JP7493018B2 - 抗スクレロスチン抗体およびその使用 - Google Patents

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Description

本発明は、抗スクレロスチン抗体およびその使用方法に関する。
骨塩量の低減は、極めて多様な条件によって引き起こされ得、重大な医学的問題をもたらし得る。例えば、骨粗鬆症は、ヒトにおける衰弱性疾患であり、罹患した個体における骨格の骨量および骨塩密度（BMD）の著しい減少、骨の構造的悪化、例えば、骨微小構造の崩壊および対応する骨脆弱性の増加（すなわち、骨強度の減少）、ならびに易骨折性を特徴とする。一般に、ヒトにおける骨粗鬆症には、臨床的骨減少症が先行し、この状態は、米国内でおよそ2500万人に見出される。米国内でさらに7～800万人の患者が、臨床的骨粗鬆症を有すると診断されている。ヒト集団における骨粗鬆症の頻度は、年齢と共に増加する。コーカサス人において、骨粗鬆症は女性に多く、米国内で、女性は骨粗鬆症患者プールの80％を占める。高齢者における骨格の骨の増加した脆弱性および易骨折性は、この集団における不慮の転倒のリスクがより高いことによって増悪される。股関節、手関節、および椎骨の骨折が、骨粗鬆症に関連した最も一般的な損傷のうちの一つである。股関節骨折は、特に、患者にとって極めて不快であり、多くの費用を要し、女性については、高い死亡率および罹患率と相関する。
骨粗鬆症の治療は、生活習慣の改善および薬物療法の形態で存在するが、現在利用可能な治療は、数および有効性が限定されており、しばしば、望ましくない副作用に関連しており、広く患者に許容されているものではない（例えば、非特許文献1を参照のこと）。カルシトニン、ビスホスホネート、エストロゲン補充、および選択的エストロゲン受容体モジュレーター（SERM）を含む多数の吸収抑制剤は、さらなる骨喪失を防止するが、一旦失われた骨を再構築することはない。骨量および骨塩密度を増加させ、骨構造を回復させる同化剤は、ヒトPTH（1～34）の形態で利用可能である。しかしながら、この治療剤は、毎日の皮下注射を、しばしば1年間またはそれ以上、必要とし、これは、不完全な患者コンプライアンスをもたらす。
SOST遺伝子の産物であるスクレロスチンは、213個のアミノ酸の分泌型糖タンパク質である。スクレロスチンは、シスチンノット含有因子のスーパーファミリーのメンバーである。スクレロスチンはDAN/ケルベロスタンパク質ファミリーに関連し、BMPとその受容体との結合を阻害し、したがって、BMPシグナル伝達カスケードを阻害することによって、BMPシグナル伝達に直接干渉する（例えば、非特許文献2を参照のこと）。スクレロスチンmRNA発現は、成人において、主に骨および腎臓で検出される。スクレロスチンタンパク質は、主に骨で検出可能である。骨内での発現は、成熟高分化骨形成細胞である骨細胞に限定されている。
スクレロスチンは、ヒトおよびマウスにおける骨形成の強力な負の制御因子である。SOST発現の欠如は、硬結性骨化症を生じさせる（例えば、非特許文献3；非特許文献4を参照のこと）。患者は、生涯にわたり骨異常増殖を患い、その結果、増加した骨塩密度および強度を生じる。この表現型は、SOST欠損マウスにおいて再現され得、SOSTの過剰発現は、骨減少症をもたらす。SOSTは、骨形成中にPTHによって下方制御され、このことは、PTHの同化作用の一部がSOSTにより媒介される可能性を示唆している（例えば、非特許文献5を参照のこと）。
骨形成の強力な負の制御因子としての役割のため、スクレロスチンは、骨量、骨塩密度、骨塩量、および骨強度のうちの少なくとも一つの増加から利益を得るであろう障害または状態、例えば、骨粗鬆症のための治療的介入のための望ましい標的である。例えば、特許文献1、特許文献2、特許文献3、特許文献4、特許文献5、および特許文献6に記載された抗スクレロスチン抗体は、スクレロスチンに結合し、かつ、骨形成の負の制御に関連したスクレロスチン活性を含む、インビトロおよびインビボにおけるスクレロスチン活性を阻害することが示されている。しかしながら、スクレロスチンに結合しかつその活性をアンタゴナイズする薬剤の有効性および利便性における改善が、当技術分野においてさらに必要とされている。
WO2006/119062 WO2006/119107 WO2008/115732 WO2009/039175 WO2009/047356 WO2012/145417
Khosla and Riggs (1995) Mayo Clin Proc 70(10): 978-982 Avsian-Kretchmer and Hsueh (2004) Mol Endocrinol 18(1): 1-12 Balemans et al (2001) Hum Mol Genet 10(5): 537-543 Brunkow et al (2001) Am J Hum Genet 68(3): 577-589 Keller and Kneissel (2005) Bone 37(2): 148-158
技術的課題
本発明は、抗スクレロスチン抗体およびその使用方法を提供する。
課題を解決する方法
いくつかの態様において、本発明の単離された抗スクレロスチン抗体は、多重特異性抗体である。いくつかの態様において、本発明の単離された抗スクレロスチン抗体は、少なくとも2種の異なる可変領域を含む。いくつかの態様において、本発明の単離された抗スクレロスチン抗体は、スクレロスチンの少なくとも2種の異なるエピトープに結合する。いくつかの態様において、本発明の単離された抗スクレロスチン抗体は、酸性pHにおいてよりも中性pHにおいて高いアフィニティでスクレロスチンに結合する。
いくつかの態様において、本発明の単離された抗スクレロスチン抗体は、スクレロスチンと免疫複合体を形成する。いくつかの態様において、免疫複合体は、少なくとも2つの本発明の抗体分子および少なくとも2つのスクレロスチン分子を含む。
いくつかの態様において、本発明の単離された抗スクレロスチン抗体は、配列番号：7のVH（重鎖可変領域）配列および配列番号：15のVL（軽鎖可変領域）配列を含む抗スクレロスチン抗体と同じエピトープに結合する。さらなる態様において、本発明の単離された抗スクレロスチン抗体は、配列番号：23のVH配列および配列番号：27のVL配列を含む抗スクレロスチン抗体と同じエピトープに結合する。
いくつかの態様において、本発明の単離された抗スクレロスチン抗体は、配列番号：7のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号：15のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、以下の位置のところで、少なくとも1つのアミノ酸が置換されている：(a)HVR-H1（配列番号：31）において：位置1；(b)HVR-H2（配列番号：34）において：位置3、5、8、9、11、および12；(c)HVR-H3（配列番号：38）において：位置2、4、5、7、および13；(d)HVR-L1（配列番号：52）において：位置1、4、5、6、7、8、9、10、および11；(e)HVR-L2（配列番号：56）において：位置1、2、4、5、6、および7；ならびに(f)HVR-L3（配列番号：60）において：位置1、3、4、5、6、7、および8。さらなる態様において、本発明の単離された抗スクレロスチン抗体は、配列番号：23のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号：27のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、以下の超可変領域（HVR）の位置のところで、少なくとも1つのアミノ酸が置換されている：(a)HVR-H1（配列番号：32）において：位置1、2、および4；(b)HVR-H2（配列番号：37）において：位置9；(c)HVR-H3（配列番号：43）において：位置2および9；(d)HVR-L1（配列番号：55）において：位置1、4、5、6、7、8、9、10、および11；(e)HVR-L2（配列番号：59）において：位置1、2、4、5、6、および7；ならびに(f)HVR-L3（配列番号：62）において：位置1、3、4、5、6、7、および8。
いくつかの態様において、本発明の単離された抗スクレロスチン抗体は、スクレロスチンに対する阻害活性を有する。
いくつかの態様において、本発明の単離された抗スクレロスチン抗体は、共通の軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本発明の単離された抗スクレロスチン抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの態様において、本発明の単離された抗スクレロスチン抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である。さらなる態様において、本発明の単離された抗スクレロスチン抗体は、全長IgG1抗体である。さらなる態様において、本発明の単離された抗スクレロスチン抗体は、スクレロスチンに結合する抗体断片である。さらなる態様において、本発明の単離された抗スクレロスチン抗体は、二重特異性抗体である。
いくつかの態様において、本発明の単離された抗スクレロスチン抗体は、配列番号：101または102のVH配列および配列番号：98～100、105のうちのいずれか1つのVL配列を含む第1の可変領域と、配列番号：103または104のVH配列および配列番号：98～100、105のうちのいずれか1つのVL配列を含む第2の可変領域とを含む。さらなる態様において、第1の可変領域のVL配列と第2の可変領域のVL配列は、同一である。
いくつかの態様において、本発明の単離された抗スクレロスチン抗体は、配列番号：7のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号：15のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、以下のHVRの位置のところで、少なくとも1つのアミノ酸が置換されている：(a)HVR-H2（配列番号：34）において：位置5および8；(b)HVR-H3（配列番号：38）において：位置2、5、7、および13；(c)HVR-L1（配列番号：52）において：位置4および7；(d)HVR-L2（配列番号：56）において：位置1および2；ならびに(e)HVR-L3（配列番号：60）において：位置1。
本発明は、本発明の抗スクレロスチン抗体をコードする単離された核酸も提供する。本発明は、本発明の核酸を含む宿主細胞も提供する。本発明は、抗体が産生されるように本発明の宿主細胞を培養する工程を含む、抗体を作製する方法も提供する。
本発明は、本発明の抗スクレロスチン抗体および薬学的に許容される担体を含む薬学的製剤も提供する。
本発明は、骨関連疾患を有する個体を治療する方法も提供する。いくつかの態様において、方法は、本発明の抗スクレロスチン抗体の有効量を個体に投与する工程を含む。本発明は、個体におけるスクレロスチンの増加したレベルに関連した疾患または状態を治療する方法も提供する。いくつかの態様において、方法は、本発明の抗スクレロスチン抗体の有効量を個体に投与する工程を含む。本発明は、個体において骨形成を増加させかつ/または骨吸収を阻害する方法も提供する。いくつかの態様において、方法は、骨形成を増加させかつ/または骨吸収を阻害するために、本発明の抗スクレロスチン抗体の有効量を個体に投与する工程を含む。本発明は、個体において骨塩密度を増加させる方法も提供する。いくつかの態様において、方法は、骨塩密度を増加させるために、本発明の抗スクレロスチン抗体の有効量を個体に投与する工程を含む。
より具体的には、本発明は以下のものを提供する：
［１］スクレロスチンに結合する単離された多重特異性抗体であって、スクレロスチンの少なくとも2種の異なるエピトープに該抗体が結合するための少なくとも2種の異なる可変領域を含み、かつ酸性pHにおいてよりも中性pHにおいて高いアフィニティでスクレロスチンに結合する、単離された多重特異性抗体。
［２］スクレロスチンと免疫複合体を形成し、
該免疫複合体が、少なくとも2つの抗体分子および少なくとも2つのスクレロスチン分子を含む、
[1]の多重特異性抗体。
［３］少なくとも2種の可変領域のうちの1種が、配列番号：7のVH配列および配列番号：15のVL配列を含む抗スクレロスチン抗体と同じエピトープに結合する、[1]または[2]の多重特異性抗体。
［４］少なくとも2種の可変領域のうちの1種が、配列番号：23のVH配列および配列番号：27のVL配列を含む抗スクレロスチン抗体と同じエピトープに結合する、[1]～[3]のいずれか1つの多重特異性抗体。
［５］少なくとも2種の可変領域のうちの1種が、配列番号：7のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号：15のアミノ酸配列を含むVLを含み、以下の位置のところで、少なくとも1つのアミノ酸が置換されている、[1]～[4]のいずれか1つの多重特異性抗体：(a)HVR-H1（配列番号：31）において：位置1；(b)HVR-H2（配列番号：34）において：位置3、5、8、9、11、および12；(c)HVR-H3（配列番号：38）において：位置2、4、5、7、および13；(d)HVR-L1（配列番号：52）において：位置1、4、5、6、7、8、9、10、および11；(e)HVR-L2（配列番号：56）において：位置1、2、4、5、6、および7；ならびに(f)HVR-L3（配列番号：60）において：位置1、3、4、5、6、7、および8。
［６］少なくとも2種の可変領域のうちの1種が配列番号：23のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号：27のアミノ酸配列を含むVLを含み、以下の位置のところで、少なくとも1つのアミノ酸が置換されている、[1]～[5]のいずれか1つの多重特異性抗体：(a)HVR-H1（配列番号：32）において：位置1、2、および4；(b)HVR-H2（配列番号：37）において：位置9；(c)HVR-H3（配列番号：43）において：位置2および9；(d)HVR-L1（配列番号：55）において：位置1、4、5、6、7、8、9、10、および11；(e)HVR-L2（配列番号：59）において：位置1、2、4、5、6、および7；ならびに(f)HVR-L3（配列番号：62）において：位置1、3、4、5、6、7、および8。
［７］スクレロスチンに対する阻害活性を有する、[1]～[6]のいずれか1つの多重特異性抗体。
［８］少なくとも2種の異なる可変領域が共通の軽鎖を含む、[1]～[7]のいずれか1つの多重特異性抗体。
［９］配列番号：101または102のVH配列および配列番号：98～100および105のうちのいずれか1つのVL配列を含む第1の可変領域と、配列番号：103または104のVH配列および配列番号：98～100および105のうちのいずれか1つのVL配列を含む第2の可変領域とを含む、二重特異性抗体。
［１０］第1の可変領域のVL配列と第2の可変領域のVL配列が同一である、[9]の二重特異性抗体。
［１１］[1]～[10]のいずれか1つの抗体および薬学的に許容される担体を含む、薬学的製剤。
［１２］骨関連疾患を有する個体を治療する方法であって、[1]～[10]のいずれか1つの抗体の有効量を該個体に投与する工程を含む、方法。
［１３］個体におけるスクレロスチンの増加したレベルに関連した疾患または状態を治療する方法であって、[1]～[10]のいずれか1つの抗体の有効量を該個体に投与する工程を含む、方法。
［１４］個体において骨形成を増加させかつ/または骨吸収を阻害する方法であって、骨形成を増加させかつ/または骨吸収を阻害するために、[1]～[10]のいずれか1つの抗体の有効量を該個体に投与する工程を含む、方法。
［１５］個体において骨塩密度を増加させる方法であって、骨塩密度を増加させるために、[1]～[10]のいずれか1つの抗体の有効量を該個体に投与する工程を含む、方法。
本発明は、以下のものも提供する：
［１６］配列番号：7のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号：15のアミノ酸配列を含むVLを含む、単離された抗スクレロスチン抗体であって、以下の位置のところで、少なくとも1つのアミノ酸が置換されている、単離された抗スクレロスチン抗体：(a)HVR-H1（配列番号：31）において：位置1；(b)HVR-H2（配列番号：34）において：位置3、5、8、9、11、および12；(c)HVR-H3（配列番号：38）において：位置2、4、5、7、および13；(d)HVR-L1（配列番号：52）において：位置1、4、5、6、7、8、9、10、および11；(e)HVR-L2（配列番号：56）において：位置1、2、4、5、6、および7；ならびに(f)HVR-L3（配列番号：60）において：位置1、3、4、5、6、7、および8。
［１７］配列番号：23のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号：27のアミノ酸配列を含むVLを含む、単離された抗スクレロスチン抗体であって、以下の超可変領域（HVR）の位置のところで、少なくとも1つのアミノ酸が置換されている、単離された抗スクレロスチン抗体：(a)HVR-H1（配列番号：32）において：位置1、2、および4；(b)HVR-H2（配列番号：37）において：位置9；(c)HVR-H3（配列番号：43）において：位置2および9；(d)HVR-L1（配列番号：55）において：位置1、4、5、6、7、8、9、10、および11；(e)HVR-L2（配列番号：59）において：位置1、2、4、5、6、および7；ならびに(f)HVR-L3（配列番号：62）において：位置1、3、4、5、6、7、および8。
［１８］酸性pHにおいてよりも中性pHにおいて高いアフィニティでスクレロスチンに結合する、[16]または[17]の抗体。
［１９］スクレロスチンに対する阻害活性を有する、[16]～[18]のいずれか1つの抗体。
［２０］[16]～[19]のいずれか1つの抗体および薬学的に許容される担体を含む、薬学的製剤。
［２１］骨関連疾患を有する個体を治療する方法であって、[16]～[19]のいずれか1つの抗体の有効量を該個体に投与する工程を含む、方法。
［２２］個体におけるスクレロスチンの増加したレベルに関連した疾患または状態を治療する方法であって、[16]～[19]のいずれか1つの抗体の有効量を該個体に投与する工程を含む、方法。
［２３］個体において骨形成を増加させかつ/または骨吸収を阻害する方法であって、骨形成を増加させかつ/または骨吸収を阻害するために、[16]～[19]のいずれか1つの抗体の有効量を該個体に投与する工程を含む、方法。
［２４］個体において骨塩密度を増加させる方法であって、骨塩密度を増加させるために、[16]～[19]のいずれか1つの抗体の有効量を該個体に投与する工程を含む、方法。
本発明は、以下のものも提供する：
［２５］2種の異なるVHの間で共有される共通VLを作製する方法であって、以下の工程を含む方法：
（1）第1のVH（VH1）および第1のVL（VL1）を含む第1の可変領域（V1）ならびに第2のVH（VH2）および第2のVL（VL2）を含む第2の可変領域（V2）を提供する工程であって、V1が第1の抗原（Ag1）に対する結合活性を有し、かつV2が第2の抗原（Ag2）に対する結合活性を有する、工程；ならびに
（2）Kabatナンバリングに従って、VL1のHVR-L1、HVR-L2、またはHVR-L3内のある1つの位置におけるアミノ酸残基を、VL2のHVR-L1、HVR-L2、またはHVR-L3内の対応する位置におけるアミノ酸残基に置き換えることによって、改変VL（mVL）を構築する工程。
［２６］以下の工程をさらに含む、[25]の方法：
（3）VL1のHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3内のすべての位置におけるアミノ酸が置き換えられるまで、他の位置のアミノ酸に対して工程（2）を繰り返す工程。
［２７］以下の工程をさらに含む、[26]の方法：
（2'）Kabatナンバリングに従って、VL2のHVR-L1、HVR-L2、またはHVR-L3内のある1つの位置におけるアミノ酸残基を、VL1のHVR-L1、HVR-L2、またはHVR-L3内の対応する位置におけるアミノ酸残基に置き換えることによって、改変VL（mVL）を構築する工程；ならびに
（3'）VL2のHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3内のすべての位置におけるアミノ酸が置き換えられるまで、他の位置のアミノ酸に対して工程（2'）を繰り返す工程。
［２８］以下の工程をさらに含む、[25]～[27]のいずれか1つの方法：
（4）前記工程において構築されたmVLについて、それぞれVH1またはVH2と組み合わせた時のAg1またはAg2に対する結合活性を測定する工程。
［２９］以下の工程をさらに含む、[28]の方法：
（5）工程（4）において測定されたmVLの結合活性に基づき、HVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3内のある1つの位置における好ましいアミノ酸残基を2種のアミノ酸残基から選択する工程であって、前記2種のアミノ酸残基の一方はVL1における対応する位置に存在するアミノ酸残基（AA1）であり、もう一方はVL2における対応する位置に存在するアミノ酸残基（AA2）である、工程；
（6）HVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3内における少なくとも2つの異なる位置に対して工程（5）を繰り返す工程；ならびに
（7）HVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3内のそれらの位置に工程（5）および（6）で選択されたアミノ酸残基を含む新規のVL（nVL）を構築する工程。
［３０］HVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3内のすべての位置において好ましいアミノ酸残基が選択されるまで、工程（5）が繰り返される、[29]の方法。
［３１］nVLのFR-L1、FR-L2、FR-L3、およびFR-L4より選択されるいずれか1つのFRのアミノ酸配列が、2種のアミノ酸配列より選択される、[29]または[30]の方法であって、前記2種のアミノ酸配列の一方はVL1の対応するFRのアミノ酸配列であり、もう一方はVL2の対応するFRのアミノ酸配列である、方法。
［３２］VL1およびVL2の両方が、κ軽鎖に由来する可変領域である、[25]～[31]のいずれか1つの方法。
［３３］VL1およびVL2の両方が、λ軽鎖に由来する可変領域である、[25]～[31]のいずれか1つの方法。
［３４］VL1のHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3より選択されるいずれか1つのHVRのアミノ酸長が、VL2の対応するHVRのアミノ酸長と同じである、[25]～[33]のいずれか1つの方法。
［３５］VL1のFR-L1、FR-L2、FR-L3、およびFR-L4より選択されるいずれか1つのFRのアミノ酸長が、VL2の対応するFRのアミノ酸長と同じである、[25]～[34]のいずれか1つの方法。
［３６］VL1のFR-L1、FR-L2、FR-L3、およびFR-L4より選択されるいずれか1つのFRのアミノ酸配列が、VL2の対応するFRのアミノ酸配列と比較した場合、50％以上の同一性を有する、[25]～[35]のいずれか1つの方法。
図1は、実施例4に記載されるような、抗スクレロスチン抗体mabAおよびそのバリアント（mabA_pH1、mabA_NpH1、mabA_pH2、およびmabA_NpH2）のインビトロ中和活性を示す。 図2は、実施例4に記載されるような、抗スクレロスチン抗体mabAおよびそのバリアント（mabA_pH3およびmabA_NpH3）のインビトロ中和活性を示す。 図3は、実施例4に記載されるような、抗スクレロスチン抗体mabAおよびバイパラトピック抗スクレロスチン抗体（mabB//mabA_pH1、mabB//mabA_pH2、mabB//mabA_pH3、およびmabB//mabA）のインビトロ中和活性を示す。 図4は、実施例5に記載されるような、透過型電子顕微鏡法によって観察された、バイパラトピック抗スクレロスチン抗体（mabB//mabA）とスクレロスチン抗原との免疫複合体の代表的な画像を示す。 図5aは、実施例5に記載されるような、バイパラトピック抗スクレロスチン抗体単独、スクレロスチン抗原単独、およびバイパラトピック抗スクレロスチン抗体とスクレロスチン抗原との免疫複合体をサイズ排除クロマトグラフィに適用することによって得られたクロマトグラムを示す。バイパラトピック抗体については、mabB//mabAを使用している。 図5bは、実施例5に記載されるような、バイパラトピック抗スクレロスチン抗体単独、スクレロスチン抗原単独、およびバイパラトピック抗スクレロスチン抗体とスクレロスチン抗原との免疫複合体をサイズ排除クロマトグラフィに適用することによって得られたクロマトグラムを示す。バイパラトピック抗体については、mabB//mabA_pH1を使用している。 図5cは、実施例5に記載されるような、バイパラトピック抗スクレロスチン抗体単独、スクレロスチン抗原単独、およびバイパラトピック抗スクレロスチン抗体とスクレロスチン抗原との免疫複合体をサイズ排除クロマトグラフィに適用することによって得られたクロマトグラムを示す。バイパラトピック抗体については、mabB//mabA-pH2を使用している。 図6は、実施例5に記載されるような、バイパラトピック抗体（mabB//mabA_pH1、mabB//mabA_pH2、mabB//mabA）のBiacore分析を示す。FcγRIIBに対する結合活性が、抗原の非存在下（Ab単独と称する）および存在下（ICと称する）で測定される。 図7は、実施例6に記載されるような、カニクイザルに静脈内投与された抗スクレロスチン抗体（mabA、mabA_pH1、mabA_pH2、mabA_NpH1、およびmabA_NpH2）の経時的な血漿中濃度を示す。 図8は、実施例6に記載されるような、抗スクレロスチン抗体（mabA、mabA_pH1、mabA_pH2、mabA_NpH1、およびmabA_NpH2）をカニクイザルに静脈内投与した後の、スクレロスチンの経時的な血漿中濃度を示す。 図9は、実施例7に記載されるような、抗スクレロスチン抗体（mabA_pH1、mabA_pH2、mabA_NpH1、およびmabA_NpH2）をカニクイザルに静脈内投与した後の、骨形成マーカーであるオステオカルシンの経時的な血漿中濃度を示す。 図10は、実施例8に記載されるような、正常ラットに静脈内投与された抗スクレロスチン抗体（mabA、mabA_pH3、およびmabA_NpH3）の経時的な血漿中濃度を示す。 図11aは、実施例8に記載されるような、正常ラットにおける腰椎の骨塩密度（BMD）に対する抗スクレロスチン抗体（mabA、mabA_pH3、およびmabA_NpH3）のインビボ有効性を示す。データは、平均値＋SEを表す。**：p＜0.01、***：p＜0.001（ウィリアムズ分析によるビヒクルとの比較）。$$：p＜0.01、$$$：p＜0.001（t検定分析によるビヒクルとの比較）。++：p＜0.01、+++：p＜0.001（t検定分析による同一投薬量のmabA_NpH3-SG2との比較）。 図11bは、実施例8に記載されるような、正常ラットにおける右大腿骨の骨塩密度（BMD）に対する抗スクレロスチン抗体（mabA、mabA_pH3、およびmabA_NpH3）のインビボ有効性を示す。データは、平均値＋SEを表す。**：p＜0.01、***：p＜0.001（ウィリアムズ分析によるビヒクルとの比較）。$$：p＜0.01、$$$：p＜0.001（t検定分析によるビヒクルとの比較）。++：p＜0.01、+++：p＜0.001（t検定分析による同一投薬量のmabA_NpH3-SG2との比較）。 図12は、実施例9に記載されるような、SCIDマウスに静脈内投与された抗スクレロスチン抗体（mabB//mabA_pH3-BS01、mabB//mabA_pH3-BS02、mabA_pH3-SG2、およびmabA-hG2）の経時的な血漿中濃度を示す。 図13は、実施例9に記載されるような、抗スクレロスチン抗体（mabB//mabA_pH3-BS01およびmabB//mabA_pH3-BS02）をSCIDマウスに静脈内投与した後の、スクレロスチンの経時的な血漿中濃度を示す。 図14は、実施例9に記載されるような、SCIDマウスにおける腰椎の骨塩密度（BMD）に対する抗スクレロスチン抗体（mabB//mabA_pH3-BS01、mabA_pH3-SG2、およびmabA-hG2）のインビボ有効性を示す。データは、平均値＋SEを表す。*：p＜0.05、**：p＜0.01、***：p＜0.001（ウィリアムズ分析によるビヒクルとの比較）。+：p＜0.5、++：p＜0.01、+++：p＜0.001（t検定分析による同一投薬量のmabA_pH3-SG2またはmabA_hG2との比較）。 図15は、実施例10に記載されるような、CDRシャッフリング法の概略図を示す。mabAおよびmabBの軽鎖の同一位置のCDRを、相互に交換（シャッフリング）し、続いて、A-A-B、A-B-A、A-B-B、B-A-A、B-A-B、およびB-B-Aのバリアント軽鎖を構築した。 図16は、実施例10に記載されるような、CDRシャッフリング抗スクレロスチン抗体バリアントの、ヒトスクレロスチンに対する結合を示す。mabA、mabB、A-A-B、A-B-A、A-B-B、B-A-A、B-A-B、B-B-A、abL063、abL081、およびabL083の軽鎖の各々を、mabAの重鎖（黒丸）またはmabBの重鎖（白丸）のいずれかと組み合わせ、得られた抗体のヒトスクレロスチンに対する結合活性を、SPR分析によって測定した。各プロットは、抗体の捕捉レベルによって標準化されている。 図17は、実施例10に記載されるような、各残基シャッフリング法の第一工程の概略図を示す。mabAおよびmabBの軽鎖のCDRにおける同一位置のアミノ酸残基を、相互に交換（シャッフリング）し、続いて、バリアントmabA軽鎖およびバリアントmabB軽鎖を構築した。 図18は、実施例10に記載されるような、各残基シャッフリング法のその後の工程の概略図を示す。同一位置に単一の変異を有するmabAおよびmabBの軽鎖バリアントの対を、評価し、相互に比較した。各位置において、よりよいアミノ酸残基を選択し、選択されたものを組み合わせることによって、「各残基シャッフリング」軽鎖バリアントを設計した。 図19は、実施例10に記載されるような、各残基シャッフリング抗スクレロスチン抗体バリアントの、ヒトスクレロスチンに対する結合を示す。abL063、abL081、およびabL083の軽鎖の各々を、mabA重鎖（黒丸）またはmabB重鎖（白丸）のいずれかと組み合わせ、得られた抗体のヒトスクレロスチンに対する結合活性を、SPR分析によって測定した。各プロットは、抗体の捕捉レベルによって標準化されている。 図20aは、実施例11に記載されるような、pI改変型バイパラトピック抗スクレロスチン抗体およびホモ二量体抗体を陽イオン交換クロマトグラフィへ適用することによって得られたクロマトグラムを示す。クロマトグラムは、（i）mabA重鎖バリアント、mabB重鎖バリアント、および共通軽鎖バリアントを含有するバイパラトピック抗体、（ii）mabA重鎖バリアントおよび共通軽鎖バリアントを含有するホモ二量体抗体、ならびに（iii）mabB重鎖バリアントおよび共通軽鎖バリアントを含有するホモ二量体抗体を含む。図20aにおいて使用されたバイパラトピック抗体は、amH848/bsH638/abL152であった。 図20bは、実施例11に記載されるような、pI改変型バイパラトピック抗スクレロスチン抗体およびホモ二量体抗体を陽イオン交換クロマトグラフィへ適用することによって得られたクロマトグラムを示す。クロマトグラムは、（i）mabA重鎖バリアント、mabB重鎖バリアント、および共通軽鎖バリアントを含有するバイパラトピック抗体、（ii）mabA重鎖バリアントおよび共通軽鎖バリアントを含有するホモ二量体抗体、ならびに（iii）mabB重鎖バリアントおよび共通軽鎖バリアントを含有するホモ二量体抗体を含む。図20bにおいて使用されたバイパラトピック抗体は、amH848/bsH656/abL152であった。 図20cは、実施例11に記載されるような、pI改変型バイパラトピック抗スクレロスチン抗体およびホモ二量体抗体を陽イオン交換クロマトグラフィへ適用することによって得られたクロマトグラムを示す。クロマトグラムは、（i）mabA重鎖バリアント、mabB重鎖バリアント、および共通軽鎖バリアントを含有するバイパラトピック抗体、（ii）mabA重鎖バリアントおよび共通軽鎖バリアントを含有するホモ二量体抗体、ならびに（iii）mabB重鎖バリアントおよび共通軽鎖バリアントを含有するホモ二量体抗体を含む。図20cにおいて使用されたバイパラトピック抗体は、amH852/bsH638/abL152であった。 図20dは、実施例11に記載されるような、pI改変型バイパラトピック抗スクレロスチン抗体およびホモ二量体抗体を陽イオン交換クロマトグラフィへ適用することによって得られたクロマトグラムを示す。クロマトグラムは、（i）mabA重鎖バリアント、mabB重鎖バリアント、および共通軽鎖バリアントを含有するバイパラトピック抗体、（ii）mabA重鎖バリアントおよび共通軽鎖バリアントを含有するホモ二量体抗体、ならびに（iii）mabB重鎖バリアントおよび共通軽鎖バリアントを含有するホモ二量体抗体を含む。図20dにおいて使用されたバイパラトピック抗体は、amH852/bsH656/abL152であった。 図21は、実施例11に記載されるような、pI改変型バイパラトピック抗スクレロスチン抗体（amH848/bsH638/abL152、amH848/bsH656/abL152、amH852/bsH638/abL152、およびamH852/bsH656/abL152）ならびに抗スクレロスチン抗体mabBのインビトロ中和活性を示す。 図22aは、実施例12に記載されるような、pH7.4における抗スクレロスチンバイパラトピック抗体のヒトスクレロスチン（h-SOST）およびカニクイザルスクレロスチン（cy-SOST）に対するBiacoreセンサーグラムを示す。バイパラトピック抗体として、amH848/bsH638/abL152が使用されている。 図22bは、実施例12に記載されるような、pH7.4における抗スクレロスチンバイパラトピック抗体のヒトスクレロスチン（h-SOST）およびカニクイザルスクレロスチン（cy-SOST）に対するBiacoreセンサーグラムを示す。バイパラトピック抗体として、amH848/bsH656/abL152が使用されている。 図22cは、実施例12に記載されるような、pH7.4における抗スクレロスチンバイパラトピック抗体のヒトスクレロスチン（h-SOST）およびカニクイザルスクレロスチン（cy-SOST）に対するBiacoreセンサーグラムを示す。バイパラトピック抗体として、amH852/bsH638/abL152が使用されている。 図22dは、実施例12に記載されるような、pH7.4における抗スクレロスチンバイパラトピック抗体のヒトスクレロスチン（h-SOST）およびカニクイザルスクレロスチン（cy-SOST）に対するBiacoreセンサーグラムを示す。バイパラトピック抗体として、amH852/bsH656/abL152が使用されている。
態様の説明
本明細書に記載または引用される手法および手順は、概して充分に理解されており、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003))；the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987))；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)；Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)；Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997)；Antibodies (P. Finch, 1997)；Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)；Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)；Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)；およびCancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)に記載された広範に利用されている技法などの従来の技法を用いて、当業者により一般的に使用される。
Ｉ．定義
別途定義しない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994)、およびMarch, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)は、本出願において使用される用語の多くに対する一般的指針を当業者に提供する。特許出願および刊行物を含む、本明細書に引用される全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書を解釈する目的のために、以下の定義が適用され、該当する場合はいつでも、単数形で使用された用語は複数形をも含み、その逆もまた同様である。本明細書で使用される用語は、特定の態様を説明することのみを目的としており、限定を意図したものではないことが、理解されるべきである。下記の定義のいずれかが、参照により本明細書に組み入れられた任意の文書と矛盾する場合には、下記の定義が優先するものとする。
本明細書の趣旨での「アクセプターヒトフレームワーク」は、下で定義するヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する、軽鎖可変ドメイン (VL) フレームワークまたは重鎖可変ドメイン (VH) フレームワークのアミノ酸配列を含む、フレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに「由来する」アクセプターヒトフレームワークは、それらの同じアミノ酸配列を含んでもよいし、またはアミノ酸配列の変更を含んでいてもよい。いくつかの態様において、アミノ酸の変更の数は、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下、または2以下である。いくつかの態様において、VLアクセプターヒトフレームワークは、VLヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と、配列が同一である。
「アフィニティ」は、分子（例えば、抗体）の結合部位1個と、分子の結合パートナー（例えば、抗原）との間の、非共有結合的な相互作用の合計の強度のことをいう。別段示さない限り、本明細書で用いられる「結合アフィニティ」は、ある結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）の間の１：１相互作用を反映する、固有の結合アフィニティのことをいう。分子XのそのパートナーYに対するアフィニティは、一般的に、解離定数 (Kd) により表すことができる。アフィニティは、本明細書に記載のものを含む、当該技術分野において知られた通常の方法によって測定され得る。結合アフィニティを測定するための具体的な実例となるおよび例示的な態様については、下で述べる。
「アフィニティ成熟」抗体は、改変を備えていない親抗体と比較して、1つまたは複数の超可変領域 (hypervariable region: HVR) 中に抗体の抗原に対するアフィニティの改善をもたらす1つまたは複数の改変を伴う、抗体のことをいう。
用語「抗スクレロスチン抗体」または「スクレロスチンに結合する抗体」は、充分なアフィニティでスクレロスチンと結合することのできる抗体であって、その結果その抗体がスクレロスチンを標的化したときに診断剤および／または治療剤として有用であるような、抗体のことをいう。一態様において、無関係な非スクレロスチンタンパク質への抗スクレロスチン抗体の結合の程度は、（例えば、放射免疫測定法 (radioimmunoassay: RIA) により）測定したとき、抗体のスクレロスチンへの結合の約10％未満である。特定の態様において、スクレロスチンに結合する抗体は、≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、または≦0.001nM（例えば、10-8M以下、例えば10-8M～10-13M、例えば、10-9M～10-13M）の解離定数 (Kd) を有する。特定の態様において、抗スクレロスチン抗体は、異なる種からのスクレロスチン間で保存されているスクレロスチンのエピトープに結合する。
本明細書で用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限りは、これらに限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片を含む、種々の抗体構造を包含する。
「抗体断片」は、完全抗体が結合する抗原に結合する当該完全抗体の一部分を含む、当該完全抗体以外の分子のことをいう。抗体断片の例は、これらに限定されるものではないが、Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子（例えば、scFv）；および、抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいてその参照抗体が自身の抗原へする結合を50%以上阻止する抗体のことをいい、また逆にいえば、参照抗体は、競合アッセイにおいて前述の抗体が自身の抗原へする結合を50%以上阻止する。例示的な競合アッセイが、本明細書で提供される。
用語「キメラ」抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の供給源または種に由来する一方で、重鎖および／または軽鎖の残りの部分が異なった供給源または種に由来する抗体のことをいう。
抗体の「クラス」は、抗体の重鎖に備わる定常ドメインまたは定常領域のタイプのことをいう。抗体には5つの主要なクラスがある：IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMである。そして、このうちいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）に分けられてもよい。例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2である。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインを、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ぶ。
本明細書でいう用語「細胞傷害剤」は、細胞の機能を阻害するまたは妨げる、および／または細胞の死または破壊の原因となる物質のことをいう。細胞傷害剤は、これらに限定されるものではないが、放射性同位体（例えば、211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、212PbおよびLuの放射性同位体）；化学療法剤または化学療法薬（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド類（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシン、または他のインターカレート剤）；増殖阻害剤；核酸分解酵素などの酵素およびその断片；抗生物質；例えば、低分子毒素または細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素的に活性な毒素（その断片および／または変異体を含む）などの、毒素；および、以下に開示される、種々の抗腫瘍剤または抗がん剤を含む。
「エフェクター機能」は、抗体のFc領域に起因する、抗体のアイソタイプによって異なる生物学的活性のことをいう。抗体のエフェクター機能の例には次のものが含まれる：C1q結合および補体依存性細胞傷害（complement dependent cytotoxicity:CDC）；Fc受容体結合；抗体依存性細胞介在性細胞傷害（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC）；貪食作用；細胞表面受容体（例えば、B細胞受容体）の下方制御；および、B細胞活性化。
ある剤（例えば、薬学的製剤）の「有効量」は、所望の治療的または予防的結果を達成するために有効である、必要な用量におけるおよび必要な期間にわたっての、量のことをいう。
用語「エピトープ」は、抗体によって結合され得る任意の決定基を含む。エピトープは、抗原を標的とする抗体によって結合される該抗原の領域であり、抗体に直接接触する特定のアミノ酸を含む。エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基またはスルホニル基などの化学的に活性な表面分子群を含むことができ、かつ特異的な三次元構造特性および／または特定の電荷特性を備えることができる。一般的に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質および／または巨大分子の複雑な混合物中でその標的抗原上のエピトープを優先的に認識する。
本明細書で用語「Fc領域」は、少なくとも定常領域の一部分を含む免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために用いられる。この用語は、天然型配列のFc領域および変異体Fc領域を含む。一態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域はCys226から、またはPro230から、重鎖のカルボキシル末端まで延びる。ただし、Fc領域のC末端のリジン (Lys447) またはグリシン‐リジン（Gly446-Lys447）は、存在していてもしていなくてもよい。本明細書では別段特定しない限り、Fc領域または定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991 に記載の、EUナンバリングシステム（EUインデックスとも呼ばれる）にしたがう。
「フレームワーク」または「FR」は、超可変領域 (HVR) 残基以外の、可変ドメイン残基のことをいう。可変ドメインのFRは、通常4つのFRドメイン：FR1、FR2、FR3、およびFR4からなる。それに応じて、HVRおよびFRの配列は、通常次の順序でVH（またはVL）に現れる：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
用語「全長抗体」、「完全抗体」、および「全部抗体」は、本明細書では相互に交換可能に用いられ、天然型抗体構造に実質的に類似した構造を有する、または本明細書で定義するFc領域を含む重鎖を有する抗体のことをいう。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」は、相互に交換可能に用いられ、外来核酸を導入された細胞（そのような細胞の子孫を含む）のことをいう。宿主細胞は「形質転換体」および「形質転換細胞」を含み、これには初代の形質転換細胞および継代数によらずその細胞に由来する子孫を含む。子孫は、親細胞と核酸の内容において完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。オリジナルの形質転換細胞がスクリーニングされたまたは選択された際に用いられたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫も、本明細書では含まれる。
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生された抗体またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を用いる非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を備える抗体である。このヒト抗体の定義は、非ヒトの抗原結合残基を含むヒト化抗体を、明確に除外するものである。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンVLまたはVHフレームワーク配列の選択群において最も共通して生じるアミノ酸残基を示すフレームワークである。通常、ヒト免疫グロブリンVLまたはVH配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。通常、配列のサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3におけるサブグループである。一態様において、VLについて、サブグループは上記のKabatらによるサブグループκIである。一態様において、VHについて、サブグループは上記のKabatらによるサブグループIIIである。
「ヒト化」抗体は、非ヒトHVRからのアミノ酸残基およびヒトFRからのアミノ酸残基を含む、キメラ抗体のことをいう。ある態様では、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、当該可変領域においては、すべてのもしくは実質的にすべてのHVR（例えばCDR）は非ヒト抗体のものに対応し、かつ、すべてのもしくは実質的にすべてのFRはヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでもよい。抗体（例えば、非ヒト抗体）の「ヒト化された形態」は、ヒト化を経た抗体のことをいう。
本明細書で用いられる用語「超可変領域」または「HVR」は、配列において超可変であり（「相補性決定領域」または「CDR」(complementarity determining region)）、および／または構造的に定まったループ（「超可変ループ」）を形成し、および／または抗原接触残基（「抗原接触」）を含む、抗体の可変ドメインの各領域のことをいう。通常、抗体は6つのHVRを含む：VHに3つ（H1、H2、H3）、およびVLに3つ（L1、L2、L3）である。本明細書での例示的なHVRは、以下のものを含む：
(a) アミノ酸残基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)、および96-101 (H3)のところで生じる超可変ループ (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))；
(b) アミノ酸残基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)、 および95-102 (H3)のところで生じるCDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))；
(c) アミノ酸残基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)、および93-101 (H3) のところで生じる抗原接触 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；ならびに、
(d) HVRアミノ酸残基46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)、および94-102 (H3)を含む、(a)、(b)、および／または(c)の組合せ。
別段示さない限り、HVR残基および可変ドメイン中の他の残基（例えば、FR残基）は、本明細書では上記のKabatらにしたがって番号付けされる。
「イムノコンジュゲート」は、1つまたは複数の異種の分子にコンジュゲートされた抗体である（異種の分子は、これに限定されるものではないが、細胞傷害剤を含む）。
「個体」または「対象」は哺乳動物である。哺乳動物は、これらに限定されるものではないが、飼育動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、およびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、ならびに、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）を含む。特定の態様では、個体または対象は、ヒトである。
「単離された」抗体は、そのもともとの環境の成分から分離されたものである。いくつかの態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、SDS-PAGE、等電点分離法 (isoelectric focusing: IEF)、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフ（例えば、イオン交換または逆相HPLC）で測定して、95%または99%を超える純度まで精製される。抗体の純度の評価のための方法の総説として、例えば、Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007) を参照のこと。
「単離された」核酸は、そのもともとの環境の成分から分離された核酸分子のことをいう。単離された核酸は、その核酸分子を通常含む細胞の中に含まれた核酸分子を含むが、その核酸分子は染色体外に存在しているかまたは本来の染色体上の位置とは異なる染色体上の位置に存在している。
「抗スクレロスチン抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖および軽鎖（またはその断片）をコードする1つまたは複数の核酸分子のことをいい、1つのベクターまたは別々のベクターに乗っている核酸分子、および、宿主細胞中の1つまたは複数の位置に存在している核酸分子を含む。
本明細書でいう用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体のことをいう。すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、生じ得る変異抗体（例えば、自然に生じる変異を含む変異抗体、またはモノクローナル抗体調製物の製造中に発生する変異抗体。そのような変異体は通常若干量存在している。）を除いて、同一でありおよび／または同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られるものである、という抗体の特徴を示し、何らかの特定の方法による抗体の製造を求めるものと解釈されるべきではない。例えば、本発明にしたがって用いられるモノクローナル抗体は、これらに限定されるものではないが、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含んだトランスジェニック動物を利用する方法を含む、様々な手法によって作成されてよく、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法および他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
「裸抗体」は、異種の部分（例えば、細胞傷害部分）または放射性標識にコンジュゲートされていない抗体のことをいう。裸抗体は、薬学的製剤中に存在していてもよい。
「天然型抗体」は、天然に生じる様々な構造を伴う免疫グロブリン分子のことをいう。例えば、天然型IgG抗体は、ジスルフィド結合している2つの同一の軽鎖と2つの同一の重鎖から構成される約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。N末端からC末端に向かって、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域 (VH) を有し、それに3つの定常ドメイン（CH1、CH2、およびCH3）が続く。同様に、N末端からC末端に向かって、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域 (VL) を有し、それに定常軽鎖 (CL) ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、2つのタイプの1つに帰属させられてよい。
用語「添付文書」は、治療用品の商用パッケージに通常含まれ、そのような治療用品の使用に関する、適応症、用法、用量、投与方法、併用療法、禁忌、および／または警告についての情報を含む使用説明書のことをいうために用いられる。
参照ポリペプチド配列に対する「パーセント (％) アミノ酸配列同一性」は、最大のパーセント配列同一性を得るように配列を整列させてかつ必要ならギャップを導入した後の、かつ、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとしたときの、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の、百分率比として定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決める目的のアラインメントは、当該技術分野における技術の範囲内にある種々の方法、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign (DNASTAR) ソフトウェア、またはGENETYX（登録商標）（株式会社ゼネティックス）などの、公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントをとるための適切なパラメーターを決定することができる。
ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムは、ジェネンテック社の著作であり、そのソースコードは米国著作権庁 (U.S. Copyright Office, Wasington D.C., 20559) に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087として登録されている。ALIGN-2プログラムは、ジェネンテック社 (Genentech, Inc., South San Francisco, California) から公に入手可能であるし、ソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、Digital UNIX V4.0Dを含むUNIXオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされる。すべての配列比較パラメーターは、ALIGN-2プログラムによって設定され、変動しない。アミノ酸配列比較にALIGN-2が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Aの、所与のアミノ酸配列Bへの、またはそれとの、またはそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、所与のアミノ酸配列Bへの、またはそれとの、またはそれに対する、ある％アミノ酸配列同一性を有するまたは含む所与のアミノ酸配列A、ということもできる）は、次のように計算される：分率X／Yの100倍。ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN-2によって、当該プログラムのAおよびBのアラインメントにおいて同一である一致としてスコアされたアミノ酸残基の数であり、YはB中のアミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、AのBへの％アミノ酸配列同一性は、BのAへの％アミノ酸配列同一性と等しくないことが、理解されるであろう。別段特に明示しない限り、本明細書で用いられるすべての％アミノ酸配列同一性値は、直前の段落で述べたとおりALIGN-2コンピュータプログラムを用いて得られるものである。
用語「薬学的製剤」は、その中に含まれた有効成分の生物学的活性が効果を発揮し得るような形態にある調製物であって、かつ製剤が投与される対象に許容できない程度に毒性のある追加の要素を含んでいない、調製物のことをいう。
「薬学的に許容される担体」は、対象に対して無毒な、薬学的製剤中の有効成分以外の成分のことをいう。薬学的に許容される担体は、これらに限定されるものではないが、緩衝液、賦形剤、安定化剤、または保存剤を含む。
本明細書でいう用語「スクレロスチン」は、別段示さない限り、霊長類（例えば、ヒト）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物供給源からの任意の天然型スクレロスチンのことをいう。この用語は、「全長」のプロセシングを受けていないスクレロスチンも、細胞中でのプロセシングの結果生じるいかなる形態のスクレロスチンも包含する。この用語はまた、自然に生じるスクレロスチンの変異体、例えば、スプライス変異体や対立遺伝子変異体も包含する。例示的なヒトスクレロスチンのアミノ酸配列を、配列番号：1に示した。例示的なカニクイザル、ラット、およびマウススクレロスチンのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：2、3、および4に示した。
本明細書で用いられる「治療」（および、その文法上の派生語、例えば「治療する」、「治療すること」など）は、治療される個体の自然経過を改変することを企図した臨床的介入を意味し、予防のためにも、臨床的病態の経過の間にも実施され得る。治療の望ましい効果は、これらに限定されるものではないが、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患による任意の直接的または間接的な病理的影響の減弱、転移の防止、疾患の進行速度の低減、疾患状態の回復または緩和、および寛解または改善された予後を含む。いくつかの態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅らせる、または疾患の進行を遅くするために用いられる。
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体を抗原へと結合させることに関与する、抗体の重鎖または軽鎖のドメインのことをいう。天然型抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれVHおよびVL）は、通常、各ドメインが4つの保存されたフレームワーク領域 (FR) および3つの超可変領域 (HVR) を含む、類似の構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 参照。）1つのVHまたはVLドメインで、抗原結合特異性を与えるに充分であろう。さらに、ある特定の抗原に結合する抗体は、当該抗原に結合する抗体からのVHまたはVLドメインを使ってそれぞれVLまたはVHドメインの相補的ライブラリをスクリーニングして、単離されてもよい。例えばPortolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)； Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991) 参照。
本明細書で用いられる用語「ベクター」は、それが連結されたもう1つの核酸を増やすことができる、核酸分子のことをいう。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、および、それが導入された宿主細胞のゲノム中に組み入れられるベクターを含む。あるベクターは、自身が動作的に連結された核酸の、発現をもたらすことができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」とも称される。
ＩＩ．組成物および方法
一局面において、本発明は、抗スクレロスチン抗体およびその使用方法に一部基づくものである。特定の態様において、スクレロスチンに結合する抗体が提供される。本発明の抗体は、例えば、骨関連疾患の診断または治療のために、有用である。
別の局面において、本発明は、共通VLを作製する方法に一部分基づくものである。そのような方法は、例えば、二重特異性抗体のような多重特異性抗体の作製のために有用である。
Ａ．例示的な抗スクレロスチン抗体
一局面において、本発明は、スクレロスチンに結合する単離された抗体を提供する。特定の態様において、配列番号：7のVH配列および配列番号：15のVL配列を含む抗体へアミノ酸改変を導入することによって調製される抗スクレロスチン抗体バリアントが提供される（mabAバリアント）。特定の態様において、配列番号：23のVH配列および配列番号：27のVL配列を含む抗体へアミノ酸改変を導入することによって調製される抗スクレロスチン抗体バリアントも提供される（mabBバリアント）。特定の態様において、本発明の抗スクレロスチン抗体は、少なくとも2種の異なる可変領域を含む多重特異性抗体である。特定の態様において、本発明の抗スクレロスチン抗体は、スクレロスチン分子上の少なくとも2種の異なるエピトープに該抗体が結合するための少なくとも2種の異なる可変領域を含む、多重パラトープ抗体である。
いくつかの態様において、本発明の多重特異性抗体の2種の異なる可変領域のうちの1種は、mabAバリアントの可変領域より選択され得る。いくつかの態様において、本発明の多重特異性抗体の2種の異なる可変領域のうちの1種は、mabBバリアントの可変領域より選択され得る。特定の態様において、多重特異性抗体の2種の異なる可変領域のうちの1種は、配列番号：7のVH配列および配列番号：15のVL配列を含む抗体（mabA）の同一エピトープに結合する。特定の態様において、多重特異性抗体の2種の異なる可変領域のうちの1種は、配列番号：23のVH配列および配列番号：27のVL配列を含む抗体（mabB）の同一エピトープに結合する。さらなる態様において、本発明の多重特異性抗体は、mabAバリアントのいずれか1つに由来する可変領域およびmabBバリアントのいずれか1つに由来する可変領域を含む。ある特定の態様では、抗スクレロスチン抗体は、二重特異性抗体またはバイパラトピック抗体である。
いくつかの態様において、本発明の抗スクレロスチン抗体は、抗原であるスクレロスチンと（本明細書において、抗原抗体複合体または免疫複合体とも記載される）複合体を形成する。いくつかの態様において、複合体は、少なくとも2つの本発明の抗体分子を含む。さらなる態様において、複合体は、少なくとも2つの抗原分子を含む。ある特定の態様では、複合体は、2つの本発明の抗体分子および2つの抗原分子を含み、ここで、各抗体分子は2つの抗原分子と結合しており、各抗原分子は2つの抗体分子と結合している。
いくつかの態様において、本発明の抗スクレロスチン抗体は、細胞内へ取り込まれる。ある特定の態様では、細胞内への抗体の取り込みは、抗体が抗原と複合体を形成していない時と比較して、抗体が抗原と複合体を形成している時に増強される。細胞内への抗原抗体複合体の増強された取り込みは、抗体が対象へ投与された時の血漿からの抗原のクリアランスの増強をもたらし得る。別の態様において、血漿からのスクレロスチンのクリアランスは、本発明の抗スクレロスチン抗体が対象へ投与された時に増強される。
いくつかの態様において、本発明の抗スクレロスチン抗体は、抗体のFc領域と細胞の表面上のFc受容体との間の相互作用を通して細胞内へ取り込まれる。ある特定の態様では、Fc受容体はFcγ受容体（FcγR）であってよく、これには、例えば、アイソフォームFcγRIa、FcγRIb、およびFcγRIcを含むFcγRI；アイソフォームFcγRIIa（アロタイプH131（H型）およびR131（R型）を含む）、FcγRIIb（FcγRIIb-1およびFcγRIIb-2を含む）、およびFcγRIIcを含むFcγRII；ならびにアイソフォームFcγRIIIa（アロタイプV158およびF158を含む）およびFcγRIIIb（アロタイプFcγRIIIb-NA1およびFcγRIIIb-NA2を含む）を含むFcγRIIIが含まれる。
2つ以上の抗体分子を含む免疫複合体は、1つの抗体分子しか含まない免疫複合体と比較して、複合体内の複数のFc領域を介したアビディティ効果のため、より強力に細胞表面上のFc受容体と結合することができ、より効率的に細胞内へ取り込まれ得る。いくつかの態様において、本発明の抗スクレロスチン抗体は、スクレロスチン分子上の互いに異なるエピトープに結合する少なくとも2種の異なる可変領域を含み、2つ以上の抗体分子および2つ以上のスクレロスチン分子が、相互に結合し、免疫複合体を形成する。ある特定の態様では、本発明の抗スクレロスチン抗体は、スクレロスチン分子上の互いに異なるエピトープに結合する2種の異なる可変領域を含み、2つの抗体分子および2つのスクレロスチン分子が、相互に結合し、免疫複合体を形成する。
いくつかの態様において、本発明の抗スクレロスチン抗体は、酸性pHにおいてよりも中性pHにおいて高いアフィニティでスクレロスチンに結合する。別の局面において、本発明は、スクレロスチンに対するpH依存的結合を示す抗スクレロスチン抗体を提供する。本明細書で用いられる表現「pH依存的結合」は、「中性pHにおける結合と比較した、酸性pHにおける低下した結合」を意味し、両方の表現は交換可能であり得る。例えば、「pH依存的結合特性を有する」抗スクレロスチン抗体には、酸性pHにおいてよりも中性pHにおいて高いアフィニティでスクレロスチンに結合する抗体が含まれる。ある特定の態様では、本発明の抗体は、酸性pHにおいてよりも中性pHにおいて、少なくとも2倍、3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、200倍、400倍、1000倍、10000倍、またはそれより高いアフィニティでスクレロスチンに結合する。
抗原が可溶性タンパク質である場合、抗体が血漿中で抗原自体よりも長い半減期を有することができ、抗原の担体として働き得ることから、抗体の抗原への結合は、血漿中の抗原の半減期の延長をもたらす可能性がある（すなわち、血漿からの抗原のクリアランスが低下する）。これは、細胞中のエンドソーム経路を介したFcRnによる抗原－抗体複合体の再利用に起因するものである（Roopenian and Akilesh (2007) Nat Rev Immunol 7(9): 715-725）。しかしながら、中性の細胞外環境でその抗原と結合する一方で、細胞内への侵入後は酸性のエンドソームコンパートメントに抗原を放出する、pH依存的結合特性を有する抗体は、pH非依存的に結合するその対応物と比べて、抗原の中和とクリアランスの点で優れた特性を有することが期待される（Igawa et al (2010) Nature Biotechnol 28(11); 1203-1207; Devanaboyina et al (2013) mAbs 5(6): 851-859; 国際特許出願公開番号WO 2009/125825）。
前述の特性の両方を有する抗体、すなわち、pH依存的に抗原に結合し、かつ2つ以上の抗体分子を含む免疫複合体を形成する抗体は、高度に加速された、血漿からの抗原の排除のための、さらに優れた特性を有すると予想される。
スクレロスチンに対する抗体の「アフィニティ」は、本開示の目的のために、抗体のKDによって表される。抗体のKDとは、抗体-抗原相互作用の平衡解離定数を指す。抗原に結合する抗体についてのKD値が大きいほど、該特定の抗原に対する結合アフィニティは弱くなる。したがって、本明細書で用いられる表現「酸性pHにおいてよりも中性pHにおいて高いアフィニティ」（または同等の表現「pH依存的結合」）は、酸性pHにおける抗体のKDが、中性pHにおける抗体のKDより大きいことを意味する。例えば、本発明の文脈において、酸性pHにおいてスクレロスチンに結合する抗体のKDが、中性pHにおいてスクレロスチンに結合する該抗体のKDより少なくとも2倍大きい場合、該抗体は、酸性pHにおいてよりも中性pHにおいて高いアフィニティでスクレロスチンに結合すると見なされる。したがって、本発明は、中性pHにおいてスクレロスチンに結合する抗体のKDよりも少なくとも2倍、3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、200倍、400倍、1000倍、10000倍、またはそれより大きいKDで、酸性pHにおいてスクレロスチンに結合する抗体を含む。別の態様において、中性pHにおける抗体のKD値は、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、またはそれ未満であり得る。別の態様において、酸性pHにおける抗体のKD値は、10-9M、10-8M、10-7M、10-6M、またはそれより大きい値であり得る。
特定の抗原に対する抗体の結合特性は、抗体のkdによって表されてもよい。抗体のkdとは、特定の抗原に対する抗体の解離速度定数を指し、秒の逆数（すなわち、sec-1）で表される。kd値の増加は、抗体のその抗原への結合がより弱いことを意味する。したがって、本発明は、中性pHにおいてよりも酸性pHにおいて高いkd値でスクレロスチンに結合する抗体を含む。本発明は、中性pHにおいてスクレロスチンに結合する抗体のkdよりも少なくとも2倍、3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、200倍、400倍、1000倍、10000倍、またはそれより大きいkdで、酸性pHにおいてスクレロスチンに結合する抗体を含む。別の態様において、中性pHにおける抗体のkd値は、10-2 1/s、10-3 1/s、10-4 1/s、10-5 1/s、10-6 1/s、またはそれ未満であり得る。別の態様において、酸性pHにおける抗体のkd値は、10-3 1/s、10-2 1/s、10-1 1/s、またはそれより大きい値であり得る。
特定の例において、「中性pHにおける結合よりも低下した、酸性pHにおける結合」は、中性pHにおける抗体のKD値に対する酸性pHにおける抗体のKD値（またはその逆）の比によって表される。例えば、抗体が2以上の酸性/中性KD比を示す場合、該抗体は、本発明の目的のために、「中性pHにおける結合よりも低下した、酸性pHにおけるスクレロスチンに対する結合」を示すと見なされ得る。特定の例示的な態様において、本発明の抗体についての酸性/中性KD比は、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000、またはそれより大きい値であり得る。別の態様において、中性pHにおける抗体のKD値は、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、またはそれ未満であり得る。別の態様において、酸性pHにおける抗体のKD値は、10-9M、10-8M、10-7M、10-6M、またはそれより大きい値であり得る。
特定の例において、「中性pHにおける結合よりも低下した、酸性pHにおける結合」は、中性pHにおける抗体のkd値に対する酸性pHにおける抗体のkd値（またはその逆）の比によって表される。例えば、抗体が2以上の酸性/中性kd比を示す場合、該抗体は、本発明の目的のために、「中性pHにおける結合よりも低下した、酸性pHにおけるスクレロスチンに対する結合」を示すと見なされ得る。特定の例示的な態様において、本発明の抗体についての酸性/中性kd比は、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000、またはそれより大きい値であり得る。別の態様において、中性pHにおける抗体のkd値は、10-2 1/s、10-3 1/s、10-4 1/s、10-5 1/s、10-6 1/s、またはそれ未満であり得る。別の態様において、酸性pHにおける抗体のkd値は、10-3 1/s、10-2 1/s、10-1 1/s、またはそれより大きい値であり得る。
本明細書で用いられる「酸性pH」との表現は、4.0～6.5のpHを意味する。「酸性pH」との表現は、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、および6.5のpH値を含む。ある特定の局面では、「酸性pH」は、5.8である。
本明細書で用いられる「中性pH」との表現は、6.7～10.0のpHを意味する。「中性pH」との表現は、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、および10.0のpH値を含む。ある特定の局面では、「中性pH」は、7.4である。
本明細書で表されるKD値およびkd値は、抗体-抗原相互作用を特徴付けるために、表面プラズモン共鳴に基づくバイオセンサーを使用して測定され得る（例えば、本明細書の実施例3を参照のこと）。KD値およびkd値は、25℃または37℃で測定することができる。
特定の態様において、本発明の抗スクレロスチン抗体は、スクレロスチンに対する阻害活性を有する。別の態様において、本発明の抗スクレロスチン抗体は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質5および6（LRP5およびLRP6）などの細胞表面受容体を介したスクレロスチンシグナル伝達を阻止する。
特定の態様において、本発明の抗スクレロスチン抗体は、複数の種に由来するスクレロスチンに結合する。ある特定の態様では、抗スクレロスチン抗体は、ヒトおよび非ヒト動物に由来するスクレロスチンに結合する。ある特定の態様では、抗スクレロスチン抗体は、ヒト、マウス、ラット、およびサル（例えば、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、チンパンジー、およびヒヒ）に由来するスクレロスチンに結合する。
MabAバリアント
一局面において、本発明は、(a)配列番号：124のアミノ酸配列を含むHVR-H1；(b)配列番号：126のアミノ酸配列を含むHVR-H2；(c)配列番号：127のアミノ酸配列を含むHVR-H3；(d)配列番号：130のアミノ酸配列を含むHVR-L1；(e)配列番号：131のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および、(f)配列番号：132のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのHVRを含む、抗スクレロスチン抗体を提供する。
一局面において、本発明は、(a)配列番号：124のアミノ酸配列を含むHVR-H1；(b)配列番号：126のアミノ酸配列を含むHVR-H2；および、(c)配列番号：127のアミノ酸配列を含むHVR-H3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVH HVR配列を含む、抗体を提供する。一態様において、抗体は、配列番号：127のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む。別の態様において、抗体は、配列番号：127のアミノ酸配列を含むHVR-H3と、配列番号：132のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む。さらなる態様において、抗体は、配列番号：127のアミノ酸配列を含むHVR-H3と、配列番号：132のアミノ酸配列を含むHVR-L3と、配列番号：126のアミノ酸配列を含むHVR-H2とを含む。さらなる態様において、抗体は、(a)配列番号：124のアミノ酸配列を含むHVR-H1と；(b)配列番号：126のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c)配列番号：127のアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含む。さらなる態様において、抗体は、(a)配列番号：31のアミノ酸配列を含むHVR-H1と；(b)配列番号：69のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c)配列番号：70のアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含む。さらなる態様において、抗体は、(a)配列番号：124のアミノ酸配列を含むHVR-H1と；(b)配列番号：118のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c)配列番号：120のアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含む。さらなる態様において、抗体は、(a)配列番号：31のアミノ酸配列を含むHVR-H1と；(b)配列番号：36のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c)配列番号：41のアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含む。さらなる態様において、抗体は、(a)配列番号：116のアミノ酸配列を含むHVR-H1と；(b)配列番号：118のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c)配列番号：120のアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含む。さらなる態様において、抗体は、(a)配列番号：31のアミノ酸配列を含むHVR-H1と；(b)配列番号：118のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；および(c)配列番号：120のアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含む。
さらなる態様において、抗体は、(a)配列番号：8～14、101、または102のVH配列由来のHVR-H1と；(b)配列番号：8～14、101、または102のVH配列由来のHVR-H2と；(c)配列番号：8～14、101、または102のVH配列由来のHVR-H3とを含む。さらなる態様において、抗体は、(a)配列番号：10のVH配列由来のHVR-H1と；(b)配列番号：10のVH配列由来のHVR-H2と；(c)配列番号：10のVH配列由来のHVR-H3とを含む。さらなる態様において、抗体は、(a)配列番号：101のVH配列由来のHVR-H1と；(b)配列番号：101のVH配列由来のHVR-H2と；(c)配列番号：101のVH配列由来のHVR-H3とを含む。さらなる態様において、抗体は、(a)配列番号：102のVH配列由来のHVR-H1と；(b)配列番号：102のVH配列由来のHVR-H2と；(c)配列番号：102のVH配列由来のHVR-H3とを含む。
別の局面において、本発明は、(a)配列番号：130のアミノ酸配列を含むHVR-L1；(b)配列番号：131のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および(c)配列番号：132のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVL HVR配列を含む、抗体を提供する。一態様において、抗体は、(a)配列番号：130のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(b)配列番号：131のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(c)配列番号：132のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む。一態様において、抗体は、(a)配列番号：71のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(b)配列番号：72のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(c)配列番号：73のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む。一態様において、抗体は、(a)配列番号：122のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(b)配列番号：123のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(c)配列番号：60のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む。一態様において、抗体は、(a)配列番号：53のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(b)配列番号：56のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(c)配列番号：60より選択されるアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む。一態様において、抗体は、(a)配列番号：109のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(b)配列番号：112のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(c)配列番号：60より選択されるアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む。一態様において、抗体は、(a)配列番号：110のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(b)配列番号：113のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(c)配列番号：60より選択されるアミノ酸配列とを含むHVR-L3を含む。一態様において、抗体は、(a)配列番号：110のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(b)配列番号：114のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(c)配列番号：60より選択されるアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む。一態様において、抗体は、(a)配列番号：111のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(b)配列番号：115のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(c)配列番号：60より選択されるアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む。
一態様において、抗体は、(a)配列番号：16～22、98～100、または105のVL配列由来のHVR-L1と；(b)配列番号：16～22、98～100、または105のVL配列由来のHVR-L2と；(c)配列番号：16～22、98～100、または105のVL配列由来のHVR-L3とを含む。一態様において、抗体は、(a)配列番号：18のVL配列由来のHVR-L1と；(b)配列番号：18のVL配列由来のHVR-L2と；(c)配列番号：18のVL配列由来のHVR-L3とを含む。一態様において、抗体は、(a)配列番号：98のVL配列由来のHVR-L1と；(b)配列番号：98のVL配列由来のHVR-L2と；(c)配列番号：98のVL配列由来のHVR-L3とを含む。一態様において、抗体は、(a)配列番号：99のVL配列由来のHVR-L1と；(b)配列番号：99のVL配列由来のHVR-L2と；(c)配列番号：99のVL配列由来のHVR-L3とを含む。一態様において、抗体は、(a)配列番号：100のVL配列由来のHVR-L1と；(b)配列番号：100のVL配列由来のHVR-L2と；(c)配列番号：100のVL配列由来のHVR-L3とを含む。一態様において、抗体は、(a)配列番号：105のVL配列由来のHVR-L1と；(b)配列番号：105のVL配列由来のHVR-L2と；(c)配列番号：105のVL配列由来のHVR-L3とを含む。
別の局面において、本発明の抗体は、(a)VHドメインであって、(i)配列番号：124のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(ii) 配列番号：126のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および(iii)配列番号：127のアミノ酸配列を含むHVR-H3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVH HVR配列を含む、VHドメインと；(b)VLドメインであって、(i)配列番号：130のアミノ酸配列を含むHVR-L1、(ii)配列番号：131のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および(c)配列番号：132のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVL HVR配列を含む、VLドメインとを含む。
別の局面において、本発明は(a)配列番号：124のアミノ酸配列を含むHVR-H1と； (b) 配列番号：126のアミノ酸配列を含むHVR-H2と； (c)配列番号：127のアミノ酸配列を含むHVR-H3と； (d)配列番号：130のアミノ酸配列を含むHVR-L1と； (e)配列番号：131のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(f)配列番号：132より選択されるアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む、抗体を提供する。別の局面において、本発明は(a)配列番号：31のアミノ酸配列を含むHVR-H1と；(b)配列番号：69のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c)配列番号：70のアミノ酸配列を含むHVR-H3と；(d)配列番号：71のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(e)配列番号：72のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(f)配列番号：73のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む、抗体を提供する。別の局面において、本発明は(a)配列番号：124のアミノ酸配列を含むHVR-H1と；(b)配列番号：118のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c)配列番号：120のアミノ酸配列を含むHVR-H3と；(d)配列番号：122のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(e)配列番号：123のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(f)配列番号：60のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む、抗体を提供する。別の局面において、本発明は(a)配列番号：31のアミノ酸配列を含むHVR-H1と；(b)配列番号：36のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c)配列番号：41のアミノ酸配列を含むHVR-H3と；(d)配列番号：53のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(e)配列番号：56のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(f)配列番号：60のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む、抗体を提供する。別の局面において、本発明は(a)配列番号：116のアミノ酸配列を含むHVR-H1と；(b)配列番号：118のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c)配列番号：120のアミノ酸配列を含むHVR-H3と；(d)配列番号：111のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(e)配列番号：115のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(f)配列番号：60のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む、抗体を提供する。別の局面において、本発明は(a)配列番号：31のアミノ酸配列を含むHVR-H1と；(b)配列番号：118のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c)配列番号：120のアミノ酸配列を含むHVR-H3と；(d)配列番号：111のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(e)配列番号：115のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(f)配列番号：60のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む、抗体を提供する。
別の局面において、本発明は(a)配列番号：8～14、101、または102のVH配列由来のHVR-H1と；(b)配列番号：8～14、101、または102のVH配列由来のHVR-H2と；(c)配列番号：8～14、101、または102のVH配列由来のHVR-H3と；(d)配列番号：16～22、98～100、または105のVL配列由来のHVR-L1と；(e)配列番号：16～22、98～100、または105のVL配列由来のHVR-L2と；(f)配列番号：16～22、98～100、または105のVL配列由来のHVR-L3とを含む、抗体を提供する。別の局面において、本発明は(a)配列番号：10のVH配列由来のHVR-H1と；(b)配列番号：10のVH配列由来のHVR-H2と；(c)配列番号：10のVH配列由来のHVR-H3と；(d)配列番号：18のVL配列由来のHVR-L1と；(e)配列番号：18のVL配列由来のHVR-L2と；(f)配列番号：18のVL配列由来のHVR-L3とを含む、抗体を提供する。別の局面において、本発明は(a)配列番号：101のVH配列由来のHVR-H1と；(b)配列番号：101のVH配列由来のHVR-H2と；(c)配列番号：101のVH配列由来のHVR-H3と；(d)配列番号：105のVL配列由来のHVR-L1と；(e)配列番号：105のVL配列由来のHVR-L2と；(f)配列番号：105のVL配列由来のHVR-L3とを含む、抗体を提供する。別の局面において、本発明は(a)配列番号：102のVH配列由来のHVR-H1と；(b)配列番号：102のVH配列由来のHVR-H2と；(c)配列番号：102のVH配列由来のHVR-H3と；(d)配列番号：105のVL配列由来のHVR-L1と；(e)配列番号：105のVL配列由来のHVR-L2と；(f)配列番号：105のVL配列由来のHVR-L3とを含む、抗体を提供する。
特定の態様において、以下のHVRの位置のところで、上述の抗スクレロスチン抗体の任意の1つまたは複数のアミノ酸が置換されている：(a)HVR-H1（配列番号：31）において：位置1；(b)HVR-H2（配列番号：34）において：位置3、5、8、9、11、および12；(c)HVR-H3（配列番号：38）において：位置2、4、5、7、および13；(d)HVR-L1（配列番号：52）において：位置1、4、5、6、7、8、9、10、および11；(e)HVR-L2（配列番号：56）において：位置1、2、4、5、6、および7；および(f)HVR-L3（配列番号：60）において：位置1、3、4、5、6、7、および8。一態様において、本発明の抗体は、配列番号：7のアミノ酸配列を含むVHと配列番号：15のアミノ酸配列を含むVLとを含み、ここで、以下のHVRの位置のところで、少なくとも1つのアミノ酸が置換されている：(a)HVR-H1（配列番号：31）において：位置1；(b)HVR-H2（配列番号：34）において：位置3、5、8、9、11、および12；(c)HVR-H3（配列番号：38）において：位置2、4、5、7、および13；(d)HVR-L1（配列番号：52）において：位置1、4、5、6、7、8、9、10、および11；(e)HVR-L2（配列番号：56）において：位置1、2、4、5、6、および7；および(f)HVR-L3（配列番号：60）において：位置1、3、4、5、6、7、および8。さらなる態様において、本発明の抗体は、配列番号：7のアミノ酸配列を含むVHと配列番号：15のアミノ酸配列を含むVLとを含み、ここで、以下のHVRの位置のところで、少なくとも1つのアミノ酸が置換されている：(a)HVR-H2（配列番号：34）において：位置5および8；(c)HVR-H3（配列番号：38）において：位置2、5、7、および13；(d)HVR-L1（配列番号：52）において：位置4および7；(e)HVR-L2（配列番号：56）において：位置1および2；および(f)HVR-L3（配列番号：60）において：位置1。さらなる態様において、本発明の抗体は、配列番号：7のアミノ酸配列を含むVHと配列番号：15のアミノ酸配列を含むVLとを含み、ここで、以下のHVRの位置のところで、少なくとも1つのアミノ酸が置換されている：(a)HVR-H1（配列番号：31）において：位置1；(b)HVR-H2（配列番号：34）において：位置3、5、8、9、11、および12；(c)HVR-H3（配列番号：38）において：位置2、4、および5；(d)HVR-L1（配列番号：52）において：位置4、5、7、8、9、および11；および(e)HVR-L2（配列番号：56）において：位置1、2、4、5、および6。
特定の態様において、本明細書で提供される抗スクレロスチン抗体の1つまたは複数のアミノ酸置換は、保存的置換である。特定の態様において、以下のいずれか1つまたは複数の置換が、任意の組み合わせで行われてもよい（注：下記の略号「AxB」は、x（数字）位のアミノ酸Aがアミノ酸Bに置換されることを意味し、ここで、AおよびBは当技術分野において使用される1文字アミノ酸略号である）：(a)HVR-H1（配列番号：31）において：D1S；(b)HVR-H2（配列番号：34）において：N3M；N5H；G8HまたはR；A9Y；Y11L；N12K；(c)HVR-H3（配列番号：38）において：G2HまたはE；D4S；D5HまたはE；Y7H；D13H；(d)HVR-L1（配列番号：52）において：R1K；Q4HまたはE；D5G；I6V；S7H；N8TまたはD；Y9A；L10V；N11A；(e)HVR-L2（配列番号：56）において：Y1HまたはW；T2HまたはA；R4T；L5R；L6WまたはE；S7T；および(f)HVR-L3（配列番号：60）において：Q1H；G3Y；D4SまたはH；T5D；L6Y；P7H；Y8W。一態様において、本発明の抗体は、配列番号：7のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号：15のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、以下のいずれか1つまたは複数の置換が、任意の組み合わせで行われてもよい：(a)HVR-H1（配列番号：31）において：D1S；(b)HVR-H2（配列番号：34）において：N3M；N5H；G8HまたはR；A9Y；Y11L；N12K；(c)HVR-H3（配列番号：38）において：G2HまたはE；D4S；D5HまたはE；Y7H；D13H；(d)HVR-L1（配列番号：52）において：R1K；Q4HまたはE；D5G；I6V；S7H；N8TまたはD；Y9A；L10V；N11A；(e)HVR-L2（配列番号：56）において：Y1HまたはW；T2HまたはA；R4T；L5R；L6WまたはE；S7T；および(f)HVR-L3（配列番号：60）において：Q1H；G3Y；D4SまたはH；T5D；L6Y；P7H；Y8W。さらなる態様において、本発明の抗体は、配列番号：7のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号：15のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、以下のいずれか1つまたは複数の置換が、任意の組み合わせで行われてもよい：(a)HVR-H2（配列番号：34）において：N5H；G8H；(c)HVR-H3（配列番号：38）において：G2H；D5H；Y7H；D13H；(d)HVR-L1（配列番号：52）において：Q4H；S7H；(e)HVR-L2（配列番号：56）において：Y1H；T2H；および(f)HVR-L3（配列番号：60）において：Q1H。さらなる態様において、本発明の抗体は、配列番号：7のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号：15のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、以下のいずれか1つまたは複数の置換が、任意の組み合わせで行われてもよい：(a)HVR-H1（配列番号：31）において：D1S；(b)HVR-H2（配列番号：34）において：N3M；N5H；G8R；A9Y；Y11L；N12K；(c)HVR-H3（配列番号：38）において：G2E；D4S；D5E；(d)HVR-L1（配列番号：52）において：Q4E；D5G；S7H；N8TまたはD；Y9A；N11A；および(e)HVR-L2（配列番号：56）において：Y1W；T2A；R4T；L5R；L6WまたはE。
上述の置換の可能なすべての組み合わせは、HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3について、それぞれ配列番号：124、126、127、130、131、および132のコンセンサス配列に包含される。
上述の態様の任意のものにおいて、抗スクレロスチン抗体は、ヒト化されている。一態様において、抗スクレロスチン抗体は、上述の態様の任意のものにおけるHVRを含み、かつさらに、アクセプターヒトフレームワーク（例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク）を含む。別の態様において、抗スクレロスチン抗体は、上述の態様の任意のものにおけるHVRを含み、かつさらに、FR配列を含むVHまたはVLを含む。さらなる態様において、抗スクレロスチン抗体は、以下の重鎖または軽鎖の可変ドメインFR配列を含む：重鎖可変ドメインについて、FR1は、配列番号：45のアミノ酸配列を含み、FR2は、配列番号：47または48のアミノ酸配列を含み、FR3は、配列番号：49または134のアミノ酸配列を含み、FR4は、配列番号：51のアミノ酸配列を含む。軽鎖可変ドメインについて、FR1は、配列番号：65のアミノ酸配列を含み、FR2は、配列番号：66のアミノ酸配列を含み、FR3は、配列番号：67のアミノ酸配列を含み、FR4は、配列番号：68のアミノ酸配列を含む。
別の局面において、抗スクレロスチン抗体は、配列番号：10のアミノ酸配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン (VH) 配列を含む。特定の態様において、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するVH配列は、参照配列に対して、置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むが、当該配列を含む抗スクレロスチン抗体は、スクレロスチンに結合する能力を保持する。特定の態様において、合計1個から10個のアミノ酸が、配列番号：10において、置換、挿入、および／または欠失される。特定の態様において、置換、挿入、または欠失は、HVRの外側の領域（すなわち、FRの中）で生じる。任意で、抗スクレロスチン抗体は、配列番号：10におけるVH配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。ある特定の態様では、VHは、(a)配列番号：31のアミノ酸配列を含むHVR-H1、 (b)配列番号：36のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および(c)配列番号：41のアミノ酸配列を含むHVR-H3より選択される、1つ、2つ、または3つのHVRを含む。
別の局面において、抗スクレロスチン抗体は、配列番号：101のアミノ酸配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン (VH) 配列を含む。特定の態様において、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するVH配列は、参照配列に対して、置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むが、当該配列を含む抗スクレロスチン抗体は、スクレロスチンに結合する能力を保持する。特定の態様において、合計1個から10個のアミノ酸が、配列番号：101において、置換、挿入、および／または欠失される。特定の態様において、置換、挿入、または欠失は、HVRの外側の領域（すなわち、FRの中）で生じる。任意で、抗スクレロスチン抗体は、配列番号：101におけるVH配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。ある特定の態様では、VHは、(a)配列番号：116のアミノ酸配列を含むHVR-H1、 (b)配列番号：118のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および(c)配列番号：120のアミノ酸配列を含むHVR-H3より選択される、1つ、2つ、または3つのHVRを含む。
別の局面において、抗スクレロスチン抗体は、配列番号：102のアミノ酸配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン (VH) 配列を含む。特定の態様において、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するVH配列は、参照配列に対して、置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むが、当該配列を含む抗スクレロスチン抗体は、スクレロスチンに結合する能力を保持する。特定の態様において、合計1個から10個のアミノ酸が、配列番号：102において、置換、挿入、および／または欠失される。特定の態様において、置換、挿入、または欠失は、HVRの外側の領域（すなわち、FRの中）で生じる。任意で、抗スクレロスチン抗体は、配列番号：102におけるVH配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。ある特定の態様では、VHは、(a)配列番号：31のアミノ酸配列を含むHVR-H1、 (b)配列番号：118のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および(c)配列番号：120のアミノ酸配列を含むHVR-H3より選択される、1つ、2つ、または3つのHVRを含む。
別の局面において、配列番号：18のアミノ酸配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン (VL) を含む、抗スクレロスチン抗体が提供される。特定の態様において、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するVL配列は、参照配列に対して、置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むが、当該配列を含む抗スクレロスチン抗体は、スクレロスチンに結合する能力を保持する。特定の態様において、合計1個から10個のアミノ酸が、配列番号：18において、置換、挿入、および／または欠失される。特定の態様において、置換、挿入、または欠失は、HVRの外側の領域（すなわち、FRの中）で生じる。任意で、抗スクレロスチン抗体は、配列番号：18におけるVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。ある特定の態様では、VLは、(a)配列番号：53のアミノ酸配列を含むHVR-L1、 (b)配列番号：56のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および(c)配列番号：60のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、1つ、2つ、または3つのHVRを含む。
別の局面において、配列番号：105のアミノ酸配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン (VL) を含む、抗スクレロスチン抗体が提供される。特定の態様において、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するVL配列は、参照配列に対して、置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むが、当該配列を含む抗スクレロスチン抗体は、スクレロスチンに結合する能力を保持する。特定の態様において、合計1個から10個のアミノ酸が、配列番号：105において、置換、挿入、および／または欠失される。特定の態様において、置換、挿入、または欠失は、HVRの外側の領域（すなわち、FRの中）で生じる。任意で、抗スクレロスチン抗体は、配列番号：105におけるVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。ある特定の態様では、VLは、(a)配列番号：111のアミノ酸配列を含むHVR-L1、 (b)配列番号：115のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および(c)配列番号：60のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、1つ、2つ、または3つのHVRを含む。
別の局面において、上述の態様の任意のものにおけるVH、および上述の態様の任意のものにおけるVLを含む、抗スクレロスチン抗体が提供される。一態様において、抗体はそれぞれ配列番号：7～14、101、および102のうちのいずれか1つならびに配列番号：15～22、98～100、および105のうちのいずれか1つ中のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。一態様において、抗体はそれぞれ配列番号：10および配列番号：18中のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。一態様において、抗体はそれぞれ配列番号：101および配列番号：105中のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。一態様において、抗体はそれぞれ配列番号：102および配列番号：105中のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。
ある特定の態様では、本発明の抗スクレロスチン抗体は、それぞれ配列番号：7および配列番号：15中のVHおよびVL配列を含む抗体ではない。
MabBバリアント
一局面において、本発明は、(a)配列番号：128のアミノ酸配列を含むHVR-H1；(b)配列番号：125のアミノ酸配列を含むHVR-H2；(c)配列番号：129のアミノ酸配列を含むHVR-H3；(d)配列番号：130のアミノ酸配列を含むHVR-L1；(e)配列番号：131のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および、(f)配列番号：132のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのHVRを含む、抗スクレロスチン抗体を提供する。
一局面において、本発明は、(a)配列番号：128のアミノ酸配列を含むHVR-H1；(b)配列番号：125のアミノ酸配列を含むHVR-H2；および、(c)配列番号：129のアミノ酸配列を含むHVR-H3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVH HVR配列を含む、抗体を提供する。一態様において、抗体は、配列番号：129のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む。別の態様において、抗体は、配列番号：129のアミノ酸配列を含むHVR-H3と、配列番号：132のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む。さらなる態様において、抗体は、配列番号：129のアミノ酸配列を含むHVR-H3と、配列番号：132のアミノ酸配列を含むHVR-L3と、配列番号：125のアミノ酸配列を含むHVR-H2とを含む。さらなる態様において、抗体は、(a)配列番号：128のアミノ酸配列を含むHVR-H1と；(b)配列番号：125のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c)配列番号：129のアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含む。さらなる態様において、抗体は、(a)配列番号：74のアミノ酸配列を含むHVR-H1と；(b)配列番号：37のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c)配列番号：75のアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含む。さらなる態様において、抗体は、(a)配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-H1と；(b)配列番号：125のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c)配列番号：121のアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含む。さらなる態様において、抗体は、(a)配列番号：33のアミノ酸配列を含むHVR-H1と；(b)配列番号：37のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c)配列番号：43のアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含む。さらなる態様において、抗体は、(a)配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-H1と；(b)配列番号：119のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c)配列番号：121のアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含む。さらなる態様において、抗体は、(a)配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-H1と；(b)配列番号：37のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；および(c)配列番号：121のアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含む。
さらなる態様において、抗体は、(a)配列番号：24～26、103、または104のVH配列由来のHVR-H1と；(b)配列番号：24～26、103、または104のVH配列由来のHVR-H2と；(c)配列番号：24～26、103、または104のVH配列由来のHVR-H3とを含む。さらなる態様において、抗体は、(a)配列番号：24のVH配列由来のHVR-H1と；(b)配列番号：24のVH配列由来のHVR-H2と；(c)配列番号：24のVH配列由来のHVR-H3とを含む。さらなる態様において、抗体は、(a)配列番号：103のVH配列由来のHVR-H1と；(b)配列番号：103のVH配列由来のHVR-H2と；(c)配列番号：103のVH配列由来のHVR-H3とを含む。さらなる態様において、抗体は、(a)配列番号：104のVH配列由来のHVR-H1と；(b)配列番号：104のVH配列由来のHVR-H2と；(c)配列番号：104のVH配列由来のHVR-H3とを含む。
別の局面において、本発明は、(a)配列番号：130のアミノ酸配列を含むHVR-L1；(b)配列番号：131のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および(c)配列番号：132のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVL HVR配列を含む、抗体を提供する。一態様において、抗体は、(a)配列番号：130のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(b)配列番号：131のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(c)配列番号：132のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む。一態様において、抗体は、(a)配列番号：55のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(b)配列番号：59のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(c)配列番号：76のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む。一態様において、抗体は、(a)配列番号：122のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(b)配列番号：123のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(c)配列番号：60のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む。一態様において、抗体は、(a)配列番号：55のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(b)配列番号：59のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(c)配列番号：63より選択されるアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む。一態様において、抗体は、(a)配列番号：109のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(b)配列番号：112のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(c)配列番号：60より選択されるアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む。一態様において、抗体は、(a)配列番号：110のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(b)配列番号：113のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(c)配列番号：60より選択されるアミノ酸配列とを含むHVR-L3を含む。一態様において、抗体は、(a)配列番号：110のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(b)配列番号：114のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(c)配列番号：60より選択されるアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む。一態様において、抗体は、(a)配列番号：111のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(b)配列番号：115のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(c)配列番号：60より選択されるアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む。
一態様において、抗体は、(a)配列番号：28～30、98～100、または105のVL配列由来のHVR-L1と；(b)配列番号：28～30、98～100、または105のVL配列由来のHVR-L2と；(c)配列番号：28～30、98～100、または105のVL配列由来のHVR-L3とを含む。一態様において、抗体は、(a)配列番号：28のVL配列由来のHVR-L1と；(b)配列番号：28のVL配列由来のHVR-L2と；(c)配列番号：28のVL配列由来のHVR-L3とを含む。一態様において、抗体は、(a)配列番号：98のVL配列由来のHVR-L1と；(b)配列番号：98のVL配列由来のHVR-L2と；(c)配列番号：98のVL配列由来のHVR-L3とを含む。一態様において、抗体は、(a)配列番号：99のVL配列由来のHVR-L1と；(b)配列番号：99のVL配列由来のHVR-L2と；(c)配列番号：99のVL配列由来のHVR-L3とを含む。一態様において、抗体は、(a)配列番号：100のVL配列由来のHVR-L1と；(b)配列番号：100のVL配列由来のHVR-L2と；(c)配列番号：100のVL配列由来のHVR-L3とを含む。一態様において、抗体は、(a)配列番号：105のVL配列由来のHVR-L1と；(b)配列番号：105のVL配列由来のHVR-L2と；(c)配列番号：105のVL配列由来のHVR-L3とを含む。
別の局面において、本発明の抗体は、(a)VHドメインであって、(i)配列番号：128のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(ii) 配列番号：125のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および(iii)配列番号：129のアミノ酸配列を含むHVR-H3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVH HVR配列を含む、VHドメインと；(b)VLドメインであって、(i)配列番号：130のアミノ酸配列を含むHVR-L1、(ii)配列番号：131のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および(c)配列番号：132のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVL HVR配列を含む、VLドメインとを含む。
別の局面において、本発明は(a)配列番号：128のアミノ酸配列を含むHVR-H1と； (b) 配列番号：125のアミノ酸配列を含むHVR-H2と； (c)配列番号：129のアミノ酸配列を含むHVR-H3と； (d)配列番号：130のアミノ酸配列を含むHVR-L1と； (e)配列番号：131のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(f)配列番号：132より選択されるアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む、抗体を提供する。別の局面において、本発明は(a)配列番号：74のアミノ酸配列を含むHVR-H1と；(b)配列番号：37のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c)配列番号：75のアミノ酸配列を含むHVR-H3と；(d)配列番号：55のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(e)配列番号：59のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(f)配列番号：76のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む、抗体を提供する。別の局面において、本発明は(a)配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-H1と；(b)配列番号：125のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c)配列番号：121のアミノ酸配列を含むHVR-H3と；(d)配列番号：122のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(e)配列番号：123のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(f)配列番号：60のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む、抗体を提供する。別の局面において、本発明は(a)配列番号：33のアミノ酸配列を含むHVR-H1と；(b)配列番号：37のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c)配列番号：43のアミノ酸配列を含むHVR-H3と；(d)配列番号：55のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(e)配列番号：59のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(f)配列番号：63のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む、抗体を提供する。別の局面において、本発明は(a)配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-H1と；(b)配列番号：119のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c)配列番号：121のアミノ酸配列を含むHVR-H3と；(d)配列番号：111のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(e)配列番号：115のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(f)配列番号：60のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む、抗体を提供する。別の局面において、本発明は(a)配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-H1と；(b)配列番号：37のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c)配列番号：121のアミノ酸配列を含むHVR-H3と；(d)配列番号：111のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(e)配列番号：115のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(f)配列番号：60のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む、抗体を提供する。
別の局面において、本発明は、(a)配列番号：24～26、103、または104のVH配列由来のHVR-H1と；(b)配列番号：24～26、103、または104のVH配列由来のHVR-H2と；(c)配列番号：24～26、103、または104のVH配列由来のHVR-H3と；(d)配列番号：28～30、98～100、または105のVL配列由来のHVR-L1と；(e)配列番号：28～30、98～100、または105のVL配列由来のHVR-L2と；(f)配列番号：28～30、98～100、または105のVL配列由来のHVR-L3とを含む、抗体を提供する。別の局面において、本発明は、(a)配列番号：24のVH配列由来のHVR-H1と；(b)配列番号：24のVH配列由来のHVR-H2と；(c)配列番号：24のVH配列由来のHVR-H3と；(d)配列番号：28のVL配列由来のHVR-L1と；(e)配列番号：28のVL配列由来のHVR-L2と；(f)配列番号：28のVL配列由来のHVR-L3とを含む、抗体を提供する。別の局面において、本発明は、(a)配列番号：103のVH配列由来のHVR-H1と；(b)配列番号：103のVH配列由来のHVR-H2と；(c)配列番号：103のVH配列由来のHVR-H3と；(d)配列番号：105のVL配列由来のHVR-L1と；(e)配列番号：105のVL配列由来のHVR-L2と；(f)配列番号：105のVL配列由来のHVR-L3とを含む、抗体を提供する。別の局面において、本発明は、(a)配列番号：104のVH配列由来のHVR-H1と；(b)配列番号：104のVH配列由来のHVR-H2と；(c)配列番号：104のVH配列由来のHVR-H3と；(d)配列番号：105のVL配列由来のHVR-L1と；(e)配列番号：105のVL配列由来のHVR-L2と；(f)配列番号：105のVL配列由来のHVR-L3とを含む、抗体を提供する。
特定の態様において、以下のHVRの位置のところで、上述の抗スクレロスチン抗体の任意の1つまたは複数のアミノ酸が置換されている：(a)HVR-H1（配列番号：32）において：位置1、2、および4；(b)HVR-H2（配列番号：37）において：位置9；(c)HVR-H3（配列番号：43）において：位置2および9；(d)HVR-L1（配列番号：55）において：位置1、4、5、6、7、8、9、10、および11；(e)HVR-L2（配列番号：59）において：位置1、2、4、5、6、および7；および(f)HVR-L3（配列番号：62）において：位置1、3、4、5、6、7、および8。一態様において、本発明の抗体は、配列番号：23のアミノ酸配列を含むVHと配列番号：27のアミノ酸配列を含むVLとを含み、ここで、以下のHVRの位置のところで、少なくとも1つのアミノ酸が置換されている：(a)HVR-H1（配列番号：32）において：位置1、2、および4；(b)HVR-H2（配列番号：37）において：位置9；(c)HVR-H3（配列番号：43）において：位置2および9；(d)HVR-L1（配列番号：55）において：位置1、4、5、6、7、8、9、10、および11；(e)HVR-L2（配列番号：59）において：位置1、2、4、5、6、および7；および(f)HVR-L3（配列番号：62）において：位置1、3、4、5、6、7、および8。さらなる態様において、本発明の抗体は、配列番号：23のアミノ酸配列を含むVHと配列番号：27のアミノ酸配列を含むVLとを含み、ここで、以下のHVRの位置のところで、少なくとも1つのアミノ酸が置換されている：(a)HVR-H1（配列番号：32）において：位置1および2；(b)HVR-H3（配列番号：43）において：位置2；および(c)HVR-L3（配列番号：62）において：位置4および7。さらなる態様において、本発明の抗体は、配列番号：23のアミノ酸配列を含むVHと配列番号：27のアミノ酸配列を含むVLとを含み、ここで、以下のHVRの位置のところで、少なくとも1つのアミノ酸が置換されている：(a)HVR-H1（配列番号：32）において：位置1および4；(b)HVR-H2（配列番号：37）において：位置9；(c)HVR-H3（配列番号：43）において：位置9；(d)HVR-L1（配列番号：55）において：位置1、4、5、6、7、8、9、および10；および(e)HVR-L2（配列番号：59）において：位置5、6、および7；および(f)HVR-L3（配列番号：62）において：位置3、4、5、6、および8。
特定の態様において、本明細書で提供される抗スクレロスチン抗体の1つまたは複数のアミノ酸置換は、保存的置換である。特定の態様において、以下のいずれか1つまたは複数の置換が、任意の組み合わせで行われてもよい：(a)HVR-H1（配列番号：32）において：D1H；T2H；Q4M；(b)HVR-H2（配列番号：37）において：T9H；(c)HVR-H3（配列番号：43）において：D2H；F9Y；(d)HVR-L1（配列番号：55）において：K1R；Q4HまたはE；D5G；V6I；H7S；T8NまたはD；A9Y；V10L；A11N；(e)HVR-L2（配列番号：59）において：W1HまたはY；A2HまたはT；T4R；R5L；W6LまたはE；T7S；および(f)HVR-L3（配列番号：62）において：Q1H；Y3G；S4DまたはH；D5T；Y6L；P7H；W8Y。一態様において、本発明の抗体は、配列番号：23のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号：27のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、以下のいずれか1つまたは複数の置換が、任意の組み合わせで行われてもよい：(a)HVR-H1（配列番号：32）において：D1H；T2H；Q4M；(b)HVR-H2（配列番号：37）において：T9H；(c)HVR-H3（配列番号：43）において：D2H；F9Y；(d)HVR-L1（配列番号：55）において：K1R；Q4HまたはE；D5G；V6I；H7S；T8NまたはD；A9Y；V10L；A11N；(e)HVR-L2（配列番号：59）において：W1HまたはY；A2HまたはT；T4R；R5L；W6LまたはE；T7S；および(f)HVR-L3（配列番号：62）において：Q1H；Y3G；S4DまたはH；D5T；Y6L；P7H；W8Y。さらなる態様において、本発明の抗体は、配列番号：23のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号：27のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、以下のいずれか1つまたは複数の置換が、任意の組み合わせで行われてもよい：(a)HVR-H1（配列番号：32）において：D1H；T2H；(b)HVR-H3（配列番号：43）において：D2H；(c)HVR-L3（配列番号：62）において：S4H；P7H。さらなる態様において、本発明の抗体は、配列番号：23のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号：27のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、以下のいずれか1つまたは複数の置換が、任意の組み合わせで行われてもよい：(a)HVR-H1（配列番号：32）において：D1H；Q4M；(b)HVR-H2（配列番号：37）において：T9H；(c)HVR-H3（配列番号：43）において：F9Y；(d)HVR-L1（配列番号：55）において：K1R；Q4E；D5G；V6I；H7S；T8D；A9Y；V10L；(e)HVR-L2（配列番号：59）において：R5L；W6LまたはE；T7S；および(f)HVR-L3（配列番号：62）において：Y3G；S4D；D5T；Y6L；W8Y。
上述の置換の可能なすべての組み合わせは、HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3について、それぞれ配列番号：128、125、129、130、131、および132のコンセンサス配列に包含される。
上述の態様の任意のものにおいて、抗スクレロスチン抗体は、ヒト化されている。一態様において、抗スクレロスチン抗体は、上述の態様の任意のものにおけるHVRを含み、かつさらに、アクセプターヒトフレームワーク（例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク）を含む。別の態様において、抗スクレロスチン抗体は、上述の態様の任意のものにおけるHVRを含み、かつさらに、FR配列を含むVHまたはVLを含む。さらなる態様において、抗スクレロスチン抗体は、以下の重鎖または軽鎖の可変ドメインFR配列を含む：重鎖可変ドメインについて、FR1は、配列番号：46または133のアミノ酸配列を含み、FR2は、配列番号：48のアミノ酸配列を含み、FR3は、配列番号：50のアミノ酸配列を含み、FR4は、配列番号：51または135のアミノ酸配列を含む。軽鎖可変ドメインについて、FR1は、配列番号：65のアミノ酸配列を含み、FR2は、配列番号：66のアミノ酸配列を含み、FR3は、配列番号：67のアミノ酸配列を含み、FR4は、配列番号：68のアミノ酸配列を含む。
別の局面において、抗スクレロスチン抗体は、配列番号：24のアミノ酸配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン (VH) 配列を含む。特定の態様において、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するVH配列は、参照配列に対して、置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むが、当該配列を含む抗スクレロスチン抗体は、スクレロスチンに結合する能力を保持する。特定の態様において、合計1個から10個のアミノ酸が、配列番号：24において、置換、挿入、および／または欠失される。特定の態様において、置換、挿入、または欠失は、HVRの外側の領域（すなわち、FRの中）で生じる。任意で、抗スクレロスチン抗体は、配列番号：24におけるVH配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。ある特定の態様では、VHは、(a)配列番号：33のアミノ酸配列を含むHVR-H1、 (b)配列番号：37のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および(c)配列番号：43のアミノ酸配列を含むHVR-H3より選択される、1つ、2つ、または3つのHVRを含む。
別の局面において、抗スクレロスチン抗体は、配列番号：103のアミノ酸配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン (VH) 配列を含む。特定の態様において、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するVH配列は、参照配列に対して、置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むが、当該配列を含む抗スクレロスチン抗体は、スクレロスチンに結合する能力を保持する。特定の態様において、合計1個から10個のアミノ酸が、配列番号：103において、置換、挿入、および／または欠失される。特定の態様において、置換、挿入、または欠失は、HVRの外側の領域（すなわち、FRの中）で生じる。任意で、抗スクレロスチン抗体は、配列番号：103におけるVH配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。ある特定の態様では、VHは、(a)配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-H1、 (b)配列番号：119のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および(c)配列番号：121のアミノ酸配列を含むHVR-H3より選択される、1つ、2つ、または3つのHVRを含む。
別の局面において、抗スクレロスチン抗体は、配列番号：104のアミノ酸配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン (VH) 配列を含む。特定の態様において、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するVH配列は、参照配列に対して、置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むが、当該配列を含む抗スクレロスチン抗体は、スクレロスチンに結合する能力を保持する。特定の態様において、合計1個から10個のアミノ酸が、配列番号：104において、置換、挿入、および／または欠失される。特定の態様において、置換、挿入、または欠失は、HVRの外側の領域（すなわち、FRの中）で生じる。任意で、抗スクレロスチン抗体は、配列番号：104におけるVH配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。ある特定の態様では、VHは、(a)配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-H1、 (b)配列番号：37のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および(c)配列番号：121のアミノ酸配列を含むHVR-H3より選択される、1つ、2つ、または3つのHVRを含む。
別の局面において、配列番号：28のアミノ酸配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン (VL) を含む、抗スクレロスチン抗体が提供される。特定の態様において、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するVL配列は、参照配列に対して、置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むが、当該配列を含む抗スクレロスチン抗体は、スクレロスチンに結合する能力を保持する。特定の態様において、合計1個から10個のアミノ酸が、配列番号：28において、置換、挿入、および／または欠失される。特定の態様において、置換、挿入、または欠失は、HVRの外側の領域（すなわち、FRの中）で生じる。任意で、抗スクレロスチン抗体は、配列番号：28におけるVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。ある特定の態様では、VLは、(a)配列番号：55のアミノ酸配列を含むHVR-L1、 (b)配列番号：59のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および(c)配列番号：63のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、1つ、2つ、または3つのHVRを含む。
別の局面において、配列番号：105のアミノ酸配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン (VL) を含む、抗スクレロスチン抗体が提供される。特定の態様において、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するVL配列は、参照配列に対して、置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むが、当該配列を含む抗スクレロスチン抗体は、スクレロスチンに結合する能力を保持する。特定の態様において、合計1個から10個のアミノ酸が、配列番号：105において、置換、挿入、および／または欠失される。特定の態様において、置換、挿入、または欠失は、HVRの外側の領域（すなわち、FRの中）で生じる。任意で、抗スクレロスチン抗体は、配列番号：105におけるVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。ある特定の態様では、VLは、(a)配列番号：111のアミノ酸配列を含むHVR-L1、 (b)配列番号：115のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および(c)配列番号：60のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、1つ、2つ、または3つのHVRを含む。
別の局面において、上述の態様の任意のものにおけるVH、および上述の態様の任意のものにおけるVLを含む、抗スクレロスチン抗体が提供される。一態様において、抗体はそれぞれ配列番号：23～26、103、および104のうちのいずれか1つならびに配列番号：27～30、98～100、および105のうちのいずれか1つ中のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。一態様において、抗体はそれぞれ配列番号：24および配列番号：28中のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。一態様において、抗体はそれぞれ配列番号：103および配列番号：105中のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。一態様において、抗体はそれぞれ配列番号：104および配列番号：105中のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。
特定の態様において、本発明の抗スクレロスチン抗体は、それぞれ配列番号：23および配列番号：27中のVHおよびVL配列を含む抗体ではない。
さらなる局面において、本発明は、本明細書で提供される抗スクレロスチン抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。別の局面において、本発明は、本明細書で提供される抗スクレロスチン抗体とスクレロスチンへの結合に関して競合する抗体を提供する。例えば、特定の態様において、配列番号：7のVH配列および配列番号：15のVL配列を含む抗スクレロスチン抗体と同じエピトープに結合しかつ/またはスクレロスチンへの結合に関してそれと競合する抗体が提供される。例えば、特定の態様において、配列番号：23のVH配列および配列番号：27のVL配列を含む抗スクレロスチン抗体と同じエピトープに結合しかつ/またはスクレロスチンへの結合に関してそれと競合する抗体が提供される。特定の態様において、配列番号：1のアミノ酸109～134（CGPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC）を含むスクレロスチンのループ構造に結合する抗体が提供される。特定の態様において、相互にジスルフィド結合した配列番号：1のアミノ酸74～87（DVSEYSCRELHFTR）、アミノ酸96～113（SAKPVTELVCSGQCGPAR）、アミノ酸124～140（WWRPSGPDFRCIPDRYR）、アミノ酸161～172（LVASCKCKRLTR）の4種のポリペプチドを含むスクレロスチンのシスチンノット構造に結合する抗体が提供される。
一局面において、本発明の抗スクレロスチン抗体は、少なくとも2種の異なる可変領域を含む多重特異性抗体または多重パラトープ抗体である。ある特定の態様では、抗スクレロスチン抗体は、二重特異性抗体または二重パラトープ（バイパラトピック）抗体である。本明細書で提供される抗スクレロスチン抗体の任意の可変領域またはそれらの任意の組み合わせを、多重特異性抗体または多重パラトープ抗体において使用することができる。いくつかの態様において、本発明の多重特異性抗体または多重パラトープ抗体は、mabAバリアントのいずれか1つに由来する可変領域およびmabBバリアントのいずれか1つに由来する可変領域を含む。
一態様において、本発明の多重特異性抗体は、第1の可変領域が(a)配列番号：124のアミノ酸配列を含むHVR-H1；(b)配列番号：126のアミノ酸配列を含むHVR-H2；(c)配列番号：127のアミノ酸配列を含むHVR-H3；(d)配列番号：130のアミノ酸配列を含むHVR-L1；(e)配列番号：131のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および(f)配列番号：132のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含み、かつ第2の可変領域が(a)配列番号：128のアミノ酸配列を含むHVR-H1；(b)配列番号：125のアミノ酸配列を含むHVR-H2；(c)配列番号：129のアミノ酸配列を含むHVR-H3；(d)配列番号：130のアミノ酸配列を含むHVR-L1；(e)配列番号：131のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および(f)配列番号：132のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む、抗体である。さらなる態様において、本発明の多重特異性抗体は、第1の可変領域が(a)配列番号：31のアミノ酸配列を含むHVR-H1；(b)配列番号：69のアミノ酸配列を含むHVR-H2；(c)配列番号：70のアミノ酸配列を含むHVR-H3；(d)配列番号：71のアミノ酸配列を含むHVR-L1；(e)配列番号：72のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および(f)配列番号：73のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含み、かつ第2の可変領域が(a)配列番号：74のアミノ酸配列を含むHVR-H1；(b)配列番号：37のアミノ酸配列を含むHVR-H2；(c)配列番号：75のアミノ酸配列を含むHVR-H3；(d)配列番号：55のアミノ酸配列を含むHVR-L1；(e)配列番号：59のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および(f)配列番号：76のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む、抗体である。さらなる態様において、本発明の多重特異性抗体は、第1の可変領域が(a)配列番号：124のアミノ酸配列を含むHVR-H1；(b)配列番号：118のアミノ酸配列を含むHVR-H2；(c)配列番号：120のアミノ酸配列を含むHVR-H3；(d)配列番号：122のアミノ酸配列を含むHVR-L1；(e)配列番号：123のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および(f)配列番号：60のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含み、かつ第2の可変領域が(a)配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-H1；(b)配列番号：125のアミノ酸配列を含むHVR-H2；(c)配列番号：121のアミノ酸配列を含むHVR-H3；(d)配列番号：122のアミノ酸配列を含むHVR-L1；(e)配列番号：123のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および(f)配列番号：60のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む、抗体である。
一態様において、本発明の多重特異性抗体は、第1の可変領域が(a)配列番号：8～14、101、102のうちのいずれか1つのVH配列に由来するHVR-H1；(b)配列番号：8～14、101、102のうちのいずれか1つのVH配列に由来するHVR-H2；(c)配列番号：8～14、101、102のうちのいずれか1つのVH配列に由来するHVR-H3；(d)配列番号：16～22、98～100、105のうちのいずれか1つのVL配列に由来するHVR-L1；(e)配列番号：16～22、98～100、105のうちのいずれか1つのVL配列に由来するHVR-L2；および(f)配列番号：16～22、98～100、105のうちのいずれか1つのVL配列に由来するHVR-L3を含み、かつ第2の可変領域が(a)配列番号：24～26、103、104のうちのいずれか1つのVH配列に由来するHVR-H1；(b)配列番号：24～26、103、104のうちのいずれか1つのVH配列に由来するHVR-H2；(c)配列番号：24～26、103、104のうちのいずれか1つのVH配列に由来するHVR-H3；(d)配列番号：28～30、98～100、105のうちのいずれか1つのVL配列に由来するHVR-L1；(e)配列番号：28～30、98～100、105のうちのいずれか1つのVL配列に由来するHVR-L2；および(f)配列番号：28～30、98～100、105のうちのいずれか1つのVL配列に由来するHVR-L3を含む、抗体である。さらなる態様において、本発明の多重特異性抗体は、第1の可変領域が(a)配列番号：8～14のうちのいずれか1つのVH配列に由来するHVR-H1；(b)配列番号：8～14のうちのいずれか1つのVH配列に由来するHVR-H2；(c)配列番号：8～14のうちのいずれか1つのVH配列に由来するHVR-H3；(d)配列番号：16～22のうちのいずれか1つのVL配列に由来するHVR-L1；(e)配列番号：16～22のうちのいずれか1つのVL配列に由来するHVR-L2；および(f)配列番号：16～22のうちのいずれか1つのVL配列に由来するHVR-L3を含み、かつ第2の可変領域が(a)配列番号：24～26のうちのいずれか1つのVH配列に由来するHVR-H1；(b)配列番号：24～26のうちのいずれか1つのVH配列に由来するHVR-H2；(c)配列番号：24～26のうちのいずれか1つのVH配列に由来するHVR-H3；(d)配列番号：28～30のうちのいずれか1つのVL配列に由来するHVR-L1；(e)配列番号：28～30のうちのいずれか1つのVL配列に由来するHVR-L2；および(f)配列番号：28～30のうちのいずれか1つのVL配列に由来するHVR-L3を含む、抗体である。さらなる態様において、本発明の多重特異性抗体は、第1の可変領域が(a)配列番号：101、102のうちのいずれか1つのVH配列に由来するHVR-H1；(b)配列番号：101、102のうちのいずれか1つのVH配列に由来するHVR-H2；(c)配列番号：101、102のうちのいずれか1つのVH配列に由来するHVR-H3；(d)配列番号：98～100、105のうちのいずれか1つのVL配列に由来するHVR-L1；(e)配列番号：98～100、105のうちのいずれか1つのVL配列に由来するHVR-L2；および(f)配列番号：98～100、105のうちのいずれか1つのVL配列に由来するHVR-L3を含み、かつ第2の可変領域が(a)配列番号：103、104のうちのいずれか1つのVH配列に由来するHVR-H1；(b)配列番号：103、104のうちのいずれか1つのVH配列に由来するHVR-H2；(c)配列番号：103、104のうちのいずれか1つのVH配列に由来するHVR-H3；(d)配列番号：98～100、105のうちのいずれか1つのVL配列に由来するHVR-L1；(e)配列番号：98～100、105のうちのいずれか1つのVL配列に由来するHVR-L2；および(f)配列番号：98～100、105のうちのいずれか1つのVL配列に由来するHVR-L3を含む、抗体である。
一態様において、本発明の多重特異性抗体は、第1の可変領域が配列番号：7のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号：15のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸が以下のHVRの位置：(a)HVR-H1（配列番号：31）において：位置1；(b)HVR-H2（配列番号：34）において：位置3、5、8、9、11、および12；(c)HVR-H3（配列番号：38）において：位置2、4、5、7、および13；(d)HVR-L1（配列番号：52）において：位置1、4、5、6、7、8、9、10、および11；(e)HVR-L2（配列番号：56）において：位置1、2、4、5、6、および7；ならびに(f)HVR-L3（配列番号：60）において：位置1、3、4、5、6、7、および8のところで置換されており、かつ第2の可変領域が配列番号：23のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号：27のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸が以下のHVRの位置：(a)HVR-H1（配列番号：32）において：位置1、2、および4；(b)HVR-H2（配列番号：37）において：位置9；(c)HVR-H3（配列番号：43）において：位置2および9；(d)HVR-L1（配列番号：55）において：位置1、4、5、6、7、8、9、10、および11；(e)HVR-L2（配列番号：59）において：位置1、2、4、5、6、および7；ならびに(f)HVR-L3（配列番号：62）において：位置1、3、4、5、6、7、および8のところで置換されている、抗体である。さらなる態様において、本発明の多重特異性抗体は、第1の可変領域が配列番号：7のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号：15のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸が以下のHVRの位置：(a)HVR-H2（配列番号：34）において：位置5および8；(b)HVR-H3（配列番号：38）において：位置2、5、7、および13；(c)HVR-L1（配列番号：52）において：位置4および7；(d)HVR-L2（配列番号：56）において：位置1および2；ならびに(e)HVR-L3（配列番号：60）において：位置1のところで置換されており、かつ第2の可変領域が配列番号：23のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号：27のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸が以下のHVRの位置：(a)HVR-H1（配列番号：32）において：位置1および2；(b)HVR-H3（配列番号：43）において：位置2；ならびに(c)HVR-L3（配列番号：62）において：位置4および7のところで置換されている、抗体である。さらなる態様において、本発明の多重特異性抗体は、第1の可変領域が配列番号：7のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号：15のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸が以下のHVRの位置：(a)HVR-H1（配列番号：31）において：位置1；(b)HVR-H2（配列番号：34）において：位置3、5、8、9、11、および12；(c)HVR-H3（配列番号：38）において：位置2、4、および5；(d)HVR-L1（配列番号：52）において：位置4、5、7、8、9、および11；ならびに(e)HVR-L2（配列番号：56）において：位置1、2、4、5、および6のところで置換されており、かつ第2の可変領域が配列番号：23のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号：27のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸が以下のHVRの位置：(a)HVR-H1（配列番号：32）において：位置1および4；(b)HVR-H2（配列番号：37）において：位置9；(c)HVR-H3（配列番号：43）において：位置9；(d)HVR-L1（配列番号：55）において：位置1、4、5、6、7、8、9、および10；(e)HVR-L2（配列番号：59）において：位置5、6、および7；ならびに(f)HVR-L3（配列番号：62）において：位置3、4、5、6、および8のところで置換されている、抗体である。
一態様において、本発明の多重特異性抗体は、第1の可変領域が配列番号：7のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号：15のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、以下のいずれか1つまたは複数の置換：(a)HVR-H1（配列番号：31）において：D1S；(b)HVR-H2（配列番号：34）において：N3M；N5H；G8HまたはR；A9Y；Y11L；N12K；(c)HVR-H3（配列番号：38）において：G2HまたはE；D4S；D5HまたはE；Y7H；D13H；(d)HVR-L1（配列番号：52）において：R1K；Q4HまたはE；D5G；I6V；S7H；N8TまたはD；Y9A；L10V；N11A；(e)HVR-L2（配列番号：56）において：Y1HまたはW；T2HまたはA；R4T；L5R；L6WまたはE；S7T；および(f)HVR-L3（配列番号：60）において：Q1H；G3Y；D4SまたはH；T5D；L6Y；P7H；Y8Wが、任意の組み合わせで行われてもよく、かつ第2の可変領域が配列番号：23のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号：27のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、以下のいずれか1つまたは複数の置換：(a)HVR-H1（配列番号：32）において：D1H；T2H；Q4M；(b)HVR-H2（配列番号：37）において：T9H；(c)HVR-H3（配列番号：43）において：D2H；F9Y；(d)HVR-L1（配列番号：55）において：K1R；Q4HまたはE；D5G；V6I；H7S；T8NまたはD；A9Y；V10L；A11N；(e)HVR-L2（配列番号：59）において：W1HまたはY；A2HまたはT；T4R；R5L；W6LまたはE；T7S；および(f)HVR-L3（配列番号：62）において：Q1H；Y3G；S4DまたはH；D5T；Y6L；P7H；W8Yが、任意の組み合わせで行われてもよい、抗体である。さらなる態様において、本発明の多重特異性抗体は、第1の可変領域が配列番号：7のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号：15のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、以下のいずれか1つまたは複数の置換：(a)HVR-H2（配列番号：34）において：N5H；G8H；(c)HVR-H3（配列番号：38）において：G2H；D5H；Y7H；D13H；(d)HVR-L1（配列番号：52）において：Q4H；S7H；(e)HVR-L2（配列番号：56）において：Y1H；T2H；および(f)HVR-L3（配列番号：60）において：Q1Hが、任意の組み合わせで行われてもよく、かつ第2の可変領域が配列番号：23のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号：27のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、以下のいずれか1つまたは複数の置換：(a)HVR-H1（配列番号：32）において：D1H；T2H；(b)HVR-H3（配列番号：43）において：D2H；および(c)HVR-L3（配列番号：62）において：S4H；P7Hが、任意の組み合わせで行われてもよい、抗体である。さらなる態様において、本発明の多重特異性抗体は、第1の可変領域が配列番号：7のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号：15のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、以下のいずれか1つまたは複数の置換：(a)HVR-H1（配列番号：31）において：D1S；(b)HVR-H2（配列番号：34）において：N3M；N5H；G8R；A9Y；Y11L；N12K；(c)HVR-H3（配列番号：38）において：G2E；D4S；D5E；(d)HVR-L1（配列番号：52）において：Q4E；D5G；S7H；N8TまたはD；Y9A；N11A；および(e)HVR-L2（配列番号：56）において：Y1W；T2A；R4T；L5R；L6WまたはEが、任意の組み合わせで行われてもよく、かつ第2の可変領域が配列番号：23のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号：27のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、以下のいずれか1つまたは複数の置換：(a)HVR-H1（配列番号：32）において：D1H；Q4M；(b)HVR-H2（配列番号：37）において：T9H；(c)HVR-H3（配列番号：43）において：F9Y；(d)HVR-L1（配列番号：55）において：K1R；Q4E；D5G；V6I；H7S；T8D；A9Y；V10L；(e)HVR-L2（配列番号：59）において：R5L；W6LまたはE；T7S；および(f)HVR-L3（配列番号：62）において：Y3G；S4D；D5T；Y6L；W8Yが、任意の組み合わせで行われてもよい、抗体である。
一態様において、本発明の多重特異性抗体は、第1の可変領域が、それぞれ配列番号：7～14、101、102のうちのいずれか1つおよび配列番号：15～22、98～100、105のうちのいずれか1つ中のVH配列およびVL配列を含み、かつ第2の可変領域が、それぞれ配列番号：23～26、103、104のうちのいずれか1つおよび配列番号：27～30、98～100、105のうちのいずれか1つ中のVH配列およびVL配列を含む、抗体である。さらなる態様において、本発明の多重特異性抗体は、第1の可変領域が、それぞれ配列番号：7～14のうちのいずれか1つおよび配列番号：15～22のうちのいずれか1つ中のVH配列およびVL配列を含み、かつ第2の可変領域が、それぞれ配列番号：23～26のうちのいずれか1つおよび配列番号：27～30のうちのいずれか1つ中のVH配列およびVL配列を含む、抗体である。さらなる態様において、本発明の多重特異性抗体は、第1の可変領域が、それぞれ配列番号：101、102のうちのいずれか1つおよび配列番号：98～100、105のうちのいずれか1つ中のVH配列およびVL配列を含み、かつ第2の可変領域が、それぞれ配列番号：103、104のうちのいずれか1つおよび配列番号：98～100、105のうちのいずれか1つ中のVH配列およびVL配列を含む、抗体である。
一態様において、本発明の多重特異性抗体は、第1の可変領域が、配列番号：7のVH配列および配列番号：15のVL配列を含む抗スクレロスチン抗体と同じエピトープに結合するかまたはスクレロスチンへの結合に関してそれと競合し、かつ第2の可変領域が、配列番号：23のVH配列および配列番号：27のVL配列を含む抗スクレロスチン抗体と同じエピトープに結合するかまたはスクレロスチンへの結合に関してそれと競合する、抗体である。
一局面において、本発明の多重特異性抗体は、少なくとも2種の異なる可変領域が共通軽鎖を含む、抗体である。共通軽鎖は、少なくとも2種の異なる重鎖の各々に結合することができ、したがって、少なくとも2種の異なる可変領域が形成される。いくつかの態様において、共通軽鎖は、mabAとmabBとで共有される。そのような軽鎖は、mabAの重鎖およびmabBの重鎖の両方に結合することができ、したがって、それぞれ、mabAおよびmabBのような2種の異なる可変領域が形成される。
mabAとmabBの共通の軽鎖
一態様において、本発明は、(a)配列番号：122のアミノ酸配列を含むHVR-L1；(b)配列番号：123のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および(c)配列番号：60のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択されるVL HVR配列を、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべて含む、共通軽鎖を提供する。別の態様において、共通軽鎖は、(a)配列番号：122のアミノ酸配列を含むHVR-L1；(b)配列番号：123のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および(c)配列番号：60のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む。ある特定の態様では、共通軽鎖は、(a)配列番号：109のアミノ酸配列を含むHVR-L1；(b)配列番号：112のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および(c)配列番号：60のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む。ある特定の態様では、共通軽鎖は、(a)配列番号：110のアミノ酸配列を含むHVR-L1；(b)配列番号：113のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および(c)配列番号：60のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む。ある特定の態様では、共通軽鎖は、(a)配列番号：110のアミノ酸配列を含むHVR-L1；(b)配列番号：114のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および(c)配列番号：60のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む。ある特定の態様では、共通軽鎖は、(a)配列番号：111のアミノ酸配列を含むHVR-L1；(b)配列番号：115のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および(c)配列番号：60のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む。一態様において、共通軽鎖は、(a)配列番号：98のVL配列に由来するHVR-L1；(b)配列番号：98のVL配列に由来するHVR-L2；および(c)配列番号：98のVL配列に由来するHVR-L3を含む。一態様において、共通軽鎖は、(a)配列番号：99のVL配列に由来するHVR-L1；(b)配列番号：99のVL配列に由来するHVR-L2；および(c)配列番号：99のVL配列に由来するHVR-L3を含む。一態様において、共通軽鎖は、(a)配列番号：100のVL配列に由来するHVR-L1；(b)配列番号：100のVL配列に由来するHVR-L2；および(c)配列番号：100のVL配列に由来するHVR-L3を含む。一態様において、共通軽鎖は、(a)配列番号：105のVL配列に由来するHVR-L1；(b)配列番号：105のVL配列に由来するHVR-L2；および(c)配列番号：105のVL配列に由来するHVR-L3を含む。
特定の態様において、上述の共通軽鎖の1つまたは複数のアミノ酸は、以下のHVRの位置のところで置換されている：(a)HVR-L1（配列番号：52）において：位置4、5、7、8、9、および11；ならびに(b)HVR-L2（配列番号：56）において：位置1、2、4、5、および6。一態様において、本発明の共通軽鎖は、配列番号：15のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸が以下のHVRの位置のところで置換されている：(a)HVR-L1（配列番号：52）において：位置4、5、7、8、9、および11；ならびに(b)HVR-L2（配列番号：56）において：位置1、2、4、5、および6。
特定の態様において、上述の共通軽鎖の1つまたは複数のアミノ酸は、以下のHVRの位置のところで置換されている：(a)HVR-L1（配列番号：55）において：位置1、4、5、6、7、8、9、および10；(b)HVR-L2（配列番号：59）において：位置5、6、および7；ならびに(c)HVR-L3（配列番号：62）において：位置3、4、5、6、および8。一態様において、本発明の共通軽鎖は、配列番号：27のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸が以下のHVRの位置のところで置換されている：(a)HVR-L1（配列番号：55）において：位置1、4、5、6、7、8、9、および10；(b)HVR-L2（配列番号：59）において：位置5、6、および7；ならびに(c)HVR-L3（配列番号：62）において：位置3、4、5、6、および8。
特定の態様において、共通軽鎖の1つまたは複数のアミノ酸置換は、本明細書で提供される保存的置換である。特定の態様において、以下のいずれか1つまたは複数の置換が、任意の組み合わせで行われてもよい：(a)HVR-L1（配列番号：52）において：Q4E；D5G；S7H；N8TまたはD；Y9A；N11A；および(b)HVR-L2（配列番号：56）において：Y1W；T2A；R4T；L5R；L6WまたはE。一態様において、本発明の共通軽鎖は、配列番号：15のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、以下のいずれか1つまたは複数の置換が、任意の組み合わせで行われてもよい：(a)HVR-L1（配列番号：52）において：Q4E；D5G；S7H；N8TまたはD；Y9A；N11A；および(b)HVR-L2（配列番号：56）において：Y1W；T2A；R4T；L5R；L6WまたはE。
特定の態様において、共通軽鎖の1つまたは複数のアミノ酸置換は、本明細書で提供される保存的置換である。特定の態様において、以下のいずれか1つまたは複数の置換が、任意の組み合わせで行われてもよい：(a)HVR-L1（配列番号：55）において：K1R；Q4E；D5G；V6I；H7S；T8D；A9Y；V10L；(b)HVR-L2（配列番号：59）において：R5L；W6LまたはE；T7S；および(c)HVR-L3（配列番号：62）において：Y3G；S4D；D5T；Y6L；W8Y。一態様において、本発明の共通軽鎖は、配列番号：27のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、以下のいずれか1つまたは複数の置換が、任意の組み合わせで行われてもよい：(a)HVR-L1（配列番号：55）において：K1R；Q4E；D5G；V6I；H7S；T8D；A9Y；V10L；(b)HVR-L2（配列番号：59）において：R5L；W6LまたはE；T7S；および(c)HVR-L3（配列番号：62）において：Y3G；S4D；D5T；Y6L；W8Y。
上述の置換の可能なすべての組み合わせは、HVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3について、それぞれ配列番号：122、123、および60のコンセンサス配列に包含される。
上述の態様の任意のものにおいて、共通軽鎖はヒト化されている。一態様において、共通軽鎖は、上述の態様の任意のものにおけるHVRを含み、かつさらに、アクセプターヒトフレームワーク（例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク）を含む。別の態様において、共通軽鎖は、上述の態様の任意のものにおけるHVRを含み、かつさらに、FR配列を含むVLを含む。さらなる態様において、共通軽鎖は、以下の軽鎖可変ドメインFR配列を含む：FR1は配列番号：65のアミノ酸配列を含み、FR2は配列番号：66のアミノ酸配列を含み、FR3は配列番号：67のアミノ酸配列を含み、FR4は配列番号：68のアミノ酸配列を含む。
別の局面において、配列番号：105のアミノ酸配列に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（VL）を含む共通軽鎖が提供される。特定の態様において、少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するVL配列は、参照配列に対して、置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含む。特定の態様において、合計1個から10個のアミノ酸が、配列番号：105において、置換、挿入、および／または欠失される。特定の態様において、置換、挿入、または欠失は、HVRの外側の領域（すなわち、FRの中）で生じる。任意で、共通軽鎖は、配列番号：105におけるVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。ある特定の態様では、VLは、(a)配列番号：111のアミノ酸配列を含むHVR-L1；(b)配列番号：115のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および(c)配列番号：60のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、1つ、2つ、または3つのHVRを含む。
ある特定の態様では、本発明の共通軽鎖は、配列番号：15または配列番号：27中のVL配列を含む軽鎖ではない。
一態様において、本発明の多重特異性抗体は、第1の可変領域が(a)配列番号：124のアミノ酸配列を含むHVR-H1；(b)配列番号：118のアミノ酸配列を含むHVR-H2；(c)配列番号：120のアミノ酸配列を含むHVR-H3；(d)配列番号：122のアミノ酸配列を含むHVR-L1；(e)配列番号：123のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および(f)配列番号：60のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含み、かつ第2の可変領域が(a)配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-H1；(b)配列番号：125のアミノ酸配列を含むHVR-H2；(c)配列番号：121のアミノ酸配列を含むHVR-H3；(d)配列番号：122のアミノ酸配列を含むHVR-L1；(e)配列番号：123のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および(f)配列番号：60のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含み、かつ第1の可変領域のVL配列と第2の可変領域のVL配列が同一である、抗体である。
一態様において、本発明の多重特異性抗体は、第1の可変領域が(a)配列番号：101または102のVH配列に由来するHVR-H1；(b)配列番号：101または102のVH配列に由来するHVR-H2；(c)配列番号：101または102のVH配列に由来するHVR-H3；(d)配列番号：98～100、105のうちのいずれか1つのVL配列に由来するHVR-L1；(e)配列番号：98～100、105のうちのいずれか1つのVL配列に由来するHVR-L2；および(f)配列番号：98～100、105のうちのいずれか1つのVL配列に由来するHVR-L3を含み、かつ第2の可変領域が(a)配列番号：103または104のVH配列に由来するHVR-H1；(b)配列番号：103または104のVH配列に由来するHVR-H2；(c)配列番号：103または104のVH配列に由来するHVR-H3；(d)配列番号：98～100、105のうちのいずれか1つのVL配列に由来するHVR-L1；(e)配列番号：98～100、105のうちのいずれか1つのVL配列に由来するHVR-L2；および(f)配列番号：98～100、105のうちのいずれか1つのVL配列に由来するHVR-L3を含み、かつ第1の可変領域のVL配列と第2の可変領域のVL配列が同一である、抗体である。
一態様において、本発明の多重特異性抗体は、第1の可変領域が配列番号：7のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号：15のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸が以下のHVRの位置：(a)HVR-H1（配列番号：31）において：位置1；(b)HVR-H2（配列番号：34）において：位置3、5、8、9、11、および12；(c)HVR-H3（配列番号：38）において：位置2、4、および5；(d)HVR-L1（配列番号：52）において：位置4、5、7、8、9、および11；ならびに(e)HVR-L2（配列番号：56）において：位置1、2、4、5、および6のところで置換されており、かつ第2の可変領域が配列番号：23のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号：27のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸が以下のHVRの位置：(a)HVR-H1（配列番号：32）において：位置1および4；(b)HVR-H2（配列番号：37）において：位置9；(c)HVR-H3（配列番号：43）において：位置9；(d)HVR-L1（配列番号：55）において：位置1、4、5、6、7、8、9、および10；(e)HVR-L2（配列番号：59）において：位置5、6、および7；ならびに(f)HVR-L3（配列番号：62）において：位置3、4、5、6、および8のところで置換されており、かつ第1の可変領域のVL配列と第2の可変領域のVL配列が同一である、抗体である。
一態様において、本発明の多重特異性抗体は、第1の可変領域が配列番号：7のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号：15のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、以下のいずれか1つまたは複数の置換：(a)HVR-H1（配列番号：31）において：D1S；(b)HVR-H2（配列番号：34）において：N3M、N5H、G8R、A9Y、Y11L、N12K；(c)HVR-H3（配列番号：38）において：G2E、D4S、D5E；(d)HVR-L1（配列番号：52）において：Q4E、D5G、S7H、N8TまたはD、Y9A、N11A；および(e)HVR-L2（配列番号：56）において：Y1W、T2A、R4T、L5R、L6WまたはEが、任意の組み合わせで行われてもよく、かつ第2の可変領域が配列番号：23のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号：27のアミノ酸配列を含むVLを含み、ここで、以下のいずれか1つまたは複数の置換：(a)HVR-H1（配列番号：32）において：D1H；Q4M；(b)HVR-H2（配列番号：37）において：T9H；(c)HVR-H3（配列番号：43）において：F9Y；(d)HVR-L1（配列番号：55）において：K1R、Q4E、D5G、V6I、H7S、T8D、A9Y、V10L；(e)HVR-L2（配列番号：59）において：R5L、W6LまたはE、T7S；および(f)HVR-L3（配列番号：62）において：Y3G、S4D、D5T、Y6L、W8Yが、任意の組み合わせで行われてもよく、かつ第1の可変領域のVL配列と第2の可変領域のVL配列が同一である、抗体である。
一態様において、本発明の多重特異性抗体は、第1の可変領域が、それぞれ配列番号：101または102および配列番号：98～100、105のうちのいずれか1つ中のVH配列およびVL配列を含み、かつ第2の可変領域が、それぞれ配列番号：103または104および配列番号：98～100、105のうちのいずれか1つ中のVH配列およびVL配列を含み、かつ第1の可変領域のVLと第2の可変領域のVLが同一である、抗体である。さらなる態様において、本発明の多重特異性抗体は、第1の可変領域が、それぞれ配列番号：101および配列番号：105中のVH配列およびVL配列を含み、かつ第2の可変領域が、それぞれ配列番号：103および配列番号：105中のVH配列およびVL配列を含む、抗体である。さらなる態様において、本発明の多重特異性抗体は、第1の可変領域が、それぞれ配列番号：101および配列番号：105中のVH配列およびVL配列を含み、かつ第2の可変領域が、それぞれ配列番号：104および配列番号：105中のVH配列およびVL配列を含む、抗体である。さらなる態様において、本発明の多重特異性抗体は、第1の可変領域が、それぞれ配列番号：102および配列番号：105中のVH配列およびVL配列を含み、かつ第2の可変領域が、それぞれ配列番号：103および配列番号：105中のVH配列およびVL配列を含む、抗体である。さらなる態様において、本発明の多重特異性抗体は、第1の可変領域が、それぞれ配列番号：102および配列番号：105中のVH配列およびVL配列を含み、かつ第2の可変領域が、それぞれ配列番号：104および配列番号：105中のVH配列およびVL配列を含む、抗体である。
本発明のさらなる局面において、上述の態様の任意のものによる抗スクレロスチン抗体は、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を含む、モノクローナル抗体である。一態様において、抗スクレロスチン抗体は、例えば、Fv、Fab、Fab’、scFv、ダイアボディ、またはF(ab’)2断片などの、抗体断片である。別の態様において、抗体は、例えば、完全IgG1抗体や、本明細書で定義された他の抗体クラスまたはアイソタイプの、全長抗体である。
さらなる局面において、上述の態様の任意のものによる抗スクレロスチン抗体は、単独または組み合わせで、以下の項目1～7に記載の任意の特徴を取り込んでもよい。
１．抗体のアフィニティ
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nMまたは≦0.001nM（例えば、10-8M以下、例えば10-8M～10-13M、例えば10-9M～10-13M）の解離定数 (Kd) を有する。
一態様において、Kdは、放射性標識抗原結合測定法 (radiolabeled antigen binding assay: RIA) によって測定される。一態様において、RIAは、目的の抗体のFabバージョンおよびその抗原を用いて実施される。例えば、抗原に対するFabの溶液中結合アフィニティは、非標識抗原の漸増量系列の存在下で最小濃度の (125I) 標識抗原によりFabを平衡化させ、次いで結合した抗原を抗Fab抗体でコーティングされたプレートにより捕捉することによって測定される。（例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999) を参照のこと）。測定条件を構築するために、MICROTITER（登録商標）マルチウェルプレート (Thermo Scientific) を50mM炭酸ナトリウム (pH9.6) 中5μg/mlの捕捉用抗Fab抗体 (Cappel Labs) で一晩コーティングし、その後に室温（およそ23℃）で2～5時間、PBS中2％ (w/v) ウシ血清アルブミンでブロックする。非吸着プレート (Nunc #269620) において、100 pMまたは26 pMの [125I]-抗原を、（例えば、Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997) における抗VEGF抗体、Fab-12の評価と同じように）目的のFabの段階希釈物と混合する。次いで、目的のFabを一晩インキュベートするが、このインキュベーションは、平衡が確実に達成されるよう、より長時間（例えば、約65時間）継続され得る。その後、混合物を、室温でのインキュベーション（例えば、1時間）のために捕捉プレートに移す。次いで溶液を除去し、プレートをPBS中0.1％のポリソルベート20（TWEEN-20（登録商標））で8回洗浄する。プレートが乾燥したら、150μl/ウェルのシンチラント（MICROSCINT-20（商標）、Packard）を添加し、TOPCOUNT（商標）ガンマカウンター (Packard) においてプレートを10分間カウントする。最大結合の20％以下を与える各Fabの濃度を、競合結合アッセイにおいて使用するために選択する。
別の態様によれば、Kdは、BIACORE（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定される。例えば、BIACORE（登録商標）-2000またはBIACORE（登録商標）-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) を用いる測定法が、およそ10反応単位 (response unit: RU) の抗原が固定されたCM5チップを用いて25℃で実施される。一態様において、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ (CM5、BIACORE, Inc.) は、供給元の指示にしたがいN-エチル-N’- (3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミドヒドロクロリド (EDC) およびN-ヒドロキシスクシンイミド (NHS) を用いて活性化される。抗原は、およそ10反応単位 (RU) のタンパク質の結合を達成するよう、5μl/分の流速で注入される前に、10mM酢酸ナトリウム、pH4.8を用いて5μg/ml（およそ0.2μM）に希釈される。抗原の注入後、未反応基をブロックするために1Mエタノールアミンが注入される。キネティクスの測定のために、25℃、およそ25μl/分の流速で、0.05％ポリソルベート20（TWEEN-20（商標））界面活性剤含有PBS (PBST) 中のFabの2倍段階希釈物 (0.78nM～500nM) が注入される。結合速度 (kon) および解離速度 (koff) は、単純な1対1ラングミュア結合モデル（BIACORE（登録商標）評価ソフトウェアバージョン3.2）を用いて、結合および解離のセンサーグラムを同時にフィッティングすることによって計算される。平衡解離定数 (Kd) は、koff/kon比として計算される。例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999) を参照のこと。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによってオン速度が106M-1s-1を超える場合、オン速度は、分光計（例えばストップフロー式分光光度計 (Aviv Instruments) または撹拌キュベットを用いる8000シリーズのSLM-AMINCO（商標）分光光度計 (ThermoSpectronic)）において測定される、漸増濃度の抗原の存在下でのPBS、pH7.2中20nMの抗抗原抗体（Fab形態）の25℃での蛍光発光強度（励起=295nm；発光=340nm、バンドパス16nm）の増加または減少を測定する蛍光消光技術を用いることによって決定され得る。
２．抗体断片
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片は、これらに限定されるものではないが、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv、および scFv断片、ならびに、後述する他の断片を含む。特定の抗体断片についての総説として、Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003) を参照のこと。scFv断片の総説として、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp.269-315 (1994)；加えて、WO93/16185；ならびに米国特許第5,571,894号および第5,587,458号を参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含みインビボ (in vivo) における半減期の長くなったFabおよびF(ab')2断片についての論説として、米国特許第5,869,046号を参照のこと。
ダイアボディは、二価または二重特異的であってよい、抗原結合部位を2つ伴う抗体断片である。例えば、EP404,097号; WO1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) 参照。トリアボディ (triabody) やテトラボディ (tetrabody) も、Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003) に記載されている。
シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分、または軽鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分を含む、抗体断片である。特定の態様において、シングルドメイン抗体は、ヒトシングルドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第6,248,516号B1参照）。
抗体断片は、これらに限定されるものではないが、本明細書に記載の、完全抗体のタンパク質分解的消化、組み換え宿主細胞（例えば、大腸菌 (E. coli) またはファージ）による産生を含む、種々の手法により作ることができる。
３．キメラおよびヒト化抗体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体が、例えば、米国特許第4,816,567号；および、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984) に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域）およびヒト定常領域を含む。さらなる例において、キメラ抗体は、親抗体のものからクラスまたはサブクラスが変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片も含む。
特定の態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性およびアフィニティを維持したままでヒトへの免疫原性を減少させるために、ヒト化される。通常、ヒト化抗体は1つまたは複数の可変ドメインを含み、当該可変ドメイン中、HVR（例えばCDR（またはその部分））は非ヒト抗体に由来し、FR（またはその部分）はヒト抗体配列に由来する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部分を含む。いくつかの態様において、ヒト化抗体中のいくつかのFR残基は、例えば、抗体の特異性またはアフィニティを回復または改善するために、非ヒト抗体（例えば、HVR残基の由来となった抗体）からの対応する残基で置換されている。
ヒト化抗体およびその作製方法は、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)において総説されており、また、例えば、Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)； Queen et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)； 米国特許第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号、および第7,087,409号；Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)（特異性決定領域 (specificity determining region: SDR) グラフティングを記載）；Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) （リサーフェイシングを記載）； Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) （FRシャッフリングを記載）；ならびに、Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) およびKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) （FRシャッフリングのための「ガイドセレクション」アプローチを記載） において、さらに記載されている。
ヒト化に使われ得るヒトフレームワーク領域は、これらに限定されるものではないが：「ベストフィット」法（Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993) 参照）を用いて選択されたフレームワーク領域；軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992) および Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993) 参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) 参照）；および、FRライブラリのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) および Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996) 参照）を含む。
４．ヒト抗体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野において知られる種々の手法によって製造され得る。ヒト抗体は、van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) および Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008) に、概説されている。
ヒト抗体は、抗原チャレンジ（負荷）に応答して完全ヒト抗体またはヒト可変領域を伴う完全抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物へ免疫原を投与することにより、調製されてもよい。そのような動物は、典型的にはヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部もしくは一部分を含み、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部もしくは一部分は、内因性の免疫グロブリン遺伝子座を置き換えるか、または、染色体外にもしくは当該動物の染色体内にランダムに取り込まれた状態で存在する。そのようなトランスジェニックマウスにおいて、内因性の免疫グロブリン遺伝子座は、通常不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得る方法の総説として、Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005) を参照のこと。また、例えば、XENOMOUSE（商標）技術を記載した米国特許第6,075,181号および第6,150,584号；HUMAB（登録商標）技術を記載した米国特許第5,770,429号；K-M MOUSE（登録商標）技術を記載した米国特許第7,041,870号；ならびに、VELOCIMOUSE（登録商標）技術を記載した米国特許出願公開第2007/0061900号を、併せて参照のこと。このような動物によって生成された完全抗体からのヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせるなどして、さらに修飾されてもよい。
ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づいた方法でも作ることができる。ヒトモノクローナル抗体の製造のための、ヒトミエローマおよびマウス‐ヒトヘテロミエローマ細胞株は、既に記述されている。（例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984)；Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；およびBoerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991) 参照。）ヒトB細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体も、Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) に述べられている。追加的な方法としては、例えば、米国特許第7,189,826号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトIgM抗体の製造を記載）、および、Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)（ヒト－ヒトハイブリドーマを記載）に記載されたものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）も、Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) およびVollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)に記載されている。
ヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリから選択されたFvクローン可変ドメイン配列を単離することでも生成できる。このような可変ドメイン配列は、次に所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。抗体ライブラリからヒト抗体を選択する手法を、以下に述べる。
５．ライブラリ由来抗体
本発明の抗体は、所望の1つまたは複数の活性を伴う抗体についてコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって単離してもよい。例えば、ファージディスプレイライブラリの生成や、所望の結合特性を備える抗体についてそのようなライブラリをスクリーニングするための、様々な方法が当該技術分野において知られている。そのような方法は、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) において総説されており、さらに例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554；Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991)； Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)； Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)； Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)； Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)； Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；およびLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004) に記載されている。
特定のファージディスプレイ法において、VHおよびVL遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応 (polymerase chain reaction: PCR) により別々にクローニングされ、無作為にファージライブラリ中で再結合され、当該ファージライブラリは、Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994) に述べられているようにして、抗原結合ファージについてスクリーニングされ得る。ファージは、典型的には、単鎖Fv (scFv) 断片としてまたはFab断片としてのいずれかで、抗体断片を提示する。免疫化された供給源からのライブラリは、ハイブリドーマを構築することを要さずに、免疫源に対する高アフィニティ抗体を提供する。あるいは、Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993) に記載されるように、ナイーブレパートリーを（例えば、ヒトから）クローニングして、免疫化することなしに、広範な非自己および自己抗原への抗体の単一の供給源を提供することもできる。最後に、ナイーブライブラリは、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992) に記載されるように、幹細胞から再編成前のV-遺伝子セグメントをクローニングし、超可変CDR3領域をコードしかつインビトロ (in vitro) で再構成を達成するための無作為配列を含んだPCRプライマーを用いることにより、合成的に作ることもできる。ヒト抗体ファージライブラリを記載した特許文献は、例えば：米国特許第5,750,373号、ならびに、米国特許出願公開第2005/0079574号、2005/0119455号、第2005/0266000号、第2007/0117126号、第2007/0160598号、第2007/0237764号、第2007/0292936号、および第2009/0002360号を含む。
ヒト抗体ライブラリから単離された抗体または抗体断片は、本明細書ではヒト抗体またはヒト抗体断片と見なす。
６．多重特異性抗体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に結合特異性を有する、モノクローナル抗体である。特定の態様において、結合特異性の1つは、スクレロスチンに対するものであり、もう1つは他の任意の抗原へのものである。特定の態様において、二重特異性抗体は、スクレロスチンの異なった2つのエピトープに結合してもよい。二重特異性抗体は、スクレロスチンを発現する細胞に細胞傷害剤を局在化するために使用されてもよい。二重特異性抗体は、全長抗体としてまたは抗体断片として調製され得る。
多重特異性抗体を作製するための手法は、これらに限定されるものではないが、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖ペアの組み換え共発現（Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)、WO93/08829、およびTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991) 参照）、およびknob-in-hole技術（例えば、米国特許第5,731,168号参照）を含む。多重特異性抗体は、Fcヘテロ二量体分子を作製するために静電ステアリング効果 (electrostatic steering effects) を操作すること (WO2009/089004A1)；2つ以上の抗体または断片を架橋すること（米国特許第4,676,980号およびBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)参照）；ロイシンジッパーを用いて2つの特異性を有する抗体を作成すること（Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) 参照）；「ダイアボディ」技術を用いて二重特異性抗体断片を作製すること（Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) 参照）；および、単鎖Fv (scFv) 二量体を用いること（Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994) 参照）；および、例えばTutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991) に記載されるように三重特異性抗体を調製すること、によって作製してもよい。
「オクトパス抗体」を含む、3つ以上の機能的抗原結合部位を伴う改変抗体も、本明細書では含まれる（例えば、米国特許出願公開第2006/0025576号A1参照）。
本明細書で抗体または断片は、スクレロスチンと別の異なる抗原とに結合する1つの抗原結合部位を含む、「デュアルアクティングFab」または「DAF」も含む（例えば、米国特許出願公開第2008/0069820号参照）。
７．抗体変異体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体も、考慮の内である。例えば、抗体の結合アフィニティおよび／または他の生物学的特性を改善することが、望ましいこともある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入すること、または、ペプチド合成によって、調製されてもよい。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列からの欠失、および／または抗体のアミノ酸配列中への挿入、および／または抗体のアミノ酸配列中の残基の置換を含む。最終構築物が所望の特徴（例えば、抗原結合性）を備えることを前提に、欠失、挿入、および置換の任意の組合せが、最終構築物に至るために行われ得る。
ａ）置換、挿入、および欠失変異体
特定の態様において、1つまたは複数のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換的変異導入の目的部位は、HVRおよびFRを含む。保存的置換を、表１の「好ましい置換」の見出しの下に示す。より実質的な変更を、表１の「例示的な置換」の見出しの下に提供するとともに、アミノ酸側鎖のクラスに言及しつつ下で詳述する。アミノ酸置換は目的の抗体に導入されてもよく、産物は、例えば、保持／改善された抗原結合性、減少した免疫原性、または改善したADCCまたはCDCなどの、所望の活性についてスクリーニングされてもよい。
（表１）
Figure 0007493018000001
アミノ酸は、共通の側鎖特性によって群に分けることができる：
(1) 疎水性：ノルロイシン、メチオニン (Met)、アラニン (Ala)、バリン (Val)、ロイシン (Leu)、イソロイシン (Ile)；
(2) 中性の親水性：システイン (Cys)、セリン (Ser)、トレオニン (Thr)、アスパラギン (Asn)、グルタミン (Gln)；
(3) 酸性：アスパラギン酸 (Asp)、グルタミン酸 (Glu)；
(4) 塩基性：ヒスチジン (His)、リジン (Lys)、アルギニン (Arg)；
(5) 鎖配向に影響する残基：グリシン (Gly)、プロリン (Pro)；
(6) 芳香族性：トリプトファン (Trp)、チロシン (Tyr)、フェニルアラニン (Phe)。
非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーを、別のクラスのものに交換することをいう。
置換変異体の1つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の1つまたは複数の超可変領域残基の置換を含む。通常、その結果として生じ、さらなる研究のために選ばれた変異体は、親抗体と比較して特定の生物学的特性における修飾（例えば、改善）（例えば、増加したアフィニティ、減少した免疫原性）を有する、および／または親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。例示的な置換変異体は、アフィニティ成熟抗体であり、これは、例えばファージディスプレイベースのアフィニティ成熟技術（例えば本明細書に記載されるもの）を用いて適宜作製され得る。簡潔に説明すると、1つまたは複数のHVR残基を変異させ、そして変異抗体をファージ上に提示させ、特定の生物学的活性（例えば、結合アフィニティ）に関してスクリーニングを行う。
改変（例えば、置換）は、例えば抗体のアフィニティを改善するために、HVRにおいて行われ得る。そのような改変は、HVRの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセスの間に高頻度で変異が起こるコドンによってコードされる残基（例えば、Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008) を参照のこと）および／または抗原に接触する残基において行われ得、得られた変異VHまたはVLが結合アフィニティに関して試験され得る。二次ライブラリからの構築および再選択によるアフィニティ成熟が、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)) に記載されている。アフィニティ成熟のいくつかの態様において、多様性は、任意の様々な方法（例えば、エラープローンPCR、チェーンシャッフリングまたはオリゴヌクレオチド指向変異導入）によって成熟のために選択された可変遺伝子に導入される。次いで、二次ライブラリが作製される。次いで、このライブラリは、所望のアフィニティを有する任意の抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入する別の方法は、いくつかのHVR残基（例えば、一度に4～6残基）を無作為化するHVR指向アプローチを含む。抗原結合に関与するHVR残基は、例えばアラニンスキャニング変異導入またはモデリングを用いて、具体的に特定され得る。特に、CDR-H3およびCDR-L3がしばしば標的化される。
特定の態様において、置換、挿入、または欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に減少させない限り、1つまたは複数のHVR内で行われ得る。例えば、結合アフィニティを実質的に減少させない保存的改変（例えば、本明細書で提供されるような保存的置換）が、HVRにおいて行われ得る。そのような改変は、例えば、HVRの抗原接触残基の外側であり得る。上記の変異VHおよびVL配列の特定の態様において、各HVRは改変されていないか、わずか1つ、2つ、もしくは3つのアミノ酸置換を含む。
変異導入のために標的化され得る抗体の残基または領域を同定するのに有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085によって記載される、「アラニンスキャニング変異導入」と呼ばれるものである。この方法において、一残基または一群の標的残基（例えば、荷電残基、例えばアルギニン、アスパラギン酸、ヒスチジン、リジン、およびグルタミン酸）が同定され、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンもしくはポリアラニン）で置き換えられ、抗体と抗原の相互作用が影響を受けるかどうかが決定される。この初期置換に対して機能的感受性を示したアミノ酸位置に、さらなる置換が導入され得る。あるいはまたは加えて、抗体と抗原の間の接触点を同定するために、抗原抗体複合体の結晶構造を解析してもよい。そのような接触残基および近隣の残基を、置換候補として標的化してもよく、または置換候補から除外してもよい。変異体は、それらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
アミノ酸配列の挿入は、配列内部への単一または複数のアミノ酸残基の挿入と同様、アミノ末端および／またはカルボキシル末端における1残基から100残基以上を含むポリペプチドの長さの範囲での融合も含む。末端の挿入の例は、N末端にメチオニル残基を伴う抗体を含む。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体のN-またはC-末端に、酵素（例えば、ADEPTのための）または抗体の血漿半減期を増加させるポリペプチドを融合させたものを含む。
ｂ）グリコシル化変異体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加させるまたは減少させるように改変されている。抗体へのグリコシル化部位の追加または削除は、1つまたは複数のグリコシル化部位を作り出すまたは取り除くようにアミノ酸配列を改変することにより、簡便に達成可能である。
抗体がFc領域を含む場合、そこに付加される炭水化物が改変されてもよい。哺乳動物細胞によって産生される天然型抗体は、典型的には、枝分かれした二分岐のオリゴ糖を含み、当該オリゴ糖は通常Fc領域のCH2ドメインのAsn297にN-リンケージによって付加されている。例えば、Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997) 参照。オリゴ糖は、例えば、マンノース、N‐アセチルグルコサミン (GlcNAc)、ガラクトース、およびシアル酸などの種々の炭水化物、また、二分岐のオリゴ糖構造の「幹」中のGlcNAcに付加されたフコースを含む。いくつかの態様において、本発明の抗体中のオリゴ糖の修飾は、特定の改善された特性を伴う抗体変異体を作り出すために行われてもよい。
一態様において、Fc領域に（直接的または間接的に）付加されたフコースを欠く炭水化物構造体を有する抗体変異体が提供される。例えば、そのような抗体におけるフコースの量は、1％～80％、1％～65％、5％～65％または20％～40％であり得る。フコースの量は、例えばWO2008/077546に記載されるようにMALDI-TOF質量分析によって測定される、Asn297に付加されたすべての糖構造体（例えば、複合、ハイブリッド、および高マンノース構造体）の和に対する、Asn297における糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Asn297は、Fc領域の297位のあたりに位置するアスパラギン残基を表す（Fc領域残基のEUナンバリング）。しかし、複数の抗体間のわずかな配列の多様性に起因して、Asn297は、297位の±3アミノ酸上流または下流、すなわち294位～300位の間に位置することもあり得る。そのようなフコシル化変異体は、改善されたADCC機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第2003/0157108号 (Presta, L.) ；第2004/0093621号 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd) を参照のこと。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体変異体に関する刊行物の例は、US2003/0157108; WO2000/61739; WO2001/29246; US2003/0115614; US2002/0164328; US2004/0093621; US2004/0132140; US2004/0110704; US2004/0110282; US2004/0109865; WO2003/085119; WO2003/084570; WO2005/035586; WO2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004) を含む。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例は、タンパク質のフコシル化を欠くLec13 CHO細胞（Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許出願公開第US2003/0157108号A1、Presta, L；およびWO2004/056312A1、Adams et al.、特に実施例11）およびノックアウト細胞株、例えばアルファ-1,6-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子FUT8ノックアウトCHO細胞（例えば、Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)；Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；およびWO2003/085107を参照のこと）を含む。
例えば抗体のFc領域に付加された二分枝型オリゴ糖がGlcNAcによって二分されている、二分されたオリゴ糖を有する抗体変異体がさらに提供される。そのような抗体変異体は、減少したフコシル化および／または改善されたADCC機能を有し得る。そのような抗体変異体の例は、例えば、WO2003/011878 (Jean-Mairet et al.) ；米国特許第6,602,684号 (Umana et al.)；およびUS2005/0123546 (Umana et al.) に記載されている。Fc領域に付加されたオリゴ糖中に少なくとも1つのガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。そのような抗体変異体は、改善されたCDC機能を有し得る。そのような抗体変異体は、例えば、WO1997/30087 (Patel et al.)；WO1998/58964 (Raju, S.)； およびWO1999/22764 (Raju, S.) に記載されている。
ｃ）Fc領域変異体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体のFc領域に1つまたは複数のアミノ酸修飾を導入して、それによりFc領域変異体を生成してもよい。Fc領域変異体は、1つまたは複数のアミノ酸位置のところでアミノ酸修飾（例えば、置換）を含む、ヒトFc領域配列（例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のFc領域）を含んでもよい。
特定の態様において、すべてではないがいくつかのエフェクター機能を備える抗体変異体も、本発明の考慮の内であり、当該エフェクター機能は、抗体を、そのインビボでの半減期が重要であるが、特定のエフェクター機能（補体およびADCCなど）は不要または有害である場合の適用に望ましい候補とするものである。CDCおよび／またはADCC活性の減少／欠乏を確認するために、インビトロ および／またはインビボ の細胞傷害測定を行うことができる。例えば、Fc受容体（FcR）結合測定は、抗体がFcγR結合性を欠く（よってADCC活性を欠く蓋然性が高い）一方でFcRn結合能を維持することを確かめるために行われ得る。ADCCを媒介するプライマリ細胞であるNK細胞はFcγRIIIのみを発現するが、一方単球はFcγRI、FcγRII、FcγRIIIを発現する。造血細胞上のFcRの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991) の第464頁のTable 3にまとめられている。目的の分子のADCC活性を評価するためのインビトロ測定法（アッセイ）の非限定的な例は、米国特許第5,500,362号（例えば、 Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) 参照）および Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；米国特許第5,821,337号（Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987) 参照）に記載されている。あるいは、非放射性の測定法を用いてもよい（例えば、ACT1（商標）non-radioactive cytotoxicity assay for flow cytometry (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)；および、CytoTox 96（登録商標）non-radioactive cytotoxicity assays 法 (Promega, Madison, WI) 参照）。このような測定法に有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞 (peripheral blood mononuclear cell: PBMC) およびナチュラルキラー (natural killer: NK) 細胞を含む。あるいはまたは加えて、目的の分子のADCC活性は、例えば、Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998) に記載されるような動物モデルにおいて、インビボで評価されてもよい。また、抗体がC1qに結合できないこと、よってCDC活性を欠くことを確認するために、C1q結合測定を行ってもよい。例えば、WO2006/029879 および WO2005/100402のC1qおよびC3c結合ELISAを参照のこと。また、補体活性化を評価するために、CDC測定を行ってもよい（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)；およびCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004) 参照）。さらに、FcRn結合性およびインビボでのクリアランス／半減期の決定も、当該技術分野において知られた方法を用いて行い得る（例えばPetkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006) 参照）。
減少したエフェクター機能を伴う抗体は、Fc領域残基238、265、269、270、297、327、および329の1つまたは複数の置換を伴うものを含む（米国特許第6,737,056号）。このようなFc変異体は、残基265および297のアラニンへの置換を伴ういわゆる「DANA」Fc変異体（米国特許第7,332,581号）を含む、アミノ酸位置265、269、270、297、および327の2つ以上の置換を伴うFc変異体を含む。
FcRsへの増加または減少した結合性を伴う特定の抗体変異体が、記述されている。（米国特許第6,737,056号；WO2004/056312、およびShields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) を参照のこと。）
特定の態様において、抗体変異体は、ADCCを改善する1つまたは複数のアミノ酸置換（例えば、Fc領域の位置298、333、および／または334（EUナンバリングでの残基）のところでの置換）を伴うFc領域を含む。
いくつかの態様において、例えば米国特許第6,194,551号、WO99/51642、およびIdusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000) に記載されるように、改変された（つまり、増加したか減少したかのいずれかである）C1q結合性および／または補体依存性細胞傷害 (CDC) をもたらす改変が、Fc領域においてなされる。
増加した半減期、および新生児型Fc受容体（FcRn：母体のIgG類を胎児に移行させる役割を負う（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)））に対する増加した結合性を伴う抗体が、米国特許出願公開第2005/0014934号A1(Hinton et al.) に記載されている。これらの抗体は、Fc領域のFcRnへの結合性を増加する1つまたは複数の置換をその中に伴うFc領域を含む。このようなFc変異体は、Fc領域残基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、または434の1つまたは複数のところでの置換（例えば、Fc領域残基434の置換（米国特許第7,371,826号））を伴うものを含む。
Fc領域変異体の他の例については、Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第5,648,260号；米国特許第5,624,821号；およびWO94/29351も参照のこと。
ｄ）システイン改変抗体変異体
特定の態様において、抗体の1つまたは複数の残基がシステイン残基で置換された、システイン改変抗体（例えば、「thioMAbs」）を作り出すことが望ましいだろう。特定の態様において、置換を受ける残基は、抗体の、アクセス可能な部位に生じる。それらの残基をシステインで置換することによって、反応性のチオール基が抗体のアクセス可能な部位に配置され、当該反応性のチオール基は、当該抗体を他の部分（薬剤部分またはリンカー‐薬剤部分など）にコンジュゲートして本明細書でさらに詳述するようにイムノコンジュゲートを作り出すのに使用されてもよい。特定の態様において、以下の残基の任意の1つまたは複数が、システインに置換されてよい：軽鎖のV205（Kabatナンバリング）；重鎖のA118（EUナンバリング）；および重鎖Fc領域のS400（EUナンバリング）。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第7,521,541号に記載されるようにして生成されてもよい。
ｅ）抗体誘導体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、当該技術分野において知られておりかつ容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含むように、さらに修飾されてもよい。抗体の誘導体化に好適な部分は、これに限定されるものではないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、これらに限定されるものではないが、ポリエチレングリコール (PEG)、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ１,3ジオキソラン、ポリ1,3,6,トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれでも）、および、デキストランまたはポリ（n-ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール類（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、および、これらの混合物を含む。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、その水に対する安定性のために、製造において有利であるだろう。ポリマーは、いかなる分子量でもよく、枝分かれしていてもしていなくてもよい。抗体に付加されるポリマーの数には幅があってよく、1つ以上のポリマーが付加されるならそれらは同じ分子であってもよいし、異なる分子であってもよい。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数および／またはタイプは、これらに限定されるものではないが、改善されるべき抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が規定の条件下での療法に使用されるか否か、などへの考慮に基づいて、決定することができる。
別の態様において、抗体と、放射線に曝露することにより選択的に熱せられ得る非タンパク質部分との、コンジュゲートが提供される。一態様において、非タンパク質部分は、カーボンナノチューブである（Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)）。放射線はいかなる波長でもよく、またこれらに限定されるものではないが、通常の細胞には害を与えないが抗体‐非タンパク質部分に近接した細胞を死滅させる温度まで非タンパク質部分を熱するような波長を含む。
Ｂ．組み換えの方法および構成
例えば、米国特許第4,816,567号に記載されるとおり、抗体は組み換えの方法や構成を用いて製造することができる。一態様において、本明細書に記載の抗スクレロスチン抗体をコードする、単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列および／またはVHを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖および／または重鎖）をコードしてもよい。さらなる態様において、このような核酸を含む1つまたは複数のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる態様において、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。このような態様の1つでは、宿主細胞は、(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列および抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または、(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一のベクターと抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二のベクターを含む（例えば、形質転換されている）。一態様において、宿主細胞は、真核性である（例えば、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞）またはリンパ系の細胞（例えば、Y0、NS0、Sp2/0細胞））。一態様において、抗スクレロスチン抗体の発現に好適な条件下で、上述のとおり当該抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養すること、および任意で、当該抗体を宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から回収することを含む、抗スクレロスチン抗体を作製する方法が提供される。
抗スクレロスチン抗体の組み換え製造のために、（例えば、上述したものなどの）抗体をコードする核酸を単離し、さらなるクローニングおよび／または宿主細胞中での発現のために、1つまたは複数のベクターに挿入する。そのような核酸は、従来の手順を用いて容易に単離および配列決定されるだろう（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることで）。
抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞を含む。例えば、抗体は、特にグリコシル化およびFcエフェクター機能が必要とされない場合は、細菌で製造してもよい。細菌での抗体断片およびポリペプチドの発現に関して、例えば、米国特許第5,648,237号、第5,789,199号、および第5,840,523号を参照のこと。（加えて、大腸菌における抗体断片の発現について記載したCharlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp.245-254も参照のこと。）発現後、抗体は細菌細胞ペーストから可溶性フラクション中に単離されてもよく、またさらに精製することができる。
原核生物に加え、部分的なまたは完全なヒトのグリコシル化パターンを伴う抗体の産生をもたらす、グリコシル化経路が「ヒト化」されている菌類および酵母の株を含む、糸状菌または酵母などの真核性の微生物は、抗体コードベクターの好適なクローニングまたは発現宿主である。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)および Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006) を参照のこと。
多細胞生物（無脊椎生物および脊椎生物）に由来するものもまた、グリコシル化された抗体の発現のために好適な宿主細胞である。無脊椎生物細胞の例は、植物および昆虫細胞を含む。昆虫細胞との接合、特にSpodoptera frugiperda細胞の形質転換に用いられる、数多くのバキュロウイルス株が同定されている。
植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第5,959,177号、第6,040,498号、第6,420,548号、第7,125,978号、および第6,417,429号（トランスジェニック植物で抗体を産生するための、PLANTIBODIES（商標）技術を記載）を参照のこと。
脊椎動物細胞もまた宿主として使用できる。例えば、浮遊状態で増殖するように適応された哺乳動物細胞株は、有用であろう。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40で形質転換されたサル腎CV1株 (COS-7)；ヒト胎児性腎株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977) などに記載の293または293細胞）；仔ハムスター腎細胞 (BHK)；マウスセルトリ細胞（Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980) などに記載のTM4細胞）；サル腎細胞 (CV1)；アフリカミドリザル腎細胞 (VERO-76)；ヒト子宮頸部癌細胞 (HELA)；イヌ腎細胞 (MDCK)；Buffalo系ラット肝細胞 (BRL 3A)；ヒト肺細胞 (W138)；ヒト肝細胞 (Hep G2)；マウス乳癌 (MMT 060562)；TRI細胞（例えば、Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982) に記載）；MRC5細胞；および、FS4細胞などである。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、DHFR－ CHO細胞 (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)) を含むチャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞；およびY0、NS0、およびSp2/0などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に好適な特定の哺乳動物宿主細胞株の総説として、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003) を参照のこと。
例えば、WO2009/125825に記載されたような、スクリーニング法および/または変異誘発法を使用することによって、pH依存的特性を有する抗体を得ることができる。スクリーニング法には、特定の抗原に対して特異的な抗体の集団において、pH依存的結合特性を有する抗体を同定する任意の過程が含まれ得る。特定の態様において、スクリーニング法は、初期抗体集団内の個々の抗体の、1種または複数種の結合パラメーター（例えば、KDまたはkd）を、酸性pHおよび中性pHの両方において測定する工程を含み得る。抗体の結合パラメーターは、例えば、表面プラズモン共鳴か、または特定の抗原に対する抗体の結合特性の定量的もしくは定性的な評価を可能にするその他の分析法を使用して、測定され得る。特定の態様において、スクリーニング法は、2以上の酸性/中性KD比で抗原に結合する抗体を同定する工程を含み得る。あるいは、スクリーニング法は、2以上の酸性/中性kd比で抗原に結合する抗体を同定する工程を含み得る。
別の態様において、変異誘発法は、抗原に対する抗体のpH依存的結合を増強するために、抗体の重鎖および/または軽鎖に、アミノ酸の欠失、置換、または付加を組み入れる工程を含み得る。特定の態様において、変異誘発は、抗体の1つまたは複数の可変ドメイン、例えば、1つまたは複数のHVR（例えば、CDR）内で実施され得る。例えば、変異誘発は、抗体の1つまたは複数のHVR（例えば、CDR）内のあるアミノ酸を別のアミノ酸に置換する工程を含み得る。特定の態様において、変異誘発は、抗体の少なくとも1つのHVR（例えば、CDR）内の1つまたは複数のアミノ酸をヒスチジンに置換する工程を含み得る。特定の態様において、「増強されたpH依存的結合」とは、変異バージョンの抗体が、変異誘発前の最初の「親」（すなわち、あまりpH依存的ではない）バージョンの抗体よりも大きい酸性/中性KD比または大きい酸性/中性kd比を示すことを意味する。特定の態様において、変異バージョンの抗体は、2以上の酸性/中性KD比を有する。あるいは、変異バージョンの抗体は、2以上の酸性/中性kd比を有する。
ポリクローナル抗体は好ましくは、関連する抗原およびアジュバントの複数回の皮下(sc)または腹腔内(ip)注射により動物において産生される。関連する抗原を、免疫化される種において免疫原性であるタンパク質に、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシン阻害因子に、二官能性物質または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介するコンジュゲーション）、N-ヒドロキシスクシンイミド(リシン残基を介する)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOCl2、またはR1N=C=NR(ここでRおよびR1は異なるアルキル基である)を用いて、コンジュゲートすることが有用であり得る。
動物(通常は非ヒト哺乳動物)は、例えば、(ウサギまたはマウスについてそれぞれ)100μgまたは5μgのタンパク質またはコンジュゲートを3倍容量のフロイント完全アジュバントと組み合わせてその溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、または誘導体に対して免疫化される。1ヶ月後、複数部位に皮下注射することによって、最初の量の1/5～1/10の、フロイント完全アジュバント中のペプチドまたはコンジュゲートで該動物を追加免疫する。7～14日後、該動物から採血し、血清を抗体力価についてアッセイする。力価がプラトーに達するまで動物を追加免疫する。好ましくは、同一抗原であるが別のタンパク質にコンジュゲートされたおよび／または別の架橋試薬を介してコンジュゲートされたコンジュゲートを用いて、該動物を追加免疫する。コンジュゲートは、組み換え細胞培養物中でタンパク質融合体として調製することも可能である。また、免疫応答を増強するために、ミョウバンなどの凝集剤も好適に使用される。
モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から得られ、すなわち、該集団を構成する個々の抗体は、若干量存在しうる自然に生じる潜在的な突然変異および／または翻訳後修飾(例えば、異性化、アミド化)を除いて同一である。したがって、修飾語「モノクローナル」は、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示している。
例えば、モノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature 256(5517):495-497 (1975)に最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製することができる。ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えばハムスターを本明細書に上記したように免疫化して、免疫化に使用されたタンパク質に特異的に結合する抗体を製造するか製造する能力があるリンパ球を誘導する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫化剤は、典型的には、抗原タンパク質またはその融合変異体を包含する。一般的に、ヒト起源の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(PBL)が使用され、非ヒト哺乳動物源が望まれる場合には脾臓細胞またはリンパ節細胞が使用される。その後、リンパ球は、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いて不死化細胞株と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), pp. 59-103)。
不死化細胞株は通常、形質転換された哺乳動物細胞、特に、げっ歯類、ウシおよびヒト起源のミエローマ細胞である。通常は、ラットまたはマウスのミエローマ細胞株が利用される。このようにして作製されたハイブリドーマ細胞を、未融合の親ミエローマ細胞の増殖または生存を阻害する1種以上の物質を好ましくは含有する適切な培養培地中に播種して増殖させる。例えば、親ミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRTまたはHPRT)を欠く場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的には、HGPRT欠損細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン(HAT培地)を含むであろう。
好ましい不死化ミエローマ細胞とは、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの製造を補助し、かつHAT培地のような培地に対して感受性である、細胞である。これらの中でも、マウスミエローマ株、例えば、米国カリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerから入手できるMOPC-21およびMPC-11マウス腫瘍に由来するもの、ならびに米国バージニア州マナッサスのAmerican Type Culture Collectionから入手できるSP-2細胞(およびその誘導体、例えばX63-Ag8-653)が好ましい。ヒトモノクローナル抗体の製造について、ヒトミエローマ細胞株およびマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株もまた、記載されている(Kozbor et al. J. Immunol. 133(6):3001-3005 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 51-63 (1987))。
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の製造についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により製造されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、またはインビトロ結合測定法、例えば放射免疫測定法(RIA)もしくは酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によって決定される。このような技術および測定法は当技術分野で公知である。例えば、結合アフィニティは、Munson, Anal Biochem. 107(1):220-239 (1980)のスキャッチャード(Scatchard)解析によって求めることができる。
所望の特異性、アフィニティ、および／または活性の抗体を製造するハイブリドーマ細胞が特定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングして、標準的な方法(Goding、前掲)により増殖させることができる。この目的のための適切な培養培地としては、例えば、D-MEMまたはRPMI-1640培地が挙げられる。また、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物内の腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、培養培地、腹水、または血清から、例えば、プロテインA-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィなどの従来の免疫グロブリン精製法によって、適切に分離される。
多重特異性抗体は、例えば、Fc領域の一方に存在するアミノ酸側鎖を、より大きい側鎖（ノブ；「突起」を意味する）に置換し、かつFc領域に存在するアミノ酸側鎖を、より小さい側鎖（ホール；「空隙」を意味する）に置換して、ホール内にノブを配置することによって、適切に調製され得る。これは、互いに異なるアミノ酸配列を有するFc領域間の効率的な会合を促進することができる（WO1996/027011；Ridgway et al., Prot. Eng. 9:617-621 (1996)；Merchant et al., Nat. Biotech. 16, 677-681 (1998)）。
異種Fc領域間の会合を促進するために、他の公知の技術を使用してもよい。具体的には、Fc領域間の意図しない同種の会合を抑制するために、Fc領域のCH2ドメインまたはCH3ドメインの界面に静電気的反発力を導入することによって、それを達成することができる（WO2006/106905）。さらに、鎖交換改変型ドメイン（strand exchange engineered domain）（SEED）CH3ヘテロ二量体を使用して、異種Fc領域間の会合を効率的に誘導することができる（Davis et al., Prot. Eng. Des. & Sel., 23:195-202 (2010)）。さらに、抗体のCH1とCLとの会合およびVHとVLとの会合を使用するヘテロ二量体化抗体作製技術を使用することもできる（WO2011/028952）。WO2008/119353およびWO2011/131746に記載された方法と同様に、2種類のホモ二量体化抗体を予め作製し、該抗体を解離させる還元条件下でそれらをインキュベートし、それらを再び会合させることによって、ヘテロ二量体化抗体を作製する技術を使用することも可能である。Strop（J. Mol. Biol. 420:204-219 (2012)）に記載された方法と同様に、静電気的反発力がCH3ドメインへ導入されるよう、Lys、Arg、Glu、およびAspのような電荷を有する残基を導入することによって、ヘテロ二量体化抗体を作製する技術を使用することも可能である。さらに、WO2012/058768に記載される方法と同様に、CH2およびCH3ドメインに改変を加えることによるヘテロ二量体化抗体作製技術を使用することも可能である。
ホモ二量体化抗体とヘテロ二量体化抗体の間で等電点に違いを生じるようなアミノ酸改変を該二種類の抗体重鎖の可変領域に導入することにより、イオン交換クロマトグラフィを用いてホモ二量体化抗体からヘテロ二量体化抗体を効率的に分離および精製するための方法が報告されている（WO2007/114325）。プロテインAに結合するマウスIgG2aおよびプロテインAに結合しないラットIgG2bに由来する二種類の重鎖を含むヘテロ二量体化抗体を構築することにより、プロテインAクロマトグラフィを用いてヘテロ二量体化抗体を精製するための別の方法が報告されている（WO1998/050431およびWO1995/033844）。さらに、異なるプロテインA結合アフィニティをもたらすように、抗体重鎖のプロテインA結合部位に位置する435位および436位（EUナンバリング）のアミノ酸残基をTyrまたはHisなどのアミノ酸で置換することにより、プロテインAクロマトグラフィを用いてヘテロ二量体化抗体を効率的に精製することができる。
一局面において、本発明は、共通VLを作製する方法を提供する。一般には、1種のVLが、1種のVHにのみ特異的に結合し、抗体可変領域を形成するが、共通VLは、少なくとも2種の異なるVHに結合して、少なくとも2種の異なる可変領域を形成することができる。例えば、二重特異性抗体のような多重特異性抗体を構築する時に、共通VLを使用することができる。本発明は、共通VLを含む多重特異性抗体を作製する方法も提供する。
一態様において、本発明は、2種の異なるVHの間で共有される共通VLを作製する方法を提供する。方法は、以下の工程を含むことができる：
（1）第1のVH（VH1）および第1のVL（VL1）を含む第1の可変領域（V1）ならびに第2のVH（VH2）および第2のVL（VL2）を含む第2の可変領域（V2）を準備する工程であって、V1が第1の抗原（Ag1）に対する結合活性を有し、かつV2が第2の抗原（Ag2）に対する結合活性を有する、工程；ならびに
（2）Kabatナンバリングに従って、VL1のHVR-L1、HVR-L2、またはHVR-L3内のある1つの位置におけるアミノ酸残基を、VL2のHVR-L1、HVR-L2、またはHVR-L3内の対応する位置におけるアミノ酸残基に置き換えることによって、改変VL（mVL）を構築する工程。
Ag1およびAg2は、互いに同じであるかまたは異なる抗原であってよい。さらに、V1およびV2は、互いに同じであるかまたは異なるエピトープに結合することができる。例えば、Ag1とAg2は同一の抗原であるが、V1およびV2が同一の抗原上の異なるエピトープに結合してもよい。
mVLの構築は、例えば、VL1およびVL2をコードする核酸を準備し、Kabatナンバリングに従って、VL1のHVR-L1、HVR-L2、またはHVR-L3内のある1つの位置におけるアミノ酸残基のコドンを、VL2のHVR-L1、HVR-L2、またはHVR-L3内の対応する位置におけるアミノ酸残基のコドンに置き換えることによってVL1をコードする核酸を変異させるような組換え法を使用して、実施され得る。変異された核酸を宿主細胞へ導入し、mVLが産生されるように宿主細胞を培養することによって、mVLを得ることができる。
一態様において、方法は、以下の工程をさらに含む：
（3）VL1のHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3内のすべての位置におけるアミノ酸が置き換えられるまで、他の位置のアミノ酸に対して工程（2）を繰り返す工程。
工程（2）および（3）において、アミノ酸の置き換えは、VL1およびVL2の両方がアミノ酸残基を有するが、VL1およびVL2内のアミノ酸残基の種類が互いに異なる位置において、実施され得る。VL1内のある1つの位置におけるアミノ酸残基が、VL2内の対応する位置における残基と同一である時、その位置における置き換えは省略され得る。VL1内のその位置に対応する位置がVL2内に存在しない時、その位置における置き換えは省略され得る。
一態様において、方法は、以下の工程をさらに含む：
（2'）Kabatナンバリングに従って、VL2のHVR-L1、HVR-L2、またはHVR-L3内のある1つの位置におけるアミノ酸残基を、VL1のHVR-L1、HVR-L2、またはHVR-L3内の対応する位置におけるアミノ酸残基に置き換えることによって、改変VL（mVL）を構築する工程；ならびに
（3'）VL2のHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3内のすべての位置におけるアミノ酸が置き換えられるまで、他の位置のアミノ酸に対して工程（2'）を繰り返す工程。
mVLの構築は、例えば、VL1およびVL2をコードする核酸を準備し、Kabatナンバリングに従って、VL2のHVR-L1、HVR-L2、またはHVR-L3内のある1つの位置におけるアミノ酸残基のコドンを、VL1のHVR-L1、HVR-L2、またはHVR-L3内の対応する位置におけるアミノ酸残基のコドンに置き換えることによってVL2をコードする核酸を変異させるような組換え法を使用して、実施され得る。変異された核酸を宿主細胞へ導入し、mVLが産生されるように宿主細胞を培養することによって、mVLを得ることができる。
工程（2'）および（3'）において、アミノ酸の置き換えは、VL1およびVL2の両方がアミノ酸残基を有するが、VL1およびVL2内のアミノ酸残基の種類が互いに異なる位置において、実施され得る。VL2内のある1つの位置におけるアミノ酸残基が、VL1内の対応する位置における残基と同一である時、その位置における置き換えは省略され得る。VL2内のその位置に対応する位置がVL1内に存在しない時、その位置における置き換えは省略され得る。
一態様において、方法は、以下の工程をさらに含む：
（4）前記工程において構築されたmVLについて、それぞれVH1またはVH2と組み合わせた時のAg1またはAg2に対する結合活性を測定する工程。
VH1またはVH2と組み合わせた時のmVLの結合活性は、例えば、mVLとVH1またはVH2のいずれかとを含む改変可変領域について結合アッセイを実施することによって測定され得る。mVLおよびVH1をコードする核酸を準備し、それらの核酸を宿主細胞へ導入し、mV1が産生されるように宿主細胞を培養することによって、mVLおよびVH1を含む改変可変領域（mV1）を得ることができる。mVLおよびVH2をコードする核酸を準備し、それらの核酸を宿主細胞へ導入し、mV2が産生されるように宿主細胞を培養することによって、mVLおよびVH2を含む改変可変領域（mV2）を得ることができる。mV1またはmV2についての結合アッセイは、例えば、ELISA法およびBiacore法のような公知の方法によって実施され得る。
一態様において、方法は、以下の工程をさらに含む：
（5）工程（4）において測定されたmVLの結合活性に基づき、HVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3内のある1つの位置における好ましいアミノ酸残基を2種のアミノ酸残基から選択する工程であって、前記2種のアミノ酸残基の一方はVL1における対応する位置に存在するアミノ酸残基（AA1）であり、もう一方はVL2における対応する位置に存在するアミノ酸残基（AA2）である、工程；
（6）HVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3内における少なくとも2つの異なる位置に対して工程（5）を繰り返す工程；ならびに
（7）HVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3内のそれらの位置に工程（5）および（6）で選択されたアミノ酸残基を含む新規のVL（nVL）を構築する工程。
HVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3内のある1つの位置における好ましいアミノ酸残基は、その位置におけるそのアミノ酸残基の存在が抗原結合に不可欠であるか否かを評価することによって、選択され得る。VL1内のある1つの位置におけるアミノ酸残基（AA1）をVL2内の対応する位置における別のアミノ酸残基（AA2）に置き換えることによってmVLが構築される例示的な状況において、そのようなmVLがVH1と組み合わせられた時にAg1に対する結合活性を失う場合、AA1は抗原結合のために不可欠であると推定することができ、その位置のアミノ酸残基としてAA1を選択することが好ましい。反対に、上述のmVLがVH1と組み合わせられた時にAg1に対する結合活性を維持する場合には、AA1は抗原結合のために不可欠ではなく、AA2に置き換え可能であると推定することができる。そのケースにおいて、その位置のアミノ酸残基としてAA2を選択することは、VH2と組み合わせられた時にAg2に対するmVLの結合活性をほぼ確実に増加させるため、好ましいであろう。あるいは、上述のmVLが、VH1と組み合わせられた時、Ag1に対する中程度の結合活性を有する場合には、AA1およびAA2の両方が候補であり得ると推定することができ、状況に依って、AA1またはAA2のいずれかを、その位置のアミノ酸残基として選択することができる。
工程（5）および（6）において、アミノ酸選択は、VL1およびVL2の両方がアミノ酸残基を有するが、VL1およびVL2内のアミノ酸残基の種類が互いに異なる位置において、実施され得る。VL1内のある1つの位置におけるアミノ酸残基が、VL2内の対応する位置における残基と同一である時、そのアミノ酸残基は、その位置における好ましいアミノ酸残基として自動的に選択される。VL2内のその位置に対応する位置がVL1内に存在しないか、またはVL1内のその位置に対応する位置がVL2内に存在しない時には、その位置における選択を省略することができ、あるいは、新しい位置をnVL内に作製し、そこに、VL1またはVL2内にのみ存在するアミノ酸残基を組み入れることができる。さらに、HVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3内のすべての位置において好ましいアミノ酸残基が選択されるまで、工程（5）を繰り返すことができる。
nVLのアミノ酸配列は、HVR（HVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3）ならびにFR（FR-L1、FR-L2、FR-L3、およびFR-L4）のアミノ酸配列を共に接続することによって設計され得る。HVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3のアミノ酸配列は、工程（5）および（6）において選択されたアミノ酸残基をそれらの位置に含むように決定され得る。FR-L1、FR-L2、FR-L3、およびFR-L4より選択されるいずれか1つのFRのアミノ酸配列は、2種のアミノ酸配列より選択され得、前記2種のアミノ酸配列の一方はVL1の対応するFRのアミノ酸配列であり、もう一方はVL2の対応するFRのアミノ酸配列である。異なる抗体に由来するFRを有する改変型抗体を構築するためのそのような方法論（「FRシャッフリング」と称される）は、当技術分野において既知である（例えば、US2004/0044187を参照のこと）。
nVLの構築は、例えば、HVR（HVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3）ならびにFR（FR-L1、FR-L2、FR-L3、およびFR-L4）をコードする核酸を準備し、それらをライゲートしてnVLをコードする核酸を構築するような組換え法を使用して、実施され得る。核酸を宿主細胞へ導入し、nVLが産生されるように宿主細胞を培養することによって、nVLを得ることができる。
一態様において、VL1およびVL2の両方が、κ軽鎖に由来する可変領域である。さらなる態様において、VL1およびVL2の両方が、ヒトVK1、VK2、VK3、VK4、VK5、VK6、およびVK7などの、κ軽鎖の同一のサブグループに属する。別の態様において、VL1およびVL2の両方が、λ軽鎖に由来する可変領域である。さらなる態様において、VL1およびVL2の両方が、ヒトVL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、およびVL9などの、λ軽鎖の同一のサブグループに属する。
一態様において、VL1のHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3より選択されるいずれか1つのHVRのアミノ酸長は、VL2の対応するHVRのアミノ酸長と同じである。さらなる態様において、VL1のHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3のアミノ酸長は、それぞれ、VL2のHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3のアミノ酸長と同じである。
一態様において、VL1のHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3より選択されるいずれか1つのHVRのアミノ酸配列は、VL2の対応するHVRのアミノ酸配列と比較した場合、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、または100％の同一性を有する。
一態様において、VL1のFR-L1、FR-L2、FR-L3、およびFR-L4より選択されるいずれか1つのFRのアミノ酸長は、VL2の対応するFRのアミノ酸長と同じである。さらなる態様において、VL1のFR-L1、FR-L2、FR-L3、およびFR-L4のアミノ酸長は、それぞれ、VL2のFR-L1、FR-L2、FR-L3、およびFR-L4のアミノ酸長と同じである。
一態様において、VL1のFR-L1、FR-L2、FR-L3、およびFR-L4より選択されるいずれか1つのFRのアミノ酸配列は、VL2の対応するFRのアミノ酸配列と比較した場合、50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、または100％の同一性を有する。
一態様において、方法は、以下の工程をさらに含む：
（8）少なくとも2種の可変領域、すなわち、一方はVH1およびnVLを含みAg1に結合する可変領域であり、もう一方はVH2およびnVLを含みAg2に結合する可変領域である可変領域を含む多重特異性抗体を作製する工程。
そのような多重特異性抗体は、例えば、VH1、VH2、およびnVLをコードする核酸を準備し、それらの核酸を宿主細胞へ導入し、多重特異性抗体が産生されるように宿主細胞を培養するような組換え法を使用して、作製され得る。VH1およびVH2の各々が、重鎖定常領域に接続され得る。nVLは、軽鎖定常領域に接続され得る。
測定法（アッセイ）
本明細書で提供される抗スクレロスチン抗体は、当該技術分野において知られている種々の測定法によって、同定され、スクリーニングされ、または物理的／化学的特性および／または生物学的活性について明らかにされてもよい。
１．結合測定法およびその他の測定法
一局面において、本発明の抗体は、例えばELISA、ウエスタンブロット等の公知の方法によって、その抗原結合活性に関して試験される。
別の局面において、スクレロスチンへの結合に関して、本明細書に記載される抗スクレロスチン抗体と競合する抗体を同定するために、競合アッセイが使用され得る。特定の態様において、そのような競合抗体が過剰に存在する場合、これは、スクレロスチンに対する参照抗体の結合を少なくとも10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、またはそれ以上阻止する（例えば、低下させる）。いくつかの例において、結合は、少なくとも80％、85％、90％、95％、またはそれ以上阻害される。特定の態様において、そのような競合抗体は、本明細書に記載される抗スクレロスチン抗体によって結合されるのと同じエピトープ（例えば、線状または立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングする、詳細な例示的方法は、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。
例示的な競合アッセイにおいて、固定化されたスクレロスチンは、スクレロスチンに結合する第1の標識された抗体およびスクレロスチンへの結合に関して第1の抗体と競合する能力に関して試験される第2の未標識の抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第2の抗体は、ハイブリドーマ上清に存在し得る。対照として、固定化されたスクレロスチンが、第1の標識された抗体を含むが第2の未標識の抗体を含まない溶液中でインキュベートされる。第1の抗体のスクレロスチンに対する結合を許容する条件下でのインキュベーションの後、余分な未結合の抗体が除去され、固定化されたスクレロスチンに結合した標識の量が測定される。固定化されたスクレロスチンに結合した標識の量が対照サンプルと比較して試験サンプルにおいて実質的に減少している場合、それは第2の抗体がスクレロスチンへの結合に関して第1の抗体と競合していることを示す。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) を参照のこと。
別の局面において、本明細書で提供される抗スクレロスチン抗体と同じエピトープに結合するか、または本明細書で提供される抗スクレロスチン抗体とスクレロスチンへの結合に関して競合する抗体は、サンドイッチアッセイを使用して同定され得る。サンドイッチアッセイは、検出すべきタンパク質の異なる免疫原性部分またはエピトープと各々結合することができる2種の抗体の使用を含む。サンドイッチアッセイにおいては、固体支持体上に固定化された第1の抗体が試験試料分析物に結合し、その後、第2の抗体が分析物に結合し、したがって、不溶性の三者複合体が形成される。David & Greeneの米国特許第4,376,110号を参照のこと。第2の抗体は、それ自体が検出可能部分によって標識されていてもよいし（直接サンドイッチアッセイ）、または検出可能部分によって標識された抗免疫グロブリン抗体を使用して測定されてもよい（間接サンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの一つの型は、ELISAアッセイであり、このケースにおいては、検出可能部分が酵素である。本明細書で提供される抗スクレロスチン抗体と同時にスクレロスチンに結合する抗体は、当該抗スクレロスチン抗体とは異なるエピトープに結合する抗体であると判定され得る。したがって、本明細書で提供される抗スクレロスチン抗体と同時にスクレロスチンに結合しない抗体は、当該抗スクレロスチン抗体と同じエピトープに結合するか、または当該抗スクレロスチン抗体とスクレロスチンへの結合に関して競合する抗体であると判定され得る。
２．活性測定法
一局面において、生物学的活性を有する抗スクレロスチン抗体を同定するための測定法が提供される。生物学的活性は、例えば、スクレロスチンに対する阻害活性を含んでよい。また、このような生物学的活性をインビボおよび／またはインビトロで有する抗体が、提供される。
特定の態様において、本発明の抗体は、このような生物学的活性について試験される。様々な局面において、抗スクレロスチン抗体は、MC3T3細胞ベースのミネラル化アッセイにおいてスクレロスチンを中和することができる。培養物中の骨芽細胞系統細胞、初代細胞または細胞株のいずれかによるミネラル化が、骨形成のインビトロモデルとして使用される。例示的な細胞ベースのミネラル化アッセイは、米国特許公開第20070110747号に記載されている。MC3T3-E1細胞（Sudo et al., J. Cell Biol., 96:191-198 (1983)）およびその最初の細胞株のサブクローンは、分化剤の存在下で増殖した時、培養物中にミネラルを形成することができる。MC3T3-E1細胞について、スクレロスチンは、ミネラル沈着を含むミネラル沈着に至る一連のイベントのうちの一つまたは複数を阻害することができる（すなわち、スクレロスチンはミネラル化を阻害する）。スクレロスチンの阻害活性を中和することができる抗スクレロスチン抗体は、スクレロスチンの存在下での培養物のミネラル化を可能にするため、例えば、（カルシウムとして測定される）リン酸カルシウムの沈着において、スクレロスチンのみ（すなわち、抗体なし）の処理群において測定されるカルシウムの量と比較した場合、統計的に有意な増加が存在する。
別の局面において、抗スクレロスチン抗体は、細胞ベースのアッセイ、例えば国際特許公開番号WO2008/115732に記載された骨特異的アルカリホスファターゼアッセイにおいて、スクレロスチンを中和することができる。骨特異的アルカリホスファターゼアッセイは、多分化能を有するマウス細胞株C2C12においてスクレロスチンがBMP-4およびWnt3a刺激によるアルカリホスファターゼレベルを減少させる能力に基づく。中和抗スクレロスチン抗体は、このアッセイにおいて、アルカリホスファターゼ活性の用量依存的な増加を媒介する。
別の局面において、抗スクレロスチン抗体は、HEK293細胞株における細胞ベースのWntシグナル伝達アッセイ、例えば国際特許公開番号WO2009/047356に記載された、Wnt1介在性のSTFレポーター遺伝子の誘導を含むWntアッセイにおいて、スクレロスチンを中和することができる。あるいは、またはさらに、抗スクレロスチン抗体は、MC3T3細胞におけるBMP2によって誘導されるミネラル化アッセイ、例えば国際特許公開番号WO2009/047356に記載されたミネラル化アッセイにおいて、スクレロスチンを中和することができる。
特定の態様において、スクレロスチン活性の阻害は、類似条件下での陰性対照と比較して、アッセイにおけるスクレロスチン活性の少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、もしくは40％以上の減少を含む。いくつかの態様において、それは、スクレロスチン活性の少なくとも45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％以上の阻害を指す。
特定の局面において、本発明の抗スクレロスチン抗体は、細胞内へ取り込まれ、特に、抗体が抗原と結合して免疫複合体を形成した時に、当該抗体の取り込みが増強される。細胞内への抗体の取り込みは、細胞画像分析によって観察され得る。蛍光標識された抗体を、抗原の非存在下および存在下で、Fc受容体（例えば、FcγR）を発現する細胞と接触させ、得られた細胞の蛍光強度を、画像解析装置を使用して測定する。そのようなアッセイのために有用な細胞は、内在性のFc受容体を発現するものであってもよいし、またはFc受容体をコードするトランスジーンを発現するよう、一過性にもしくは安定的に、遺伝学的に改変されたものであってもよい。抗原の非存在下と比較して増加した蛍光強度が、抗原の存在下で検出される場合、試験抗体が抗原と複合体を形成した時に、細胞内への試験抗体の取り込みが増強されると判定される。
別の局面において、抗体が、抗原と免疫複合体、特に、2つ以上の抗体分子を含有する免疫複合体を形成することができるか否かは、例えば、サイズ排除（ゲルろ過）クロマトグラフィ、超遠心分離、光散乱、電子顕微鏡、または質量分析などの方法によって評価され得る（Mol Immunol (2002) 39:77-84、Mol Immunol (2009) 47:357-364）。これらの方法は、抗原の存在下で形成された免疫複合体の分子サイズを推定することができる。免疫複合体の分子サイズが、1つの抗体分子から推量されるより大きい時、その抗体は、2つ以上の抗体分子を含有する免疫複合体を形成することができると判定される。別の局面において、免疫複合体の形成は、例えば、ELISA、FACS、またはSPR（表面プラズモン共鳴アッセイ；例えば、Biacoreを使用したもの）を使用した、Fc受容体（例えば、FcγR）との結合アッセイによって検出され得る（J Biol Chem (2001) 276(9):6591-6604；J Immunol Methods (1982) 50:109-114；J Immunol (2010) 184(4):1968-1976；mAbs (2009) 1(5):491-504）。これらの方法は、2つ以上の抗体分子を含有する免疫複合体が、抗体分子単独よりもまたは1つの抗体分子を含有する免疫複合体よりも強くFc受容体と結合することができるという特性を利用する。抗体が、抗原の非存在下と比較してより高いアフィニティで、抗原の存在下でFc受容体と結合する時、その抗体は、2つ以上の抗体分子を含有する免疫複合体を形成することができると判定される。
Ｃ．イムノコンジュゲート
本発明はまた、1つまたは複数の細胞傷害剤（例えば化学療法剤または化学療法薬、増殖阻害剤、毒素（例えば細菌、真菌、植物もしくは動物起源のタンパク質毒素、酵素的に活性な毒素、もしくはそれらの断片）または放射性同位体）にコンジュゲートされた本明細書の抗スクレロスチン抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
一態様において、イムノコンジュゲートは、抗体が、これらに限定されるものではないが以下を含む1つまたは複数の薬剤にコンジュゲートされた、抗体－薬剤コンジュゲート (antibody-drug conjugate: ADC) である：メイタンシノイド（米国特許第5,208,020号、第5,416,064号、および欧州特許第0,425,235号B1参照）；例えばモノメチルオーリスタチン薬剤部分DEおよびDF（MMAEおよびMMAF）（米国特許第5,635,483号および第5,780,588号および第7,498,298号参照）などのオーリスタチン；ドラスタチン；カリケアマイシンまたはその誘導体（米国特許第5,712,374号、第5,714,586号、第5,739,116号、第5,767,285号、第5,770,701号、第5,770,710号、第5,773,001号、および第5,877,296号；Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)；ならびにLode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998) 参照）；ダウノマイシンまたはドキソルビシンなどのアントラサイクリン（Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006)；Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006)；Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005)；Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000)；Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002)；King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)；および米国特許第6,630,579号参照）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、およびオルタタキセルなどのタキサン；トリコテセン；ならびにCC1065。
別の態様において、イムノコンジュゲートは、これらに限定されるものではないが以下を含む酵素的に活性な毒素またはその断片にコンジュゲートされた、本明細書に記載の抗体を含む：ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素A鎖（緑膿菌 (Pseudomonas aeruginosa) 由来）、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、アルファ-サルシン、シナアブラギリ (Aleurites fordii) タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ (Phytolacca americana) タンパク質（PAPI、PAPIIおよびPAP-S）、ツルレイシ (momordica charantia) 阻害剤、クルシン (curcin)、クロチン、サボンソウ (saponaria officinalis) 阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン (mitogellin)、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、ならびにトリコテセン。
別の態様において、イムノコンジュゲートは、放射性コンジュゲートを形成するために放射性原子にコンジュゲートされた本明細書に記載の抗体を含む。様々な放射性同位体が放射性コンジュゲートの製造に利用可能である。例は、211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、212PbおよびLuの放射性同位体を含む。放射性コンジュゲートを検出のために使用する場合、放射性コンジュゲートは、シンチグラフィー検査用の放射性原子（例えばTc-99mもしくは123I）、または、核磁気共鳴 (NMR) イメージング（磁気共鳴イメージング、MRIとしても知られる）用のスピン標識（例えばここでもヨウ素-123、ヨウ素-131、インジウム-111、フッ素-19、炭素-13、窒素-15、酸素-17、ガドリニウム、マンガン、または鉄）を含み得る。
抗体および細胞傷害剤のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質連結剤を用いて作製され得る。例えばN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート (SPDP)、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート (SMCC)、イミノチオラン (IT)、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルHCl）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス-アジド化合物（例えば、ビス（p-アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス-ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン2,6-ジイソシアネート）、およびビス活性フッ素化合物（例えば、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン）である。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta et al., Science 238:1098 (1987) に記載されるようにして調製され得る。炭素-14標識された1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸 (MX-DTPA) は、抗体への放射性核種のコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である。WO94/11026を参照のこと。リンカーは、細胞内での細胞傷害薬の放出を促進する「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)；米国特許第5,208,020号）が使用され得る。
本明細書のイムノコンジュゲートまたはADCは、（例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aから）市販されているBMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、およびスルホ-SMPB、ならびにSVSB（スクシンイミジル-(4-ビニルスルホン)ベンゾエート）を含むがこれらに限定されない架橋試薬を用いて調製されるコンジュゲートを明示的に考慮するが、これらに限定されない。
Ｄ．診断および検出のための方法および組成物
特定の態様において、本明細書で提供される抗スクレロスチン抗体のいずれも、生物学的サンプルにおけるスクレロスチンの存在を検出するのに有用である。本明細書で用いられる用語「検出」は、定量的または定性的な検出を包含する。特定の態様において、生物学的サンプルは、細胞または組織、例えば、血清、全血、血漿、生検サンプル、組織サンプル、細胞懸濁物、唾液、痰、口腔液、脳脊髄液、羊水、腹水、母乳、初乳、乳腺分泌物、リンパ液、尿、汗、涙液、胃液、滑液、腹水、眼用レンズ液、および粘液を含む。
一態様において、診断方法または検出方法において使用するための抗スクレロスチン抗体が提供される。さらなる局面において、生物学的サンプル中のスクレロスチンの存在を検出する方法が提供される。特定の態様において、この方法は、スクレロスチンへの抗スクレロスチン抗体の結合が許容される条件下で本明細書に記載の抗スクレロスチン抗体と生物学的サンプルを接触させること、および抗スクレロスチン抗体とスクレロスチンの間で複合体が形成されたかどうかを検出することを含む。そのような方法は、インビトロの方法またはインビボの方法であり得る。一態様において、抗スクレロスチン抗体は、例えばスクレロスチンが患者を選択するためのバイオマーカーである場合、抗スクレロスチン抗体を用いる治療に適合する対象を選択するために使用される。
本発明の抗体を用いて診断され得る例示的な障害は、軟骨無形成症、鎖骨頭蓋骨形成不全症、内軟骨腫症、線維性骨異形成症、ゴーシェ病、低リン酸血症性くる病、マルファン症候群、遺伝性多発性外骨腫、神経線維腫症、骨形成不全症、大理石骨病、骨斑紋症、硬化性病変、偽関節、化膿性骨髄炎、歯周病、抗てんかん薬誘発性骨喪失、一次性および二次性副甲状腺機能亢進症、家族性副甲状腺機能亢進症候群、無重力誘発性骨喪失、閉経後骨喪失、骨関節炎、腎性骨ジストロフィー、浸潤性骨障害、口腔内骨喪失、顎骨壊死、若年性パジェット病、メロレオストーシス、代謝性骨疾患、肥満細胞症、鎌形赤血球貧血症/疾患、臓器移植関連骨喪失、腎移植関連骨喪失、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、てんかん、若年性関節炎、サラセミア、ムコ多糖症、ファブリー病、ターナー症候群、ダウン症候群、クラインフェルター症候群、ハンセン病、ペルテス病、思春期特発性側弯症、乳児発症型多系統炎症性疾患、ウィンチェスター症候群、メンケス病、ウィルソン病、（レッグ・カルベ・ペルテス病および限局性遊走性骨粗鬆症などの）虚血性骨疾患、貧血状態、ステロイドによって引き起こされた状態、グルココルチコイド誘発性骨喪失、ヘパリン誘発性骨喪失、骨髄障害、壊血病、栄養障害、カルシウム欠乏症、骨粗鬆症、骨減少症、アルコール中毒、慢性肝疾患、閉経後状態、慢性炎症性状態、関節リウマチ、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、炎症性大腸炎、クローン病、希発月経、無月経、妊娠関連骨喪失、糖尿病、甲状腺機能亢進症、甲状腺障害、副甲状腺障害、クッシング病、先端巨大症、性腺機能低下症、運動抑制または非活動、反射性交感神経性ジストロフィー症候群、限局性骨粗鬆症、骨軟化症、関節置換術に関連した骨喪失、HIV関連骨喪失、成長ホルモンの低減に関連した骨喪失、嚢胞性線維症に関連した骨喪失、化学療法関連骨喪失、腫瘍誘発性骨喪失、癌関連骨喪失、ホルモン除去による骨喪失、多発性骨髄腫、薬物誘発性骨喪失、神経性食欲不振症、疾患関連顔面骨喪失、疾患関連頭蓋骨喪失、疾患関連顎骨喪失、疾患関連頭骨喪失、加齢に関連した骨喪失、加齢に関連した顔面骨喪失、加齢に関連した頭蓋骨喪失、加齢に関連した顎骨喪失、加齢に関連した頭骨喪失、ならびに宇宙旅行に関連した骨喪失などの、骨関連疾患を含む。
特定の態様において、標識された抗スクレロスチン抗体が提供される。標識は、直接的に検出される標識または部分（例えば、蛍光標識、発色標識、高電子密度標識、化学発光標識、および放射性標識）ならびに、例えば酵素反応または分子間相互作用を通じて間接的に検出される部分（例えば酵素またはリガンド）を含むが、これらに限定されない。例示的な標識は、これらに限定されるものではないが、以下を含む：放射性同位体32P、14C、125I、3Hおよび131I、希土類キレートなどの発蛍光団またはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ（米国特許第4,737,456号）などのルシフェラーゼ、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ (horseradish peroxidase: HRP)、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、単糖オキシダーゼ（例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ）、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなどの複素環オキシダーゼ、過酸化水素を用いて色素前駆体を酸化する酵素（例えばHRP、ラクトペルオキシダーゼ、またはミクロペルオキシダーゼ）と連結されたもの、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定なフリーラジカル類、ならびにこれらに類するもの。
Ｅ．薬学的製剤
本明細書に記載の抗スクレロスチン抗体の薬学的製剤は、所望の純度を有する抗体を、1つまたは複数の任意の薬学的に許容される担体 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、調製される。薬学的に許容される担体は、概して、用いられる際の用量および濃度ではレシピエントに対して非毒性であり、これらに限定されるものではないが、以下のものを含む：リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む、抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；3-ペンタノール；およびm-クレゾールなど）；低分子（約10残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、単糖、二糖、および他の炭水化物；EDTAなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトールなどの、砂糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン類；金属錯体（例えば、Zn-タンパク質錯体）；および／またはポリエチレングリコール (PEG) などの非イオン系表面活性剤。本明細書の例示的な薬学的に許容される担体は、さらに、可溶性中性活性型ヒアルロニダーゼ糖タンパク質 (sHASEGP)（例えば、rHuPH20 (HYLENEX（登録商標）、Baxter International, Inc.) などのヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質）などの間質性薬剤分散剤を含む。特定の例示的sHASEGPおよびその使用方法は（rHuPH20を含む）、米国特許出願公開第2005/0260186号および第2006/0104968号に記載されている。一局面において、sHASEGPは、コンドロイチナーゼなどの1つまたは複数の追加的なグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第6,267,958号に記載されている。水溶液抗体製剤は、米国特許第6,171,586号およびWO2006/044908に記載のものを含み、後者の製剤はヒスチジン－アセテート緩衝液を含んでいる。
本明細書の製剤は、治療される特定の適応症のために必要であれば1つより多くの有効成分を含んでもよい。互いに悪影響を与えあわない相補的な活性を伴うものが好ましい。例えば、骨吸収抑制剤、骨形成剤（すなわち、同化剤）、（ラロキシフェン、バゼドキシフェン、およびラソフォキシフェンを含むが、これらに限定されない）エストロゲン受容体モジュレーター、破骨細胞に対する阻害効果を有する薬物、（アレンドロン酸ナトリウム（FOSAMAX（登録商標））、リセドロン酸、イバンドロン酸ナトリウム（BONIVA（登録商標））、およびゾレドロン酸（RECLAST（登録商標））を含むが、これらに限定されない）ビスホスホネート；エストロゲンまたはエストロゲン類似体；抗RANKリガンド（RANKL）抗体（例えば、PROLIA（登録商標））のような抗RANKL阻害剤；ビタミンDもしくはビタミンD誘導体またはその模倣物；カルシウム源、カテプシンK（cat-K）阻害剤（例えば、オダナカチブ）、チボロン、カルシトニン、またはカルシトリオール；ホルモン補充療法、副甲状腺ホルモン（PTH）またはそのペプチド断片、PTH関連タンパク質（PTHrp）、骨形成タンパク質（例えば、BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-14、および/またはBMP-15）、オステオゲニン（osteogenin）、NaF、PGE2アゴニスト、スタチン、ストロンチウムラネラート、スクレロスチン阻害剤（例えば、米国特許第7,592,429号または第7,872,106号等に記載された抗スクレロスチン抗体）、抗DKKl抗体または阻害剤、Forteo（登録商標）（テリパラチド）、Preotact（登録商標）、またはProtelos（登録商標）からなる群より選択される第2の骨増強剤をさらに提供することが望ましい。このような有効成分は、意図された目的のために有効である量で、好適に組み合わせられて存在する。
有効成分は、例えば液滴形成（コアセルベーション）手法によってまたは界面重合によって調製されたマイクロカプセル（それぞれ、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル、およびポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル）に取り込まれてもよいし、コロイド状薬剤送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル）に取り込まれてもよいし、マクロエマルションに取り込まれてもよい。このような手法は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) に開示されている。
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含んだ固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスを含み、当該マトリクスは例えばフィルムまたはマイクロカプセルなどの造形品の形態である。
インビボ (in vivo) 投与のために使用される製剤は、通常無菌である。無菌状態は、例えば滅菌ろ過膜を通して濾過することなどにより、容易に達成される。
Ｆ．治療的方法および治療用組成物
本明細書で提供される抗スクレロスチン抗体のいずれも、治療的な方法において使用されてよい。
一局面において、医薬品としての使用のための、抗スクレロスチン抗体が提供される。さらなる局面において、骨関連疾患および/またはスクレロスチンの増加したレベルに関連した疾患もしくは状態の治療における使用のための、抗スクレロスチン抗体が提供される。特定の態様において、治療方法における使用のための、抗スクレロスチン抗体が提供される。特定の態様において、本発明は、骨関連疾患および/またはスクレロスチンの増加したレベルに関連した疾患もしくは状態を有する個体を治療する方法であって、当該個体に抗スクレロスチン抗体の有効量を投与する工程を含む方法における使用のための、抗スクレロスチン抗体を提供する。このような態様の1つにおいて、方法は、当該個体に少なくとも1つの（例えば後述するような）追加治療剤の有効量を投与する工程を、さらに含む。さらなる態様において、本発明は、（i）骨形成を増加させ、（ii）骨吸収を阻害し、かつ/または（iii）骨塩密度を増加させることにおける使用のための抗スクレロスチン抗体を提供する。特定の態様において、本発明は、個体において（i）骨形成を増加させ、（ii）骨吸収を阻害し、かつ/または（iii）骨塩密度を増加させる方法であって、それぞれ、（i）骨形成を増加させ、（ii）骨吸収を阻害し、かつ/または（iii）骨塩密度を増加させるために、当該個体に抗スクレロスチン抗体の有効量を投与する工程を含む方法における使用のための、抗スクレロスチン抗体を提供する。さらなる態様において、本発明は、血漿からのスクレロスチンのクリアランスを増強することにおける使用のための抗スクレロスチン抗体を提供する。特定の態様において、本発明は、個体において血漿からのスクレロスチンのクリアランスを増強する方法であって、血漿からのスクレロスチンのクリアランスを増強するために、当該個体に抗スクレロスチン抗体の有効量を投与する工程を含む方法における使用のための、抗スクレロスチン抗体を提供する。上述の態様の任意のものによる抗スクレロスチン抗体は、少なくとも2つの抗体分子を含有する免疫複合体を形成することができる。上述の態様の任意のものによる抗スクレロスチン抗体は、酸性pH（例えば、pH5.8）においてよりも中性pH（例えば、pH7.4）において高いアフィニティでスクレロスチンに結合することもできる。上記態様の任意のものによる「個体」は、好適にはヒトである。
さらなる局面において、本発明は医薬品の製造または調製における抗スクレロスチン抗体の使用を提供する。一態様において、医薬品は、骨関連疾患および/またはスクレロスチンの増加したレベルに関連した疾患もしくは状態の治療のためのものである。さらなる態様において、医薬品は、骨関連疾患および/またはスクレロスチンの増加したレベルに関連した疾患もしくは状態を有する個体を治療する方法であって、当該個体に医薬品の有効量を投与する工程を含む方法における使用のためのものである。このような態様の1つにおいて、方法は、当該個体に少なくとも1つの（例えば後述するような）追加治療剤の有効量を投与する工程を、さらに含む。さらなる態様において、医薬品は、（i）骨形成を増加させ、（ii）骨吸収を阻害し、かつ/または（iii）骨塩密度を増加させるためのものである。さらなる態様において、医薬品は、個体において（i）骨形成を増加させ、（ii）骨吸収を阻害し、かつ/または（iii）骨塩密度を増加させる方法であって、それぞれ、（i）骨形成を増加させ、（ii）骨吸収を阻害し、かつ/または（iii）骨塩密度を増加させるために、当該個体に医薬品の有効量を投与する工程を含む方法における使用のためのものである。さらなる態様において、医薬品は、血漿からのスクレロスチンのクリアランスを増強するためのものである。さらなる態様において、医薬品は、個体において血漿からのスクレロスチンのクリアランスを増強する方法であって、血漿からのスクレロスチンのクリアランスを増強するために、当該個体に医薬品の有効量を投与する工程を含む方法における使用のためのものである。上述の態様の任意のものによる抗スクレロスチン抗体は、少なくとも2つの抗体分子を含有する免疫複合体を形成することができる。上述の態様の任意のものによる抗スクレロスチン抗体は、酸性pH（例えば、pH5.8）においてよりも中性pH（例えば、pH7.4）において高いアフィニティでスクレロスチンに結合することもできる。上記態様の任意のものによる「個体」は、ヒトであってもよい。
さらなる局面において、本発明は骨関連疾患および/またはスクレロスチンの増加したレベルに関連した疾患もしくは状態を治療する方法を提供する。一態様において、方法は、そのような骨関連疾患および/またはスクレロスチンの増加したレベルに関連した疾患もしくは状態を有する個体に抗スクレロスチン抗体の有効量を投与する工程を含む。そのような態様の1つにおいて、方法は、当該個体に少なくとも1つの（後述するような）追加治療剤の有効量を投与する工程を、さらに含む。上記態様の任意のものによる「個体」は、ヒトであってもよい。
さらなる局面において、本発明は個体において（i）骨形成を増加させ、（ii）骨吸収を阻害し、かつ/または（iii）骨塩密度を増加させるための方法を提供する。一態様において、方法は、それぞれ（i）骨形成を増加させ、（ii）骨吸収を阻害し、かつ/または（iii）骨塩密度を増加させるために個体に抗スクレロスチン抗体の有効量を投与する工程を含む。一態様において、「個体」は、ヒトである。
さらなる局面において、本発明は、個体において血漿からのスクレロスチンのクリアランスを増強する方法を提供する。一態様において、方法は、血漿からのスクレロスチンのクリアランスを増強するために、抗スクレロスチン抗体の有効量を個体に投与する工程を含む。上述の態様の任意のものによる抗スクレロスチン抗体は、少なくとも2つの抗体分子を含有する免疫複合体を形成することができる。上述の態様の任意のものによる抗スクレロスチン抗体は、酸性pH（例えば、pH5.8）においてよりも中性pH（例えば、pH7.4）において高いアフィニティでスクレロスチンに結合することもできる。一態様において、「個体」は、ヒトである。
さらなる局面において、本発明は、本明細書で提供される抗スクレロスチン抗体の任意のものを含む、薬学的製剤を提供する（例えば上述の治療的方法の任意のものにおける使用のための）。一態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗スクレロスチン抗体の任意のものと、薬学的に許容される担体とを含む。さらなる態様において、薬学的製剤は、骨関連疾患および/またはスクレロスチンの増加したレベルに関連した疾患もしくは状態の治療のためのものである。一態様において、薬学的製剤は、骨関連疾患および/またはスクレロスチンの増加したレベルに関連した疾患もしくは状態を有する個体に投与される。別の態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗スクレロスチン抗体の任意のものと、少なくとも1つの（例えば後述するような）追加治療剤とを含む。さらなる態様において、薬学的製剤は、（i）骨形成を増加させ、（ii）骨吸収を阻害し、かつ/または（iii）骨塩密度を増加させるためのものである。さらなる態様において、薬学的製剤は、血漿からのスクレロスチンのクリアランスを増強するためのものである。上述の態様の任意のものによる抗スクレロスチン抗体は、少なくとも2つの抗体分子を含有する免疫複合体を形成することができる。上述の態様の任意のものによる抗スクレロスチン抗体は、酸性pH（例えば、pH5.8）においてよりも中性pH（例えば、pH7.4）において高いアフィニティでスクレロスチンに結合することもできる。上述の態様の任意のものによる「個体」は、好適にはヒトである。
特定の態様において、骨関連疾患は、軟骨無形成症、鎖骨頭蓋骨形成不全症、内軟骨腫症、線維性骨異形成症、ゴーシェ病、低リン酸血症性くる病、マルファン症候群、遺伝性多発性外骨腫、神経線維腫症、骨形成不全症、大理石骨病、骨斑紋症、硬化性病変、偽関節、化膿性骨髄炎、歯周病、抗てんかん薬誘発性骨喪失、一次性および二次性副甲状腺機能亢進症、家族性副甲状腺機能亢進症候群、無重力誘発性骨喪失、閉経後骨喪失、骨関節炎、腎性骨ジストロフィー、浸潤性骨障害、口腔内骨喪失、顎骨壊死、若年性パジェット病、メロレオストーシス、代謝性骨疾患、肥満細胞症、鎌形赤血球貧血症/疾患、臓器移植関連骨喪失、腎移植関連骨喪失、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、てんかん、若年性関節炎、サラセミア、ムコ多糖症、ファブリー病、ターナー症候群、ダウン症候群、クラインフェルター症候群、ハンセン病、ペルテス病、思春期特発性側弯症、乳児発症型多系統炎症性疾患、ウィンチェスター症候群、メンケス病、ウィルソン病、（レッグ・カルベ・ペルテス病および限局性遊走性骨粗鬆症などの）虚血性骨疾患、貧血状態、ステロイドによって引き起こされた状態、グルココルチコイド誘発性骨喪失、ヘパリン誘発性骨喪失、骨髄障害、壊血病、栄養障害、カルシウム欠乏症、骨粗鬆症、骨減少症、アルコール中毒、慢性肝疾患、閉経後状態、慢性炎症性状態、関節リウマチ、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、炎症性大腸炎、クローン病、希発月経、無月経、妊娠関連骨喪失、糖尿病、甲状腺機能亢進症、甲状腺障害、副甲状腺障害、クッシング病、先端巨大症、性腺機能低下症、運動抑制または非活動、反射性交感神経性ジストロフィー症候群、限局性骨粗鬆症、骨軟化症、関節置換術に関連した骨喪失、HIV関連骨喪失、成長ホルモンの低減に関連した骨喪失、嚢胞性線維症に関連した骨喪失、化学療法関連骨喪失、腫瘍誘発性骨喪失、癌関連骨喪失、ホルモン除去による骨喪失、多発性骨髄腫、薬物誘発性骨喪失、神経性食欲不振症、疾患関連顔面骨喪失、疾患関連頭蓋骨喪失、疾患関連顎骨喪失、疾患関連頭骨喪失、加齢に関連した骨喪失、加齢に関連した顔面骨喪失、加齢に関連した頭蓋骨喪失、加齢に関連した顎骨喪失、加齢に関連した頭骨喪失、ならびに宇宙旅行に関連した骨喪失からなる群より選択される。
いくつかの態様において、骨形成を増加させ、骨吸収を阻害し、かつ/または骨塩密度を増加させるための医薬品は、骨折治癒、非癒合性治癒、遷延癒合性治癒、および顔面再建のような、整形外科的手技、歯科手技、移植手術、関節置換術、骨移植、骨美容手術、および骨修復の転帰を改善するのに有用である。そのような医薬品は、手技、置換術、移植、手術、または修復の前、間、および/または後に投与され得る。
いくつかの態様において、骨形成を増加させ、骨吸収を阻害し、かつ/または骨塩密度を増加させるための医薬品は、2つの骨部分の間の間隙を含むいかなる骨折の治療にも有用である。例示的な骨間隙欠損は、粉砕骨折、非癒合性骨折、部分骨格欠損、外科的に生じた骨欠損、外科的に治療された骨欠損、および外傷性骨損傷または疾患（関節炎、腫瘍除去（切除）、または感染除去を含むが、これらに限定されない）から生じた骨欠損を含むが、これらに限定されない。いくつかの態様において、骨間隙欠損は、感染した骨部分の除去によって、または骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、悪性線維性組織球腫、線維肉腫、および脊索腫を含むが、これらに限定されない骨癌による骨からの癌の除去によって、作製される。いくつかの態様において、骨間隙欠損は、例えば、遺伝子欠損による、発生上の変形である。いくつかの態様において、骨間隙欠損は、良性腫瘍を含有する骨部分の除去によって作製される。例示的な良性骨腫瘍は、骨腫、類骨腫、骨芽細胞腫、骨軟骨腫、内軟骨腫、軟骨粘液線維腫、動脈瘤様骨嚢胞、単発性骨嚢腫、線維性骨異形成症、および骨巨細胞腫を含むが、これらに限定されない。
骨形成および/または骨塩密度は、X線検査（例えば、X線吸収測定法）、単一または二重エネルギーX線吸収測定法、定量的コンピュータ断層撮影法（QCT）、超音波検査、および磁気共鳴画像法を使用して測定され得る。骨量も、体重から、またはその他の方法を使用することによって、計算され得る（Gunness-Hey, Metab. Bone Dis. Relat. Res., 5:177-181 (1984)を参照のこと）。骨粗鬆症および骨減少症のようなヒト疾患の状態を模倣する動物モデルが、例えば、骨喪失、骨吸収、骨形成、骨強度、または骨ミネラル化のパラメーターに対する、薬学的組成物および方法の効果を試験するために、当技術分野において使用されている。そのようなモデルの例には、卵巣切除ラットモデルが含まれる（Kalu, Bone and Mineral, 15:175-191 (1991)；Frost and Jee, Bone and Mineral, 18:227-236 (1992)；およびJee and Yao, J. Musculoskelet. Neuronal Interact., 1:193-207 (2001)）。
あるいは、1種または複数種のスクレロスチン結合剤に対する生理学的応答を、骨マーカーレベルをモニタリングすることによって判断することができる。骨マーカーは、骨リモデリング過程において生じる産物であり、骨、骨芽細胞、および/または破骨細胞によって放出される。骨マーカーレベルの変動は、骨リモデリングの変化を意味する。骨吸収（または破骨細胞活性）を示すマーカーには、例えば、C-テロペプチド（例えば、1型コラーゲンのC末端テロペプチド（CTX）または血清架橋C-テロペプチド）、N-テロペプチド（1型コラーゲンのN末端テロペプチド（NTX））、デオキシピリジノリン（DPD）、ピリジノリン、尿ヒドロキシプロリン、ガラクトシルヒドロキシリジン、および酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（例えば、血清酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼアイソフォーム5b）が含まれる。骨形成/ミネラル化マーカーは、骨特異的アルカリホスファターゼ（BSAP）、I型プロコラーゲンのN末端およびC末端の伸長部分から放出されたペプチド（P1NP、P1CP）、ならびにオステオカルシンを含むが、これらに限定されない。
さらなる局面において、本発明は、例えば、上述の治療法のいずれかにおいて使用するために、本明細書で提供される抗スクレロスチン抗体のいずれかを、薬学的に許容される担体と混合する工程を含む、医薬品または薬学的製剤を調製するための方法を提供する。一態様において、医薬品または薬学的製剤を調製するための方法は、少なくとも1種の追加治療剤を医薬品または薬学的製剤に添加する工程をさらに含む。
本発明の抗体は、療法において、単独または他の剤との組み合わせのどちらでも使用され得る。例えば、本発明の抗体は、少なくとも1つの追加の治療剤と同時投与されてもよい。特定の態様において、追加治療剤は、骨吸収抑制剤、骨形成剤（すなわち、同化剤）、（ラロキシフェン、バゼドキシフェン、およびラソフォキシフェンを含むが、これらに限定されない）エストロゲン受容体モジュレーター、破骨細胞に対する阻害効果を有する薬物、（アレンドロン酸ナトリウム（FOSAMAX（登録商標））、リセドロン酸、イバンドロン酸ナトリウム（BONIVA（登録商標））、およびゾレドロン酸（RECLAST（登録商標））を含むが、これらに限定されない）ビスホスホネート；エストロゲンまたはエストロゲン類似体；抗RANKリガンド（RANKL）抗体（例えば、PROLIA（登録商標））のような抗RANKL阻害剤；ビタミンDもしくはビタミンD誘導体またはその模倣物；カルシウム源、カテプシンK（cat-K）阻害剤（例えば、オダナカチブ）、チボロン、カルシトニン、またはカルシトリオール；ホルモン補充療法、副甲状腺ホルモン（PTH）またはそのペプチド断片、PTH関連タンパク質（PTHrp）、骨形成タンパク質（例えば、BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-14、および/またはBMP-15）、オステオゲニン、NaF、PGE2アゴニスト、スタチン、ストロンチウムラネラート、スクレロスチン阻害剤（例えば、米国特許第7,592,429号または第7,872,106号等に記載された抗スクレロスチン抗体）、抗DKKl抗体または阻害剤、Forteo（登録商標）（テリパラチド）、Preotact（登録商標）、またはProtelos（登録商標）からなる群より選択される第2の骨増強剤である。
上述したような併用療法は、併用投与（2つ以上の治療剤が、同じまたは別々の製剤に含まれる）、および個別投与を包含し、個別投与の場合、本発明の抗体の投与が追加治療剤の投与に先立って、と同時に、および／または、続いて、行われ得る。一態様において、抗スクレロスチン抗体の投与および追加治療剤の投与は、互いに、約1か月以内、または約1、2、または3週間以内、または約1、2、3、4、5、または6日以内に行われる。
本発明の抗体（および、任意の追加治療剤）は、非経口投与、肺内投与、および経鼻投与、また局所的処置のために望まれる場合は病巣内投与を含む、任意の好適な手段によって投与され得る。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与を含む。投薬は、投与が短期か長期かに一部応じて、例えば、静脈内注射または皮下注射などの注射によるなど、任意の好適な経路によってなされ得る。これらに限定されるものではないが、単回投与または種々の時点にわたる反復投与、ボーラス投与、および、パルス注入を含む、種々の投薬スケジュールが本明細書の考慮の内である。
本発明の抗体は、優良医療規範 (good medical practice) に一致したやり方で、製剤化され、投薬され、また投与される。この観点から考慮されるべきファクターは、治療されているその特定の障害、治療されているその特定の哺乳動物、個々の患者の臨床症状、障害の原因、剤を送達する部位、投与方法、投与のスケジュール、および医療従事者に公知の他のファクターを含む。抗体は、必ずしもそうでなくてもよいが、任意で、問題の障害を予防するまたは治療するために現に使用されている1つまたは複数の剤とともに、製剤化される。そのような他の剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害または治療のタイプ、および上で論じた他のファクターに依存する。これらは通常、本明細書で述べたのと同じ用量および投与経路で、または本明細書で述べた用量の約1から99%で、または経験的／臨床的に適切と判断される任意の用量および任意の経路で、使用される。
疾患の予防または治療のために、本発明の抗体の適切な用量（単独で用いられるときまたは1つまたは複数の他の追加治療剤とともに用いられるとき）は、治療される疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度および経過、抗体が予防的目的で投与されるのか治療的目的で投与されるのか、薬歴、患者の臨床歴および抗体に対する応答、ならびに、主治医の裁量に依存するだろう。抗体は、患者に対して、1回で、または一連の処置にわたって、好適に投与される。疾患のタイプおよび重症度に応じて、例えば、1回または複数回の別々の投与によるにしても連続注入によるにしても、約1μg/kgから15 mg/kg（例えば、0.1mg/kg～10mg/kg）の抗体が、患者に対する投与のための最初の候補用量とされ得る。1つの典型的な1日用量は、上述したファクターに依存して、約1μg/kgから100mg/kg以上まで、幅があってもよい。数日またはより長くにわたる繰り返しの投与の場合、状況に応じて、治療は通常疾患症状の所望の抑制が起きるまで維持される。抗体の1つの例示的な用量は、約0.05mg/kg から約 10mg/kgの範囲内である。よって、約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、もしくは 10mg/kgの1つまたは複数の用量（またはこれらの任意の組み合わせ）が、患者に投与されてもよい。このような用量は、断続的に、例えば1週間毎にまたは3週間毎に（例えば、患者が約2から約20、または例えば約6用量の抗体を受けるように）、投与されてもよい。高い初回負荷用量の後に、1回または複数回の低用量が投与されてもよい。この療法の経過は、従来の手法および測定法によって、容易にモニタリングされる。
上述の製剤または治療的方法のいずれについても、抗スクレロスチン抗体の代わりにまたはそれに追加して、本発明のイムノコンジュゲートを用いて実施してもよいことが、理解されよう。
Ｇ．製品
本発明の別の局面において、上述の障害の治療、予防、および／または診断に有用な器材を含んだ製品が、提供される。製品は、容器、および当該容器上のラベルまたは当該容器に付属する添付文書を含む。好ましい容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、IV溶液バッグなどが含まれる。容器類は、ガラスやプラスチックなどの、様々な材料から形成されていてよい。容器は組成物を単体で保持してもよいし、症状の治療、予防、および／または診断のために有効な別の組成物と組み合わせて保持してもよく、また、無菌的なアクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は、皮下注射針によって突き通すことのできるストッパーを有する静脈内投与用溶液バッグまたはバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも1つの有効成分は、本発明の抗体である。ラベルまたは添付文書は、組成物が選ばれた症状を治療するために使用されるものであることを示す。さらに製品は、(a)第一の容器であって、その中に収められた本発明の抗体を含む組成物を伴う、第一の容器；および、(b)第二の容器であって、その中に収められたさらなる細胞傷害剤またはそれ以外で治療的な剤を含む組成物を伴う、第二の容器を含んでもよい。本発明のこの態様における製品は、さらに、組成物が特定の症状を治療するために使用され得ることを示す、添付文書を含んでもよい。あるいはまたは加えて、製品はさらに、注射用制菌水 (BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、およびデキストロース溶液などの、薬学的に許容される緩衝液を含む、第二の（または第三の）容器を含んでもよい。他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジなどの、他の商業的観点またはユーザの立場から望ましい器材をさらに含んでもよい。
上述の製品のいずれについても、抗スクレロスチン抗体の代わりにまたはそれに追加して、本発明のイムノコンジュゲートを含んでもよいことが、理解されよう。
本明細書で引用したすべての特許文献および非特許文献は、参照により本明細書に組み入れられる。
以下は、本発明の方法および組成物の実施例である。上述の一般的な記載に照らし、種々の他の態様が実施され得ることが、理解されるであろう。
実施例１：組換えヒト、カニクイザル、ラット、およびマウススクレロスチンの発現および精製
組換えヒトスクレロスチン（NCBI GenBankアクセッション番号：NP_079513、配列番号：1）を、FreeStyle293-F細胞株（Thermo Fisher, Carlsbad, CA, USA）を使用して一過性に発現させた。ヒトスクレロスチンを発現する培養上清を、ヘパリンセファロースHPカラム（GE healthcare, Uppsala, Sweden）に適用した後、NaCl勾配で溶出させた。ヒトスクレロスチンを含有する画分をプールし、塩濃度を100mM NaClに調整した。得られた試料を、SPセファロースHP陽イオン交換カラム（GE healthcare, Uppsala, Sweden）に適用し、NaCl勾配で溶出させた。ヒトスクレロスチンを含有する画分をプールし、Superdex 200またはSuperdex 75ゲルろ過カラム（GE healthcare, Uppsala, Sweden）に供した。ヒトスクレロスチンを含有する画分をプールし、-150℃で保存した。
組換えカニクイザルスクレロスチン（配列番号：2）、組換えラットスクレロスチン（NCBI GenBankアクセッション番号：NP_085073.1、配列番号：3）、および組換えマウススクレロスチン（NCBI GenBankアクセッション番号：NP_077769.4、配列番号：4）の発現および精製を、ヒト対応物と全く同じ方式で行った。
実施例２：pH依存的抗スクレロスチン抗体およびバイパラトピック抗体の生成
いずれも当技術分野において公知である抗スクレロスチン抗体mabA（VH；配列番号：7およびVL；配列番号：15）およびmabB（VH；配列番号：23およびVL；配列番号：27）のアミノ酸配列を、抗体にpH依存的抗原結合活性がもたらされるように改変した。mabAおよびmabBの抗体バリアントを以下のように生成した：莫大な数の変異およびそれらの組み合わせを試験し、抗原結合特性を改善するようにいくつかの変異をmabAまたはmabBの可変領域へ導入し、最適化された可変領域mabA_pH1（VH；配列番号：8およびVL；配列番号：16）、mabA_pH2（VH；配列番号：9およびVL；配列番号：17）、mabA_pH3（VH；配列番号：10およびVL；配列番号：18）、mabA_pH4（VH；配列番号：11およびVL；配列番号：19）、mabA_NpH1（VH；配列番号：12およびVL；配列番号：20）、mabA_NpH2（VH；配列番号：13およびVL；配列番号：21）、mabA_NpH3（VH；配列番号：14およびVL；配列番号：22）、mabB_pH1（VH；配列番号：24およびVL；配列番号：28）、mabB_pH4（VH；配列番号：25およびVL；配列番号：29）、およびmabB_pH5（VH；配列番号：26およびVL；配列番号：30）を生成した。抗体バリアントのアミノ酸配列を、表2にまとめている。VHをコードする遺伝子を、野生型ヒトIgG2 CH、hG2（配列番号：77）、ヒトIgG4 CH、hG4（配列番号：108）、または改変ヒトIgG CHバリアント、SG1（配列番号：78）、SG2（配列番号：79）、BS01b（配列番号：80）、およびBS01a（配列番号：81）と組み合わせ、VLをコードする遺伝子を、野生型ヒトCL、SK1（配列番号：82）と組み合わせ、それらの各々を発現ベクターへクローニングした。
（表２）mabAバリアントおよびmabBバリアントのアミノ酸配列
Figure 0007493018000002
薬物動態学的分析のために、抗スクレロスチン抗体SCL0099-rbIgG（VH；配列番号：83およびVL；配列番号：84）を以下のように調製した：12～16週齢のNZWウサギを、ヒトスクレロスチンおよび/またはサルスクレロスチン（50～100μg/投与/ウサギ）によって皮内免疫した。この投与を、2ヶ月にわたり4～5回繰り返した。最終免疫の1週間後、免疫されたウサギから、脾臓および血液を採取した。抗原特異的B細胞を、標識抗原によって染色し、FCMセルソータ（FACS aria III, BD）で選別し、25,000細胞/ウェルのEL4細胞（European Collection of Cell Cultures）および20倍希釈した活性化ウサギT細胞培養上清と共に、1細胞/ウェルの密度で96穴プレートに播種し、7～12日間培養した。EL4細胞は、事前にマイトマイシンC（Sigma, Cat No. M4287）で2時間処理し、3回洗浄した後、使用した。活性化ウサギT細胞培養上清は、ウサギ胸腺細胞を、フィトヘマグルチニンM（Roche, Cat No. 1 1082132-001）、ホルボール12-ミリステート13-アセテート（Sigma, Cat No. P1585）、および2％FBSを含有するRPMI-1640培地中で培養することによって調製した。培養後、B細胞培養上清を、さらなる分析のために回収し、ペレットを凍結保存した。いくつかの抗スクレロスチン抗体を選択し、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、それぞれ、ウサギIgG定常領域（rbIgG）（配列番号：85）およびウサギIgk定常領域（rbIgk）（配列番号：86）と共にクローニングした。次いで、SCL0099-rbIgGを薬物動態学的分析のために選択した。抗スクレロスチン抗体SCL0122-SG110（VH；配列番号：87およびVL；配列番号：88）も、薬物動態学的分析のために調製した。VHおよびVLを、改変ヒトIgG CHバリアント、SG110（配列番号：89）および野生型ヒトCL、SK1（配列番号：82）とそれぞれ組み合わせた。抗スクレロスチン抗体SCL0800-rbIgG（VH；配列番号：90およびVL；配列番号：91）も、薬物動態学的分析のために調製した。VHおよびVLを、ウサギIgG定常領域（rbIgG）（配列番号：85）およびウサギIgk定常領域（rbIgk）（配列番号：86）とそれぞれ組み合わせた。
組換え抗体を、FreeStyle293-F細胞株（Thermo Fisher, Carlsbad, CA, USA）を使用して一過性に発現させた。抗体を発現する培養上清からの精製を、プロテインAを使用する従来の方法によって行った。必要に応じて、ゲルろ過をさらに実施した。
親抗体の対（表3にリストしたAb-AおよびAb-B）を、25mM 2-メルカプトエチルアミン-HCl（2-MEA）の存在下、1:1のモル比で、1×PBS中で混合し、二重特異性抗体を生成するために、37℃で90分間インキュベートした。2-MEAを除去するために、標準的な条件の下でプロテインAを使用することによって、二重特異性抗体産物を精製した。
（表３）バイパラトピック抗体の構築
Figure 0007493018000003
実施例３：BiacoreにおけるpH依存性の評価
抗スクレロスチンバリアントの、ヒトスクレロスチン、カニクイザル（cyno）スクレロスチン、ラットスクレロスチン、またはマウススクレロスチンに対する結合のアフィニティを、Biacore T200機（GE Healthcare）を使用して、pH7.4およびpH5.8において、37℃で測定した。アミンカップリングキット（GE Healthcare）を使用して、抗ヒトFc（GE Healthcare）を、CM4センサーチップのすべてのフローセルに固定化した。すべての抗体および分析物を、20mM ACES、150mM NaCl、1.2mM CaCl2、0.05％Tween 20、0.005％NaN3を含有するpH7.4またはpH5.8のACES緩衝液中で調製した。各抗体を抗ヒトFcによってセンサー表面上に捕捉した。ヒトスクレロスチン、cynoスクレロスチン、ラットスクレロスチン、またはマウススクレロスチンを、pH7.4のアッセイ条件については、1.25nMおよび5nMまたは0.5nMおよび2nMで注入し、pH5.8のアッセイ条件については、5nMまたは2nMで注入した。各サイクルで、3M MgCl2によってセンサー表面を再生させた。Biacore T200 Evaluationソフトウェア、バージョン2.0（GE Healthcare）を使用して、データを処理し、1:1結合モデルにフィッティングさせることによって、結合アフィニティを測定した。
pH依存的相互作用評価を、改変Biacoreアッセイによって判定した。簡単に説明すると、pH7.4における解離相の直後に、pH5.8における付加的な解離相を、Biacoreアッセイに組み込んだ。これは、pH7.4において形成された複合体からの抗体と抗原との間のpH依存的解離を評価するためである。Scrubber 2.0（BioLogic Software）カーブフィッティングソフトウェアを使用して、データを処理し、フィッティングさせることによって、pH5.8緩衝液における解離速度を測定した。
pH7.4およびpH5.8における抗スクレロスチンバリアントの、ヒトスクレロスチン、カニクイザル（cyno）スクレロスチン、ラットスクレロスチン、またはマウススクレロスチンに対する結合のアフィニティ（KD）を、表4に示す。Koff7.4＞＞5.8とは、pH7.4において形成された抗体/抗原複合体についてのpH5.8における解離速度を指す。
（表４）pH7.4およびpH5.8における抗スクレロスチン（SOST）抗体の動力学的パラメーター
Figure 0007493018000004
注：
n.d.は、弱い結合を指し、KDが測定不可能である。
*は、pH7.4における速いkoffを指し、pH5.8におけるkoffが測定不可能である。
#は、遅い解離を指し、pH5.8におけるkoffが測定不可能である。
実施例４：インビトロ中和有効性の評価
Wnt1誘導レポーター遺伝子アッセイ
完全培地を以下のように調製した：50mLのウシ胎児血清（Bovogen, Cat. SFBS-D）、5mLのペニシリン/ストレプトマイシン（Gibco, Cat. 15140-122）、および5mLのMEM非必須アミノ酸（Gibco, Cat. 11140-050）を、500mLのDMEM（Gibco, Cat. 11965-092）に添加した。
完全培地中のHEK293T細胞（ATCC CRL11268）を、トランスフェクションの前日に、1ウェル当たり2×104細胞の密度で（0.05mLの体積で）96穴プレート（PerkinElmer Cat.600568）に播種した。
翌日、抗体の3倍段階希釈物を、400μg/mLから出発して、PBS中で調製した。4μg/mlのスクレロスチン（サル、ラット、またはマウス）を、完全培地中で調製した。60μLの段階希釈抗体および60μLの4μg/mlのスクレロスチンを、ポリプロピレンプレートにおいて混合し、37℃で1時間インキュベートした。抗体と抗原との混合物50μLを培養プレートに添加し、37℃で30分間インキュベートした。培養培地中の抗体およびスクレロスチンの最終濃度は、それぞれ、100μg/mlおよび1μg/mlであった。
以下のプラスミドを、このアッセイにおいて使用した：CAGプロモーターによって駆動されるヒトWnt1（配列番号：5のヌクレオチド配列、配列番号：6のアミノ酸配列）プラスミドであるphWnt1；空CAGベクターであるpCXND3；TCF/LEF応答エレメントによって駆動されるホタルルシフェラーゼプラスミドであるpTCF-Fluc（Promega pGL4.49）；TKプロモーターによって駆動されるウミシイタケルシフェラーゼプラスミドであるpTK-Rluc（Promega pGL4.74）。
プラスミドのトランスフェクションを以下の通りに実施した：固定量のプラスミド、具体的には、対照ウェルについては、0.1ngのpCXND3、50ngのpTCF-Fluc、および50ngのpTK-Rluc、Wnt1処理ウェルについては、0.1ngのphWnt1、50ngのpTCF-Fluc、および50ngのpTK-Rlucを、5mL/ウェルの最終体積のOptiMEM（Invitrogen, Cat. 31985-070）に添加した。1ウェル当たり0.3mLのFuGENE（Promega, Cat. E231A）を、希釈したプラスミドに添加し、十分に混合した。次いで、DNA脂質複合体を細胞に添加し、5％CO2インキュベータにおいて37℃で16時間より長くインキュベートした。各条件を二回ずつ試験した。
翌日、ルシフェラーゼ活性を、Dual-Gloルシフェラーゼアッセイシステム（Promega, Cat. E2940）によって測定した。ルシフェラーゼ活性の測定を、マイクロプレートリーダ、SpectraMax Paradigm（Molecular Devices）によって行った。
ホタル対ウミシイタケルシフェラーゼの比（F/R）を、各ウェルで計算した。スクレロスチン阻害のパーセントを、100×[(F/RMAb - F/RWnt(+)SOST(+))/(F/RWnt(+)SOST(-) - F/RWnt(+)SOST(+))]として定義した。本明細書において、F/RWnt(+)SOST(-)は、Wnt1単独の存在下でのF/R値を表し、これは、スクレロスチンの想定される最大阻害を示す。F/RMabは、評価される抗スクレロスチンモノクローナル抗体、Wnt1、およびスクレロスチンの存在下でのF/R値を表す。F/RWnt(+)SOST(+)は、Wnt1およびスクレロスチンの存在下でのF/R値を表し、これは、スクレロスチンの阻害がないことを示す。
pH依存的抗体（mabA_pH1-SG2、mabA_pH2-SG2、およびmabA_pH3-SG2）は、親mabA-hG2と比較して、同等の中和活性を示した（図1および2）。
pH依存的バイパラトピック抗体（mabB//mabA_pH1-BS01、mabB//mabA_pH2-BS01、およびmabB//mabA_pH3-BS01）は、Wnt1レポーター遺伝子アッセイにおいて、mabA-hG2より優れた特異的活性を示した（図3）。
実施例５：バイパラトピック抗スクレロスチン抗体の免疫複合体形成
抗原取り込みアッセイ
抗体による抗原取り込みの能力を、インビトロでの細胞ベースのアッセイによって評価した。ヒトFcγ受容体IIBおよびヒトFcRnを発現するMDCK細胞を樹立し、10％ウシ胎仔血清（Bovogen, Cat. SFBS-D）、2mM GlutaMAX-1（Invitrogen, Cat. 35050-061）、および1％ペニシリン/ストレプトマイシン（Invitrogen Cat. 15140）を含むEMEM（Sigma, Cat. M5650）中で培養した。
MDCK細胞を、1ウェル当たり5×104細胞の密度で、48穴プレートに播種した。マウススクレロスチンを、pH感受性の蛍光色素pHrodo-Red（Molecular Probes, Cat. P36600）によって、製造業者の説明書に従って標識した。抗体および標識スクレロスチンを、培養培地中1:1のモル比で混合し、37℃で1時間インキュベートした。インキュベーションの直後に、細胞の培養培地を吸引し、抗体抗原混合物に置き換え、その後、細胞培養物を37℃で1.5時間インキュベートした。MDCK細胞を洗浄し、トリプシンによって剥離させた。MDCK細胞を培養培地で洗浄し、PBS中0.2％FBSに懸濁した。内部移行した抗原の量を、フローサイトメトリーによって検出された蛍光強度に基づき測定した。生細胞における平均蛍光強度（MFI）を、FlowJoソフトウェアによって計算した。mabB//mabA_pH1-BS01、mabB//mabA_pH2-BS01、およびmabB//mabA_pH3-BS01は、非pH依存的抗体（mabB//mabA_NpH3-BS01およびmabA_NpH3-SG2）と比較して、増強された抗原取り込みを示した（表5）。これらの結果は、細胞内への複合体の加速された取り込みをもたらす、抗原と大きい免疫複合体を形成する抗体の能力、および細胞内における抗原の加速された放出をもたらす、抗体のpH依存的抗原結合活性によるものと考えられる。
（表５）細胞へ取り込まれた蛍光標識スクレロスチンの量
Figure 0007493018000005
透過型電子顕微鏡法
免疫複合体形成を透過型電子顕微鏡法によって確認した。mabB//mabA-BS01およびヒトスクレロスチンを1:1のモル比で混合し、37℃で1時間インキュベートした。インキュベーションの直後に、混合物を画像化のために1:1000に希釈した。CCDカメラが装備されたFEI Tecnai T12電子顕微鏡を使用して、電子顕微鏡分析を実施した。標本の全体分布を評価するために、各グリッドの画像を複数のスケールで取得した。顕微鏡観察および分析は、Nanoimaging Services, Incにおいて実施した。代表的な画像を図4に示す。2つの抗体分子および2つの抗原分子から構成された複合体が観察された。
サイズ排除クロマトグラフィ
サイズ排除クロマトグラフィ（SEC）を、ACQUITY UPLC H-Classシステム（Waters）において、ACQUITY UPLC Protein BEH SECカラム（450Å、1.7μm、4.6mm×150mm）（Waters）にて、50mM Na2HPO4、300mM NaCl（pH7.0）で、0.3ml/分の流速で実施した。UV検出器（280nm）によって検出を行った。免疫複合体の試料調製のために、各抗体（1μM）をヒトスクレロスチン（1μM）と1:1のモル比で混合し、PBS中で25℃で1時間インキュベートした。mabB//mabA-BS01、mabB//mabA_pH1-BS01、およびmabB//mabA_pH2-BS01についてのクロマトグラムを、それぞれ、図5a、5b、および5cに示す。これらのバイパラトピック抗体は、抗原と混合した時、複数の抗体分子を含有する大きい免疫複合体を形成したことが、クロマトグラムから推測される。
５．４．FcγRIIB結合のBiacore分析
pH7.4における、マウスFcγRIIBに対する抗スクレロスチン抗体/スクレロスチン免疫複合体の結合を、Biacore T200機（GE Healthcare）を使用して、25℃で判定した。すべての抗体およびマウスFcγRIIBを、20mM ACES、250mM NaCl、1.2mM CaCl2、0.05％Tween 20、1mg/ml BSA、1mg/mlカルボキシメチルデキストラン（CMD）、0.005％NaN3を含有するACES（pH7.4）中で調製した。アミンカップリングキット（GE Healthcare）を使用して、抗ヒスチジン抗体（GE Healthcare）を、CM4センサーチップのすべてのフローセルに固定化した。フローセル1を参照フローセルとして、フローセル2上にマウスFcγRIIBを抗ヒスチジン抗体によって捕捉した。マウスFcγRIIB捕捉レベルが400レゾナンスユニット（RU）となるようにした。すべての抗体をすべてのフローセルに100nMで注入した。1:1のモル比で抗体およびヒトスクレロスチンを混合することによって、免疫複合体を調製し、室温で1時間インキュベートした。各サイクルで、10mMグリシンHCl（pH1.5）によってセンサー表面を再生させた。
マウスFcγRIIBに対する抗スクレロスチン抗体または免疫複合体の結合レベルを、結合応答からモニタリングした。結合レベルを、対応するマウスFcγRIIBの捕捉レベルに対して標準化した。結果は、抗体が抗原と免疫複合体を形成した時に、FcγRIIBに対する抗体の結合が大きく増強されたことを示している（図6）。
実施例６：pH依存的抗スクレロスチン抗体（サル）のインビボ薬物動態およびスイーピング効果
カニクイザルを使用したインビボ試験
カニクイザル（PrimetricsまたはBiological Resource Centre, Singapore）に抗スクレロスチン抗体を投与して、抗スクレロスチン抗体のインビボ薬物動態を評価した。使い捨ての注射器を使用して、10mg/kgの用量レベルを橈側皮静脈または伏在静脈へ注射した。投薬開始前ならびに投薬終了から5分後、7時間後、1日後、2日後、3日後、7日後、14日後、21日後、28日後、35日後、42日後、49日後、および56日後のいずれかに、血液を採取した。血液を氷上で直ちに冷やし、4℃、2500×gでの10分間の遠心分離によって血漿を得た。血漿試料を測定まで-80℃の冷凍庫で保存した。使用した抗スクレロスチン抗体は、mabA-hG2、mabA_pH1-SG2、mabA_pH2-SG2、mabA_NpH1-SG2、およびmabA_NpH2-SG2であった。
ELISAによる血漿中の抗スクレロスチン抗体濃度の測定
カニクイザル血漿中の抗スクレロスチン抗体の濃度をELISAによって測定した。抗ヒトIgG固定化プレートを調製するために、抗ヒトIgG k鎖抗体（Antibody Solutions）をNunc-ImmunoPlate MaxiSorp（Nalge Nunc International）に分配し、4℃で一晩放置した。100倍以上希釈した較正曲線試料およびカニクイザル血漿試料を調製した。その後、試料を抗ヒトIgG固定化プレートに分配し、室温で1時間放置した。次いで、HRP標識抗ヒトIgG抗体（SouthernBiotech）を、室温で30分間反応させるために添加し、洗浄を実施した。その後、ABTS ELISA HRP基質（KPL）を添加した。シグナルを、405nmの波長でプレートリーダによって測定した。抗スクレロスチン抗体濃度を、分析ソフトウェアSOFTmax PRO（Molecular Devices）を使用して、較正曲線の応答に基づき計算した。この方法によって測定された経時的な血漿中抗スクレロスチン抗体濃度を図7に示す。結果は、pH依存的抗スクレロスチン抗体mabA_pH1-SG2およびmabA_pH2-SG2が、それぞれ、非pH依存的抗スクレロスチン抗体mabA_NpH1-SG2およびmabA_NpH2-SG2と比較して、延長されたPKプロファイルを有することを示している。
電気化学発光（ECL）による血漿中の全スクレロスチン濃度の測定
カニクイザル血漿中の全スクレロスチンの濃度をECLによって測定した。抗スクレロスチン固定化プレートは、抗スクレロスチン抗体SCL0099-rbIgGを未処理のMULTI-ARRAY 96穴プレート（Meso Scale Discovery）に分配することによって調製し、4℃で一晩放置した。16.7倍以上希釈した較正曲線試料およびカニクイザル血漿試料を調製した。すべてのスクレロスチンが抗体と複合体を形成するように、試料をmabA-hG2溶液（20μg/mL）と混合し、37℃で1時間インキュベートした。その後、試料を抗スクレロスチン固定化プレートに添加し、30℃で1時間インキュベートした。次に、SULFO TAG標識抗ヒトIgG抗体（SouthernBiotech）を添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした。Read Buffer T（×2）（Meso Scale Discovery）をプレートに直ちに添加し、シグナルをSECTOR Imager 2400（Meso Scale Discovery）によって検出した。全スクレロスチン濃度を、分析ソフトウェアSOFTmax PRO（Molecular Devices）を使用して、較正曲線の応答に基づき計算した。この方法によって測定された経時的な血漿中全スクレロスチン濃度を図8に示す。結果は、pH依存的抗スクレロスチン抗体mabA_pH1-SG2およびmabA_pH2-SG2が、それぞれ、非pH依存的抗スクレロスチン抗体mabA_NpH1-SG2およびmabA_NpH2-SG2と比較して、2～3倍、血漿中のスクレロスチン蓄積を低下させる能力を有することを示している。
実施例７：pH依存的抗スクレロスチン抗体（サル）のインビボPD有効性
サルにおける血清骨マーカーの評価
臨床的に使用される骨形成マーカーであるオステオカルシンを、実施例6に記載されたサルにおいて測定した。血清を毎週採取し、市販のELISAキット（Biomedical Technologies Inc., Cat. J64816）を使用して、測定を行った。各血清を、指定の試料緩衝液で10倍希釈した後に測定を行った。オステオカルシンの濃度を、ベースラインからの変化率（％）として示した（抗体投与前の濃度を100％と表示する）。ADA陽性動物は、分析において省略した。この方法によって測定された経時的な血清中オステオカルシン濃度を図9に示す。標準偏差を示すエラーバーと共に、平均値（n＝3～4）を示す。pH依存的抗スクレロスチン抗体mabA_pH1-SG2およびmabA_pH2-SG2は、それぞれ、非pH依存的抗スクレロスチン抗体mabA_NpH1-SG2およびmabA_NpH2-SG2と比較して、より高いオステオカルシンレベルを示した。
実施例８：正常ラットにおけるpH依存的スクレロスチン抗体のインビボ有効性
正常ラットを使用したインビボ試験
pH依存的抗スクレロスチン抗体の有効性を、正常ラットにおいて評価した。10mg/kgの従来の抗体mabA-hG2、3mg/kgおよび10mg/kgの非pH依存的抗体mabA_NpH3-SG2、ならびに1mg/kg、3mg/kg、および10mg/kgのpH依存的抗体mabA_pH3-SG2を、週1回、4週間にわたり、8週齢雌正常ラット（Charles River Laboratories Japan, Inc.）に静脈内（IV）投与した。抗体投与前に週1回頚静脈から血液を採取することによって、血漿試料を得、抗体の血漿レベルをELISAによって測定した。4週間の投与の後、ラットを屠殺し、腰椎および右大腿骨を得た。腰椎および右大腿骨の骨塩密度（BMD）を、DCS-600EX（Aloka）を使用した二重エネルギーX線吸収測定法（DXA）によって評価した。データを平均値+/-SEとして表し、統計的有意性をJMP（Ver.11.2.1, SAS Institute Inc.）を使用して判定した。抗体処理群における、ビヒクル群または同一投薬量の他の抗体群と比較した有意差を検出するために、ウィリアムズ検定またはスチューデントt検定を実施した。
ELISAによる血漿中の抗スクレロスチン抗体濃度の測定
ラット血漿中の抗スクレロスチン抗体の濃度を、実施例6に記載されるようにELISAによって測定した。血漿ラット試料を、100倍以上希釈した。この方法によって測定された経時的な血漿中抗スクレロスチン抗体濃度を図10に示す。抗体の血漿レベルは、用量依存的に増加した。
抗体mabA_pH3-SG2は、3mg/kgおよび10mg/kgで、腰椎および全大腿骨のBMDを有意に増加させた（図11aおよび11b）。抗体mabA_NpH3-SG2は、10mg/kgで腰椎BMDを増加させ、3mg/kgおよび10mg/kgで大腿骨BMDを増加させた。抗体mabA-hG2は、10mg/kgで腰椎および大腿骨のBMDを有意に増加させた。3mg/kgのmabA_pH3-SG2による腰椎および全大腿骨のBMDのレベルは、3mg/kgのmabA_NpH3-SG2によるレベルより有意に高かった。
これらの結果は、正常ラットにおいて、腰椎および大腿骨のBMDに対するpH依存的抗体mabA_pH3-SG2の同化効果が、非pH依存的抗体mabA_NpH3-SG2より高いことを示した。
実施例９：SCIDマウスにおけるpH依存的抗スクレロスチンバイパラトピック抗体のインビボ有効性
SCIDマウスを使用したインビボ試験
バイパラトピック抗スクレロスチンスイーピング抗体の有効性を、SCIDマウスにおいて評価した。従来の抗体mabA-hG2、pH依存的抗体mabA_pH3-SG2、およびバイパラトピックスイーピング抗体mabB//mabA_pH3-BS01を、2mg/kgおよび10mg/kgで、8週齢雌SCIDマウス（Charles River Laboratories Japan, Inc.）へ、週1回、4週間にわたり、静脈内（IV）投与した。抗体投与前に、週1回、頚静脈から血液を採取することによって、血漿試料を得、抗体の血漿中レベルをELISAによって測定した。4週間の投与の後、マウスを屠殺し、腰椎を得た。腰椎の骨塩密度（BMD）を、DCS-600EX（Aloka）を使用した二重エネルギーX線吸収測定法（DXA）によって評価した。データを平均値+/-SEとして表し、統計的有意性をJMP（Ver.11.2.1,SAS Institute Inc.）を使用して判定した。抗体処理群における、ビヒクル群または同一投薬量の他の抗体群と比較した有意差を検出するために、ウィリアムズ検定またはスチューデントt検定を実施した。
ELISAによる血漿中の抗スクレロスチン抗体濃度の測定
マウス血漿中の抗スクレロスチン抗体の濃度を、実施例6に記載されるようにELISAによって測定した。血漿マウス試料を、100倍以上希釈した。この方法によって測定された経時的な血漿中抗スクレロスチン抗体濃度を図12に示す。
電気化学発光（ECL）による血漿中の全スクレロスチン濃度の測定
マウス血漿中の全スクレロスチンの濃度をECLによって測定した。抗スクレロスチン抗体を含有していないマウス血漿試料について、抗スクレロスチン固定化プレートは、抗スクレロスチン抗体SCL0122-SG110を未処理のMULTI-ARRAY 96穴プレート（Meso Scale Discovery）に分配することによって調製し、4℃で一晩放置した。10倍希釈した較正曲線試料およびマウス血漿試料を調製した。その後、試料を抗スクレロスチン固定化プレートに添加し、30℃で1時間インキュベートした。次に、SULFO TAG標識mabA-hG2を添加し、プレートを30℃で1時間インキュベートした。Read Buffer T（×2）（Meso Scale Discovery）をプレートに直ちに添加し、シグナルをSECTOR Imager 2400（Meso Scale Discovery）によって検出した。抗スクレロスチン抗体を含有するマウス血漿試料について、抗スクレロスチン固定化プレートは、抗スクレロスチン抗体SCL0800-rbIgGを未処理のMULTI-ARRAY 96穴プレート（Meso Scale Discovery）に分配することによって調製し、4℃で一晩放置した。500倍希釈した較正曲線試料およびマウス血漿試料を調製した。すべてのスクレロスチンが抗体と複合体を形成するように、試料を、注射された抗体溶液（2μg/mL）と混合し、37℃で1時間インキュベートした。その後、試料を抗スクレロスチン固定化プレートに添加し、30℃で1時間インキュベートした。次に、SULFO TAG標識抗ヒトIgG抗体（SouthernBiotech）を添加し、プレートを30℃で1時間インキュベートした。Read Buffer T（×2）（Meso Scale Discovery）をプレートに直ちに添加し、シグナルをSECTOR Imager 2400（Meso Scale Discovery）によって検出した。全スクレロスチン濃度を、分析ソフトウェアSOFTmax PRO（Molecular Devices）を使用して、較正曲線の応答に基づき計算した。この方法によって測定された経時的な血漿中全スクレロスチン濃度を図13に示す。
抗体mabA-hG2は、10mg/kgで腰椎BMDを有意に増加させた（図14）。抗体mabA_pH3-SG2は、2mg/kgおよび10mg/kgで腰椎BMDを増加させた。抗体mabB//mabA_pH3-BS01は、2mg/kgおよび10mg/kgで腰椎BMDを有意に増加させた。10mg/kgのmabB//mabA_pH3-BS01による腰椎BMDのレベルは、同一投薬量のmabA-hG2およびmabA_pH3-SG2によるレベルより有意に高かった。
これらの結果は、SCIDマウスにおいて、BMDに対するバイパラトピック抗スクレロスチンスイーピング抗体mabB//mabA_pH3-BS01の同化効果が、従来の抗体mabA-hG2またはpH依存的抗体mabA_pH3-SG2の効果より優れていることを示した。
実施例１０：mabAおよびmabBのための共通軽鎖の同定（「各残基シャッフリング」）
治療薬開発のためには、臨床グレードでの大規模製造を可能にするために、分子工学によって二重特異性（バイパラトピック）抗体を最適化する必要があり、単鎖ダイアボディ、タンデムscFv、IgG-scFv、DVD-Ig、CrossMab、二重結合性Fab（Kontermann RE, mAbs 2012; 4:182-197）、および非対称二重特異性IgGを含む、二重特異性抗体のための多様な分子フォーマットが研究されている。非対称二重特異性IgG抗体は、2種の異なる重鎖および2種の異なる軽鎖からなり、したがって、重鎖および軽鎖の10種の異なる組み合わせの混合物の分泌がもたらされ（Klein C et al, mAbs 2012; 4:653-663）、1種の所望の二重特異性抗体を9種のミスペア副産物の混合物から精製することは、ほぼ不可能であるため、非対称二重特異性IgG抗体の組換え作製は、他のフォーマットより困難である。この困難を克服するための工学技術が以前に報告された。第一に、2種の重鎖のパートナーとして使用するための、ファージディスプレイ技術による共通軽鎖の同定は、重鎖および軽鎖の組み合わせの数を、10種から3種（1種のヘテロ二量体二重特異性抗体および2種のホモ二量体単一特異性抗体）へと低下させることができる（Merchant AM et al, Nat Biotechnol 1998; 16:677-681）。第二に、Fcヘテロ二量体化を容易にするためのCH3ドメインの改変によって、ホモ二量体副産物の量を最小化することができる（Klein C et al, mAbs 2012; 4:653-663、Merchant AM et al, Nat Biotechnol 1998; 16:677-681）。
2種の異なる重鎖のための共通軽鎖は、CDRシャッフリングアプローチによって同定され得る（Sampei et al, PLoS One 2013; 8:e57479）。したがって、本発明者らは、図15に示すように、mabAおよびmabBのための効果的な共通軽鎖を得るために、CDRシャッフリングを実施した。評価した軽鎖は、以下の通りである：軽鎖A（配列番号：15）、軽鎖B（配列番号：27）、A-A-B（配列番号：92）、A-B-A（配列番号：93）、A-B-B（配列番号：94）、B-A-A（配列番号：95）、B-A-B（配列番号：96）、およびB-B-A（配列番号：97）。軽鎖バリアントのアミノ酸配列を、表6にまとめている。
これらの軽鎖の各々を、mabAまたはmabBのいずれかのIgG1重鎖と共に発現させた。それぞれ、VH領域をヒトIgG CH、SG1（配列番号：78）と組み合わせ、VL領域をヒトCL、SK1（配列番号：82）と組み合わせた。図16は、SPR分析によって測定された、組換えヒトSOSTに対する結合活性を示す。CDRシャッフリング軽鎖バリアントは、mabAおよびmabBの重鎖と組み合わせられた時、いずれのケースにおいても、抗原と強く結合することができなかったため、いずれも、効果的な共通軽鎖として機能しなかった。
CDRシャッフリングアプローチによって強力な共通軽鎖が同定されなかったため、本発明者らは、各残基シャッフリングと名付けた新規のアプローチを実施した。本発明者らは、図17に示すように、mabA（mabB）内のある1つの位置におけるアミノ酸をmabB（mabA）内の対応する位置におけるアミノ酸に置換した単一のアミノ酸変異をCDRに有する、mabAおよびmabBの軽鎖バリアントのセットを構築した。
これらのmabAおよびmabBの軽鎖バリアントを、それぞれ、mabAおよびmabBのIgG1重鎖と共に発現させた。VH領域をヒトIgG CH、SG1（配列番号：78）と組み合わせ、VL領域をヒトCL、SK1（配列番号：82）と組み合わせた。mabAおよびmabBの軽鎖の各位置の置換の感受性および許容性を評価するために、これらの抗体の抗原結合活性を試験した。同一位置に単一の変異を有するmabAおよびmabBの軽鎖バリアント対の結果に基づき、各位置においてよりよいアミノ酸残基を選択することができ、図18に示すように、選択されたアミノ酸残基を組み合わせることによって、「各残基シャッフリング」バリアントを設計した。候補軽鎖バリアントは、以下の通りである：abL063（配列番号：98）、abL081（配列番号：99）、およびabL083（配列番号：100）。軽鎖バリアントのアミノ酸配列を、表6にまとめている。
各残基シャッフリングアプローチによって設計された軽鎖バリアントの各々を、mabA重鎖またはmabB重鎖のいずれかと共に発現させた。図19は、SPR分析によって測定された、組換えヒトSOSTに対する結合活性を示す。これらの軽鎖バリアントは、2種の重鎖のいずれかと組み合わせられた時、明白に抗原と結合することができたため、効果的な共通軽鎖として機能した。したがって、このアプローチ、各残基シャッフリングは、CDRシャッフリングアプローチが奏功しない時、強力な共通軽鎖を同定するための新規の効果的なアプローチである。
（表６）軽鎖バリアントのアミノ酸配列
Figure 0007493018000006
実施例１１：最適化されたバイパラトピック抗体のpI改変
共通軽鎖を有することは、重鎖および軽鎖の対の数を10種から3種へ低下させ、CH3ドメインの改変は、ヘテロ二量体化重鎖の優先的な分泌を可能にする。しかしながら、大規模生産においてミスペアのホモ二量体化を完全に防止することは、未だ困難である。したがって、ホモ二量体副産物を除去するための下流の精製工程が、医薬品開発のために必須である。イオン交換（IEX）クロマトグラフィは、プロテインA精製工程の後に不純物を除去するための主要な精製過程である。IEXクロマトグラフィによるIgG抗体の保持は、pIとして測定され得る抗体分子の静電気的電荷によって判定される。二重特異性（バイパラトピック）抗体の精製を容易にするために、アフィニティ、pH依存性、および交差反応性などの安定性および抗原結合活性についての他の最適化と平行して、二重特異性抗体とホモ二量体副産物との間のpI差を増加させるように重鎖可変領域におけるpI改変を実施した。最適化の後、陽イオン交換クロマトグラフィ（CIEX）を実施し、二重特異性（ヘテロ二量体）抗体と、2種のホモ二量体副産物との分離を観察した。4種の選択された抗体（amH848/bsH638/abL152、amH848/bsH656/abL152、amH852/bsH638/abL152、およびamH852/bsH656/abL152）についてのクロマトグラムを、図20a～dに示す。本明細書において、amH848（配列番号：101）およびamH852（配列番号：102）は、mabA重鎖バリアントであり、bsH638（配列番号：103）およびbsH656（配列番号：104）は、mabB重鎖バリアントであり、abL152（配列番号：105）は、共通軽鎖バリアントである。重鎖バリアントおよび軽鎖バリアントのアミノ酸配列を、表6および7にまとめている。ホモ二量体抗体を、それぞれ、mabAバリアントについては、IgG1定常領域BS01b（配列番号：80）、mabBバリアントについては、BS01a（配列番号：81）を使用して作製した。二重特異性抗体を、ノブ・イントゥ・ホール変異を有するIgG1定常領域、具体的には、mabAバリアントについてはSG1v14k（配列番号：106）、mabBバリアントについてはSG1v14h（配列番号：107）を使用して作製した。結果は、最適化された二重特異性抗体が、CIEXによって、2種のホモ二量体副産物から完全に分離され得、したがって、製造中のこれらの二重特異性抗体の精製が実現可能であることを示している。
（表７）mabAバリアントおよびmabBバリアントのアミノ酸配列
Figure 0007493018000007
二重特異性抗体（amH848/bsH638/abL152、amH848/bsH656/abL152、amH852/bsH638/abL152、およびamH852/bsH656/abL152）のインビトロ中和有効性を、実施例4に記載されるのと同じ方法を使用して測定した。その結果、これらの抗体は、mabB-hG4より優れた特異的活性を示すことが見出された（図21）。
実施例１２：ヒト抗原とカニクイザル抗原との間の交差反応性の改善
一般に、臨床試験の前に、抗体のPKデータおよびカニクイザルのような霊長類における抗原濃度に対する効果が必要とされる。しかしながら、カニクイザル抗原に対するmabBの結合活性は、ヒト抗原に対する活性よりはるかに弱かった。したがって、本発明者らは、アフィニティおよびpH依存性の最適化と共に、カニクイザル抗原に対するmabBのアフィニティを改善し得る変異を、合理的または包括的にスクリーニングした。本発明者らは、表8に示すように、極めて同様にヒトおよびカニクイザルの抗原と結合するmabBバリアント（bsH638/abL152およびbsH656/abL152）を生成することに成功した。図22a～dは、SPR分析によって測定された、組換えヒトまたはカニクイザルSOSTに対する結合活性を示す。選択された4種の二重特異性（バイパラトピック）抗体（amH848/bsH638/abL152、amH848/bsH656/abL152、amH852/bsH638/abL152、およびamH852/bsH656/abL152）は、表8に示されたパラメーターで、pH7.4においては極めて強力な結合活性を示し、pH5.8においては抗原から迅速に解離し、ヒト抗原とカニクイザル抗原との間に有意差は存在しない。改善されたヒト/カニクイザル交差反応性を有する抗体を使用して、本発明者らは、カニクイザルにおける研究の結果に基づき、はるかに正確に、ヒトにおける抗体PK、抗原濃度、および有効性を予測することができ、これは、臨床試験前に強く望まれることである。
（表８）pH7.4およびpH5.8におけるヒトSOSTおよびcyno SOSTに対する抗スクレロスチン（SOST）抗体の動力学的パラメーター
Figure 0007493018000008
* pH5.8でのkoffのフィッティングが適用不可能な、弱い結合
実施例１３：mabBの免疫原性の低下
mabBは、この抗体がヒト化されていたとしても、ヒトへ投与した時に、抗薬物抗体（ADA）を発生させるリスクを有し得ると推測された。臨床的な適用のためには、抗体の免疫原性のさらなる低下が必要とされた。mabB重鎖のアミノ酸配列（配列番号：23）の位置27～30（FPIK配列）は、非ヒト配列であることが見出され、本発明者らは、この領域を、より低い免疫原性を示すと考えられるヒト生殖細胞系列配列に置換することを目標とした。本発明者らは、他の最適化と共に、この領域をヒト生殖細胞系列配列に置換し、抗体の可能性のある免疫原性を低下させることに成功した。実施例12に記載された二重特異性抗体のmabB重鎖バリアントは、この領域にヒト生殖細胞系列配列を有する（位置27～30、YTLT）。
実施例１４：化学的安定性の改善
皮下注射可能液体製剤および治療用抗体の製造可能性のためには、高い溶解度および安定性のような十分に優れた薬学的特性が必須である。液体製剤は、患者にとってはるかに便利であるが、水性溶液中に保存されたモノクローナル抗体は、抗体の生物学的活性の低下をもたらす、CDR内のアスパラギン残基のアスパラギン酸へのアミド分解およびアスパラギン酸残基の異性化/スクシンイミド形成を受けることが多い。したがって、本発明者らは、他の最適化と平行して、化学的に分解される可能性のあるこれらの残基を他のアミノ酸に置換した。本発明者らは、実施例12に記載されるように、以下の導入された変異によって、二重特異性抗体の安定性を改善することに成功した：mabA重鎖におけるD31S、N52M、N53H、N60K、D98S、D99E、およびmabB重鎖におけるD31H、および共通軽鎖におけるD28G、N31D、N34A（mabA軽鎖配列との比較）。
前述の発明は、明確な理解を助ける目的のもと、実例および例示を用いて詳細に記載したが、本明細書における記載および例示は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書で引用したすべての特許文献および科学文献の開示は、その全体にわたって、参照により明示的に本明細書に組み入れられる。

配列番号：74、128、および130-132の配列を以下に示す：
<210> 74
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial sequence

<220>
<223> HVR-H1 consensus

<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Asp or His

<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa = Thr or His

<400> 74
Xaa Xaa Phe Gln His
1 5

<210> 128
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial sequence

<220>
<223> HVR-H1 consensus

<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Asp or His

<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa = Thr or His

<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa = Gln or Met

<400> 128
Xaa Xaa Phe Xaa His
1 5

<210> 130
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial sequence

<220>
<223> HVR-L1 consensus

<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Arg or Lys

<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa = Gln, His or Glu

<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa = Asp or Gly

<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa = Ile or Val

<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa = Ser or His

<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = Asn, Thr or Asp

<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Tyr or Ala

<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa = Leu or Val

<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Asn or Ala

<400> 130
Xaa Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10

<210> 131
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial sequence

<220>
<223> HVR-L2 consensus

<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Tyr, His or Trp

<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa = Thr, His or Ala

<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa = Arg or Thr

<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa = Leu or Arg

<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa = Leu, Trp or Glu

<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa = Ser or Thr

<400> 131
Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5

<210> 132
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence

<220>
<223> HVR-L3 consensus

<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Gln or His

<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa = Gly or Tyr

<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa = Asp, Ser or His

<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa = Thr or Asp

<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa = Leu or Tyr

<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa = Pro or His

<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = Tyr or Trp

<400> 132
Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr
1 5

Claims (9)

  1. スクレロスチンに結合する単離された二重特異性抗体であって、スクレロスチンの少なくとも2種の異なるエピトープに該抗体が結合するための少なくとも2種の異なる可変領域を含み、かつ酸性pHにおいてよりも中性pHにおいて高いアフィニティでスクレロスチンに結合し、ここで、
    （１）該抗体の2種の重鎖可変領域はそれぞれ、
    配列番号：116のアミノ酸配列を含むHVR-H1と、配列番号：118のアミノ酸配列を含むHVR-H2と、配列番号：120のアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含む重鎖可変領域、および
    配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-H1と、配列番号：119のアミノ酸配列を含むHVR-H2と、配列番号：121のアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含む重鎖可変領域
    を含み、かつ、
    該抗体の軽鎖可変領域は、
    配列番号：111のアミノ酸配列を含むHVR-L1と、配列番号：115のアミノ酸配列を含むHVR-L2と、配列番号：60のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む；
    （２）該抗体の2種の重鎖可変領域はそれぞれ、
    配列番号：116のアミノ酸配列を含むHVR-H1と、配列番号：118のアミノ酸配列を含むHVR-H2と、配列番号：120のアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含む重鎖可変領域、および
    配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-H1と、配列番号：37のアミノ酸配列を含むHVR-H2と、配列番号：121のアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含む重鎖可変領域
    を含み、かつ、
    該抗体の軽鎖可変領域は、
    配列番号：111のアミノ酸配列を含むHVR-L1と、配列番号：115のアミノ酸配列を含むHVR-L2と、配列番号：60のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む；
    （３）該抗体の2種の重鎖可変領域はそれぞれ、
    配列番号：31のアミノ酸配列を含むHVR-H1と、配列番号：118のアミノ酸配列を含むHVR-H2と、配列番号：120のアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含む重鎖可変領域、および
    配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-H1と、配列番号：119のアミノ酸配列を含むHVR-H2と、配列番号：121のアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含む重鎖可変領域
    を含み、かつ、
    該抗体の軽鎖可変領域は、
    配列番号：111のアミノ酸配列を含むHVR-L1と、配列番号：115のアミノ酸配列を含むHVR-L2と、配列番号：60のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む； または
    （４）該抗体の2種の重鎖可変領域はそれぞれ、
    配列番号：31のアミノ酸配列を含むHVR-H1と、配列番号：118のアミノ酸配列を含むHVR-H2と、配列番号：120のアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含む重鎖可変領域、および
    配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-H1と、配列番号：37のアミノ酸配列を含むHVR-H2と、配列番号：121のアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含む重鎖可変領域
    を含み、かつ、
    該抗体の軽鎖可変領域は、
    配列番号：111のアミノ酸配列を含むHVR-L1と、配列番号：115のアミノ酸配列を含むHVR-L2と、配列番号：60のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む、
    単離された二重特異性抗体。
  2. スクレロスチンと免疫複合体を形成し、
    該免疫複合体が、少なくとも2つの抗体分子および少なくとも2つのスクレロスチン分子を含む、
    請求項1に記載の二重特異性抗体。
  3. スクレロスチンに対する阻害活性を有する、請求項1または2に記載の二重特異性抗体。
  4. （１）配列番号：101のVH配列および配列番号：105のVL配列を含む第1の可変領域と、配列番号：103のVH配列および配列番号：105のVL配列を含む第2の可変領域とを含む；
    （２）配列番号：101のVH配列および配列番号：105のVL配列を含む第1の可変領域と、配列番号：104のVH配列および配列番号：105のVL配列を含む第2の可変領域とを含む；
    （３）配列番号：102のVH配列および配列番号：105のVL配列を含む第1の可変領域と、配列番号：103のVH配列および配列番号：105のVL配列を含む第2の可変領域とを含む； または
    （４）配列番号：102のVH配列および配列番号：105のVL配列を含む第1の可変領域と、配列番号：104のVH配列および配列番号：105のVL配列を含む第2の可変領域とを含む、
    請求項1～3のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
  5. 請求項1～4のいずれか一項に記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む、薬学的製剤。
  6. 請求項1～4のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を有効成分として含む、骨関連疾患の治療のための医薬組成物。
  7. 請求項1～4のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を有効成分として含む、スクレロスチンの増加したレベルに関連した疾患または状態を治療するための医薬組成物。
  8. 請求項1～4のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を有効成分として含む、骨形成を増加させかつ/または骨吸収を阻害するための医薬組成物。
  9. 請求項1～4のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を有効成分として含む、骨塩密度を増加させるための医薬組成物。
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