KR102376605B1 - 종교차성 항잠재형 TGF-β1 항체 및 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 목적은, 잠재형 TGF-β1의 인테그린 매개 활성화를 저해하지 않고 잠재형 TGF-β1의 프로테아제 매개 활성화를 저해하는, 종교차성의 항잠재형 TGF-β1 항체를 제공하는 것이다. 본 발명의 항잠재형 TGF-β1 항체를 얻기 위해서, 잠재형 TGF-β1의 인테그린 매개 활성화를 저해하지 않고 잠재형 TGF-β1의 프로테아제 매개 활성화를 저해하는 항잠재형 TGF-β1 항체를 스크리닝한 후, 인간화하고, 추가로 최적화했다. 본 발명은 또한, 항잠재형 TGF-β1 항체와, 1개 또는 복수의 면역 체크포인트 저해제, 바람직하게는 PD-1계 결합 안타고니스트를 포함하는 병용 요법을 제공한다.

Description

종교차성 항잠재형 TGF-β1 항체 및 사용 방법
본 발명은, 항잠재형 TGF-β1 항체 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.
형질 전환 성장 인자 β(형질 전환 성장 인자 베타; TGF-β)는, TGF-β 아이소폼, 액티빈, 인히빈, 노달(Nodal), 골형성 단백질(BMP), 항뮐러관 호르몬(AMH) 및 증식 분화 인자(GDF)로 이루어지는, 사이토카인의 TGF-β 슈퍼패밀리의 멤버이다. 이 슈퍼패밀리의 멤버는, 보존된 구조를 갖는 이량체 단백질이며, 인비트로 및 인비보로 다면적인 기능을 갖는다(비특허문헌 1, 2). TGF-β 아이소폼은, 증식 저해, 세포 유주, 침윤, 상피간엽 전환(EMT), 세포외 매트릭스(ECM) 리모델링 및 면역 억제를 포함하는 많은 세포 프로세스에 관여한다(비특허문헌 3). 그러나, 통상 시에는 동적으로 조절되어 조직의 항상성에 관여하고 있음에도 불구하고, TGF-β 아이소폼은 자주, 암, 섬유증 및 염증을 포함하는 질환 상태에 있어서 만성적으로 과잉 발현되고, 이 TGF-β의 과잉 산생은, 세포 증식, 유주 또는 표현형을 변화시키는 것에 의해 질환의 진행을 촉진한다.
포유동물에 있어서는 3개의 별개의 TGF-β 아이소폼(TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3)이 동정되어 있고, 이들은 아미노산 레벨로 70 내지 82%의 상동성을 공유하고 있다(비특허문헌 4). 3개의 TGF-β 아이소폼은 모두, 호모이량체(그들의 활성 형태)로 TGF-β 수용체 2형(TGFR2)에 결합하고; TGFR2는 그것에 의해, TGF-β 수용체 1형(TGFR1)을 동원 및 활성화하여, 수용체 시그널 전달을 활성화시킨다(비특허문헌 5). 그러나, 3개의 아이소폼의 발현 레벨은, 조직에 따라 다양하고(비특허문헌 6), 그들의 기능은, 녹아웃 마우스의 표현형에 의해 나타나듯이, 상이하다(비특허문헌 7 내지 11).
TGF-β 슈퍼패밀리의 다른 멤버와 마찬가지로, TGF-β는, 그 잠재 관련 펩티드(latency-associated peptide; LAP) 및 잠재형 TGF-β 결합 단백질(LTBP)과 상호작용하여 잠재형 대복합체(large latent complex; LLC)로 불리는 큰 복합체를 형성하는 호모이량체를 형성하는 전구체 단백질로서 합성된다. TGF-β 유전자는, 시그널 펩티드, 프로단백질 컨버타제(PPC) 절단 부위에서 종료되는 프로펩티드, 및 성숙 TGF-β 서열로 이루어지는 프리프로단백질 서열을 코딩한다. 퓨린은, PPC 절단 부위를 가수분해하여, TGF-β 및 프로펩티드 유래의 별개의 호모이량체를 생성한다. 이들 2개의 호모이량체는, 비공유결합적으로 결합한 상태를 유지하여, 분비된다. 이 잠재형 복합체는, TGF-β를, 그 수용체에 결합할 수 없는 불활성 형태로 유지한다(비특허문헌 12, 13). TGF-β 활성화 프로세스는, ECM으로부터의 LLC의 방출, 그 후의 LAP의 추가적인 단백질 분해에 의한 그 수용체로의 활성 TGF-β의 방출을 포함한다(비특허문헌 3). 잠재형 TGF-β는, 플라스민(PLN), 혈장 칼리크레인(PLK), 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP) 2 및 MMP9를 포함하는 광범위의 프로테아제(비특허문헌 14)에 의해, 및 트롬보스폰딘 1(TSP-1)(비특허문헌 15)에 의해 절단되어 활성 TGF-β를 방출한다. 어떠한 학설에 구속되는 것을 바라지 않지만, MMP2 및 MMP9는, 잠재형 TGF-β1을 단백질 분해에 의해 절단하여, 잠재형 형태로부터 성숙 TGF-β1을 방출한다. MMP2 및 MMP9는 둘 다, 불활성인 프로MMP로서 합성된다. 프로MMP2는, 막형 MMP1(MT1-MMP/MMP14) 및 조직 메탈로프로테아제 저해 물질 2(TIMP-2)의 복합체에 의해 활성화된다. 프로MMP9는, 플라스민 및 스트로멜리신 1(MMP-3)을 포함하는 상호작용 프로테아제 캐스케이드를 통해서 활성화된다. 플라스민은, 그 효소원으로부터 활성 MMP-3을 생성한다. 활성 MMP-3은, 92-kDa의 프로MMP-9로부터 프로펩티드를 절단하여, 82-kDa의 효소적으로 활성인 효소를 생성한다. MMP의 절단 부위는, 구체적으로 결정되어 있지 않지만; MMP3은, 잠재형 TGF-β의 79 Ala와 80 Leu의 사이의 부위를 특이적으로 절단하여, TGF-β를 활성화함이 보고되어 있다(WO2005/023870). 혹은, 기계적 신장에 의해, 인테그린이, LAP 내에 존재하는 RGD 모티프로의 결합에 의해 TGF-β를 활성화하여, 그 잠재형 복합체로부터의 성숙 TGF-β의 방출을 유도할 수 있다(비특허문헌 16, 17).
활성화 후, 이량체 TGF-β 리간드는, I형 및 II형 수용체의 세포외 도메인에 결합하여 근접하도록 유도하여, 수용체의 세포내 세린/트레오닌 키나제 도메인을, I형 수용체의 인산화 및 그 후의 활성화를 촉진하는 입체배치로 한다. 이 I형 수용체의 활성화는, 적어도 2개의 표면 상 독립되어 있는 경로: SMAD 의존적 카노니칼 경로 및 SMAD 비의존적 또는 비카노니칼 경로에 의한 시그널 전달의 증폭을 가져온다. SMAD 의존적 경로에 있어서, TGFR1(ALK5로서도 공지)의 활성화는, SMAD 단백질의 인산화를 가져온다. SMAD2 및 SMAD3은, TGFR1의 기질이다. 수용체에 의해 인산화되면, SMAD는 공통의 메디에이터인 SMAD4와 함께 핵으로 이행하고, 거기에서 그들은 다른 전사 인자와 상호작용하여 전사 응답을 조절한다(비특허문헌 18). 비카노니칼 경로에 있어서, 활성화된 TGF-β 수용체 복합체는, 다른 인자, 예를 들어 종양괴사 인자(TNF) 수용체 관련 인자 4(TRAF4), TRAF6, TGF-β 활성화 키나제 1(TAK1, MAP3K7로서도 공지), p38 마이토젠 활성화 단백질 키나제(p38 MAPK), RHO, 포스포이노시티드 3-키나제(PI3K), AKT(프로테인 키나제 B로서도 공지), 세포외 시그널 조절 키나제(ERK), JUN N말단 키나제(JNK) 또는 핵인자 κB(NF-κB)를 통해서 시그널을 전달한다. 따라서, TGF-β 시그널 전달에 대한 세포 응답은, 카노니칼 및 비카노니칼 시그널 전달 캐스케이드의 동적인 제휴에 의해 초래된다.
섬유증, 또는 반흔 조직을 형성하는 ECM 분자의 축적은, 만성 조직 손상의 일반적인 특징이다. 폐 섬유증, 신장 섬유증, 및 간경변은, 특히 보다 일반적인 섬유증이며, 이들에 대해서 충족되지 않은 임상적 요구가 많이 존재한다. TGF-β는, 간엽계 세포의 세포외 매트릭스의 생성을 강하게 촉진하면서, 동시에 상피 세포의 증식을 억제하여, 이것이 경화성 질환의 발병에 기여하고 있다. 트랜스제닉 마우스의 간장에 있어서의 활성 형태의 TGF-β1의 과잉 발현은, 복수의 장기에 있어서 섬유증을 유도하는 데 충분하다(비특허문헌 19). 다른 한편, TGF-β는 또한, 우리의 건강의 유지에 있어서도 중요한 역할을 담당하고 있다. 예를 들어, TGF-β는, 폐에 있어서 프로테아제의 과잉 생성을 억제하여, 폐기종을 야기하는 폐 조직의 파괴를 억제한다. 또한, TGF-β1이 결여된 마우스는, 출생전 치사(교미 후 10.5일에 약 50%) 또는 출생 후, 폐(혈관염, 혈관 주위성 세포 침윤, 및 간질성 폐렴) 및 심장(심내막염 및 심근염)을 포함하는 많은 장기에 있어서 중증의 염증 병소가 나타나, 이른 죽음을 나타낸다. 이것은, TGF-β1이 면역 항상성의 유지에 있어서 결정적인 역할을 담당하고 있음을 시사하고 있다(비특허문헌 7).
TGF-β에 대한 중화 항체 및 동물 모델을 이용한 연구의 결과는, TGF-β의 작용을 억제하는 것에 의해 경화성 질환을 예방 또는 치유할 수 있음을 명확히 했다. TGF-β는 전구체 단백질로서 산생되므로, 그 잠재 형태로부터의 활성화를 방지하는 접근 방법이 몇몇 보고되어 있다. 그 잠재 형태로부터의 활성화를 방지하는 다른 방법은, 잠재형 TGF-β에 결합하는 저해제 또는 항체를 사용하여, 프로테아제, 예를 들어 PLK 및 PLN에 의한 절단을 블로킹하는 것이다. TGF-β의 활성화를 억제하는 이 방법을 사용하는 다양한 항체가, 간 섬유증/간경변을 예방 또는 치료함이 보고되었다(특허문헌 1). 게다가, 몇몇 문헌에 있어서, 암을 치료하기 위한 항LAP 항체(특허문헌 2) 및 TGF-β1 관련 장애를 치료하기 위한 TGF-β1 결합 면역글로불린(특허문헌 3)이 언급되어 있다.
WO 2011102483 WO 2016115345 WO 2017156500
McCartney-Francis, N. L. et al. Int. Rev. Immunol. 16, 553-580 (1998) Massague, J. Annu. Rev. Biochem. 67, 753-791 (1998) Derynck, R. & Miyazono, K. Cold Spring Harbor Press (2008) Yu, L. et al. Kidney Int. 64, 844-856 (2003). Xu, P., Liu, J. & Derynck, R. et al. FEBS Lett. 586, 1871-1884 (2012). Millan, F. A. et al. Development 111, 131-143 (1991). Kulkarni, A. B. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 90, 770-774 (1993). Shull, M. M. et al. Nature 359, 693-699 (1992). Dickson, M. C. et al. Development 121, 1845-1854 (1995). Sanford, L.P. et al. Development 124, 2659-2670 (1997). Proetzel, G. et al. Nature Genet. 11, 409-414 (1995). Dubois, C. M.et al. J. Biol. Chem. 270, 10618-10624 (1995) Nunes, I. et al. J. Am. Optom. Assoc. 69, 643-648 (1998) Annes, J. et al. J. Cell Sci. 116, 217-224 (2003). Schultz-Cherry, S. et al. J. Biol. Chem. 269, 26775-26782 (1994). Munger, J. S. et al. Cell 96, 319-328 (1999). Shi, M. et al. Nature 474, 343-349 (2011). Shi, Y. & Massague, et al. Cell 113, 685-700 (2003). Sanderson, N. et al. Proc. Natl Acad. Sci.USA 92, 2572-2576 (1995).
본 발명의 하나의 목적은, 잠재형 TGF-β1의 인테그린 매개 활성화를 저해하지 않고 잠재형 TGF-β1의 프로테아제 매개 활성화를 저해하는, 종교차성의(cross-species) 인간화 및 최적화한 항잠재형 TGF-β1 항체를 제공하는 것이다. 본 발명은 또한, 항잠재형 TGF-β1 항체 및 1개 또는 복수의 면역 체크포인트 저해제를 포함하는, 병용 요법을 제공한다.
본 발명자들은, 상기의 상황하에서 예의 연구를 행한 결과, 잠재형 TGF-β1의 인테그린 매개 활성화를 저해하지 않고 TGF-β1의 프로테아제 매개 활성화를 저해하는, 종교차성의 인간화 및 최적화한 항잠재형 TGF-β1 항체를 창출했다. 더욱이, 당해 항잠재형 TGF-β1 항체는, 1개 또는 복수의 면역 체크포인트 저해제와 조합하여 투여했을 때에, 항종양 효과를 나타냈다.
본 발명은 이하를 제공한다:
A1. 이하를 포함하는, 항잠재형 TGF-β1 항체:
(a) 서열 번호: 20, 21 및 22의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3;
(b) 서열 번호: 26, 27 및 28의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3;
(c) 서열 번호: 32, 33 및 34의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3; 또는
(d) 서열 번호: 38, 39 및 40의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3.
A2. 이하를 추가로 포함하는, A1에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체:
(a) 서열 번호: 23, 24 및 25의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3;
(b) 서열 번호: 29, 30 및 31의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3;
(c) 서열 번호: 35, 36 및 37의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3; 및
(d) 서열 번호: 41, 42 및 43의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3.
A3. 이하를 포함하는, 항잠재형 TGF-β1 항체:
(a) 서열 번호: 20, 21 및 22의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3, 및 서열 번호: 23, 24 및 25의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3;
(b) 서열 번호: 26, 27 및 28의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3, 및 서열 번호: 29, 30 및 31의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3;
(c) 서열 번호: 32, 33 및 34의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3, 및 서열 번호: 35, 36 및 37의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3; 또는
(d) 서열 번호: 38, 39 및 40의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3, 및 서열 번호: 41, 42 및 43의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3.
A4. 이하를 포함하는, A1 내지 A3 중 어느 하나에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체:
(a) (i) 서열 번호: 12의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VH 서열, (ii) 서열 번호: 13의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VL 서열, 혹은 (iii) (i)의 VH 서열 및 (ii)의 VL 서열;
(b) (i) 서열 번호: 14의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VH 서열, (ii) 서열 번호: 15의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VL 서열, 혹은 (iii) (i)의 VH 서열 및 (ii)의 VL 서열;
(c) (i) 서열 번호: 16의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VH 서열, (ii) 서열 번호: 17의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VL 서열, 혹은 (iii) (i)의 VH 서열 및 (ii)의 VL 서열; 또는
(d) (i) 서열 번호: 18의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VH 서열, (ii) 서열 번호: 19의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VL 서열, 혹은 (iii) (i)의 VH 서열 및 (ii)의 VL 서열.
A5. 서열 번호: 12, 14, 16, 또는 18의 VH 서열을 포함하는, A4에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체.
A6. 서열 번호: 13, 15, 17, 또는 19의 VL 서열을 포함하는, A4 또는 A5에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체.
A7. 이하를 포함하는, A4 내지 A6 중 어느 하나에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체:
(a) 서열 번호: 12의 VH 서열 및 서열 번호: 13의 VL 서열;
(b) 서열 번호: 14의 VH 서열 및 서열 번호: 15의 VL 서열;
(c) 서열 번호: 16의 VH 서열 및 서열 번호: 17의 VL 서열; 또는
(d) 서열 번호: 18의 VH 서열 및 서열 번호: 19의 VL 서열.
A8. 이하를 포함하는, 항잠재형 TGF-β1 항체:
(a) 서열 번호: 12의 VH 서열 및 서열 번호: 13의 VL 서열;
(b) 서열 번호: 14의 VH 서열 및 서열 번호: 15의 VL 서열;
(c) 서열 번호: 16의 VH 서열 및 서열 번호: 17의 VL 서열; 또는
(d) 서열 번호: 18의 VH 서열 및 서열 번호: 19의 VL 서열.
A9. 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체인, A1 내지 A8 중 어느 하나에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체.
A10. 전장 IgG 항체, 바람직하게는 전장 IgG1 항체인, A1 내지 A9 중 어느 하나에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체.
A11. 이중 특이성 항체인, A1 내지 A9 중 어느 하나에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체.
A12. 야생형 IgG1 Fc 영역과 비교하여 저감된 이펙터 기능을 갖는 개변 IgG1 Fc 영역을 포함하는, A1 내지 A11 중 어느 하나에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체.
A13. 상기 개변 IgG1 Fc 영역이, EU 인덱스에 의한 EU235 위치 및/또는 EU236 위치에 아미노산 치환을 포함하는, A12에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체.
A14. 상기 개변 IgG1 Fc 영역이, EU 인덱스에 의한 L235R 및 G236R의 아미노산 치환을 포함하는, A12 또는 A13에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체.
A15. 상기 개변 IgG1 Fc 영역이, 야생형 IgG1 Fc 영역과 비교하여 증강된 FcRn 결합 활성을 추가로 갖는, A12 내지 A14 중 어느 하나에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체.
A16. 상기 개변 IgG1 Fc 영역이, EU 인덱스에 의한 EU428 위치, EU434 위치, EU438 위치, 및 EU440 위치로 이루어지는 군으로부터 선택되는 위치에 1개 또는 복수의 아미노산 치환을 포함하는, A15에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체.
A17. 상기 개변 IgG1 Fc 영역이, M428L, N434A, Q438R, 및 S440E의 아미노산 치환을 포함하는, A15 또는 A16에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체.
A18. K214R, L235R, 및 G236R의 아미노산 치환을 포함하는 개변 IgG1 Fc 영역을 포함하는, A1 내지 A11 중 어느 하나에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체.
A19. K214R, L235R, G236R, M428L, N434A, Q438R, 및 S440E의 아미노산 치환을 포함하는 개변 IgG1 Fc 영역을 포함하는, A1 내지 A11 중 어느 하나에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체.
A20. 항체 단편인, A1 내지 A11 중 어느 하나에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체.
A21. 이하를 포함하는, 항잠재형 TGF-β1 항체:
(a) 서열 번호: 47의 전장 중쇄 서열 및 서열 번호: 60의 전장 경쇄 서열;
(b) 서열 번호: 48의 전장 중쇄 서열 및 서열 번호: 61의 전장 경쇄 서열;
(c) 서열 번호: 49의 전장 중쇄 서열 및 서열 번호: 62의 전장 경쇄 서열;
(d) 서열 번호: 50의 전장 중쇄 서열 및 서열 번호: 63의 전장 경쇄 서열;
(e) 서열 번호: 51의 전장 중쇄 서열 및 서열 번호: 64의 전장 경쇄 서열;
(f) 서열 번호: 52의 전장 중쇄 서열 및 서열 번호: 65의 전장 경쇄 서열;
(g) 서열 번호: 53의 전장 중쇄 서열 및 서열 번호: 66의 전장 경쇄 서열; 또는
(h) 서열 번호: 54의 전장 중쇄 서열 및 서열 번호: 67의 전장 경쇄 서열.
A22. 잠재형 TGF-β1이, 인간 잠재형 TGF-β1, 마우스 잠재형 TGF-β1, 또는 필리핀원숭이 잠재형 TGF-β1인, A1 내지 A21 중 어느 하나에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체.
A23. 인간 잠재형 TGF-β1, 마우스 잠재형 TGF-β1, 및 필리핀원숭이 잠재형 TGF-β1에 결합하는, A1 내지 A22 중 어느 하나에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체.
A24. 잠재형 TGF-β1의 잠재 관련 펩티드(latency associated peptide; LAP) 영역에 결합하는, A1 내지 A23 중 어느 하나에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체.
A25. A1 내지 A24 중 어느 하나에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체 및 세포상해제를 포함하는, 이뮤노컨주게이트.
A26. A1 내지 A24 중 어느 하나에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체를 코딩하는, 단리된 핵산.
A27. A26에 기재된 핵산을 포함하는 벡터.
A28. A26에 기재된 핵산 또는 A27에 기재된 벡터를 포함하는 숙주 세포.
A29. 항잠재형 TGF-β1 항체를 제작하는 방법으로서, 해당 항체가 산생되도록 A28에 기재된 숙주 세포를 배양하는 공정을 포함하는, 방법.
A30. 항체를 숙주 세포로부터 회수하는 공정을 추가로 포함하는, A29에 기재된 방법.
B1. 의약으로서 사용하기 위한, A1 내지 A24 중 어느 하나에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체 또는 A25에 기재된 이뮤노컨주게이트.
B2. 섬유증 또는 암의 치료에 있어서 사용하기 위한, A1 내지 A24 중 어느 하나에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체 또는 A25에 기재된 이뮤노컨주게이트.
B3. 섬유증 또는 암의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의, A1 내지 A24 중 어느 하나에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체 또는 A25에 기재된 이뮤노컨주게이트의 사용.
B4. 암의 치료를 위해서, 추가의 치료제, 바람직하게는 면역 체크포인트 저해제와 조합하여 사용하기 위한, A1 내지 A24 중 어느 하나에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체 또는 A25에 기재된 이뮤노컨주게이트.
B5. 면역 체크포인트 저해제가, PD-1계 결합 안타고니스트, 바람직하게는 항PD-1 항체 또는 항PD-L1 항체인, B4에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체 또는 이뮤노컨주게이트.
B6. 면역 체크포인트 저해제가 항PD-L1 항체인, B4에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체 또는 이뮤노컨주게이트.
B7. 면역 체크포인트 저해제가, 항잠재형 TGF-β1 항체 또는 이뮤노컨주게이트와 동시에 투여되는, B4 내지 B6 중 어느 하나에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체 또는 이뮤노컨주게이트.
B8. 면역 체크포인트 저해제가, 항잠재형 TGF-β1 항체 또는 이뮤노컨주게이트의 투여 전 또는 투여 후에 투여되는, B4 내지 B6 중 어느 하나에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체 또는 이뮤노컨주게이트.
C1. A1 내지 A24 중 어느 하나에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체 또는 A25에 기재된 이뮤노컨주게이트와, 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약학적 제제.
C2. 추가의 치료제, 바람직하게는 면역 체크포인트 저해제를 추가로 포함하는, C1에 기재된 약학적 제제.
C3. 면역 체크포인트 저해제가, PD-1계 결합 안타고니스트, 바람직하게는 항PD-1 항체 또는 항PD-L1 항체인, C2에 기재된 약학적 제제.
C4. 면역 체크포인트 저해제가 항PD-L1 항체인, C2에 기재된 약학적 제제.
C5. 섬유증 또는 암의 치료에 있어서 사용하기 위한, C1 내지 C4 중 어느 하나에 기재된 약학적 제제.
C6. 암의 치료를 위해서, 추가의 치료제, 바람직하게는 면역 체크포인트 저해제와 조합하여 사용하기 위한, C1 내지 C4 중 어느 하나에 기재된 약학적 제제.
C7. 면역 체크포인트 저해제가, PD-1계 결합 안타고니스트, 바람직하게는 항PD-1 항체 또는 항PD-L1 항체인, C6에 기재된 약학적 제제.
C8. 면역 체크포인트 저해제가 항PD-L1 항체인, C6에 기재된 약학적 제제.
C9. 면역 체크포인트 저해제가, 약학적 제제와 동시에 투여되는, C6 내지 C8 중 어느 하나에 기재된 약학적 제제.
C10. 면역 체크포인트 저해제가, 약학적 제제의 투여 전 또는 투여 후에 투여되는, C6 내지 C8 중 어느 하나에 기재된 약학적 제제.
D1. 면역 체크포인트 저해제와 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 제제로서, 암의 치료를 위해서, 청구항 A1 내지 A24 중 어느 하나에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체 또는 청구항 A25에 기재된 이뮤노컨주게이트와 조합하여 사용하기 위한, 약학적 제제.
D2. 면역 체크포인트 저해제가, PD-1계 결합 안타고니스트, 바람직하게는 항PD-1 항체 또는 항PD-L1 항체인, D1에 기재된 약학적 제제.
D3. 면역 체크포인트 저해제가 항PD-L1 항체인, D1에 기재된 약학적 제제.
D4. 항잠재형 TGF-β1 항체 또는 이뮤노컨주게이트가, 약학적 제제와 동시에 투여되는, D1 내지 D3 중 어느 하나에 기재된 약학적 제제.
D5. 항잠재형 TGF-β1 항체 또는 이뮤노컨주게이트가, 약학적 제제의 투여 전 또는 투여 후에 투여되는, D1 내지 D3 중 어느 하나에 기재된 약학적 제제.
E1. 섬유증 또는 암을 갖는 개체를 치료하는 방법으로서, A1 내지 A24 중 어느 하나에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체 또는 A25에 기재된 이뮤노컨주게이트의 유효량을 해당 개체에게 투여하는 공정을 포함하는, 방법.
E2. 추가의 치료제, 바람직하게는 면역 체크포인트 저해제를 개체에게 투여하는 공정을 추가로 포함하는, E1에 기재된 방법.
E3. 면역 체크포인트 저해제가, PD-1계 결합 안타고니스트, 바람직하게는 항PD-1 항체 또는 항PD-L1 항체인, E1 또는 E2에 기재된 방법.
E4. 면역 체크포인트 저해제가 항PD-L1 항체인, E3에 기재된 방법.
E5. 면역 체크포인트 저해제가, 항잠재형 TGF-β1 항체 또는 이뮤노컨주게이트와 동시에 투여되는, E1 내지 E4 중 어느 하나에 기재된 방법.
E6. 면역 체크포인트 저해제가, 항잠재형 TGF-β1 항체 또는 이뮤노컨주게이트의 투여 전 또는 투여 후에 투여되는, E1 내지 E4 중 어느 하나에 기재된 방법.
[도 1a] 도 1a는, BaF3 세포 상의 세포 표면의 잠재형 TGF-β1로의 항체 결합의 결과를 나타낸다. IC17-hIgG1은, 음성 대조로서의 항KLH 항체를 나타낸다. hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191, 및 hT0947AE09-SG191은, 항잠재형 TGF-β1 항체를 나타낸다.
[도 1b] 도 1b는, FreeStyle(상표) 293-F 세포 상의 세포 표면의 잠재형 TGF-β1로의 항체 결합의 결과를 나타낸다. IC17-hIgG1은, 음성 대조로서의 항KLH 항체를 나타낸다. hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191, 및 hT0947AE09-SG191은, 항잠재형 TGF-β1 항체를 나타낸다.
[도 2a] 도 2a는, 마우스 성숙 TGF-β1로의 항체 결합의 결과를 나타낸다. GC1008-F1332m은, 양성 대조로서의 항성숙 TGF-β 항체를 나타낸다. IC17-hIgG1은, 음성 대조로서의 항KLH 항체를 나타낸다. hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191, 및 hT0947AE09-SG191은, 항잠재형 TGF-β1 항체를 나타낸다.
[도 2b] 도 2b는, 인간 성숙 TGF-β1로의 항체 결합의 결과를 나타낸다. GC1008-F1332m은, 양성 대조로서의 항성숙 TGF-β 항체를 나타낸다. IC17-hIgG1은, 음성 대조로서의 항KLH 항체를 나타낸다. hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191, 및 hT0947AE09-SG191은, 항잠재형 TGF-β1 항체를 나타낸다.
[도 2c] 도 2c는, 마우스 LAP로의 항체 결합의 결과를 나타낸다. GC1008-F1332m은, 항성숙 TGF-β 항체를 나타낸다. IC17-hIgG1은, 음성 대조로서의 항KLH 항체를 나타낸다. hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191, 및 hT0947AE09-SG191은, 항잠재형 TGF-β1 항체를 나타낸다.
[도 3a] 도 3a는, 자연발생적 마우스 잠재형 TGF-β1 활성화에 대한 항체 활성의 결과를 나타낸다. mSLC는, 재조합 마우스 잠재형 TGF-β1을 나타낸다. IC17-hIgG1은, 음성 대조로서의 항KLH 항체를 나타낸다. hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191, 및 hT0947AE09-SG191은, 항잠재형 TGF-β1 항체를 나타낸다.
[도 3b] 도 3b는, 자연발생적 인간 잠재형 TGF-β1 활성화에 대한 항체 활성의 결과를 나타낸다. hSLC는, 재조합 인간 잠재형 TGF-β1을 나타낸다. IC17-hIgG1은, 음성 대조로서의 항KLH 항체를 나타낸다. hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191, 및 hT0947AE09-SG191은, 항잠재형 TGF-β1 항체를 나타낸다.
[도 4a] 도 4a는, 플라스민(PLN) 매개 마우스 잠재형 TGF-β1 활성화에 대한 항체 활성의 결과를 나타낸다. mSLC는, 재조합 마우스 잠재형 TGF-β1을 나타낸다. IC17-hIgG1은, 음성 대조로서의 항KLH 항체를 나타낸다. hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191, 및 hT0947AE09-SG191은, 항잠재형 TGF-β1 항체를 나타낸다.
[도 4b] 도 4b는, 플라스민(PLN) 매개 인간 잠재형 TGF-β1 활성화에 대한 항체 활성의 결과를 나타낸다. hSLC는, 재조합 인간 잠재형 TGF-β1을 나타낸다. IC17-hIgG1은, 음성 대조로서의 항KLH 항체를 나타낸다. hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191, 및 hT0947AE09-SG191은, 항잠재형 TGF-β1 항체를 나타낸다.
[도 5a] 도 5a는, 칼리크레인(PLK) 매개 마우스 잠재형 TGF-β1 활성화에 대한 항체 활성의 결과를 나타낸다. mSLC는, 재조합 마우스 잠재형 TGF-β1을 나타낸다. IC17-hIgG1은, 음성 대조로서의 항KLH 항체를 나타낸다. hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191, 및 hT0947AE09-SG191은, 항잠재형 TGF-β1 항체를 나타낸다.
[도 5b] 도 5b는, 칼리크레인(PLK) 매개 인간 잠재형 TGF-β1 활성화에 대한 항체 활성의 결과를 나타낸다. hSLC는, 재조합 인간 잠재형 TGF-β1을 나타낸다. IC17-hIgG1은, 음성 대조로서의 항KLH 항체를 나타낸다. hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191, 및 hT0947AE09-SG191은, 항잠재형 TGF-β1 항체를 나타낸다.
[도 6a] 도 6a는, 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP) 2 매개 인간 잠재형 TGF-β1 활성화에 대한 항체 활성의 결과를 나타낸다. hSLC는, 재조합 인간 잠재형 TGF-β1을 나타낸다. IC17-hIgG1은, 음성 대조로서의 항KLH 항체를 나타낸다. hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191, 및 hT0947AE09-SG191은, 항잠재형 TGF-β1 항체를 나타낸다.
[도 6b] 도 6b는, 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP) 9 매개 인간 잠재형 TGF-β1 활성화에 대한 항체 활성의 결과를 나타낸다. hSLC는, 재조합 인간 잠재형 TGF-β1을 나타낸다. IC17-hIgG1은, 음성 대조로서의 항KLH 항체를 나타낸다. hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191, 및 hT0947AE09-SG191은, 항잠재형 TGF-β1 항체를 나타낸다.
[도 7a] 도 7a는, 플라스민(PLN) 매개 마우스 잠재형 TGF-β1 절단에 대한 항체 활성의 결과를 나타낸다. Cam은, 대조로서 사용한 프로테아제 저해제인 캐모스타트를 나타낸다. AE04(hT0947AE04-SG191), AE07(hT0947AE07-SG191), AE08(hT0947AE08-SG191), 및 AE09(hT0947AE09-SG191)는, 항잠재형 TGF-β1 항체를 나타낸다.
[도 7b] 도 7b는, 플라스민(PLN) 매개 인간 잠재형 TGF-β1 절단에 대한 항체 활성의 결과를 나타낸다. Cam은, 대조로서 사용한 프로테아제 저해제인 캐모스타트를 나타낸다. AE04(hT0947AE04-SG191), AE07(hT0947AE07-SG191), AE08(hT0947AE08-SG191), 및 AE09(hT0947AE09-SG191)는, 항잠재형 TGF-β1 항체를 나타낸다.
[도 8] 도 8은, 마우스 PBMC에 있어서의 인테그린 매개 마우스 TGF-β1 활성화에 대한 항체 활성의 결과를 나타낸다. IC17-hIgG1은, 음성 대조로서의 항KLH 항체를 나타낸다. GC1008-F1332m은, 양성 대조로서의 항성숙 TGF-β 항체를 나타낸다. RGE는 RGE 펩티드를 나타낸다. RGD는, 양성 대조로서의 RGD 펩티드를 나타낸다. hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191, 및 hT0947AE09-SG191은, 항잠재형 TGF-β1 항체를 나타낸다.
[도 9] 도 9는, 아이소타입 컨트롤 처치 그룹(●), 항PD-L1 처치 그룹(■), hT0947AE04-mF18 처치 그룹(▲), 및 hT0947AE04-mF18 + 항PD-L1 처치 그룹(×)의, 종양 증식 곡선을 나타낸다. 각 점은, 각 그룹의 평균 종양 체적을 나타낸다. (N=10)
[도 10] 도 10은, 아이소타입 컨트롤 처치 그룹(●), 항PD-L1 처치 그룹(■), hT0947AE04-mF18 처치 그룹(▲), 및 hT0947AE04-mF18 + 항PD-L1 처치 그룹(×)의, 종양 증식 곡선을 나타낸다. 각 점은, 각 그룹의 평균 종양 체적을 나타낸다. (N=10)
[도 11] 도 11은, 용매 처치 그룹(●), 항PD-L1 처치 그룹(■), hT0947AE04-mF18 + 항PD-L1 처치 그룹(×), hT0947AE07-SG181 + 항PD-L1 처치 그룹(▲), 및 hT0947AE08-SG181 + 항PD-L1 처치 그룹(○)의 종양 증식 곡선을 나타낸다. 각 점은, 각 그룹의 평균 종양 체적을 나타낸다. (N=10)
[도 12] 도 12는, 신장 중의 하이드록시프롤린 함량의 결과를 나타낸다. 모노클로날 항체를, 편측 요관 폐색(Unilateral Ureteral Obstruction, UUO) 유도 마우스 신장 섬유증 모델에 있어서 평가했다. 의사(疑似) 수술 그룹은, 비질환 유도 대조를 나타낸다. IC17dk-SG181은, 음성 대조로서의 항KLH 항체를 나타낸다. hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, 및 hT0947AE08-SG191은, 항잠재형 TGF-β1 항체를 나타낸다.
[도 13] 도 13은, 용매 처치 그룹(●), 항마우스 PD-L1 항체 처치 그룹(■), hT0947AE07-SG191(10mg/kg) + 항마우스 PD-L1 항체 처치 그룹(▲), 및 hT0947AE07-SG191(30mg/kg) + 항마우스 PD-L1 항체 처치 그룹(○)의 종양 증식 곡선을 나타낸다. 각 점은, 대응하는 그룹의 평균 종양 체적을 나타낸다. (각 그룹에 있어서 N=10)
I. 정의
본 명세서의 취지에서의 "억셉터 인간 프레임워크"는, 아래에서 정의하는 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크에서 유래하는, 경쇄 가변 도메인(VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는, 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크에서 "유래하는" 억셉터 인간 프레임워크는, 그들의 동일한 아미노산 서열을 포함해도 되고, 또는 아미노산 서열의 변경을 포함하고 있어도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 아미노산의 변경의 수는, 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 또는 2 이하이다. 몇몇 태양에 있어서, VL 억셉터 인간 프레임워크는, VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 서열이 동일하다.
용어 "결합 활성"은, 분자(예를 들어, 항체)의 1개 또는 복수의 결합 부위와, 그의 결합 파트너(예를 들어, 항원) 사이의, 비공유결합적인 상호작용의 합계의 강도를 말한다. 본 명세서에 있어서, "결합 활성"은, 어떤 결합쌍의 멤버(예를 들어, 항체와 항원) 사이의 1:1 상호작용에 엄밀하게 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 어떤 결합쌍의 멤버가 1가의 1:1 상호작용을 반영하는 경우, 당해 결합 활성을 특히 고유의 결합 어피니티(어피니티)라고 부른다. 결합쌍의 한쪽의 멤버가, 1가의 결합과 다가의 결합의 양쪽이 가능한 경우는, 당해 결합 활성은 각각의 결합 강도의 합이 된다. 분자 X의 그 파트너 Y에 대한 결합 활성은, 일반적으로, 해리 상수(KD) 또는 "리간드의 단위량당의 애널라이트의 결합량"(이하, "결합량"이라고 칭하는 경우가 있다)에 의해 나타낼 수 있다. 당업자이면, 일반적으로, 해리 상수의 값이 낮을수록 높은 결합 활성을 의미하고, "리간드의 단위량당의 애널라이트의 결합량" 또는 "결합량"의 값이 높을수록 높은 결합 활성을 의미함을 이해한다. 결합 활성은, 본 명세서에 기재된 것을 포함하는, 당해 기술 분야에 있어서 알려진 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 활성을 측정하기 위한 구체적인 실례 및 예시적인 태양에 대해서는, 이하에 기술한다.
"결합 활성 성숙", "어피니티 성숙" 항원 결합 분자 또는 항체, "결합 활성 증대(증강)" 혹은 "어피니티 증대(증강)" 항원 결합 분자 또는 항체란, 1개 또는 복수의 초가변 영역(hypervariable region: HVR) 중에, 1개 또는 복수의 개변(예를 들어 치환)을 갖는 항체이며, 그와 같은 개변을 갖지 않는 친항원 결합 분자 또는 친항체와 비교하여, 그와 같은 개변이 당해 항원 결합 분자 또는 항체의 항원에 대한 결합 활성의 향상을 가져오는, 항체를 말한다.
용어 "항잠재형 TGF-β1 항체" 또는 "잠재형 TGF-β1에 결합할 수 있는 항체"는, 충분한 결합 활성으로 잠재형 TGF-β1에 결합할 수 있는 항체이며, 그 결과 그 항체가 잠재형 TGF-β1을 표적화했을 때에 진단제 및/또는 치료제로서 유용한 항체를 말한다. 일 태양에 있어서, "잠재형 TGF-β1에 결합할 수 있는 항체"는, 잠재형 TGF-β1에 특이적으로 결합하는 항체이다. 일 태양에 있어서, 무관계한 비잠재형 TGF-β1 단백질로의 항잠재형 TGF-β1 항체의 결합 활성의 정도는, (예를 들어, 방사면역측정법(radioimmunoassay: RIA)에 의해) 측정했을 때, 항체의 잠재형 TGF-β1로의 결합 활성의 약 10% 미만이다. 특정의 태양에 있어서, TGF-β1에 결합할 수 있는 항체는, ≤1μM, ≤100nM, ≤10nM, ≤1nM, ≤0.1nM, ≤0.01nM, 또는 ≤0.001nM(예를 들어, 10-8M 이하, 예를 들어 10-8M 내지 10-13M, 예를 들어, 10-9M 내지 10-13M)의 해리 상수(KD)를 갖는다. 특정의 태양에 있어서, 항잠재형 TGF-β1 항체는, 상이한 종으로부터의 잠재형 TGF-β1 사이에서 보존되어 있는 잠재형 TGF-β1의 에피토프에 결합한다.
본 명세서에서 용어 "항체"는, 가장 넓은 의미로 사용되고, 원하는 항원 결합 활성을 나타내는 한은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중 특이성 항체(예를 들어, 이중 특이성 항체) 및 항체 단편을 포함하는, 여러 가지 항체 구조를 포함한다. 용어 "항체"는 또한, 면역글로불린의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 구조를 포함하는 임의의 항원 결합 분자를 포함한다.
"항체 단편"은, 완전 항체가 결합하는 항원에 결합하는 당해 완전 항체의 일부분을 포함하는, 당해 완전 항체 이외의 분자를 말한다. 항체 단편의 예는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아보디; 선상 항체; 단쇄 항체 분자(예를 들어, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이성 항체를 포함한다.
참조 항체와 "동일 에피토프에 결합하는 항체"는, 경합 어세이에 있어서 그 참조 항체가 자신의 항원에 하는 결합을 50% 이상 저지하는 항체를 말하고, 또한 반대로 말하면, 참조 항체는, 경합 어세이에 있어서 전술한 항체가 자신의 항원에 하는 결합을 50% 이상 저지한다. 예시적인 경합 어세이가, 본 명세서에서 제공된다.
용어 "암" 및 "암성"은, 무질서한 세포 성장/증식에 의해 전형적으로 특징지어지는 포유동물에 있어서의 생리학적 상태를 말하거나, 또는 기술한다. 암의 예로서는, 암종, 림프종(예를 들어, 호지킨림프종 및 비호지킨림프종), 아세포종, 육종, 및 백혈병을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 그와 같은 암의 보다 특정한 예로서는, 편평상피암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐선암, 폐편평상피암, 복막암, 간세포암, 위장암, 췌장암, 신경교종, 자궁경암, 난소암, 간장암, 방광암, 헤파토마, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁 내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 간장암, 전립선암, 외음암, 갑상선암, 간암, 백혈병 및 다른 림프 증식성 장애, 및 다양한 타입의 두경부암을 들 수 있다. 일례에 있어서, 암은 면역 체크포인트 저해제에 대해서 저항성이며, 및/또는 면역 체크포인트 저해제에 대해서 한정된 응답을 나타낸다.
용어 "키메라" 항체는, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정의 공급원 또는 종에서 유래하는 한편으로, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지의 부분이 상이한 공급원 또는 종에서 유래하는 항체를 말한다.
항체의 "클래스"는, 항체의 중쇄에 구비되는 정상 도메인 또는 정상 영역의 타입을 말한다. 항체에는 5개의 주요한 클래스가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이다. 그리고, 이들 중 몇몇은 추가로 서브클래스(아이소타입)로 나눠져도 된다. 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2이다. 다른 클래스의 면역글로불린에 대응하는 중쇄 정상 도메인을, 각각, α, δ, ε, γ, 및 μ라고 부른다.
본 명세서에서 말하는 용어 "세포상해제"는, 세포의 기능을 저해하거나 또는 방해하는, 및/또는 세포의 죽음 또는 파괴의 원인이 되는 물질을 말한다. 세포상해제는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 방사성 동위체(예를 들어, 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 212Pb 및 Lu의 방사성 동위체); 화학요법제 또는 화학요법약(예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드류(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포사이드), 독소루비신, 멜팔란, 마이토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신, 또는 다른 인터캘레이트제); 증식 저해제; 핵산 분해 효소 등의 효소 및 그의 단편; 항생물질; 예를 들어, 저분자 독소 또는 세균, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소(그의 단편 및/또는 변이체를 포함한다) 등의 독소; 및 이하에 개시되는, 여러 가지 항종양제 또는 항암제를 포함한다.
"이펙터 기능"은, 항체의 Fc 영역에 기인하는, 항체의 아이소타입에 따라서 상이한 생물학적 활성을 말한다. 항체의 이펙터 기능의 예에는 다음의 것이 포함된다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포상해(complement dependent cytotoxicity: CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포 개재성 세포상해(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC); 탐식 작용; 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체)의 하부 제어; 및 B 세포 활성화.
어떤 제(예를 들어, 약학적 제제)의 "유효량"은, 원하는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하기 위해서 유효한, 필요한 용량에 있어서의 및 필요한 기간에 걸쳐서의, 양을 말한다.
본 명세서에서 용어 "Fc 영역"은, 적어도 정상 영역의 일부분을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C말단 영역을 정의하기 위해서 이용된다. 이 용어는, 천연형 서열의 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일 태양에 있어서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226으로부터, 또는 Pro230으로부터, 중쇄의 카복실 말단까지 신장된다. 단, Fc 영역의 C말단의 리신(Lys447) 또는 글리신-리신(Gly446-Lys447)은, 존재하고 있어도 존재하고 있지 않아도 된다. 본 명세서에서는 특별히 특정하지 않는 한, Fc 영역 또는 정상 영역 중의 아미노산 잔기의 번호 붙이기는, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991에 기재된, EU 넘버링 시스템(EU 인덱스라고도 불린다)에 따른다.
"프레임워크" 또는 "FR"은, 초가변 영역 (HVR) 잔기 이외의, 가변 도메인 잔기를 말한다. 가변 도메인의 FR은, 통상 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3, 및 FR4로 이루어진다. 그에 따라서, HVR 및 FR의 서열은, 통상 다음의 순서로 VH(또는 VL)에 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체", "완전 항체", 및 "전부 항체"는, 본 명세서에서는 서로 교환 가능하게 이용되고, 천연형 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나, 또는 본 명세서에서 정의하는 Fc 영역을 포함하는 중쇄를 갖는 항체를 말한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주", 및 "숙주 세포 배양물"은, 서로 교환 가능하게 이용되고, 외래 핵산이 도입된 세포(그와 같은 세포의 자손을 포함한다)를 말한다. 숙주 세포는 "형질 전환체" 및 "형질 전환 세포"를 포함하고, 이것에는 초대의 형질 전환 세포 및 계대수에 상관 없이 그 세포에서 유래하는 자손을 포함한다. 자손은, 친세포와 핵산의 내용에 있어서 완전히 동일하지 않아도 되고, 변이를 포함하고 있어도 된다. 오리지널의 형질 전환 세포가 스크리닝되었거나 또는 선택되었을 때에 이용된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이체 자손도, 본 명세서에서는 포함된다.
"인간 항체"는, 인간 혹은 인간 세포에 의해 산생된 항체 또는 인간 항체 레퍼터리 혹은 다른 인간 항체 코드 서열을 이용하는 비인간 공급원에서 유래하는 항체의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 구비하는 항체이다. 이 인간 항체의 정의는, 비인간의 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를, 명확히 제외하는 것이다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택군에 있어서 가장 공통되게 생기는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 통상, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은, 가변 도메인 서열의 서브그룹으로부터이다. 통상, 서열의 서브그룹은, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3에 있어서의 서브그룹이다. 일 태양에 있어서, VL에 대해, 서브그룹은 상기의 Kabat 등에 의한 서브그룹 κI이다. 일 태양에 있어서, VH에 대해, 서브그룹은 상기의 Kabat 등에 의한 서브그룹 III이다.
"인간화" 항체는, 비인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는, 키메라 항체를 말한다. 어떤 태양에서는, 인간화 항체는, 적어도 1개, 전형적으로는 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전체를 포함하고, 당해 가변 영역에 있어서는, 모든 혹은 실질적으로 모든 HVR(예를 들어 CDR)은 비인간 항체의 것에 대응하고, 또한, 모든 혹은 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 것에 대응한다. 인간화 항체는, 임의로, 인간 항체에서 유래하는 항체 정상 영역의 적어도 일부분을 포함해도 된다. 항체(예를 들어, 비인간 항체)의 "인간화된 형태"는, 인간화를 거친 항체를 말한다.
본 명세서에서 이용되는 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은, 서열에 있어서 초가변이고("상보성 결정 영역" 또는 "CDR"(complementarity determining region)), 및/또는 구조적으로 정해진 루프("초가변 루프")를 형성하고, 및/또는 항원 접촉 잔기("항원 접촉")를 포함하는, 항체의 가변 도메인의 각 영역을 말한다. 통상, 항체는 6개의 HVR을 포함한다: VH에 3개(H1, H2, H3), 및 VL에 3개(L1, L2, L3)이다. 본 명세서에서의 예시적인 HVR은, 이하의 것을 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2), 및 96-101(H3)의 장소에 생기는 초가변 루프(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) 아미노산 잔기 24-34(L1), 50-56(L2), 89-97(L3), 31-35b(H1), 50-65(H2), 및 95-102(H3)의 장소에 생기는 CDR(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) 아미노산 잔기 27c-36(L1), 46-55(L2), 89-96(L3), 30-35b(H1), 47-58(H2), 및 93-101(H3)의 장소에 생기는 항원 접촉(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); 및
(d) HVR 아미노산 잔기 46-56(L2), 47-56(L2), 48-56(L2), 49-56(L2), 26-35(H1), 26-35b(H1), 49-65(H2), 93-102(H3), 및 94-102(H3)를 포함하는, (a), (b), 및/또는 (c)의 조합.
특별히 나타내지 않는 한 HVR 잔기 및 가변 도메인 중의 다른 잔기(예를 들어, FR 잔기)는, 본 명세서에서는 상기의 Kabat 등에 따라 번호 붙여진다.
"이뮤노컨주게이트"는, 1개 또는 복수의 이종의 분자에 컨주게이트된 항체이다(이종의 분자는, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 세포상해제를 포함한다).
"개체" 또는 "피험체"는 포유동물이다. 포유동물은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 사육 동물(예를 들어, 소, 양, 고양이, 개, 말), 영장류(예를 들어, 인간, 및 원숭이 등의 비인간 영장류), 토끼, 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함한다. 특정의 태양에서는, 개체 또는 피험체는 인간이다.
"단리된" 항체는, 그 원래의 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 몇몇 태양에 있어서, 항체는, 예를 들어, 전기영동(예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 분리법(isoelectric focusing: IEF), 캐필러리 전기영동) 또는 크로마토그래프(예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)로 측정하여, 95% 또는 99%를 초과하는 순도까지 정제된다. 항체의 순도의 평가를 위한 방법의 총설로서, 예를 들어, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)을 참조.
"단리된" 핵산은, 그 원래의 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 말한다. 단리된 핵산은, 그 핵산 분자를 통상 포함하는 세포 중에 포함된 핵산 분자를 포함하지만, 그 핵산 분자는 염색체 외에 존재하고 있거나 또는 본래의 염색체 상의 위치와는 상이한 염색체 상의 위치에 존재하고 있다.
"항잠재형 TGF-β1 항체를 코딩하는 단리된 핵산" 또는 "항잠재형 TGF-β1 항체를 코딩하는 핵산"은, 항체의 중쇄 및 경쇄(또는 그의 단편)를 코딩하는 1개 또는 복수의 핵산 분자를 말하고, 1개의 벡터 또는 별개의 벡터들에 타고 있는 핵산 분자, 및 숙주 세포 중의 1개 또는 복수의 위치에 존재하고 있는 핵산 분자를 포함한다.
본 명세서에서 말하는 용어 "모노클로날 항체"는, 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 얻어지는 항체를 말한다. 즉, 그 집단을 구성하는 개개의 항체는, 생길 수 있는 변이 항체(예를 들어, 자연스럽게 생기는 변이를 포함하는 변이 항체, 또는 모노클로날 항체 조제물의 제조 중에 발생하는 변이 항체. 그와 같은 변이체는 통상 약간량 존재하고 있다.)를 제외하고, 동일하고 및/또는 동일 에피토프에 결합한다. 상이한 결정기(에피토프)에 대한 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 조제물과는 대조적으로, 모노클로날 항체 조제물의 각 모노클로날 항체는, 항원 상의 단일한 결정기에 대한 것이다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은, 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 얻어지는 것이라고 하는 항체의 특징을 나타내고, 어떠한 특정의 방법에 의한 항체의 제조를 요구하는 것이라고 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 이용되는 모노클로날 항체는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 하이브리도마법, 재조합 DNA법, 파지 디스플레이법, 인간 면역글로불린 유전자자리의 전부 또는 일부를 포함하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 포함하는, 다양한 수법에 의해 작성되어도 되고, 모노클로날 항체를 제작하기 위한 그와 같은 방법 및 다른 예시적인 방법은, 본 명세서에 기재되어 있다.
"나(裸)항체"는, 이종의 부분(예를 들어, 세포상해 부분) 또는 방사성표지에 컨주게이트되어 있지 않은 항체를 말한다. 나항체는, 약학적 제제 중에 존재하고 있어도 된다.
"천연형 항체"는, 천연으로 생기는 다양한 구조를 수반하는 면역글로불린 분자를 말한다. 예를 들어, 천연형 IgG 항체는, 다이설파이드 결합하고 있는 2개의 동일한 경쇄와 2개의 동일한 중쇄로 구성되는 약 150,000돌턴의 헤테로사량체 당단백질이다. N말단으로부터 C말단을 향해, 각 중쇄는, 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역(VH)을 갖고, 추가로 3개의 정상 도메인(CH1, CH2 및 CH3)이 계속된다. 마찬가지로, N말단으로부터 C말단을 향해, 각 경쇄는, 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역(VL)을 갖고, 추가로 정상 경쇄(CL) 도메인이 계속된다. 항체의 경쇄는, 그 정상 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는, 2개의 타입 중 하나에 귀속되어도 된다.
용어 "첨부 문서"는, 치료 용품의 상용 패키지에 통상 포함되고, 그와 같은 치료 용품의 사용에 관한, 적응증, 용법, 용량, 투여 방법, 병용 요법, 금기, 및/또는 경고에 대한 정보를 포함하는 사용 설명서를 말하기 위해서 이용된다.
참조 폴리펩티드 서열에 대한 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은, 최대의 퍼센트 서열 동일성을 얻도록 서열을 정렬시키고 또한 필요하면 갭을 도입한 후의, 또한, 어떠한 보존적 치환도 서열 동일성의 일부라고 생각하지 않는다고 했을 때의, 참조 폴리펩티드 서열 중의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 중의 아미노산 잔기의, 백분율비로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하는 목적의 얼라인먼트는, 당해 기술 분야에 있어서의 기술의 범위 내에 있는 여러 가지 방법, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN, Megalign(DNASTAR) 소프트웨어, 또는 GENETYX(등록상표)(주식회사 제네틱스) 등의, 공개적으로 입수 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하는 것에 의해 달성할 수 있다. 당업자는, 비교되는 서열의 전장에 걸쳐서 최대의 얼라인먼트를 달성하기 위해서 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 서열의 얼라인먼트를 취하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은, 제넨테크사의 저작이며, 그 소스 코드는 미국 저작권청(U.S. Copyright Office, Wasington D.C., 20559)에 사용자용 서류와 함께 제출되어 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로서 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은, 제넨테크사(Genentech, Inc., South San Francisco, California)로부터 공개적으로 입수 가능하고, 소스 코드로부터 컴파일해도 된다. ALIGN-2 프로그램은, Digital UNIX V4.0D를 포함하는 UNIX operating system 상에서의 사용을 위해서 컴파일된다. 모든 서열 비교 파라미터는, ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고 변동하지 않는다. 아미노산 서열 비교에 ALIGN-2가 이용되는 상황에서는, 주어진 아미노산 서열 A의, 주어진 아미노산 서열 B로의, 또는 그것과의, 또는 그에 대한 %아미노산 서열 동일성(혹은, 주어진 아미노산 서열 B로의, 또는 그것과의, 또는 그에 대한, 어떤 %아미노산 서열 동일성을 갖거나 또는 포함하는 주어진 아미노산 서열 A라고 할 수도 있다)은, 다음과 같이 계산된다:
분율 X/Y의 100배.
여기에서, X는 서열 얼라인먼트 프로그램 ALIGN-2에 의해, 당해 프로그램의 A 및 B의 얼라인먼트에 있어서 동일한 일치로서 스코어링된 아미노산 잔기의 수이며, Y는 B 중의 아미노산 잔기의 전체 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, A의 B로의 %아미노산 서열 동일성은, B의 A로의 %아미노산 서열 동일성과 동일하지 않은 것이, 이해될 것이다. 특별히 달리 명시하지 않는 한, 본 명세서에서 이용되는 모든 %아미노산 서열 동일성 값은, 직전의 단락에서 기술한 바와 같이 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 얻어지는 것이다.
용어 "약학적 제제"는, 그 중에 포함된 유효 성분의 생물학적 활성이 효과를 발휘할 수 있는 형태에 있는 조제물이며, 또한 제제가 투여되는 피험체에 허용할 수 없을 정도로 독성이 있는 추가의 요소를 포함하지 않은, 조제물을 말한다.
"약학적으로 허용되는 담체"는, 피험체에 대해서 무독인, 약학적 제제 중의 유효 성분 이외의 성분을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 완충액, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 포함한다.
"TGF-β1"이라는 용어는, 본 명세서에서 사용되는 경우, 그 이외의 것이 나타나지 않은 한, 포유동물, 예를 들어 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)를 포함하는 임의의 척추동물원 유래의 임의의 천연 TGF-β1을 나타낸다. 이 용어는, "전장"의 프로세싱을 받고 있지 않은 TGF-β1 및 세포 내에서의 프로세싱에 의해 생기는 임의의 형태의 TGF-β1을 포함한다. 이 용어는 또한, TGF-β1의 천연에 존재하는 배리언트, 예를 들어 스플라이스 배리언트 또는 대립 유전자 배리언트도 포함한다. 예시적인 인간 TGF-β1 프리프로단백질의 아미노산 서열은, 서열 번호: 68(NCBI RefSeq: NP_000651.3)에 나타나고, 예시적인 인간 TGF-β1을 코딩하는 핵산 서열은, 서열 번호: 69(NCBI RefSeq: NM_000660.6)에 나타난다. 예시적인 마우스 TGF-β1 프리프로단백질의 아미노산 서열은, 서열 번호: 70(NCBI RefSeq: NP_035707.1)에 나타나고, 예시적인 마우스 TGF-β1을 코딩하는 핵산 서열은, 서열 번호: 71(NCBI RefSeq: NM_011577.2)에 나타난다. 예시적인 필리핀원숭이 TGF-β1 프리프로단백질의 아미노산 서열은, 서열 번호: 72(NCBI RefSeq: XP_005589396.1)에 나타나고, 예시적인 필리핀원숭이 TGF-β1을 코딩하는 핵산 서열은, 서열 번호: 73(NCBI RefSeq: XM_005589339.2)에 나타난다. "TGF-β1"이라는 용어는, 잠재형 TGF-β1 및 성숙 TGF-β1의 양쪽을 포함한다.
"잠재형 TGF-β1"이라는 용어는, 본 명세서에서 사용되는 경우, 잠재형 TGF-β1 복합체("세포 표면 잠재형 TGF-β1", LLC 혹은 SLC(이하 참조))를 형성하는 및/또는 그 수용체에 결합할 수 없는 임의의 TGF-β1을 나타낸다. 형질 전환 성장 인자 β1(TGF-β1)은 TGF-β의 멤버이며, 이것은 TGF-β 슈퍼패밀리의 멤버이다. TGF-β 슈퍼패밀리의 다른 멤버와 마찬가지로, TGF-β는, 그 잠재 관련 펩티드(latency associated peptide; LAP) 및 잠재형 TGF-β결합 단백질(LTBP)과 상호작용하여 잠재형 대복합체(LLC)로 불리는 보다 큰 복합체를 형성하는 호모이량체를 형성하는 전구체 단백질로서 합성된다. 예시적인 잠재형 인간 TGF-β1(TGF-β 호모이량체 및 그의 LAP)의 아미노산 서열은, 서열 번호: 68의 아미노산 30 내지 390이다. 예시적인 마우스 잠재형 TGF-β1(TGF-β 호모이량체 및 그의 LAP)의 아미노산 서열은, 서열 번호: 70의 아미노산 30 내지 390이다. 예시적인 잠재형 필리핀원숭이 TGF-β1(TGF-β 호모이량체 및 그의 LAP)의 아미노산 서열은, 서열 번호: 72의 아미노산 30 내지 390이다.
TGF-β 호모이량체 및 그의 LAP로부터 형성되는 복합체는, 잠재형 소복합체(SLC)로 불린다. 이 잠재형 복합체는, TGF-β를, 그 수용체에 결합할 수 없는 불활성인 형태로 유지한다. SLC는, 추가적인 단백질인 잠재형 TGF-β 결합 단백질(LTBP)에 공유결합에 의해 연결되어, 잠재형 대복합체(LLC)를 형성할 수 있다. LTBP-1, LTBP-2, LTBP-3, 및 LTBP-4의 4개의 상이한 LTBP 아이소폼이 알려져 있다. LTBP-1, LTBP-3, 및 LTBP-4는, SLC에 결합함이 보고되어 있다(예를 들어, Rifkin et al., J Biol Chem. 2005 Mar 4;280(9):7409-12를 참조). SLC는 또한, 다른 추가적인 단백질, 예를 들어 반복 우위 당단백질 A(GARP) 또는 류신 리치 반복 함유 단백질 33(LRRC33)에도 공유결합에 의해 연결될 수 있다. GARP 및 LRRC는, 막관통 도메인을 가져, 세포 표면 상의 LAP에 결합한다(예를 들어, Wang et al., Mol Biol Cell. 2012 Mar;23(6):1129-39를 참조). LLC에 관해서, LLC는, LTBP의 N말단을 통해서 세포외 매트릭스(ECM)에 공유결합에 의해 결합함이 보고되어 있다(예를 들어, Saharinen et al., Cytokine Growth Factor Rev. 1999 Jun;10(2):99-117을 참조). 몇몇 태양에 있어서, 세포 표면 상의 ECM에 결합한 잠재형 TGF-β1은, "세포 표면 잠재형 TGF-β1"이라고 칭해진다.
"활성 TGF-β1", "성숙 TGF-β1", 또는 "활성 성숙 TGF-β1"이라는 용어는, 본 명세서에서 사용되는 경우, 잠재형 TGF-β1 복합체(LLC 또는 SLC)를 형성하지 않고 또한 그 수용체에 결합할 수 있는 임의의 TGF-β1 호모이량체를 나타낸다. TGF-β1 활성화 프로세스는, ECM로부터의 LLC의 방출, 그 후의 활성 TGF-β를 그 수용체에 방출하는 LAP의 추가적인 단백질 분해를 수반한다. 플라스민(PLN), 프레칼리크레인(PLK), 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP) 2, MMP9, MMP13, MMP14, 트롬빈, 트립타제 및 칼파인을 포함하는 광범위한 프로테아제가, 잠재형 TGF-β를 절단하여, 활성 TGF-β를 방출함이 알려져 있다. 본 발명의 문맥에서, 이들 프로테아제는, 집합적으로, "(잠재형) TGF-β 절단 프로테아제" 또는 "(잠재형) TGF-β1 절단 프로테아제"라고 칭해질 수 있다. 프로테아제에 더하여, 트롬보스폰딘 1(TSP-1), 뉴로필린 1(Nrp1), ADAMSTS1 및 F-스폰딘이, 잠재형 TGF-β를 활성화한다. 혹은, 기계적 신장에 의해, 인테그린(바람직하게는 인테그린 αVβ8 및/또는 인테그린 αVβ6)이, LAP 내에 존재하는 RGD 모티프로의 결합에 의해 TGF-β를 활성화하여, 그 잠재형 복합체 형태로부터의 성숙 TGF-β의 방출을 유도할 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 "치료"(및 그 문법상의 파생어, 예를 들어 "치료한다", "치료하는 것" 등)는, 치료되는 개체의 자연 경과를 개변하는 것을 기도한 임상적 개입을 의미하고, 예방을 위해서도, 임상적 병태의 경과 동안에도 실시될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 질환의 발생 또는 재발의 방지, 증상의 경감, 질환에 의한 임의의 직접적 또는 간접적인 병리적 영향의 감약, 전이의 방지, 질환의 진행 속도의 저감, 질환 상태의 회복 또는 완화, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함한다. 몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항체는, 질환의 발증을 늦추거나, 또는 질환의 진행을 늦게 하기 위해서 이용된다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은, 항체를 항원에 결합시키는 것에 관여하는, 항체의 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 말한다. 천연형 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은, 통상, 각 도메인이 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 초가변 영역(HVR)을 포함하는, 유사한 구조를 갖는다. (예를 들어, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 참조.) 1개의 VH 또는 VL 도메인으로, 항원 결합 특이성을 주는 데에 충분할 것이다. 더욱이, 어떤 특정의 항원에 결합하는 항체는, 당해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 각각 VL 또는 VH 도메인의 상보적 라이브러리를 스크리닝하여, 단리되어도 된다. 예를 들어 Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991) 참조.
본 명세서에서 이용되는 용어 "벡터"는, 그것이 연결된 다른 하나의 핵산을 증식시킬 수 있는, 핵산 분자를 말한다. 이 용어는, 자기 복제 핵산 구조로서의 벡터, 및 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈 중에 짜넣어지는 벡터를 포함한다. 어떤 벡터는, 자신이 동작적으로 연결된 핵산의 발현을 가져올 수 있다. 그와 같은 벡터는, 본 명세서에서는 "발현 벡터"라고도 칭해진다.
II. 조성물 및 방법
하나의 국면에 있어서, 본 발명은, 일부, 항잠재형 TGF-β1 항체 및 그의 사용에 기초한다. 특정의 태양에 있어서, TGF-β1에 결합하는 항체가 제공된다. 본 발명의 항체는, 예를 들어, 섬유증, 바람직하게는 심근 섬유증, 폐 섬유증, 간 섬유증, 신장 섬유증, 피부 섬유증, 안 섬유증, 및 골수 섬유증의 진단 또는 치료에 유용하다. 본 발명의 항체는 또한, 예를 들어, 암의 진단 또는 치료에 유용하다. 암의 예로서는, 암종, 림프종(예를 들어, 호지킨림프종 및 비호지킨림프종), 아세포종, 육종, 및 백혈병을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 그와 같은 암의 보다 특정한 예로서는, 편평상피암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐선암, 폐편평상피암, 복막암, 간세포암, 위장암, 췌장암, 신경교종, 자궁경암, 난소암, 간장암, 방광암, 헤파토마, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁 내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 간장암, 전립선암, 외음암, 갑상선암, 간암, 백혈병 및 다른 림프 증식성 장애, 및 다양한 타입의 두경부암을 들 수 있다.
A. 예시적인 항잠재형 TGF-β1 항체
하나의 국면에 있어서, 본 발명은, 잠재형 TGF-β1에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 추가적인 태양에 있어서, 항잠재형 TGF-β1 항체는, 잠재형 TGF-β1의 잠재 관련 단백질(latency associated protein; LAP) 영역에 결합한다. LAP 영역의 예는, 인간 TGF-β1 프리프로단백질(서열 번호: 1)의 아미노산 30 내지 278을 포함한다. LAP는, 상기와 같이, 잠재형 TGF-β1의 일 성분이다. 몇몇 태양에 있어서, 항잠재형 TGF-β1 항체는, 10-8nM 이하, 10-9nM 이하, 또는 10-10nM 이하의 해리 상수(KD)로 잠재형 TGF-β1에 결합한다.
하나의 국면에 있어서, 항잠재형 TGF-β1 항체는, LLC를 형성하는 잠재형 TGF-β1, 및/또는 GARP 혹은 LRRC33과 복합체를 형성하는 잠재형 TGF-β1에 결합한다. 특정의 태양에 있어서, 항잠재형 TGF-β1 항체는, 세포 표면 상의 세포외 매트릭스(ECM)에 결합한 잠재형 TGF-β1인, 세포 표면 잠재형 TGF-β1에 결합한다. 다른 국면에 있어서, 항잠재형 TGF-β1 항체는, 잠재형 TGF-β1에 결합하고, 여기에서 잠재형 TGF-β1의 LAP 영역은 LTBP에 연결되지 않고, 잠재형 소복합체(SLC)를 형성하고 있다. 특정의 태양에 있어서, SLC는, 가용성 형태로 존재한다. 몇몇 태양에 있어서, 항잠재형 TGF-β1 항체는, 10-8nM 이하, 10-9nM 이하, 또는 10-10nM 이하의 해리 상수(KD)로 잠재형 TGF-β1(세포 표면 잠재형 TGF-β1, LLC 또는 SLC)에 결합한다.
하나의 국면에 있어서, 항잠재형 TGF-β1 항체는, 잠재형 TGF-β1의 활성화를 저해한다. 잠재형 TGF-β1의 "활성화"라는 용어는, 본 명세서에서 사용되는 경우, 잠재형 TGF-β1의 일 성분인 LAP로부터 성숙 TGF-β1이 방출되는 임의의 프로세스를 나타낸다. 잠재형 TGF-β1의 활성화는, 예를 들어, 당 기술분야에서 공지된 또는 본 명세서에 기재되는 다양한 기술을 이용하는 성숙 TGF-β1의 측정 및/또는 성숙 TGF-β1 활성의 측정에 의해 검출될 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, 항잠재형 TGF-β1 항체는, 잠재형 TGF-β1로부터의 성숙 TGF-β1의 방출을 저해한다. 상기와 같이, 성숙 TGF-β1은, 프로테아제, 인테그린 및 다른 비프로테아제 활성화 인자 등의 활성화 인자에 의해 잠재형 TGF-β1로부터 방출됨이 보고되어 있다. 잠재형 TGF-β1을 활성화하는 프로테아제의 비한정적인 예는, 플라스민(PLN), 프레칼리크레인(PLK), 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP) 2 및 MMP9를 포함한다. 몇몇 태양에 있어서, 항잠재형 TGF-β1 항체는, 잠재형 TGF-β1로부터의 성숙 TGF-β1의 프로테아제 매개 및/또는 인테그린 매개 방출을 저해한다. 상기와 같이, 프로테아제는, 잠재형 TGF-β1의 LAP 영역을 절단하여, 성숙 TGF-β1을 방출시킨다. 몇몇 태양에 있어서, PLN 및/또는 PLK에 의한 절단 부위는, LAP 폴리펩티드의 아미노산 56 내지 59로 이루어지는 프래그먼트 내에 위치한다.
하나의 국면에 있어서, 항잠재형 TGF-β1 항체는, 잠재형 TGF-β1의 LAP 부분의 프로테아제 매개 절단을 저해하지 않고, 잠재형 TGF-β1로부터의 성숙 TGF-β1의 프로테아제 매개 방출을 저해한다. 몇몇 태양에 있어서, 항잠재형 TGF-β1 항체는, 잠재형 TGF-β1로부터의 성숙 TGF-β1의 프로테아제 매개 방출을 저해하여, 항잠재형 TGF-β1 항체가 잠재형 TGF-β1의 LAP 영역에 결합하고 있는 동안에 프로테아제가 LAP 영역을 절단할 수 있도록 한다. 몇몇 태양에 있어서, 항잠재형 TGF-β1 항체는, 잠재형 TGF-β1에 대한, 특히 PLN 및/또는 PLK에 의한 절단 부위에 대한 프로테아제의 억세스를 블로킹하지 않는다. 다른 태양에 있어서, 항잠재형 TGF-β1 항체는, 잠재형 TGF-β1의 LAP 부분의 프로테아제 절단 부위, 특히 PLN 및/또는 PLK에 의한 절단 부위에 결합하지 않는다.
몇몇 태양에 있어서, 잠재형 TGF-β1로부터의 성숙 TGF-β1의 프로테아제 매개 방출을 저해하는 항잠재형 TGF-β1 항체는, (i) 1개 또는 복수의 프로테아제에 의해 매개되는 LAP 영역의 절단을 저해하지만, (ii) 다른 프로테아제에 의해 매개되는 LAP 영역의 절단을 저해하지 않는 항체이다. 예를 들어, 항잠재형 TGF-β1 항체는, (1-i) 잠재형 TGF-β1의 LAP 부분의 MMP2 및/또는 MMP9 매개 절단을 저해하는 것에 의해 성숙 TGF-β1의 MMP2 및/또는 MMP9 매개 방출을 저해하고, (1-ii) 잠재형 TGF-β1의 LAP 부분의 PLN 및/또는 PLK 매개 절단을 저해하지 않고 성숙 TGF-β1의 PLN 및/또는 PLK 매개 방출을 저해한다. 혹은, 항잠재형 TGF-β1 항체는, (2-i) 잠재형 TGF-β1의 LAP 부분의 PLN 및/또는 PLK 매개 절단을 저해하는 것에 의해 성숙 TGF-β1의 PLN 및/또는 PLK 매개 방출을 저해하고, (2-ii) 잠재형 TGF-β1의 LAP 부분의 MMP2 및/또는 MMP9 매개 절단을 저해하지 않고 성숙 TGF-β1의 MMP2 및/또는 MMP9 매개 방출을 저해한다. 혹은, 항잠재형 TGF-β1 항체는, (3-i) 잠재형 TGF-β1의 LAP 부분의 PLN 및/또는 PLK 매개 절단을 저해하지 않고 성숙 TGF-β1의 PLN 및/또는 PLK 매개 방출을 저해하고, (3-ii) 잠재형 TGF-β1의 LAP 부분의 MMP2 및/또는 MMP9 매개 절단을 저해하지 않고 성숙 TGF-β1의 MMP2 및/또는 MMP9 매개 방출을 저해한다.
몇몇 태양에 있어서, "잠재형 TGF-β1의 활성화를 저해하는" 항체는, TGF-β1의 활성화의 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 혹은 40% 또는 그 이상의 감소를 가져오는 항체를 포함한다. 다른 태양에 있어서, "잠재형 TGF-β1로부터의 성숙 TGF-β1의 프로테아제 매개 방출을 저해하는" 항체는, 잠재형 TGF-β1로부터의 성숙 TGF-β1의 프로테아제 매개 방출의 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 혹은 40% 또는 그 이상의 감소를 가져오는 항체를 포함한다. 추가적인 태양에 있어서, "잠재형 TGF-β1의 LAP 영역의 프로테아제 매개 절단을 저해하지 않고" 잠재형 TGF-β1로부터의 성숙 TGF-β1의 프로테아제 매개 방출을 저해하는 항체는, 잠재형 TGF-β1의 LAP 영역의 프로테아제 매개 절단의 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하의 감소를 가져오는 항체를 포함한다.
몇몇 태양에 있어서, 항잠재형 TGF-β1 항체는, 잠재형 TGF-β1의 LAP 영역의 프로테아제 매개 절단을 저해하지 않고, 잠재형 TGF-β1의 LAP 영역의 구조를 안정화한다. 본 명세서에서 사용되는 경우, 항잠재형 TGF-β1 항체가 LAP 영역의 구조를 "안정화"할 때, 항잠재형 TGF-β1 항체에 의해 결합된 LAP 영역은, 성숙 TGF-β1을 방출할 수 없는 특정의 구조로 유지되었다. 추가적인 태양에 있어서, 항잠재형 TGF-β1 항체에 의해 안정화되는 잠재형 TGF-β1은, 인테그린(바람직하게는 인테그린 αVβ8 및/또는 인테그린 αVβ6)에 의해 활성화될 수 있다. 특정의 태양에 있어서, 항잠재형 TGF-β1 항체에 의해 안정화되어 있는 LAP 영역은, 프로테아제에 의해 절단된 것 또는 절단되어 있지 않은 것 중 어느 하나이다. 몇몇 태양에 있어서, 항잠재형 TGF-β1 항체는, 잠재형 TGF-β1의 LAP 영역의 구조를 안정화하여, 항잠재형 TGF-β1 항체가 잠재형 TGF-β1의 LAP 영역에 결합하고 있는 동안에 프로테아제가 LAP 영역을 절단하는 것을 가능하게 한다. 몇몇 태양에 있어서, 항잠재형 TGF-β1 항체는, 잠재형 TGF-β1에 대한, 특히 PLN 및/또는 PLK에 의한 절단 부위에 대한 프로테아제의 억세스를 블로킹하지 않고, 잠재형 TGF-β1의 LAP 영역의 구조를 안정화한다. 다른 태양에 있어서, 항잠재형 TGF-β1 항체는, 잠재형 TGF-β1에 대한, 특히 MMP2 및/또는 MMP9에 의한 절단 부위에 대한 프로테아제의 억세스를 블로킹하지 않고, 잠재형 TGF-β1의 LAP 영역의 구조를 안정화한다.
하나의 국면에 있어서, 항잠재형 TGF-β1 항체는, 성숙 TGF-β1에 결합하지 않는다. 몇몇 태양에 있어서, 항잠재형 TGF-β1 항체는, 성숙 TGF-β1보다도 높은 결합 활성으로 잠재형 TGF-β1에 결합한다. 특정의 태양에 있어서, 본 발명의 항체는, 성숙 TGF-β1에 대한 것보다도 적어도 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000배 또는 그 이상 높은 결합 활성으로 잠재형 TGF-β1에 결합한다.
하나의 국면에 있어서, 항잠재형 TGF-β1 항체는, 인테그린 매개 TGF-β1 활성화, 즉, 잠재형 TGF-β1로부터의 성숙 TGF-β1의 인테그린 매개 방출을 저해하지 않거나 또는 유의하게 저해하지 않는다. 바람직하게는, 여기에서의 인테그린은 인테그린 αVβ8 및/또는 인테그린 αVβ6이다. 몇몇 태양에 있어서, "인테그린 매개 TGF-β1 활성화를 저해하지 않거나 또는 유의하게 저해하지 않는" 항체는, 인테그린 매개 TGF-β1 활성화, 즉, 잠재형 TGF-β1로부터의 성숙 TGF-β1의 인테그린 매개 방출의 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하의 감소를 가져오는 항체를 포함한다.
하나의 국면에 있어서, 항잠재형 TGF-β1 항체는, 항TGF-β 안타고니스트에 관련되는, 저감되거나 또는 보다 적은 독성 및/또는 부작용을 일으킨다. 몇몇 태양에 있어서, 본 명세서에 기재되는 것 등의 항잠재형 TGF-β1 항체는, 성숙 TGF-β1에 대해서 활성을 야기하는 약제, 또는 잠재형 TGF-β1에 대해서 활성을 야기하지만 잠재형 TGF-β1의 프로테아제 매개 활성화와 인테그린 매개 활성화의 양쪽을 저해하는 약제와 비교하여, 우수한 안전성-유효성 프로파일을 갖는다. 몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 항잠재형 TGF-β1 항체는, 항성숙 TGF-β1 항체보다 우수하거나 또는 동일한 정도의 유효성을 가지면서, 저감된 심(心) 독성을 갖는다. 어떠한 이론에도 구속되는 것은 아니지만, 본 개시의 항잠재형 TGF-β1 항체는, 인테그린이 매개하는 TGF-β1의 활성화를 저해하지 않거나, 또는 유의하게 저해하지 않기 때문에, (i) 인테그린이 매개하는 TGF-β1의 활성화, 또는 (ii) 인테그린에 의해 TGF-β1이 활성화된 부위에 있어서의 TGF-β1 시그널 전달의 저해에 기인하는 독성 및/또는 부작용이 저감되어 있거나, 또는 보다 적다. 따라서, 본 개시의 항잠재형 TGF-β1 항체는, 그것을 필요로 하는 대상에게, 부작용, 특히 심 독성을 일으키지 않고, 치료적 유효량을 투여할 수 있다. 따라서, 이와 같은 접근 방법은, 환자에 있어서 유효성과 안전성/인용성의 양쪽을 달성할 수 있는 용량 범위를 확대할 것이다. 따라서, 본 발명은, 인테그린 매개 TGF-β1 활성화를 저해하지 않거나 또는 유의하게 저해하지 않는 항잠재형 TGF-β1 항체의 유효량을 대상에게 투여하는 것에 의해, TGF-β1 시그널 전달에 관련되는 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 대상에 있어서 TGF-β1 저해에 관련되는 독성 및/또는 부작용을 저감시키기 위한, 항잠재형 TGF-β1 항체의 사용이, 본 발명에 포함된다. 몇몇 태양에 있어서, 독성 및/또는 부작용에는, 심혈관 독성, 위장 독성, 면역 독성, 골/연골 독성, 생식 독성, 및 신장 독성이 포함될 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, 심혈관 독성에는, 심장변 병변, 예를 들어 출혈, 염증, 변 간질세포의 변성 및 증식이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. 몇몇 태양에 있어서, 독성 및/또는 부작용은 출혈을 포함할 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, 독성 및/또는 부작용은 피부의 병변 또는 종양을 포함할 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, 독성 및/또는 부작용은 종양의 진행을 포함할 수 있다.
몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항잠재형 TGF-β1 항체는:
잠재형 TGF-β1에 결합한다;
SLC를 형성하는 잠재형 TGF-β1에 결합한다;
LLC를 형성하는 잠재형 TGF-β1에 결합한다;
GARP 또는 LRRC33과 복합체를 형성하는 잠재형 TGF-β1에 결합한다;
세포 표면 잠재형 TGF-β1에 결합한다;
잠재형 TGF-β1의 LAP 영역에 결합한다;
LAP에 결합한다;
10-8nM 이하, 10-9nM 이하, 또는 10-10nM 이하의 해리 상수(KD)로 잠재형 TGF-β1에 결합한다;
잠재형 TGF-β1로부터의 성숙 TGF-β1의 프로테아제 매개 방출을 저해한다;
잠재형 TGF-β1의 LAP 영역의 프로테아제 매개 절단을 저해하지 않는다;
잠재형 TGF-β1로부터의 성숙 TGF-β1의 인테그린 매개 방출을 저해하지 않거나 또는 유의하게 저해하지 않는다; 및/또는
항TGF-β1 안타고니스트, 예를 들어 항성숙 TGF-β 항체에 관련되는, 저감되거나 또는 보다 적은 독성 및/또는 부작용을 일으킨다.
추가적인 태양에 있어서, 본 발명의 항잠재형 TGF-β1 항체는:
모노클로날 항체;
인간 항체, 인간화 항체, 혹은 키메라 항체;
전장의 IgG 항체; 및/또는
항체 프래그먼트
이다.
하나의 국면에 있어서, 본 발명은, (a) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택되는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 HVR을 포함하는 항잠재형 TGF-β1 항체를 제공한다.
하나의 국면에 있어서, 본 발명은, (a) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택되는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 HVR을 포함하는 항잠재형 TGF-β1 항체를 제공한다.
하나의 국면에 있어서, 본 발명은, (a) 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택되는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 HVR을 포함하는 항잠재형 TGF-β1 항체를 제공한다.
하나의 국면에 있어서, 본 발명은, (a) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택되는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항잠재형 TGF-β1 항체를 제공한다.
하나의 국면에 있어서, 본 발명은, (a) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항잠재형 TGF-β1 항체를 제공한다.
하나의 국면에 있어서, 본 발명은, (a) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항잠재형 TGF-β1 항체를 제공한다.
하나의 국면에 있어서, 본 발명은, (a) 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항잠재형 TGF-β1 항체를 제공한다.
하나의 국면에 있어서, 본 발명은, (a) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항잠재형 TGF-β1 항체를 제공한다.
하나의 국면에 있어서, 본 발명은, 서열 번호: 12에 기재되는 VH 서열의 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3, 및 서열 번호: 13에 기재되는 VL 서열의 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는, 항잠재형 TGF-β1 항체로서, 해당 HVR이, (a) Chothia; (b) Kabat; (c) MacCallum; 또는 (d) (a), (b) 및/또는 (c)의 조합에 의해 정의되는, 항잠재형 TGF-β1 항체를 제공한다.
하나의 국면에 있어서, 본 발명은, 서열 번호: 14에 기재되는 VH 서열의 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3, 및 서열 번호: 15에 기재되는 VL 서열의 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는, 항잠재형 TGF-β1 항체로서, 해당 HVR이, (a) Chothia; (b) Kabat; (c) MacCallum; 또는 (d) (a), (b) 및/또는 (c)의 조합에 의해 정의되는, 항잠재형 TGF-β1 항체를 제공한다.
하나의 국면에 있어서, 본 발명은, 서열 번호: 16에 기재되는 VH 서열의 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3, 및 서열 번호: 17에 기재되는 VL 서열의 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는, 항잠재형 TGF-β1 항체로서, 해당 HVR이, (a) Chothia; (b) Kabat; (c) MacCallum; 또는 (d) (a), (b) 및/또는 (c)의 조합에 의해 정의되는, 항잠재형 TGF-β1 항체를 제공한다.
하나의 국면에 있어서, 본 발명은, 서열 번호: 18에 기재되는 VH 서열의 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3, 및 서열 번호: 19에 기재되는 VL 서열의 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는, 항잠재형 TGF-β1 항체로서, 해당 HVR이, (a) Chothia; (b) Kabat; (c) MacCallum; 또는 (d) (a), (b) 및/또는 (c)의 조합에 의해 정의되는, 항잠재형 TGF-β1 항체를 제공한다.
상기 태양의 임의의 것에 있어서, 항잠재형 TGF-β1 항체는 인간화된다. 일 태양에 있어서, 항잠재형 TGF-β1 항체는, 상기 태양의 임의의 것의 HVR을 포함하고, 억셉터 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 추가로 포함한다.
다른 국면에 있어서, 항잠재형 TGF-β1 항체는, 서열 번호: 12, 14, 16, 또는 18의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다. 특정의 태양에 있어서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 VH 서열은, 참조 서열에 대해서 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 포함하지만, 당해 서열을 포함하는 항잠재형 TGF-β1 항체는, 잠재형 TGF-β1에 결합하는 능력을 유지하고 있다. 특정의 태양에 있어서는, 서열 번호: 12, 14, 16, 또는 18에 있어서 합계 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입, 및/또는 결실되어 있다. 특정의 태양에 있어서, 치환, 삽입, 또는 결실은, HVR 외의 영역에 있어서(즉, FR에 있어서) 생긴다. 임의로, 항잠재형 TGF-β1 항체는, 서열 번호: 12, 14, 16, 또는 18 중의 VH 서열을, 당해 서열의 번역 후 수식을 포함하는 것도 포함하여, 포함한다. 특정의 태양에 있어서, VH는, (a) 서열 번호: 20, 26, 32, 또는 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 21, 27, 33, 또는 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 22, 28, 34, 또는 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택되는 1개, 2개, 또는 3개의 HVR을 포함한다. 번역 후 수식은, 중쇄 또는 경쇄 N말단의 글루타민 또는 글루타민산의 파이로글루타밀화에 의한 파이로글루타민산으로의 수식을 포함하지만, 이것으로 한정되지 않는다.
다른 국면에 있어서, 서열 번호: 13, 15, 17, 또는 19의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항잠재형 TGF-β1 항체가 제공된다. 특정의 태양에 있어서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 VL 서열은, 참조 서열에 대해서 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 포함하지만, 당해 서열을 포함하는 항잠재형 TGF-β1 항체는, 잠재형 TGF-β1에 결합하는 능력을 유지하고 있다. 특정의 태양에 있어서는, 서열 번호: 13, 15, 17, 또는 19에 있어서 합계 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입, 및/또는 결실되어 있다. 특정의 태양에 있어서, 치환, 삽입, 또는 결실은, HVR외의 영역에 있어서(즉, FR에 있어서) 생긴다. 임의로, 항잠재형 TGF-β1 항체는, 서열 번호: 13, 15, 17, 또는 19 중의 VL 서열을, 당해 서열의 번역 후 수식을 포함하는 것도 포함하여, 포함한다. 특정의 태양에 있어서, VL은, (a) 서열 번호: 23, 29, 35, 또는 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호: 24, 30, 36, 또는 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 번호: 25, 31, 37, 또는 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택되는 1개, 2개, 또는 3개의 HVR을 포함한다. 번역 후 수식은, 중쇄 또는 경쇄 N말단의 글루타민 또는 글루타민산의 파이로글루타밀화에 의한 파이로글루타민산으로의 수식을 포함하지만, 이것으로 한정되지 않는다.
다른 국면에 있어서, 전술한 태양의 임의의 것에 있어서의 VH, 및 전술한 태양의 임의의 것에 있어서의 VL을 포함하는, 항잠재형 TGF-β1 항체가 제공된다. 일 태양에 있어서, 항체는 각각 서열 번호: 12 및 서열 번호: 13 중의 VH 및 VL 서열을, 당해 서열의 번역 후 수식을 포함하는 것도 포함하여, 포함한다. 번역 후 수식은, 중쇄 또는 경쇄 N말단의 글루타민 또는 글루타민산의 파이로글루타밀화에 의한 파이로글루타민산으로의 수식을 포함하지만, 이것으로 한정되지 않는다.
일 태양에 있어서, 당해 항체는 서열 번호: 14 및 서열 번호: 15에 각각 기재되는 VH 및 VL 서열을, 당해 서열의 번역 후 수식을 포함하는 것도 포함하여, 포함한다. 번역 후 수식은, 중쇄 또는 경쇄 N말단의 글루타민 또는 글루타민산의 파이로글루타밀화에 의한 파이로글루타민산으로의 수식을 포함하지만, 이것으로 한정되지 않는다.
일 태양에 있어서, 당해 항체는 서열 번호: 16 및 서열 번호: 17에 각각 기재되는 VH 및 VL 서열을, 당해 서열의 번역 후 수식을 포함하는 것도 포함하여, 포함한다. 번역 후 수식은, 중쇄 또는 경쇄 N말단의 글루타민 또는 글루타민산의 파이로글루타밀화에 의한 파이로글루타민산으로의 수식을 포함하지만, 이것으로 한정되지 않는다.
일 태양에 있어서, 당해 항체는 서열 번호: 18 및 서열 번호: 19에 각각 기재되는 VH 및 VL 서열을, 당해 서열의 번역 후 수식을 포함하는 것도 포함하여, 포함한다. 번역 후 수식은, 중쇄 또는 경쇄 N말단의 글루타민 또는 글루타민산의 파이로글루타밀화에 의한 파이로글루타민산으로의 수식을 포함하지만, 이것으로 한정되지 않는다.
추가적인 국면에 있어서, 본 발명은, 본 명세서에 제공되는 항잠재형 TGF-β1 항체와 같은 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 예를 들어, 특정의 태양에 있어서,
(1) (a) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 항잠재형 TGF-β1 항체;
(2) (a) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 항잠재형 TGF-β1 항체;
(3) (a) 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 항잠재형 TGF-β1 항체; 또는
(4) (a) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 항잠재형 TGF-β1 항체
와 같은 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다.
추가적인 국면에 있어서, 본 발명은, 인간, 원숭이, 마우스, 및/또는 래트의 잠재형 TGF-β1에 결합하는 항체를 제공한다. 특정의 태양에 있어서, 본 발명은, 인간, 원숭이, 및 마우스의 잠재형 TGF-β1에 결합하는 항체를 제공한다. 특정의 태양에 있어서, 본 발명은, 인간, 원숭이, 및 마우스의 SLC를 형성하는 잠재형 TGF-β1에 결합하는 항체를 제공한다. 특정의 태양에 있어서, 본 발명은, 인간, 원숭이, 및 마우스의 LLC를 형성하는 잠재형 TGF-β1에 결합하는 항체를 제공한다. 특정의 태양에 있어서, 본 발명은, 인간, 원숭이, 및 마우스의 LLC를 형성하는 잠재형 TGF-β1에 결합하는 항체를 제공한다. 특정의 태양에 있어서, 본 발명은, 인간, 원숭이, 및 마우스의 GARP 또는 LRRC33과의 복합체를 형성하는 잠재형 TGF-β1에 결합하는 항체를 제공한다. 특정의 태양에 있어서, 본 발명은, 인간, 원숭이, 및 마우스의 세포 표면 잠재형 TGF-β1에 결합하는 항체를 제공한다.
추가적인 국면에 있어서, 본 발명은, 본 명세서에 제공되는 항잠재형 TGF-β1 항체 중 임의의 하나와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 에피토프는, 인간, 원숭이, 마우스, 및/또는 래트의 TGF-β1 상에 존재할 수 있다. 예를 들어, 특정의 태양에 있어서, 본 발명은, 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공하고, 여기에서 참조 항체는,
(1) (a) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 항잠재형 TGF-β1 항체;
(2) (a) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 항잠재형 TGF-β1 항체;
(3) (a) 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 항잠재형 TGF-β1 항체; 또는
(4) (a) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 항잠재형 TGF-β1 항체
이다.
추가적인 국면에 있어서, 본 발명은, 인간, 원숭이, 마우스, 및/또는 래트의 TGF-β1에 결합하는 본 명세서에 제공되는 항잠재형 TGF-β1 항체와 경합하는 항체를 제공한다. 예를 들어, 특정의 태양에 있어서, 인간, 원숭이, 마우스, 및/또는 래트의 TGF-β1과의 결합에 관해서,
(1) (a) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 항잠재형 TGF-β1 항체;
(2) (a) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 항잠재형 TGF-β1 항체;
(3) (a) 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 항잠재형 TGF-β1 항체; 또는
(4) (a) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 항잠재형 TGF-β1 항체
와 경합하는 항체가 제공된다.
본 발명의 추가적인 국면에 있어서, 상기 태양의 임의의 것에 따른 항잠재형 TGF-β1 항체는, 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체를 포함하는 모노클로날 항체이다. 일 태양에 있어서, 항잠재형 TGF-β1 항체는, 항체 프래그먼트, 예를 들어 Fv, Fab, Fab', scFv, 다이아보디 또는 F(ab')2 프래그먼트이다. 다른 태양에 있어서, 항체는, 전장 항체, 예를 들어 인타크트인 IgG1, IgG2, IgG3 혹은 IgG4 항체 또는 본 명세서에서 정의되는 다른 항체 클래스 혹은 아이소타입이다. 추가적인 국면에 있어서, 항잠재형 TGF-β1 항체는 또한, 면역글로불린의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 구조를 포함하는 임의의 항원 결합 분자를 포함한다.
추가적인 국면에 있어서, 전술한 태양의 임의의 것에 따른 항잠재형 TGF-β1 항체는, 단독 또는 조합으로, 이하의 항목 1 내지 7에 기재된 임의의 특징을 가지고 있어도 된다.
1. 항체의 결합 활성
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체는, ≤1μM, ≤100nM, ≤10nM, ≤1nM, ≤0.1nM, ≤0.01nM 또는 ≤0.001nM(예를 들어, 10-8M 이하, 예를 들어 10-8M 내지 10-13M, 예를 들어 10-9M 내지 10-13M)의 해리 상수(KD)를 갖는다.
일 태양에 있어서, 항체의 결합 활성은, 방사성표지 항원 결합 측정법(radiolabeled antigen binding assay: RIA)에 의해 측정되고, KD에 의해 표시된다. 일 태양에 있어서, RIA는, 목적하는 항체의 Fab 버전 및 그 항원을 이용하여 실시된다. 예를 들어, 항원에 대한 Fab의 용액 중 결합 활성은, 비표지 항원의 점증량 계열의 존재하에서 최소 농도의 (125I) 표지 항원에 의해 Fab를 평형화시키고, 그 다음에 결합된 항원을 항Fab 항체로 코팅된 플레이트에 의해 포착하는 것에 의해 측정된다. (예를 들어, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)를 참조). 측정 조건을 구축하기 위해서, MICROTITER(등록상표) 멀티웰 플레이트(Thermo Scientific)를 50mM 탄산 나트륨(pH 9.6) 중 5μg/ml의 포착용 항Fab 항체(Cappel Labs)로 하룻밤 코팅하고, 그 후에 실온(대략 23℃)에서 2 내지 5시간, PBS 중 2%(w/v) 소 혈청 알부민으로 블로킹한다. 비흡착 플레이트(Nunc #269620)에 있어서, 100pM 또는 26pM의 [125I]- 항원을, (예를 들어, Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)에 있어서의 항VEGF 항체, Fab-12의 평가와 동일하게) 목적하는 Fab의 단계 희석물과 혼합한다. 그 다음에, 목적하는 Fab를 하룻밤 인큐베이트하지만, 이 인큐베이션은, 평형이 확실히 달성되도록, 보다 장시간(예를 들어, 약 65시간) 계속될 수 있다. 그 후, 혼합물을, 실온에서의 인큐베이션(예를 들어, 1시간)을 위해서 포착 플레이트로 옮긴다. 그 다음에 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중 0.1%의 폴리소베이트 20(TWEEN-20(등록상표))으로 8회 세정한다. 플레이트가 건조되면, 150μl/웰의 신틸런트(MICROSCINT-20(상표), Packard)를 첨가하고, TOPCOUNT(상표) 감마 카운터(Packard)에 있어서 플레이트를 10분간 카운트한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각 Fab의 농도를, 경합 결합 어세이에 있어서 사용하기 위해서 선택한다.
일 태양에 있어서, 항체의 결합 활성을 측정하기 위해서는, 예를 들어, 측정 원리로서 표면 플라즈몬 공명 분석법에 의거하는, BIACORE(등록상표) T200 또는 BIACORE(등록상표) 4000(GE Healthcare, Uppsala, 스웨덴)을 사용한, 리간드 포착법을 사용한다. 장치의 조작에는, BIACORE(등록상표) Control Software를 사용한다. 일 태양에 있어서, 아민 커플링 키트(GE Healthcare, Uppsala, 스웨덴)를 제조자의 지시에 따라 사용하여, 리간드 포착용의 분자, 예를 들어 항태그 항체, 항IgG 항체, 프로테인 A 등을, 카복시메틸덱스트란으로 코팅된 센서 칩(GE Healthcare, Uppsala, 스웨덴) 상에 고정시킨다. 리간드 포착 분자는, 적절한 pH의 10mM 아세트산 나트륨 용액으로 희석하고, 적절한 유속으로 적절한 주입 시간 주입한다. 결합 활성의 측정은, 0.05%의 폴리소베이트 20(별명 Tween(등록상표)-20)을 포함하는 버퍼를 측정 버퍼로서 사용하여, 10 내지 30μL/분의 유속에서, 바람직하게는 25℃ 또는 37℃의 측정 온도에서 측정한다. 항체를 리간드로서 리간드 포착 분자에 포착시켜 행하는 측정의 경우, 항체를 주입하여 목표량의 항체를 포착시킨 후, 측정 버퍼를 이용하여 조제한 항원 및/또는 Fc 수용체(애널라이트)의 단계 희석액을 주입한다. 항원 및/또는 Fc 수용체를 리간드로서 리간드 포착 분자에 포착시켜 행하는 측정의 경우, 항원 및/또는 Fc 수용체를 주입하여 그 목표량을 포착시킨 후, 측정 버퍼를 이용하여 조제한 항체(애널라이트)의 단계 희석액을 주입한다.
일 태양에 있어서, 측정 결과는 BIACORE(등록상표) Evaluation Software를 사용하여 해석한다. 속도론적 파라미터의 산출은, 결합 및 해리의 센서그램을 동시에 1:1 결합 모델을 이용하여 피팅하는 것에 의해 행하여, 결합 속도 상수(kon 또는 ka), 해리 속도 상수(koff 또는 kd), 및 평형 해리 상수(KD)가 산출될 수 있다. 결합 활성이 약한 경우, 특히, 해리가 빠르고 속도론적 파라미터의 산출이 곤란한 경우는, 정상 상태(Steady state) 모델을 사용하여 평형 해리 상수(KD)를 산출해도 된다. 결합 활성에 관한 추가적인 파라미터로서, 특정의 농도에서의 애널라이트의 결합량(리조넌스 유닛: RU)을, 포착한 리간드량으로 나누는 것에 의해, "단위 리간드량당의 애널라이트의 결합량"을 산출해도 된다.
2. 항체 단편
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체는, 항체 단편이다. 항체 단편은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, 및 scFv 단편, 및 후술하는 다른 단편을 포함한다. 특정의 항체 단편에 대한 총설로서, Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)을 참조. scFv 단편의 총설로서, 예를 들어, Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); 더하여, WO93/16185; 및 미국 특허 제5,571,894호 및 제5,587,458호를 참조. 샐비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 인비보(in vivo)에 있어서의 반감기가 길어진 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 논설로서, 미국 특허 제5,869,046호를 참조.
다이아보디는, 2가 또는 이중 특이적이어도 되고, 항원 결합 부위를 2개 수반하는 항체 단편이다. 예를 들어, EP404,097호; WO1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448(1993) 참조. 트라이아보디(triabody)나 테트라보디(tetrabody)도, Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)에 기재되어 있다.
싱글 도메인 항체는, 항체의 중쇄 가변 도메인의 모두 혹은 일부분, 또는 경쇄 가변 도메인의 모두 혹은 일부분을 포함하는, 항체 단편이다. 특정의 태양에 있어서, 싱글 도메인 항체는, 인간 싱글 도메인 항체이다(Domantis, Inc., Waltham, MA; 예를 들어, 미국 특허 제6,248,516호 B1 참조).
항체 단편은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 본 명세서에 기재된, 완전 항체의 단백질 분해적 소화, 재조합 숙주 세포(예를 들어, 대장균(E. coli) 또는 파지)에 의한 산생을 포함하는, 여러 가지 수법에 의해 만들 수 있다.
본 발명은 또한, 예를 들어 미니보디(저분자량 항체) 및 스캐폴드 단백질을 포함하지만 이들로 한정되지 않는, TGF-β1에 결합하는 항원 결합 분자에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 안정적인 삼차원 구조를 갖고, 적어도 항원에 결합할 수가 있는 펩티드인 한, 임의의 스캐폴드 단백질이 허용될 수 있다. 그와 같은 펩티드는, 예를 들어, 항체 가변 영역의 프래그먼트, 피브로넥틴, 프로테인 A 도메인, LDL 수용체 A 도메인, 리포칼린 및 Nygren et al. (Current Opinion in Structural Biology, (1997) 7:463-469; Journal of Immunol Methods, (2004) 290:3-28), Binz et al. (Nature Biotech. (2005) 23:1257-1266) 및 Hosse et al. (Protein Science, (2006) 15:14-27)에 기재되는 다른 분자를 포함한다. 본 명세서의 문맥에 있어서, 그와 같은 항체를 참조하는 경우, 예를 들어, "항잠재형 TGF-β1 항체"는, "항잠재형 TGF-β1 항원 결합 분자"로 치환할 수 있을 것이다.
3. 키메라 및 인간화 항체
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체는, 키메라 항체이다. 특정의 키메라 항체가, 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)에 기재되어 있다. 일례에서는, 키메라 항체는, 비인간 가변 영역(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 원숭이 등의 비인간 영장류에서 유래하는 가변 영역) 및 인간 정상 영역을 포함한다. 추가적인 예에 있어서, 키메라 항체는, 친항체의 것으로부터 클래스 또는 서브클래스가 변경된 "클래스 스위치" 항체이다. 키메라 항체는, 그의 항원 결합 단편도 포함한다.
특정의 태양에 있어서, 키메라 항체는, 인간화 항체이다. 전형적으로는, 비인간 항체는, 친비인간 항체의 특이성 및 결합 활성을 유지한 채로 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해서, 인간화된다. 통상, 인간화 항체는 1개 또는 복수의 가변 도메인을 포함하고, 당해 가변 도메인 중, HVR(예를 들어 CDR(또는 그의 부분))은 비인간 항체에서 유래하고, FR(또는 그의 부분)은 인간 항체 서열에서 유래한다. 인간화 항체는, 임의로, 인간 정상 영역의 적어도 일부분을 포함한다. 몇몇 태양에 있어서, 인간화 항체 중의 몇 개의 FR 잔기는, 예를 들어, 항체의 특이성 또는 결합 활성을 회복 또는 개선하기 위해서, 비인간 항체(예를 들어, HVR 잔기의 유래가 된 항체)로부터의 대응하는 잔기로 치환되어 있다.
인간화 항체 및 그의 제작 방법은, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)에 있어서 총설되어 있고, 또한, 예를 들어, Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); 미국 특허 제5,821,337호, 제7,527,791호, 제6,982,321호, 및 제7,087,409호; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)(특이성 결정 영역(specificity determining region: SDR) 그래프팅을 기재); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)(리서페이싱을 기재); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)(FR 셔플링을 기재); 및 Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)(FR 셔플링을 위한 "가이드 셀렉션" 접근 방법을 기재)에 있어서, 추가로 기재되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은, 이들로 한정되는 것은 아니지만: "베스트-피트"법(Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993) 참조)을 이용하여 선택된 프레임워크 영역; 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정의 서브그룹의 인간 항체의 컨센서스 서열에서 유래하는 프레임워크 영역(Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992) 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993) 참조); 인간 성숙(체세포 변이) 프레임워크 영역 또는 인간 생식 세포계 프레임워크 영역(예를 들어, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) 참조); 및 FR 라이브러리의 스크리닝에서 유래하는 프레임워크 영역(Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996) 참조)을 포함한다.
4. 인간 항체
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체는, 인간 항체이다. 인간 항체는, 당해 기술 분야에 있어서 알려진 여러 가지 수법에 의해 제조될 수 있다. 인간 항체는, van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)에 개설되어 있다.
인간 항체는, 항원 챌린지(부하)에 응답하여 완전 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 수반하는 완전 항체를 산생하도록 개변된 트랜스제닉 동물에 면역원을 투여하는 것에 의해 조제되어도 된다. 그와 같은 동물은, 전형적으로는 인간 면역글로불린 유전자자리의 전부 혹은 일부분을 포함하고, 인간 면역글로불린 유전자자리의 전부 혹은 일부분은, 내인성의 면역글로불린 유전자자리를 치환하거나, 또는, 염색체 외에 혹은 당해 동물의 염색체 내에 랜덤으로 반입된 상태로 존재한다. 그와 같은 트랜스제닉 마우스에 있어서, 내인성의 면역글로불린 유전자자리는, 통상 불활성화되어 있다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 얻는 방법의 총설로서, Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)를 참조할 것. 또한, 예를 들어, XENOMOUSE(상표) 기술을 기재한 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호; HUMAB(등록상표) 기술을 기재한 미국 특허 제5,770,429호; K-M MOUSE(등록상표) 기술을 기재한 미국 특허 제7,041,870호; 및 VELOCIMOUSE(등록상표) 기술을 기재한 미국 특허출원공개 제2007/0061900호를, 아울러 참조할 것. 이와 같은 동물에 의해 생성된 완전 항체로부터의 인간 가변 영역은, 예를 들어, 다른 인간 정상 영역과 조합하는 등을 하여, 추가로 수식되어도 된다.
인간 항체는, 하이브리도마에 기초한 방법으로도 만들 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 제조를 위한, 인간 미엘로마 및 마우스-인간 헤테로미엘로마 세포주는, 이미 기술되어 있다. (예를 들어, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991) 참조.) 인간 B 세포 하이브리도마 기술을 통하여 생성된 인간 항체도, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)에 진술되어 있다. 추가적인 방법으로서는, 예를 들어, 미국 특허 제7,189,826호(하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 IgM 항체의 제조를 기재), 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)(인간-인간 하이브리도마를 기재)에 기재된 것을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술(트리오마 기술)도, Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)에 기재되어 있다.
인간 항체는, 인간 유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리하는 것으로도 생성할 수 있다. 이와 같은 가변 도메인 서열은, 다음에 원하는 인간 정상 도메인과 조합할 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하는 수법을, 이하에 기술한다.
5. 라이브러리 유래 항체
본 발명의 항체는, 원하는 1개 또는 복수의 활성을 수반하는 항체에 대해 컴비나토리얼 라이브러리를 스크리닝하는 것에 의해 단리해도 된다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리의 생성이나, 원하는 결합 특성을 구비하는 항체에 대해 그와 같은 라이브러리를 스크리닝하기 위한, 다양한 방법이 당해 기술 분야에 있어서 알려져 있다. 그와 같은 방법은, Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)에 있어서 총설되어 있고, 더욱이, 예를 들어, McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)에 기재되어 있다.
특정의 파지 디스플레이법에 있어서, VH 및 VL 유전자의 레퍼터리는, 폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR)에 의해 따로따로 클로닝되어, 무작위로 파지 라이브러리 중으로 재결합되고, 당해 파지 라이브러리는, Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)에 진술되어 있는 바와 같이 하여, 항원 결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는, 전형적으로는, 단쇄 Fv(scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서의 어느 것인가로, 항체 단편을 제시한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는, 하이브리도마를 구축하는 것을 필요로 하지 않고서, 면역원에 대한 고결합 활성 항체를 제공한다. 혹은, Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)에 기재되어 있는 바와 같이, 나이브 레퍼터리를 (예를 들어, 인간으로부터) 클로닝하여, 면역화하지 않고서, 광범위한 비자기 및 자기 항원으로의 항체의 단일한 공급원을 제공할 수도 있다. 마지막으로, 나이브 라이브러리는, Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)에 기재되어 있는 바와 같이, 줄기세포로부터 재조합 전의 V-유전자 세그먼트를 클로닝하여, 초가변 CDR3 영역을 코딩하고 또한 인비트로(in vitro)로 재구성을 달성하기 위한 무작위 서열을 포함하는 PCR 프라이머를 이용하는 것에 의해, 합성적으로 만들 수도 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재한 특허문헌은, 예를 들어: 미국 특허 제5,750,373호, 및 미국 특허출원공개 제2005/0079574호, 2005/0119455호, 제2005/0266000호, 제2007/0117126호, 제2007/0160598호, 제2007/0237764호, 제2007/0292936호 및 제2009/0002360호를 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은, 본 명세서에서는 인간 항체 또는 인간 항체 단편이라고 본다.
6. 다중 특이성 항체
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체는, 다중 특이성 항체(예를 들어, 이중 특이성 항체)이다. 다중 특이성 항체는, 적어도 2개의 상이한 부위에 결합 특이성을 갖는, 모노클로날 항체이다. 특정의 태양에 있어서, 결합 특이성 중 1개는, TGF-β1에 대한 것이고, 다른 1개는 다른 임의의 항원에 대한 것이다. 특정의 태양에 있어서, 이중 특이성 항체는, TGF-β1의 상이한 2개의 에피토프에 결합해도 된다. 이중 특이성 항체는, TGF-β1을 발현하는 세포에 세포상해제를 국재화하기 위해서 사용되어도 된다. 이중 특이성 항체는, 전장 항체로서 또는 항체 단편으로서 조제될 수 있다.
다중 특이성 항체를 제작하기 위한 수법은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 페어의 재조합 공발현(Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983), WO93/08829, 및 Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991) 참조), 및 knob-in-hole 기술(예를 들어, 미국 특허 제5,731,168호 참조)을 포함한다. 다중 특이성 항체는, Fc 헤테로이량체 분자를 제작하기 위해서 정전 스티어링 효과(electrostatic steering effects)를 조작하는 것(WO2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교하는 것(미국 특허 제4,676,980호 및 Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) 참조); 류신 지퍼를 이용하여 2개의 특이성을 갖는 항체를 작성하는 것(Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) 참조); "다이아보디" 기술을 이용하여 이중 특이성 항체 단편을 제작하는 것(Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) 참조); 및 단쇄 Fv(scFv) 이량체를 이용하는 것(Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994) 참조); 및 예를 들어 Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)에 기재되어 있는 바와 같이 삼중 특이성 항체를 조제하는 것에 의해 제작해도 된다.
"옥토퍼스 항체"를 포함하는, 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 수반하는 개변 항체도, 본 명세서에서는 포함된다(예를 들어, 미국 특허출원공개 제2006/0025576호 A1 참조).
본 명세서에서 항체 또는 단편은, TGF-β1과 별도의 상이한 항원에 결합하는 1개의 항원 결합 부위를 포함하는, "듀얼 액팅 Fab" 또는 "DAF"도 포함한다(예를 들어, 미국 특허출원공개 제2008/0069820호 참조).
7. 항체 변이체
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체의 아미노산 서열 변이체도, 고려 중에 있다. 예를 들어, 항체의 결합 활성 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이, 바람직한 경우도 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는, 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 수식을 도입하는 것, 또는, 펩티드 합성에 의해, 조제되어도 된다. 그와 같은 수식은, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열로부터의 결실, 및/또는 항체의 아미노산 서열 중으로의 삽입, 및/또는 항체의 아미노산 서열 중의 잔기의 치환을 포함한다. 최종 구축물이 원하는 특징(예를 들어, 항원 결합성)을 구비하는 것을 전제로, 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합이, 최종 구축물에 이르기 위해서 행해질 수 있다.
a) 치환, 삽입, 및 결실 변이체
특정의 태양에 있어서, 1개 또는 복수의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환적 변이 도입의 목적 부위는, HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환을, 표 1의 "바람직한 치환"의 표제하에 나타낸다. 보다 실질적인 변경을, 표 1의 "예시적인 치환"의 표제하에 제공함과 함께, 아미노산 측쇄의 클래스에 언급하면서 아래에서 상술한다. 아미노산 치환은 목적하는 항체에 도입되어도 되고, 산물은, 예를 들어, 유지/개선된 항원 결합성, 감소한 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC 등의, 원하는 활성에 대해 스크리닝되어도 된다.
Figure 112020129062073-pct00001
아미노산은, 공통의 측쇄 특성에 따라 군으로 나눌 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, 메티오닌(Met), 알라닌(Ala), 발린(Val), 류신(Leu), 아이소류신(Ile);
(2) 중성의 친수성: 시스테인(Cys), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 아스파라긴(Asn), 글루타민(Gln);
(3) 산성: 아스파라긴산(Asp), 글루타민산(Glu);
(4) 염기성: 히스티딘(His), 리신(Lys), 아르기닌(Arg);
(5) 쇄 배향에 영향을 주는 잔기: 글리신(Gly), 프롤린(Pro);
(6) 방향족성: 트립토판(Trp), 티로신(Tyr), 페닐알라닌(Phe).
비보존적 치환은, 이들 클래스 중 하나의 멤버를, 다른 클래스의 것으로 교환하는 것을 말한다.
치환 변이체의 하나의 타입은, 친항체(예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 1개 또는 복수의 초가변 영역 잔기의 치환을 포함한다. 통상, 그 결과로서 생기고, 추가적인 연구를 위해서 선택된 변이체는, 친항체와 비교하여 특정의 생물학적 특성에 있어서의 수식(예를 들어, 개선)(예를 들어, 증가한 결합 활성, 감소한 면역원성)을 갖고, 및/또는 친항체의 특정의 생물학적 특성을 실질적으로 유지하고 있을 것이다. 예시적인 치환 변이체는, 결합 활성 성숙 항체이며, 이것은, 예를 들어 파지 디스플레이 베이스의 결합 활성 성숙 기술(예를 들어 본 명세서에 기재되는 것)을 이용하여 적절히 제작될 수 있다. 간결하게 설명하면, 1개 또는 복수의 HVR 잔기를 변이시키고, 그리고 변이 항체를 파지 상에 제시시키고, 특정의 생물학적 활성(예를 들어, 결합 활성)에 관해서 스크리닝을 행한다.
개변(예를 들어, 치환)은, 예를 들어 항체의 결합 활성을 개선하기 위해서, HVR에 있어서 행해질 수 있다. 그와 같은 개변은, HVR의 "핫스폿", 즉, 체세포 성숙 프로세스 동안에 고빈도로 변이가 일어나는 코돈에 의해 코딩되는 잔기(예를 들어, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)을 참조) 및/또는 항원에 접촉하는 잔기에 있어서 행해질 수 있고, 얻어진 변이 VH 또는 VL이 결합 활성에 관해서 시험될 수 있다. 2차 라이브러리로부터의 구축 및 재선택에 의한 결합 활성 성숙이, 예를 들어, Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))에 기재되어 있다. 결합 활성 성숙의 몇몇 태양에 있어서, 다양성은, 임의의 다양한 방법(예를 들어, 에러-프론 PCR, 체인 셔플링 또는 올리고뉴클레오티드 지향 변이 도입)에 따라 성숙을 위해서 선택된 가변 유전자에 도입된다. 그 다음에, 2차 라이브러리가 제작된다. 그 다음에, 이 라이브러리는, 원하는 결합 활성을 갖는 임의의 항체 변이체를 동정하기 위해서 스크리닝된다. 다양성을 도입하는 다른 방법은, 몇 개의 HVR 잔기(예를 들어, 한 번에 4 내지 6잔기)를 무작위화하는 HVR 지향 접근 방법을 포함한다. 항원 결합에 관여하는 HVR 잔기는, 예를 들어 알라닌 스캐닝 변이 도입 또는 모델링을 이용하여, 구체적으로 특정될 수 있다. 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 자주 표적화된다.
특정의 태양에 있어서, 치환, 삽입, 또는 결실은, 그와 같은 개변이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 1개 또는 복수의 HVR 내에서 행해질 수 있다. 예를 들어, 결합 어피니티를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 개변(예를 들어, 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 보존적 치환)이, HVR에 있어서 행해질 수 있다. 그와 같은 개변은, 예를 들어, HVR의 항원 접촉 잔기의 외측일 수 있다. 상기의 변이 VH 및 VL 서열의 특정의 태양에 있어서, 각 HVR은 개변되지 않거나, 불과 1개, 2개, 혹은 3개의 아미노산 치환을 포함한다.
변이 도입을 위해서 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역을 동정하는 데 유용한 방법은, Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085에 의해 기재되는, "알라닌 스캐닝 변이 도입"이라고 불리는 것이다. 이 방법에 있어서, 1 잔기 또는 일군의 표적 잔기(예를 들어, 하전 잔기, 예를 들어 아르기닌, 아스파라긴산, 히스티딘, 리신, 및 글루타민산)가 동정되고, 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들어, 알라닌 혹은 폴리알라닌)으로 치환되어, 항체와 항원의 상호작용이 영향을 받을지 여부가 결정된다. 이 초기 치환에 대해서 기능적 감수성을 나타낸 아미노산 위치에, 추가적인 치환이 도입될 수 있다. 혹은 또는 추가로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 동정하기 위해서, 항원 항체 복합체의 결정 구조를 해석해도 된다. 그와 같은 접촉 잔기 및 근린의 잔기를, 치환 후보로서 표적화해도 되고, 또는 치환 후보로부터 제외해도 된다. 변이체는, 그것들이 원하는 특성을 포함할지 여부를 결정하기 위해서 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열의 삽입은, 서열 내부로의 단일 또는 복수의 아미노산 잔기의 삽입과 마찬가지로, 아미노 말단 및/또는 카복실 말단에 있어서의 1잔기 내지 100잔기 이상을 포함하는 폴리펩티드의 길이의 범위에서의 융합도 포함한다. 말단의 삽입의 예는, N말단에 메티오닐 잔기를 수반하는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는, 항체의 N- 또는 C-말단에, 효소(예를 들어, ADEPT를 위한) 또는 항체의 혈장 반감기를 증가시키는 폴리펩티드를 융합시킨 것을 포함한다.
b) 글리코실화 변이체
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체는, 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 또는 감소시키도록 개변되어 있다. 항체로의 글리코실화 부위의 추가 또는 삭제는, 1개 또는 복수의 글리코실화 부위를 만들어 내거나 또는 없애도록 아미노산 서열을 개변하는 것에 의해, 간편하게 달성 가능하다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 거기에 부가되는 탄수화물이 개변되어도 된다. 포유동물 세포에 의해 산생되는 천연형 항체는, 전형적으로는, 분기한 2분기의 올리고당을 포함하고, 당해 올리고당은 통상 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-링키지에 의해 부가되고 있다. 예를 들어, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997) 참조. 올리고당은, 예를 들어, 만노스, N-아세틸글루코사민(GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산 등의 여러 가지 탄수화물, 또한, 2분기의 올리고당 구조의 "줄기" 중의 GlcNAc에 부가된 푸코스를 포함한다. 몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항체 중의 올리고당의 수식은, 특정의 개선된 특성을 수반하는 항체 변이체를 만들어 내기 위해서 행해져도 된다.
일 태양에 있어서, Fc 영역에 (직접적 또는 간접적으로) 부가된 푸코스를 결여하는 탄수화물 구조체를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 그와 같은 항체에 있어서의 푸코스의 양은, 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은, 예를 들어 WO2008/077546에 기재되어 있는 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분석에 의해 측정되는, Asn297에 부가된 모든 당구조체(예를 들어, 복합, 하이브리드, 및 고(高)만노스 구조체)의 합에 대한, Asn297에 있어서의 당쇄 내의 푸코스의 평균량을 계산하는 것에 의해 결정된다. Asn297은, Fc 영역의 297 위치의 근방에 위치하는 아스파라긴 잔기를 나타낸다(Fc 영역 잔기의 EU 넘버링). 그러나, 복수의 항체 사이의 근소한 서열의 다양성에 기인하여, Asn297은, 297 위치의 ±3 아미노산 상류 또는 하류, 즉 294위치 내지 300위치 사이에 위치하는 경우도 있을 수 있다. 그와 같은 푸코실화 변이체는, 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허출원공개 제2003/0157108호(Presta, L.); 제2004/0093621호 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)를 참조. "탈푸코실화" 또는 "푸코스 결손" 항체 변이체에 관한 간행물의 예는, US2003/0157108; WO2000/61739; WO2001/29246; US2003/0115614; US2002/0164328; US2004/0093621; US2004/0132140; US2004/0110704; US2004/0110282; US2004/0109865; WO2003/085119; WO2003/084570; WO2005/035586; WO2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)를 포함한다. 탈푸코실화 항체를 산생할 수 있는 세포주의 예는, 단백질의 푸코실화를 결여하는 Lec13 CHO 세포(Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); 미국 특허출원공개 제US2003/0157108호 A1, Presta, L; 및 WO2004/056312 A1, Adams et al., 특히 실시예 11) 및 녹아웃 세포주, 예를 들어 알파-1,6-푸코실트랜스페라제 유전자 FUT8 녹아웃 CHO 세포(예를 들어, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 및 WO2003/085107을 참조)를 포함한다.
예를 들어 항체의 Fc 영역에 부가된 2분기된 올리고당이 GlcNAc에 의해 2분되어 있는, 2분기의 올리고당을 갖는 항체 변이체가 추가로 제공된다. 그와 같은 항체 변이체는, 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 그와 같은 항체 변이체의 예는, 예를 들어, WO2003/011878(Jean-Mairet et al.); 미국 특허 제6,602,684호(Umana et al.); 및 US2005/0123546(Umana et al.)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부가된 올리고당 중에 적어도 1개의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체도 제공된다. 그와 같은 항체 변이체는, 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 그와 같은 항체 변이체는, 예를 들어, WO1997/30087(Patel et al.); WO1998/58964(Raju, S.); 및 WO1999/22764(Raju, S.)에 기재되어 있다.
c) Fc 영역 변이체
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체의 Fc 영역에 1개 또는 복수의 아미노산 수식을 도입하고, 그것에 의해 Fc 영역 변이체를 생성해도 된다. Fc 영역 변이체는, 1개 또는 복수의 아미노산 포지션에서 아미노산 수식(예를 들어, 치환)을 포함하는, 인간 Fc 영역 서열(예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 Fc 영역)을 포함해도 된다. 다른 태양에 있어서, 인간 Fc 변이체는, 키메라 인간 Fc 영역 서열(예를 들어, 인간 IgG1/4 또는 인간 IgG2/4 Fc 영역), 또는 1개 또는 복수의 아미노산 위치에 아미노산 개변(예를 들어 치환)을 추가로 포함하는 키메라 인간 Fc 영역 서열을 포함해도 된다.
특정의 태양에 있어서, 모두는 아니지만 몇몇 이펙터 기능을 구비하는 항체 변이체도, 본 발명의 고려 내에 있으며, 당해 이펙터 기능은, 항체를, 그 인비보에서의 반감기가 중요하지만, 특정의 이펙터 기능(보체 및 ADCC 등)은 불요 또는 유해한 경우의 적용에 바람직한 후보로 하는 것이다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/결핍을 확인하기 위해서, 인비트로 및/또는 인비보의 세포상해 측정을 행할 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체(FcR) 결합 측정은, 항체가 FcγR 결합성을 결여하는(따라서 ADCC 활성을 결여할 개연성이 높은) 한편으로 FcRn 결합능을 유지하는 것을 확인하기 위해서 행해질 수 있다. ADCC를 매개하는 프라이머리 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하지만, 한편 단구는 FcγRI, FcγRII, FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR의 발현은, Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)의 제464페이지의 Table 3에 정리되어 있다. 목적하는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 인비트로 측정법(어세이)의 비한정적인 예는, 미국 특허 제5,500,362호(예를 들어, Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) 참조) 및 Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 미국 특허 제5,821,337호(Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987) 참조)에 기재되어 있다. 혹은, 비방사성의 측정법을 이용해도 된다(예를 들어, ACT1(상표) non-radioactive cytotoxicity assay for flow cytometry(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); 및 CytoTox 96(등록상표) non-radioactive cytotoxicity assays법(Promega, Madison, WI) 참조). 이와 같은 측정법에 유용한 이펙터 세포는, 말초혈 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell: PBMC) 및 NK(natural killer: NK) 세포를 포함한다. 혹은 또는 추가로, 목적하는 분자의 ADCC 활성은, 예를 들어, Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)에 기재되는 바와 같은 동물 모델에 있어서, 인비보로 평가되어도 된다. 또한, 항체가 C1q에 결합할 수 없는 것, 따라서 CDC 활성을 결여하는 것을 확인하기 위해서, C1q 결합 측정을 행해도 된다. 예를 들어, WO2006/029879 및 WO2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조. 또한, 보체 활성화를 평가하기 위해서, CDC 측정을 행해도 된다(예를 들어, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004) 참조). 더욱이, FcRn 결합성 및 인비보에서의 클리어런스/반감기의 결정도, 당해 기술 분야에 있어서 알려진 방법을 이용하여 행할 수 있다(예를 들어 Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006) 참조).
감소한 이펙터 기능을 수반하는 항체는, Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327, 및 329의 1개 또는 복수의 치환을 수반하는 것을 포함한다(미국 특허 제6,737,056호). 이와 같은 Fc 변이체는, 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 수반하는 이른바 "DANA" Fc 변이체(미국 특허 제7,332,581호)를 포함하는, 아미노산 포지션 265, 269, 270, 297, 및 327의 2개 이상의 치환을 수반하는 Fc 변이체를 포함한다.
FcRs로의 증가 또는 감소한 결합성을 수반하는 특정의 항체 변이체가, 기술되어 있다. (미국 특허 제6,737,056호; WO2004/056312, 및 Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)을 참조.)
특정의 태양에 있어서, 항체 변이체는, ADCC를 개선하는 1개 또는 복수의 아미노산 치환(예를 들어, Fc 영역의 포지션 298, 333, 및/또는 334(EU 넘버링에서의 잔기)에서의 치환)을 수반하는 Fc 영역을 포함한다.
몇몇 태양에 있어서, 예를 들어 미국 특허 제6,194,551호, WO99/51642, 및 Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)에 기재되는 바와 같이, 개변된(즉, 증가했거나 감소했거나의 어느 한쪽인) C1q 결합성 및/또는 보체 의존성 세포상해(CDC)를 가져오는 개변이, Fc 영역에 있어서 이루어진다.
증가한 반감기, 및 신생아형 Fc 수용체(FcRn: 모체의 IgG류를 태아에게 이행시키는 역할을 부담한다(Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)))에 대한 증가한 결합성을 수반하는 항체가, 미국 특허출원공개 제2005/0014934호 A1(Hinton et al.)에 기재되어 있다. 이들 항체는, Fc 영역의 FcRn에 대한 결합성을 증가시키는 1개 또는 복수의 치환을 그 중에 수반하는 Fc 영역을 포함한다. 이와 같은 Fc 변이체는, Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 또는 434의 1개 또는 복수의 곳에서의 치환(예를 들어, Fc 영역 잔기 434의 치환(미국 특허 제7,371,826호))을 수반하는 것을 포함한다.
Fc 영역 변이체의 다른 예에 대해서는, Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); 미국 특허 제5,648,260호; 미국 특허 제5,624,821호; 및 WO94/29351도 참조.
d) 시스테인 개변 항체 변이체
특정의 태양에 있어서, 항체의 1개 또는 복수의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된, 시스테인 개변 항체(예를 들어, "thioMAbs")를 만들어 내는 것이 바람직할 것이다. 특정의 태양에 있어서, 치환을 받는 잔기는, 항체의, 억세스 가능한 부위에 생긴다. 그들 잔기를 시스테인으로 치환하는 것에 의해, 반응성의 싸이올기가 항체의 억세스 가능한 부위에 배치되고, 당해 반응성의 싸이올기는, 당해 항체를 다른 부분(약제 부분 또는 링커-약제 부분 등)에 컨주게이트하여 본 명세서에서 추가로 상술하는 바와 같이 이뮤노컨주게이트를 만들어 내는 데 사용되어도 된다. 특정의 태양에 있어서, 이하의 잔기의 임의의 1개 또는 복수가, 시스테인으로 치환되어도 된다: 경쇄의 V205(Kabat 넘버링); 중쇄의 A118(EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400(EU 넘버링). 시스테인 개변 항체는, 예를 들어, 미국 특허 제7,521,541호에 기재되는 바와 같이 하여 생성되어도 된다.
e) 항체 유도체
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체는, 당해 기술 분야에 있어서 알려져 있고 또한 용이하게 입수 가능한 추가의 비단백질 부분을 포함하도록, 추가로 수식되어도 된다. 항체의 유도체화에 적합한 부분은, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 수용성 폴리머를 포함한다. 수용성 폴리머의 비한정적인 예는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 에틸렌 글라이콜/프로필렌 글라이콜의 코폴리머, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리바이닐 알코올, 폴리바이닐 피롤리돈, 폴리-1,3-다이옥솔레인, 폴리-1,3,6,-트라이옥세인, 에틸렌/무수 말레산 코폴리머, 폴리아미노산(호모폴리머 또는 랜덤 코폴리머의 어느 것이어도), 및, 덱스트란 또는 폴리(n-바이닐 피롤리돈) 폴리에틸렌 글라이콜, 폴리프로필렌 글라이콜 호모폴리머, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 코폴리머, 폴리옥시에틸화 폴리올류(예를 들어 글리세롤), 폴리바이닐 알코올, 및, 이들의 혼합물을 포함한다. 폴리에틸렌 글라이콜 프로피온 알데하이드는, 그의 물[水]에 대한 안정성 때문에, 제조에 있어서 유리할 것이다. 폴리머는, 어떠한 분자량이어도 되고, 분기하고 있어도 하고 있지 않아도 된다. 항체에 부가되는 폴리머의 수에는 폭이 있어도 되고, 1개 이상의 폴리머가 부가된다면 그것들은 동일한 분자여도 되고, 상이한 분자여도 된다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 폴리머의 수 및/또는 타입은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 개선되어야 할 항체의 특정의 특성 또는 기능, 항체 유도체가 규정의 조건하에서의 요법에 사용되는지 여부 등에 대한 고려에 기초하여 결정할 수 있다.
다른 태양에 있어서, 항체와, 방사선에 폭로하는 것에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질 부분의 컨주게이트가 제공된다. 일 태양에 있어서, 비단백질 부분은, 카본 나노튜브이다(Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). 방사선은 어떠한 파장이어도 되고, 또한 이들로 한정되는 것은 아니지만, 통상의 세포에는 해를 주지 않지만 항체-비단백질 부분에 근접한 세포를 사멸시키는 온도까지 비단백질 부분을 가열하는 파장을 포함한다.
B. 재조합의 방법 및 구성
예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호에 기재되는 바와 같이, 항체는 재조합의 방법이나 구성을 이용하여 제조할 수 있다. 일 태양에 있어서, 본 명세서에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체를 코딩하는, 단리된 핵산이 제공된다. 그와 같은 핵산은, 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열(예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코딩해도 된다. 추가적인 태양에 있어서, 이와 같은 핵산을 포함하는 1개 또는 복수의 벡터(예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가적인 태양에 있어서, 이와 같은 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이와 같은 태양의 하나로는, 숙주 세포는, (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는, (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제 1 벡터와 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터를 포함한다(예를 들어, 형질 전환되어 있다). 일 태양에 있어서, 숙주 세포는, 진핵성이다(예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포) 또는 림프액계의 세포(예를 들어, Y0, NS0, Sp2/0 세포)). 일 태양에 있어서, 항잠재형 TGF-β1 항체의 발현에 적합한 조건하에서, 전술한 바와 같이 당해 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 것, 및 임의로, 당해 항체를 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 회수하는 것을 포함하는, 항잠재형 TGF-β1 항체를 제작하는 방법이 제공된다.
항잠재형 TGF-β1 항체의 재조합 제조를 위해서, (예를 들어, 전술한 것 등의) 항체를 코딩하는 핵산을 단리하여, 추가적인 클로닝 및/또는 숙주 세포 중에서의 발현을 위해서, 1개 또는 복수의 벡터에 삽입한다. 그와 같은 핵산은, 종래의 수순을 이용하여 용이하게 단리 및 서열 결정될 수 있다(예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써).
항체를 코딩하는 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는, 본 명세서에 기재된 원핵세포 또는 진핵세포를 포함한다. 예를 들어, 항체는, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요해지지 않는 경우는, 세균으로 제조해도 된다. 세균에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 관해서, 예를 들어, 미국 특허 제5,648,237호, 제5,789,199호, 및 제5,840,523호를 참조. (더하여, 대장균에 있어서의 항체 단편의 발현에 대해 기재한 Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254도 참조.) 발현 후, 항체는 세균 세포 페이스트로부터 가용성 프랙션 중에 단리되어도 되고, 또한 추가로 정제할 수 있다.
원핵생물에 더하여, 부분적인 또는 완전한 인간의 글리코실화 패턴을 수반하는 항체의 산생을 가져오는, 글리코실화 경로가 "인간화"되어 있는 균류 및 효모의 주를 포함하는, 사상균 또는 효모 등의 진핵성의 미생물은, 항체 코드 벡터의 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004) 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)을 참조.
다세포 생물(무척추 생물 및 척추 생물)에서 유래하는 것도 또한, 글리코실화된 항체의 발현을 위해서 적합한 숙주 세포이다. 무척추 생물 세포의 예는, 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 곤충 세포와의 접합, 특히 Spodoptera frugiperda 세포의 형질 전환에 이용되는, 수많은 바큘로바이러스주가 동정되어 있다.
식물 세포 배양물도, 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,959,177호, 제6,040,498호, 제6,420,548호, 제7,125,978호, 및 제6,417,429호(트랜스제닉 식물에서 항체를 산생하기 위한, PLANTIBODIES(상표) 기술을 기재)를 참조.
척추 동물 세포도 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 부유 상태에서 증식하도록 적응된 포유 동물 세포주는 유용할 것이다. 유용한 포유 동물 숙주 세포주의 다른 예는, SV40으로 형질 전환된 원숭이 신장 CV1주(COS-7); 인간 태아성 신장 주(Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977) 등에 기재된 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 서톨리 세포(Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980) 등에 기재된 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카녹색원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁 경부암 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK); Buffalo계 래트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유방암(MMT 060562); TRI 세포(예를 들어, Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)에 기재); MRC5 세포; 및 FS4 세포 등이다. 다른 유용한 포유 동물 숙주 세포주는, DHFR-CHO 세포(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))를 포함하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 Y0, NS0, 및 Sp2/0 등의 골수종 세포주를 포함한다. 항체 산생에 적합한 특정 포유 동물 숙주 세포주의 총설로서, 예를 들어, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)을 참조.
C. 측정법(어세이)
본 명세서에서 제공되는 항잠재형 TGF-β1 항체는, 당해 기술 분야에 있어서 알려져 있는 여러 가지 측정법에 의해, 동정되거나, 스크리닝되거나, 또는 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 밝혀져도 된다.
1. 결합 어세이 및 다른 어세이
하나의 국면에 있어서, 본 발명의 항체는, 예를 들어, 공지된 방법, 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯, 표면 플라즈몬 공명(예를 들어, BIACORE(등록상표) 또는 마찬가지의 기술(예를 들어, KinExa 혹은 OCTET(등록상표))) 등에 의해, 그 항원 결합 활성에 대해 시험된다.
다른 국면에 있어서, 잠재형 TGF-β1에 대한 결합에 관해서 본 명세서에 기재되는 임의의 항잠재형 TGF-β1 항체, 바람직하게는 hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191 또는 hT0947AE09-SG191과 경합하는 항체를 동정하기 위해서, 경합 어세이가 사용될 수 있다. 특정의 태양에 있어서, 그와 같은 경합 항체는, 본 명세서에 기재되는 임의의 항잠재형 TGF-β1 항체, 바람직하게는 hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191 또는 hT0947AE09-SG191에 의해 결합되는 것과 같은 에피토프(예를 들어, 직쇄상 또는 입체 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 매핑하기 위한 예시적인 방법의 상세는, Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)에 있어서의 Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols"에 제공되어 있다. 에피토프를 매핑 하는 방법은, X선 결정학 및 알라닌 스캔 변이 유발법을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
특정의 태양에 있어서, 그와 같은 경합 항체가 과잉으로 존재하는 경우, 그것은, TGF-β1에 대한 참조 항체의 결합을, 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 그 이상 블록한다(감소시킨다). 몇몇의 예에 있어서, 결합은, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 그 이상 저해된다. 특정의 태양에 있어서, 그와 같은 경합 항체는, 본 명세서에 기재되는 항잠재형 TGF-β1 항체에 의해 결합되는 것과 같은 에피토프(예를 들어, 직쇄상 또는 입체 에피토프)에 결합한다. 추가적인 국면에 있어서, 참조 항체는, hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191 또는 hT0947AE09-SG191이다.
예시적인 경합 어세이에 있어서는, 고정된 잠재형 TGF-β1이, 잠재형 TGF-β1에 결합하는 제 1 표지 항체(참조 항체)(예를 들어, hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191 또는 hT0947AE09-SG191) 및 잠재형 TGF-β1에 대한 결합에 관해서 제 1 항체와 경합하는 그 능력에 대해 시험되는 제 2 비표지 항체를 포함하는 용액 중에서 인큐베이트된다. 제 2 항체는, 하이브리도마 상청 중에 존재할 수 있다. 대조로서, 고정된 잠재형 TGF-β1은, 제 1 표지 항체를 포함하지만 제 2 비표지 항체를 포함하지 않는 용액 중에서 인큐베이트된다. TGF-β1에 대한 제 1 항체의 결합을 허용하는 조건하에서의 인큐베이트 후, 과잉한 미결합 항체가 제거되고, 고정된 잠재형 TGF-β1에 결합한 표지의 양이 측정된다. 시험 샘플에 있어서, 고정된 잠재형 TGF-β1에 결합한 표지의 양이 대조 샘플보다도 실질적으로 감소하고 있는 경우, 그것은, 제 2 항체가, 잠재형 TGF-β1에 대한 결합에 관해서 제 1 항체와 경합함을 나타내고 있다. Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)를 참조.
특정의 태양에 있어서, 세포 표면 잠재형 TGF-β1에 대한 항잠재형 TGF-β1 항체의 결합은, 공지된 방법, 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯, BIAcore, 플로 사이토메트리 등에 의해 시험될 수 있다. 예를 들어, 잠재형 TGF-β1을 발현하는 세포는, PE 혹은 APC에 직접적으로 컨주게이트된 항잠재형 TGF-β1 항체, 또는 컨주게이트되어 있지 않은 항잠재형 TGF-β1 항체와 그 후의 PE 혹은 APC 컨주게이트 2차 항체의 어느 것인가와 접촉시킬 수 있어, 세포 표면 잠재형 TGF-β1의 염색이 검출될 수 있다. 예를 들어, Oida et al., PLoS One. 2010 Nov 24;5(11):e15523; Su et al, Hum Mol Genet. 2015 Jul 15;24(14):4024-36을 참조.
2. 활성 어세이
하나의 국면에 있어서, 생물학적 활성을 갖는 항잠재형 TGF-β1 항체를 동정하기 위한 어세이가 제공된다. 생물학적 활성은, 예를 들어, 잠재형 TGF-β1의 활성화를 저해하는 것, 잠재형 TGF-β1로부터의 성숙 TGF-β1의 방출을 저해하는 것, 잠재형 TGF-β1로부터의 성숙 TGF-β1의 프로테아제 매개 방출을 저해하는 것, 잠재형 TGF-β1의 LAP 영역의 프로테아제 매개 절단을 저해하지 않고 잠재형 TGF-β1로부터의 성숙 TGF-β1의 프로테아제 매개 방출을 저해하는 것, 잠재형 TGF-β1에 대한 프로테아제의 억세스를 블로킹하지 않고 잠재형 TGF-β1로부터의 성숙 TGF-β1의 프로테아제 매개 방출을 저해하는 것, 프로테아제가 잠재형 TGF-β1의 LAP 영역을 절단하는 것을 가능하게 하면서 잠재형 TGF-β1로부터의 성숙 TGF-β1의 프로테아제 매개 방출을 저해하는 것, 인테그린 매개 TGF-β1 활성화를 저해하지 않거나 또는 부분적으로 저해하면서 잠재형 TGF-β1로부터의 성숙 TGF-β1의 프로테아제 매개 방출을 저해하는 것 등을 포함한다. 인비보 및/또는 인비트로로 그와 같은 생물학적 활성을 갖는 항체도 또한 제공된다.
특정의 태양에 있어서, 본 발명의 항체는, 그와 같은 생물학적 활성에 대해 시험된다.
몇몇 태양에 있어서, 시험 항체가 잠재형 TGF-β1의 활성화를 저해하는지, 즉, 잠재형 TGF-β1로부터의 성숙 TGF-β1의 방출을 저해하는지 여부는, 잠재형 TGF-β1의 활성화 인자(예를 들어, 프로테아제, 인테그린, 다른 비프로테아제 활성화 인자 등)를 시험 항체의 존재하 또는 비존재하에서 잠재형 TGF-β1과 접촉시킨 후에, 당 기술 분야에서 공지된 방법, 예를 들어 전기 영동, 크로마토그래피, 면역 블롯 분석, 효소 연결 면역 흡착 어세이(ELISA) 또는 질량 분석을 이용하여 성숙 TGF-β1을 검출하는 것에 의해 결정된다. 일례에 있어서, 활성화 인자는 단리되어 있는 것(예를 들어, 단리된 프로테아제 또는 인테그린) 및/또는 단리되어 있지 않은 것(예를 들어, 인테그린을 포함하는 마우스, 원숭이 또는 인간 PBMC)일 수 있다. 잠재형 TGF-β1의 활성화, 즉, 잠재형 TGF-β1로부터의 성숙 TGF-β1의 방출은, 활성화 인자의 비존재하에서도 일어나는(잠재형 TGF-β1의 자연발생적 활성화) 것도 공지이다. 몇몇 태양에 있어서, 시험 항체가 잠재형 TGF-β1의 자연발생적 활성화를 저해하는지 여부는, 잠재형 TGF-β1을 시험 항체와 함께 또는 시험 항체 없이 인큐베이트한 후에, 상기의 방법을 이용하여 성숙 TGF-β1을 검출하는 것에 의해 결정된다. 몇몇 태양에 있어서, 시험 항체의 비존재하에서 검출되는 양과 비교하여 시험 항체의 존재하에서(시험 항체와 접촉시킨 후에) 성숙 TGF-β1의 양의 감소가 검출되는 경우, 그 시험 항체는, 잠재형 TGF-β1의 활성화를 저해할 수 있는 항체라고 동정된다. 일례에 있어서, 성숙 TGF-β1의 양은, 감소 또는 증가 모두, 성숙 TGF-β1의 농도(예를 들어, g/ml, mg/ml, 마이크로그램/ml, ng/ml 또는 pg/ml 등)로 환산하여 측정될 수 있다. 다른 예에 있어서, 성숙 TGF-β의 양은, 감소 또는 증가 모두, 성숙 TGF-β에 직접적 또는 간접적으로 결합된 표지의 광학 밀도(O.D.)(예를 들어, mm 또는 nm의 파장 등)로 환산하여 측정될 수 있다.
특정의 태양에 있어서, TGF-β1 활성화의 저해는, 마찬가지의 조건하에서의 음성 대조와 비교하여, 그 어세이에 있어서의 성숙 TGF-β1의 양의 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 혹은 40%, 또는 그 이상의 감소를 포함한다. 몇몇 태양에 있어서, 그것은, 적어도 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 혹은 95%, 또는 그 이상의 TGF-β1 활성화의 저해, 즉, 성숙 TGF-β1의 방출의 저해를 나타낸다.
몇몇 태양에 있어서, 시험 항체가 잠재형 TGF-β1의 활성화를 저해하는지, 즉, 잠재형 TGF-β1로부터의 성숙 TGF-β1의 방출을 저해하는지 여부는, 성숙 TGF-β1 활성, 예를 들어, TGF-β1 수용체에 결합하는 활성 또는 TGF-β1 수용체를 발현하는 세포에 있어서 시그널 전달을 매개하는 활성 등을 검출하는 것에 의해서도 결정된다. 몇몇 태양에 있어서, TGF-β1 수용체에 대한 성숙 TGF-β1의 결합은, 수용체 결합 어세이를 이용하여 검출될 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, TGF-β1 시그널 전달을 매개하는 활성은, TGF-β1/Smad 경로의 활성화를 검출하는 것에 의해 결정될 수 있다. 그와 같은 어세이에 있어서 유용한 세포는, 내인성 TGF-β1 수용체를 발현하는 것 또는 TGF-β1 수용체 유전자를 이용한 세포의 트랜스펙션에 의해 생성된 것일 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재되는 실시예에 있어서 사용된 HEK-Blue(상표) TGF-β 세포 또는 TGF-β1 수용체를 코딩하는 도입 유전자를 발현하도록 일과적 또는 안정적으로 유전자 개변된 것이 사용될 수 있다. TGF-β1 매개 시그널 전달은, 시그널 전달 경로에 있어서 임의의 레벨로, 예를 들어, Smad 폴리펩티드의 인산화를 시험하는 것에 의해, 수용체 유전자를 포함하는 TGF-β1에 의해 조절되는 유전자의 발현을 시험하는 것에 의해, 또는 TGF-β1 의존적 세포의 증식을 측정하는 것에 의해, 검출될 수 있다.
몇몇 태양에 있어서, TGF-β1 시그널 전달을 매개하는 활성은 또한, Smad 폴리펩티드의 인산화를 시험하는 것에 의해 TGF-β1/Smad 경로의 활성화를 검출하는 것에 의해서도 결정할 수 있다(예를 들어, Fukasawa et. al., Kidney International. 65(1):63-74 (2004) 및 Ganapathy et al., Molecular Cancer 26;9:122 (2010)을 참조). 다른 태양에 있어서, TGF-β1 시그널 전달을 매개하는 활성은 BAE 세포의 "상처 입은" 단층 배양물에 있어서 세포 유주를 저해하는 TGF-β의 능력을 시험하는, 세포 증식을 저해하는 TGF-β의 능력을 시험하는, 프라스미노겐 활성화 인자(PA) 활성을 억제하는 TGF-β의 능력을 시험하는, 플라스미노겐 활성화 인자 저해 인자 1(PAI-1)을 상방 조절하는 TGF-β의 능력을 시험하는 등에 의해 결정할 수 있다(Mazzieri et. al., Methods in Molecular Biology 142:13-27(2000)을 참조).
TGF-β1 활성화의 저해는 또한, 실시예에 기재하여 예시하는 방법을 이용하여, 검출 및/또는 측정할 수 있다. 이들 또는 다른 적절한 타입의 어세이를 이용함으로써, 시험 항체는, TGF-β1의 활성화를 저해할 수 있는 것에 관해서 스크리닝될 수 있다. 특정의 태양에 있어서, TGF-β1 활성화의 저해는, 마찬가지의 조건하에서의 음성 대조와 비교하여, 그 어세이에 있어서의 TGF-β1 활성화의 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 혹은 40%, 또는 그 이상의 감소를 포함한다. 몇몇 태양에 있어서, 그것은, 적어도 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 혹은 95% 또는 그 이상의 TGF-β1 활성화의 저해를 나타낸다. 특정의 태양에 있어서, TGF-β1 활성화의 저해는, 마찬가지의 조건하에서의 음성 대조와 비교하여, 그 어세이로 검출되는 성숙 TGF-β1의 양의 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 혹은 40%, 또는 그 이상의 감소를 포함한다. 몇몇 태양에 있어서, 그것은, 적어도 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 혹은 95%, 또는 그 이상의 성숙 TGF-β1의 양의 감소를 나타낸다.
몇몇 태양에 있어서, 시험 항체가 잠재형 TGF-β1의 LAP 부분의 절단을 저해하는지 여부는, 시험 항체의 존재하 또는 비존재하에서 프로테아제를 잠재형 TGF-β1과 접촉시킨 후에, 당 기술 분야에서 공지된 다양한 방법, 예를 들어 전기 영동, 크로마토그래피, 면역 블롯 분석, 효소 연결 면역 흡착 어세이(ELISA) 또는 질량 분석을 이용하여, 잠재형 TGF-β1의 절단 산물 및/또는 비절단 잠재형 TGF-β1을 검출하는 것에 의해 결정된다. 예를 들어, 단백질 태그(예를 들어, FLAG 태그 등)가 잠재형 TGF-β1의 LAP 영역의 N말단에 부가되는 경우, 프로테아제 매개 절단이 일어났을 때에, 단백질 태그가 부가된 부분이 절단되어 버린다. 따라서, 잠재형 TGF-β1의 절단 산물은, 단백질 태그를 갖지 않는 잠재형 TGF-β1(혹은 잠재형 TGF-β1의 LAP 영역)을 검출하는 것에 의해 검출될 수 있고 및/또는 비절단 잠재형 TGF-β1은, 단백질 태그를 가지는 잠재형 TGF-β1을 검출하는 것에 의해 검출될 수 있다.
다른 예로서, 단백질 태그(예를 들어, FLAG 태그 등)가 잠재형 TGF-β1의 LAP 영역의 N말단에 부가되고, 또한 프로테아제에 의한 절단 부위의 장소가 잠재형 TGF-β1의 LAP 영역의 N말단 부근이 아닌 경우, 프로테아제 매개 절단이 일어났을 때에, 단백질 태그를 갖는 LAP 영역이 단축된다. 따라서, 잠재형 TGF-β1의 절단 산물은, 단백질 태그를 갖는 단축된 LAP 영역을 갖는 잠재형 TGF-β1(또는 잠재형 TGF-β1의 단축된 LAP 영역)을 검출하는 것에 의해 검출할 수 있다.
몇몇 태양에 있어서, 시험 항체의 비존재하에서 검출되는 양과 비교하여 시험 항체의 존재하에서(또는 시험 항체와의 접촉 후에) 잠재형 TGF-β1의 절단 산물의 양의 감소가 검출되는 경우, 그 시험 항체는, 잠재형 TGF-β1의 절단을 저해할 수 있는 항체라고 동정된다. 반대로, 시험 항체의 비존재하에서 검출되는 양과 비교하여 시험 항체의 존재하에서(또는 시험 항체와의 접촉 후에) 잠재형 TGF-β1의 절단 산물의 양이 유의하게 감소하지 않는 경우, 그 시험 항체는, 잠재형 TGF-β1의 절단을 저해하지 않는 항체라고 동정된다. 몇몇 태양에 있어서, 시험 항체의 비존재하에서 검출되는 양과 비교하여 시험 항체의 존재하에서(또는 시험 항체와의 접촉 후에) 비절단 잠재형 TGF-β1의 양의 증가가 검출되는 경우, 그 시험 항체는, 잠재형 TGF-β1의 절단을 저해할 수 있는 항체라고 동정된다. 반대로, 시험 항체의 비존재하에서 검출되는 양과 비교하여 시험 항체의 존재하에서(또는 시험 항체와의 접촉 후에) 비절단 잠재형 TGF-β1의 양이 유의하게 증가하지 않는 경우, 그 시험 항체는, 잠재형 TGF-β1의 절단을 저해하지 않는 항체라고 동정된다. 특정의 태양에 있어서, 시험 항체가 잠재형 TGF-β1로의 프로테아제의 억세스를 블록하는지 여부는, 프로테아제와 잠재형 TGF-β1 사이의 단백질 상호작용의 검출을 위한 방법, 예를 들어 ELISA 또는 표면 플라즈몬 공명(예를 들어, BIACORE(등록상표) 혹은 마찬가지의 기술(예를 들어, KinExa 혹은 OCTET(등록상표)))에 의해 결정된다. 시험 항체의 비존재하에서 검출되는 상호작용과 비교하여 시험 항체의 존재하에서(또는 시험 항체와의 접촉 후에) 프로테아제와 잠재형 TGF-β1 사이의 상호작용의 감소가 검출되는 경우, 그 시험 항체는, 잠재형 TGF-β1로의 프로테아제의 억세스를 블록할 수 있는 항체라고 동정된다.
특정의 태양에 있어서, 잠재형 TGF-β1의 절단의 비저해는, 마찬가지의 조건하에서의 음성 대조와 비교하여, 그 어세이에 있어서의 잠재형 TGF-β1의 절단 산물의 양의 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 혹은 40%, 또는 그 이상의 증가를 포함한다. 몇몇 태양에 있어서, 잠재형 TGF-β1의 절단의 비저해는, 마찬가지의 조건하에서의 음성 대조와 비교하여, 그 어세이에 있어서의 비절단 잠재형 TGF-β1의 양의 적어도 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하의 증가를 포함한다.
몇몇 태양에 있어서, 항잠재형 TGF-β1 항체는, 예를 들어 치료약으로서의 유효성을 평가하기 위해서, 다른 생물학적 활성 어세이에 제공해도 된다. 그와 같은 어세이는 당 기술 분야에 있어서 공지이며, 항체의 표적 항원 및 사용 목적에 의해 정해진다. 예를 들어, 항잠재형 TGF-β1 항체에 의한 TGF-β1 차단의 생물학적 효과는, 편측 요관 폐색(Unilateral Ureteral Obstruction, UUO) 유도 마우스 신장 섬유증 모델(예를 들어 Chevalier RL et al., Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney Int. 2009 Jun;75(11):1145-1152에 기재되어 있다), 콜린 결핍 L-아미노산 한정 고지방식(CDAHFD) 유도 NASH/간 섬유증 마우스 모델, bleomycin(BLM) 유도 폐 섬유증 마우스 모델, 및/또는 동계 종양 모델(예를 들어, Mariathasan S et al., TGF-beta attenuates tumour response to PD-L1 blockade by contributing to exclusion of T cells. Nature. 2018 Feb 22;554(7693):544-548에 기재되어 있다)에 있어서 평가할 수 있다. 추가적인 태양에 있어서, 항잠재형 TGF-β1 항체는, 본 명세서에 기재된 생물학적 활성 어세이에 제공해도 된다.
3. 스크리닝 방법
하나의 국면에 있어서, 본 발명의 항체를 스크리닝하기 위한 방법은, 본 명세서에 기재되고 또한 당 기술 분야에서 공지된 다양한 방법을 포함한다. 예를 들어, 항잠재형 TGF-β1 항체를 스크리닝하기 위한 방법은, 이하의 공정을 포함한다:
(a) 잠재형 TGF-β1 및 프로테아제를 포함하는 생물학적 샘플을 시험 항체와 접촉시키는 공정,
(b) (i) 시험 항체가 잠재형 TGF-β1의 LAP 영역의 절단을 저해하는지 여부, 및 (ii) 시험 항체가 잠재형 TGF-β1의 활성화를 저해하는지 여부를 검출하는 공정, 및
(c) 잠재형 TGF-β1의 LAP 부분의 프로테아제 매개 절단을 저해하지 않고 잠재형 TGF-β1의 활성화를 저해하는 시험 항체를 선택하는 공정.
혹은, 상기의 공정(b) 및 (c)는 아닌, 항잠재형 TGF-β1 항체를 스크리닝하기 위한 방법은, 예를 들어, 이하의 공정(b) 및 (c)를 포함한다:
(b) (i) 비절단 잠재형 TGF-β1의 양 및 (ii) 성숙 TGF-β1의 양을 측정하는 공정, 및
(c) 시험 항체가 비존재인 경우와 비교하여 비절단 잠재형 TGF-β1의 양이 유의하게 증가하지 않고, 성숙 TGF-β1의 양이 감소하는 경우, 잠재형 TGF-β1의 LAP 영역의 프로테아제 매개 절단을 저해하지 않고 잠재형 TGF-β1로부터의 성숙 TGF-β1의 프로테아제 매개 방출을 저해하는 상기 시험 항체를 선택하는 공정.
혹은, 상기의 공정(b) 및 (c)는 아닌, 항잠재형 TGF-β1 항체를 스크리닝하기 위한 방법은, 예를 들어, 이하의 공정(b) 및 (c)를 포함한다:
(b) (i) 잠재형 TGF-β1의 절단 산물의 양 및 (ii) 성숙 TGF-β1 활성의 레벨을 측정하는 공정, 및
(c) 시험 항체가 비존재인 경우와 비교하여 절단 산물의 양이 유의하게 감소하지 않고, 성숙 TGF-β1 활성의 레벨이 감소하는 경우, 잠재형 TGF-β1의 LAP 영역의 프로테아제 매개 절단을 저해하지 않고 잠재형 TGF-β1의 프로테아제 매개 활성화를 저해하는 상기 시험 항체를 선택하는 공정.
더욱이, 본 발명은, 항잠재형 TGF-β1 항체를 제조하기 위한 방법을 제공하고, 본 방법은, 예를 들어, 상기의 공정(a) 내지 (c)에 더하여, 이하의 공정(d) 및 (e)를 포함한다:
(d) 공정(c)에 있어서 선택된 항잠재형 TGF-β1 항체의 아미노산 서열 정보를 입수하는 공정, 및
(e) 해당 항잠재형 TGF-β1 항체를 코딩하는 유전자를 숙주 세포에 도입하는 공정.
이 문맥에 있어서, 예를 들어 "비절단 잠재형 TGF-β1의 양이 유의하게 증가하지 않는다" 및 "(잠재형 TGF-β1의) 절단 산물의 양이 유의하게 감소하지 않는다"라는 문구에 있어서의 "유의하게 증가/감소하지 않는다"라는 용어는, 그 증가/감소의 레벨/정도가 제로일 수 있다, 또는 제로는 아닐지도 모르지만 거의 제로이다, 또는 기술적으로 무시할 수 있거나 혹은 당업자에 의해 현실적/실질적으로 제로라고 보이는 데 충분할 정도로 극히 낮은 것일 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 면역 블롯 분석에 있어서, 연구자가 비절단 잠재형 TGF-β1에 관해서 어떠한 유의한 시그널/밴드(또는 비교적 높은 또는 강한 시그널)도 검출 또는 관찰할 수 없는 경우, 그 비절단 잠재형 TGF-β1의 양은 "유의하게 증가하지 않는다", 또는 (잠재형 TGF-β1의) 절단 산물의 양은 "유의하게 감소하지 않는다"라고 보인다. 게다가, "유의하게 증가/감소하지 않는다"라는 용어는, "실질적으로 증가/감소하지 않는다"라는 용어와 바꿔 말하기 가능하게 사용된다.
몇몇 태양에 있어서, 시험 항체가 잠재형 TGF-β1의 LAP 영역의 절단을 저해하는지 여부, 및 시험 항체가 잠재형 TGF-β1의 활성화를 저해하는지 여부는, 본 명세서에 기재되고 또한 당 기술 분야에서 공지된 다양한 어세이에 의해 결정할 수 있다.
D. 이뮤노컨주게이트
본 발명은 또한, 1개 또는 복수의 세포상해제(예를 들어 화학요법제 또는 화학요법약, 증식 저해제, 독소(예를 들어 세균, 진균, 식물 혹은 동물 기원의 단백질 독소, 효소적으로 활성인 독소, 혹은 그들의 단편) 또는 방사성 동위체)에 컨주게이트된 본 명세서의 항잠재형 TGF-β1 항체를 포함하는 이뮤노컨주게이트를 제공한다.
일 태양에 있어서, 이뮤노컨주게이트는, 항체가, 이들로 한정되는 것은 아니지만 이하를 포함하는 1개 또는 복수의 약제에 컨주게이트된, 항체-약제 컨주게이트(antibody-drug conjugate: ADC)이다: 메이탄시노이드(미국 특허 제5,208,020호, 제5,416,064호, 및 유럽 특허 제0,425,235호 B1 참조); 예를 들어 모노메틸오리스타틴 약제 부분 DE 및 DF(MMAE 및 MMAF)(미국 특허 제5,635,483호 및 제5,780,588호 및 제7,498,298호 참조) 등의 오리스타틴; 돌라스타틴; 칼리케아마이신 또는 그 유도체(미국 특허 제5,712,374호, 제5,714,586호, 제5,739,116호, 제5,767,285호, 제5,770,701호, 제5,770,710호, 제5,773,001호, 및 제5,877,296호; Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); 및 Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998) 참조); 다우노마이신 또는 독소루비신 등의 안트라사이클린(Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); 및 미국 특허 제6,630,579호 참조); 메토트렉세이트; 빈데신; 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀, 및 오르타탁셀 등의 탁세인; 트리코테센; 및 CC1065.
다른 태양에 있어서, 이뮤노컨주게이트는, 이들로 한정되는 것은 아니지만 이하를 포함하는 효소적으로 활성인 독소 또는 그의 단편에 컨주게이트된, 본 명세서에 기재된 항체를 포함한다: 디프테리아 A쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A쇄(녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A쇄, 아브린 A쇄, 모데신 A쇄, 알파-사르신, 유동나무(Aleurites fordii) 단백질, 다이안틴 단백질, 미국자리공(Phytolacca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 여주(momordica charantia) 저해제, 쿠르신(curcin), 크로틴, 비누풀(saponaria officinalis) 저해제, 겔로닌, 미토겔린(mitogellin), 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센.
다른 태양에 있어서, 이뮤노컨주게이트는, 방사성 컨주게이트를 형성하기 위해서 방사성 원자에 컨주게이트된 본 명세서에 기재된 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위체가 방사성 컨주게이트의 제조에 이용 가능하다. 예는, 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 212Pb 및 Lu의 방사성 동위체를 포함한다. 방사성 컨주게이트를 검출을 위해서 사용하는 경우, 방사성 컨주게이트는, 신티그래피 검사용의 방사성 원자(예를 들어 Tc-99m 혹은 123I), 또는, 핵자기 공명(NMR) 이미징(자기 공명 이미징, MRI로서도 알려짐)용의 스핀 표지(예를 들어 여기에서도 아이오딘-123, 아이오딘-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망가니즈, 또는 철)를 포함할 수 있다.
항체 및 세포상해제의 컨주게이트는, 다양한 2작용성 단백질 연결제를 이용하여 제작될 수 있다. 예를 들어 N-석신이미딜-3-(2-피리딜다이싸이오)프로피오네이트(SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥세인-1-카복실레이트(SMCC), 이미노싸이올레인(IT), 이미도에스터의 2작용성 유도체(예를 들어, 아디프이미드산 다이메틸 HCl), 활성 에스터(예를 들어, 수베르산 다이석신이미딜), 알데하이드(예를 들어, 글루타르알데하이드), 비스-아자이도 화합물(예를 들어, 비스(p-아자이도벤조일)헥세인다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예를 들어, 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이아이소사이아네이트(예를 들어, 톨루엔 2,6-다이아이소사이아네이트), 및 비스 활성 불소 화합물(예를 들어, 1,5-다이플루오로-2,4-다이나이트로벤젠)이다. 예를 들어, 리신 면역 독소는, Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)에 기재된 바와 같이 하여 조제될 수 있다. 탄소-14 표지 된 1-아이소싸이오싸이아네이토벤질-3-메틸다이에틸렌 트라이아민펜타아세트산(MX-DTPA)은, 항체로의 방사성 핵종의 컨주게이션을 위한 예시적인 킬레이트제이다. WO94/11026을 참조. 링커는, 세포 내에서의 세포상해약의 방출을 촉진하는 "절단 가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산불안정성 링커, 펩티다제 감수성 링커, 광불안정성 링커, 다이메틸 링커, 또는 다이설파이드 함유 링커(Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); 미국 특허 제5,208,020호)가 사용될 수 있다.
본 명세서의 이뮤노컨주게이트 또는 ADC는, (예를 들어, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A로부터) 시판되고 있는 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB(석신이미딜-(4-바이닐설폰)벤조에이트)를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 가교 시약을 이용하여 조제되는 컨주게이트를 명시적으로 고려하지만, 이들로 한정되지 않는다.
E. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에 제공되는 항잠재형 TGF-β1 항체는 모두, 생물학적 샘플에 있어서 TGF-β1, 예를 들어 잠재형 TGF-β1의 존재를 검출하는 데 유용하다. "검출"이라는 용어는, 본 명세서에서 사용되는 경우, 정량적 또는 정성적 검출/측정을 포함한다. 특정의 태양에 있어서, 생물학적 샘플은, 세포 또는 조직, 예를 들어 혈청, 전혈, 혈장, 생검 샘플, 조직 샘플, 세포 현탁물, 타액, 담, 구강액, 뇌척수액, 양수, 복수, 모유, 초유, 유선 분비물, 림프액, 소변, 땀, 누액, 위액, 활액, 복강액, 안구액, 및 점액을 포함한다.
일 태양에 있어서, 진단 또는 검출 방법에 있어서 사용하기 위한 항잠재형 TGF-β1 항체가 제공된다. 추가적인 국면에 있어서, 생물학적 샘플에 있어서 TGF-β1, 예를 들어 잠재형 TGF-β1의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 예를 들어, 잠재형 TGF-β1의 존재를 검출하는 방법은,
(a) 생물학적 샘플과 본 명세서에 기재되는 본 발명의 항잠재형 TGF-β1 항체를, 항잠재형 TGF-β1 항체가 잠재형 TGF-β1에 결합하는 것을 허용하는 조건하에서 접촉시키는 공정, 및
(b) 항잠재형 TGF-β1 항체와 잠재형 TGF-β1 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 공정
을 포함한다.
그와 같은 방법은, 인비트로 또는 인비보법일 수 있다. 일 태양에 있어서, 항잠재형 TGF-β1 항체는, 예를 들어, TGF-β1, 예를 들어 잠재형 TGF-β1이 환자의 선택을 위한 바이오마커가 되는 경우, 항잠재형 TGF-β1 항체를 이용하는 치료에 적절한 대상을 선택하기 위해서 사용된다. 즉, 항잠재형 TGF-β1 항체는, TGF-β1을 표적으로 하는 데 있어서 진단제로서 유용하다.
보다 구체적으로는, 항잠재형 TGF-β1 항체는, 섬유증, 바람직하게는 심근 섬유증, 폐 섬유증, 간 섬유증, 신장 섬유증, 피부 섬유증, 안구 근육 섬유증, 및 골수 섬유증의 진단에 유용하다. 본 발명의 항잠재형 TGF-β1 항체는 또한, 암의 진단에 유용하다.
몇몇 태양에 있어서, 본 발명은, 생물학적 샘플에 있어서 프로테아제에 의해 매개되는 잠재형 TGF-β1의 LAP 영역의 절단을 저해하지 않고 잠재형 TGF-β1로부터의 성숙 TGF-β1의 방출을 저해하는 방법으로서, 잠재형 TGF-β1을 포함하는 생물학적 샘플과 본 발명의 항TGF-β1 항체를, 항체가 잠재형 TGF-β1에 결합하는 것을 허용하는 조건하에서 접촉시키는 공정을 포함하는 방법을 제공한다.
특정의 태양에 있어서, 예를 들어 검출/진단 목적을 위해서, 표지된 항잠재형 TGF-β1 항체가 제공된다. 표지는, 직접적으로 검출되는 표지 또는 부분(예를 들어, 형광 표지, 발색 표지, 고전자 밀도 표지, 화학 발광 표지, 및 방사성 표지) 및, 예를 들어 효소 반응 또는 분자간 상호작용을 통해서 간접적으로 검출되는 부분(예를 들어 효소 또는 리간드)을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 예시적인 표지는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 이하를 포함한다: 방사성 동위체 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 희토류 킬레이트 등의 발형광단 또는 플루오레세인 및 그 유도체, 로다민 및 그 유도체, 단실, 움벨리페론, 반딧불 루시페라제 및 세균 루시페라제(미국 특허 제4,737,456호) 등의 루시페라제, 루시페린, 2,3-다이하이드로프탈라진다이온, 서양와사비 퍼옥시다제(horseradish peroxidase: HRP), 알칼리 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 단당 옥시다제(예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-인산 데하이드로제나제), 우리카제 및 잔틴 옥시다제 등의 헤테로환 옥시다제, 과산화 수소를 이용하여 색소 전구체를 산화시키는 효소(예를 들어 HRP, 락토퍼옥시다제, 또는 마이크로퍼옥시다제)와 연결된 것, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 프리 라디칼류, 및 이들과 유사한 것.
F. 약학적 제제
본 명세서에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체의 약학적 제제는, 원하는 순도를 갖는 항체를, 1개 또는 복수의 임의의 약학적으로 허용되는 담체(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합하는 것에 의해, 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로, 조제된다. 약학적으로 허용되는 담체는, 대체로, 이용될 때의 용량 및 농도에서는 레시피언트에 대해서 비독성이며, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 이하의 것을 포함한다: 인산염, 시트르산염, 및 다른 유기산 등의 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는, 항산화제; 보존료(옥타데실다이메틸벤질 염화 암모늄; 염화 헥사메토늄; 염화 벤잘코늄; 염화 벤제토늄; 페놀, 뷰틸, 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤 등의 알킬 파라벤; 카테콜; 레소신올; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸 등); 저분자(약 10잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린 등의 단백질; 폴리바이닐피롤리돈 등의 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신 등의 아미노산; 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는, 단당, 이당, 및 다른 탄수화물; EDTA 등의 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스, 소비톨 등의, 설탕류; 나트륨 등의 염형성 짝이온류; 금속 착체(예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG) 등의 비이온계 표면 활성제. 본 명세서의 예시적인 약학적으로 허용되는 담체는, 추가로 가용성 중성 활성형 하이알루로니다제 당단백질(sHASEGP)(예를 들어, rHuPH20(HYLENEX(등록상표), Baxter International, Inc.) 등의 인간 가용성 PH-20 하이알루로니다제 당단백질) 등의 간질성 약제 분산제를 포함한다. 특정의 예시적 sHASEGP 및 그의 사용 방법은(rHuPH20을 포함한다), 미국 특허출원공개 제2005/0260186호 및 제2006/0104968호에 기재되어 있다. 일 국면에 있어서, sHASEGP는, 콘드로이티나제 등의 1개 또는 복수의 추가적인 글리코사미노글리카나제와 조합된다.
예시적인 동결건조 항체 제제는, 미국 특허 제6,267,958호에 기재되어 있다. 수용액 항체 제제는, 미국 특허 제6,171,586호 및 WO2006/044908에 기재된 것을 포함하고, 후자의 제제는 히스티딘-아세테이트 완충액을 포함하고 있다.
하나의 국면에 있어서, 본 발명은, 항잠재형 TGF-β1 항체를 포함하는, 섬유증의 치료를 위한, 바람직하게는 심근 섬유증, 폐 섬유증, 간 섬유증, 신장 섬유증, 피부 섬유증, 안구 근육 섬유증, 및 골수 섬유증의 치료를 위한, 약학적 제제를 제공한다. 본 발명은 또한, 항잠재형 TGF-β1 항체를 포함하는, 암의 치료를 위한 약학적 제제도 제공한다.
본 명세서의 제제는 또한, 치료되는 특정의 적응증에 대해서 필요해지는 2개 이상의 유효 성분, 바람직하게는 서로 악영향을 미치지 않는 보완적 활성을 갖는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 하기의 "III. 병용 요법"에 기재되는 면역 체크포인트 저해제를 추가로 제공하는 것이 바람직한 경우가 있다.
유효 성분은, 예를 들어 액적 형성(코아세르베이션) 수법에 의해 또는 계면중합에 의해 조제된 마이크로캡슐(각각, 예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴 마이크로캡슐, 및 폴리(메타크릴산 메틸) 마이크로캡슐)에 도입되어도 되고, 콜로이드상 약제 송달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 소구체, 마이크로에멀션, 나노입자, 및 나노캡슐)에 도입되어도 되고, 매크로에멀션에 도입되어도 된다. 이와 같은 수법은, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에 개시되어 있다.
서방성 제제를 조제해도 된다. 서방성 제제의 적합한 예는, 항체를 포함하는 고체 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 당해 매트릭스는 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 등의 조형품의 형태이다.
생체내(in vivo) 투여를 위해서 사용되는 제제는, 통상 무균이다. 무균 상태는, 예를 들어 멸균 여과막을 통해 여과하는 것 등에 의해, 용이하게 달성된다.
G. 치료 방법 및 조성물
본 명세서에 제공되는 항잠재형 TGF-β1 항체의 모두, 치료 방법에 있어서 사용될 수 있다. 하나의 국면에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 항잠재형 TGF-β1 항체가 제공된다. 추가적인 국면에 있어서, 암 또는 섬유증(예를 들어, 간 섬유증, 신장 섬유증, 혹은 폐 섬유증) 등을 치료하는 데 사용하기 위한 항잠재형 TGF-β1 항체가 제공된다. 특정의 태양에 있어서, 치료 방법에 있어서 사용하기 위한 항잠재형 TGF-β1 항체가 제공된다. 특정의 태양에 있어서, 본 발명은, 개체에게 유효량의 항잠재형 TGF-β1 항체를 투여하는 공정을 포함하는 암 또는 섬유증(예를 들어, 간 섬유증, 신장 섬유증, 혹은 폐 섬유증) 등을 갖는 개체를 치료하는 방법에 있어서 사용하기 위한 항잠재형 TGF-β1 항체를 제공한다. 그와 같은 일 태양에 있어서, 이 방법은, 예를 들어 이하에 기재되는 바와 같은 적어도 1개의 추가 치료제를 유효량으로 개체에게 투여하는 공정을 추가로 포함한다. 추가적인 태양에 있어서, 본 발명은, 잠재형 TGF-β1의 프로테아제 매개 활성화를 저해하는 데 사용하기 위한 항잠재형 TGF-β1 항체를 제공한다. 특정의 태양에 있어서, 본 발명은, 잠재형 TGF-β1의 프로테아제 매개 활성화를 저해하도록 개체에게 유효량의 항잠재형 TGF-β1 항체를 투여하는 공정을 포함하는, 개체에 있어서의 잠재형 TGF-β1의 프로테아제 매개 활성화를 저해하는 방법에 있어서 사용하기 위한 항잠재형 TGF-β1 항체를 제공한다. 전술한 태양의 임의의 것에 있어서의 "개체"는, 바람직하게는 인간이다.
추가적인 국면에 있어서, 본 발명은, 의약의 제조 또는 조제에 있어서의 항잠재형 TGF-β1 항체의 사용을 제공한다. 일 태양에 있어서, 의약은, 암 또는 섬유증(예를 들어, 간 섬유증, 신장 섬유증, 혹은 폐 섬유증) 등을 치료하기 위한 것이다. 추가적인 태양에 있어서, 의약은, 암 또는 섬유증(예를 들어, 간 섬유증, 신장 섬유증, 혹은 폐 섬유증) 등을 갖는 개체에게 유효량의 의약을 투여하는 공정을 포함하는, 암 또는 섬유증(예를 들어, 간 섬유증, 신장 섬유증, 혹은 폐 섬유증) 등을 치료하는 방법에 있어서 사용하기 위한 것이다. 그와 같은 일 태양에 있어서, 이 방법은, 예를 들어 이하에 기재되는 바와 같은 적어도 1개의 추가 치료제를 유효량으로 개체에게 투여하는 공정을 추가로 포함한다. 추가적인 태양에 있어서, 의약은, 잠재형 TGF-β1의 프로테아제 매개 활성화를 저해하기 위한 것이다. 추가적인 태양에 있어서, 의약은, 잠재형 TGF-β1의 프로테아제 매개 활성화를 저해하도록 개체에게 유효량의 의약을 투여하는 공정을 포함하는, 개체에 있어서의 잠재형 TGF-β1의 프로테아제 매개 활성화를 저해하는 방법에 있어서 사용하기 위한 것이다. 전술한 태양의 임의의 것에 있어서의 "개체"는, 바람직하게는 인간이다.
추가적인 국면에 있어서, 본 발명은, 암 또는 섬유증(예를 들어, 간 섬유증, 신장 섬유증, 혹은 폐 섬유증) 등을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 일 태양에 있어서, 이 방법은, 그와 같은 암 또는 섬유증(예를 들어, 간 섬유증, 신장 섬유증, 혹은 폐 섬유증) 등을 갖는 개체에게 유효량의 항TGF-β1 항체를 투여하는 공정을 포함한다. 그와 같은 일 태양에 있어서, 이 방법은, 예를 들어 이하에 기재되는 바와 같은 적어도 1개의 추가 치료제를 유효량으로 개체에게 투여하는 공정을 추가로 포함한다. 몇몇 태양에 있어서, 당해 항체와 당해 약제의 투여는 동시이다. 전술한 태양의 임의의 것에 있어서의 "개체"는, 인간일 수 있다.
추가적인 국면에 있어서, 본 발명은, 개체에 있어서의 잠재형 TGF-β1의 프로테아제 매개 활성화를 저해하기 위한 방법을 제공한다. 일 태양에 있어서, 이 방법은, 잠재형 TGF-β1의 프로테아제 매개 활성화를 저해시키도록 개체에게 유효량의 항잠재형 TGF-β1 항체를 투여하는 공정을 포함한다. 일 태양에 있어서, "개체"는 인간이다.
추가적인 국면에 있어서, 본 발명은, 본 명세서에서 제공되는 항잠재형 TGF-β1 항체의 임의의 것을 포함하는, 약학적 제제를 제공한다(예를 들어 전술한 치료적 방법의 임의의 것에 있어서의 사용을 위한). 일 태양에 있어서, 약학적 제제는, 본 명세서에서 제공되는 항잠재형 TGF-β1 항체의 임의의 것과, 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 다른 태양에 있어서, 약학적 제제는, 본 명세서에서 제공되는 항잠재형 TGF-β1 항체의 임의의 것과, 적어도 1개의 (예를 들어 후술하는 바와 같은) 추가 치료제를 포함한다.
본 발명의 항체(및 임의의 추가 치료제)는, 비경구 투여, 폐내 투여, 및 경비 투여, 또한 국소적 처치를 위해서 요망하는 경우는 병소내 투여를 포함하는, 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은, 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은, 투여가 단기인지 장기인지에 일부 따라서, 예를 들어, 정맥내 주사 또는 피하 주사 등의 주사에 의하는 등, 임의의 적합한 경로에 의해 이루어질 수 있다. 이들로 한정되는 것은 아니지만, 단회 투여 또는 여러 가지 시점에 걸친 반복 투여, 볼러스 투여, 및 펄스 주입을 포함하는, 여러 가지 투약 스케줄이 본 명세서의 고려 내에 있다.
본 발명의 항체는, 우량 의료 규범(good medical practice)에 일치한 방식으로, 제제화되고, 투약되고, 또한 투여된다. 이 관점에서 고려되어야 할 팩터는, 치료되고 있는 그 특정의 장애, 치료되고 있는 그 특정의 포유동물, 개개의 환자의 임상 증상, 장애의 원인, 제를 송달하는 부위, 투여 방법, 투여의 스케줄, 및 의료 종사자에게 공지된 다른 팩터를 포함한다. 항체는, 반드시 그렇지 않아도 되지만, 임의로, 문제의 장애를 예방하거나 또는 치료하기 위해서 실제로 사용되고 있는 1개 또는 복수의 제와 함께, 제제화된다. 그와 같은 다른 제의 유효량은, 제제 중에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 타입, 및 위에서 논한 다른 팩터에 의존한다.
질환의 예방 또는 치료를 위해서, 본 발명의 항체의 적절한 용량(단독으로 이용될 때 또는 1개 또는 복수의 다른 추가 치료제와 함께 이용될 때)은, 치료되는 질환의 타입, 항체의 타입, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방적 목적으로 투여되는지 치료적 목적으로 투여되는지, 약력, 환자의 임상력 및 항체에 대한 응답, 및, 주치의의 재량에 의존할 것이다. 항체는, 환자에 대해서, 1회로, 또는 일련의 처치에 걸쳐서, 적합하게 투여된다.
본 명세서에 기재되는 제품 모두, 항잠재형 TGF-β1 항체 대신에, 또는 그에 더하여, 본 발명의 이뮤노컨주게이트를 포함해도 됨이 이해된다.
III. 병용 요법
본 발명의 항잠재형 TGF-β1 항체는, 치료에 있어서, 바람직하게는 암 또는 섬유증의 치료를 위해서, 보다 바람직하게는 암의 치료를 위해서, 단독으로 사용하거나 또는 다른 약제와 병용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 적어도 1개의 추가의 치료제와 공투여해도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 당해 항체와 당해 약제의 투여는 동시이다. 특정의 태양에 있어서, 추가의 치료제는 1개 또는 복수의 면역 체크포인트 저해제, 예를 들어 CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, CD160, CD57, CD244, LAG-3, CD272, KLRG1, CD26, CD39, CD73, CD305, TIGIT, TIM-3, 및/또는 VISTA의 저해제이다. 몇몇 태양에 있어서, 면역 체크포인트 저해제는, 예를 들어, 항CTLA-4 항체, 항PD-1 항체, 항PD-L1 항체, 항PD-L2항체, 항CD160 항체, 항CD57 항체, 항CD244 항체, 항LAG-3 항체, 항CD272 항체, 항KLRG1 항체, 항CD26 항체, 항CD39 항체, 항CD73 항체, 항CD305 항체, 항TIGIT 항체, 항TIM-3 항체, 및/또는 항VISTA 항체이다. 바람직하게는, 면역 체크포인트 저해제는 PD-1계 결합 안타고니스트이다. 보다 바람직하게는, 면역 체크포인트 저해제는 항PD-1 항체 또는 항PD-L1 항체이다. 몇몇 태양에 있어서, 항PD-1 항체는 니볼루마브, 펨브롤리주마브, 또는 세미플리마브이다. 몇몇 태양에 있어서, 항PD-L1 항체는 아테졸리주마브, 아벨루마브, 또는 듀르발루마브이며, 바람직하게는 아테졸리주마브이다. 바람직하게는, 병용 요법은, 본 발명의 항잠재형 TGF-β1 항체와 아테졸리주마브를 포함한다. 몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항잠재형 TGF-β1 항체와 1개 또는 복수의 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 병용 요법은, 항TGFβ 항체의 단독 요법 또는 면역 체크포인트 저해제의 단독 요법과 비교하여, 상가적 또는 상승적 효과, 예를 들어, 상가적, 복합적, 또는 상승적 항종양 효과를 갖는다.
하나의 국면에 있어서, 본 발명의 병용 요법은, 암 또는 섬유증의 치료, 바람직하게는 암의 치료를 위한 것이다. 일 태양에 있어서, 암은 면역 체크포인트 저해제에 대해서 저항성이며, 또한/또는 면역 체크포인트 저해제에 대해서 한정된 응답을 나타낸다. 어떠한 이론에도 구속되지 않지만, 일부의 면역 체크포인트 내성 암 및/또는 면역 체크포인트 저해제에 대해서 한정된 응답을 나타내는 암의 응답의 결여는, 특히, CD8+ T 세포가 종양 실질로부터 배제되고 있는 대신에 섬유아세포나 콜라겐이 풍부한 종양 주위 간질 중에 발견되는 환자에 있어서의, 섬유아세포 내의 TGF-β 시그널링의 흔적(signature)과 관련되어 있다. 따라서, 면역 체크포인트 저해제와 조합한 항잠재형 TGF-β1 항체는, 간질 세포 내의 TGF-β 시그널링을 저감시켜, 종양의 중심부로의 T 세포의 침윤을 촉진할 수 있어, 증강된 항종양 활성을 발휘할 수 있다.
프로그램 세포사(programmed cell death) 단백질 1(PD-1; CD274 또는 B7-H1로서도 알려짐)은, T 세포 레귤레이터의 CD28/CTLA-4 패밀리에 속하는 I형 막단백질이다. PD-1은, B7 패밀리에 속하는 PD-L1 및 PD-L2라고 하는 2개의 리간드를 갖는다. PD-1과 리간드는, T 세포 응답 등의 면역 응답을 음으로 조절한다고 생각되고 있다. PD-L1 및 PD-1은, 몇몇 타입의 암에서 고발현하고 있어, 암의 면역 회피에 관여하고 있다고 생각되고 있다. "(면역) 체크포인트 저해제" 등의, 예를 들어 PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용을 저해하는 저해제는, T 세포 응답을 증강시켜, 항종양 활성을 증가시킬 수 있다.
용어 "PD-1계(PD-1 axis) 결합 안타고니스트"는, PD-1 시그널 전달계 상의 시그널 전달로부터 생기는 T 세포의 기능 부전을 제거하도록, PD-1계 결합 파트너와 그 결합 파트너의 1개 또는 복수의 상호작용을 저해하여, T 세포 기능(예를 들어, 증식, 사이토카인 산생, 표적 세포의 사멸)을 회복 또는 증강시키는 결과를 가져오는, 분자를 말한다. 본 명세서에 있어서 이용되는, PD-1계 결합 안타고니스트에는, PD-1 결합 안타고니스트, PD-L1 결합 안타고니스트, 및 PD-L2 결합 안타고니스트가 포함된다.
용어 "PD-1 결합 안타고니스트"는, PD-1과, PD-L1이나 PD-L2 등의 그 결합 파트너의 1개 또는 복수의 상호작용으로부터 생기는 시그널 전달을, 감소시키거나, 차단하거나, 저해하거나, 억제하거나, 또는 방해하는 분자를 말한다. 몇몇 태양에 있어서, PD-1 결합 안타고니스트는, PD-1이 그 결합 파트너의 1개 또는 복수에 결합하는 것을 저해하는 분자이다. 구체적인 국면에 있어서, PD-1 결합 안타고니스트는, PD-1이 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하는 것을 저해한다. 예를 들어, PD-1 결합 안타고니스트로서는, PD-1과 PD-L1 및/또는 PD-L2의 상호작용으로부터 생기는 시그널 전달을 감소시키거나, 차단하거나, 저해하거나, 억제하거나, 또는 방해하는, 항PD-1 항체, 그 항원 결합 단편, 이뮤노아드헤신, 융합 단백질, 올리고펩티드, 및 그 외의 분자를 들 수 있다. 일 태양에 있어서, PD-1 결합 안타고니스트는, 기능 부전의 T 세포의 기능을 개선하는 것(예를 들어, 항원 인식에 대한 이펙터 반응을 증강하는 것)과 같이, PD-1을 개재시킨 시그널 전달에 의해 매개되는, T 림프구 상에 발현한 세포 표면 단백질에 의해 매개되는 또는 당해 단백질을 개재시키는 음의 공자극 시그널을 저감시킨다. 구체적인 국면에 있어서, PD-1 결합 안타고니스트는, MDX-1106(니볼루마브), MK-3475(람브롤리주마브), CT-011(피딜리주마브), 또는 AMP-224 혹은 AMP-514(MEDI0680)이다. 다른 구체적인 국면에 있어서, PD-1 결합 안타고니스트는, PDR001, REGN2810, BGB A317 및 SHR-1210으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
용어 "PD-L1 결합 안타고니스트"는, PD-L1과, PD-1이나 B7-1 등의 그 결합 파트너의 1개 또는 복수의 상호작용으로부터 생기는 시그널 전달을, 감소시키거나, 차단하거나, 저해하거나, 억제하거나, 또는 방해하는 분자를 말한다. 몇몇 태양에 있어서, PD-L1 결합 안타고니스트는, PD-L1이 그 결합 파트너에 결합하는 것을 저해하는 분자이다. 구체적인 국면에 있어서, PD-L1 결합 안타고니스트는, PD-L1이 PD-1 및/또는 B7-1에 결합하는 것을 저해한다. 몇몇 태양에 있어서, PD-L1 결합 안타고니스트로서는, PD-L1과 PD-1이나 B7-1 등의 그 결합 파트너의 1개 또는 복수의 상호작용으로부터 생기는 시그널 전달을 감소시키거나, 차단하거나, 저해하거나, 억제하거나, 또는 방해하는, 항PD-L1 항체, 그 항원 결합 단편, 이뮤노아드헤신, 융합 단백질, 올리고펩티드, 및 그 외의 분자를 들 수 있다. 일 태양에 있어서, PD-L1 결합 안타고니스트는, 기능 부전의 T 세포의 기능을 개선하는 것(예를 들어, 항원 인식에 대한 이펙터 반응을 증강하는 것)과 같이, PD-L1을 개재시킨 시그널 전달에 의해 매개되는, T 림프구 상에 발현한 세포 표면 단백질에 의해 매개되는 또는 당해 단백질을 개재시키는 음의 공자극 시그널을 저감시킨다. 몇몇 태양에 있어서, PD-L1 결합 안타고니스트는 항PD-L1 항체이다. 구체적인 국면에 있어서, 항PD-L1 항체는 YW243.55.S70(아테졸리주마브), MDX-1105, 아벨루마브, MPDL3280A, 또는 MEDI4736(듀르발루마브)이다.
용어 "PD-L2 결합 안타고니스트"는, PD-L2와, PD-1 등의 그 결합 파트너의 1개 또는 복수의 상호작용으로부터 생기는 시그널 전달을, 감소시키거나, 차단하거나, 저해하거나, 억제하거나, 또는 방해하는 분자를 말한다. 몇몇 태양에 있어서, PD-L2 결합 안타고니스트는, PD-L2가 그 결합 파트너의 1개 또는 복수에 결합하는 것을 저해하는 분자이다. 구체적인 국면에 있어서, PD-L2 결합 안타고니스트는, PD-L2가 PD-1에 결합하는 것을 저해한다. 몇몇 태양에 있어서, PD-L2 안타고니스트로서는, PD-L2와 PD-1 등의 그 결합 파트너의 1개 또는 복수의 상호작용으로부터 생기는 시그널 전달을 감소시키거나, 차단하거나, 저해하거나, 억제하거나, 또는 방해하는, 항PD-L2 항체, 그 항원 결합 단편, 이뮤노아드헤신, 융합 단백질, 올리고펩티드, 및 그 외의 분자를 들 수 있다. 일 태양에 있어서, PD-L2 결합 안타고니스트는, 기능 부전의 T 세포의 기능을 개선하는 것(예를 들어, 항원 인식에 대한 이펙터 반응을 증강하는 것)과 같이, PD-L2를 개재시킨 시그널 전달에 의해 매개되는, T 림프구 상에 발현한 세포 표면 단백질에 의해 매개되거나 또는 당해 단백질을 개재시키는 음의 공자극 시그널을 저감시킨다. 몇몇 태양에 있어서, PD-L2 결합 안타고니스트는 이뮤노아드헤신이다.
이와 같은 상기의 병용 요법은, 조합 투여(2개 이상의 치료제가 동일 또는 별개의 제제에 포함되는 경우), 및 별도의 투여(이 경우, 본 발명의 항체는, 1개 또는 복수의 추가의 치료제의 투여 전, 동시, 또는 후에 투여될 수 있다)를 포함한다. 일 태양에 있어서, 항잠재형 TGF-β1 항체의 투여와 추가의 치료제의 투여는, 서로 약 1개월 이내, 또는 약 1주간, 2주간, 혹은 3주간 이내, 또는 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 혹은 6일 이내에 행해진다. 본 발명의 항체는, 방사선 요법과 병용할 수도 있다.
하나의 국면에 있어서, 상기의 병용 요법이 조합 투여를 포함하고, 2개 이상의 치료제가 동일한 약학적 제제에 포함되는 경우, 본 명세서에 있어서의 약학적 제제는, 예를 들어 본 발명의 항잠재형 TGF-β1 항체와, 상기의 1개 또는 복수의 면역 체크포인트 저해제를 포함한다. 바람직하게는, 본 명세서에 있어서의 약학적 제제는, 본 발명의 항잠재형 TGF-β1 항체, PD-1계 결합 안타고니스트(바람직하게는 항PD-L1 항체, 보다 바람직하게는 아테졸리주마브), 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
하나의 국면에 있어서, 본 발명은, 1개 또는 복수의 질환의 치료를 위해서, 추가의 치료제와 조합하여 사용하기 위한, 항잠재형 TGF-β1 항체를 제공한다. 다른 국면에 있어서, 본 발명은, 1개 또는 복수의 질환의 치료를 위해서, 추가의 치료제와 조합하여 사용하기 위한, 항잠재형 TGF-β1 항체를 포함하는 약학적 제제를 제공한다. 일 태양에 있어서, 당해 1개 또는 복수의 질환은 암 및/또는 섬유증이며, 바람직하게는 암이다. 일 태양에 있어서, 당해 추가의 치료제는 상기의 1개 또는 복수의 면역 체크포인트 저해제이다. 바람직하게는, 본 발명은, 암의 치료를 위한, PD-1계 결합 안타고니스트(바람직하게는 항PD-L1 항체, 보다 바람직하게는 아테졸리주마브)와 조합하여 사용하기 위한, 항잠재형 TGF-β1 항체를 제공한다.
하나의 국면에 있어서, 본 발명은, 1개 또는 복수의 질환의 치료를 위한, 항잠재형 TGF-β1 항체와 조합하여 사용하기 위한, PD-1계 결합 안타고니스트(바람직하게는 항PD-L1 항체, 보다 바람직하게는 아테졸리주마브)를 제공한다. 다른 국면에 있어서, 본 발명은, 1개 또는 복수의 질환의 치료를 위한, 항잠재형 TGF-β1 항체와 조합하여 사용하기 위한, PD-1계 결합 안타고니스트(바람직하게는 항PD-L1 항체, 보다 바람직하게는 아테졸리주마브)를 포함하는 약학적 제제를 제공한다. 일 태양에 있어서, 당해 1개 또는 복수의 질환은 암 및/또는 섬유증이며, 바람직하게는 암이다.
IV. 제품, 키트
A. 제품
본 발명의 다른 국면에 있어서, 전술한 장애(예를 들어 섬유증 및 암)의 치료, 예방, 및/또는 진단에 유용한 기재를 포함하는 제품이 제공된다. 제품은, 용기, 및 당해 용기 상의 라벨 또는 당해 용기에 부속되는 첨부 문서를 포함한다. 바람직한 용기로서는, 예를 들어, 보틀, 바이알, 시린지, IV 용액 백 등이 포함된다. 용기류는, 유리나 플라스틱 등의, 다양한 재료로부터 형성되어 있어도 된다. 용기는 조성물을 단체(單體)로 보유해도 되고, 증상(예를 들어 섬유증 및 암)의 치료, 예방, 및/또는 진단을 위해서 유효한 다른 조성물과 조합하여 보유해도 되며, 또한, 무균적인 억세스 포트를 갖고 있어도 된다(예를 들어, 용기는, 피하 주사바늘에 의해 꿰뚫을 수 있는 스토퍼를 갖는 정맥내 투여용 용액 백 또는 바이알이어도 된다). 조성물 중의 적어도 1개의 유효 성분은, 본 발명의 항체 또는 이뮤노컨주게이트이다. 라벨 또는 첨부 문서는, 조성물이 선택된 증상(예를 들어 섬유증 및 암)을 치료하기 위해서 사용되는 것임을 나타낸다. 더욱이 제품은, (a) 제 1 용기로서, 그 속에 들어간 본 발명의 항체/이뮤노컨주게이트를 포함하는 조성물을 수반하는, 제 1 용기; 및 (b) 제 2 용기로서, 그 속에 들어간 추가적인 세포상해제 또는 그 이외에 치료적인 제를 포함하는 조성물을 수반하는, 제 2 용기를 포함해도 된다. 본 발명의 이 태양에 있어서의 제품은, 추가로 조성물이 특정의 증상(예를 들어 섬유증 및 암)을 치료하기 위해서 사용될 수 있음을 나타내는, 첨부 문서를 포함해도 된다. 혹은 또는 더하여, 제품은 추가로 주사용 제균수(BWFI), 인산 완충 생리 식염수, 링거 용액, 및 덱스트로스 용액 등의, 약학적으로 허용되는 완충액을 포함하는, 제 2(또는 제 3) 용기를 포함해도 된다. 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 및 시린지 등의, 다른 상업적 관점 또는 유저의 입장에서 바람직한 기재를 추가로 포함해도 된다.
전술한 제품의 어느 것에 대해서도, 항잠재형 TGF-β1 항체 대신에 또는 그에 추가하여, 본 발명의 이뮤노컨주게이트를 포함해도 됨이 이해될 것이다.
B. 키트
본 개시는, 본 명세서에 기재되는 장애의 치료, 예방, 및/또는 진단, 특히, 섬유증 또는 암을 갖는 개체의 치료를 위한 방법에 있어서 사용하기 위한 키트로서, 본 개시의, 또는 본 개시의 방법에 의해 제작되는, 항잠재형 TGF-β1 항체, 당해 항잠재형 TGF-β1 항체를 포함하는 이뮤노컨주게이트, 당해 항잠재형 TGF-β1 항체를 코딩하는 단리된 핵산, 또는 당해 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 키트를 제공한다. 당해 키트는, 본 명세서의 "III. 병용 요법"에 예시되는, 항PD-L1 항체를 포함하는 면역 체크포인트 저해제 등의 임의의 치료제를 추가로 포함해도 된다. 당해 키트는, 본 명세서에 개시된 추가의 약학적으로 허용되는 담체 또는 매체, 또는 키트의 사용 방법을 기재한 취급 설명서와 함께 포장되어 있어도 된다. 본 명세서에 기재되는 제품과 마찬가지로, 당해 키트는 섬유증 또는 암의 치료에 유용한 재료; 용기 및 당해 용기 상의 라벨 또는 당해 용기에 부속되는 첨부 문서; 조성물 단체 또는 섬유증 또는 암의 치료에 유효한 다른 조성물과 조합한, 조성물; 무균적인 억세스 포트 등을 포함해도 된다. 당해 키트는 추가로 당해 조성물이 섬유증 또는 암을 치료하기 위해서 사용될 수 있음을 나타내는 라벨 또는 첨부 문서를 포함해도 된다. 혹은 또는 더하여, 당해 키트는, 주사용 제균수(BWFI), 인산 완충 생리 식염수, 링거 용액, 및 덱스트로스 용액 등의 약학적으로 허용되는 완충액을 포함하는, 제 2(또는 제 3) 용기를 추가로 포함해도 된다. 당해 키트는 추가로 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 및 시린지 등의 다른 상업적 관점 또는 유저의 입장에서 바람직한 기재를 추가로 포함해도 된다.
실시예
이하는, 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 전술한 일반적인 기재에 비추어, 여러 가지 다른 실시태양이 실시될 수 있음이 이해될 것이다.
실시예 1: 항원의 발현 및 정제
(1-1) 잠재형 TGF-β1의 발현 및 정제
발현 및 정제에 이용한 서열은 다음과 같다: FLAG 태그 부가 인간 잠재형 TGF-β1(서열 번호: 1, 2), FLAG 태그 부가 마우스 잠재형 TGF-β1(서열 번호: 3, 4) 및 FLAG 태그 부가 필리핀원숭이 잠재형 TGF-β1(서열 번호: 5, 6). 이들 FLAG 태그 부가 잠재형 TGF-β1은, 각각 N말단으로부터 C말단에 걸쳐 래트 혈청 알부민 유래의 시그널 서열(서열 번호: 7), FLAG 태그, 및 잠재형 TGF-β1의 서열을 갖는다. 이들 FLAG 태그 부가 잠재형 TGF-β1은, 각각 30번째의 Cys 잔기가 Ser로 치환되고, 이것은 "C33S 변이"에 상당한다(예를 들어, Yoshinaga K, et al. Perturbation of transforming growth factor (TGF)-β1 association with latent TGF-beta binding protein yields inflammation and tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105(48):18758-18763 참조).
FLAG 태그 부가 인간 잠재형 TGF-β1(이하 "인간 잠재형 TGF-β1(SLC)" 또는 "인간 잠재형 TGF-β1"이라고 부른다), FLAG 태그 부가 마우스 잠재형 TGF-β1(이하 "마우스 잠재형 TGF-β1 (SLC)" 또는 "마우스 잠재형 TGF-β1"이라고 부른다) 또는 FLAG 태그 부가 필리핀원숭이 잠재형 TGF-β1(이하 "원숭이 잠재형 TGF-β1(SLC)" 또는 "원숭이 잠재형 TGF-β1"이라고 부른다)을, FreeStyle 293-F 또는 Expi293F 세포주(서모피셔 사이언티픽)를 이용하여 일과성으로 발현시켰다. 인간, 마우스 또는 원숭이 잠재형 TGF-β1(SLC)을 발현하는 배양 상청(conditioned media)을, 항FLAG M2 어피니티 수지(Sigma)를 채운 컬럼에 어플라이하고, 잠재형 TGF-β1(SLC)을 FLAG 펩티드(Sigma)로 용출했다. 인간, 마우스 또는 원숭이 잠재형 TGF-β1 (SLC)을 포함하는 획분을 회수하고, 계속하여 1x PBS로 평형화한 Superdex 200 겔 여과 컬럼(GE헬스케어)에 제공했다. 그 후 인간, 마우스 또는 원숭이 잠재형 TGF-β1(SLC)을 포함하는 획분을 풀링하고, -80℃에서 보존했다.
(1-2) 마우스 잠재 관련 펩티드(latency associated peptide; LAP)의 발현 및 정제
발현 및 정제에 이용한 서열은 다음과 같다: N말단으로부터 C말단에 걸쳐, 래트 혈청 알부민 유래의 시그널 서열(서열 번호: 7), FLAG 태그 및 잠재 관련 단백질(latency associated protein; LAP)의 서열을 갖는 FLAG 태그 부가 마우스 LAP(서열 번호: 8, 9). FLAG 태그 부가 LAP의 30번째의 Cys 잔기가 Ser로 치환되어 있고, 이것은 "C33S 변이"에 상당한다. FLAG 태그 부가 마우스 LAP(서열 번호: 8, 9)(이하 "재조합 마우스 잠재 관련 단백질(latency associated protein; LAP)"이라고 부른다)의 발현 및 정제는 실시예(1-1)에 기재된 방법과 완전히 동일한 방법으로 행했다.
실시예 2: 항TGF-β1 항체의 인간화 및 최적화
(2-1) 인간화
키메라 항체인 친항체, 항TGF-β 항체 TBA0947을 이하와 같이 인간화했다. 우선, 인간화 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을, TBA0947의 가변 영역 및 인간 생식 계열 프레임워크를 이용하여 설계했다. 다음에, 설계된 각각의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 폴리뉴클레오티드를, 각각 중쇄 정상 영역 SG181 서열(서열 번호: 10) 및 경쇄 정상 영역 SK1 서열(서열 번호: 11)을 포함하는 발현 벡터에 클로닝했다. 인간화 항체를, FreeStyle 293-F 세포(서모피셔 사이언티픽)에 일과성으로 발현시키고, Biacore 해석을 행했다. 친항체와 적어도 마찬가지의 Biacore 결합 활성을 나타낸 인간화 항체를 선택했다.
(2-2) 최적화
실시예(2-1)에서 얻어진 인간화 항체를, 잠재형 TGF-β1(SLC)에 대해서 결합 활성이 개선된 hT0947AE04, hT0947AE07, hT0947AE08 및 hT0947AE09로 최적화했다. 간결하게는, 양 중쇄 및 경쇄의 상보성 결정 영역(complementarity-determining regions; CDRs)의 모든 잔기에 대해 망라적인 변이 도입을 행했다. 각 아미노산을, 원래의 아미노산 및 시스테인을 제외한 18종류의 다른 천연 아미노산으로 치환했다. 개변체를, 일과성으로 FreeStyle 293-F 세포(서모피셔 사이언티픽)에 발현시키고, Biacore에 의한 평가를 위해, 배양 상청으로부터 정제했다. 인간 및 마우스 양쪽의 잠재형 TGF-β1(SLC)에 대해 개선된 결합 활성을 갖는 목적의 개변체를 선택했다. 계속하여 이들 변이의 조합을 CDR에 갖는 항체가 작성되었다.
(2-3) 최적화 항체의 아미노산 서열
hT0947AE04, hT0947AE07, hT0947AE08 및 hT0947AE09의 가변 영역의 아미노산 서열은 다음과 같이 특정되었다:
- hT0947AE04의 중쇄 가변 영역(hT0947AE04H)은 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하고, hT0947AE04의 경쇄 가변 영역(hT0947AE04L)은 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함한다.
- hT0947AE07의 중쇄 가변 영역(hT0947AE07H)은 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하고, hT0947AE07의 경쇄 가변 영역(hT0947AE07L)은 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함한다.
- hT0947AE08의 중쇄 가변 영역(hT0947AE08H)은 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하고, hT0947AE08의 경쇄 가변 영역(hT0947AE08L)은 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함한다.
- hT0947AE09의 중쇄 가변 영역(hT0947AE09H)은 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하고, hT0947AE09의 경쇄 가변 영역(hT0947AE09L)은 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함한다.
hT0947AE04, hT0947AE07, hT0947AE08 및 hT0947AE09의 CDR(HVR)의 아미노산 서열은 Kabat에 따라 다음과 같이 특정되었다:
- hT0947AE04는, 각각 서열 번호: 20, 21 및 22의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호: 23, 24 및 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다.
- hT0947AE07은, 각각 서열 번호: 26, 27 및 28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호: 29, 30 및 31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다.
- hT0947AE08은, 각각 서열 번호: 32, 33 및 34의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호: 35, 36 및 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다.
- hT0947AE09는, 각각 서열 번호: 38, 39 및 40의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열 번호: 41, 42 및 43의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다.
(2-4) 전장 중쇄 및 경쇄의 작성
복수의 아미노산 치환을 중쇄 정상 영역 SG1(서열 번호: 44)에 도입했다. SG1은, 최후의 2개의 C말단 아미노산 Gly-Lys(GK)의 결손이 있는 야생형 인간 IgG1 중쇄 정상 영역이다. 그 결과, SG181(서열 번호: 10) 및 SG191(서열 번호: 45)이 작성되었다. SG181은 EU 인덱스에 의해 나타나는 아미노산 치환 L235R/G236R(이펙터 기능을 저감시키는 아미노산 치환) 및 K214R을 포함한다. SG191은 EU 인덱스에 의해 나타나는 아미노산 치환 L235R/G236R(이펙터 기능을 저감시키는 아미노산 치환), M428L/N434A(FcRn에 대한 결합 활성을 향상시키는 아미노산 치환), Q438R/S440E(류머티즘 인자에 대한 결합을 저감시키는 아미노산 치환) 및 K214R을 포함한다. 또한, P235K/S239K(이펙터 기능을 저감시키는 아미노산 치환)를 포함하는 마우스 IgG 중쇄 정상 영역 mF18(서열 번호: 46)이 작성되었다.
중쇄 가변 영역의 각각을, 중쇄 정상 영역 SG181(서열 번호: 10), SG191(서열 번호: 45) 또는 mF18(서열 번호: 46)과 조합했다. 이와 같이 하여, 다음의 아미노산 서열을 갖는 전장 중쇄 서열이 작성되었다:
(a1) hT0947AE04H(중쇄 가변 영역) 및 SG181(중쇄 정상 영역)을 포함하는, 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 전장 중쇄
(a2) hT0947AE07H(중쇄 가변 영역) 및 SG181(중쇄 정상 영역)을 포함하는, 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 전장 중쇄
(a3) hT0947AE08H(중쇄 가변 영역) 및 SG181(중쇄 정상 영역)을 포함하는, 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 전장 중쇄
(a4) hT0947AE09H(중쇄 가변 영역) 및 SG181(중쇄 정상 영역)을 포함하는, 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 전장 중쇄
(b1) hT0947AE04H(중쇄 가변 영역) 및 SG191(중쇄 정상 영역)을 포함하는, 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 전장 중쇄
(b2) hT0947AE07H(중쇄 가변 영역) 및 SG191(중쇄 정상 영역)을 포함하는, 서열 번호: 52의 아미노산 서열을 포함하는 전장 중쇄
(b3) hT0947AE08H(중쇄 가변 영역) 및 SG191(중쇄 정상 영역)을 포함하는, 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 전장 중쇄
(b4) hT0947AE09H(중쇄 가변 영역) 및 SG191(중쇄 정상 영역)을 포함하는, 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 전장 중쇄
(c1) hT0947AE04H(중쇄 가변 영역) 및 mF18(중쇄 정상 영역)을 포함하는, 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 전장 중쇄
(c2) hT0947AE07H(중쇄 가변 영역) 및 mF18(중쇄 정상 영역)을 포함하는, 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 전장 중쇄
(c3) hT0947AE08H(중쇄 가변 영역) 및 mF18(중쇄 정상 영역)을 포함하는, 서열 번호: 57의 아미노산 서열을 포함하는 전장 중쇄
(c4) hT0947AE09H(중쇄 가변 영역) 및 mF18(중쇄 정상 영역)을 포함하는, 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 전장 중쇄.
경쇄 가변 영역의 각각을, 인간 IgG 경쇄 정상 영역(kappa) SK1(서열 번호: 11) 또는 마우스 IgG 경쇄 정상 영역(kappa) mk1(서열 번호: 59)과 조합했다. 이와 같이 하여, 다음의 아미노산 서열을 갖는 전장 경쇄 서열이 작성되었다:
(d1) hT0947AE04L(경쇄 가변 영역) 및 SK1(경쇄 정상 영역)을 포함하는, 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 전장 경쇄
(d2) hT0947AE07L(경쇄 가변 영역) 및 SK1(경쇄 정상 영역)을 포함하는, 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 전장 경쇄
(d3) hT0947AE08L(경쇄 가변 영역) 및 SK1(경쇄 정상 영역)을 포함하는, 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 전장 경쇄
(d4) hT0947AE09L(경쇄 가변 영역) 및 SK1(경쇄 정상 영역)을 포함하는, 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 전장 경쇄
(e1) hT0947AE04L(경쇄 가변 영역) 및 mk1(경쇄 정상 영역)을 포함하는, 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 전장 경쇄
(e2) hT0947AE07L(경쇄 가변 영역) 및 mk1(경쇄 정상 영역)을 포함하는, 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 전장 경쇄
(e3) hT0947AE08L(경쇄 가변 영역) 및 mk1(경쇄 정상 영역)을 포함하는, 서열 번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 전장 경쇄
(e4) hT0947AE09L(경쇄 가변 영역) 및 mk1(경쇄 정상 영역)을 포함하는, 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 전장 경쇄
다음에, 각 전장 중쇄 및 경쇄를 조합하여 표 2에 나타내는 항체를 작성했다. 작성된 항체는 표 2에 나타내는 바와 같이 이름 붙이고, 각각의 명칭으로 본 명세서에 있어서 참조된다.
Figure 112020129062073-pct00002
실시예 3: 항잠재형 TGF-β1 항체의 결합 활성 평가를 위한 Biacore 해석
항잠재형 TGF-β1 항체(hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191 및 hT0947AE09-SG191)의 인간, 필리핀원숭이 또는 마우스의 잠재형 TGF-β1(SLC)에 대한 결합 활성이 Biacore 8k 기기(GE헬스케어)를 이용하여 측정되었다. 마우스 항인간 Ig kappa 경쇄 항체(BD Pharmingen)를, CM5 센서 칩의 모든 플로 셀 상에 아민 커플링 키트(GE헬스케어)를 이용하여 고정화했다. 항체를 항kappa 센서 표면 상에 20RU(리조넌스 유닛) 부근의 포착 레벨로 포착한 후, 플로 셀 상에 실시예(1-1)에 있어서 조제한 인간, 필리핀원숭이 또는 마우스의 잠재형 TGF-β1(SLC)을 첨가했다. 모든 항체 및 애널라이트는 20mM ACES, 150mM NaCl, 0.05% Tween 20, 0.005% NaN3을 포함하는 ACES(pH 7.4)로 조제했다. 어세이 온도는 37℃로 설정했다. 센서 표면을, 사이클마다 10mM Glycine-HCl(pH 2.1)로 재생했다. Biacore Insight 소프트웨어, 버전 1.1.1.7442(GE헬스케어)를 이용하여 데이터를 처리하고, 1:1 결합 모델에 피팅하는 것에 의해 결합 활성을 결정했다.
항잠재형 TGF-β1 항체의, 인간, 필리핀원숭이(사이노) 또는 마우스 잠재형 TGF-β1에 대한 결합 활성(ka, kd 및 KD)을 표 3에 나타냈다.
Figure 112020129062073-pct00003
실시예 4: 항잠재형 TGF-β1 항체의 특성 평가
(4-1) 항잠재형 TGF-β1 항체는 세포 표면의 잠재형 TGF-β1에 결합했다
항잠재형 TGF-β1 항체(hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191 또는 hT0947AE09-SG191)의, 세포 표면의 잠재형 TGF-β1에 대한 결합 활성을, 마우스 잠재형 TGF-β1을 발현하는 Ba/F3 세포 또는 인간 잠재형 TGF-β1을 발현하는 FreeStyle(상표) 293-F 세포(서모피셔)를 이용하여 FACS로 시험했다. 항잠재형 TGF-β1 항체(각 10μg/mL)를, 각 세포주와 함께 4℃에서 30분간 인큐베이트하고, FACS 버퍼(PBS 중 2% FBS, 2mM EDTA)로 세정했다. 마우스 잠재형 TGF-β1에도 인간 잠재형 TGF-β1에도 결합하지 않는, 인간 IgG1 Fc 영역(IC17-hIgG1)을 갖는 항KLH 항체를 음성 대조 항체로서 이용했다. 그 후, Goat F(ab')2 anti-Human IgG, Mouse ads-PE(Southern Biotech, 카탈로그 2043-09)를 가하고 4℃에서 30분간 인큐베이트하고, FACS 버퍼로 세정했다. FACS Verse(벡톤 디킨슨)로 데이터를 취득한 후, FlowJo 소프트웨어(Tree Star) 및 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad)를 이용하여 해석 및 평균 형광 강도(Mean Fluorescence intensity; MFI)의 계산을 행했다. 도 1에 나타내는 바와 같이, 모든 항잠재형 TGF-β1 항체가, Ba/F3 세포에 발현한 마우스 세포 표면의 잠재형 TGF-β1 및 FreeStyle(상표) 293-F 세포에 발현한 세포 표면의 인간 잠재형 TGF-β1에 결합했다.
(4-2) 항잠재형 TGF-β1 항체는 성숙 TGF-β1에 결합하지 않고, 마우스 LAP에 결합했다
항잠재형 TGF-β1 항체(hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191 또는 hT0947AE09-SG191)의 성숙 TGF-β1에 대한 결합 활성을, ELISA에 의해 시험했다. 384웰 플레이트를, 마우스 혹은 인간 성숙 TGF-β1로 4℃에서 하룻밤 코팅한 후, PBS-T로 4회 세정했다. 세정 후, 플레이트를 블로킹 버퍼(1x TBS/Tween-20 + 0.5% BSA + 1x 블록 에이스)를 이용하여, 적어도 1시간 실온에서 블로킹한 후, PBS-T로 4회 세정했다. 세정 후, 항체 용액을 플레이트에 첨가하고, 2시간 실온에서 인큐베이트했다. 그 후 PBS-T로 4회 세정했다. 세정 후, 희석한 2차 항체(염소 항인간 IgG-HRP, Abcam, 카탈로그 ab98624)를 플레이트에 첨가하고, 1시간 실온에서 인큐베이트했다. 그 후, PBS-T로 4회 세정했다. 세정 후, TMB 용액을 플레이트에 첨가하고, 15분간 실온에서 인큐베이트했다. 그 후, 1N 황산을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 흡광도(optical density; OD)를 450nm/570nm에서 측정했다. 항KLH 항체(IC17-IgG1)를 음성 대조 항체로서 이용하고, 인간 IgG1 Fc 영역을 갖는 항성숙 TGF-β 항체 GC1008(미국 특허번호 US 8,383,780호에 기재된 바와 같음)(GC1008-F1332m)을 양성 대조 항체로서 이용했다. 도 2a 및 2b에 나타내는 바와 같이, 항잠재형 TGF-β1 항체는, 마우스 성숙 TGF-β1에도 인간 성숙 TGF-β1에도 결합하지 않았다.
더욱이, 항잠재형 TGF-β1 항체(hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191 또는 hT0947A09-SG191)의 마우스 잠재 관련 단백질(latency associated protein; LAP)에 대한 결합 활성을 ELISA에 의해 전술한 바와 같이 시험했다. 도 2c에 나타내는 바와 같이, 항잠재형 TGF-β1 항체는 마우스 LAP에 결합했다.
(4-3) 항잠재형 TGF-β1 항체는 자연발생적 잠재형 TGF-β1 활성화를 저해했다
실시예(1-1)에서 조제한 마우스 잠재형 TGF-β1(mSLC) 및 인간 잠재형 TGF-β1(hSLC)을 각각, 항잠재형 TGF-β1 항체(hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191 또는 hT0947AE09-SG191) 존재하 또는 비존재하, 37℃에서 1시간 인큐베이트했다. 항KLH 항체(IC17-IgG1)를 음성 대조로서 이용했다. 자연발생적 잠재형 TGF-β1 활성화 및 자연발생적 잠재형 TGF-β1 활성화의 항체 매개 저해를, 성숙 TGF-β1 ELISA(human TGF-β1 Quantikine ELISA Kit, R&D systems)에 의해 제조원의 수순에 따라 해석했다.
도 3에 나타내는 바와 같이, 항잠재형 TGF-β1 항체에 의해, 잠재형 TGF-β1의 자연발생적 활성화가 억제되었다.
(4-4) 항잠재형 TGF-β1 항체는 플라스민(PLN) 매개 잠재형 TGF-β1 활성화를 저해했다
실시예(1-1)에서 조제한 마우스 잠재형 TGF-β1(mSLC) 및 인간 잠재형 TGF-β1(hSLC)을 각각 항잠재형 TGF-β1 항체(hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191 또는 hT0947AE09-SG191) 존재하 또는 비존재하, 인간 플라스민(칼비오켐)과 함께 37℃에서 1시간 인큐베이트했다. 항체는, 플라스민과 함께 인큐베이트하기 전에, 마우스 혹은 인간 잠재형 TGF-β1(SLC)과 함께 30분간 실온에서 프레인큐베이트했다. 항KLH 항체(IC17-hIgG1)를 음성 대조로서 이용했다. 플라스민 매개 잠재형 TGF-β1 활성화 및 항체 매개 저해를, 성숙 TGF-β1 ELISA(Human TGF-β1 Quantikine ELISA Kit, R&D systems)에 의해, 제조원의 수순에 따라 해석했다. 도 4에 나타내는 바와 같이, 플라스민 매개 잠재형 TGF-β1 활성화가 항잠재형 TGF-β1 항체에 의해 억제되었다.
(4-5) 항잠재형 TGF-β1 항체는 혈장 칼리크레인(plasma kallikrein; PLK) 매개 잠재형 TGF-β1 활성화를 저해했다
실시예(1-1)에서 조제한 마우스 잠재형 TGF-β1(mSLC) 및 인간 잠재형 TGF-β1(hSLC)을, 각각 항잠재형 TGF-β1 항체(hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191 또는 hT0947AE09-SG191) 존재하 또는 비존재하, 인간 칼리크레인(Enzyme Research Laboratories)과 함께 37℃에서 2시간 인큐베이트했다. 항체는 칼리크레인과 함께 인큐베이트하기 전에, 마우스 또는 인간 잠재형 TGF-β1 (SLC)과 함께 30분간 실온에서 프레인큐베이트했다. 항KLH 항체(IC17-hIgG1)를 음성 대조로서 이용했다. 칼리크레인 매개 잠재형 TGF-β1 활성화 및 항체 매개 저해를, 성숙 TGF-β1 ELISA(Human TGF-β1 Quantikine ELISA Kit, R&D systems)에 의해 제조원의 수순에 따라 해석했다. 도 5에 나타내는 바와 같이, 칼리크레인 매개 잠재형 TGF-β1 활성화가 항잠재형 TGF-β1 항체에 의해 억제되었다.
(4-6) 항잠재형 TGF-β1 항체는 MMP2 및 MMP9 매개 인간 잠재형 TGF-β1 활성화를 저해했다
실시예(1-1)에 있어서 조제한 인간 잠재형 TGF-β1(SLC)을, 항잠재형 TGF-β1 항체(hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191 또는 hT0947AE09-SG191) 존재하 또는 비존재하, 활성 메탈로프로테이나제 2(MMP2) 또는 MMP9(R&D systems)와 함께 37℃에서 2시간 인큐베이트했다. 항체는, MMP2 또는 MMP9와 함께 인큐베이트하기 전에, 인간 잠재형 TGF-β1(SLC)과 함께 30분간 실온에서 프레인큐베이트했다. 항KLH 항체(IC17-hIgG1)를 음성 대조로서 이용했다. MMP2 및 MMP9 매개 인간 잠재형 TGF-β1 활성화 및 항체 매개 저해를, 성숙 TGF-β1 ELISA(Human TGF-β1 Quantikine ELISA Kit, R&D systems)에 의해 제조원의 수순에 따라 해석했다. 도 6에 나타내는 바와 같이, MMP2 매개 인간 잠재형 TGF-β1 활성화 및 MMP9 매개 인간 잠재형 TGF-β1 활성화의 양쪽이 항잠재형 TGF-β1 항체에 의해 억제되었다.
(4-7) 항잠재형 TGF-β1 항체는, 플라스민(PLN)에 의한 잠재형 TGF-β1 프로펩티드 절단을 방해하지 않고 잠재형 TGF-β1 활성화를 저해했다
실시예(1-1)에서 조제한 마우스 잠재형 TGF-β1(mSLC) 및 인간 잠재형 TGF-bβ1(hSLC)을, 각각 항잠재형 TGF-β1 항체(hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191 또는 hT0947AE09-SG191)의 존재하 또는 비존재하, 인간 플라스민(칼비오켐)과 함께 37℃에서 1시간 인큐베이트했다. 항체는, 플라스민과 인큐베이트하기 전에, 마우스 혹은 인간 잠재형 TGF-β1(SLC)과 함께 30분간 실온에서 프레인큐베이트했다. 세린 프로테아제 저해제의 하나로서, 플라스민의 활성을 저해함이 알려져 있는 캐모스타트 메실산염(TOCRIS)을 대조로서 이용했다. 시료는 4x SDS-PAGE 샘플 버퍼(와코)와 혼합한 후 95℃에서 5분간 가열하고, SDS 겔 전기 영동을 위해 로드했다. 단백질을, Trans-Blot(등록상표) Turbo(상표) Transfer System(바이오라드)에서 멤브레인에 전사했다. 잠재형 TGF-β1 프로펩티드는 마우스 항FLAG, M2-HRP 항체(시그마 알드리치)를 이용하여 검출했다. 멤브레인은 ECL 기질과 함께 인큐베이트하고, 화상을 ImageQuant LAS 4000(GE헬스케어)에 의해 취득했다.
도 7에 나타내는 바와 같이, 플라스민에 의한 잠재형 TGF-β1 프로펩티드 절단은 항잠재형 TGF-β1 항체에 의해서는 저해되지 않았다.
(4-8) 항잠재형 TGF-β1 항체는 마우스 PBMC에 있어서의 인테그린 매개 잠재형 TGF-β1 활성화를 유의하게 저해하지 않았다
인테그린 매개 잠재형 TGF-β1 활성화를 검출하기 위해, 마우스 PBMC 및 HEK-Blue(상표) TGF-β 세포 공-배양 어세이를 행했다. 마우스 PBMC는 Histopaque-1083 밀도 구배 배지(시그마 알드리치)를 이용하여 마우스 혈액으로부터 단리했다. Smad3/4-결합 엘리먼트(SBE) 유도성 SEAP 리포터 유전자를 발현하는 HEK-Blue(상표) TGF-β 세포(Invivogen)는, Smad3/4의 활성화를 모니터하는 것에 의해, 생물 활성 TGF-β1(마우스 TGF-β1 및 인간 TGF-β1의 양쪽)을 검출하는 것이 가능하다. 활성 TGF-β1은, SEAP의 산생 및 세포 상청으로의 분비를 자극한다. 분비된 SEAP량은 QUANTI-Blue(상표) 시약(Invivogen)을 이용하여 평가했다.
HEK-Blue(상표) TGF-β 세포는, 10% 소 태아 혈청, 50U/mL 스트렙토마이신, 50μg/mL 페니실린, 100μg/mL 노르모신, 30μg/mL 블래스티사이딘, 200μg/mL HygroGold 및 100μg/mL 제오신을 첨가한 DMEM 배지(Gibco)에서 유지했다. 기능 어세이 중, 세포용의 배지는 어세이 배지(10% FBS 함유 RPMI1640)로 교환하여, 96웰 플레이트에 파종했다. 다음에 항잠재형 TGF-β1 항체(hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191 또는 hT0947AE09-SG191) 및 마우스 PBMC를 웰에 어플라이하고, HEK-Blue(상표) TGF-β 세포와 함께 하룻밤 인큐베이트했다. 그 후, 세포 상청을 QUANTI-Blue(상표)와 혼합하고, 620nm에 있어서의 흡광도(OD)를 비색(比色) 플레이트 리더로 측정했다. RGD 펩티드(GRRGDLATIH, GenScript)는 인테그린류에 결합함이 알려져 있고, 데코이 인테그린 리간드로서 기능하여 인테그린 매개 TGF-β1 활성화를 억제한다. 그래서, RGD 펩티드를 양성 대조로서 이용했다. 더욱이, 데코이 인테그린 리간드로서 기능하지 않음이 알려져 있는 RGE 대조 펩티드(GRRGELATIH, GenScript)를 음성 대조로서 이용했다. 항KLH 항체(IC17-hIgG1)를 음성 대조로서 이용했다. 항성숙 TGF-β1 항체(GC1008-F1332m)를 양성 대조로서 이용했다. F1332m은, 이펙터 기능을 저감시키는 아미노산 치환을 포함하는 인간 IgG1 중쇄 정상 영역이다.
도 8에 나타내는 바와 같이, 항잠재형 TGF-β1 항체는, 마우스 PBMC에 있어서의 인테그린 매개 TGF-β1 활성화를 유의하게 저해하지 않았다.
실시예 5: 항잠재형 TGF-β1 항체의 항종양 활성(1)
항잠재형 TGF-β1 모노클로날 항체 hT0947AE04-mF18 단독 혹은 항PD-L1 항체와 병용했을 경우의 인비보 유효성을 EMT6 마우스 유방암 세포 및 Balb/c 마우스를 이용한 마우스 동종 이식 모델로 평가했다. 이 모델에 있어서, 면역 체크포인트 저해제 단독 처치는, 종양 증식 및 생존에 대해 한정된 효과를 나타낸다(Nature. 2018 Feb 22;554(7693):544-548 참조).
(5-1) 마우스 동종 이식 모델의 확립
EMT6 마우스 유방암 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC CRL-2755)으로부터 취득했다. 세포는 10% 소 태아 혈청(fetal bovine serum; FBS)(SIGMA)과 함께 2mM L-글루타민(SIGMA)을 첨가한 RPMI-1640 배지(SIGMA)에서 배양했다. 6주령의 특정 병원체 프리 Balb/c 암컷 마우스는, 일본 찰즈 리버사로부터 구입하여, 이식 전 2주간 순화시켰다. 대수 증식기의 EMT6 세포를 회수하고 행크스 평형 염 용액(Hank's balanced salt solution; HBSS)(SIGMA)으로 세정하고, 1x106세포/mL의 농도로 50% HBSS 및 50% 마트리겔(코닝)에 재현탁했다. 마우스의 좌 제5 유선 지방체에, 100μL의 HBSS:Matrigel(1:1) 중 1x105 세포의 EMT6 세포를 이식했다.
평균 종양 체적이 약 100-300mm3에 이른 후(이식 7일 후), 종양 체적 및 체중을 기초로, 마우스를 무작위로 그룹으로 나누었다. 종양 체적은 노기스로 측정하여, 다음과 같이 계산했다:
종양 체적(mm3) = (1/2) x 길이(mm) x 폭(mm)2
(5-2) 항종양 활성의 평가
실시예(5-1)에서 마우스 모델을 확립 후, 표 4에 나타내는 바와 같이, 아이소타입 컨트롤 항체(마우스 IgG1 항체와 래트 IgG2b 항체의 병용, Bio X Cell로부터 구입), 항마우스 PD-L1 항체(래트 IgG2b 클론 10F.9G2, Bio X Cell로부터 구입), hT0947AE04-mF18 또는 hT0947AE04-mF18과 항마우스 PD-L1 항체의 병용에 의해 마우스를 처치했다. 항체는 주 3회, 3주간 투여했다. 초회 투여는 정맥내 투여, 투여 2회째 이후는 복강내 투여로 행했다.
Figure 112020129062073-pct00004
종양 체적은 주 2회 측정했다. 결과를 도 9에 나타낸다.
항종양 활성은 종양 증식 저해(tumor growth inhibition: TGI[%])에 의해서도 평가했다. 특정의 그룹의 특정의 날에 있어서의 TGI[%]는 다음과 같이 계산했다:
TGI[%] = {1-(T-T0)/(C-C0)} x 100
여기에서, 'T'는 측정일에 있어서의 그룹의 평균 종양 체적, 'T0'은 무작위화일에 있어서의 그룹의 평균 종양 체적, 'C'는 측정일에 있어서의 그룹 1(아이소타입 컨트롤)의 평균 종양 체적, 및 'C0'는 무작위화일에 있어서의 그룹 1(아이소타입 컨트롤)의 평균 종양 체적이다.
그 결과, 항마우스 PD-L1 항체(그룹 2), hT0947AE04-mF18(그룹 3) 및 hT0947AE04-mF18과 항마우스 PD-L1 항체의 병용(그룹 4)의, 초회 투여 14일 후에 있어서의 TGI[%]치는 각각 51, 12 및 83이었다. 따라서, 항잠재형 TGF-β1 (hT0947AE04-mF18) 및 항PD-L1 항체 사이에 상승적인 항종양 효과가 관찰되었다.
또한, 생존 곡선을 플로팅하여, 각 그룹의 생존을 평가했다. "생존한" 마우스의 정의는 다음과 같다: 마우스의 종양 체적이 1955mm3를 초과하지 않았다. 도 10에 나타내는 바와 같이, hT0947AE04-mF18과 항마우스 PD-L1 항체의 병용 처치(그룹 4)는, 항마우스 PD-L1 항체 처치 마우스(그룹 2) 및 hT0947AE04-mF18 처치 마우스(그룹 3)와 비교하여, 마우스의 생존을 유의하게 증가시켰다.
실시예 6: 항잠재형 TGF-β1 항체의 항종양 활성(2)
항잠재형 TGF-β1 모노클로날 항체 hT0947AE04-mF18, hT0947AE07-SG181 또는 hT0947AE08-SG181의 항PD-L1 항체와의 병용에 있어서의 인비보 유효성을, EMT6 마우스 유방암 세포 및 Balb/c 마우스를 이용한 마우스 동종 이식 모델에 있어서 평가했다.
(6-1) 마우스 동종 이식 모델의 확립
EMT6 마우스 유방암 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC CRL-2755)으로부터 취득했다. 세포는 10% 소 태아 혈청(FBS; SIGMA)과 함께 2mM L-글루타민(SIGMA)을 첨가한 RPMI-1640 배지(SIGMA)에서 배양했다. 7주령의 특정 병원체 프리 Balb/c 암컷 마우스를 일본 찰즈 리버사로부터 구입하고, 이식 전 1주간 순화시켰다. 대수 증식기의 EMT6 세포를 회수하고 행크스 평형 염 용액(HBSS; SIGMA)으로 세정하고, 1x106세포/mL의 농도로 50% HBSS 및 50% 마트리겔(코닝)에 재현탁했다. 마우스 좌 제5 유선 지방체에, 100μL의 HBSS:마트리겔(1:1) 중 1x105 세포의 EMT6 세포를 이식했다.
평균 종양 체적이 약 100-300mm3에 이른 후(이식 7일 후), 종양 체적 및 체중을 기초로, 마우스를 그룹으로 무작위로 나누었다. 종양 체적은 노기스로 측정하여, 다음과 같이 계산했다:
종양 체적(mm3) = (1/2) x 길이(mm) x 폭(mm)2
(6-2) 항종양 활성의 평가
실시예(6-1)에서 마우스 모델을 확립 후, 표 5에 나타내는 바와 같이, 마우스를, 용매(150mM NaCl/20mM His-HCl 버퍼, pH 6.0), 항마우스 PD-L1 항체(래트 IgG2b 클론 10F.9G2, Bio X Cell로부터 구입), hT0947AE04-mF18의 항마우스 PD-L1 항체와의 병용, hT0947AE07-SG181의 항마우스 PD-L1 항체와의 병용 또는 hT0947AE08-SG181의 항마우스 PD-L1 항체와의 병용으로 처치했다. 항체는, 주 3회, 3주간 투여했다. 초회 투여는 정맥내 투여, 투여 2회째 이후는 복강내 투여로 행했다.
Figure 112020129062073-pct00005
종양 체적은 주 2회 측정했다. 결과를 도 11에 나타낸다.
항종양 활성은, 종양 증식 저해(TGI[%])에 의해서도 평가했다. (TGI[%])는, 실시예(5-2)와 마찬가지로, {1-(T-T0)/(C-C0)} x 100으로서 계산했다.
항마우스 PD-L1 항체 단독(그룹 2), hT0947AE04-mF18과 항마우스 PD-L1 항체의 병용(그룹 3), hT0947AE07-SG181과 항마우스 PD-L1 항체의 병용(그룹 4) 및 hT0947AE08-SG181과 항마우스 PD-L1 항체의 병용(그룹 5)에 있어서의 초회 투여 14일 후의 TGI[%]는, 각각 64, 89, 86 및 76이었다. 따라서, 항잠재형 TGF-β1 항체는 항PD-L1 항체와의 병용 유효성을 나타냈다.
실시예 7: 항잠재형 TGF-β1 항체의 UUO 유도성 마우스 신장 섬유증 모델에 있어서의 인비보 유효성
모노클로날 항체 hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191 및 hT0947AE08-SG191의 인비보 유효성을, 진행성 신장 섬유증을 유도함이 알려져 있는 편측 요관 결찰(Unilateral Ureteral Obstruction; UUO) 마우스 모델로 평가했다.
(7-1) UUO 유도 마우스 신장 섬유증 모델의 확립
모노클로날 항체 hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191 및 hT0947AE08-SG191의 인비보 유효성을, 진행성 신장 섬유증을 유도하는 편측 요관 결찰(UUO) 마우스 모델로 평가했다.
6주령의 특정 병원체 프리 C57BL/6NTac 수컷 마우스를 Invivos Pte Ltd(싱가포르)로부터 구입하고, 처치 개시 전에 1주간 순화시켰다. 동물은, 20 내지 26℃, 12시간 명기/12시간 암기의 사이클로, 시판되는 표준 사료(5P75; PMI Nutrition INT'L(LabDiet), 미주리주, 미국) 및 수돗물을 자유롭게 주어 유지했다.
아이소플루레인 마취 조건하에서 UUO 수술을 행했다. 복부의 좌측을 체모(剃毛)하고, 피부 상에 세로 절개부를 형성했다. 제 2 절개부를 복막 상에 형성하고, 피부도 끌어 당겨, 신장을 노출시켰다. 겸자를 이용하여, 신장을 표면에 꺼내고, 좌뇨관을, 신장 아래에서 2개소, 수술용의 실크를 이용하여 단단히 조였다. 결찰한 신장을, 신중하게 그 정확한 해부학적 위치로 되돌리고, 그 후에 복막 및 피부를 봉합했다. 동물의 고통을 완화시키기 위해서 진통제를 첨가했다. 의사 수술 그룹에서는, 복막 및 피부를 절개 및 봉합했을 뿐이었다.
(7-2) 인비보 유효성의 평가
모노클로날 항체는 모두, 15mg/kg으로 정맥내 주사에 의해 외과 수술 1일 전부터 주 3회 투여했다. 본 시험에서는, 항KLH 항체(IC17dk-SG181)를 음성 대조로서 이용했다. 의사 수술 그룹에는 항KLH 항체(IC17dk-SG181)를 투여했다. 수술 7일 후 동물을 체중 측정하고, 아이소플루레인 마취하 전채혈에 의해 도살했다. 혈액 샘플을 심장강 또는 하대정맥으로부터 회수하고, 어세이까지 -80℃에서 유지했다. 신장은 신속하게 꺼냈다. 분자 해석을 위해서, 신장 조직의 일부를 액체 질소 혹은 드라이아이스로 급속 동결했다.
콜라겐에 포함되는 아미노산의 하나인 하이드록시프롤린의 신장 내포량을 측정하여, 조직으로의 세포외 매트릭스(extramatrix) 침착을 평가했다. 습신장 조직은 95℃에서 3시간 건조시키고, 칭량했다. 그 다음에, 6N HCl(100μL/1mg 건조 조직)을 건조한 조직에 첨가하고, 하룻밤 끓였다. 시료는 필터에 의해 세정하고, 10μL의 각 시료를 96웰 플레이트에 파종했다. 시료를 포함하는 플레이트를 60℃에서 건조하고, 하이드록시프롤린 어세이 키트(BioVision)를 이용하여 하이드록시프롤린을 측정했다. 이 실험 결과를 도 12에 나타낸다. 하이드록시프롤린 함량의 유의한 증가가 질환 유도 신장에 있어서 관찰되고, 모든 항체(hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191 및 hT0947AE08-SG191)가 신장 섬유화를 저해했다. 데이터는 평균+/-평균치의 표준 오차(SEM)로 나타낸다. 통계 분석은, 스튜던트의 t 검정의 해석을 이용하여 행했다. P치가 <0.05였을 때, 차이가 유의하다고 간주했다.
실시예 8: 항잠재형 TGF-β1 항체의 독성 평가
항잠재형 TGF-β1 항체의 잠재 독성을, 항성숙 TGF-β 항체 GC1008-mF18(마우스 IgG Fc 영역 mF18을 갖는 항성숙 TGF-β 항체 GC1008(미국 특허번호 US 8,383,780호에 기재된 바와 같음))과 비교한 정상 마우스 및 필리핀원숭이에 있어서의 반복 투여 독성 시험으로 평가했다. 항잠재형 TGF-β1 항체는 마우스 및 필리핀원숭이에 있어서 교차 반응하기 때문에, 마우스 및 필리핀원숭이를, 인비보 독성 시험에 있어서의 평가를 위한 동물종으로서 선택했다. 모든 독성 시험의 개요에 대해서는, 표 6을 참조.
Figure 112020129062073-pct00006
마우스 3개월 시험(IV; 5 또는 20mg/kg, Q2D, 합계 46 투여)에 있어서는, 빈혈(hT0947AE04-mF18 그룹에 있어서는 20mg/kg; GC1008-mF18 그룹에 있어서는 5 및 20mg/kg) 및 심장병변(GC1008-mF18 그룹에 있어서는 5 및 20mg/kg; 표 7 참조)이 인정되었다. 이들 소견은, TGF-β 저해의 온타겟(on-target) 독성에 의해 야기되고 있다고 생각되었다. 마우스 3개월 시험에 있어서의 온타겟 독성을 고려하면, hT0947AE04-mF18에 대한 NOAEL은 5mg/kg IV Q2D였다. 또한, GC1008-mF18의 5mg/kg군에 대한 유해 작용에 의해, 마우스 3개월 시험의 조건에 있어서는, GC1008-mF18에 대한 NOAEL은 결정되지 않았다.
Figure 112020129062073-pct00007
원숭이 6주 시험(IV; 10, 30 또는 100mg/kg, Q2W, 합계 4 투여)에 있어서, hT0947AE07-SG191의 IV 투여에 의한 독성 변화는 인정되지 않고, NOAEL은 최고 용량인 100mg/kg Q2W였다.
실시예 9: 항잠재형 TGF-β1 항체의 항종양 활성(3)
항마우스 PD-L1 항체와 병용했을 경우의 항잠재형 TGF-β1 모노클로날 항체 hT0947AE07-SG191의 인비보 유효성을, EMT6 마우스 유방암 Balb/c 마우스 동종 이식 모델에 있어서 평가했다.
EMT6 마우스 유방암 세포주는, American Type Culture Collection으로부터 취득했다. 세포는, 10% 소 태아 혈청(FBS; 주식회사 니치레이 바이오사이언스)을 첨가한 RPMI-1640 배지(SIGMA)에서 배양했다. 6주령의 특정 병원체 프리 Balb/c 암컷 마우스는, 일본 찰즈 리버사부터 구입하고, 이식 1주간 전 순화시켰다. 대수 증식기의 EMT6 세포를 회수하고, 행크스 평형 염 용액(HBSS; SIGMA)으로 세정하고, 1x106세포/mL의 농도로 50% HBSS 및 50% Matrigel(코닝)에 재현탁했다. 마우스의 좌 제5 유선 지방체에, 100μL의 HBSS:마트리겔(1:1) 중 1x105 세포의 EMT6 세포를 이식했다.
평균 종양 체적이 약 100-300mm3(이식 7일 후)에 이른 후, 마우스를 종양 체적 및 체중을 기초로, 무작위로 그룹으로 나누었다. 종양 체적은 노기스로 측정하고, 1/2 x l x w2(l=길이, w=폭)로서 계산했다.
용매(150mM NaCl/20mM His-HCl 버퍼, pH 6.0), 항마우스 PD-L1 항체(래트 IgG2b 클론 10F.9G2, Bio X cell로부터 구입, 초회 투여 10mg/kg, 계속하여 그 이후 5mg/kg), hT0947AE07-SG191(10mg/kg)과 항마우스 PD-L1 항체의 병용 또는 hT0947AE07-SG191(30mg/kg)과 항마우스 PD-L1 항체의 병용에 의해 마우스를 처치했다. 항체는 주 3회 2주간, 초회 투여는 정맥내 투여, 그 이후는 복강내 투여로 투여했다.
종양 체적은 주 2회 측정했다. 항종양 활성은, {1-(T-T0)/(C-C0)} x 100으로서 계산된 종양 증식 저해(TGI[%])에 의해 평가했고, 여기에서 그룹의 측정일에 있어서의 평균 종양 체적은 T이고 무작위화일에 있어서의 평균 종양 체적은 T0이며, 마찬가지로 용매 대조 그룹의 평균 종양 체적은 C 및 C0에 의해 나타내진다.
본 실험의 결과를 도 13에 나타낸다.
항마우스 PD-L1 항체만, hT0947AE07-SG191(10mg/kg)과 항마우스 PD-L1 항체의 병용, 및 hT0947AE07-SG191(30mg/kg)과 항마우스 PD-L1 항체의 병용의 초회 투여 14일 후에 있어서의 TGI[%]는 각각 60, 77 및 80이었다. hT0947AE07-SG191은, 항마우스 PD-L1 항체와의 병용 유효성을 나타냈다.
본원 발명은, 명확한 이해를 위해서 도시 및 실시예에 의해 어느 정도 상세하게 본 명세서에 기재되어 있지만, 상세한 설명 및 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 본 명세서에서 인용되고 있는 모든 특허 및 과학 문헌의 개시는, 참조에 의해 그들의 전체가 명시적으로 원용된다.
본원 발명은, 잠재형 TGF-β1의 인테그린 매개 활성화를 저해하지 않고 잠재형 TGF-β1의 프로테아제 매개 활성화를 저해하는 종교차성 항잠재형 TGF-β1 항체를 제공한다. 본원 발명은 또한, 항잠재형 TGF-β1 항체 및 체크포인트 저해제를 포함하는 병용 요법을 제공한다. 체크포인트 저해제와 병용 투여할 수 있는 본원 발명의 항잠재형 TGF-β1 항체는, 섬유증 및 암과 같은 TGF-β1 관련 질환의 치료에 유용할 것이 기대된다.
SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> CROSS-SPECIES ANTI-LATENT TGF-BETA 1 ANTIBODIES AND METHODS OF USE <130> C1-A1921P <150> JP 2019-155278 <151> 2019-08-28 <160> 73 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 387 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> flag-tagged human latent TGF-beta 1 <400> 1 Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Leu Leu Phe Ile Ser Gly Ser Ala 1 5 10 15 Phe Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Leu Ser Thr Ser Lys Thr 20 25 30 Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala Ile Arg Gly 35 40 45 Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser Gln Gly Glu 50 55 60 Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu Ala Leu Tyr Asn Ser 65 70 75 80 Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Ala Glu Pro Glu Pro Glu Pro 85 90 95 Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr Arg Val Leu Met Val Glu 100 105 110 Thr His Asn Glu Ile Tyr Asp Lys Phe Lys Gln Ser Thr His Ser Ile 115 120 125 Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Glu Leu Arg Glu Ala Val Pro Glu Pro 130 135 140 Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Leu Arg Leu Lys Leu Lys 145 150 155 160 Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln Lys Tyr Ser Asn Asn Ser Trp 165 170 175 Arg Tyr Leu Ser Asn Arg Leu Leu Ala Pro Ser Asp Ser Pro Glu Trp 180 185 190 Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly Val Val Arg Gln Trp Leu Ser Arg Gly 195 200 205 Gly Glu Ile Glu Gly Phe Arg Leu Ser Ala His Cys Ser Cys Asp Ser 210 215 220 Arg Asp Asn Thr Leu Gln Val Asp Ile Asn Gly Phe Thr Thr Gly Arg 225 230 235 240 Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile His Gly Met Asn Arg Pro Phe Leu Leu 245 250 255 Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu Arg Ala Gln His Leu Gln Ser Ser Arg 260 265 270 His Arg Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys 275 280 285 Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly 290 295 300 Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu 305 310 315 320 Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr Ser Lys Val 325 330 335 Leu Ala Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Cys 340 345 350 Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr Tyr Val Gly 355 360 365 Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Arg Ser Cys 370 375 380 Lys Cys Ser 385 <210> 2 <211> 1167 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> flag-tagged human latent TGF-beta 1 <400> 2 atgaagtggg taacctttct cctcctcctc ttcatctccg gttctgcctt ttccgactac 60 aaggatgacg atgacaagct atccacctcc aagactatcg acatggagct ggtgaagcgg 120 aagcgcatcg aggccatccg cggccagatc ctgtccaagc tgcggctcgc cagccccccg 180 agccaggggg aggtgccgcc cggcccgctg cccgaggccg tgctcgccct gtacaacagc 240 acccgcgacc gggtggccgg ggagagtgca gaaccggagc ccgagcctga ggccgactac 300 tacgccaagg aggtcacccg cgtgctaatg gtggaaaccc acaacgaaat ctatgacaag 360 ttcaagcaga gtacacacag catatatatg ttcttcaaca catcagagct ccgagaagcg 420 gtacctgaac ccgtgttgct ctcccgggca gagctgcgtc tgctgaggct caagttaaaa 480 gtggagcagc acgtggagct gtaccagaaa tacagcaaca attcctggcg atacctcagc 540 aaccggctgc tggcacccag cgactcgcca gagtggttat cttttgatgt caccggagtt 600 gtgcggcagt ggttgagccg tggaggggaa attgagggct ttcgccttag cgcccactgc 660 tcctgtgaca gcagggataa cacactgcaa gtggacatca acgggttcac taccggccgc 720 cgaggtgacc tggccaccat tcatggcatg aaccggcctt tcctgcttct catggccacc 780 ccgctggaga gggcccagca tctgcaaagc tcccggcacc gccgagccct ggacaccaac 840 tattgcttca gctccacgga gaagaactgc tgcgtgcggc agctgtacat tgacttccgc 900 aaggacctcg gctggaagtg gatccacgag cccaagggct accatgccaa cttctgcctc 960 gggccctgcc cctacatttg gagcctggac acgcagtaca gcaaggtcct ggccctgtac 1020 aaccagcata acccgggcgc ctcggcggcg ccgtgctgcg tgccgcaggc gctggagccg 1080 ctgcccatcg tgtactacgt gggccgcaag cccaaggtgg agcagctgtc caacatgatc 1140 gtgcgctcct gcaagtgcag ctgatga 1167 <210> 3 <211> 387 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> flag-tagged mouse latent TGF-beta 1 <400> 3 Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Leu Leu Phe Ile Ser Gly Ser Ala 1 5 10 15 Phe Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Leu Ser Thr Ser Lys Thr 20 25 30 Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala Ile Arg Gly 35 40 45 Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser Gln Gly Glu 50 55 60 Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu Ala Leu Tyr Asn Ser 65 70 75 80 Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Ala Asp Pro Glu Pro Glu Pro 85 90 95 Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr Arg Val Leu Met Val Asp 100 105 110 Arg Asn Asn Ala Ile Tyr Glu Lys Thr Lys Asp Ile Ser His Ser Ile 115 120 125 Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Asp Ile Arg Glu Ala Val Pro Glu Pro 130 135 140 Pro Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Gln Arg Leu Lys Ser Ser 145 150 155 160 Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln Lys Tyr Ser Asn Asn Ser Trp 165 170 175 Arg Tyr Leu Gly Asn Arg Leu Leu Thr Pro Thr Asp Thr Pro Glu Trp 180 185 190 Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly Val Val Arg Gln Trp Leu Asn Gln Gly 195 200 205 Asp Gly Ile Gln Gly Phe Arg Phe Ser Ala His Cys Ser Cys Asp Ser 210 215 220 Lys Asp Asn Lys Leu His Val Glu Ile Asn Gly Ile Ser Pro Lys Arg 225 230 235 240 Arg Gly Asp Leu Gly Thr Ile His Asp Met Asn Arg Pro Phe Leu Leu 245 250 255 Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu Arg Ala Gln His Leu His Ser Ser Arg 260 265 270 His Arg Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys 275 280 285 Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly 290 295 300 Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu 305 310 315 320 Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr Ser Lys Val 325 330 335 Leu Ala Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ser Pro Cys 340 345 350 Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr Tyr Val Gly 355 360 365 Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Arg Ser Cys 370 375 380 Lys Cys Ser 385 <210> 4 <211> 1167 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> flag-tagged mouse latent TGF-beta 1 <400> 4 atgaagtggg taacctttct cctcctcctc ttcatctccg gttctgcctt ttccgactac 60 aaggatgacg atgacaagct ctccacctcc aagaccatcg acatggagct ggtgaaacgg 120 aagcgcatcg aagccatccg tggccagatc ctgtccaaac taaggctcgc cagtccccca 180 agccaggggg aggtaccgcc cggcccgctg cccgaggcgg tgctcgcttt gtacaacagc 240 acccgcgacc gggtggcagg cgagagcgcc gacccagagc cggagcccga agcggactac 300 tatgctaaag aggtcacccg cgtgctaatg gtggaccgca acaacgccat ctatgagaaa 360 accaaagaca tctcacacag tatatatatg ttcttcaata cgtcagacat tcgggaagca 420 gtgcccgaac ccccattgct gtcccgtgca gagctgcgct tgcagagatt aaaatcaagt 480 gtggagcaac atgtggaact ctaccagaaa tatagcaaca attcctggcg ttaccttggt 540 aaccggctgc tgacccccac tgatacgcct gagtggctgt cttttgacgt cactggagtt 600 gtacggcagt ggctgaacca aggagacgga atacagggct ttcgattcag cgctcactgc 660 tcttgtgaca gcaaagataa caaactccac gtggaaatca acgggatcag ccccaaacgt 720 cggggcgacc tgggcaccat ccatgacatg aaccggccct tcctgctcct catggccacc 780 cccctggaaa gggcccagca cctgcacagc tcacggcacc ggagagccct ggataccaac 840 tattgcttca gctccacaga gaagaactgc tgtgtgcggc agctgtacat tgactttagg 900 aaggacctgg gttggaagtg gatccacgag cccaagggct accatgccaa cttctgtctg 960 ggaccctgcc cctatatttg gagcctggac acacagtaca gcaaggtcct tgccctctac 1020 aaccaacaca acccgggcgc ttcggcgtca ccgtgctgcg tgccgcaggc tttggagcca 1080 ctgcccatcg tctactacgt gggtcgcaag cccaaggtgg agcagttgtc caacatgatt 1140 gtgcgctcct gcaagtgcag ctgatga 1167 <210> 5 <211> 387 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> flag-tagged cynomolgus monkey latent TGF-beta 1 <400> 5 Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Leu Leu Phe Ile Ser Gly Ser Ala 1 5 10 15 Phe Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Leu Ser Thr Ser Lys Thr 20 25 30 Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala Ile Arg Gly 35 40 45 Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser Gln Gly Glu 50 55 60 Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu Ala Leu Tyr Asn Ser 65 70 75 80 Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Ala Glu Pro Glu Pro Glu Pro 85 90 95 Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr Arg Val Leu Met Val Glu 100 105 110 Thr His Asn Glu Ile Tyr Asp Lys Phe Lys Gln Ser Thr His Ser Ile 115 120 125 Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Glu Leu Arg Glu Ala Val Pro Glu Pro 130 135 140 Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Leu Arg Leu Lys Leu Lys 145 150 155 160 Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln Lys Tyr 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Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala 100 105 110 Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser 115 120 125 Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp 130 135 140 Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val 145 150 155 160 Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser 180 185 190 Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215 <210> 65 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hT0947AE07L-mk1 <400> 65 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 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20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ser Asp Ala Asp Ser 85 90 95 Val Gly Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala 100 105 110 Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser 115 120 125 Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp 130 135 140 Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val 145 150 155 160 Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser 180 185 190 Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215 <210> 68 <211> 390 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Met Pro Pro Ser Gly Leu Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu Pro Leu Leu 1 5 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agcgcatcga ggccatccgc ggccagatcc tgtccaagct gcggctcgcc 180 agccccccga gccaggggga ggtgccgccc ggcccgctgc ccgaggccgt gctcgccctg 240 tacaacagca cccgcgaccg ggtggccggg gagagtgcag aaccggagcc cgagcctgag 300 gccgactact acgccaagga ggtcacccgc gtgctaatgg tggaaaccca caacgaaatc 360 tatgacaagt tcaagcagag tacacacagc atatatatgt tcttcaacac atcagagctc 420 cgagaagcgg tacctgaacc cgtgttgctc tcccgggcag agctgcgtct gctgaggctc 480 aagttaaaag tggagcagca cgtggagctg taccagaaat acagcaacaa ttcctggcga 540 tacctcagca accggctgct ggcacccagc gactcgccag agtggttatc ttttgatgtc 600 accggagttg tgcggcagtg gttgagccgt ggaggggaaa ttgagggctt tcgccttagc 660 gcccactgct cctgtgacag cagggataac acactgcaag tggacatcaa cgggttcact 720 accggccgcc gaggtgacct ggccaccatt catggcatga accggccttt cctgcttctc 780 atggccaccc cgctggagag ggcccagcat ctgcaaagct cccggcaccg ccgagccctg 840 gacaccaact attgcttcag ctccacggag aagaactgct gcgtgcggca gctgtacatt 900 gacttccgca aggacctcgg ctggaagtgg atccacgagc ccaagggcta ccatgccaac 960 ttctgcctcg ggccctgccc ctacatttgg agcctggaca cgcagtacag caaggtcctg 1020 gccctgtaca accagcataa cccgggcgcc tcggcggcgc cgtgctgcgt gccgcaggcg 1080 ctggagccgc tgcccatcgt gtactacgtg ggccgcaagc ccaaggtgga gcagctgtcc 1140 aacatgatcg tgcgctcctg caagtgcagc tga 1173 <210> 70 <211> 390 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 70 Met Pro Pro Ser Gly Leu Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu Pro Leu Pro 1 5 10 15 Trp Leu Leu Val Leu Thr Pro Gly Arg Pro Ala Ala Gly Leu Ser Thr 20 25 30 Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala 35 40 45 Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser 50 55 60 Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu Ala Leu 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Ala Asp Pro Glu 85 90 95 Pro Glu Pro Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr Arg Val Leu 100 105 110 Met Val Asp Arg Asn Asn Ala Ile Tyr Glu Lys Thr Lys Asp Ile Ser 115 120 125 His Ser Ile Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Asp Ile Arg Glu Ala Val 130 135 140 Pro Glu Pro Pro Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Gln Arg Leu 145 150 155 160 Lys Ser Ser Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln Lys Tyr Ser Asn 165 170 175 Asn Ser Trp Arg Tyr Leu Gly Asn Arg Leu Leu Thr Pro Thr Asp Thr 180 185 190 Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly Val Val Arg Gln Trp Leu 195 200 205 Asn Gln Gly Asp Gly Ile Gln Gly Phe Arg Phe Ser Ala His Cys Ser 210 215 220 Cys Asp Ser Lys Asp Asn Lys Leu His Val Glu Ile Asn Gly Ile Ser 225 230 235 240 Pro Lys Arg Arg Gly Asp Leu Gly Thr Ile His Asp Met Asn Arg Pro 245 250 255 Phe Leu Leu Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu Arg Ala Gln His Leu His 260 265 270 Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser 275 280 285 Thr Glu Lys Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys 290 295 300 Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn 305 310 315 320 Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr 325 330 335 Ser Lys Val Leu Ala Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala 340 345 350 Ser Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr 355 360 365 Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val 370 375 380 Arg Ser Cys Lys Cys Ser 385 390 <210> 71 <211> 1173 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 71 atgccgccct cggggctgcg gctactgccg cttctgctcc cactcccgtg gcttctagtg 60 ctgacgcccg ggaggccagc cgcgggactc tccacctgca agaccatcga catggagctg 120 gtgaaacgga agcgcatcga agccatccgt ggccagatcc tgtccaaact aaggctcgcc 180 agtcccccaa gccaggggga ggtaccgccc ggcccgctgc ccgaggcggt gctcgctttg 240 tacaacagca cccgcgaccg ggtggcaggc gagagcgccg acccagagcc ggagcccgaa 300 gcggactact atgctaaaga ggtcacccgc gtgctaatgg tggaccgcaa caacgccatc 360 tatgagaaaa ccaaagacat ctcacacagt atatatatgt tcttcaatac gtcagacatt 420 cgggaagcag tgcccgaacc cccattgctg tcccgtgcag agctgcgctt gcagagatta 480 aaatcaagtg tggagcaaca tgtggaactc taccagaaat atagcaacaa ttcctggcgt 540 taccttggta accggctgct gacccccact gatacgcctg agtggctgtc ttttgacgtc 600 actggagttg tacggcagtg gctgaaccaa ggagacggaa tacagggctt tcgattcagc 660 gctcactgct cttgtgacag caaagataac aaactccacg tggaaatcaa cgggatcagc 720 cccaaacgtc ggggcgacct gggcaccatc catgacatga accggccctt cctgctcctc 780 atggccaccc ccctggaaag ggcccagcac ctgcacagct cacggcaccg gagagccctg 840 gataccaact attgcttcag ctccacagag aagaactgct gtgtgcggca gctgtacatt 900 gactttagga aggacctggg ttggaagtgg atccacgagc ccaagggcta ccatgccaac 960 ttctgtctgg gaccctgccc ctatatttgg agcctggaca cacagtacag caaggtcctt 1020 gccctctaca accaacacaa cccgggcgct tcggcgtcac cgtgctgcgt gccgcaggct 1080 ttggagccac tgcccatcgt ctactacgtg ggtcgcaagc ccaaggtgga gcagttgtcc 1140 aacatgattg tgcgctcctg caagtgcagc tga 1173 <210> 72 <211> 390 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 72 Met Pro Pro Ser Gly Leu Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu Pro Leu Leu 1 5 10 15 Trp Leu Leu Val Leu Thr Pro Gly Arg Pro Ala Ala Gly Leu Ser Thr 20 25 30 Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala 35 40 45 Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser 50 55 60 Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu Ala Leu 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Ala Glu Pro Glu 85 90 95 Pro Glu Pro Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr Arg Val Leu 100 105 110 Met Val Glu Thr His Asn Glu Ile Tyr Asp Lys Phe Lys Gln Ser Thr 115 120 125 His Ser Ile Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Glu Leu Arg Glu Ala Val 130 135 140 Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Leu Arg Leu 145 150 155 160 Lys Leu Lys Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln Lys Tyr Ser Asn 165 170 175 Asn Ser Trp Arg Tyr Leu Ser Asn Arg Leu Leu Ala Pro Ser Asp Ser 180 185 190 Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly Val Val Arg Gln Trp Leu 195 200 205 Ser Arg Gly Gly Glu Ile Glu Gly Phe Arg Leu Ser Ala His Cys Ser 210 215 220 Cys Asp Ser Lys Asp Asn Thr Leu Gln Val Asp Ile Asn Gly Phe Thr 225 230 235 240 Thr Gly Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile His Gly Met Asn Arg Pro 245 250 255 Phe Leu Leu Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu Arg Ala Gln His Leu Gln 260 265 270 Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser 275 280 285 Thr Glu Lys Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys 290 295 300 Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn 305 310 315 320 Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr 325 330 335 Ser Lys Val Leu Ala Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala 340 345 350 Ala Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr 355 360 365 Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val 370 375 380 Arg Ser Cys Lys Cys Ser 385 390 <210> 73 <211> 1173 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 73 atgccgccct ccgggctgcg gctgctgccg ctgctgctac cgctgctgtg gctactggtg 60 ctgacgcctg gccggccggc cgccggacta tccacctgca agactatcga catggagctg 120 gtgaagcgga agcgcatcga ggccatccgc ggccagatcc tgtccaagct gcggctcgcc 180 agccccccga gccaggggga ggtgccgccc ggcccgctgc ccgaggccgt gctcgccctg 240 tacaacagca cccgcgaccg ggtggccggg gagagtgcgg agccggaacc cgaaccggag 300 gccgactact acgccaagga ggtcacccgc gtgctaatgg tggaaaccca caacgaaatc 360 tatgacaagt tcaagcagag cacacacagc atatatatgt tcttcaacac atcagagctc 420 cgagaagcag tacctgaacc tgtgttgctc tcccgggcag agctgcgtct gctgaggctc 480 aagttaaaag tggagcagca tgtggagctg taccagaaat acagcaacaa ttcctggcga 540 tacctcagca accggctgct ggcgcccagc gactcgccgg agtggttgtc ttttgatgtc 600 accggagttg tgcggcagtg gttgagccgc ggaggggaaa ttgagggctt tcgccttagc 660 gcccactgct cctgtgacag caaagataac acactgcaag tggacatcaa cgggttcact 720 accggccgcc gaggtgacct ggccaccatt catggcatga accggccttt cctgcttctc 780 atggccaccc cgctggagag ggcccaacat ctgcaaagct cccggcaccg ccgagccctg 840 gacaccaact actgcttcag ctccacggag aagaactgct gcgtgcggca gctgtatatt 900 gacttccgca aggacctcgg ctggaagtgg atccacgagc ccaagggcta ccatgccaac 960 ttctgcctgg gaccctgccc ctacatttgg agcctggaca cgcagtacag caaggtcctg 1020 gccctgtaca accagcataa cccgggcgcc tcggcggcgc cgtgctgcgt gccgcaggcg 1080 ctggagccgc tgcccatcgt gtactacgtg ggccgcaagc ccaaggtgga gcagctgtcc 1140 aacatgatcg tgcgctcctg caaatgcagc tga 1173

Claims (15)

  1. 이하를 포함하는, 항잠재형 TGF-β1 항체:
    (a) 서열 번호: 20, 21 및 22의 아미노산 서열로 각각 이루어진 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3, 및 서열 번호: 23, 24 및 25의 아미노산 서열로 각각 이루어진 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3;
    (b) 서열 번호: 26, 27 및 28의 아미노산 서열로 각각 이루어진 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3, 및 서열 번호: 29, 30 및 31의 아미노산 서열로 각각 이루어진 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3;
    (c) 서열 번호: 32, 33 및 34의 아미노산 서열로 각각 이루어진 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3, 및 서열 번호: 35, 36 및 37의 아미노산 서열로 각각 이루어진 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3; 또는
    (d) 서열 번호: 38, 39 및 40의 아미노산 서열로 각각 이루어진 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3, 및 서열 번호: 41, 42 및 43의 아미노산 서열로 각각 이루어진 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3.
  2. 이하를 포함하는, 항잠재형 TGF-β1 항체:
    (a) 서열 번호: 12의 VH 서열 및 서열 번호: 13의 VL 서열;
    (b) 서열 번호: 14의 VH 서열 및 서열 번호: 15의 VL 서열;
    (c) 서열 번호: 16의 VH 서열 및 서열 번호: 17의 VL 서열; 또는
    (d) 서열 번호: 18의 VH 서열 및 서열 번호: 19의 VL 서열.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체인, 항잠재형 TGF-β1 항체.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    전장 IgG 항체인, 항잠재형 TGF-β1 항체.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    전장 IgG1 항체인, 항잠재형 TGF-β1 항체.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    야생형 IgG1 Fc 영역과 비교하여 저감된 이펙터 기능을 갖는 개변 IgG1 Fc 영역을 포함하는, 항잠재형 TGF-β1 항체.
  7. 이하를 포함하는, 항잠재형 TGF-β1 항체:
    (a) 서열 번호: 47의 전장 중쇄 서열 및 서열 번호: 60의 전장 경쇄 서열;
    (b) 서열 번호: 48의 전장 중쇄 서열 및 서열 번호: 61의 전장 경쇄 서열;
    (c) 서열 번호: 49의 전장 중쇄 서열 및 서열 번호: 62의 전장 경쇄 서열;
    (d) 서열 번호: 50의 전장 중쇄 서열 및 서열 번호: 63의 전장 경쇄 서열;
    (e) 서열 번호: 51의 전장 중쇄 서열 및 서열 번호: 60의 전장 경쇄 서열;
    (f) 서열 번호: 52의 전장 중쇄 서열 및 서열 번호: 61의 전장 경쇄 서열;
    (g) 서열 번호: 53의 전장 중쇄 서열 및 서열 번호: 62의 전장 경쇄 서열; 또는
    (h) 서열 번호: 54의 전장 중쇄 서열 및 서열 번호: 63의 전장 경쇄 서열.
  8. 제 1 항, 제 2 항 및 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체 및 세포상해제를 포함하는, 이뮤노컨주게이트.
  9. 제 1 항, 제 2 항 및 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 항잠재형 TGF-β1 항체를 코딩하는, 단리된 핵산.
  10. 제 9 항에 기재된 핵산을 포함하는 벡터.
  11. ◈청구항 11은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈
    제 9 항에 기재된 핵산 또는 제 9 항에 기재된 핵산이 도입된 벡터를 포함하는 숙주 세포주.
  12. ◈청구항 12은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈
    항잠재형 TGF-β1 항체를 제작하는 방법으로서, 해당 항체가 산생되도록 제 11 항에 기재된 숙주 세포주를 배양하는 공정을 포함하는, 방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
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