualquiera de:

10 glutamina (Q) por acido glutamico (E) y viceversa; leucina (L) por valina (V) y viceversa; serina (S) por treonina (T) y viceversa; isoleucina (I) por valina (V) y viceversa; lisina (K) por glutamina (Q) y viceversa; isoleucina (I) por metionina (M) y viceversa; serina (S) por asparagina (N) y viceversa; leucina (L) por metionina (M) y viceversa; lisina (L) por acido glutamico (E) y viceversa; alanina (A) por serina (S) y viceversa; tirosina (Y) por fenilalanina (F) y viceversa; acido glutamico (E) por acido aspartico (D) y viceversa; leucina (L) por isoleucina (I) y viceversa; lisina (K) por arginina 15 (R) y viceversa.

Tambien se pueden introducir sustituciones de aminoacidos para sustituir un aminoacido con una propiedad particularmente preferible. Por ejemplo, se puede introducir una Cys como un sitio potencial de puentes disulfuro por otra Cys. Se puede introducir una His como un sitio particularmente «catalftico» (es decir, His puede actuar como un 20 acido o una base y es el aminoacido mas comun en la catalisis bioqufmica). Se puede introducir una Pro debido a su estructura particularmente plana, que induce giros p en la estructura de la protefna.

Dos secuencias de aminoacidos son «sustancialmente homologas» cuando al menos aproximadamente el 70 % de los residuos de aminoacidos (preferiblemente, al menos aproximadamente el 80 %, y lo mas preferiblemente al menos 25 aproximadamente el 90 % o 95 %) son identicos, o representan sustituciones conservadoras. Las regiones CDR de dos anticuerpos son sustancialmente homologas cuando uno o mas aminoacidos estan sustituidos con una sustitucion de aminoacidos conservadora o similar, y donde el uno o mas anticuerpos tienen el perfil de union y las actividades de uno o mas de los anticuerpos, particularmente del anticuerpo 13A1 desvelado en el presente documento. Un anticuerpo puede ser sustancialmente homologo donde uno, dos o tres aminoacidos, o hasta tres aminoacidos, de las 30 regiones de dominio CDR estan sustituidos por otro aminoacido y donde el anticuerpo retiene el perfil de union de antfgeno y actividades.

Una region «heterologa» del constructo de ADN es un segmento de ADN identificable dentro de una molecula de ADN mas grande que no se encuentra en la naturaleza asociado a la molecula mas grande. Por tanto, cuando la region 35 heterologa codifica un gen de mamffero, el gen estara normalmente flanqueado por ADN que no flanquea el ADN genomico de mamffero en el genoma del organismo fuente. Otro ejemplo de una secuencia codificadora heterologa es un constructo en el que la propia secuencia codificadora no se encuentra en la naturaleza (p. ej., un ADNc en el que la secuencia codificadora genomica contiene intrones, o secuencias sinteticas que tienen codones diferentes al gen nativo). Las variaciones alelicas o eventos mutacionales naturales no dan lugar a una region heterologa de ADN 40 como se define en el presente documento.

Una secuencia de ADN esta «conectada operativamente» a una secuencia de control de la expresion cuando la secuencia de control de la expresion controla y regula la transcripcion y traduccion de esa secuencia de ADN. La expresion «conectada operativamente» incluye tener una senal de inicio apropiada (p. ej., ATG) delante de la 45 secuencia de ADN a expresar y mantener el marco de lectura correcto para permitir la expresion de la secuencia de ADN bajo el control de la secuencia de control de la expresion y la produccion del producto deseado codificado por la secuencia de ADN. Si un gen que se desea introducir en una molecula de ADN recombinante no contiene una senal de inicio apropiada, tal senal de inicio puede ser introducida delante del gen. 50 * * * * 55

50 El termino «condiciones de hibridacion estandar» se refiere a las condiciones se salinidad y temperatura

sustancialmente equivalentes a 5 x SCC y 65 °C tanto para hibridacion como para lavado. Sin embargo, un experto

en la materia comprendera que tales «condiciones de hibridacion estandar» son dependientes de condiciones

concretas, que incluyen la concentracion de sodio y magnesio en el tampon, la longitud de la secuencia de nucleotidos

y la concentracion, el porcentaje de falta de identidad, el porcentaje de formamida y similares. Tambien es importante

55 en la determinacion de las «condiciones de hibridacion estandar» si las dos secuencias que se hibridan son ARN- ARN, ADN-ADN o ARN-ADN. Tales condiciones de hibridacion estandar son facilmente determinadas por un experto

en la materia segun formulas bien conocidas, donde la hibridacion es habitualmente a 10-20 °C por debajo de la Tm prevista o determinada con lavados de exigencia mas alta, si se desea.

El termino «agente» significa cualquier molecula, incluyendo polipeptidos, anticuerpos, polinucleotidos, compuestos 5 qufmicos y moleculas pequenas. En particular, el termino agente incluye compuestos tales como compuestos de ensayo o compuestos de farmacos candidatos.

El termino «agonista» se refiere a un ligando que estimula el receptor al que se une el ligando en el sentido mas amplio.

10

El termino «ensayo» significa cualquier procedimiento usado para medir una propiedad especffica de un compuesto. Un «ensayo de cribado» significa un proceso usado para caracterizar o seleccionar compuestos de una biblioteca de compuestos en funcion de su actividad.

15 El termino «prevenir» o «prevencion» se refiere a una reduccion del riesgo de adquirir o desarrollar una enfermedad o trastorno (es decir, que provoca que al menos uno de los sfntomas clfnicos de la enfermedad no se desarrolle) en un sujeto que puede estar expuesto a un agente causante de la enfermedad, o predispuesto a la enfermedad, con antelacion al inicio de la enfermedad.

20 El termino «profilaxis» esta relacionado con el termino «prevencion» y es abarcado por el mismo, y se refiere a una medida o procedimiento cuyo proposito es prevenir, en lugar de tratar o curar una enfermedad. Los ejemplos no limitantes de medidas profilacticas pueden incluir la administracion de vacunas; la administracion de heparina de bajo peso molecular a pacientes hospitalarios con riesgo de trombosis debido a, por ejemplo, inmovilizacion; y la administracion de un agente contra la malaria, tal como cloroquina, con antelacion a una visita a una region geografica 25 en la que la malaria es endemica o el riesgo de contraer malaria es alto.

«Cantidad terapeuticamente efectiva» significa aquella cantidad de un farmaco, compuesto, antimicrobiano, anticuerpo o agente farmaceutico que provocara la respuesta biologica o medica de un sujeto buscada por un doctor especialista u otro medico. En particular, con respecto a las infecciones por bacterias gram positivas y el crecimiento de bacterias 30 gram positivas, el termino «cantidad efectiva» esta destinado a incluir una cantidad efectiva de un compuesto o agente que lograra una reduccion biologicamente significativa de la cantidad o magnitud de regresion tumoral y/o aumentara el tiempo de supervivencia de un sujeto, o el periodo libre de enfermedad o de remision. La expresion «cantidad terapeuticamente efectiva» se usa en el presente documento para indicar una cantidad suficiente para prevenir, y preferiblemente reducir en al menos aproximadamente un 30 por ciento, mas preferiblemente al menos un 50 por 35 ciento, lo mas preferiblemente al menos un 90 por ciento, un cambio clfnicamente significativo en el crecimiento o la cantidad del tamano tumoral, o mejorar la supervivencia o el periodo libre de enfermedad en al menos aproximadamente un 30 por ciento, mas preferiblemente en al menos un 50 por ciento, lo mas preferiblemente en al menos un 90 por ciento.

40 El termino «tratar» o «tratamiento» de cualquier enfermedad o infeccion se refiere, en una forma de realizacion, a mejorar la enfermedad o infeccion (es decir, detener la enfermedad o el crecimiento del agente infeccioso o la bacteria o reducir la manifestacion, magnitud o gravedad de al menos uno de los sfntomas clfnicos de la misma). En otra forma de realizacion, «tratar» o «tratamiento» se refiere a mejorar al menos un parametro ffsico, que puede no ser discernible por el sujeto. En otra forma de realizacion mas, «tratar» o «tratamiento» se refiere a modular la enfermedad o infeccion, 45 ya sea ffsicamente (p. ej., estabilizacion de un sfntoma discernible), fisiologicamente (p. ej., estabilizacion de un parametro ffsico) o ambas. En una forma de realizacion adicional, «tratar» o «tratamiento» se refiere a ralentizar la progresion de una enfermedad o reducir una infeccion.

La expresion «farmaceuticamente aceptable» se refiere a entidades moleculares y composiciones que son 50 fisiologicamente tolerables y habitualmente no producen reaccion alergica o adversa similar, tal como molestias gastricas, mareos y similares, cuando se administran a un humano.

Como se usa en el presente documento, «pg» significa picogramo, «ng» significa nanogramo, «ug» o «pg» significa microgramo, «mg» significa miligramo, «ul» o «pl» significa microlitro, «ml» significa mililitro y «l» significa litro.

55

B. DESCRIPCION DETALLADA

La invencion proporciona anticuerpos dirigidos contra el factor de crecimiento transformante beta 1 (TGFp1) para fines diagnosticos y terapeuticos. En particular, se proporcionan anticuerpos especfficos para el TGF-p1, donde dichos 60 anticuerpos reconocen y son capaces de unir el TGF-p1 humano y de raton, y no reconocen o se unen a otras formas

de TGF beta, en particular, los anticuerpos no reconocen o unen el TGF-p2 o TGF-p3. En el presente documento se proporcionan, en particular, anticuerpos del TGF-p1 ejemplares. Los anticuerpos ejemplares incluyen los anticuerpos 4C3.7, 8D6, 19D8, 4A11, 19H11, 21C11, 13A1 y 4G9. La invencion proporciona, en particular, un anticuerpo o fragmento activo del mismo que reconoce y neutraliza el TGF-p1. Los anticuerpos ejemplares capaces de reconocer 5 especfficamente el TGF-p1 y neutralizar el TGF-p1 incluyen los anticuerpos 4C3.7, 19D8, 13A1 y 4G9. Los anticuerpos de la presente invencion tienen un uso diagnostico y terapeutico en la inmunomodulacion y el cancer. En un aspecto concreto, los anticuerpos de la invencion son aplicables en canceres, que incluyen, pero no se limitan a, carcinoma adrenocortical, canceres relacionados con el SIDA, linfoma relacionado con el SIDA, cancer anal, cancer anorrectal, cancer del canal anal, cancer de apendice, astrocitoma cerebeloso infantil, astrocitoma cerebral infantil, carcinoma de 10 celulas basales, cancer de piel (no melanoma), cancer biliar, cancer del conducto biliar extrahepatico, cancer del conducto biliar intrahepatico, cancer de vejiga, cancer de la vejiga urinaria, cancer de hueso y articulaciones, osteosarcoma e histiocitoma fibroso maligno, cancer de cerebro, tumor cerebral, glioma del tronco encefalico, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral/glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodermicos primitivos supratentoriales, glioma hipotalamico y de las vfas opticas centrales, cancer de mama, 15 adenomas/carcinoides bronquiales, tumor carcinoide, gastrointestinal, cancer del sistema nervioso, linfoma del sistema nervioso, cancer del sistema nervioso central, linfoma del sistema nervioso central, cancer cervical, canceres infantiles, leucemia linfocftica cronica, leucemia mielogena cronica, trastornos mieloproliferativos cronicos, cancer de colon, cancer colorrectal, linfoma de celulas T cutaneo, neoplasia linfoide, micosis fungoide, sfndrome de Seziary, cancer endometrial, cancer esofagico, tumor de celulas germinales extracraneal, tumor de celulas germinales 20 extragonadal, cancer del conducto biliar extrahepatico, cancer de ojo, melanoma intraocular, retinoblastoma, cancer de la vesfcula biliar, cancer gastrico (estomago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumor de estroma gastrointestinal (TEGI), tumor de celulas germinales, tumor de celulas germinales de ovario, tumor trofoblastico gestacional, glioma, cancer de cabeza y cuello, cancer hepatocelular (hfgado), linfoma de Hodgkin, cancer hipofarfngeo, melanoma intraocular, cancer ocular, tumores de las celulas de los islotes (pancreas endocrino), sarcoma de Kaposi, cancer de 25 rinon, cancer renal, cancer de rinon, cancer de laringe, leucemia linfoblastica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocftica cronica, leucemia mielogena cronica, leucemia de celulas pilosas, cancer de labio y cavidad oral, cancer de hfgado, cancer de pulmon, cancer de pulmon de celulas no pequenas, cancer de pulmon de celulas pequenas, linfoma relacionado con el SIDA, linfoma no Hodgkiniano, linfoma primario del sistema nervioso central, macroglobulinemia de Waldenstram, meduloblastoma, melanoma, melanoma intraocular (ojo), carcinoma de las 30 celulas de Merkel, mesotelioma maligno, mesotelioma, cancer escamoso metastasico de cuello, cancer de boca, cancer de lengua, sfndrome de neoplasia endocrina multiple, micosis fungoide, sfndromes mielodisplasicos, enfermedades mielodisplasicas/mieloproliferativas, leucemia mielogena cronica, leucemia mieloide aguda, mieloma multiple, trastornos mieloproliferativos cronicos, cancer nasofarfngeo, neuroblastoma, cancer oral, cancer de la cavidad oral, cancer orofarfngeo, cancer ovarico, cancer epitelial de ovario, tumor ovarico de bajo potencial de 35 malignidad, cancer pancreatico, cancer pancreatico de los islotes, cancer de seno paranasal y de la cavidad nasal, cancer paratiroideo, cancer de pene, cancer farfngeo, feocromocitoma, pineoblastoma y tumores neuroectodermicos primitivos supratentoriales, tumor pituitario, neoplasia de celulas plasmaticas/mieloma multiple, blastoma pleuropulmonar, cancer de prostata, cancer rectal, cancer de celulas transicionales de pelvis renal y ureter, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cancer de las glandulas salivares, tumores de la familia del sarcoma de Ewing, 40 sarcoma de Kaposi, sarcoma de tejidos blandos, cancer uterino, sarcoma uterino, cancer de piel (no melanoma), cancer de piel (melanoma), carcinoma cutaneo de celulas de Merkel, cancer del intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, carcinoma de celulas escamosas, cancer de estomago (gastrico), tumores neuroectodermicos primitivos supratentoriales, cancer testicular, cancer de garganta, timoma, timoma y carcinoma tfmico, cancer de tiroides, cancer de celulas transicionales de pelvis renal y ureter y otros organos urinarios, tumor trofoblastico gestacional, cancer de 45 uretra, cancer uterino endometrial, sarcoma uterino, cancer del cuerpo uterino, cancer vaginal, cancer vulvar y tumor de Wilms.

En un aspecto general, la presente invencion proporciona una molecula de anticuerpo aislado o fragmento del mismo que reconoce el factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-p1) humano y de raton, no reacciona con el TGF-p2 50 o TGF-p3 y neutraliza la actividad del TGF-p1; y que comprende una region variable de cadena pesada que comprende las secuencias de dominio CDR CDR1 GYTFTNYW (SEQ ID NO: 11)_o GYTFTNYWMH (SEQ ID NO: 3), CDR2 IYPGNSDT (SEQ ID NO: 12) o TIYPGNSDTN (SEQ ID NO: 4)_ y CDR3 EDSRSLYYNGWDYFDY (SEQ ID NO: 5) y una region variable de cadena ligera que comprende las secuencias de dominio CDR CDR1 ESVDNYGISF (SEQ ID NO: 6), CDR2 YAAS (SEQ ID NO: 7) y CDR3 QQSKEVPRT (SEQ ID NO: 8). En un aspecto concreto, el anticuerpo 55 de la presente invencion bloquea la senalizacion mediada por el TGF-p1 y/o la respuesta celular o proliferacion celular mediada por el TGF-p1. En un aspecto concreto, la invencion proporciona el anticuerpo especffico anti-TGF-p1 13A1. En un aspecto concreto adicional, la invencion proporciona un anticuerpo especffico del TGF-p1 capaz de unir especfficamente y neutralizar el TGF-p1 que comprende la secuencia de aminoacidos de cadena pesada como se presenta en la Figura 1. En tal aspecto, la invencion proporciona un anticuerpo del TGF-p1 que comprende las 60 secuencias CDR de la region variable de cadena pesada presentadas en la Figura 1. El anticuerpo de la invencion

puede comprender la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 1) presentada en la Figura 1 o las secuencias de la region de dominio CDR de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 de la Figura 1 y una region variable de cadena ligera. El anticuerpo de la invencion puede comprender la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 2) o las secuencias CDR de cadena ligera como se presentan en 5 la Figura 1. En un aspecto de la misma, se proporciona anticuerpo especffico del TGF-p1 que tiene una region variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoacidos del dominio CDR 1, CDR2 y CDR3 de ESVDNYGISF (SEQ ID NO: 6), YAAS (SEQ ID NO: 7) y QQSKEVPRT (SEQ ID NO: 8), respectivamente.

Se pueden cribar paneles de anticuerpos monoclonales que reconocen el TGF-p1 humano y de raton para determinar 10 diversas propiedades; es decir, isotipo, epftopo, afinidad, etc. De particular interes son los anticuerpos que simulan la actividad de los anticuerpos ejemplares 4C3.7, 19D8, 13A1 y/o 4G9 y tienen afinidad por el TGF-p1 humano y de raton, no reaccionan con el TGF-p2 o TGF-p3, e influyen directamente en la actividad del TGF-p1, en particular, neutralizan el TGF-p1. Tales anticuerpos pueden identificarse y/o cribarse facilmente en ensayos de actividad de miembros de union especffica.

15

Un anticuerpo monoclonal de la presente invencion puede comprender una region variable de cadena pesada, tal como se ilustra en la Figura 1, y opcionalmente una region variable de cadena ligera. En general, las regiones CDR, que comprenden secuencias de aminoacidos sustancialmente como las presentadas como las regiones CDR de la Figura 1, seran portadas en una estructura que permita la union de las regiones CDR al TGF-p1 y, en particular, al 20 TGF-p1 humano y de raton.

Por «sustancialmente como se presentan» se entiende que las secuencias de la region variable y/o, en particular, las secuencias CDR de la invencion seran identicas o muy homologas a las regiones especificadas de la Figura 1. Por «muy homologas» se contempla que solo se pueden hacer unas pocas sustituciones, preferiblemente de 1 a 8, 25 preferiblemente de 1 a 5, preferiblemente de 1 a 4, o de 1 a 3, o de 1 a 2 sustituciones en la secuencia de la region variable y/o en las secuencias CDR. El termino sustancialmente como se presentan incluye, en particular, sustituciones conservadoras de aminoacidos que no afectan materialmente o significativamente a la especificidad y/o actividad de los presentes anticuerpos. En el presente documento se contemplan sustituciones conservadoras y no conservadoras de aminoacidos para las secuencias de la region variable y tambien para la secuencias de la region CDR.

30

Las sustituciones se pueden hacer en la secuencia de la region variable no perteneciente a las CDR con el fin de retener las secuencias CDR. Por tanto, pueden introducirse o utilizarse cambios en la secuencia de la region variable o las secuencias de la region variable no homologas o inactivadas alternativas de tal forma que las secuencias CDR se mantengan y el resto de la secuencia de la region variable se pueda sustituir.

35

Como alternativa, se pueden hacer sustituciones, en particular, en las CDR. Las secuencias CDR para el anticuerpo, en particular, el anticuerpo 13A1, de la presente invencion se presentan y describen en el presente documento, incluyendo en la Figura 1. El anticuerpo 13A1 comprende las secuencias CDR de cadena pesada CDR1 GYTFTNYWMH (SEQ ID NO: 3), CDR2 TIYPGNSDTN (SEQ ID NO: 4) y CDR3 EDSRSLYYNGWDYFDY (SEQ ID 40 NO: 5), como se presentan en la Figura 1. Cuando se especifica un grupo de CDR aceptado mas corto, el anticuerpo comprende las secuencias CDR de cadena pesada CDR1 GYTFTNYW (SEQ ID NO: 11), CDR2 IYPGNSDT (SEQ ID NO: 12) y CDR3 EDSRSLYYNGWDYFDY (SEQ ID NO: 5). El anticuerpo 13A1 comprende las secuencias CDR de cadena ligera CDR1 ESVDNYGISF (SEQ ID NO: 6), CDR2 YAAS (SEQ ID NO: 7) y CDR3 QQSKEVPRT (SEQ ID NO: 8).

45

Los anticuerpos de la invencion que tienen sustituciones como se han descrito y contemplado anteriormente se seleccionan para que mantengan las actividades y especificidad acordes a los anticuerpos ejemplares, incluyendo el anticuerpo 13A1, y tengan las caracterfsticas presentadas en el presente documento y en las reivindicaciones.

50 La estructura para portar las CDR de la invencion generalmente sera una secuencia de cadena pesada o ligera de anticuerpo o una porcion sustancial de la misma en la que las regiones CDR estan ubicadas en ubicaciones que corresponden a la region CDR de los dominios variables de anticuerpo VH y VL naturales codificados por genes de inmunoglobulina reordenados. Las estructuras y ubicaciones de los dominios variables de inmunoglobulina pueden determinarse consultando Kabat, E.A. y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4a edicion. 55 Departamento de Salud y Servicios Sociales de Estados Unidos. 1987, y actualizaciones del mismo, actualmente disponible en internet (http ://immuno.bme.nwu.edu)).

Los dominios variables pueden derivar de cualquier lfnea germinal o dominio variable humano reordenado, o pueden ser un dominio variable sintetico a base de secuencias de consenso de dominios variables humanos conocidos. Las 60 secuencias derivadas de CDR de la invencion, como se definen en el parrafo anterior, pueden introducirse en un

repertorio de dominios variables carentes de regiones CDR usando tecnologfa de ADN recombinante.

Por ejemplo, Marks y col. (Bio/Technology, 1992, 10:779-783) describen metodos de producir repertorios de dominios variables de anticuerpo en los que los cebadores consenso dirigidos o adyacentes al extremo 5' del area del dominio 5 variable se usan en combinacion con cebadores consenso para la tercera region marco de genes VH humanos para proporcionar un repertorio de dominios variables VH carentes de una o mas CDR. Marks y col, describen ademas como puede combinarse este repertorio con una CDR de un anticuerpo concreto. A continuacion, el repertorio puede ser expresado en un sistema huesped adecuado tal como el sistema de expresion en fago del documento WO92/01047 de tal forma que se puedan seleccionar miembros de union especffica adecuados. Un repertorio puede consistir en 10 algo como de 104 miembros a mas, por ejemplo, de 106 a 108 o 1010miembros. Tecnicas transposicionales o combinatoriales analogas tambien son descritas por Stemmer (Nature, 1994, 370:389-391), que describe la tecnica en relacion con un gen de p-lactamasa, pero advierte que la estrategia puede usarse para la generacion de anticuerpos.

15 Una alternativa adicional es general regiones VH o VL novedosas que lleven las secuencias derivadas de las CDR de la invencion usando mutagenesis aleatoria de, por ejemplo, los genes VH o VL de Ac para generar mutaciones en todo el dominio variable. Tal tecnica es descrita por Gram y col. (1992, Proc. Natl. Acad. Sci., EE. UU., 89:3576-3580), que usaron RCP propenso a error. Otro metodo que puede usarse es dirigir la mutagenesis a las regiones CDR de genes VH o VL. Tales tecnicas son desveladas por Gram y col. (1994, Proc. Natl. Acad. Sci., EE. UU., 91:3809-3813) 20 y Schier y col. (1996, J. Mol. Biol. 263:551-567).

Todas las tecnicas antes descritas son conocidas como tales en la tecnica y, en si mismas, no forman parte de la presente invencion. El experto en la materia sera capaz de usar tales tecnicas para proporcionar miembros de union especffica de la invencion usando metodologfa rutinaria en la tecnica.

25

Una porcion sustancial de un dominio variable de inmunoglobulina comprendera al menos las tres regiones CDR, junto con sus regiones marco intermedias. Preferiblemente, la porcion tambien incluira al menos aproximadamente un 50 % de las regiones marco primera o cuarta, o ambas, siendo el 50 % el 50 % del C-terminal de la primera region marco y el 50 % del N-terminal de la cuarta region marco. Los residuos adicionales en el extremo N-terminal o C-terminal de 30 la parte sustancial del dominio variable pueden ser aquellos normalmente no asociados a regiones de dominio variable naturales. Por ejemplo, la construccion de miembros de union especffica de la presente invencion fabricados mediante tecnicas de ADN recombinante puede derivar en la introduccion de residuos C-terminales de Nor codificados por conectores introducidos para facilitar la clonacion u otras etapas de manipulacion. Las otras etapas de manipulacion incluyen la introduccion de conectores para unir dominios variables de la invencion a secuencias proteicas adicionales 35 que incluyen cadenas pesadas de inmunoglobulina, otros dominios variables (por ejemplo, en la produccion de dianticuerpos) o marcadores proteicos como se proporcionan en el presente documento y/o son conocidos por los expertos en la materia.

Aunque, en un aspecto preferido de la invencion, se prefieren miembros de union especffica que comprenden un par 40 de dominios de union basados en secuencias sustancialmente presentadas en la Figura 1, los dominios de union unicos basados en cualquiera de estas secuencias, en particular, basados en la cadena pesada y las CDR de cadena pesada, constituyen aspectos adicionales de la invencion. En el caso de los dominios de union basados en la secuencia sustancialmente presentada en la Figura 1, tales dominios de union pueden usarse como agentes de direccionamiento para el TGF-p1, ya que se sabe que los dominios VH de inmunoglobulina son capaces de unir 45 antfgenos diana de una forma especffica.

Esto puede conseguirse mediante metodos de cribado de expresion en fago usando la denominada estrategia combinatorial dual jerarquica como se desvela en la patente de EE. UU. 5.969.108, en la que se usa una colonia individual que contiene un clon de cadena H o L para infectar una biblioteca completa de clones que codifican la otra 50 cadena (L o H) y el miembro de union especffica de dos cadenas resultante se selecciona segun tecnicas de expresion en fago tales como las descritas en esa referencia. Esta tecnica tambien es desvelada en Markset y col., en el mismo lugar. La biblioteca de fagos y los sistemas y tecnicas de seleccion de expresion en fago tambien se proporcionan en el presente documento.

55 Se contemplan e incorporan porciones o dominios de los anticuerpos de la invencion, incluyendo cualquier porcion o dominio, que incluyen aquellas modificadas o fusionadas a reactivos, marcadores u otros dominios o fragmentos, donde las porciones o dominios retienen las caracterfsticas de los anticuerpos del presente documento, incluyendo la union especffica al TGF-p1 y, opcionalmente, incluyendo la neutralizacion especffica del TGF-p1, como se ilustra en el anticuerpo 13A1 del presente documento. Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de la invencion incluyen 60 fragmentos de anticuerpo recombinante mas pequenos (por ejemplo, fragmentos de anticuerpo monovalentes (Fab,

scFv) y variantes disenadas (dianticuerpos, trianticuerpos, minianticuerpos y anticuerpos de dominio unico) que retienen la especificidad de direccionamiento de los anticuerpos completos (mAc) (para consultar esto, vease Hollinger P and Hudson PJ (2005) Nature Biotech 23(9):1126-1136). Estos incluyen, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo de dominio (dAc), que comprende un unico dominio variable (Ward, E.S. y col., Nature 341, 544-546 (1989)); un 5 anticuerpo de camelido; una region determinante de complementariedad (CDR) aislada; fragmentos Fv de cadena sencilla donde un dominio VH y un dominio VL estan conectados mediante un conector peptfdico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de union de antfgeno (Bird y col., Science, 242, 423-426, 1988; Huston y col., PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988); un dianticuerpo, que es un anticuerpo biespecffico bivalente en el que los dominios VH y VL se expresan en una unica cadena polipeptfdica, pero usando un conector que es demasiado corto 10 para permitir el apareamiento entre los dos dominios de la misma cadena, forzando de ese modo a que los dominios se apareen con los dominios de complementariedad de otra cadena y creen dos sitios de union de antfgeno (Wo94/13804;P. Holliger y col. Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 90 6444-6448, (1993)); un anticuerpo lineal, que comprende un par de segmentos Fv en tandem (VH-CH1-VH-CH1 ) que, junto con polipeptidos de complementariedad de cadena ligera, forman un par de regiones de union de antfgeno; fragmentos de anticuerpo multivalentes [dfmeros, 15 trfmeros y/o tetrameros de scFv (Power and Hudson, J Immunol. Methods 242: 193-204 9 (2000)); y un minianticuerpo, que es una molecula bivalente que comprende un scFv fusionado a dominios constantes de inmunoglobulina, CH3 o CH4 (por ejemplo, IgG1 (Ch3) e IgE (Ch4), donde los dominios constantes CH3 o CH4 funcionan como dominios de dimerizacion (Olafsen T y col. (2004) Prot Eng Des Sel 17(4):315-323;Hollinger P and Hudson PJ (2005) Nature Biotech 23(9): 1126-1136). Estos anticuerpos mas pequenos y variantes o fragmentos disenados pueden producirse 20 de una forma mas economica y pueden poseer otras propiedades unicas y superiores para un abanico de aplicaciones diagnosticas y terapeuticas. Por ejemplo, los scFV2-Fc pueden acumularse con mas abundancia en tumores o tejidos, y un minianticuerpo es de aproximadamente 80 kDa y puede ser ideal para terapia debido a su mayor absorcion en los tejidos, a que tiene una eliminacion mas rapida y tiene mejores proporciones de tejido a sangre que la inmunoglobulina intacta (150 kDa) o el Fab'2 (110 kDa) Los fragmentos de anticuerpo pueden forjarse en reactivos 25 multivalentes y multiespecfficos, conectados a cargas terapeuticas efectivas (tales como radionuclidos, toxinas, enzimas, liposomas y virus) y disenados para una eficacia terapeutica mejorada. Recientemente, los dominios de anticuerpo sencillos han sido disenados y seleccionados como agentes de direccionamiento contra las, hasta ahora, cavidades inmunosilenciosas de enzimas, receptores y agentes infecciosos.

30 Los miembros de union especffica de la presente invencion pueden comprender ademas regiones constantes de anticuerpo o partes de las mismas. Por ejemplo, los miembros de union especfficos basados en las secuencias de la Figura 1 pueden unirse en su extremo C-terminal a dominios constantes de cadena ligera de anticuerpo que incluyen las cadenas Ck o CA humanas, preferiblemente las cadenas CA. De forma similar, los miembros de union especffica basados en las secuencias de la Figura 1 pueden unirse en su extremo C-terminal a toda o parte de una cadena 35 pesada de inmunoglobulina derivada de cualquier isotipo de anticuerpo, p. ej., IgG, IgA, IgE, IgD e IgM y cualquiera de las subclases de isotipos, en particular, IgG1, IgG2b e IgG4. Se prefiere la IgG1.

Los anticuerpos, o cualquier fragmento de los mismos, pueden conjugarse o fusionarse recombinantemente a cualquier toxina celular, bacteriana u otras, p. ej., exotoxina de pseudomonas, ricina o toxina de difteria. La parte de 40 la toxina usada puede ser la toxina completa o cualquier dominio concreto de la toxina. Tales moleculas anticuerpo- endotoxina se han usado con exito para el direccionamiento y la terapia de diferentes clases de canceres, vease, p. ej.,Pastan, Biochim Biophys Acta. 1997 Oct 24;1333(2):C1-6; Kreitman y col., N Engl J Med. 2001 Jul 26;345(4):241- 7; Schnell y col., Leukemia. 2000 Jan;14(1):129-35; Ghetie y col., Mol Biotechnol. 2001 Jul;18(3):251-68. 45 * * * * 50 * * * * 55 * * * * 60

45 Los multfmeros bi- y triespecfficos pueden formarse mediante asociacion de diferentes moleculas de scFv y han sido

disenados como reactivos de reticulacion para el reclutamiento de celulas T en tumores (inmunoterapia), el

redireccionamiento viral (terapia genica) y como reactivos de aglutinacion de globulos rojos (inmunodiagnostico),

vease, p. ej., Todorovska y col., J Immunol Methods. 2001 Feb 1;248(1-2):47-66; Tomlinson y col., Methods Enzymol.

2000;326:461-79; McCall y col., J Immunol. 15 de mayo de 2001;166(10):6112-7.

50

Los anticuerpos humanos completos pueden prepararse inmunizando ratones transgenicos que portan porciones

grandes de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina humana. Estos ratones, ejemplos de tales ratones son

los Xenomouse™ (Abgenix, Inc.) (patentes de Estados Unidos n.°. 6.075.181 y 6.150.584), los HuMAb-Mouse™

(Medarex, Inc./GenPharm) (patentes de Estados Unidos 5.545.806 y 5.569.825), los TransChromo Mouse™ (Kirin) y

55 los KM Mouse™ (Medarex/Kirin), son bien conocidos en la tecnica. A continuacion, pueden prepararse los anticuerpos

mediante, p. ej., la tecnica del hibridoma o mediante expresion en fago. Estos anticuerpos contendran solo secuencias

de aminoacidos completamente humanas. Los anticuerpos completamente humanos tambien pueden generarse

usando expresion en fago a partir de bibliotecas humanas. La expresion en fago puede realizarse usando metodos

bien conocidos por el experto en la materia y, como se proporciona en el presente documento, como en Hoogenboom

60 y col. y Marks y col. (Hoogenboom HR and Winter G. (1992) J Mol Biol. 227(2):381-8; Marks JD y col. (1991) J Mol

Biol. 222(3):581-97; y tambien en las patentes de Estados Unidos 5.885.793 y 5.969.108).

Los anticuerpos de la invencion pueden marcarse con un marcador detectable o funcional. Los marcadores detectables incluyen, pero no se limitan a, radiomarcadores tales como los isotopos 5 3H,14C,32P,35S,36Cl,51Cr,57Co,58Co,59Fe,90Y,121I,124I,125I,131I,11In,117Lu,211At,198Au,67Cu,225Ac,213Bi,99Tc y 186Re, que pueden unirse a los anticuerpos de la invencion usando qufmica convencional conocida en la tecnica del diagnostico por imagenes con anticuerpos. Los marcadores tambien incluyen marcadores fluorescentes (por ejemplo, fluorescefna, rodamina, rojo Texas) y marcadores usados convencionalmente en la tecnica del diagnostico por imagenes IRM-TC. Tambien incluyen marcadores enzimaticos tales como peroxidasa de rabano picante, p-glucoronidasa, p10 galactosidasa, ureasa. Los marcadores incluyen ademas restos qufmicos tales como biotina que pueden detectarse a traves de su union a un resto detectable de receptor especffico, p. ej., avidina marcada. Los marcadores funcionales incluyen sustancias que estan disenadas para ser direccionadas al sitio de un tumor con el fin de provocar la destruccion de tejido tumoral. Tales marcadores funcionales incluyen farmacos citotoxicos tales como 5-fluorouracilo o ricina y enzimas tales como carboxipeptidasa o nitroreductasa bacteriana, que son capaces de convertir profarmacos 15 en farmacos activos en el sitio de un tumor.

El TGF-p1 juega un papel importante en el control del sistema inmune y es un promotor tumoral y un supresor tumoral. Los estudios del TGF-p en el cancer proporcionan una logica para el bloqueo de la senalizacion del TGF-p en canceres humanos con efecto terapeutico. Se ha notificado sobreexpresion de ligandos del TGF-p en la mayorfa de canceres, 20 incluyendo en tumores resistentes a la quimioterapia convencional, y los altos niveles de estos en los tejidos tumorales y/o el suero estan asociados a recidivas metastasicas tempranas y/o mala evolucion del paciente (Teicher, B.A. y col. (1997) In Vivo 11:463-472;Wojtowicz-Praga, S. (2003) Invest New Drugs 21:21-32; Ito, N., y col. (1995) Cancer Lett 89:45-48; Shariat, S.F. y col. (2001) Cancer 92:2985-2992; Shariat, S.F. Y col. (2001) J Clin Oncol 19:2856-2864; Tsushima, H. y col. (2001) Clin Cancer Res 7:1258-1262; Rich, J.N. (2003) Front Biosci 8:e245-e260). Los estudios 25 en animales con anticuerpo pan-TGF-p han demostrado inhibicion de la recidiva o metastasis tumoral en el fibrosarcoma, cancer de colon y cancer de mama (Terabe M y col. (2003) J Exp Med 198:1741-1752; Nam J-S y col. (2008) Cancer Res 68(10):3835-3843) y reducida aceleracion inducida por la radiacion del cancer de mama metastasico (Biswas S y col. (2007) 117:1305-1313). Las evidencias hasta la fecha respaldan el hecho de que el bloqueo del TGFp puede mejorar la captacion, presentacion y activacion de la respuesta inmune antitumoral al 30 antfgeno mediada por las vacunas terapeuticas. De hecho, estudios recientes han demostrado que el bloqueo del TGF-p, usando anticuerpo TGF-p generico de raton ID11 (que reconoce el TGF-p1, TGF-p2 y TGF-p3), mejora sinergicamente las vacunas tumorales en modelos animales por medio de las celulas T CD8+ (Terabe M y col. (2009) Clin Cancer Res 15:6560-6569; Takaku S y col. (2010) Int J Cancer 126(7):1666).

35 Cabe destacar que, en estudios de radiacion, la radiacion toracica y la quimioterapia en modelos de cancer de mama metastasico inducfan especfficamente niveles plasmaticos del TGF-p1 (Biswas S y col. (2007) 117:1305-1313), y que el bloqueo generico de la respuesta del TGF-p inhibfa la metastasis del cancer de prostata, pero llevaba a enfermedad inflamatoria generalizada en los animales (Shah AH, y col. (2002) J Immunol 169:3485-91). Por lo tanto, la disponibilidad de un inhibidor especffico del TGF-p1, en particular, un anticuerpo especffico del TGF-p1, puede 40 proporcionar una intervencion y un control de la respuesta inmune y la modulacion del cancer mas dirigida y direccionada, sin tal riesgo de enfermedad inflamatoria generalizada o efectos no deseados en un animal o paciente.

Se han generado anticuerpos del TGF-p y un ejemplo concreto denominado 1D11, y su equivalente humanizado GC1008, se han evaluado en modelos animales y ensayos clfnicos en humanos en fase temprana y se proporcionan 45 y desvelan en solicitudes de patente, incluyendo en los documentos WO2007076391, WO2005097832, WO2006086469 y 5.571.714. El anticuerpo 1D11 y su equivalente, sin embargo, son anticuerpos del TGF-p genericos, que reconocen todas las formas del TGF-p, incluyendo el TGF-p1, TGF-p2 y TGF-p3. El anticuerpo 1D11 y su equivalente humanizado, por lo tanto, no proporcionan modulacion especffica y dirigida del TGF-p1. En los documentos WO2006116002 y WO2000066631 se desvelan anticuerpos especfficos del TGF-p1, pero son diferentes 50 de cualquiera de los anticuerpos ejemplares descritos en el presente documento.

Los anticuerpos monoclonales derivados mediante la tecnica del hibridoma a partir de otras especies distintas de la humana, tales como de raton, pueden humanizarse, lo que significa que un anticuerpo no humano se disena mediante ingenierfa genetica para que sea mas humano con el fin de evitar aHaR cuando se infunde a humanos. Los metodos 55 de humanizacion de anticuerpos son bien conocidos en la tecnica, entre los metodos mas conocidos estan el trasplante y la remodelacion superficial o «veneering» (tambien conocido como «resurfacing») de regiones determinantes de complementariedad (CDR). Estos metodos se han descrito ampliamente en la bibliograffa y las patentes, vease, p. ej., King "Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies" Taylor & Francis, 1998; las patentes de Estados Unidos 5.225.539; 5.530.101; 5.585.089, 5.859.205 y 6.797.492, cada uno de ellos incorporado en el presente documento 60 como referencia. Otro metodo comun es la tecnologfa de remodelacion superficial (veneering) (v) (Daugherty y col.

(1991). Nucleic Acids Res. 19(9), 2471-6; patente de Estados Unidos 6.797.492; Padlan, E.A. (1991) Mol. Immunol. 28(4-5), 489-98; patente europea n.°519596), donde se realiza una sustitucion de los residuos expuestos superficialmente de las regiones marco, que difieren de los normalmente encontrados en los anticuerpos humanos, con el fin de minimizar la inmunogenicidad de los dominios variables de un anticuerpo, a la vez que se preservan las 5 propiedades de union de ligando.

Los anticuerpos, incluyendo fragmentos de los mismos, y farmacos que modulan la produccion o actividad de los miembros de union especfficos, los anticuerpos y/o sus subunidades pueden poseer ciertas aplicaciones diagnosticas y pueden utilizarse, por ejemplo, con el fin de detectar y/o medir afecciones tales como cancer, lesiones precancerosas, 10 afecciones relacionadas con, o derivadas de, crecimiento celular hiperproliferativo o similares. Por ejemplo, los miembros de union especfficos, anticuerpos o sus subunidades, pueden usarse para producir tanto anticuerpos policlonales como monoclonales para si mismos en una variedad de medios celulares mediante tecnicas conocidas tales como la tecnica del hibridoma, que utiliza, por ejemplo, linfocitos de bazo de raton y celulas de mieloma fusionadas. Asimismo, se pueden descubrir o sintetizar moleculas pequenas que simulen o antagonicen la una o mas 15 actividades de los miembros de union especffica de la invencion y se pueden usar en protocolos diagnosticos y/o terapeuticos.

Los miembros de union especffica radiomarcados, en particular, anticuerpos y fragmentos de los mismos, son utiles en tecnicas diagnosticas in vitro, en tecnicas de radiodiagnostico in vivo y en radioinmunoterapia. En el caso del 20 diagnostico por imagenes in vivo, los miembros de union especffica de la presente invencion pueden conjugarse a un agente para el diagnostico por imagenes en lugar de a uno o mas radioisotopos, que incluye, pero no se limita a, un agente potenciador de imagenes de resonancia magnetica donde, por ejemplo, se carga una molecula de anticuerpo con un gran numero de iones paramagneticos por medio de grupos quelantes. Los ejemplos de grupos quelantes incluyen EDTA, porfirinas, eteres corona de poliaminas y polioximas. Los ejemplos de iones paramagneticos incluyen 25 gadolinio, hierro, manganeso, renio, europio, lantano, holmio y ferbio. En otro aspecto de la invencion, los miembros de union especffica radiomarcados, en particular, anticuerpos y fragmentos de los mismos, en particular, radioinmunoconjugados, son utiles en radioinmunoterapia, en particular, como anticuerpos radiomarcados para terapia contra el cancer. En otro aspecto adicional, los miembros de union especifica radiomarcados, en particular, anticuerpos y fragmentos de los mismos, son utiles en tecnicas de cirugfa radioinmunoguiada, donde pueden identificar e indicar 30 la presencia y/o ubicacion de celulas cancerosas, celulas precancerosas y celulas hiperproliferativas antes de, durante, o despues de la cirugfa para retirar tales celulas.

Los inmunoconjugados o protefnas de fusion de anticuerpos de la presente invencion, donde los miembros de union especffica, en particular, anticuerpos y fragmentos de los mismos, de la presente invencion estan conjugados o unidos 35 a otras moleculas o agentes, incluyen ademas, pero no se limitan a, miembros de union conjugados a un agente de ablacion qufmica, toxina, inmunomodulador, citoquina, agente citotoxico, agente quimioterapeutico o farmaco.

La radioinmunoterapia (RIT) se ha introducido en la clfnica y ha demostrado eficacia usando diversos inmunoconjugados de anticuerpos. El anticuerpo anti-antfgeno carcinoembrionario (anti-CEA) humanizado marcado 40 con 131I hMN-14 se ha evaluado en el cancer colorrectal (Behr TM y col. (2002) Cancer 94(4Suppl): 1373-81) y el mismo anticuerpo marcado con 90Y se ha evaluado en el cancer medular de tiroides (Stein R y col. (2002) Cancer 94(1):51-61). La radioinmunoterapia usando anticuerpos monoclonales tambien se ha evaluado y notificado para el linfoma no Hodgkiniano y el cancer pancreatico (Goldenberg DM (2001) Crit Rev Oncol Hematol 39(1-2):195-201; Gold DV y col. (2001) Crit Rev Oncol Hematol 39 (1-2) 147-54). Tambien se describen metodos de radioinmunoterapia con 45 anticuerpos concretos en las patentes de Estados Unidos 6.306.393 y 6.331.175. La cirugfa radioinmunoguiada (CRIG) tambien se ha introducido en la clfnica y ha demostrado eficacia y utilidad, incluyendo con anticuerpos anti-CEA y anticuerpos dirigidos contra antfgenos asociados a tumores (Kim JC y col. (2002) Int J Cancer 97(4):542-7; Schneebaum S y col. (2001) World J Surg 25(12): 1495-8; Avital S y col. (2000) Cancer 89(8): 1692-8; McIntosh DG y col. (1997) Cancer Biother Radiopharm 12 (4):287-94).

50

Los expertos en la materia pueden utilizar modelos animales in vivo o estudios de xenoinjertos animales para cribar, evaluar y/o verificar adicionalmente los miembros de union especffica y anticuerpos o fragmentos de los mismos de la presente invencion, incluyendo la evaluacion adicional de la modulacion e inhibicion del TGF-p1 in vivo y la inhibicion de la progresion, recidiva, metastasis o respuesta inmune contra celulas tumorales o la respuesta a antfgenos o 55 vacunas, incluyendo antfgenos tumorales o cancerosos o vacunas. Tales modelos animales incluyen, pero no se limitan a, modelos de respuesta inmune, inmunomodulacion, vacunacion, cancer, metastasis del cancer. Los modelos de canceres cuya recidiva o metastasis estan asociadas a elevados niveles de TGF-p1 son particularmente susceptibles a, y estan direccionados por, los anticuerpos de la presente invencion. Tales canceres incluyen melanomas, cancer de mama, pulmon y prostata. Los expertos en la materia conocen y disponen facilmente de 60 modelos ejemplares y adecuados e incluyen aquellos a los que se ha hecho referencia y/o descritos en el presente

documento y conocidos en la tecnica. Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos activos de los mismos pueden evaluarse en modelos de cancer de mama, incluyendo tumorigenicidad de las celulas del cancer de mama humanas en ratones atfmicos (Arteaga CL y col. (1993) Cell Growth Diff 4:193-201), o en tumores mamarios inducidos por Neu (Muraoka-Cok RS y col. (2004) Cancer Res 64:2002-2011), o en la evaluacion de tumores mamarios transgenicos 5 (Siegel PM y col. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100:8430-8435). Tambien, a modo de ejemplo, puede examinarse el efecto antitumoral del anticuerpo del TGF-p1 sobre una vacuna de celulas completas en la profilaxis contra tumores de carcinoma de colon CT26 inyectados en ratones singenicos usando un metodo similar al notificado por Takaku y col. (Takaku S y col. (2010) Int J Cancer 126(7):1666).

10 Los anticuerpos de la presente invencion pueden administrarse a un paciente con necesidad de tratamiento a traves de cualquier via adecuada, incluyendo mediante inyeccion intramuscular, subcutanea, en el torrente sangufneo o en el LCR, o directamente en el sitio del tumor. La dosis exacta dependera de varios factores, incluyendo de si el anticuerpo es para diagnostico o para tratamiento, el tamano y localizacion del tumor, la naturaleza exacta del anticuerpo (si es un anticuerpo completo, fragmento, dianticuerpo, etc.) y la naturaleza del marcador detectable o 15 funcional unido al anticuerpo. Cuando se usa un radionuclido para terapia, una dosis unica maxima adecuada puede ser de aproximadamente 45 mCi/m2 a un maximo de aproximadamente 250 mCi/m2. La dosificacion preferible esta en el intervalo de 15 a 40 mCi, con un intervalo de dosificacion mas preferido de 20 a 30 mCi, o de 10 a 30 mCi. Tal terapia puede requerir sustitucion de medula espinal o celulas madre. Una dosis de anticuerpo habitual para diagnostico por imagenes de tumores o tratamiento de tumores estara en el intervalo de 0,5 a 40 mg, preferiblemente 20 de 1 a 4 mg de anticuerpo en forma de F(ab')2. Los anticuerpos desnudos se administran preferiblemente en dosis de 20 a 1000 mg de protefna por dosis, o de 20 a 500 mg de protefna por dosis, o de 20 a 100 mg de protefna por dosis. Esta es una dosis para un tratamiento unico de un paciente adulto, que puede ajustarse proporcionalmente para ninos y lactantes, y tambien puede ajustarse para otros formatos de anticuerpo, en proporcion, por ejemplo, al peso molecular. Los tratamientos pueden repetirse diariamente, dos veces a la semana, semanalmente o mensualmente, a 25 criterio del medico.

Composiciones farmaceuticas y terapeuticas

Los miembros de union especffica de la presente invencion normalmente se administraran en forma de una 30 composicion farmaceutica, que puede comprender al menos un componente ademas del miembro de union especffica. Por tanto, las composiciones farmaceuticas segun la presente invencion, y para uso segun la presente invencion, pueden comprender, ademas de ingrediente activo, un excipiente, vehfculo, tampon, estabilizante u otros materiales farmaceuticamente aceptables bien conocidos por los expertos en la materia. Tales materiales no deben ser toxicos y no deben interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza exacta del vehfculo u otro material dependera 35 de la via de administracion, que puede ser oral, o mediante inyeccion, p. ej., intravenosa, o mediante deposicion en el sitio tumoral.

Las composiciones farmaceuticas para administracion oral pueden ser en forma de comprimido, capsula, polvo o lfquido. Un comprimido puede comprender un vehfculo solido tal como gelatina o un adyuvante. Las composiciones 40 farmaceuticas lfquidas comprenden generalmente un vehfculo lfquido tal como agua, petroleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintetico. Puede incluirse solucion salina fisiologica, dextrosa u otra solucion de sacarido o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.

Para inyeccion intravenosa, o inyeccion en el sitio de afliccion, el ingrediente activo puede estar en forma de una 45 solucion acuosa parenteralmente aceptable que este libre de pirogenos y tenga un pH, isotonicidad y estabilidad adecuadas. Los expertos en la materia correspondientes son bien capaces de preparar soluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehfculos isotonicos tales como inyeccion de cloruro sodico, inyeccion de Ringer, inyeccion de Ringer lactada. Pueden incluirse conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/o otros aditivos, segun sea necesario.

50

Una composicion puede administrarse sola o en combinacion con otros tratamientos, terapeuticos o agentes, simultaneamente o secuencialmente dependiendo de la afeccion a tratar. Ademas, la presente invencion contempla e incluye composiciones que comprenden el miembro de union, en particular, el anticuerpo o fragmento del mismo, descrito en el presente documento y otros agentes o terapeuticos tales como agentes o terapeuticos anticancerfgenos, 55 hormonas, agentes antimitoticos, agentes antiapoptoticos, anticuerpos o inmunomoduladores. De forma mas general, estos agentes anticancerfgenos pueden ser, pero no se limitan a, inhibidores de la tirosina quinasa o inhibidores de la cascada de fosforilacion, moduladores postraduccionales, inhibidores del crecimiento o la division celular (p. ej., antimitoticos) o inhibidores de la transduccion de senal. Otros tratamientos o terapeuticos pueden incluir la administracion de dosis adecuadas de farmacos analgesicos tales como farmacos antiinflamatorios no esteroideos (p. 60 ej., aspirina, paracetamol, ibuprofeno o ketoprofeno) u opiaceos tales como morfina, o antihemeticos. La composicion

puede administrarse en combinacion (secuencialmente (es decir, antes o despues) o simultaneamente) con inhibidores de la tirosina quinasa (que incluyen, pero no se limitan a AG1478 y ZD1839, STI571, OSI-774, SU-6668), doxorubicina, temozolomida, cisplatino, carboplatino, nitrosoureas, procarbazina, vincristina, hidroxiurea, 5-fluoruracilo, arabinosido de citosina, ciclofosfamida, epipodofilotoxina, carmustina, lomustina y/o otros agentes quimioterapeuticos. Por tanto, 5 estos agentes pueden ser agentes anticancerfgenos o moduladores de la respuesta inmune celular especfficos o pueden ser agentes anticancerfgenos o antineoplasicos mas generales tales como doxorubicina, cisplatino, temozolomida, nitrosoureas, procarbazina, vincristina, hidroxiurea, 5-fluoruracilo, arabinosido de citosina, ciclofosfamida, epipodofilotoxina, carmustina o lomustina. Ademas, la composicion puede administrarse con hormonas tales como dexametasona, inmunomoduladores, tales como interleuquinas, el factor de necrosis tumoral (TNF) u otros 10 factores de crecimiento, factores estimulantes de colonias, citoquinas, anticuerpos agonistas o antagonistas a reguladores de la respuesta inmune que estimulan, mejoran o deprimen la respuesta inmune y la reduccion o eliminacion de celulas cancerosas o tumores. La composicion tambien puede administrarse con, o puede incluir, combinaciones con otros anticuerpos antigenicos antitumorales.

15 Ademas, la presente invencion contempla e incluye composiciones terapeuticas para el uso de miembro de union en combinacion con radioterapia convencional.

La presente invencion contempla ademas composiciones terapeuticas utiles en la puesta en practica de los metodos terapeuticos de esta invencion. Una composicion terapeutica en cuestion incluye, mezclado, un excipiente (vehfculo) 20 farmaceuticamente aceptable y uno o mas de un miembro de union especffica, analogo polipeptfdico del mismo o fragmento del mismo, como se describen en el presente documento como ingrediente activo. En una forma de realizacion preferida, la composicion comprende un antfgeno capaz de modular la union especffica del presente miembro de union/anticuerpo con una celula diana. En una forma de realizacion, la composicion comprende un antfgeno o formulacion de vacuna, en particular, un antfgeno tumoral o vacuna contra el cancer.

25

La preparacion de composiciones terapeuticas que contienen polipeptidos, analogos o fragmentos activos como ingredientes activos se entiende bien en la tecnica. Habitualmente, tales composiciones se preparan como inyectables, ya sea como soluciones o como suspensiones lfquidas. Sin embargo, tambien pueden prepararse formas solidas para solucion en, o suspension en, lfquidos previa a la inyeccion. La preparacion tambien se puede emulsionar. Con 30 frecuencia, el ingrediente terapeutico activo se mezcla con excipientes que son farmaceuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solucion salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares y combinaciones de los mismos. Ademas, si se desea, la composicion puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores del pH, que mejoran la efectividad del ingrediente activo.

35

Un polipeptido, analogo o fragmento del mismo puede formularse en la composicion terapeutica como formas de sal farmaceuticamente aceptables neutralizadas. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen las sales de adicion de acido (formadas con los grupos amino libres del polipeptido o molecula de antibiotico) y que estan formadas con acidos inorganicos tales como, por ejemplo, acido clorhfdrico o fosforico, o acidos organicos tales como acetico, 40 oxalico, tartarico, mandelico y similares. Las sales formadas a partir de los grupos carboxilo libres tambien pueden derivar de bases inorganicas tales como, por ejemplo, hidroxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o ferrico, y bases organicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procafna, y similares.

Las composiciones terapeuticas que contienen anticuerpo o fragmento activo se administran convencionalmente 45 intravenosamente, como mediante inyeccion de una dosis unitaria, por ejemplo. El termino «dosis unitaria», cuando se usa en referencia a una composicion terapeutica de la presente invencion se refiere a unidades ffsicamente discretas adecuadas como dosificacion unitaria para humanos, conteniendo cada unidad una cantidad de material activo predeterminada calculada para que produzca el efecto terapeutico deseado junto con el diluyente requerido, es decir, vehfculo o excipiente.

50

Las composiciones se administran de una forma compatible con la formulacion de dosificacion, y en una cantidad terapeuticamente efectiva. La cantidad por administrar depende del sujeto a tratar, la capacidad del sistema inmune del sujeto para utilizar el ingrediente activo y el grado de capacidad de union del peptido/CMH o antfgeno tumoral deseada. Las cantidades exactas de ingrediente activo que se necesita administrar dependen del criterio del facultativo 55 y son diferentes para cada individuo. Los regfmenes de administracion inicial y administracion subsiguiente adecuados tambien son variables, y pueden incluir una administracion inicial seguida de dosis repetidas a intervalos de una o mas horas mediante una inyeccion u otra administracion posterior. Como alternativa, se contempla una infusion intravenosa continua suficiente para mantener concentraciones apropiadas y suficientes en la sangre o en el sitio de terapia deseado.

Las composiciones farmaceuticas para administracion oral pueden ser en forma de comprimido, capsula, polvo o liquido. Un comprimido puede comprender un vehfculo solido tal como gelatina o un adyuvante. Las composiciones farmaceuticas lfquidas comprenden generalmente un vehfculo liquido tal como agua, petroleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintetico. Puede incluirse solucion salina fisiologica, dextrosa u otra solucion de 5 sacarido o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.

Para inyeccion intravenosa, o inyeccion en el sitio de afliccion, el ingrediente activo estara en forma de una solucion acuosa parenteralmente aceptable que este libre de pirogenos y tenga un pH, isotonicidad y estabilidad adecuadas. Los expertos en la materia correspondientes son bien capaces de preparar soluciones adecuadas usando, por 10 ejemplo, vehfculos isotonicos tales como inyeccion de cloruro sodico, inyeccion de Ringer, inyeccion de Ringer lactada. Pueden incluirse conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/o otros aditivos, segun sea necesario.

Ensayos diagnosticos

15 La presente invencion tambien se refiere a una variedad de aplicaciones diagnosticas, incluyendo metodos para detectar la expresion de, o la elevada presencia de, TGF-p1, cancer mediado por el TGF-p1 o cancer de forma mas general, evaluando la presencia o cantidad de celulas sensibles al TGF-p1, mediante referencia a su capacidad para ser reconocidas por el uno o mas miembros de union especffica presentes. Los complejos peptfdicos pueden identificarse, direccionarse, marcarse y/o cuantificarse en las celulas, incluyendo los inmunocitos y/o las celulas 20 tumorales.

Las aplicaciones diagnosticas de los miembros de union especffica de la presente invencion, en particular, anticuerpos y fragmentos de los mismos, incluyen aplicaciones in vitro e in vivo bien conocidas y estandar para el experto en la materia y basadas en la presente descripcion. Pueden utilizarse ensayos y kits diagnosticos para evaluacion y analisis 25 in vitro del estado de tumores y canceres, y la respuesta tumoral o respuesta inmune, para evaluar y monitorizar muestras de pacientes, incluyendo aquellos que se sabe que padecen o se sospecha que padecen cancer, una afeccion precancerosa, una afeccion relacionada con crecimiento celular hiperproliferativo, o una muestra tumoral. La evaluacion y analisis del estado del cancer, tumor y la enfermedad metastasica tambien es util en la determinacion de la idoneidad de un paciente para un ensayo clfnico de un farmaco o para la administracion de un agente 30 quimioterapeutico o miembro de union especffica concreto, en particular un anticuerpo, de la presente invencion, incluyendo combinaciones del mismo, frente a un agente o miembro de union diferente. Este tipo de monitorizacion y evaluacion diagnostica ya esta en practica utilizando anticuerpos contra la protefna HER2 en el cancer de mama (HercepTest, Dako Corporation), donde el ensayo tambien se usa para evaluar los pacientes para terapia con anticuerpos usando Herceptin. Las aplicaciones in vivo incluyen el diagnostico por imagenes de tumores o la 35 evaluacion del estado del cancer de los individuos, incluyendo el radiodiagnostico.

Preferiblemente, el anticuerpo usado en los metodos diagnosticos de esta invencion es anticuerpo de raton, humano, humanizado o recombinante. Mas preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla o anticuerpo de dominio. Ademas, las moleculas de anticuerpo usadas en el presente documento pueden estar en forma de porciones 40 de moleculas de anticuerpo completo Fab, Fab', F(ab')2 o F(v), en particular, Fab.

La presencia de TGF-p1 en las celulas o celulas sensibles al TGF-p1 o genes o protefnas sensibles al TGF-p1 puede determinarse mediante los procedimientos inmunologicos in vitro o in vivo aplicables a tales determinaciones. Se conocen varios procedimientos utiles. Los procedimientos y su aplicacion son familiares para los expertos en la materia 45 y, por consiguiente, se pueden utilizar dentro del alcance de la presente invencion. El procedimiento «competitivo» se describe en las patentes de Estados Unidos n.° 3.654.090 y 3.850.752. El procedimiento «sandwich» se describe en las patentes de Estados Unidos n.° .RE 31.006 y 4.016.043. Se conocen otros procedimientos, tales como el procedimiento de «doble anticuerpo» o «DASP».

50 En una forma de realizacion adicional de esta invencion, pueden preparase kits de ensayo comerciales adecuados para su uso por parte de un especialista medico para determinar la presencia o ausencia de expresion aberrante de, que incluye, pero no se limita a, TGF-p1 amplificado, en celulas diana sospechosas. Segun las tecnicas de ensayo comentadas anteriormente, una clase de tales kits contendra al menos el marcador o su ligando, por ejemplo, un anticuerpo especffico para el mismo, e instrucciones, por supuesto, dependiendo del metodo seleccionado, p. ej., 55 «competitivo», «sandwich», «DASP» y similares. Los kits tambien pueden contener reactivos perifericos tales como tampones, estabilizantes, etc.

Por consiguiente, puede preparase un kit de ensayo para la puesta en evidencia de la presencia de, o elevados niveles de, TGF-p1 o un elemento o protefna sensible al TGF-p1 que comprende:

(a) una cantidad predeterminada de al menos un componente inmunoqufmicamente reactivo marcado, obtenido mediante la union directa o indirecta del miembro de union especffica, o un ligando especffico del mismo, a un nivel detectable;

(b) otros reactivos; e

5 (c) instrucciones de uso de dicho kit.

Puede preparase un kit de ensayo para la puesta en evidencia de la presencia de cancer mediado por el TGF-p1, en particular, seleccionado de entre cancer de mama, pulmon, hfgado, prostata, vejiga que comprende:

10 (a) una cantidad predeterminada de al menos un componente inmunoqufmicamente reactivo marcado, obtenido mediante la union directa o indirecta del miembro de union especffica, o un ligando especffico del mismo, a un nivel detectable;

(b) otros reactivos; e

(c) instrucciones de uso de dicho kit.

15

Segun lo anterior, puede prepararse un sistema de ensayo para cribar farmacos potenciales efectivos para modular la presencia o actividad del TGF-p1 y/o la actividad o union del anticuerpo de la presente invencion. El peptido antigenico o el miembro de union o anticuerpo pueden introducirse en un sistema de ensayo, y el futuro farmaco tambien puede introducirse en el cultivo celular resultante y, despues examinarse el cultivo para observar cualquier cambio en la 20 actividad de las celulas, la union del anticuerpo o la cantidad y magnitud de TGF-p1, debido a la adicion del futuro farmaco solo, o debido al efecto de cantidades anadidas del uno o mas agentes conocidos.

Acidos nucleicos

25 La presente invencion proporciona ademas un acido nucleico aislado que codifica un miembro de union especffica de la presente invencion. Acido nucleico incluye ADN y ARN. En un aspecto preferido, la presente invencion proporciona un acido nucleico que codifica para un polipeptido de la invencion como se ha definido anteriormente, incluyendo un polipeptido como se presenta en la Figura 1 o capaz de codificar las regiones CDR del mismo.

30 La presente invencion tambien proporciona constructos en forma de plasmidos, vectores, casetes de transcripcion o expresion, que comprenden al menos un polinucleotido como el anterior. La presente invencion tambien proporciona una celula huesped recombinante que comprende uno o mas constructos como los anteriores. Un acido nucleico que codifica cualquier miembro de union especffica como se proporcionan, forma por sf mismo un aspecto de la presente invencion, asf como tambien lo hace un metodo de produccion del miembro de union especffico, metodo que 35 comprende la expresion a partir de un acido nucleico codificador del mismo. La expresion puede conseguirse convenientemente cultivando celulas huesped recombinantes que contienen el acido nucleico en condiciones apropiadas. Tras la produccion mediante expresion, puede aislarse y/o purificarse un miembro de union especffica usando cualquier tecnica adecuada y, a continuacion, usarse segun proceda.

40 Los miembros de union especffica y moleculas de acido nucleico y vectores codificadores segun la presente invencion pueden proporcionarse aislados y/o purificados, p. ej., de su medio natural, en forma sustancialmente pura u homogenea, o, en el caso de los acidos nucleicos, libres o sustancialmente libres de acidos nucleicos o genes de origen diferente a la secuencia que codifica un polipeptido con la funcion requerida. El acido nucleico segun la presente invencion puede comprender ADN o ARN y puede ser total o parcialmente sintetico.

45

Los sistemas de clonacion y expresion de un polipeptido en una variedad de celulas huesped diferentes son bien conocidos. Las celulas huesped adecuadas incluyen bacterias, celulas de mamfferos, levaduras y sistemas de baculovirus. Las lfneas celulares de mamffero disponibles en la tecnica para la expresion de un polipeptido heterologo incluyen celulas de ovario de hamster chino, celulas HeLa, celulas de rinon de hamster bebe, celulas cancerosas, 50 celulas de cancer de ovario y muchas otras. Un huesped bacteriano preferido habitual es la E. coli. La expresion de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo en celulas procariotas tales como E. coli esta bien consolidada en la tecnica.

Pueden elegirse o construirse vectores adecuados, que contengan las secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias de promotor, secuencias de terminador, secuencias de poliadenilacion, secuencias de potenciador, genes 55 marcadores y otras secuencias, segun proceda. Los vectores pueden ser plasmidos, virales, p. ej., «fagos», o fagemidos, segun proceda. Para conocer mas detalles, vease, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2a edicion, Sambrook y col., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas tecnicas y protocolos conocidos para la manipulacion de acidos nucleicos, por ejemplo, de preparacion de constructos de acido nucleico, mutagenesis, secuenciacion, introduccion de ADN en celulas y expresion genica, y analisis de protefnas se describen en detalle en 60 Short Protocols in Molecular Biology, Segunda edicion, Ausubel y col. eds., John Wiley & Sons, 1992. Las

divulgaciones de Sambrook y col. y Ausubel y col. se incorporan en el presente documento como referenda.

Por tanto, un aspecto adicional de la presente invencion proporciona una celula huesped que contiene un acido nucleico como se desvela en el presente documento. Otro aspecto adicional proporciona un metodo que comprende 5 introducir tal acido nucleico en una celula huesped. La introduccion puede emplear cualquier tecnica disponible. Para celulas eucariotas, las tecnicas adecuadas pueden incluir transfeccion mediante fosfato calcico, electroporacion con DEAE-dextrano, transfeccion mediada por liposomas y transduccion usando retrovirus u otros virus, p. ej., vaccinia o, para celulas de insectos, baculovirus. Para celulas bacterianas, las tecnicas adecuadas pueden incluir transformacion con cloruro calcico, electroporacion y transfeccion usando bacteriofagos. La introduccion puede ir seguida de provocar 10 o permitir la expresion desde el acido nucleico, p. ej., cultivando celulas huesped en condiciones para la expresion del gen. La presente invencion tambien proporciona un metodo que comprende usar un constructo como se ha indicado anteriormente en un sistema de expresion con el fin de expresar un miembro de union especffica o polipeptido como se ha comentado anteriormente.

15 Otra caracterfstica de esta invencion es la expresion de las secuencias de ADN desveladas en el presente documento. Como es bien conocido en la tecnica, las secuencias de ADN se pueden expresar conectandolas operativamente a una secuencia de control de la expresion en un vector de expresion apropiado y empleando ese vector de expresion para transformar un huesped unicelular apropiado. Se puede utilizar una amplia variedad de combinaciones de huesped/vector de expresion en la expresion de las secuencias de ADN de esta invencion. Los vectores de expresion 20 utiles, por ejemplo, pueden consistir en segmentos de secuencias de ADN cromosomicas, no cromosomicas y sinteticas. Los vectores adecuados incluyen derivados del SV40 y plasmidos bacterianos conocidos, p. ej., los plasmidos de E. coli, colEl, pCR1, pBR322, pMB9 y sus derivados, plasmidos tales como RP4; ADN de fago, p. ej., los numerosos derivados del fago A, p. ej., NM989, y otro ADN de fago, p. ej., M13 y ADN de fago filamentoso monocatenario; plasmidos de levadura tales como el plasmido 2u o derivados del mismo; vectores utiles en celulas 25 eucariotas, tales como vectores utiles en celulas de insecto o mamffero; vectores derivados de combinaciones de plasmidos y ADN de fago, tales como plasmidos que han sido modificados para emplear ADN de fago u otras secuencias de control de la expresion; y similares.

Puede usarse cualquiera de una amplia variedad de secuencias de control de la expresion, secuencias que controlan 30 la expresion de una secuencia de ADN conectada operativamente a ella, para expresar las secuencias de ADN de esta invencion. Tales secuencias de control de la expresion utiles incluyen, por ejemplo, los promotores tempranos o tardfos del SV40, CMV, vaccinia, polioma o adenovirus, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC, el sistema TRC, el sistema LTR, las regiones de operador y promotor del fago A principales, las regiones de control de la protefna de cubierta fd, el promotor de la 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glicolfticas, los promotores de la fosfatasa acida 35 (p. ej., Pho5), los promotores de los factores de apareamiento de la levadura, y otras secuencias conocidas para el control de la expresion de genes de celulas procariotas o eucariotas o sus virus, y diversas combinaciones de los mismos.

Una amplia variedad de celulas huesped unicelulares tambien son utiles en la expresion de las secuencias de ADN 40 de esta invencion. Estos huespedes pueden incluir huespedes eucariotas y procariotas muy conocidos, tales como cepas de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, hongos tales como levaduras, y celulas animales, tales como celulas CHO, YB/20, NSO, SP2/0, R1.1, B-W y L-M, celulas de rinon de mono verde africano (p. ej., COS-1 , COS-7, BSC1 , BSC40 y BMT10), celulas de insecto (p. ej., Sf9), y celulas humanas y celulas de plantas en cultivo tisular.

45 Se entendera que no todos los vectores, secuencias de control de la expresion y huespedes funcionaran igualmente bien para expresar las secuencias de ADN de esta invencion. Tampoco todos los huespedes funcionaran igualmente bien con el mismo sistema de expresion. Sin embargo, un experto en la materia sera capaz de seleccionar los vectores, secuencias de control de la expresion y huespedes correctos sin experimentacion excesiva para lograr la expresion deseada sin apartarse del alcance de esta invencion. En la seleccion de una secuencia de control de la expresion, 50 normalmente se consideraran una variedad de factores. Esos incluyen, por ejemplo, la fortaleza relativa del sistema, su controlabilidad y su compatibilidad con la secuencia de ADN o el gen concreto a expresar, en particular, en lo que respecta a estructuras secundarias potenciales. Los huespedes unicelulares adecuados se seleccionaran mediante consideracion de, p. ej., su compatibilidad con el vector elegido, sus caracterfsticas de secrecion, su capacidad para plegar correctamente protefnas y sus requisitos de fermentacion, asf como de la toxicidad para el huesped del producto 55 codificado por las secuencias de ADN a expresar y la facilidad de purificacion de los productos de expresion. Teniendo en cuenta estos y otros factores, un experto en la materia sera capaz de construir una variedad de combinaciones de vector/secuencia de control de la expresion/huesped que expresaran las secuencias de ADN de esta invencion en la fermentacion o el cultivo animal a gran escala.

60 Como se ha mencionado anteriormente, una secuencia de ADN que codifica un miembro de union especffica puede

prepararse sinteticamente en lugar de por clonacion. La secuencia de ADN puede disenarse con los codones apropiados para la secuencia de aminoacidos del miembro de union especffica. En general, si la secuencia se va a usar para expresion, se seleccionaran los codones preferidos para la expresion en el huesped previsto. La secuencia completa se ensambla a partir de oligonucleotidos solapantes preparados mediante metodos estandar y ensamblados 5 en una secuencia codificadora completa. Vease, p. ej.,Edge, Nature, 292:756 (1981); Nambair y col., Science, 223:1299 (1984); Jay y col., J. Biol. Chem., 259:6311 (1984). Las secuencias de AdN sinteticas permiten la construccion conveniente de genes que expresaran analogos del miembro de union especffica o «mutefnas». Como alternativa, el ADN que codifica mutefnas puede fabricarse mediante mutagenesis sitio-dirigida de genes o ADNc del miembro de union especffica nativo, y las mutefnas pueden fabricarse directamente usando sfntesis polipeptfdica 10 convencional.

La invencion se puede entender mejor consultando los siguientes ejemplos no limitantes, que se proporcionan como ejemplares de la invencion. Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de ilustrar completamente las formas de realizacion de la invencion preferidas y de ninguna manera se deben considerar, sin embargo, como limitantes del 15 amplio alcance de la invencion.

EJEMPLO 1

PRODUCCION DE ANTICUERPOS DEL TGFbeta-1

20

Se generaron anticuerpos del TGF-beta usando un procedimiento en ratones que hemos denominado «autovacunacion». La autovacunacion se utilizo con exito para generar anticuerpos en ratones contra varias protefnas implicadas en el control de las respuestas inmune e inflamatoria. En este procedimiento, se fabricaron multfmeros de oVa grandes tratando ovalbumina (OVA) con glutaraldehfdo para generar OVAglu y, tras purificar los productos 25 polimerizados mediante cromatograffa de exclusion por tamano, estos multfmeros de OVA se hacen reaccionar con la citoquina diana (en este caso, TGF-beta) antes de saturar los sitios de glutaraldehfdo restantes con peptido PADRE (aKXVAAWTLKAAC) (SEQ ID NO: 9) (Alexander, J. y col. (1994) Immunity 1:751-761) para maximizar la inmunogenicidad La eficacia de OVAglu para romper la tolerancia contra autoantfgenos se demostro mediante deteccion de anticuerpos especfficos para el TGF-beta 1 mediante ELISA a diluciones sericas de 104-106.

30

Los anticuerpos para el TGF-beta-1 humano se prepararon mediante vacunacion subcutanea de ratones C57BL/6 en las almohadillas plantares con 2-5 ug de complejos TGF-beta1 humano-OVA-PADRE con adyuvante GERBU100 5 veces a intervalos de 2 semanas. Los ratones se sangraron dos semanas despues de la ultima dosis de refuerzo. Tras un descanso de 2 a 6 semanas, se administro una dosis de refuerzo intravenosa e intraperitoneal combinada con 2-5 35 ug de complejos para la produccion de mAc.

El complejo TGF-beta1-OVA-PADRE se genero acoplando citoquina TGF-beta-1 humana a polfmeros de ovalbumina reactivos a aminas mediante incubacion con agitacion a 4 °C con una cantidad equimolar de protefna diana a pH 8,5 y con tampon carbonato 0,1 M para desprotonar los grupos amino de la citoquina y permitir su reaccion con los 40 componentes de glutaraldehfdo libres. Tras 6 h a temperatura ambiente seguidas de una noche a 4 °C, se anadio peptido de toxina del tetanos (CQYIKANSKFIGITEL) (SEQ ID NO: 10). Tras incubacion adicional de 6 a 12 h, se anadio un exceso molar de peptido PADRE de diez veces (aKXVAAWTLKAAC) y se incubo la muestra adicionalmente durante la noche antes de su dialisis contra tampon glicina 0,1 M, pH 5,8. En la secuencia PADRE, X = ciclohexilamina, a = D-aminoacido.

45

Se aislo un grupo de anticuerpos del TGF-p1 de raton: MTGF-beta-1.4C3.7 (tambien denominado Ac 4C3.7), MTGF- beta1.8D6 (tambien denominado anticuerpo 8D6), MTGF-beta-1.19D8 (tambien denominado anticuerpo 19D8), MTGF-beta-1.4A11 (tambien denominado anticuerpo 4A11), MTGF-beta-1.19H11 (tambien denominado anticuerpo 19H11), MTGF-beta-1.21C11 (tambien denominado anticuerpo 21C11), MTGF-beta1.13A1 (tambien denominado 50 anticuerpo 13A1) y MTGF-beta 1.4G9 (tambien denominado anticuerpo 4G9). Los anticuerpos son todos anticuerpos de clase IgG y difieren en la subclase. Los anticuerpos 4C3.7, 8D6, 19D8 y 13A11 son IgG1. Los anticuerpos 4A11 y 4G9 son IgG2b. Los anticuerpos 19H11 y 21C11 son IgG2a. Posteriormente, se evaluo la union de TGFp1 y la neutralizacion de TGF-p1 de los anticuerpos como se describe en los ejemplos siguientes.

55 MATERIALES Y METODOS

Reactivos y ratones

T odas las vacunaciones se realizaron en ratones C57BL/6 mantenidos en condiciones libres de patogenos especfficas 60 en nuestras instalaciones para animales (Instituto Ludwig para la Investigacion del Cancer, sede de Bruselas, Bruselas,

Belgica). El TGF-p1 humano, que difiere de la protefna madura de raton en un solo aminoacido (A en humano y S en raton en la posicion 354) (Derynck R y col. (1986) J Biol Chem 261:4377-4379), fue de R&D Systems o fue producido y purificado por el Dr. Peter Sun (Seccion de Inmunologfa Estructural, Laboratorio de Inmunogenetica, Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas/Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, EE. UU.).

5

Produccion de vehfculo activado

Se polimerizo OVA (Producto A2512, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.), a una concentracion de 0,22 mM, mediante incubacion durante la noche con glutaraldehfdo 20 mM en tampon de fosfato potasico 50 mM, pH 6, a 4 °C. 10 Tras dialisis contra el mismo tampon, se fracciono el producto soluble en una columna de exclusion por tamano de Superose 12 (GE Healthcare, Diegem, Belgica) y se equilibro a pH 6 en tampon fosfato 50 mM. Los productos de gran tamano (> 1000 kD), en lo sucesivo denominados OVAglu, se recogieron y congelaron en alfcuotas a -80 °C.

El acoplamiento de citoquinas a OVAglu se realizo mediante incubacion con agitacion a 4 °C con una cantidad 15 equimolar de protefna diana (TGF-p1 humano) a pH 8,5 en tampon carbonato 0,1 M para desprotonar los grupos amino de la citoquina y permitir su reaccion con los componentes de glutaraldehfdo libres. Tras una incubacion de 612 h, se anadio un exceso de diez veces de peptido PAdRe (aKXVAAWTLKAAC) (Alexander, J. y col. (1994) Immunity 1:751-761) y se incubo la mezcla adicionalmente durante la noche antes de su dialisis contra tampon de glicina 0,1 M, pH 5,8.

20

Inmunizaciones

Las inmunizaciones se realizaron mediante de cuatro a cinco inyecciones SC bisemanales en las almohadillas plantares de 2-5 pg de complejos emulsionados en adyuvante GERBU100, segun las instrucciones del proveedor 25 (GERBU Biochemicals, Gaiberg, Alemania). Los ratones se sangraron 2 semanas despues de la ultima dosis de refuerzo. Tras un descanso de 2-6 semanas, se administro una dosis de refuerzo IV e IP combinada con 2-5 pg de complejos para la produccion de mAc.

EJEMPLO 2

30

LA UNION DE ANTICUERPOS DE TGF-BETA AISLADOS ES ESPECIFICA PARA EL TGF-BETA-1

Los anticuerpos anti-TGF-beta aislados generados mediante el protocolo anterior se cribaron por su capacidad de union a diferentes isoformas de TGF-beta. Se recubrieron inmunoplacas Maxisorb durante la noche a 4 °C con TGF- 35 beta-1, TGF-beta-2 o TGF-beta-3 humano (20-200 ng/ml en tampon de glicina 50 mM, pH 9) o se recubrieron primero con neutravidina a 2 ug/ml en PBS, seguida de antfgenos biotinilados (100 ng/ml). A diferencia del anticuerpo anti- TGF-beta monoclonal de raton 1D11.16 (tambien denominado 1D11), un anticuerpo anti-TGF-p de referencia consolidado que reconoce el TGF-p1, TGF-p2 y TGF-p3 (Dasch JR y col. (1989) J Immunol 142:1536-1541), todos los anticuerpos aislados, MTGF-beta-1.4C3.7, MTGF-beta1.8D6, MTGF-beta-1.19D8, MTGF-beta-1.4A11, MTGF- 40 beta-1.19H11, MTGF-beta-1.21C11, MTGF-beta1.13A1 y MTGF-beta 1.4G9, se unen solo al TGF-beta-1 (FIGURA 2). La deteccion del TGF-beta-1 humano mediante ELISA sandwich se consigue mejor usando el anticuerpo 21C11, que se recubre sobre una placa inmunoabsorbente para capturar el TGF-p1. A continuacion, se detecta el TGF-p1 con el anticuerpo 8D6.H5 (FIGURA 3).

45 Cribado de anticuerpos mediante ELISA. Los anticuerpos especfficos para la citoquina TGF-p1 se ensayaron mediante ELISA sobre inmunoplacas Maxisorb (Nunc, Roskild, Dinamarca), se recubrieron durante la noche a 4 °C con el antfgeno diana, p. ej., TGF-p1 (20-200 ng/ml en tampon de glicina 50 mM, pH 9), o se recubrieron primero con neutravidina (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EE. UU.) a 2 g/ml en PBS, seguida de antfgenos biotinilados (100 ng/ml). Tras saturacion de la placa con BSA al 1 %, se procesaron los sueros como se describe (Uyttenhove C y col. 50 (2006) Eur J Immunol 26:2868-2874).

EJEMPLO3

NEUTRALIZACION DE LA ACTIVIDAD DEL TGF-beta-1

55

Se ensayo la actividad neutralizante de los anticuerpos del TGF-p1 evaluando la induccion mediada por el TGF-p1 del gen PAI-1 aguas abajo en un ensayo de luciferasa en celulas. MTGF-beta1.4C3.7, MTGF-beta1.4G9.1, MTGF- beta1.19D8 y MTGF-beta1.13A1 neutralizan la actividad del TGFbeta-1, ya sea humano o de raton. Los anticuerpos MTGF-beta1.8D6, MTGF-beta1.4A11, MTGF-beta1.19H11 y MTGF-beta1.21C11 no mostraron neutralizacion de la 60 actividad del TGF-beta en este ensayo (datos no mostrados). La neutralizacion de la actividad del TGF-beta-1 se

demostro evaluando la perdida de induccion mediada por TGF-beta de genes aguas abajo usando metodos descritos por Abe M y col. (Anal Biochem 1994 Feb 1;216(2):276-84). La expresion del gen PAI-1 se uso para monitorizar la actividad del TGF-beta.

5 Se transfecto de forma estable la lfnea de celulas epiteliales de pulmon de vison (TMLEC) con un promotor de PAI-1 truncado fusionado al gen reportero de luciferasa de luciernaga. Se incubaron 500 pg/ml de TGFbeta-1 humano con diluciones sericas en serie de anticuerpo del TGFbl aislado recuperado de suero de ratones durante 4 h a 37° antes de transferirlo a un volumen igual de medio de cultivo (DMEM + FCS al 10 %) en el que se habfan sembrado 50 000 celulas TMLEC 4 h antes. Tras incubacion adicional durante 24 h, se midio la actividad de la luciferasa con el kit 10 Britelite de Perkin-Elmer y se midio la luminiscencia en un TopCount NXT de Perkin Elmer. Los tftulos sericos inhibitorios se definen como las diluciones sericas que dan una inhibicion del 50 % de las actividades biologicas de la citoquina. La significacion estadfstica (*P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001) se calculo mediante la prueba de Mann-Whitney o de Student como se indica.

15 En presencia de anticuerpos del TGF-beta-1 en suero de raton, la induccion del promotor de PAI-1 mediada por TGF- beta se reduce de forma dependiente de la dosis. Los tftulos sericos inhibitorios variaron de 103 a 104. En particular, el anticuerpo 13A1 es muy potente inhibiendo la bioactividad del TGF-beta-1 (FIGURA 4). Los datos indican que aquf parece haber una tendencia a la mejora del 13A1 sobre el anticuerpo 1D11.16 (1D11) de la tecnica anterior en la neutralizacion del TGF-beta-1.

20

El anticuerpo 13A1 tambien se une al TGF-p1 in vivo, lo que deriva en la eliminacion de la actividad del TGF-beta de suero de raton (FIGURA 5). Esto fue demostrado en estudios en los que se trataron ratones FVB con 13A1 (500 pg) y se recogieron los sueros 6 h despues para el ensayo, tras tratamiento acido, de la induccion mediada por TGF-beta de la actividad de la luciferasa en celulas TMLEC. Para evaluar la actividad del TGF-beta, se incubaron sueros con 25 HCl 0,16 M durante 10 min y se neutralizaron con NaOH. Este tratamiento acido es necesario para liberar TGF-beta activo y, de ese modo, permitir su interaccion con el receptor del TGF-beta en la celula respondedora. Tambien deberfa disociar el TGF-beta de cualquier anticuerpo unido y desnaturalizarlo. Por lo tanto, el hecho de que el tratamiento in vivo con 13A1 aboliera la actividad serica del TGF-beta sugiere que el 13A1 impulsaba la eliminacion del TGF-beta de la sangre, porque no es probable que el 13A1 restante pudiera haber resistido la exposicion a tal acido fuerte.

30

EJEMPLO4

ENFERMEDAD INJERTO CONTRA HUESPED

35 Se ha demostrado que la neutralizacion del TGF-beta tras el trasplante de celulas madre aumenta significativamente la gravedad de la enfermedad injerto contra huesped (EICH) aguda (Banovic T y col. (2005) Blood 106(6):2206-2214). Por tanto, se ensayo la actividad neutralizante del 13A1 in vivo en un modelo de EICH. La enfermedad injerto contra huesped (EICH) se produce en los trasplantes cuando se transfieren celulas donantes inmunocompetentes a receptores o huespedes que son incapaces de rechazar las celulas donantes debido a inmunotolerancia, sistema 40 inmune inmaduro del huesped o inmunodeficiencia, Una reaccion de injerto contra huesped se produce tras la respuesta de las celulas T vfrgenes del donante a estimulantes alogenicos que provocan diferenciacion en celulas efectoras. Los efectos sistemicos de esta reaccion antihuesped inicial del donante puede derivar en fallo multiorganico.

Para entender la inmunobiologfa de los trasplantes, se usan modelos de EICH murinos. Especfficamente, se uso la 45 induccion de EICH en ratones huesped F1 adultos inmunocompetentes para evaluar la actividad neutralizante del 13A1 contra el TGF-p1. Se inyectaron intraperitonealmente celulas del bazo (70 x 106) de donantes C57BL/6 procedentes de la cepa parental en C57BL/6xDBA/2 adultos inmunocompetentes en el dfa 0 y el dfa 6. El donante difiere del receptor en los loci del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) tanto de clase I como de clase II. En el huesped F1, las celulas T del donante parental se expanden y producen efectores citotoxicos, lo que deriva en la 50 eliminacion del sistema linfohematopoyetico del huesped semialogenico. Posteriormente, la quimera donante/huesped es repoblada por celulas de donante derivadas de celulas madre en el inoculo esplenico original. Se observa una grave deficiencia en la funcion de las celulas tanto T como B durante varias semanas.

Se preve que, si la inmunosupresion es mitigada mediante anticuerpo neutralizante para el TGF-p1 13A1, entonces la 55 EICH se agrava. Para evaluar la actividad de neutralizacion del 13A1 durante la EICH, se administraron intraperitonealmente anticuerpos para el TGF-beta 13A1 (0,5 mg) o Ac de control de isotipo IgG1 (0,5 mg) en los dfas 0, 5, 10, 14 y 19. Se usaron dos brazos de tratamiento para determinar el efecto de bloquear el TGF-p1. En un brazo, cinco ratones recibieron Ac de control de isotipo IgG1. En el segundo brazo, 4 ratones recibieron anticuerpos 13A1. La respuesta EICH se evaluo monitorizando la supervivencia (FIGURA 6A) y perdida de peso (FIGURA 6B) entre los 60 grupos de tratamiento. La adicion de anticuerpo 13A1 agravo la EICH. Aunque la perdida de peso en ambas

condiciones de tratamiento es comparable, los ratones que recibieron anticuerpos 13A1 neutralizantes del TFG-beta murieron aproximadamente en el dfa 15, mientras que el 80 % de los ratones del grupo de control permanecieron vivos en ese momento.

5 EJEMPLO5

EVALUACION IN VIVO DEL ANTICUERPO ESPECIFICO DEL TGF-pi

En canceres humanos, los datos recopilados muestran que las celulas T reguladoras, T reg CD4+FOXP3+ (T reg), estan 10 presentes en sitios tumorales locales. Sato y col. han demostrado que la proporcion de celulas T CD8+T a Treg CD4+CD25+FOXP3+ es un indicador pronostico importante, con una baja proporcion asociada a una mala evolucion en pacientes con cancer ovarico. Esto indica el papel esencial de las Treg en la contribucion a respuestas inmunes antitumorales no protectoras. (Sato, E y col. (2o05) PNAS 102(51):18538-18543). La citoquina TGFp1 induce la conversion de celulas T a Treg. A traves de la conversion a Treg y la inhibicion de la activacion de linfocitos T, el 15 TGFp1 tambien favorece la invasion tumoral y la progresion de la enfermedad metastasica en etapas mas tardfas de la tumorigenesis. Como la conversion a Treg inducida por el TGFp1 contribuye a la atenuacion de las respuestas inmunes y a un pronostico malo, un inhibidor del TGFp puede contribuir a la reduccion del numero de celulas T-reg, la mejora de las respuestas inmunes antitumorales y la reduccion de la progresion tumoral.

20 Los trabajos anteriores en modelos de tumor en raton mostraron que el tratamiento con anticuerpos neutralizantes de pan-TGFp antagonistas derivaba en estimulacion de la actividad de las celulas T espedficas de antfgeno tumoral y reduda las poblaciones de Treg. Se determino que estos anticuerpos redudan las poblaciones de celulas T reguladoras FoxP3+ infiltrantes de tumores, lo que indicaba que los anticuerpos neutralizantes de pan-TGFp bloqueaban la conversion de las celulas T a celulas T reguladoras y reduda la metastasis tumoral (Liu VC y col. (2007) 25 J Immunol 178(5): 2883-92).

Hay multiples formas de TGFp, por lo tanto, es necesario bloquear selectivamente el TGFp1 con el fin de conseguir el potencial terapeutico total del bloqueo de la inmunosupresion inducida por el TGFp1 para el tratamiento del cancer. Evaluamos bloquear espedficamente el TGFp1 con anticuerpos neutralizantes que se dirigen solo al TGFp1 y no se 30 unen a otras formas de TGFp. Se ha ensayado la actividad inhibitoria de los anti-TGFp1 sobre el crecimiento y la metastasis tumoral en modelos de raton. Los modelos se utilizan para investigar la proteccion, mejora e inmunosupresion tumoral.

Se han evaluado anticuerpos neutralizantes del TGFp1 en tumores consolidados en modelos subcutaneos o modelos 35 de metastasis con el fin de determinar la actividad antitumoral de los anti-TGFp1 contra tumores primarios y metastasicos. Se permite que los tumores crezcan hasta aproximadamente 200 mm de tamano y, a continuacion, los ratones se aleatorizan en grupos de tratamiento. En modelos de metastasis al pulmon, se inyectan intravenosamente celulas tumorales a los ratones a traves de la vena caudal. Se ensaya el anticuerpo anti-TGFp1 en un raton que recibe anticuerpo anti-TGFp1 administrado IP o IV en un intervalo de dosificaciones con diferencias de 2-10 veces en 40 comparacion con las dosificaciones usadas en el modelo de EICH (0,5 mg). Los ratones de los grupos de control reciben un volumen igual de solucion salina o solucion de IgG1 normal. El tratamiento de los animales se continua durante toda la duracion del experimento. Se calculan los volumenes tumorales usando cualquier metodo estandar bien conocido en la tecnica.

45 Se analizan los datos de volumen tumoral para determinar las diferencias significativas de tamano tumoral entre los tratamientos, momentos temporales e interacciones tratamiento-tiempo. Un valor P inferior a 0,05 se considera que es estadfsticamente significativo. El anticuerpo anti-TGFp1 inhibe significativamente el crecimiento del tumor primario y la metastasis pulmonar espontanea en un modelo de tumor.

50 Se evalua la actividad inhibitoria de anti-TGFp1 de raton contra la conversion de celulas T a celulas Treg CD4/CD25/Foxp3 Treg en modelos de tumor. En resumen, se activan celulas CD4+ vfrgenes purificadas aisladas de muestras de tumor procedentes de los grupos de anticuerpo anti-TGFp-1 o IgG1 de control mediante estimulacion usando metodos bien conocidos en la tecnica. Se determina mediante analisis FACS el efecto inhibitorio del anticuerpo anti-TGFp1 sobre la conversion de celulas T en Treg en ratones con tumores para evaluar los cambios en la poblacion 55 de CD4/CD25/Foxp3 tras el tratamiento de los ratones con anticuerpo anti-TGFp1. El anticuerpo anti-TGFp1 de raton reduce significativamente el numero de celulas Treg CD4/CD25/Foxp3 en los ratones con tumores tratados en comparacion con el control de IgG1. Estos resultados indican que los anticuerpos anti-TGFp1 pueden controlar la poblacion de CD4/CD25/Foxp3 mediante inhibicion y/o deplecion de Treg.

60 La contribucion de la actividad inhibitoria del anticuerpo anti-TGFp1 a la mejora inmune se evalua analizando celulas

T asociadas a tumor derivadas de muestras de biopsias tumorales para activacion del TCR. En resumen, se activan celulas CD4+ vmgenes purificadas aisladas de muestras de tumor procedentes de los grupos de anticuerpo anti-TGFp- 1 o IgG1 de control mediante estimulacion de las celulas T usando metodos bien conocidos en la tecnica. Se evaluan las celulas para determinar actividad de las celulas T mejorada buscando perdida de anergia de las celulas T inducida 5 por Treg, incluso monitorizando la produccion de citoquinas y marcadores de activacion mediante metodos bien conocidos en la tecnica (Broderick L. y col. (2006) J Immunol 177:3082-3088). El anticuerpo anti-TGFp1 mejora la activacion de las celulas T en comparacion con las celulas tratadas con IgG1 de control.

Se ha descubierto que el mAc del CTLA-4 humano provoca respuestas clmicas objetivas y duraderas en un subgrupo 10 de pacientes con melanoma. Estudios anteriores han demostrado que el bloqueo de la accion del CTLA-4 mediante anticuerpos monoclonales mejora las respuestas de las celulas T efectoras e induce rechazo tumoral mediado por las celulas T en modelos de raton (Fong L y col. (2008) J Clin Oncol 26:5275-5283). Sin embargo, la efectividad de tal inmunoterapia puede ser atenuada por las Treg. El bloqueo del CLTA-4 induce un aumento del numero de Treg, asf como del numero de celulas T CD8+. Teniendo en cuenta la importancia de las Treg en la supresion de las respuestas 15 inmunes antitumorales, el control de las Treg es un objetivo importante y clmicamente relevante. Por lo tanto, hemos buscado aumentar las respuestas inmunes mediante modulacion combinatorial de moleculas reguladoras que incluyen IDO, TDO, a-galactosilceramida y analogos de las mismas tales como IMM47 Lag3, iCOS, GITR, ligando de GITR, CTLA-4, PD1, ligando de PD1, OX40 y ligando de OX40. Los agonistas del OX40 se enumeran en la solicitud de patente publicada US2012/0141465 basada en USSN 11/867.621. Garison K y col. notificaron que los anti-TGFp1 20 mejorados redprocamente por anti-OX40 provocaban un potente efecto antitumoral contra tumores primarios consolidados (Garrison K y col. (2012) Cancer Immunol Immunother Apr;61 (4):511-21). Los inmunomoduladores adicionales son moleculas pequenas, anticuerpos antagonistas o anticuerpos agonistas que se dirigen a los correspondientes inmunomoduladores incluyendo IDO, TDO, la familia de receptores de tipo Toll, iCOS, CTLA-4, PD1, ligando de PD1, OX40 y ligando de OX40, interleuquinas, el factor de necrosis tumoral (TNF) u otros factores de 25 crecimiento, factores estimulantes de colonias, moduladores de celulas T, incluyendo moduladores de celulas T CD8+, citoquinas que estimulan la respuesta inmune o la reduccion o eliminacion de celulas cancerosas o tumores.

Ademas, los anticuerpos anti-TGFp1 de la presente invencion pueden administrarse solos o en combinacion con un agente antineoplasico distinto de los anticuerpos anti-TGFp1, radiacion, otros antagonistas del TGFpRII, antagonistas 30 del TGFp, anticuerpos para otras dianas y moleculas pequenas. La administracion de los anticuerpos con otros anticuerpos y/o tratamientos puede producirse simultaneamente, o por separado, a traves de la misma via o una diferente, en el mismo o diferentes momentos.

Dadas las limitaciones clmicas notificadas para las estrategias de vacunas contra el cancer terapeuticas, la 35 combinacion de la inhibicion del TGFp1 derivado de tumores y la inmunosupresion mediada por Treg con una vacuna o estrategia inmunogenica direccionada puede proporcionar la sinergia necesaria para superar los mecanismos de evasion inmune tumoral. Por lo tanto, hemos buscado aumentar las respuestas inmunes combinando anticuerpos anti- TGFp1 con antfgenos del cancer de testmulos, incluyendo los antfgenos del cancer de testmulos MAGE-A1, MAGE- A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE- 40 A12, MAGE-A13, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, BAGE-1, RAGE-1, LB33/MUM-1, PRAME, NAG, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), tirosinasa, glucogeno fosforilasa del cerebro, Melan-A, MAGE-C1, MAGE-C2, NY-ESO-1, LAGE-1, SSX-1, SSX-2(HOM-MEL- 40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 y CT-7. Por ejemplo, los peptidos antigenicos caractensticos de tumores incluyen los enumerados en la solicitud PCT publicada Wo00/20581(PcT/US99/21230), en la solicitud de Estados Unidos 45 publicada US2012/0328660 basada en USSN 13/484.884 y 61/493.164 y en Sabbatini PJ y col. (2012) Clin Cancer Res 18; 6497.

EJEMPLO6

50 CARACTERISTICAS DE UNION DE LOS ANTICUERPOS DEL TGF-pi

Se compararon las caractensticas de union relativa de los anticuerpos del TGF-p1 aislados en experimentos de union competitiva frente a 1D11, que une todas las formas de TGF-p, y al anticuerpo espedfico del TGF-p1 13A1. En cada caso, se incubo TGF-p1 humano biotinilado (20 ng/ml) durante la noche con anticuerpo monoclonal del TGF-p1 13A1 55 (20 pg/ml) o pananticuerpo 1D11 o BSA. Tras el periodo de preincubacion de una noche, se transfirieron las mezclas de union de anticuerpo a placas recubiertas con anticuerpos 1D11, 4A11,4C3, 4G9, 8D6, 13A1, 19D8, 19H11,21C11 o BSA. Se incubaron las placas durante 2 h. Tras 2 h a 37°, se anadio estreptavidina-HRP durante 1 h. Si el TGF-p1 biotinilado se une a la placa, los Ac recubiertos reaccionan con un sitio sobre el TGF-p1 que no se enmascaro durante la preincubacion con 1D11 o 13A1. Los resultados se presentan en la Figura 7.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Van Snick, Jacques 5

<120> ANTICUERPOS ESPECIFICOS DEL TGF-B1 Y METODOS Y USOS DE LOS MISMOS

<130> 2332-1-026PCT

10 <140> SIN ASIGNAR <141>

<150> 61/608.393 <151> 15

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

20 <210> 1 <211> 115 <212> PRT <213> Mus musculus

25 <400> 1

imagen1

<210>2

<211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus

5 <400>2

Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gin Arg Ala 15 10 15

Thr lie Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly lie Ser 20 25 30

Phe Leu Asn Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45

lie Tyr Ala Ala Ser Asn Gin Gly Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn lie His Pro Met Glu 65 70 75 80

Glu Asp Asp Thr Gly Met Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Lys Glu Val Pro 85 90 95

Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie lie 100 105

<210>3 10 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 3 15

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Met His 15 10

<210>4 <211> 10 20 <212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

Thr lie Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Asn

25 15 10

<210>5 <211> 16 <212> PRT

30 <213> Mus musculus <400> 5

Glu Asp Ser Arg Ser Leu Tyr Tyr Asn Gly Trp Asp Tyr Phe Asp Tyr 15 10 15

<210>6 5 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus

<400>6

10

Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly lie Ser Phe 15 10

<210> 7 <211>4 <212> PRT

15 <213> Mus musculus

<400>7

Tyr Ala Ala Ser 1

20

<210>8 <211>9 <212> PRT <213> Mus musculus 25

<400> 8

Gin Gin Ser Lys Glu Val Pro Arg Thr 1 5

30 <210>9 <211> 13 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

35 <220>

<223> Peptido PADRE

<220>

<221> misc feature

40 <222> (3)..(3)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido natural

<400> 9

Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Cys 45 1 5 10

<210> 10 <211> 16 <212> PRT

50 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Peptido de la toxina del tetanos 55 <400> 10

Cys Gin Tyr lie Lys Ala Asn Ser Lys Phe lie Gly lie Thr Glu Leu

15 10 15

<210> 11 <211>8 5 <212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 11

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp

10 15

<210> 12 <211>8 <212> PRT

15 <213> Mus musculus <400> 12

20

lie Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr 1 5

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una molecula de anticuerpo aislado o fragmento del mismo que reconoce el factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-p1) humano y de raton, no reacciona con el TGF-p2 o TGF-p3, y neutraliza la actividad del

   5 TGF-p1; y que comprende una region variable de cadena pesada que comprende las secuencias de dominio CDR CDR1 GYTFTNYW (SEQ ID NO: 11)_o GYTFTNYWMH (SEQ ID NO: 3), CDR2 IYPGNSDT (SEQ ID NO: 12) o TIYPGNSDTN (SEQ ID NO: 4)_ y CDR3 EDSRSLYYNGWDYFDY (SEQ ID NO: 5) y una region variable de cadena ligera que comprende las secuencias de dominio CDR CDR1 ESvDnYGISF (SEQ ID NO: 6), CDR2 YAAS (SEQ ID NO: 7) y CDR3 QQSKEVPRT (SEQ ID NO: 8).

   10
2. 2. El anticuerpo aislado o fragmento de la reivindicacion 1 que es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende una region variable de cadena pesada que comprende las secuencias de dominio CDR CDR1 GYTFTNYW (SEQ ID NO: 11), CDR2 IYPGNSDT (SEQ ID NO: 12) y CDR3 EDSRSLYYNGWDYFDY (SEQ ID NO: 5) o CDR1 GYTFTNYWMH (SEQ ID NO: 3), CDR2 TIYPGNSDTN (SEQ ID NO: 4) y CDR3 EDSRSLYYNGWDYFDY

   15 (SEQ ID NO: 5) y una region variable de cadena ligera que comprende las secuencias de dominio CDR CDR1 ESVDNYGISF (SEQ ID NO: 6), CDR2 YAAS (SEQ ID NO: 7) y CDR3 QQSKEVPRT (SEQ ID NO: 8).
3. 3. El anticuerpo aislado o fragmento de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2 que es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena pesada

   20 seleccionada de entre la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1 presentada en la Figura 1, o variantes de la misma que tienen al menos un 90 % de identidad de aminoacidos con la SEQ ID NO: 1 o comprenden de 1 a 3 sustituciones de aminoacidos en una o mas regiones CDR de cadena pesada de la Figura 1, donde dichas variantes retienen la reactividad contra y la neutralizacion del TGF-p1 y carecen de reactividad contra el TGF-p2 y TGF-p3.

   25 4. El anticuerpo aislado de la reivindicacion 3 que comprende ademas una region variable de cadena ligera

   que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada de entre la secuencia de aminoacidos como se presenta en la SEQ ID NO: 2, o variantes de la misma que tienen al menos un 90 % de identidad de aminoacidos con la SEQ ID NO: 2 o comprenden de 1 a 3 sustituciones de aminoacidos en una o mas regiones CDR de cadena ligera de la Figura 1, donde dichas variantes retienen la reactividad contra y la neutralizacion del TGF-p1 y carecen de reactividad 30 contra el TGF-p2 y TGF-p3.
4. 5. El anticuerpo aislado o fragmento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que es un anticuerpo o fragmento del mismo donde dicho anticuerpo aislado esta en forma de un F(ab')2 de anticuerpo, fragmento scFv, anticuerpo de dominio, minianticuerpo, dianticuerpo, trianticuerpo o tetranticuerpo.

   35
5. 6. El anticuerpo aislado o fragmento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que comprende ademas un marcador detectable o funcional.
6. 7. El anticuerpo aislado de la reivindicacion 6, donde dicho marcador detectable o funcional es un farmaco 40 unido covalentemente o es un radiomarcador.
7. 8. Un acido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un anticuerpo o fragmento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

   45 9. Un metodo de preparacion de un anticuerpo o fragmento como se define en una cualquiera de las

   reivindicaciones 1 a 5 que comprende expresar el acido nucleico de la reivindicacion 8 en celulas in vitro en condiciones que logran la expresion de dicho anticuerpo o fragmento, y recuperar el anticuerpo o fragmento.
8. 10. Un anticuerpo o fragmento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para uso en un metodo

   50 de tratamiento del cancer o prevencion de la recidiva o metastasis del cancer en un mamffero, para uso en la estimulacion o mejora de una respuesta inmune a una vacuna contra el cancer o un antfgeno canceroso, para uso como agente inmunomodulador en un mamffero, para uso en el bloqueo de la inmunosupresion mediada por Treg en un mamffero, o para uso en un metodo de diagnostico del cancer en un mamffero.

   55 11. Un kit para el diagnostico o pronostico in vitro del cancer en el que se expresa antfgeno TGF-p1,

   comprendiendo dicho kit un anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, opcionalmente con reactivos y/o instrucciones de uso.
9. 12. Una composicion farmaceutica o composicion inmunologica que comprende un anticuerpo o fragmento

   60 como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un vehfculo, excipiente o diluyente farmaceuticamente

   aceptable, que comprende opcionalmente un adyuvante y/o uno o mas antfgenos, un anticuerpo inmunoregulador, o un inhibidor de molecula pequena de un inmunomodulador.
10. 13. Una forma de dosificacion farmaceutica de la composicion farmaceutica o la composicion inmunologica

    5 de la reivindicacion 12 para uso en un kit para el tratamiento de un tumor en un paciente humano, que comprende ademas una forma de dosificacion farmaceutica independiente que comprende un agente anticancerfgeno adicional seleccionado del grupo que consiste en antfgeno(s) canceroso(s) o tumoral(es), agentes quimioterapeuticos, agentes radioinmunoterapeuticos y combinaciones de los mismos.

    10 14. Un metodo in vitro para detectar la presencia de cancer o determinar el pronostico de un cancer en un

    mamffero donde dicho cancer se mide o se determina su pronostico determinando la presencia y/o cantidad de TGF- p1 que comprende:

    A. poner en contacto una muestra biologica de un mamffero en el que se sospecha la presencia de cancer con el 15 anticuerpo o fragmento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en condiciones que permiten que se produzca la

    union de dicho TGF-p1 a dicho anticuerpo; y

    B. detectar si se ha producido union entre dicho TGF-p1 de dicha muestra y el anticuerpo o determinar la cantidad de union que se ha producido de dicho TGF-p1 de dicha muestra y el anticuerpo;

    20

    donde la deteccion de union indica la presencia de cancer en dicha muestra y la cantidad de union indica el pronostico del cancer en dicha muestra.
11. 15. Un anticuerpo o fragmento para uso segun la reivindicacion 10 en un metodo de tratamiento del cancer

    25 o prevencion de la recidiva o metastasis del cancer en un mamffero, para estimular o mejorar una respuesta inmune a una vacuna contra el cancer o antfgeno canceroso o para diagnostico del cancer en un mamffero o un metodo segun la reivindicacion 14 donde el cancer se selecciona de entre melanoma, cancer de colon, cancer de mama, cancer de pulmon, cancer de prostata y fibrosarcoma.