JP6517357B2 - 抗ｔｉｍ３抗体及び使用方法 - Google Patents

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Description

発明の分野
本発明は、抗ＴＩＭ３抗体及びその使用方法に関する。
ＴＩＭ３は、免疫グロブリンスーパーファミリー、及びタンパク質のＴＩＭファミリーに属するヒトタンパク質である。ヒトにおいて、ＴＩＭ−３は、マウスと同様に、Ｔ細胞ならびにマクロファージ及び樹状細胞などの食細胞上に発現される。ＴＩＭ−３のタンパク質リガンド（例えば、ガレクチン−９）への結合は、アポトーシス誘導のメカニズムを介してＴｈ１応答を阻害することができ、従って、末梢耐性の誘導などをもたらす。ｓｉＲＮＡによるヒトＴＩＭ−３の発現の減少又はブロッキング抗体によるヒトＴＩＭ−３の阻害は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞からのインターフェロンアルファの分泌を増加させ、ヒトＴ細胞におけるＴＩＭ−３の阻害的役割を支持した。食細胞において、ＴＩＭ−３は、アポトーシス細胞を認識するための受容体としても機能する。自己免疫疾患患者からの臨床試料の分析は、ＣＤ４陽性細胞においてＴＩＭ−３の発現を示さなかった。特に、多発性硬化症患者の脳脊髄液に由来するＴ細胞クローンでは、ＴＩＭ−３の発現量が低く、ＩＦＮ−γの分泌量が健常人由来のクローンのものよりも高かった（Koguchi K et al., J Exp Med. 203 (2006) 1413-1418）。
ＴＩＭ−３とアレルギー性疾患又は喘息との関係についての報告がある（国際公開第９６／２７６０３号及び国際公開第２００３／０６３７９２号）。
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者からの造血幹細胞及び正常な造血幹細胞のマイクロアレイ分析によれば、ＴＩＭ−３はＡＭＬ幹細胞上に発現され、従って、この分析は、血液悪性腫瘍におけるＴＩＭ−３の関与を示唆していた（Majeti R et al., PNAS, 106 (2009) 3396-3401及び国際公開第２００９／０９１５４７号）。
抗ＴＩＭ−３モノクローナル抗体の例は、抗ヒトＴＩＭ−３ラットモノクローナル抗体（クローン３４４８２３、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓにより製造）及び抗ヒトＴＩＭ−３マウスモノクローナル抗体（クローンＦ３８−２Ｅ２、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓにより製造）を含む。国際公開第２０１３／０６４９０号は、がんを治療しかつ炎症を軽減するための、急速な内部移行を示す抗ＴＩＭ−３抗体及びそのイムノコンジュゲートに関する。米国特許出願公開第２０１２／１８９６１７号は、ヒトＴＩＭ−３発現細胞に関連する疾患において、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ活性）などのより高いエフェクター活性を示す抗ＴＩＭ−３抗体に関する。
本発明は、抗ＴＩＭ３抗体及びそれらの使用方法を提供する。
本発明の一態様は、ＴＩＭ３に結合する単離された抗体であり、ここで抗体は、
・ ３７℃で１２０分後に少なくとも４５％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１５５ＴＭ）についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する。
本発明の別の態様は、そのような抗ＴＩＭ３抗体であり、ここで抗体は、
・ ＴＩＭ３への結合について、配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬを含む抗Ｔｉｍ３抗体と競合し、
・ ヒト及びカニクイザルＴＩＭ３に結合し、
・ イムノコンジュゲートとして、ＴＩＭ３発現細胞に対して細胞傷害活性を示し、
・ インターフェロン−ガンマ放出を誘導する。
一実施態様において、本発明による抗ＴＩＭ３抗体は、モノクローナル抗体である。
一実施態様において、本発明による抗ＴＩＭ３抗体は、ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である。
一実施態様において、本発明による抗ＴＩＭ３抗体は、ＴＩＭ３に結合する抗体断片である。
一実施態様において、本発明による抗ＴＩＭ３抗体は、Ｆａｂ断片である。
一実施態様において、本発明による抗ＴＩＭ３抗体は、
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｃ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｄ）（ａ）（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｅ）（ａ）（ｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｆ）（ａ）（ｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｇ）（ａ）（ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｈ）（ａ）（ｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｉ）（ａ）（ｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｊ）（ａ）（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
本発明は更に、ヒトＴＩＭ３に結合する単離された抗体を提供し、ここで抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む。
本発明は更に、ヒトＴＩＭ３に結合する単離された抗体を提供し、ここで抗体は、
ｉ）配列番号７９のＶＨ配列及び配列番号８０のＶＬ配列、又は
ｉｉ）配列番号８１のＶＨ配列及び配列番号８２のＶＬ配列
を含む。
本発明は更に、ヒトＴＩＭ３に結合する単離された抗体を提供し、ここで抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
本発明は更に、ヒトＴＩＭ３に結合する単離された抗体を提供し、ここで抗体は、
ｉ）配列番号８３のＶＨ配列及び配列番号８４のＶＬ配列、又は
ｉｉ）配列番号８５のＶＨ配列及び配列番号８６のＶＬ配列
を含む。
一実施態様において、本発明による抗ＴＩＭ３抗体は、完全長ＩｇＧ１抗体である。
一実施態様において、本発明による抗ＴＩＭ３抗体は、変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する完全長ＩｇＧ１抗体である。
本発明の別の態様は、本発明による抗体をコードする単離された核酸である。
本発明の別の態様は、本発明の抗体及び細胞傷害性剤を含むイムノコンジュゲートである。
本発明の１つの好ましい実施態様では、細胞傷害性剤がシュードモナス外毒素Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｅｘｏｔｏｘｉｎ Ａ）又はアマトキシン（Ａｍａｔｏｘｉｎ）であるイムノコンジュゲートである。
本発明の別の態様は、本発明による抗体又は本発明によるイムノコンジュゲート及び薬学的に許容される担体を含む薬学的製剤である。
本発明の別の態様は、医薬として使用のための、本発明による抗体又は本発明によるイムノコンジュゲートである。
本発明の別の態様は、がんを治療することにおいて使用のための、本発明による抗体又は本発明によるイムノコンジュゲートである。
本発明の別の態様は、医薬の製造において使用のための、本発明による抗体又は本発明によるイムノコンジュゲートである。
本発明の別の態様は、がんの治療のための医薬の製造において使用のための、本発明による抗体又は本発明によるイムノコンジュゲートである。
本発明の別の態様は、本発明の抗体又は本発明のイムノコンジュゲートの有効量を個体に投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法である。
本発明の抗ＴＩＭ３抗体は、ＴＩＭ３発現がん細胞上での迅速かつ強力な内部移行、イムノコンジュゲートとしての強力な細胞傷害活性（例えば、シュードモナス外毒素又はアメトキシとコンジュゲートした場合）などの非常に有用な特性を示す。従って、それらは、様々ながん、特に白血病及びリンパ腫のような血液腫瘍の治療のための有用な治療薬である。更に、それらは、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）において強力な免疫刺激性サイトカイン放出を示し、従って、免疫刺激性がん療法として有用である。更に、ヒト化抗体バージョンは、親抗体と比較した場合、ＣＤ４ Ｔ細胞への結合及び結合特異性を改善している。
３７℃でのインキュベーション後の、ｈｕＴＩＭ−３を発現するｒｅｃ ＣＨＯＫ１細胞に内部移行された抗ＴＩＭ３抗体Ｔｉｍ３＿００２２（略して＜ＴＩＭ−３＞ Ａｂ（０２２））の時間依存性ＦＡＣＳに基づく内部移行。 ＦＡＣＳに基づく内部移行アッセイの結果は、抗ＴＩＭ３抗体Ｔｉｍ３＿００２２（略して＜ＴＩＭ−３＞ Ａｂ（０２２））は、３７℃でのインキュベーション後に、全長ＩｇＧフォーマットと類似のキネティックを示して、ｈｕＴＩＭ−３を発現するｒｅｃ ＣＨＯＫ１細胞に内部移行されたことを示している。 ＲＰＭＩ−８２２６細胞への抗ＴＩＭ３抗体の結合（抗体指定クローン００１６は抗体Ｔｉｍ３＿００１６を指し、クローン００１６は抗体Ｔｉｍ３＿００１６変異体（抗体Ｔｉｍ３＿００１８）を指し、クローン００２２は抗体Ｔｉｍ３＿００１２２を指す、等）。 プファイファー細胞への抗ＴＩＭ３抗体の結合（抗体指定クローン００１６は抗体Ｔｉｍ３＿００１６を指し、クローン００１６は抗体Ｔｉｍ３＿００１６変異体（抗体Ｔｉｍ３＿００１８）を指し、クローン００２２は抗体Ｔｉｍ３＿００１２２を指す、等）。 抗ＴＩＭ−３ ｍＡｂを用いたＦＡＣＳによる異なる患者のＡＭＬ細胞試料上のＴＩＭ−３の発現レベル。 異なる末梢血単核細胞（単球、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞）に対するＴＩＭ３抗体の結合の直接比較：４Ａ：Ｔｉｍ３＿００１６変異体（抗体Ｔｉｍ３＿００１８）及びヒト化バージョンが結合する陽性細胞の％。４Ｂ：平均蛍光強度−Ｔｉｍ３＿００１６変異体（抗体Ｔｉｍ３＿００１８）及びヒト化バージョンの異なる末梢血単核細胞への結合。４Ｃ：Ｔｉｍ３＿００２８並びにキメラ及びヒト化バージョンが結合する陽性細胞の％。４Ｄ：平均蛍光強度−Ｔｉｍ３＿００２８並びにキメラ及びヒト化バージョンの異なる末梢血単核細胞への結合。発明の実施態様の詳細な説明Ｉ．定義本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「から得られる」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれはアミノ酸配列の変化を含んでもよい。幾つかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。幾つかの実施態様において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。（必要に応じて生殖系列を定義する）。
用語「抗ＴＩＭ３抗体」及び「ＴＩＭ３に結合する抗体」は、ＴＩＭ３を標的とする際に診断薬及び／又は治療剤として抗体が有用であるように、十分な親和性でＴＩＭ３に結合可能である抗体を指す。一実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体の、無関係な、非ＴＩＭ３タンパク質への結合の程度は、例えば、表面プラズモン共鳴アッセイ（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）によって測定されるように、抗体のＴＩＭ３への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、ヒトＴＩＭ３に結合する抗原結合タンパク質は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）のヒトＴＩＭ３への結合に対する結合親和性のＫＤ値を有する。１つの好ましい実施態様において、結合親和性のそれぞれのＫＤ値は、ＴＩＭ３結合親和性についてのヒトＴＩＭ３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ＴＩＭ３−ＥＣＤ）を用いた表面プラズモン共鳴アッセイにおいて決定される。
本明細書における用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、種々の抗体構造を包含し、限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨは、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて、参照抗体のその抗原に対する結合を５０％以上阻害する抗体を指し、逆に参照抗体は、競合アッセイにおいて、抗体のその抗原に対する結合を５０％以上阻害する。例示的な競合アッセイが、本明細書において提供される。
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種に由来し、一方重鎖及び／又は軽鎖の残りは異なる起源又は種に由来する抗体を指す。
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは、更にサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
本明細書で用いられる「細胞傷害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害若しくは阻止し、及び／又は細胞死若しくは細胞破壊を生ずる物質を指す。細胞傷害性剤は、限定されるものではないが、放射性同位体（（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体）：化学療法剤又は薬物（例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）；増殖阻害剤；酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素；抗生物質；小分子毒素等の毒素、又は細菌、真菌、植物若しくは動物由来の酵素活性毒素（それらの断片及び／又は変異体を含む）、及び以下に開示される種々の抗腫瘍剤又は抗がん剤を含む。
１つの好ましい実施態様では、「細胞傷害性剤」がシュードモナス外毒素Ａ（又はその変異体）である。国際公開第２００５０５２００６号、国際公開第２００７０１６１５０号、国際公開第２００７０１４７４３号、国際公開第２００７０３１７４１号、国際公開第２００９３２９５４号、国際公開第２０１１３２０２２号、国際公開第２０１２／１５４５３０号、及び国際公開第２０１２／１７０６１７号、Liu W, et al, PNAS 109 (2012) 11782-11787, Mazor R, et al PNAS 111 (2014) 8571-8576及びAlewine C, et al, Mol Cancer Ther. (2014) 2653-61。１つの好ましい実施態様では、「シュードモナス外毒素Ａ」は、配列番号６９のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号７０のアミノ酸配列を含む（その調製は、Mazor R, et al PNAS 111 (2014) 8571-8576及びAlewine C, et al, Mol Cancer Ther. (2014) 2653-61に記載される）。
別の好ましい実施態様では、「細胞傷害性剤」は、例えば、国際公開第２０１０／１１５６３０号、国際公開第２０１０／１１５６２９号、国際公開第２０１２／１１９７８７号、国際公開第２０１２／０４１５０４号、及び国際公開第２０１４１３５２８２号に記載されているようなアモトキシン（又はその変異体）であり、好ましい変異体は国際公開第２０１２／０４１５０４号（例えば、アマトキシンアミノ酸の６’Ｃ原子を介して、特にアマトキシンアミノ酸の６’Ｃ原子に結合した酸素原子を介してコンジュゲートされ、ここでＴＩＭ３抗体は、尿素部分を介してリンカーによって連結されている）及び国際公開第２０１４１３５２８２号に記載されている。
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」は、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での有効な量を指す。
本明細書において用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために用いられる。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端にまで及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても、存在してなくともよい。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242に記載のように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に四つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、それには、継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれず、突然変異が含まれる場合がある。本明細書には、最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が含まれる。
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリーや他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般的には、配列のサブグループは、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3にあるサブグループである。一実施態様において、ＶＬについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループカッパＩである。一実施態様において、ＶＨについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループＩＩＩである。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの全てを実質的に含み、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。
本明細書で用いられる「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、配列が超可変である抗体可変ドメインの領域（「相補性決定領域」若しくは「ＣＤＲ」）及び／又は構造的に定義されるループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの領域及び／又は抗原に接触する残基（「抗原コンタクト（ａｎｔｉｇｅｎ ｃｏｎｔａｃｔ）」を含有する抗体可変ドメインの領域のそれぞれを指す。一般的に、抗体は、ＶＨに三つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに三つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の計六つのＨＶＲを含む。本明細書において、例示的なＨＶＲは、
（ａ）アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）に生じる超可変ループ（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）；
（ｂ）アミノ酸残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、８９〜９７（Ｌ３）、３１〜３５ｂ（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、及び９５〜１０２（Ｈ３）に生じるＣＤＲ（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ〜３６（Ｌ１）、４６〜５５（Ｌ２）、８９〜９６（Ｌ３）、３０〜３５ｂ（Ｈ１）、４７〜５８（Ｈ２）、及び９３−１０１（Ｈ３）に生じる抗原コンタクト（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）；及び
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６〜５６（Ｌ２）、４７〜５６（Ｌ２）、４８〜５６（Ｌ２）、４９〜５６（Ｌ２）、２６〜３５（Ｈ１）、２６〜３５ｂ（Ｈ１）、４９〜６５（Ｈ２）、９３〜１０２（Ｈ３）、及び９４〜１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組み合わせ
を含む。
特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書では、上掲のＫａｂａｔらに従って番号付けされる。
「イムノコンジュゲート」とは、細胞傷害性剤を含むがそれに限定されない、一又は複数の異種分子にコンジュゲートした抗体である。１つの好ましい実施態様では、イムノコンジュゲートは、１つ又は複数の細胞傷害性剤（好ましくはシュードモナス外毒素Ａ又はアマトキシン）にコンジュゲートされた本明細書に記載の抗ＴＩＭ３抗体である。
「個体」又は「被験体」とは、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。特定の実施態様において、個体又は被検体はヒトである。
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から分離されたものである。幾つかの実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定されるように、９５％又は９９％を上回る純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えばFlatman, S. et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87を参照のこと。
「単離された」核酸とは、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、しかし、その核酸分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。
「抗ＴＩＭ３抗体をコードする分離された核酸」とは、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする一又は複数の核酸分子（又はその断片）を指し、それは、単一のベクター内又は別々のベクター内のそのような核酸分子及び宿主細胞内の一又は複数の場所に存在するそのような核酸分子を含む。
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる変異を含むか又はモノクローナル抗体調製物の製造時に発生し、一般的に少量で存在している可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。従って、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の製造を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されるものではないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含めた様々な技術によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのこれらの方法及びその他の例示的な方法は本明細書に記載されている。
「ネイキッド抗体」とは、異種の部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は、薬学的製剤中に存在してもよい（先行技術がイムノコンジュゲートを有する場合を含む）。
「天然型の抗体」とは、天然に生じる、様々な構造をとる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型のＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している二つの同一の軽鎖と二つの同一の重鎖からなる約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、続いて三つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有する。同様に、各軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、続いて定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、二つの種類のうちの何れかに割り当てることができる。
用語「添付文書」は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに使用され、このような治療製品の使用に関する指示、使用法、用量、投与、併用療法、禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを得るように配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書において、アミノ酸配列同一性％の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、ジェネンテック社によって著作され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。また、ＡＬＩＧＮ−２は、ジェネンテック社（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含めたＵＮＩＸオペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定されて変動しない。
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一であるとして一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して、直前の段落で説明したように得られる。
用語「薬学的製剤」は、その中に含有されている活性成分の生物学的活性が有効になることを可能にするような形態であって、製剤が投与される被験体にとって許容できないほど毒性である追加の成分を含まない調製物を指す。
「薬学的に許容される担体」とは、有効成分以外の薬学的製剤中の成分であって、被験体に対して非毒性である成分を指す。薬学的に許容される担体は、限定されるものではないが、緩衝液、賦形剤、安定剤又は保存剤を含む。
本明細書で使用される用語「ＴＩＭ３」は、特に断りのない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源からの任意の天然型Ｔ細胞免疫グロブリンムチン３（ＴＩＭ３）タンパク質（Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２（ＨＡＶｃｒ−２）、腎臓傷害分子３（ＫＩＭ−３）、ＴＩＭ−３、Ｔｉｍ３、又はＴｉｍ−３としても知られている）を指す。この用語は、「完全長」の未処理のＴＩＭ３ならびに細胞内でのプロセシングから生じるＴＩＭ３の任意の形態を包含する。その用語はまた、ＴＩＭ３の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。例示的なヒトＴＩＭ３のアミノ酸配列を配列番号７７に示す。ＴＩＭ３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のアミノ酸配列を配列番号７８に示す。
ＴＩＭ３は、免疫グロブリンスーパーファミリー、及びタンパク質のＴＩＭファミリーに属するヒトタンパク質である。ヒトにおいて、ＴＩＭ−３は、マウスと同様に、Ｔ細胞ならびにマクロファージ及び樹状細胞などの食細胞上に発現される。ＴＩＭ−３のタンパク質リガンド（例えば、ガレクチン−９）への結合は、アポトーシス誘導のメカニズムを介してＴｈ１応答を阻害することができ、従って、末梢耐性の誘導などをもたらす。ｓｉＲＮＡによるヒトＴＩＭ−３の発現の減少又はブロッキング抗体によるヒトＴＩＭ−３の阻害は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞からのインターフェロンアルファの分泌を増加させ、ヒトＴ細胞におけるＴＩＭ−３の阻害的役割を支持した。食細胞において、ＴＩＭ−３は、アポトーシス細胞を認識するための受容体としても機能する。自己免疫疾患患者からの臨床試料の分析は、ＣＤ４陽性細胞においてＴＩＭ−３の発現を示さなかった。特に、多発性硬化症患者の脳脊髄液に由来するＴ細胞クローンでは、ＴＩＭ−３の発現量が低く、ＩＦＮ−γの分泌量が健常人由来のクローンのものよりも高かった（Koguchi K et al., J Exp Med. 203 (2006) 1413-1418）。
ＴＩＭ−３とアレルギー性疾患又は喘息との関係についての報告がある（国際公開第９６／２７６０３号及び国際公開第２００３／０６３７９２号）。
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者からの造血幹細胞及び正常な造血幹細胞のマイクロアレイ分析によれば、ＴＩＭ−３はＡＭＬ幹細胞上に発現され、従って、この分析は、血液悪性腫瘍におけるＴＩＭ−３の関与を示唆していた（Majeti R et al., PNAS, 106 (2009) 3396-3401及び国際公開第２００９／０９１５４７号）。
抗ＴＩＭ−３モノクローナル抗体の例は、抗ヒトＴＩＭ−３ラットモノクローナル抗体（クローン３４４８２３、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓにより製造）及び抗ヒトＴＩＭ−３マウスモノクローナル抗体（クローンＦ３８−２Ｅ２、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓにより製造）を含む。
本明細書で用いられる場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」など、その文法的変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のため、又は臨床病理の過程において実施され得る。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、疾患の進行（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）を遅延させるか、又は疾患の増悪（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）を遅らせるために使用される。
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。通常、天然型抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、各々が四つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と三つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む類似構造を有する。（例えば、Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007)の９１頁を参照）。抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分である。更に、ある特定の抗原に結合する複数の抗体を、その抗原に特異的に結合するある一つの抗体に由来するＶＨドメイン又はＶＬドメインを用いて単離し、相補的なＶＬドメイン又はＶＨドメインそれぞれのライブラリーをスクリーニングすることができる。例えば、Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628)を参照。
本明細書で使用される用語「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びに導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それが作動可能に連結された核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。
ＩＩ．組成物及び方法
一態様では、本発明は、本発明の選択された抗ＴＩＭ３抗体は、ＴＩＭ３の特定のエピトープに結合し、強力かつ迅速な内部移行及び／又はイムノコンジュゲートとしてがん細胞に対する高い細胞傷害活性を示し、及び／又は強力な免疫刺激性サイトカイン（例えば、インターフェロンγ）放出を示すという知見に部分的に基づいている。特定の実施態様において、ＴＩＭ３に結合する抗体が提供される。本発明の抗体は、例えば、がんの診断又は治療のために有用である。
Ａ．例示的な抗ＴＩＭ３抗体
一態様において、本発明は、ＴＩＭ３に結合する単離された抗体を提供する。特定の実施態様において、抗ＴＩＭ３が提供され、ここで抗体は、
・ ３７℃で１２０分後に少なくとも４５％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１５５ＴＭ）についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）。
・ 一実施態様において、抗体は、３７℃で１２０分後に少なくとも５０％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１５５ＴＭ）についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）。
・ 一実施態様において、抗体は、３７℃で１２０分後に少なくとも５５％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１５５ＴＭ）についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）。
・ 一実施態様において、抗体は、３７℃で２４０分後に少なくとも６０％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１５５ＴＭ）についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）。
・ 一実施態様において、抗体は、３７℃で２４０分後に少なくとも６５％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１５５ＴＭ）についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）。
特定の実施態様において、抗ＴＩＭ３が提供され、ここで抗体は、
・ ＴＩＭ３への結合について、Ｔｉｍ３＿００１６のＶＨ及びＶＬを含む抗Ｔｉｍ３抗体と競合し、
・ ヒト及びカニクイザルＴＩＭ３に結合し、
・ イムノコンジュゲートとして、ＴＩＭ３発現細胞に対して細胞傷害活性を示し（一実施態様において、イムノコンジュゲートは、ＲＰＭＩ−８２２６細胞に対してシュードモナス外毒素Ａコンジュゲートとしての、０．１以下の細胞傷害活性の相対的ＩＣ５０値（実施例１１で測定される）を有する）
・ インターフェロン−ガンマ放出を誘導する（ＭＬＲアッセイにおいて−実施例５を参照）。
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；又は配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、又は六つのＨＶＲを含む抗ＴＩＭ３抗体を提供する。
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；又は配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；又は配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗ＴＩＭ３抗体を提供する。
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、抗ＴＩＭ３抗体を提供する。
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、抗ＴＩＭ３抗体を提供する。
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、抗ＴＩＭ３抗体を提供する。
別の態様において、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；又は配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；又は配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
別の態様において、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１，（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；又は配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；又は配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
別の態様において、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
別の態様において、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
別の態様において、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
一実施態様において、そのような抗ＴＩＭ３抗体は、
ｉ）配列番号７のＶＨ配列及び配列番号８のＶＬ配列；
ｉｉ）配列番号９のＶＨ配列及び配列番号１０のＶＬ配列；
ｉｉｉ）又はｉ）若しくはｉｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体
を含む。
一つの好ましい実施態様において、そのような抗ＴＩＭ３抗体は、
ｉ）配列番号７９のＶＨ配列及び配列番号８０のＶＬ配列、又は
ｉｉ）配列番号８１のＶＨ配列及び配列番号８２のＶＬ配列
を含む。
一つの好ましい実施態様は、配列番号７９のＶＨ配列及び配列番号８０のＶＬ配列を含む、ヒトＴＩＭ３抗体に結合する抗体である。
一つの好ましい実施態様は、配列番号８１のＶＨ配列及び配列番号８２のＶＬ配列を含む、ヒトＴＩＭ３抗体に結合する抗体である。
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、又は六つのＨＶＲを含む抗ＴＩＭ３抗体を提供する。
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、抗ＴＩＭ３抗体を提供する。
別の態様において、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１，（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１，（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
別の態様において、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
一実施態様において、そのような抗ＴＩＭ３抗体は、
ｉ）配列番号１９のＶＨ配列及び配列番号２０のＶＬ配列；
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体
を含む。
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、又は六つのＨＶＲを含む抗ＴＩＭ３抗体を提供する。
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、抗ＴＩＭ３抗体を提供する。
別の態様において、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１，（ｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１，（ｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
別の態様において、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
一実施態様において、そのような抗ＴＩＭ３抗体は、
ｉ）配列番号２７のＶＨ配列及び配列番号２８のＶＬ配列；
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体
を含む。
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、又は六つのＨＶＲを含む抗ＴＩＭ３抗体を提供する。
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、抗ＴＩＭ３抗体を提供する。
別の態様において、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１，（ｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
別の態様において、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
一実施態様において、そのような抗ＴＩＭ３抗体は、
ｉ）配列番号３５のＶＨ配列及び配列番号３６のＶＬ配列；
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体
を含む。
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、又は六つのＨＶＲを含む抗ＴＩＭ３抗体を提供する。
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、抗ＴＩＭ３抗体を提供する。
別の態様において、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１，（ｉｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
別の態様において、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
一実施態様において、そのような抗ＴＩＭ３抗体は、
ｉ）配列番号４３のＶＨ配列及び配列番号４４のＶＬ配列；
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体
を含む。
一つの好ましい実施態様において、そのような抗ＴＩＭ３抗体は、
ｉ）配列番号８３のＶＨ配列及び配列番号８４のＶＬ配列、又は
ｉｉ）配列番号８５のＶＨ配列及び配列番号８６のＶＬ配列
を含む。
一つの好ましい実施態様は、配列番号８３のＶＨ配列及び配列番号８４のＶＬ配列を含む、ヒトＴＩＭ３抗体に結合する抗体である。
一つの好ましい実施態様は、配列番号８５のＶＨ配列及び配列番号８６のＶＬ配列を含む、ヒトＴＩＭ３抗体に結合する抗体である。
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、又は六つのＨＶＲを含む抗ＴＩＭ３抗体を提供する。
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、抗ＴＩＭ３抗体を提供する。
別の態様において、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１，（ｉｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
別の態様において、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
一実施態様において、そのような抗ＴＩＭ３抗体は、
ｉ）配列番号５１のＶＨ配列及び配列番号５２のＶＬ配列；
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体
を含む。
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、又は六つのＨＶＲを含む抗ＴＩＭ３抗体を提供する。
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、抗ＴＩＭ３抗体を提供する。
別の態様において、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１，（ｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
別の態様において、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
一実施態様において、そのような抗ＴＩＭ３抗体は、
ｉ）配列番号５９のＶＨ配列及び配列番号６０のＶＬ配列；
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体
を含む。
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、又は六つのＨＶＲを含む抗ＴＩＭ３抗体を提供する。
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、抗ＴＩＭ３抗体を提供する。
別の態様において、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１，（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
別の態様において、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
一実施態様において、そのような抗ＴＩＭ３抗体は、
ｉ）配列番号６７のＶＨ配列及び配列番号６８のＶＬ配列；
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体
を含む。
上記の実施態様の何れかにおいて、抗ＴＩＭ３抗体はヒト化されている。一実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、上記実施態様の何れかにおけるＨＶＲを含み、更にはアクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。別の実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、上記の実施形態の何れかにあるようなＨＶＲを含み、このようなＨＶＲを含むＶＨ及びＶＬを更に含む。
更なる態様において、本発明は、本明細書で提供される抗ＴＩＭ３抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。例えば、特定の実施態様では、配列番号７のＶＨ配列及び配列番号８のＶＬ配列を含む抗ＴＩＭ３抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供され、又は配列番号９のＶＨ配列及び配列番号１０のＶＬ配列を含む抗ＴＩＭ３抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供され、又は配列番号１９のＶＨ配列及び配列番号２０のＶＬ配列を含む抗ＴＩＭ３抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供され、又は配列番号２７のＶＨ配列及び配列番号２８のＶＬ配列を含む抗ＴＩＭ３抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供され、又は配列番号３５のＶＨ配列及び配列番号３６のＶＬ配列を含む抗ＴＩＭ３抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供され、又は配列番号４３のＶＨ配列及び配列番号４４のＶＬ配列を含む抗ＴＩＭ３抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供され、又は配列番号５１のＶＨ配列及び配列番号５２のＶＬ配列を含む抗ＴＩＭ３抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供され、又は配列番号５９のＶＨ配列及び配列番号６０のＶＬ配列を含む抗ＴＩＭ３抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供され、又は配列番号６７のＶＨ配列及び配列番号６８のＶＬ配列を含む抗ＴＩＭ３抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。
１つの好ましい実施態様において、配列番号７のＶＨ配列及び配列番号８のＶＬ配列を含む抗ＴＩＭ３抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。
１つの好ましい実施態様において、（ＲＰＭＩ−８２２６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１５５ＴＭ）において実施例４に記載の競合アッセイで測定されるように）配列番号７のＶＨ配列及び配列番号８のＶＬ配列を含む抗ＴＩＭ３抗体と、ヒトＴＩＭ３への結合について競合する抗体が提供される。
一態様において、本発明は、
Ａ）（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｂ）（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｃ）（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｄ）（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｅ）（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｆ）（ａ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｇ）（ａ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｈ）（ａ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｉ）（ａ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｊ）（ａ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む抗ＴＩＭ３抗体（例えば、ヒトＴＩＭ３に結合する抗体）を提供する。
別の態様において、本発明は、
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｃ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｄ）（ａ）（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｅ）（ａ）（ｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｆ）（ａ）（ｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｇ）（ａ）（ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｈ）（ａ）（ｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｉ）（ａ）（ｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｊ）（ａ）（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む抗ＴＩＭ３抗体（例えば、ヒトＴＩＭ３に結合する抗体）を提供する。
一態様において、本発明は、
Ａ１）
ｉ）配列番号７のＶＨ配列及び配列番号８のＶＬ配列を含み；
ｉｉ）配列番号９のＶＨ配列及び配列番号１０のＶＬ配列を含み；
ｉｉｉ）又はｉ）若しくはｉｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含む
又はＡ２）
ｉ）配列番号７９のＶＨ配列及び配列番号８０のＶＬ配列を含み；
ｉｉ）配列番号８１のＶＨ配列及び配列番号８２のＶＬ配列を含み；
又はＢ）
ｉ）配列番号１９のＶＨ配列及び配列番号２０のＶＬ配列を含み；
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含み；
又はＣ）
ｉ）配列番号２７のＶＨ配列及び配列番号２８のＶＬ配列を含み；
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含み；
又はＤ）
ｉ）配列番号３５のＶＨ配列及び配列番号３６のＶＬ配列を含み；
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含み；
又はＥ）
ｉ）配列番号４３のＶＨ配列及び配列番号４４のＶＬ配列を含み；
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含み；
又はＦ）
ｉ）配列番号５１のＶＨ配列及び配列番号５２のＶＬ配列を含み；
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含み；
又はＧ１）
ｉ）配列番号５９のＶＨ配列及び配列番号６０のＶＬ配列を含み；
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含み；
又はＧ２）
ｉ）配列番号８３のＶＨ配列及び配列番号８４のＶＬ配列を含み；
ｉｉ）配列番号８５のＶＨ配列及び配列番号８６のＶＬ配列を含み；
又はＨ）
ｉ）配列番号６７のＶＨ配列及び配列番号６８のＶＬ配列を含み；
ｉｉ）又はｉ）の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト化変異体を含む
抗ＴＩＭ３抗体（例えば、ヒトＴＩＭ３に結合する抗体）を提供する。
別の態様において、本発明は、
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｃ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｄ）（ａ）（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｅ）（ａ）（ｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｆ）（ａ）（ｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｇ）（ａ）（ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｈ）（ａ）（ｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｉ）（ａ）（ｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｊ）（ａ）（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む抗ＴＩＭ３抗体（例えば、ヒトＴＩＭ３に結合する抗体）を提供し；
ここで、抗体は以下の特性の１つ以上によって独立して特徴づけられる：
抗ＴＩＭ３抗体が、
・ ３７℃で１２０分後に少なくとも４５％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）
・ 一実施態様において、抗体は、３７℃で１２０分後に少なくとも５０％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）。
・ 一実施態様において、抗体は、３７℃で１２０分後に少なくとも５５％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）。
・ 一実施態様において、抗体は、３７℃で２４０分後に少なくとも６０％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）。
・ 一実施態様において、抗体は、３７℃で２４０分後に少なくとも６５％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）。
別の態様において、本発明は、
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｃ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｄ）（ａ）（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｅ）（ａ）（ｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｆ）（ａ）（ｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｇ）（ａ）（ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｈ）（ａ）（ｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｉ）（ａ）（ｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｊ）（ａ）（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む抗ＴＩＭ３抗体（例えば、ヒトＴＩＭ３に結合する抗体）を提供し；
ここで、抗体は以下の特性の１つ以上によって独立して特徴づけられる：
抗ＴＩＭ３抗体が、
・ ３７℃で１２０分後に少なくとも４５％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）
・ 一実施態様において、抗体は、３７℃で１２０分後に少なくとも５０％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）。
・ 一実施態様において、抗体は、３７℃で１２０分後に少なくとも５５％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）。
・ 一実施態様において、抗体は、３７℃で２４０分後に少なくとも６０％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）。
・ 一実施態様において、抗体は、３７℃で２４０分後に少なくとも６５％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）。
・ ＴＩＭ３への結合について、配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬを含む抗Ｔｉｍ３抗体と競合し、
・ ヒト及びカニクイザルＴＩＭ３に結合し、
・ イムノコンジュゲートとして、ＴＩＭ３発現細胞に対して細胞傷害活性を示し（一実施態様において、イムノコンジュゲートは、ＲＰＭＩ−８２２６細胞に対してシュードモナス外毒素Ａコンジュゲートとしての、０．１以下の細胞傷害活性の相対的ＩＣ５０値（実施例１１で測定される）を有する）。
・ （実施例５に記載の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて）インターフェロン−ガンマ放出を誘導する。
本発明の更なる態様において、上記の任意の実施態様に記載の抗ＴＩＭ３抗体は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含めたモノクローナル抗体である。一実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ（ａｂ’）２断片である。別の実施態様において、抗体は完全長抗体、例えばインタクトなＩｇＧ４抗体又は本明細書で定義される他の抗体クラス若しくはアイソタイプである。
更なる態様において、上記の実施態様の何れかに記載の抗ＴＩＭ３抗体は、以下の第１−７節に記載されているように、任意の特徴を単独で又は組み合わせて組み込むことができる。
１．抗体親和性
特定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数ＫＤを有する。
１つの好ましい実施態様において、ＫＤは、〜１０応答単位（ＲＵ）で固定化抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）を使用する表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ Ｉｎｃ．）が、供給業者の指示書に従い、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化される。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈し、結合したタンパク質の応答単位（ＲＵ）がおよそ１０を達成するように５μｌ／分の流速で注入する。抗原の注入後、未反応基をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。速度論的な測定のために、Ｆａｂの２倍段階希釈液（０．７８ｎＭから５００ｎＭ））を、０．０５％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０ＴＭ）界面活性剤を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中、およそ２５ｕｌ／分の流速にて２５℃で注入する。会合速度（ｋｏｎ又はｋａ）と解離速度（ｋｏｆｆ又はｋｄ）を、単純な１対１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングさせることにより算出する。平衡解離定数ＫＤは比率ｋｄ／ｋａ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）として算出される。例えば、Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881を参照。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を上回る場合、会合速度は、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計（stop-flow equipped spectrophometer）（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズのＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯＴＭ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、２５℃で、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）の増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて測定することができる。
２．抗体断片
特定の実施態様において、本明細書に提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片は、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ，及びｓｃＦｖ断片、及び下記の他の断片を含む。所定の抗体断片の総説については、Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315のPluckthuenを参照；また、国際公開第９３／１６１８５号、並びに米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。
ダイアボディは、二価又は二重特異性でありうる二つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134；及びHolliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照。トリアボディ及びテトラボディもHudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (20039 129-134)に記載される。
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て若しくは一部、又は軽鎖可変ドメインの全て若しくは一部を含む抗体断片である。特定の実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ、Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６（Ｂ１）号を参照）。
抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載するように、インタクトな抗体の分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む。
３．キメラ及びヒト化抗体
特定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体が、例えば米国特許第４８１６５６７号及びMorrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ又はサル等の非ヒト霊長類に由来する可変領域）及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが、親抗体のものから変化されている「クラススイッチされた」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
特定の実施態様において、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持しつつ、ヒトへの免疫原性を低下させるためにヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）（又はその一部）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来する、一又は複数の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、場合によって、ヒト定常領域の少なくとも一部も含み得る。幾つかの実施態様において、ヒト化抗体の幾つかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。
ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633に総説され、更に、Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033；米国特許第５８２１３３７号、第７５２７７９１号、第６９８２３２１号、及び第７０８７４０９号；Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34 （ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）移植を記載する）； Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 （「リサーフェシング」を記載する）； Dall'Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60（「ＦＲシャフリング」を記載する）；並びにOsbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68及び Klimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 （ＦＲシャフリングへの「ガイド付き選択」アプローチを記載する）に記載されている。
ヒト化に用いられ得るヒトフレームワーク領域は、限定されないが、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Sims, M.J. et al.,J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308）；軽鎖又は重鎖の可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワーク領域（例えば、Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289;及びPresta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633を参照）；及びＦＲライブラリスクリーニング由来のフレームワーク領域（例えば、Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684及びRosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618)を参照）を含む。
４．ヒト抗体
特定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的に、van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374及びLonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459に記載されている。
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してインタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することによって調製することができる。このような動物は、典型的には内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するか若しくは該動物の染色体にランダムに組み込まれているヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、通常は不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125を参照。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術を記載している、米国特許第６０７５１８１号及び６１５０５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５７７０４２９号；Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７０４１８７０号及び、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号）も参照のこと。このような動物により生成されるインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、更に改変され得る。
ヒト抗体は、ハイブリドーマベースの方法によって作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が記載されている。（例えば、Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005; Brodeur, B.R. et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63；及びBoerner, P. et al.,J. Immunol. 147 (1991) 86-95を参照）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術から生成されたヒト抗体はまた、Li, J. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562にも記載されている。更なる方法は、例えば米国特許第７１８９８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載する）及びNi, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268 （ヒト−ヒトハイブリドーマを記載する）に記載されている方法を含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）もまた、Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937及びVollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191に記載されている。
ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成することもできる。このような可変ドメイン配列は、次に所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術を以下に記載する。
５．ライブラリー由来の抗体
本発明の抗体は、一又は複数の所望の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、様々な方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体について、そのようなライブラリーをスクリーニングするために、当該技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37に総説され、更に、例えば、McCafferty, J. et al., Nature348 (1990) 552-554; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472；及びLee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132に記載されている。
所定のファージディスプレイ法において、ＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により別々にクローニングされ、ファージライブラリーにおいてランダムに組換えられ、それは、次に、Winter, G. et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片の何れかとして抗体断片を提示する。免疫化された供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要を伴うことなく、免疫原に対して高親和性の抗体を提供する。あるいは、Griffiths, A.D. et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734により記載されるように、ナイーブなレパートリーを（例えばヒトから）クローニングし、任意の免疫化を伴わず、広範囲の非自己抗原及びまた自己抗原への抗体の単一の供給源を提供することができる。最後に、Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388によって記載されるように、幹細胞由来の再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを用いて高度に可変なＣＤＲ３領域をコードし、インビトロでの再配列を達成することにより、ナイーブライブラリーを合成的に作成することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載している特許公報は、例えば、米国特許第５７５０３７３号、及び米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、第２００５／０１１９４５５号、第２００５／０２６６０００号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０１６０５９８号、第２００７／０２３７７６４号、第２００７／０２９２９３６号及び第２００９／０００２３６０を含む。
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片は、本明細書においてヒト抗体又はヒト抗体の断片とみなされる。
６．多重特異性抗体
特定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施態様において、結合特異性のうちの一方はＴＩＭ３に対するものであり、もう一方は任意の他の抗原に対するものである。特定の実施態様において、二重特異性抗体は、ＴＩＭ３の二つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体はまた、ＴＩＭ３を発現する細胞に細胞傷害性剤を局在化させるために使用することもできる。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
多重特異性抗体を作製するための技術は、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現（Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659を参照）及び「ノブ−イン−ホール」（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）操作（例えば、米国特許第５７３１１６８号を参照）を含む。多重特異抗体はまた、抗体のＦｃ−ヘテロ二量体分子を作成するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４号）、２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４６７６９８０号；及びBrennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83を参照）；二重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553を参照）；二重特異性抗体断片を作製するために「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照）；単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374を参照）；及び、例えば、Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作成することができる。
「オクトパス抗体（Ｏｃｔｏｐｕｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」を含む三つ以上の機能的抗原結合部位を有する操作抗体も本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６号を参照）。
本明細書中の抗体又は断片はまた、ＴＩＭ３及び別の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」を含む（例えば、米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号参照）。
本明細書の抗体又は断片はまた、国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２００９／０８０２５２号、国際公開第２００９／０８０２５３号、国際公開第２００９／０８０２５４号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号、及び国際公開第２０１０／１４５７９３号、国際公開第２０１１／１１７３３０号、国際公開第２０１２／０２５５２５号、国際公開第２０１２／０２５５３０号、国際公開第２０１３／０２６８３５号、国際公開第２０１３／０２６８３１号、国際公開第２０１３／１６４３２５号、又は国際公開第２０１３／１７４８７３号に記載される多重特異性抗体を含む。
７．抗体変異体
特定の実施態様において、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましいこともある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することにより、又はペプチド合成により調製することができる。このような修飾は、例えば抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又はそれへの挿入、及び／又はそれの置換を含む。最終構築物が所望の特性、例えば抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせがなされることにより、最終構築物に到達することができる。
ａ）置換、挿入、及び欠失変異体
特定の実施態様において、一つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換型変異誘発の対象となる部位は、ＨＶＲとＦＲを含む。例示的な変化が、「例示的置換」の見出しの下で表１に提供され、アミノ酸側鎖クラスを参照して以下で更に記載される。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表１に示す。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、保持／改善された抗原結合、減少した免疫原性又は改善されたＡＤＣＣ若しくはＣＤＣについてスクリーニングされる。
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アミノ酸は、共通の側鎖特性に従ってグループ化することができる。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの一クラスのメンバーを別のクラスのもと交換することを必要とするであろう。
置換変異体の一つの種類は、親抗体（例えばヒト化又はヒト抗体）の一又は複数の超可変領域残基を置換することを伴う。一般的には、更なる研究のために選択され得られた変異体は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性を減少）を有し、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。例示的な置換型変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるようなファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて、簡便に生成され得る。簡潔に言えば、一又は複数のＨＶＲ残基を変異させ、変異体抗体は、ファージ上に提示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
改変（例えば、置換）は、例えば抗体の親和性を向上させるために、ＨＶＲにおいて行うことができる。このような改変は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされた残基（例えば、Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196を参照）、及び／又はＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）でなされてもよく、得られる変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリーを構築しそこから再選択することによる親和性成熟が、例えば、Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37のＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ， Ｈ．Ｒらに記載されている。親和性成熟の幾つかの実施態様において、多様性が、種々の方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチドを標的とした突然変異誘発）の何れかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが作製される。次いで、ライブラリーは、所望の親和性を持つ抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するための別の方法は、幾つかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４〜６残基）がランダム化されるＨＶＲ指向アプローチを含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発又はモデリングを用いて、特異的に同定することができる。特にＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３が、しばしば標的化される。
特定の実施態様において、置換、挿入又は欠失は、これらの改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、一又は複数のＨＶＲ内で生じ得る。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的変更（例えば本明細書において提供される保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。そのような改変は、ＨＶＲの「ホットスポット」又はＳＤＲの外にある可能性がある。上記変異体ＶＨ又はＶＬ配列の特定の実施態様では、各ＨＶＲは不変であるか、又は、わずか一つ、二つ若しくは三つのアミノ酸置換を含む。
突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085により記載されているように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又はグループ（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、中性又は負に帯電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）により置換される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入され得る。あるいは、又は加えて、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定する。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされるか又は排除され得る。変異体は、それらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
アミノ酸配列挿入は、一残基から百以上の残基を含有するポリペプチド長にわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例は、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体を含む。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を延長させる酵素（例えばＡＤＥＰＴのための）又はポリペプチドに対する抗体のＮ末端又はＣ末端への融合物を含む。
ｂ）Ｆｃ領域変異体
特定の実施態様では、一又は複数のアミノ酸修飾を、本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入することにより、Ｆｃ領域変異体が生成される。Ｆｃ領域変異体は、一又は複数のアミノ酸位置でアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含み得る。
エフェクター機能が低下した抗体は、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの一又は複数の置換を伴うものを含む（米国特許第６７３７０５６号）。このようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の二つ以上における置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。
ＦｃＲへの改善又は減少した結合を有する特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604を参照）。
一実施態様において、本発明のそのような抗体は、変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するか、又は変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを有するＩｇＧ１である。別の実施態様においては、変異Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅ、又はＳ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを有するＩｇＧ４である（ＫａｂａｔらのＥＵインデックスに従う番号付け、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991）。
半減期が延長され、胎児への母性ＩｇＧの移送を担う（Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593、及びKim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434）新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合性が改善された抗体は、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一又は複数の置換を伴うＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４のうちの一又は複数における置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換（米国特許第７３７１８２６号）を含むものを含む。
また、Ｆｃ領域変異体の他の例に関する、Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740；米国特許第５６４８２６０号；米国特許第５６２４８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照。
ｄ）システイン操作抗体変異体
特定の実施態様において、抗体の一又は複数の残基がシステイン残基で置換されているシステイン操作抗体、例えば「チオＭＡｂ」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施態様において、置換される残基は抗体の接近可能な部位で生じる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基がそれにより抗体の接近可能な部位に配置され、抗体を、他の部分（例えば薬物部分又はリンカー−薬物部分）にコンジュゲートするために使用してイムノコンジュゲートを作製してもよい（本明細書において更に記載する通り）。特定の実施態様では、以下の残基のうちの何れかの一又は複数がシステインで置換される：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。
ｄ）抗体誘導体
特定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られており、容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含むように更に修飾することができる。抗体の誘導体化に適した部分は、限定されるものではないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーの何れか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにそれらの混合物を含む（ただし、これらに限定されない）。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のために製造上の利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に付着するポリマーの数は変動し得るが、一を超えるポリマーが付着する場合、それらは同じか又は異なる分子であってよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は型は、限定されるものではないが、改善されるべき抗体の特定の特性又は機能、その抗体誘導体が定まった条件下で治療に使用されるかどうかを含む考慮事項に基づいて決定することができる。
別の実施態様において、放射線への曝露によって選択的に加熱されてもよい非タンパク質部分と抗体とのコンジュゲートが提示される。一実施態様において、非タンパク質部分は、カーボンナノチューブである（Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605）。放射線は、任意の波長であってよく、通常の細胞に害を与えないが、抗体−非タンパク質部分の近位細胞が死滅する温度まで非タンパク質部分を加熱する波長を含むが、これに限定されない。
Ｂ．組換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号に記載されているような組み換え方法及び組成物を用いて製造される。一態様において、本明細書に記載の抗ＴＩＭ３抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。更なる実施態様では、そのような核酸を含む一又は複数のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施態様では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一実施態様では、宿主細胞は以下を含む（例えば、以下で形質転換されている）：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクターと、抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第ニベクター。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様において、上述のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することと、任意選択的に宿主細胞（又は宿主細胞培地）から抗体を回収することとを含む、抗ＴＩＭ３抗体を作製する方法が提供される。
抗ＴＩＭ３抗体の組換え生産のために、例えば上述のような、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために一又は複数のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離することができ、一般的な手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適した宿主細胞は、本明細書に記載の原核生物細胞又は真核細胞を含む。例えば、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は、細菌内で産生され得る。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号、同第５７８９１９９号及び同第５８４０５２３号を参照。（また、大腸菌における抗体断片の発現について記載している、Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254も参照のこと）。発現の後、抗体を、可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離し、更に精製することができる。
原核生物に加えて、グリコシル化経路が「ヒト化」されていて、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす真菌株及び酵母株を含めた糸状菌又は酵母などの真核微生物も、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主である。Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; and Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215を参照のこと。
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）からも得られる。無脊椎動物細胞の例は、植物細胞及び昆虫細胞を含む。多数のバキュロウイルス株が同定されており、これらは特にスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。
植物細胞培養物を宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号、及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照のこと。
脊椎動物細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適応された哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（例えば、Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74）に記載された２９３細胞又は２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスのセルトリ細胞（例えば、Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252に記載されるＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頚がん細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）；例えばMather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ− ＣＨＯ細胞（Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、並びにＹ０、ＮＳ０、及びＳｐ２／０等の骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268を参照のこと。
Ｃ．アッセイ
本明細書で提供される抗ＴＩＭ３抗体は、当技術分野で周知の種々のアッセイによって同定され、その物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされ、又は特徴付けされ得る。
１．結合アッセイ及びその他のアッセイ
一態様において、本発明の抗体を、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットなどの既知の方法によって、その抗原結合活性について試験する。
別の態様において、競合アッセイを用いて、ＴＩＭ３への結合についてＴｉｍ３＿００１６（配列番号７のＶＨ配列及び配列番号８のＶＬ配列を含む）と（又は、同一の６つのＨＶＲを有するＴｉｍ３＿００１６変異体抗体Ｔｉｍ３＿００１８と）競合する抗体を同定することができる。従って本発明の一実施態様は、配列番号７のＶＨ配列の３つ全てのＨＶＲ及び配列番号８のＶＬ配列の３つ全てのＨＶＲを含む抗ＴＩＭ３抗体と、ヒトＴＩＭ３への結合について競合する抗体である。特定の実施態様において、そのような競合する抗体は、抗ＴＩＭ３抗体Ｔｉｍ３＿００１６によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法が、Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Humana Press, Totowa, NJ (1996) (Humana Press, Totowa, NJ)に掲載のMorris, G.E. （編）、「Epitope Mapping Protocols」に示されている。
例示的競合アッセイにおいて、固定化ＴＩＭ３（−ＥＣＤ）が、ＴＩＭ３に結合する第１標識抗体（例えば、抗ＴＩＭ３抗体ａＴｉｍ３＿００１６）及びＴＩＭ３への結合について第１抗体と競合するその能力について試験されている第２非標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第２抗体はハイブリドーマ上清に存在してもよい。対照として、固定化したＴＩＭ３を、第１標識抗体を含むが第２非標識抗体は含まない溶液中でインキュベートする。ＴＩＭ３への第１抗体の結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰な非結合抗体を除去し、固定化したＴＩＭ３に結合した標識の量を測定する。固定化したＴＩＭ３に結合した標識の量が対照試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第２抗体がＴＩＭ３への結合に関して第１抗体と競合していることを示している。Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988)を参照。別の例示的な競合アッセイについては、実施例４を参照されたい。
２．活性のアッセイ
一態様において、アッセイは、生物学的活性を有するその抗ＴＩＭ３抗体を同定するために提供される。生物学的活性は、例えばＴＩＭ３受容体内部移行、又はサイトカイン放出、又は細胞傷害活性（毒素に結合したイムノコンジュゲートとして）、又はカニクイザル結合交差反応性、並びに異なる細胞型への結合を含み得る。また、インビボ及び／又はインビトロでそのような生物学的活性を有する抗体も提供される。
特定の実施態様において、実施例５から１５に記載のように、本発明の抗体はそのような生物学的活性について試験される。
Ｄ．イムノコンジュゲート（がんのみ、又は標的用に改変）
本発明はまた、本明細書において一又は複数の細胞傷害性剤、例えば化学療法剤若しくは薬物、増殖阻害剤、毒素（例えばタンパク質毒素、細菌、真菌、植物若しくは動物起源の酵素的に活性な毒素又はその断片）又は放射性同位体にコンジュゲートした抗ＴＩＭ３抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
一実施態様において、イムノコンジュゲートは、その中の抗体が、メイタンシノイド（米国特許第５２０８０２０号、第５４１６０６４号、及び欧州特許（ＥＰ）第０４２５２３５号を参照）；アウリスタチン、例えばモノメチルアウリスタチン薬物部分であるＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（米国特許第５６３５４８３号、第５７８０５８８号、第７４９８２９８号を参照）；ドラスタチン；カリケアマイシン又はその誘導体（米国特許第５７１２３７４号、米国特許第５７１４５８６号、米国特許第５７３９１１６号、米国特許第５７６７２８５号、米国特許第５７７０７０１号、米国特許第５７７０７１０号、米国特許第５７７３００１号、及び米国特許第５８７７２９６号； Hinman, L.M. et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342；及びLode, H.N. et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928を参照）；アントラサイクリン、例えばダウノマイシン又はドキソルビシン（Kratz, F. et al., Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523; Jeffrey, S.C. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362; Torgov, M.Y. et al., Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721; Nagy, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834; Dubowchik, G.M. et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532; King, H.D. et al., J. Med. Chem. 45 (20029 4336-4343；及び米国特許第６６３０５７９号を参照）；メトトレキサート；ビンデシン；タキサン、例えばドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル（ｌａｒｏｔａｘｅｌ）、テセタキセル（ｔｅｓｅｔａｘｅｌ）、及びオルタタキセル（ｏｒｔａｔａｘｅｌ）；トリコテセン；及びＣＣ１０６５を含む（ただし、これらに限定されない）一又は複数の薬物にコンジュゲートしている抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。
他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サポンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、及びトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）を含む（ただし、これらに限定されない）酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートしている、本明細書に記載の抗体を含む。
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、シュードモナス外毒素Ａ（又はその変異体）にコンジュゲートした本明細書に記載の抗体を含む。シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）は、望ましくない細胞、例えばがん細胞の増殖を破壊又は阻害するのに有効であり得る細胞傷害活性を有する細菌性毒素である。従って、ＰＥは、例えばがんなどの疾患を治療又は予防するために有用であり得る。幾つかの脱免疫化シュードモナス外毒素（ＰＥ）が当該分野で公知である。ドメインＩＩ欠損バージョン（例えばＰＥ２４）は、免疫原性がより低く、ドメインＩＩを含むＰＥ３８と比較してより少ない副作用（例えば、毛細血管漏出症候群及び肝毒性）を引き起こす可能性がある。異なるフューリン切断可能リンカーをＰＥ２４変異体に用いることができる。そのような脱免疫化シュードモナス外毒素（ＰＥ）は、例えば、国際特許出願公開の国際公開第２００５０５２００６号、国際公開第２００７０１６１５０号、国際公開第２００７０１４７４３号、国際公開第２００７０３１７４１号、国際公開第２００９３２９５４号、国際公開第２０１１３２０２２号、国際公開第２０１２／１５４５３０号、及び国際公開第２０１２／１７０６１７号に記載されている。本明細書で使用される用語「シュードモナス外毒素Ａ」は、野生型及び脱免疫化シュードモナス外毒素（ＰＥ）を包含する。１つの好ましい実施形態において、「シュードモナス外毒素Ａ」とは、例えば、限定されないが、国際公開第２００９／３２９５４号、国際公開第２０１１／３２０２２号、国際公開第２０１２／１５４５３０号、国際公開第２０１２／１７０６１７号、Liu W, et al, PNAS 109 (2012) 11782-11787, Mazor R, et al PNAS 111 (2014) 8571-8576及びAlewine C, et al, Mol Cancer Ther. (2014) 2653-61に記載されるような脱免疫化ＰＥ２４変異体を指す。１つの好ましい実施態様では、「シュードモナス外毒素Ａ」は、配列番号６９のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号７０のアミノ酸配列を含む（その調製は、Mazor R, et al PNAS 111 (2014) 8571-8576及びAlewine C, et al, Mol Cancer Ther. (2014) 2653-61に記載される）。
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、アマトキシン又はその変異体にコンジュゲートした本明細書に記載される抗体を含む。アマトキシン（α−アマニチン、β−アマニチン、アマニン）は、８アミノ酸からなる環状ペプチドである。それらはタマゴテングタケ（Ａｍａｎｉｔａ ｐｈａｌｌｏｉｄｅｓ）キノコから単離することができ、又は合成によって構成要素から調製することができる。アマトキシンは、哺乳動物細胞のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＩＩを特異的に阻害し、これにより、細胞の転写及びタンパク質生合成が影響を受ける。細胞における転写の阻害は、成長及び増殖の停止を引き起こす。共有結合していないが、アマニチンとＲＮＡポリメラーゼＩＩとの複合体は非常に緊密である（ＫＤ＝３ｎＭ）。酵素からのアマニチンの解離は、影響を受けた細胞の回収を見込みなくさせる非常に遅いプロセスである。細胞内で転写の阻害があまりに長く続くであろう場合、α−アマニチンと共にインキュベートしたＪｕｒｋａｔ細胞の培養物において示されるように、又は、はるかに高い効率で、膜透過性Ｏ−メチル−α−アマニチンオレイン酸と共にインキュベートしたＪｕｒｋａｔ細胞において示されるように、細胞はプログラムされた細胞死（アポトーシス）を受ける。好ましい一実施態様では、本明細書で使用される用語「アマトキシン」は、例えば、国際公開第２０１０／１１５６３０号、国際公開第２０１０／１１５６２９号、国際公開第２０１２／１１９７８７号、国際公開第２０１２／０４１５０４号、及び国際公開第２０１４１３５２８２号に記載されるようなアルファ−アマニチン又はその変異体を指し、好ましい変異体は国際公開第２０１２／０４１５０４号（例えば、アマトキシンアミノ酸の６’Ｃ原子を介して、特にアマトキシンアミノ酸の６’Ｃ原子に結合した酸素原子を介してコンジュゲートされ、ここでＴＩＭ３抗体は、尿素部分を介してリンカーによって連結されている）及び国際公開第２０１４１３５２８２号に記載されている。
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートして放射性コンジュゲートを形成する、本明細書に記載の抗体を含む。種々の放射性同位体が、放射性コンジュゲートの製造のために入手可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体を含む。検出のために用いられる場合、放射性コンジュゲートは、シンチグラフ検査用の放射性原子、例えばＴＣ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ＭＲＩとしても知られている）のためのスピン標識、例えば再びヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含む。
抗体と細胞傷害性剤とのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダート ＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン ２，６−ジイソシアネート）、及び二活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta, E.S. et al., Science 238 (1987) 1098-1104に記載のようにして調製することができる。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照。リンカーは、細胞内で細胞傷害性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari, R.V. et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131；米国特許第５２０８０２０号）が使用され得る。
本明細書に記載のイムノコンジュゲート又はＡＤＣは、限定されるものではないが、市販（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ．、Ｕ．Ｓ．Ａより）のＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）等の架橋試薬を用いて調製したものが特に考えらえる。
Ｅ．診断及び検出のための方法並びに組成物
特定の実施態様において、本明細書において提供される抗ＴＩＭ３抗体のいずれもが、生物学的試料中のＴＩＭ３の存在を検出するために有用である。本明細書で使用する「検出（する）」という用語は、定量的又は定性的検出を包含する。特定の実施態様において、生物学的試料は、ＡＭＬ幹がん細胞などの細胞又は組織を含む。
一実施態様において、診断又は検出方法における使用のための抗ＴＩＭ３抗体が提供される。更なる態様において、生物学的試料中におけるＴＩＭ３の存在を検出する方法が提供される。特定の実施態様において、方法は、生物学的試料を、抗ＴＩＭ３抗体のＴＩＭ３への結合を許容する条件下において、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体と接触させること、及び抗ＴＩＭ３抗体とＴＩＭ３との間に複合体が形成されたかどうかを検出することを含む。そのような方法は、インビトロ法又はインビボ法である。一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体は、抗ＴＩＭ３抗体を用いた療法に適した被験体を選択するために使用され、例えばＴＩＭ３は患者の選択のためのバイオマーカーである。
本発明の抗体を使用して診断され得る例示的な障害には、ＡＭＬ又は多発性骨髄腫（ＭＭ）のような異なる形態の血液がんを含むがんが含まれる。
特定の実施態様において、標識された抗ＴＩＭ３抗体が提供される。標識は、限定されないが、（例えば、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、放射性標識などの）直接検出される標識又は部分、並びに、例えば、酵素反応又は分子間相互作用を介して間接的に検出される酵素又はリガンドのような部分が含まれる。このような標識の例には、限定されないが、ラジオアイソトープ３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシェフェラーゼ、例えばホタルルシェフェラーゼ及び細菌ルシェフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシェフェリン、２，３−ジヒドロフタルジネジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼを、色素前駆体、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定な遊離ラジカルなどを酸化するために過酸化水素を利用する酵素とカップリングさせたもの、などが含まれる。
Ｆ．薬学的製剤
本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体の薬学的製剤は、所望の程度の純度を有するこのような抗体を、一又は複数の任意選択的な薬学的に許容される担体と混合することによって（RemingtonのPharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)）、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態に調製される。通常、薬学的に許容される担体は、用いられる用量及び濃度で受容者に対して非毒性であり、限定されるものではないが、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えばオクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール、メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及びその他の糖質；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体は、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）などの介在性薬物分散剤、例えばｒｈｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。特定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、ｒｈｕＰＨ２０を含み、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの一又は複数の更なるグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
例示的な凍結乾燥抗体製剤が米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものを含み、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
本明細書中の製剤はまた、治療される特定の適応症に必要な一を超える活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含有してもよい。例えば、［抗ＴＩＭ３抗体と組み合わせることができる薬物のリスト］］を更に提供することが望ましい場合がある。そのような活性成分は、意図された目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。
活性成分は、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョン中において、例えばコアセルベーション技術又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルのそれぞれの中に封入されていてもよい。そのような技術は、RemingtonのPharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性調製物の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、このマトリックスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。
インビボ投与に使用される製剤は、一般的に滅菌されていなければならない。滅菌状態は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、容易に達成される。
Ｇ．治療的方法及び組成物
本明細書において提供される抗ＴＩＭ３抗体（又は抗原結合タンパク質）又は抗ＴＩＭ３抗体（又は抗原結合タンパク質）のイムノコンジュゲートの何れかが、治療方法において使用され得る。
一態様において、医薬としての使用のための、抗ＴＩＭ３抗体又は細胞傷害性剤にコンジュゲートした抗ＴＩＭ３抗体のイムノコンジュゲートが提供される。更なる態様において、がんを治療することにおいて使用のための、抗ＴＩＭ３抗体又は細胞傷害性剤にコンジュゲートした抗ＴＩＭ３抗体のイムノコンジュゲートが提供される。特定の実施態様において、治療の方法において使用のための、抗ＴＩＭ３抗体又は細胞傷害性剤にコンジュゲートした抗ＴＩＭ３抗体のイムノコンジュゲートが提供される。特定の実施態様において、本発明は、有効量の抗ＴＩＭ３抗体又は細胞傷害性剤にコンジュゲートした抗ＴＩＭ３抗体のイムノコンジュゲートを個体に投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法において使用のための、抗ＴＩＭ３抗体又は細胞傷害性剤にコンジュゲートした抗ＴＩＭ３抗体のイムノコンジュゲートを提供する。
更なる実施態様において、本発明は、がん細胞においてアポトーシスを誘導すること／又はがん細胞増殖を阻害することにおいて使用のための、抗ＴＩＭ３抗体又は細胞傷害性剤にコンジュゲートした抗ＴＩＭ３抗体のイムノコンジュゲートを提供する。特定の実施態様において、本発明は、がん細胞においてアポトーシスを誘導するために／又はがん細胞増殖を阻害するために、有効量の抗ＴＩＭ３抗体又は細胞傷害性剤にコンジュゲートした抗ＴＩＭ３抗体のイムノコンジュゲートを個体に投与することを含む、個体において、がん細胞においてアポトーシスを誘導する／又はがん細胞増殖を阻害する方法において使用のための、抗ＴＩＭ３抗体又は細胞傷害性剤にコンジュゲートした抗ＴＩＭ３抗体のイムノコンジュゲートを提供する。
更なる実施態様において、本発明は、免疫刺激剤として／又はＩＦＮガンマ分泌を刺激するために使用のための抗ＴＩＭ３抗体を提供する。特定の実施態様において、本発明は、免疫刺激のための／又はＩＦＮガンマ分泌を刺激するための有効量の抗ＴＩＭ３抗体を個体に投与することを含む、個体における免疫刺激の方法／又はＩＦＮガンマ分泌を刺激する方法における使用のための抗ＴＩＭ３抗体を提供する。
上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、好ましくはヒトである。更なる実施態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における、抗ＴＩＭ３抗体又は細胞傷害性剤にコンジュゲートした抗ＴＩＭ３抗体のイムノコンジュゲートの使用を提供する。一実施態様において、医薬はがんの治療のためのものである。更なる実施態様において、医薬は、がんを有する個体に医薬の有効量を投与することを含む、がんを治療する方法における使用のためのものである。更なる実施態様において、医薬は、がん細胞においてアポトーシスを誘導するため／又はがん細胞増殖を阻害するためのものである。更なる実施態様において、医薬は、がん細胞におけるアポトーシスを誘導するための／又はがん細胞増殖を阻害するための医薬の有効量を個体に投与することを含む、がんに罹患している個体において、がん細胞においてアポトーシスを誘導する／又はがん細胞増殖を阻害する方法における使用のためのものである。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、ヒトであってよい。
更なる態様において、本発明は、がんを治療するための方法を提供する。一実施態様において、本方法は、がんを有する個体に、抗ＴＩＭ３抗体の有効量を投与することを含む。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、ヒトであってよい。
更なる態様において、本発明は、がんに罹患している個体において、がん細胞においてアポトーシスを誘導するため／又はがん細胞増殖を阻害するための方法を提供する。一実施態様において、該方法は、がんに罹患している個体において、がん細胞においてアポトーシスを誘導するため／又はがん細胞増殖を阻害するために、抗ＴＩＭ３抗体又は細胞傷害性剤にコンジュゲートした抗ＴＩＭ３抗体のイムノコンジュゲートの有効量を個体に投与することを含む。
一実施態様において、「個体」はヒトである。
更なる態様において、本発明は、例えば上述の任意の治療方法における使用のための、本明細書で提供される任意の抗ＴＩＭ３抗体を含む薬学的製剤を提供する。一実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される任意の抗ＴＩＭ３抗体及び薬学的に許容される担体を含む。
本発明の抗体（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内を含めた任意の適切な手段により投与することができ、また、局所治療が望まれるのであれば、病巣内投与であってもよい。非経口点滴は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与を含む。投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存して、任意の適切な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射により行うことができる。限定されないが、様々な時間点にわたる、単一又は複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投薬スケジュールが本明細書において考慮される。
本発明の抗体は、医療実施基準に一致した様式で製剤化され、投薬され、投与される。こうした観点において考慮すべき因子として、治療される特定の疾患、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床症状、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与計画、及び医師に既知のその他の因子が挙げられる。抗体は、必要ではないが任意で、問題の障害の予防又は治療のために現在使用されている一又は複数の薬剤とともに製剤化される。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療の種類、及び上記以外の因子によって決まる。これらは一般的には、本明細書に記載されているのと同じ用量及び投与経路で、又は本明細書に記載の用量の約１から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路で使用される。
疾患の予防又は治療のために、本発明の抗体の用量は、（単独で又は一若しくは複数の追加の治療剤との併用で用いられる場合）治療される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体の投与が予防的目的か治療的目的か、治療歴、患者の病歴及び抗体に対する応答、並びに主治医の裁量に依存するであろう。本発明の抗体は、単回又は一連の治療にわたって患者へ適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体又が患者への投与のための初期候補用量となり得る。一つの典型的な１日用量は、上記の因子に応じて約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲であろう。数日以上にわたる反復投与に関しては、状態に応じて、治療は一般に疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続されるであろう。抗体の一の例示的投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇであろう。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一又は複数の用量（又はこれらの何れかの組み合わせ）を患者に投与してよい。このような用量は断続的に、例えば毎週又は三週毎（例えば患者が約２から約２０、例えば抗体の約６用量を受けるように）投与してよい。初期の高負荷用量の後、一以上の低用量を投与してよい。例示的な投薬レジメンは、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷用量、続いて抗体の約２ｍｇ／ｋｇの毎週の維持用量を投与することを含む。しかしながら、他の投与量レジメンが有用であり得る。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
上記の製剤又は治療方法の何れも、抗ＴＩＭ３抗体の代わりに又はそれに加えて本発明のイムノコンジュゲートを用いて実施することができることが理解される。
上記の製剤又は治療方法の何れも、抗ＴＩＭ３抗体の代わりに又はそれに加えて本発明のイムノコンジュゲートを用いて実施することができることが理解される。
ＩＩＩ．製造品
本発明の別の態様では、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器と容器上の又は容器に付随するラベル又は添付文書を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、疾患の治療、予防、及び／又は診断に効果的である、単独の又は別の組成物と併用の組成物を収容し、滅菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってもよい）。該組成物中の少なくとも一の活性剤は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、該組成物が特定の疾患の治療のために使用されることを示す。更に、製造品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物を中に収容する第一の容器、及び（ｂ）更なる細胞傷害性剤又はその他の治療剤含む組成物を中に収容する第二の容器を含んでもよい。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療するために使用され得ることを示す添付文書を更に含んでもよい。代替的に又は追加的に、製造品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器を更に含んでもよい。製造品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含めた、商業的及び使用者の観点から望ましいその他の材料を更に含んでもよい。
上記のいずれの製造品も、抗ＴＩＭ３抗体の代わりに又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを含んでもよい。
アミノ酸配列の説明
配列番号１ 重鎖ＨＶＲ−Ｈ１、Ｔｉｍ３＿００１６
配列番号２ 重鎖ＨＶＲ−Ｈ２、Ｔｉｍ３＿００１６
配列番号３ 重鎖ＨＶＲ−Ｈ３、Ｔｉｍ３＿００１６
配列番号４ 軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１、Ｔｉｍ３＿００１６
配列番号５ 軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２、Ｔｉｍ３＿００１６
配列番号６ 軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３、Ｔｉｍ３＿００１６
配列番号７ 重鎖可変ドメインＶＨ、Ｔｉｍ３＿００１６
配列番号８ 軽鎖可変ドメインＶＬ、Ｔｉｍ３＿００１６
配列番号９ 重鎖可変ドメインＶＨ、Ｔｉｍ３＿００１６変異体（００１８）
配列番号１０ 軽鎖可変ドメインＶＬ、Ｔｉｍ３＿００１６変異体（００１８）
配列番号１１ 軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１、Ｔｉｍ３＿００１６＿ＨＶＲ−Ｌ１変異体１＿ＮＱ
（ＮからＱへの変異によるグリコシル化部位の除去）
配列番号１２ 軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１、Ｔｉｍ３＿００１６＿ＨＶＲ−Ｌ１変異体２＿ＮＳ
（ＮからＳへの変異によるグリコシル化部位の除去）
配列番号１３ 重鎖ＨＶＲ−Ｈ１、Ｔｉｍ３＿００２１
配列番号１４ 重鎖ＨＶＲ−Ｈ２、Ｔｉｍ３＿００２１
配列番号１５ 重鎖ＨＶＲ−Ｈ３、Ｔｉｍ３＿００２１
配列番号１６ 軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１、Ｔｉｍ３＿００２１
配列番号１７ 軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２、Ｔｉｍ３＿００２１
配列番号１８ 軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３、Ｔｉｍ３＿００２１
配列番号１９ 重鎖可変ドメインＶＨ、Ｔｉｍ３＿００２１
配列番号２０ 軽鎖可変ドメインＶＬ、Ｔｉｍ３＿００２１
配列番号２１ 重鎖ＨＶＲ−Ｈ１、Ｔｉｍ３＿００２２
配列番号２２ 重鎖ＨＶＲ−Ｈ２、Ｔｉｍ３＿００２２
配列番号２３ 重鎖ＨＶＲ−Ｈ３、Ｔｉｍ３＿００２２
配列番号２４ 軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１、Ｔｉｍ３＿００２２
配列番号２５ 軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２、Ｔｉｍ３＿００２２
配列番号２６ 軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３、Ｔｉｍ３＿００２２
配列番号２７ 重鎖可変ドメインＶＨ、Ｔｉｍ３＿００２２
配列番号２８ 軽鎖可変ドメインＶＬ、Ｔｉｍ３＿００２２
配列番号２９ 重鎖ＨＶＲ−Ｈ１、Ｔｉｍ３＿００２６
配列番号３０ 重鎖ＨＶＲ−Ｈ２、Ｔｉｍ３＿００２６
配列番号３１ 重鎖ＨＶＲ−Ｈ３、Ｔｉｍ３＿００２６
配列番号３２ 軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１、Ｔｉｍ３＿００２６
配列番号３３ 軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２、Ｔｉｍ３＿００２６
配列番号３４ 軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３、Ｔｉｍ３＿００２６
配列番号３５ 重鎖可変ドメインＶＨ、Ｔｉｍ３＿００２６
配列番号３６ 軽鎖可変ドメインＶＬ、Ｔｉｍ３＿００２６
配列番号３７ 重鎖ＨＶＲ−Ｈ１、Ｔｉｍ３＿００２８
配列番号３８ 重鎖ＨＶＲ−Ｈ２、Ｔｉｍ３＿００２８
配列番号３９ 重鎖ＨＶＲ−Ｈ３、Ｔｉｍ３＿００２８
配列番号４０ 軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１、Ｔｉｍ３＿００２８
配列番号４１ 軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２、Ｔｉｍ３＿００２８
配列番号４２ 軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３、Ｔｉｍ３＿００２８
配列番号４３ 重鎖可変ドメインＶＨ、Ｔｉｍ３＿００２８
配列番号４４ 軽鎖可変ドメインＶＬ、Ｔｉｍ３＿００２８
配列番号４５ 重鎖ＨＶＲ−Ｈ１、Ｔｉｍ３＿００３０
配列番号４６ 重鎖ＨＶＲ−Ｈ２、Ｔｉｍ３＿００３０
配列番号４７ 重鎖ＨＶＲ−Ｈ３、Ｔｉｍ３＿００３０
配列番号４８ 軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１、Ｔｉｍ３＿００３０
配列番号４９ 軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２、Ｔｉｍ３＿００３０
配列番号５０ 軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３、Ｔｉｍ３＿００３０
配列番号５１ 重鎖可変ドメインＶＨ、Ｔｉｍ３＿００３０
配列番号５２ 軽鎖可変ドメインＶＬ、Ｔｉｍ３＿００３０
配列番号５３ 重鎖ＨＶＲ−Ｈ１、Ｔｉｍ３＿００３３
配列番号５４ 重鎖ＨＶＲ−Ｈ２、Ｔｉｍ３＿００３３
配列番号５５ 重鎖ＨＶＲ−Ｈ３、Ｔｉｍ３＿００３３
配列番号５６ 軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１、Ｔｉｍ３＿００３３
配列番号５７ 軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２、Ｔｉｍ３＿００３３
配列番号５８ 軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３、Ｔｉｍ３＿００３３
配列番号５９ 重鎖可変ドメインＶＨ、Ｔｉｍ３＿００３３
配列番号６０ 軽鎖可変ドメインＶＬ、Ｔｉｍ３＿００３３
配列番号６１ 重鎖ＨＶＲ−Ｈ１、Ｔｉｍ３＿００３８
配列番号６２ 重鎖ＨＶＲ−Ｈ２、Ｔｉｍ３＿００３８
配列番号６３ 重鎖ＨＶＲ−Ｈ３、Ｔｉｍ３＿００３８
配列番号６４ 軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１、Ｔｉｍ３＿００３８
配列番号６５ 軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２、Ｔｉｍ３＿００３８
配列番号６６ 軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３、Ｔｉｍ３＿００３８
配列番号６７ 重鎖可変ドメインＶＨ、Ｔｉｍ３＿００３８
配列番号６８ 軽鎖可変ドメインＶＬ、Ｔｉｍ３＿００３８
配列番号６９ 例示的なシュードモナス外毒素Ａ変異体１（脱免疫化ＰＥ２４の例）
配列番号７０ 例示的なシュードモナス外毒素Ａ変異体２（脱免疫化ＰＥ２４の例）
配列番号７１ ヒトカッパ軽鎖定常領域
配列番号７２ ヒトラムダ軽鎖定常領域
配列番号７３ ＩｇＧ１に由来するヒト重鎖定常領域
配列番号７４ 変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するＩｇＧ１に由来するヒト重鎖定常領域
配列番号７５ 変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを有するＩｇＧ１に由来するヒト重鎖定常領域
配列番号７６ ＩｇＧ４に由来するヒト重鎖定常領域
配列番号７７ 例示的なヒトＴＩＭ３配列
配列番号７８ ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）
配列番号７９ Ｔｉｍ３＿００１６変異体（００１８）のＶＨヒト化バージョン（＝Ｔｉｍ３−０４３３）
配列番号８０ Ｔｉｍ３＿００１６変異体（００１８）のＶＬヒト化バージョン（＝Ｔｉｍ３−０４３３）
配列番号８１ Ｔｉｍ３＿００１６変異体（００１８）のＶＨヒト化バージョン（＝Ｔｉｍ３−０４３４）
配列番号８２ Ｔｉｍ３＿００１６変異体（００１８）のＶＬヒト化バージョン（＝Ｔｉｍ３−０４３４）
配列番号８３ Ｔｉｍ３−００２８のＶＨヒト化バージョン（＝Ｔｉｍ３−０４３８）
配列番号８４ Ｔｉｍ３−００２８のＶＬヒト化バージョン（＝Ｔｉｍ３−０４３８）
配列番号８５ Ｔｉｍ３−００２８のＶＨヒト化バージョン（＝Ｔｉｍ３−０４４３）
配列番号８６ Ｔｉｍ３−００２８のＶＬヒト化バージョン（＝Ｔｉｍ３−０４４３）
以下では、抗ＴＩＭ３抗体Ｔｉｍ３−００１６、Ｔｉｍ３−００１６変異体（００１８）及びそのヒト化バージョンＴｉｍ３−０４３３及びＴｉｍ３−０４３４、Ｔｉｍ３−００２１、Ｔｉｍ３−００２２、Ｔｉｍ３−００２６、Ｔｉｍ３−００２８及びそのヒト化バージョンＴｉｍ３−０４３８及びＴｉｍ３−０４４３、Ｔｉｍ３−００３０、及びＴｉｍ３−００３３、Ｔｉｍ３−００３８のマーキングされたＨＶＲ（太字で下線が引かれたＨＶＲ）を含むＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列が掲載される。
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以下に、本発明の特定の実施態様が記載される：
１． ＴＩＭ３に結合する単離された抗体であり、ここで抗体は、
・ ３７℃で１２０分後に少なくとも４５％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１５５ＴＭ）についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）。
・ 一実施態様において、抗体は、３７℃で１２０分後に少なくとも５０％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１５５ＴＭ）についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）。
・ 一実施態様において、抗体は、３７℃で１２０分後に少なくとも５５％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１５５ＴＭ）についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）。
・ 一実施態様において、抗体は、３７℃で２４０分後に少なくとも６０％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１５５ＴＭ）についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）。
・ 一実施態様において、抗体は、３７℃で２４０分後に少なくとも６５％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１５５ＴＭ）についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）。
２． 抗体が、
・ ＴＩＭ３への結合について、Ｔｉｍ３＿００１６のＶＨ及びＶＬを含む抗Ｔｉｍ３抗体と競合し、
・ ヒト及びカニクイザルＴＩＭ３に結合し、
・ イムノコンジュゲートとして、ＴＩＭ３発現細胞に対して細胞傷害活性を示し（一実施態様において、イムノコンジュゲートは、ＲＰＭＩ−８２２６細胞に対してシュードモナス外毒素Ａコンジュゲートとしての、０．１以下の細胞傷害活性の相対的ＩＣ５０値（実施例１１で測定される）を有する）
・ インターフェロンガンマ放出を誘導する（ＭＬＲアッセイにおいて）
実施態様１に記載の抗ＴＩＭ３抗体。
３． ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である、実施態様１に記載の抗体。
４． ＴＩＭ３に結合する抗体断片である、実施態様１に記載の抗体。
５． Ｆａｂ断片である、実施態様４に記載の抗体断片。
６．
Ａ）（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｂ）（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｃ）（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｄ）（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｅ）（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｆ）（ａ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｇ）（ａ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｈ）（ａ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｉ）（ａ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
Ｊ）（ａ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む、実施態様１から５の何れか一に記載の抗ＴＩＭ３抗体。
７． 抗体が、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、ヒトＴＩＭ３に結合する単離された抗体。
８． 抗体が、
ｉ）配列番号７９のＶＨ配列及び配列番号８０のＶＬ配列、又は
ｉｉ）配列番号８１のＶＨ配列及び配列番号８２のＶＬ配列
を含む実施態様７に記載の抗体。
９． 抗体が、
配列番号７９のＶＨ配列及び配列番号８０のＶＬ配列
を含む実施態様７に記載の抗体。
１０． 抗体が、
配列番号８１のＶＨ配列及び配列番号８２のＶＬ配列
を含む実施態様７に記載の抗体。
１１． 抗体が、（ａ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、ヒトＴＩＭ３に結合する単離された抗体。
１２． 抗体が、
ｉ）配列番号８３のＶＨ配列及び配列番号８４のＶＬ配列、又は
ｉｉ）配列番号８５のＶＨ配列及び配列番号８６のＶＬ配列
を含む実施態様１１に記載の抗体。
１３． 抗体が、
配列番号８３のＶＨ配列及び配列番号８４のＶＬ配列
を含む実施態様１１に記載の抗体。
１４． 抗体が、
配列番号８５のＶＨ配列及び配列番号８６のＶＬ配列
を含む実施態様１１に記載の抗体。
１５．
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｃ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｄ）（ａ）（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｅ）（ａ）（ｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｆ）（ａ）（ｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｇ）（ａ）（ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｈ）（ａ）（ｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｉ）（ａ）（ｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｊ）（ａ）（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む、実施態様１から１４の何れか一に記載の抗ＴＩＭ３抗体。
１６． 抗体が、（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む、ヒトＴＩＭ３に結合する単離された抗体。
１７． 抗体が、
ｉ）配列番号７９のＶＨ配列及び配列番号８０のＶＬ配列、又は
ｉｉ）配列番号８１のＶＨ配列及び配列番号８２のＶＬ配列
を含む実施態様１６に記載の抗体。
１８． 抗体が、
配列番号７９のＶＨ配列及び配列番号８０のＶＬ配列
を含む実施態様１６に記載の抗体。
１９． 抗体が、
配列番号８１のＶＨ配列及び配列番号８２のＶＬ配列
を含む実施態様１６に記載の抗体。
２０． 抗体が、（ａ）（ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む、ヒトＴＩＭ３に結合する単離された抗体。
２１． 抗体が、
ｉ）配列番号８３のＶＨ配列及び配列番号８４のＶＬ配列、又は
ｉｉ）配列番号８５のＶＨ配列及び配列番号８６のＶＬ配列
を含む実施態様２０に記載の抗体。
２２． 抗体が、
配列番号８３のＶＨ配列及び配列番号８４のＶＬ配列
を含む実施態様２０に記載の抗体。
２３． 抗体が、
配列番号８５のＶＨ配列及び配列番号８６のＶＬ配列
を含む実施態様２０に記載の抗体。
２４．
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｃ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｄ）（ａ）（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｅ）（ａ）（ｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｆ）（ａ）（ｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｇ）（ａ）（ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｈ）（ａ）（ｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｉ）（ａ）（ｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｊ）（ａ）（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む、実施態様１から５の何れか一に記載の抗ＴＩＭ３抗体であって；
ここで、抗体は以下の特性の１つ以上によって独立して特徴づけられる：
抗ＴＩＭ３抗体が、
・ ３７℃で１２０分後に少なくとも４５％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）
・ 一実施態様において、抗体は、３７℃で１２０分後に少なくとも５０％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）。
・ 一実施態様において、抗体は、３７℃で１２０分後に少なくとも５５％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）。
・ 一実施態様において、抗体は、３７℃で２４０分後に少なくとも６０％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）。
・ 一実施態様において、抗体は、３７℃で２４０分後に少なくとも６５％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）。
・ ＴＩＭ３への結合について、配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬを含む抗Ｔｉｍ３抗体と競合し、
・ ヒト及びカニクイザルＴＩＭ３に結合し、
・ イムノコンジュゲートとして、ＴＩＭ３発現細胞に対して細胞傷害活性を示し（一実施態様において、イムノコンジュゲートは、ＲＰＭＩ−８２２６細胞に対してシュードモナス外毒素Ａコンジュゲートとしての、０．１以下の細胞傷害活性の相対的ＩＣ５０値（実施例１１で測定される）を有する）
・ （実施例５に記載の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて）インターフェロン−ガンマ放出を誘導する。
２５． 抗体が、（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む、ヒトＴＩＭ３に結合する単離された抗体であって；
ここで、抗体は以下の特性の１つ以上によって独立して特徴づけられる：
抗ＴＩＭ３抗体が、
・ ３７℃で１２０分後に少なくとも４５％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）
・ 一実施態様において、抗体は、３７℃で１２０分後に少なくとも５０％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）。
・ 一実施態様において、抗体は、３７℃で１２０分後に少なくとも５５％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）。
・ 一実施態様において、抗体は、３７℃で２４０分後に少なくとも６０％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）。
・ 一実施態様において、抗体は、３７℃で２４０分後に少なくとも６５％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）。
・ ＴＩＭ３への結合について、配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬを含む抗Ｔｉｍ３抗体と競合し、
・ ヒト及びカニクイザルＴＩＭ３に結合し、
・ イムノコンジュゲートとして、ＴＩＭ３発現細胞に対して細胞傷害活性を示し（一実施態様において、イムノコンジュゲートは、ＲＰＭＩ−８２２６細胞に対してシュードモナス外毒素Ａコンジュゲートとしての、０．１以下の細胞傷害活性の相対的ＩＣ５０値（実施例１１で測定される）を有する）
・（実施例５に記載の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて）インターフェロン−ガンマ放出を誘導する。
２６． 抗体が、（ａ）（ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む、ヒトＴＩＭ３に結合する単離された抗体であって；
ここで、抗体は以下の特性の１つ以上によって独立して特徴づけられる：
抗ＴＩＭ３抗体が、
・ ３７℃で１２０分後に少なくとも４５％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）
・ 一実施態様において、抗体は、３７℃で１２０分後に少なくとも５０％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）。
・ 一実施態様において、抗体は、３７℃で１２０分後に少なくとも５５％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）。
・ 一実施態様において、抗体は、３７℃で２４０分後に少なくとも６０％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）。
・ 一実施態様において、抗体は、３７℃で２４０分後に少なくとも６５％のＴＩＭ３の内部移行を（ＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ８２２６細胞についてのＦＡＣＳアッセイにおいて）誘導する（実施例６を参照）。
・ ＴＩＭ３への結合について、配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬを含む抗Ｔｉｍ３抗体と競合し、
・ ヒト及びカニクイザルＴＩＭ３に結合し、
・ イムノコンジュゲートとして、ＴＩＭ３発現細胞に対して細胞傷害活性を示し（一実施態様において、イムノコンジュゲートは、ＲＰＭＩ−８２２６細胞に対してシュードモナス外毒素Ａコンジュゲートとしての、０．１以下の細胞傷害活性の相対的ＩＣ５０値（実施例１１で測定される）を有する）
・ （実施例５に記載の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて）インターフェロン−ガンマ放出を誘導する。
２７． 完全長ＩｇＧ１抗体である、実施態様１から２６の何れか一に記載の抗体。
２８． Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する完全長ＩｇＧ１抗体である、実施態様１から２７の何れか一に記載の抗体。
２９． 実施態様１から２８の何れか一に記載の抗体をコードする、単離された核酸。
３０． 実施態様２９に記載の核酸を含む宿主細胞。
３１． 抗体が産生されるように、実施態様３０に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗体を産生する方法。
３２． 抗体を宿主細胞から回収することを更に含む、実施態様３１に記載の方法。
３３． 実施態様１から２８の何れか一に記載の抗体と細胞傷害性剤とを含むイムノコンジュゲート。
３４． 細胞傷害性剤がシュードモナスエキソトキシンＡ又はアマトキシンである、実施態様３３に記載のイムノコンジュゲート。
３５． 実施態様１から２８の何れか一に記載の抗体と薬学的に許容される担体とを含む薬学的製剤。
３６． 医薬としての使用のための、実施態様１から２８の何れか一に記載の抗体又は実施態様３３若しくは３４の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
３７． がんを治療することにおいて使用のための、実施態様１から２８の何れか一に記載の抗体又は実施態様３３若しくは３４の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
３８． 医薬の製造における、実施態様１から２８の何れか一に記載の抗体又は実施態様３３若しくは３４の何れか一に記載のイムノコンジュゲートの使用。
３９． 医薬はがんの治療のためのものである、実施態様３８の使用。
４０． 実施態様１に記載の抗体又は実施態様３３に記載のイムノコンジュゲートの有効量を個体に対して投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法。
Ｖ．実施例
以下は本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
前述の発明は理解を明確にするために例示及び実施例によってある程度詳細に説明されているが、説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示内容は、その全体が出典明示により援用される。
実施例１ａ：抗ＴＩＭ３抗体の生成
マウスの免疫化
ＮＭＲＩマウスを、完全長ヒトＴｉｍ−３をコードするプラスミド発現ベクターを用いて、１００ｕｇのベクターＤＮＡ（プラスミド１５３０４＿ｈＴＩＭ３−ｆｌ）を皮内適用し、続いてエレクトロポレーション（１０００Ｖ／ｃｍの２平方パルス、持続時間０．１ｍｓ、間隔０．１２５ｓ；続いて２８７．５Ｖ／ｃｍの４平方パルス、持続時間１０ｍｓ、間隔０．１２５ｓ）により遺伝的に免疫化した。マウスは、０，１４，２８，４２，５６，７０及び８４日目に６回の連続した免疫化を受けた。血液を３６日目、７８日目及び９２日目に採取し、血清を調製し、これをＥＬＩＳＡによる力価決定のために用いた（以下を参照）。最も高い力価を有する動物を、５０μｇの組換えヒトＴｉｍ−３ヒトＦｃキメラの静脈内注射によって９６日目に追加免疫のために選択し、追加免疫の３日後に脾臓細胞と骨髄腫細胞株との融合により、モノクローナル抗体をハイブリドーマ技術により単離した。
血清力価の測定（ＥＬＩＳＡ）
ヒト組換えＴｉｍ−３ヒトＦｃキメラを、ＰＢＳ中０．３μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェルでの９６ウェルＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートに固定化し、続いて、ＰＢＳ中２％Ｃｒｏｔｅｉｎ Ｃ、２００μｌ／ウェルを用いてプレートをブロッキングし；抗血清の段階希釈をＰＢＳ中０．５％Ｃｒｏｔｅｉｎ Ｃ、１００μｌ／ウェルで二重に適用し；ＨＲＰ結合ヤギ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ／Ｄｉａｎｏｖａ １１５−０３６−０７１；１／１６ ０００）により検出した。全ての工程について、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。全ての工程の間に、プレートをＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で３回洗浄した。ＢＭ Ｂｌｕｅ ＰＯＤ基質可溶性（Ｒｏｃｈｅ）、１００μｌ／ウェルの添加によりシグナルを発生させ；１ＭのＨＣｌ、１００μｌ／ウェルの添加により停止させた。リファレンスとして６９０ｎｍに対して吸光度を４５０ｎｍで読み取った。力価は、最大値の半分のシグナルをもたらす抗血清の希釈として定義された。
実施例１ｂ：抗Ｔｉｍ３抗体の特徴付け
Ｔｉｍ３のＥＬＩＳＡ
Ｎｕｎｃ−Ｍａｘｉ Ｓｏｒｐ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｅプレート（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ＃１１９７４９９８／ＭＣ１０９９）をＴｉｍ３−ＥＣＤ−Ｈｉｓ−Ｂｉｏｔｉｎ（ＢｉｒＡ Ｌｉｇａｓｅでビオチン化）により２５μｌ／ウェルでコーティングし、４００ｒｐｍ回転で振とうしながら室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌのａＴｉｍ３試料又は希釈した（１：２工程）参照抗体ａＴｉｍ３Ｆ３８−２Ｅ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのヒツジ抗マウスＰＯＤ（ＧＥ ＮＡ９３１０Ｖ）を１：９０００希釈で添加し、４００ｒｐｍ回転で振とうしながら室温で１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で４×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、＃ＣＬ０７）を添加し、ＯＤ１．５−２．５までインキュベートした。次に、２５μｌ／ウェルの１ＮのＨＣＬ溶液の添加により反応を停止させた。測定は３７０／４９２ｎｍで行った。
ＥＬＩＳＡの結果は、下記の表２の概要において、ＥＣ５０値［ｎｇ／ｍｌ］としてリストされる。
実施例：Ｔｉｍ３の細胞ＥＬＩＳＡ
完全長ヒトＴｉｍ３をコードするプラスミド１５３１２＿ｈＴＩＭ３−ｆｌ＿ｐＵＣ＿Ｎｅｏで安定にトランスフェクトされ、Ｇ４１８（プラスミド上のネオマイシン耐性マーカー）により選択された接着性ＣＨＯ−Ｋ１細胞株を、３８４ウェル平底プレートに１．２×１０Ｅ６細胞／ｍｌの濃度で播種し、一晩増殖させた。
翌日、２５μｌ／ウェルのＴｉｍ３試料又はＴｉｍ３参照抗体Ｆ３８−２Ｅ２アジドフリー（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３５４００４）を添加し、４℃で２時間インキュベートした（内部移行を避けるため）。洗浄後（３×９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴ（ＢＩＯＴＥＫ Ｗａｓｈｅｒ：Ｐｒｏｇ。２９、１×９０）、残留緩衝液をはじき出し、１×ＰＢＳ緩衝液中５０μｌ／ウェルの０．０５％グルタルアルデヒド：２５％グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ カタログ番号：Ｇ５８８２）の１：５００希釈液を添加することによって細胞を固定化し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後（３×９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴ（ＢＩＯＴＥＫ Ｗａｓｈｅｒ：Ｐｒｏｇ．２１，３×９０ ＧｒｅｉｎＬｙｓｉｎ）、２５μｌ／ウェルの二次抗体を検出のために加え（ヒツジ抗マウスＰＯＤ；西洋わさびＰＯＤ結合Ｆ（ａｂ’）２断片；ＧＥ ＮＡ９３１０）、４００ｒｐｍで振とうしながら室温で２時間インキュベートした。洗浄後（３×９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴ（ＢＩＯＴＥＫ Ｗａｓｈｅｒ：Ｐｒｏｇ． ２１、３ｘ９０ ＧｒｅｉｎＬｙｓｉｎ）２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質溶液（Ｒｏｃｈｅ １１８３５０３３００１）を添加し、ＯＤ１．５−２．５までインキュベートした。次に、２５μｌ／ウェルの１ＮのＨＣＬ溶液の添加により反応を停止させた。測定は３７０／４９２ｎｍで行った。
細胞ＥＬＩＳＡの結果は、下記の表２の概要において、「ＥＣ５０ ＣＨＯ−Ｔｉｍ３」値［ｎｇ／ｍｌ］としてリストされる。
Figure 0006517357
Ｔｉｍ３ ＡＢのＢＩＡｃｏｒｅの特性評価
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースのアッセイが、幾つかのマウスＴｉｍ３結合剤並びに市販のヒトＴｉｍ３結合参照物間の結合の動態パラメーターを決定するために使用されている。従って、（ＢＩＡｃｏｒｅ）ＣＭ５センサーチップの表面にアミン結合させて抗マウスＩｇＧを固定化した。次いで、試料を捕捉し、単量体ｈｕ／ｃｙＴｉｍ３−ＥＣＤ並びにＦｃ−タグ付きヒトＴｉｍ３−ＥＣＤ二量体をそれらに結合させた。センサーチップ表面は、各分析サイクルの後に再生された。平衡定数ＫＤは、データを１：１ラングミュア相互作用モデルに適合させることによって最終的に得られた。
３０μｇ／ｍｌの抗マウスＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ＃ＢＲ−１００８−３８）の約１２０００応答単位（ＲＵ）を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅが提供するアミンカップリングキットを使用することにより、ｐＨ５．０で、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｂ４０００において、ＣＭ５センサーチップのフローセル１−４のスポット１，２，４及び５（スポット１，５が活性であり、スポット２，４が基準スポットである）に結合させた。
試料及びランニング緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＰ＋（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ ｖ／ｖ界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）であった。フローセルの温度は２５℃に、試料コンパートメントの温度は１２℃に設定された。システムは、ランニング緩衝液で満たされた。
試料を２００μｇ／ｍｌの濃度で３０秒間注入し、各フローセルのスポット１及び５に結合させ、８つの試料の並行測定を可能にした。次いで、各試料にわたって２４０秒間、異なる（単量体カニクイザル、単量体ヒト及びｈｕＦｃ融合二量体ヒトＴｉｍ３−ＥＣＤ）濃度の完全な１組（表Ｘ）が注入され、続いて３０／１８００秒の解離時間をかけた（表１）。次いで、各分析サイクル（試料捕捉、スポット１及び５−Ｔｉｍ３ ＥＣＤ注入）を、グリシン−ＨＣｌ ｐＨ１．７の３０秒間の長い注入により再生した。流速は、全運転について３０μｌ／分に設定した。
最後に、二重参照データを、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｂ４０００評価ソフトウェアを用いて１：１ラングミュア相互作用モデルに適合させた。単量体ヒト、カニクイザルＴｉｍ３及びｈｕＦｃ融合二量体ヒトＴｉｍ３に対する得られた親和性を表２及び３に示す。ｈｕＴｉｍ３二量体に対する親和性は、結合活性によって影響される可能性が最も高く、従って、単量体ｈｕＴｉｍ３に対する親和性より明らかに強い。
Figure 0006517357
ＳＰＲによるＴｉｍ３への親和性の決定（キメラＴＩＭ３−００１６変異体（００１８）及びヒト化バージョン）
プロテインＡを、（ＢＩＡｃｏｒｅ）ＣＭ５センサーチップの表面にアミン結合させて固定化した。試料を捕捉し、Ｔｉｍ３−ＥＣＤをそれらに結合させた。センサーチップ表面は、各分析サイクルの後に再生された。平衡定数及び速度定数は、データを１：１ラングミュア相互作用モデルに適合させることによって最終的に得られた。
２０μｇ／ｍｌのプロテインＡの約２０００応答単位（ＲＵ）を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給されるアミンカップリングキットを使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｂ４０００機器においてＣＭ５センサーチップの全てのフローセルのスポット１，２，４及び５に結合させた。
試料及びランニング緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＰ＋（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ ｖ／ｖ界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）であった。フローセルの温度は２５℃に、試料コンパートメントの温度は１２℃に設定された。システムは、ランニング緩衝液で満たされた。
異なる試料を１０ｎＭの濃度で３０秒間注入し、全てのフローセル中のスポット１及び５に連続的に結合させた。次いで、各試料にわたって、単量体ヒトＴｉｍ３−ＥＣＤ希釈物（６００ｎＭ、２００ｎＭ、６６．７ｎＭ、２×２２．２ｎＭ、７．４ｎＭ、２．５ｎＭ及び２×０ｎＭ）の完全な１組を３００秒間連続的に注入した。各抗原注入の後に、１２秒／１０００秒の解離時間、及びグリシン−ＨＣｌ ｐＨ１．５溶液を用いた２回の３０秒の再生工程が続き、そのうちの最後の工程は２０秒の注入後に安定化期間を含めた。
最後に、二重参照データを、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｂ４０００評価ソフトウェアを用いて１：１ラングミュア相互作用モデルに適合させた。得られたＫＤ値を表３ｂに示す。
ＳＰＲによるＴｉｍ３への親和性の決定（キメラＴＩＭ３−００２８及びヒト化バージョン）
（Ｂｉａｃｏｒｅ）ＣＭ５センサーチップの表面にアミン結合させて抗ヒトＦｃ ＩｇＧを固定化した。試料を捕捉し、Ｔｉｍ３−ＥＣＤをそれらに結合させた。センサーチップ表面は、各分析サイクルの後に再生された。平衡定数及び速度定数は、データを１：１ラングミュア相互作用モデルに適合させることによって最終的に得られた。
１０μｇ／ｍｌの抗ヒトＦｃ ＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ＃ＢＲ−１００８−３９）の約２５００応答単位（ＲＵ）を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給されるアミンカップリングキットを使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｂ４０００機器においてＣＭ５センサーチップの全てのフローセルのスポット１，２，４及び５に結合させた。
試料及びランニング緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＰ＋（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ ｖ／ｖ界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）であった。フローセルの温度は２５℃に、試料コンパートメントの温度は１２℃に設定された。システムは、ランニング緩衝液で満たされた。
異なる試料を１０ｎＭの濃度で３０秒間注入し、全てのフローセル中のスポット１及び５に連続的に結合させた。次いで、各試料にわたって、単量体ヒトＴｉｍ３−ＥＣＤ希釈物（６００ｎＭ、２００ｎＭ、６６．７ｎＭ、２×２２．２ｎＭ、７．４ｎＭ、２．５ｎＭ及び２×０ｎＭ）の完全な１組を３００秒間連続的に注入した。各抗原注入の後に、１２秒／７００秒の解離時間、及び３ＭのＭｇＣｌ２溶液を用いた２回の３０秒の再生工程が続き、そのうちの最後の工程はランニング緩衝液を用いた「注射後の追加洗浄」を含めた。
最後に、二重参照データを、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｂ４０００評価ソフトウェアを用いて１：１ラングミュア相互作用モデルに適合させた。得られたＫＤ値を表３ｂに示す。
Figure 0006517357
実施例２：抗Ｔｉｍ３抗体誘導体の生成
キメラ抗体誘導体
キメラＴｉｍ３抗体は、抗ＴＩＭ３マウス抗体Ｔｉｍ３−００１６、Ｔｉｍ３−００１６変異体（００１８）、Ｔｉｍ３−００２１、Ｔｉｍ３−００２２、Ｔｉｍ３−００２６、Ｔｉｍ３−００２８、Ｔｉｍ３−００３０、及びＴｉｍ３−００３３、Ｔｉｍ３−００３８の可変重鎖及び軽鎖領域をＰＣＲを介して増幅し、エフェクター機能を抑制するＬＡＬＡ及びＰＧ変異（ロイシン２３４からアラニン、ロイシン２３５からアラニン、プロリン３２９からグリシン）を有するヒトＩｇＧ１骨格／ヒトＣＨ１−Ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３との融合タンパク質として重鎖発現ベクター中に及びヒトＣ−カッパに対する融合タンパク質として軽鎖発現ベクター中にそれらをクローニングすることによって生成された。次いで、ＬＣ及びＨＣプラスミドをＨＥＫ２９３にコトランスフェクトし、７日後に、抗体精製のための標準的な方法によって上清から精製した。
グリコシル化部位ＮＹＴの除去：Ｔｉｍ３＿００１６、Ｔｉｍ３＿００１６変異体（００１８又はＴｉｍ３＿００１８と命名する）の１つのＨＶＲ−Ｌ１位置を、ＮをＱ又はＳによって置換することによって修飾する
Ｔｉｍ３＿００１６及びＴｉｍ３＿００１６変異体（００１８）の可変軽鎖領域内の変異は、Ａｇｉｌｅｎｔの「Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」を製造業者の指示に従って使用してインビトロ突然変異誘発によって生成した。この方法により、軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１（配列番号４）のグリコシル化部位モチーフＮＹＴのアスパラギン（Ｎ）がグルタミン（Ｑ）により置換され（配列番号１１＝Ｔｉｍ３＿００１６＿ＨＶＲ−Ｌ１変異体１＿ＮＱを得る）、又は、代わりに、アスパラギン（Ｎ）がセリン（Ｓ）により置換される（配列番号１２＝Ｔｉｍ３＿００１６＿ＨＶＲ−Ｌ１変異体２＿ＮＳを得る）。両方とも、グリコシル化部位のモチーフＮＹＴはうまく改変された。次いで、変異体をコードするＬＣ及びＨＣプラスミドをＨＥＫ２９３にコトランスフェクトし、７日後に、抗体精製のための標準的な方法によって上清から精製した。
生成された変異体を、ヒトＴｉｍ３に対するＥＬＩＳＡ、カニクイザルＴｉｍ３に対するＥＬＩＳＡ及び完全長ヒトＴｉｍ３を発現する接着性ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対する細胞ＥＬＩＳＡによって試験した。
Figure 0006517357
生成された全ての変異体は、親抗体Ｔｉｍ３＿００１６又はＴｉｍ３＿００１６抗体変異体Ｔｉｍ３＿００１８のそれぞれよりも、ＣＨＯ細胞上のヒトＴＩＭ３（ヒト）、ｃｙｎｏ ＴＩＭ３（ｃｙｎｏ）又はヒトＴＩＭＲに対して更に機能的結合を示すことが見出された。
ヒト化抗体誘導体
マウス抗Ｔｉｍ３−００１６変異体（００１８）及び抗Ｔｉｍ３＿００２８のＶＨ及びＶＬドメインのヒト化
ａ）抗Ｔｉｍ３抗体Ｔｉｍ３＿００１６変異体（００１８）（６つのＨＶＲのアミノ酸配列を有する；ここで軽鎖においてＨＶＲ−Ｌ１変異体２＿ＮＳ（ＮからＳへの変異によるグリコシル化部位の除去）が用いられた（配列番号１，２，３，１２，５及び６））のＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列に基づいて、ヒト化抗Ｔｉｍ３抗体変異体Ｔｉｍ３−０４３３及びＴｉｍ３−０４３４を作製し、ｂ）抗−Ｔｈ３抗体Ｔｉｍ３＿００２８（６つのＨＶＲのアミノ酸配列（配列番号３７，３８，３９，４０，４１及び４２）を有する）のＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列に基づいて、ヒト化抗Ｔｉｍ３抗体変異体Ｔｉｍ３−０４３８及びＴｉｍ３−０４４３を作製した。
重鎖及び軽鎖可変領域のヒト化アミノ酸配列をＤＮＡに逆翻訳し、得られたｃＮＤＡを合成し（ＧｅｎＡｒｔ）、次いでエフェクター機能を抑制するＬＡＬＡ及びＰＧ変異（ロイシン２３４からアラニン、ロイシン２３５からアラニン、プロリン３２９からグリシン）を有するヒトＩｇＧ１骨格／ヒトＣＨ１−Ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３との融合タンパク質として重鎖発現ベクター中に及びヒトＣ−カッパに対する融合タンパク質として軽鎖発現ベクター中にクローニングされた。次いで、ＬＣ及びＨＣプラスミドをＨＥＫ２９３にコトランスフェクトし、７日後に、抗体精製のための標準的な方法によって上清から精製した。得られたヒト化Ｔｉｍ３抗体は、以下のように命名される：
Figure 0006517357
Figure 0006517357
実施例３：精製モノクローナル抗体の蛍光標識
ハイブリドーマ由来モノクローナル抗体の蛍光標識は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて製造業者の指示に従って行った。標識後、ＴＩＭ−３発現ＲＰＭＩ−８２２６及びＰｆｅｉｆｆｅｒ細胞について、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（以下、「Ａｌｅｘａ−４８８」と称する）により各抗体が陽性に標識されていることを確認した。
実施例４：ＦＡＣＳに基づく競合アッセイを用いた結合エピトープグループの分類
生成した抗ＴＩＭ３抗体と６つの抗ＴＩＭ３参照抗体との間のエピトープの関係を、ＦＡＣＳに基づく結合競合アッセイによって分析した。ＴＩＭ３参照抗体は以下の抗体であった：米国特許出願公開第２０１２／１８９６１７号に記載の抗体４１７７及び８２１３、国際公開第２０１３／０６４９０号に記載の抗体１．７Ｅ１０及び２７．１２Ｅ１２；抗体３４４８２３（クローン３４４８２３、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓにより製造）及び抗体Ｆ３８−２Ｅ２（Ｃｌｏｎｅ Ｆ３８−２Ｅ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ及びＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓにより製造）。簡潔には、試験抗体をＴＩＭ−３発現ＲＰＭＩ−８２２６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１５５ＴＭ）と相互作用させ、結合させ、次いで別の抗ＴＩＭ−３抗体がＴＩＭ−３発現細胞にも結合できるかどうかをフローサイトメトリー法によって評価した。
手短に言えば、ヒトＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ−８２２６細胞をＢＤヒトＦｃ Ｂｌｏｃｋと共に室温で１０分間インキュベートし、２つの異なる実験設定により染色して、試験した抗体の結合に対する親和性の差の影響を排除した：
１）開示された精製抗ＴＩＭ３（４℃で０．５時間、ＢＤ染色緩衝液中１０μｇ／ｍｌ）、製造業者の説明書（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ａ−２０１８１）に従ってＡｌｅｘａ＊４８８とコンジュゲートさせたものであり、抗体あたり平均２．７個のフルオロフォアを有する。次いで、ａ）非標識（１−４）参照組換え抗ＴＩＭ３抗体又はアイソタイプ対照をＢＤ ＳＢ中で４℃で０．５時間添加し（１０μｇ／ｍｌ）、ＢＤ ＳＢにより洗浄した後、ＰＥで標識した抗ｈｕＦｃγ抗体により染色し（ＪＩＲ、１０９−１１６−０９８、１：２００、ＢＤ ＳＢ中４℃で０．５時間）、又はｂ）ＰＥで標識した（５−６）利用可能な参照抗ＴＩＭ３抗体若しくは適切なアイソタイプ対照をＢＤ ＳＢ中で４℃で０．５時間添加した（１０μｇ／ｍｌ）。洗浄及び遠心分離後、染色されたＲＰＭＩ−８２２６細胞のＭＦＩシグナルを、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーターによって分析した。
Figure 0006517357
ＦＡＣＳベースのエピトープグループマッピングの結果は、Ｔｉｍ３＿００１６及びＴｉｍ３＿００１６変異体Ｔｉｍ３＿００１８は、試験した抗ＴＩＭ−３参照抗体との結合の競合を示さないことを示しており、これらの抗体（Ａｂ）が、以前に記載された全てのＴＩＭ３参照抗体が認識したエピトープとは異なる新しいエピトープを認識し、一方、Ｔｉｍ３＿００２２、Ｔｉｍ３＿００２６、Ｔｉｍ３＿００２８及びＴｉｍ３＿００３８は、様々な競合相手とのＪＲＰＭＩ−８２２６細胞上の表面発現ＴＩＭ３への結合について競合することが示唆された。
実施例５：混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におけるサイトカイン産生に対するヒト抗ＴＩＭ−３抗体の効果
リンパ球エフェクター細胞へのＴＩＭ−３経路を遮断する効果を実証するために混合リンパ球反応を用いた。アッセイにおけるＴ細胞を、抗ＴＩＭ−３ ｍＡｂの存在下又は非存在下における活性化及びＩＦＮ−ガンマ分泌について試験した。
ヒトリンパ球をＬｅｕｋｏｓｅｐ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ、２２７ ２８８）を用いた密度勾配遠心分離によって健常なドナーの末梢血から単離した。簡潔に述べると、ヘパリン添加血液を３倍容量のＰＢＳで希釈し、希釈した血液の２５ｍｌアリコートを５０ｍｌのＬｅｕｋｏｓｅｐチューブに重層した。室温で８００×ｇで１５分間遠心分離した後（中断なし）、リンパ球含有画分を回収し、ＰＢＳで洗浄し、機能アッセイにおいて直接使用したか、又は１．０Ｅ＋０７細胞／ｍｌで凍結培地（１０％ＤＭＳＯ、９０％ＦＣＳ）に再懸濁し、液体窒素中で保存した。１：１の標的／応答細胞比をＭＬＲアッセイで使用した（すなわち、各ＭＬＲ培養物は、総量２００μｌ中に各ドナーからの２．０Ｅ＋０５のＰＢＭＣを含有した）。抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体Ｔｉｍ３＿００１６、Ｔｉｍ３＿００１６変異体（Ｔｉｍ３＿００１８）、Ｔｉｍ３＿００２１、Ｔｉｍ３＿００２２、Ｔｉｍ３＿００２６、Ｔｉｍ３＿００２８、Ｔｉｍ３＿００３０、Ｔｉｍ３＿００３３、Ｔｉｍ３＿００３８及びＦ３８−２Ｅ２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を各培養物に対して異なる抗体濃度で添加した。抗体もアイソタイプ対照抗体も陰性対照として使用せず、陽性対照としてｒｅｃＨｕ ＩＬ−２（２０ＥＵ／ｍｌ）を使用した。細胞を３７℃で６日間培養した。６日後、サイトカイン測定のために各培養物から１００μｌの培地を採取した。ＩＦＮ−ガンマのレベルは、ＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定した。
結果を表６に示す（ＩＦＮ−γ分泌／放出）。抗ＴＩＭ−３モノクローナル抗体は、濃度依存的にＴ細胞活性化及びＩＦＮ−ガンマの分泌を促進した。抗ＴＩＭ３抗体Ｔｉｍ３＿００２１、Ｔｉｍ３＿００２２、Ｔｉｍ３＿００２８、及びＴｉｍ３＿００３８は、Ｆ３８−２Ｅ２抗体よりも炎症性サイトカインＩＦＮ−ガンマの放出を減少させる。Ｔｉｍ３＿００１６、Ｔｉｍ３＿００１６変異体（Ｔｉｍ３＿００１８）、Ｔｉｍ３＿００３３及びＴｉｍ３＿００３８は、Ｆ３８−２Ｅ２抗体と比較して同様の放出を示した。対照的に、アイソタイプ対照抗体を含有する培養物は、ＩＦＮ−ガンマの分泌の増加を示さなかった。
Figure 0006517357
更なる実験において、０．１μｇ／ｍｌの抗ＰＤ１ ｍＡｂと組み合わせた以下のキメラ抗体及びヒト化抗体（上記のように生成されたもの）のＥＣ５０値を測定した：キメラｃｈｉ＿Ｔｉｍ３＿０１８抗体及びそのヒト化バージョンＴｉｍ３−４３３及びＴｉｍ３−４３４、キメラｃｈｉ＿Ｔｉｍ３＿０２８抗体及びそのヒト化バージョンＴｉｍ３−４３８及びＴｉｍ３−４４３を異なるリンパ球ドナー混合物（それぞれＤ２及びＤ３、又はＤ１及びＤ５）で測定した。結果を表６ｂに示す。
Figure 0006517357
実施例６：抗ＴＩＭ−３抗体のＴＩＭ−３発現細胞への内部移行
本明細書に記載のＴＩＭ−３特異的抗体は、ＴＩＭ−３発現リンパ腫、多発性骨髄腫及びＡＭＬ細胞を含む、ＴＩＭ−３発現細胞に内部移行することができる。例えば、開示されたＴＩＭ−３特異的抗体及びその断片は、細胞ベースのＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）及び共焦点顕微鏡によって評価されるヒトＴＩＭ−３を安定に発現するｒｅｃ ＴＩＭ３ ＣＨＯ細胞に内部移行されることが示される。
例えば、新鮮な培地を使用して９８ウェル−ＭＴＰ中に安定なＴｉｍ３トランスフェクトＣＨＯ−Ｋ１細胞（クローン８）（４×１０４細胞／ウェル／１００μｌ）を播種した。一晩細胞を付着させた後、細胞培地を除去し、試験抗体を細胞に添加し（細胞培地中１０μｇ／ｍｌ）、４℃で０．５時間インキュベートした。参照として、市販のマウス抗ヒト抗体（ＴＩＭ３ ＭＡＢ １１Ｅ３６５（ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｔ５４６９−９２Ｐ））を使用した。洗浄後（細胞培地で２回）、遠心分離細胞を、ａ）４℃又はｂ）３７℃で３時間、２００μｌの細胞培地中でインキュベートした。内部移行は、典型的には３７℃で起こるが、４℃では起こらず、これは反応の別の制御を提供する。次いで、細胞を室温（ＲＴ）で１０分間、１ｘＰＢＳ中の１００μｌ／ウェルの０．０５％グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａカタログ番号：Ｇ５８８２）で固定した。この後２００μｌのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄工程が続き、二次抗体ヒツジ抗マウスＰＯＤ（西洋わさびＰＯＤ結合Ｆ（ａｂ’）２断片 ＧＥ；ＮＡ９３１０）を室温で１時間添加した。最終洗浄工程（３×ＰＢＳ−Ｔ）の後、ＴＭＢ基質を１５分間添加し（Ｒｏｃｈｅ注文番号１１８３５０３３００１）、１ＮのＨＣｌを用いて発色を停止させた。最終ＯＤは、ＥＬＩＳＡリーダーにおいて４５０／６２０ｎｍでの測定によって決定した。この細胞ＥＬＩＳＡの手順を、ハイブリドーマ上清から精製した試験抗体の内部移行能力の中程度のスループット評価に使用した。
内部移行のパーセンテージは以下のように計算された。
内部移行［％］＝（１−ＯＤ試料＿３７℃／ＯＤ試料＿４℃）＊１００
（内部移行）について結果を１Ａ及びＢに示す。ほとんど全ての試験した抗ＴＩＭ−３モノクローナル抗体は、３７℃で３時間インキュベートした後、安定したＴｉｍ３トランスフェクトＣＨＯ−Ｋ１細胞中に同様に良好に内部移行した（全てのデータは示されていない）。
選択された候補について、ＥＣ５０内部移行値（時間依存性）の決定並びに一価対二価に依存する内部移行の動態の比較をＦＡＣＳによって評価した。
手短に言えば、ヒトＴＩＭ３を安定に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、新鮮な培地を用いて９８ウェルｖ底ＭＴＰに播種し（４×１０５細胞／ウェル／５０μｌ）、非特異的結合をブロックするために室温で１０分間Ｒｅｄｉｍｕｎｅ（登録商標）ＮＦ Ｌｉｑｕｉｄと共にインキュベートした。次いで、選択された精製抗ＴＩＭ３（細胞培地中１０μｇ／ｍｌ）５０μｌ／ウェルを添加し、４℃で１時間インキュベートした。洗浄後（細胞培地による）、遠心分離細胞を、ａ）４℃又はｂ）３７℃で０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間及び２４時間、２００μｌの細胞培地中でインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳ／１％ＢＳＡで洗浄し、二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆ（ａｂ）２を４℃で１時間添加した。洗浄及び遠心分離後、１２５μｌのＣｅｌｌＦｉｘ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１：１０００）を添加し、染色された細胞のＭＦＩシグナルを、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーターによって分析した。
内部移行のパーセンテージは以下のように計算された。
内部移行［％］＝（１−ＭＦＩ試料＿３７℃／ＭＦＩ試料＿４℃）＊１００
ＲＰＭＩ−８２２６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１５５ＴＭ）における抗ＴＩＭ３抗体Ｔｉｍ３＿００１６、Ｔｉｍ３＿００１６変異体（Ｔｉｍ３＿００１８）、Ｔｉｍ３＿００２１、Ｔｉｍ３＿００２８、Ｔｉｍ３＿００３０、Ｔｉｍ３＿００３３、Ｔｉｍ３＿００３８の時間依存性内部移行の評価の例：
現在開示されている抗ＴＩＭ３抗体は、高いレベルでＴＩＭ３発現ＲＰＭＩ−８２２６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１５５ＴＭ）中に迅速に内部移行される。実験は、ｈｕＴＩＭ−３を発現するｒｅｃ ＣＨＯＫ１細胞の代わりにＴＩＭ３を発現するＲＰＭＩ−８２２６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１５５ＴＭ）を用いて上記のように行った。結果を７に示される。ＴＩＭ３参照抗体として、以下の抗体を使用した：米国特許出願公開第２０１２／１８９６１７号に記載の抗体８２１３、国際公開第２０１３／０６４９０号に記載の抗体２７．１２Ｅ１２。Ｔｉｍ３＿００１６、Ｔｉｍ３＿００１６変異体（Ｔｉｍ３＿００１８）、Ｔｉｍ３＿００３８をヒトＩｇＧ１キメラバージョンとして使用した。
Figure 0006517357
結果から、本発明の抗体は、ＲＰＭＩ−８２２６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１５５ＴＭ）において参照抗体と比較して、高い割合で迅速に内部移行される。
実施例７：ＴＩＭ−３を発現する単離されたヒト単球への抗ＴＩＭ−３抗体の結合
ＣＤ１４＋単球を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた密度勾配遠心分離（Ｕｓｅｒ ＭａｎｕａｌｓのＧｅｎｅｒａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを参照するか、又はｗｗｗ．ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ．ｃｏｍ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを参照）及びその後のＣＤ１４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓによる陽性選択により、健常ドナーの抗凝固剤処置末梢血から単離した。最初に、ＣＤ１４＋細胞をＣＤ１４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓにより磁気的に標識する。次いで、細胞懸濁液をＭＡＣＳセパレータの磁場中に配置されたＭＡＣＳ（登録商標）カラムにロードする。磁気的に標識されたＣＤ１４＋細胞はカラムに保持される。非標識細胞が通過すると、この細胞画分はＣＤ１４＋細胞を枯渇させる。磁場からカラムを除去した後、磁気的に保持されたＣＤ１４＋細胞は、陽性選択された細胞画分として溶出することができる。室温で２００×ｇで１０分間遠心分離した後（中断なし）、単球を回収し、結合アッセイにおいて直接使用したか、又は１．０Ｅ＋０７細胞／ｍｌで凍結培地（１０％ＤＭＳＯ、９０％ＦＣＳ）に再懸濁し、液体窒素中で保存した。
文献に示されているように、単球はそれらの表面上に構成的にＴＩＭ３を発現する。１×１０５個の単離されたＣＤ１４＋ヒト単球（５０μｌ／ウェル）を、新鮮な培地中の９８ウェルｖ底ＭＴＰの中に入れ、非特異的結合をブロックするために室温で１５分間Ｒｅｄｉｍｕｎｅ（登録商標）ＮＦ Ｌｉｑｕｉｄと共にインキュベートした。次いで、開示された抗ＴＩＭ３ ｍＡｂ又は参照抗ＴＩＭ−３ ｍＡｂ ３４４８２３（Ｒ＆Ｄ）及びＦ３８−２Ｅ２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）（細胞培地中１０μｇ／ｍｌ）５０μｌ／ウェルを添加し、４℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳ／１％ＢＳＡで洗浄し、二次抗体ＰＥ標識ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ １１５−００６−０７２）を４℃で１時間添加した。洗浄及び遠心分離後、染色された細胞のＭＦＩシグナルを、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーターによって分析した。
特異的結合は以下のように計算された。
特異的結合［ＭＦＩ］＝幾何平均ＭＦＩ試料−幾何平均ＭＦＩアイソタイプ対照
結果を表８に示す（ヒト単球への結合）。ＴＩＭ３クローンＴｉｍ３＿００１６、Ｔｉｍ３＿００１８、Ｔｉｍ３＿００２０、Ｔｉｍ３＿００２８及びＴｉｍ３＿００３８は、参照抗ＴＩＭ−３抗体よりも更に良好に異なるドナーのヒト単球に結合する。
Figure 0006517357
実施例８：ＴＩＭ−３を発現する単離されたカニクイザル単球への抗ＴＩＭ−３抗体の結合
ＣＤ１４＋単球を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた密度勾配遠心分離（Ｕｓｅｒ ＭａｎｕａｌｓのＧｅｎｅｒａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを参照するか、又はｗｗｗ．ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ．ｃｏｍ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを参照）及びその後のＮＨＰ ＣＤ１４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓによる陽性選択により、カニクイザル抗凝固剤処置末梢血（Ｃｏｖａｎｃｅ）から単離した。最初に、ＣＤ１４＋細胞をＣＤ１４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓにより磁気的に標識する。次いで、細胞懸濁液をＭＡＣＳセパレータの磁場中に配置されたＭＡＣＳ（登録商標）カラムにロードする。磁気的に標識されたＣＤ１４＋細胞はカラムに保持される。非標識細胞が通過すると、この細胞画分はＣＤ１４＋細胞を枯渇させる。磁場からカラムを除去した後、磁気的に保持されたＣＤ１４＋細胞は、陽性選択された細胞画分として溶出することができる。室温で２００×ｇで１０分間遠心分離した後（中断なし）、単球を回収し、結合アッセイにおいて直接使用したか、又は１．０Ｅ＋０７細胞／ｍｌで凍結培地（１０％ＤＭＳＯ、９０％ＦＣＳ）に再懸濁し、液体窒素中で保存した。
文献に示されているように、単球はそれらの表面上に構成的にＴＩＭ３を発現する。１×１０５個の単離されたＣＤ１４＋カニクイザル単球（５０μｌ／ウェル）を、新鮮な培地中の９８ウェルｖ底ＭＴＰの中に入れ、非特異的結合をブロックするために室温で１５分間Ｒｅｄｉｍｕｎｅ（登録商標）ＮＦ Ｌｉｑｕｉｄと共にインキュベートした。次いで、Ａｌｅｘａ４８８標識抗ＴＩＭ３（細胞培地中１０μｇ／ｍｌ）５０μｌ／ウェルを添加し、４℃で１時間インキュベートした。洗浄及び遠心分離後、染色された細胞のＭＦＩシグナルを、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーターによって分析した。
特異的結合は以下のように計算された。
特異的結合［ＭＦＩ］＝幾何平均ＭＦＩ試料−幾何平均ＭＦＩアイソタイプ対照
結果を表９に示す（カニクイザル単球への結合）。ＴＩＭ３クローンＴｉｍ３＿００１６、Ｔｉｍ３＿００１８、Ｔｉｍ３＿００２６、Ｔｉｍ３＿００２８及びＴｉｍ３＿００３０は、異なるカニクイザルドナーのカニクイザル単球に結合する。
Figure 0006517357
実施例９：ＴＩＭ−３を発現するＮＨＬ及びＭＭ細胞株に対する抗ＴＩＭ−３抗体の結合
開示された抗ＴＩＭ３抗体及び２つの抗ＴＩＭ３参照抗体クローン（１）４１７７及び（２）８２１３（Ｋｙｏｗａ）の結合能をＦＡＣＳによって分析した。手短に言えば、非特異的結合をブロックするために、ヒトＴＩＭ３発現Ｂ細胞リンパ腫細胞（Ｐｆｅｉｆｆｅｒ細胞として例示される）及び多発性骨髄腫細胞（ＲＰＭＩ−８２２６細胞として例示される）をＢＤヒトＦｃ Ｂｌｏｃｋとともに室温で１０分間インキュベートした。次いで、２×１０５個の細胞（５０μｌ／ウェル）を９８ウェルｖ底ＭＴＰに入れ、５０μｌ／ウェルのＡｌｅｘａ４８８標識抗ＴＩＭ３（ＢＤ染色緩衝液中に１０μｇ／ｍｌ）を添加し、４℃で１時間インキュベートした。洗浄及び遠心分離後、染色された細胞のＭＦＩシグナルを、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーターによって分析した。
特異的結合は以下のように計算された。
特異的結合［ＭＦＩ］＝幾何平均ＭＦＩ試料−幾何平均ＭＦＩアイソタイプ対照
結果を図２Ａ及び２Ｂに示す（ＲＰＭＩ−８２２６及びＰｆｅｉｆｆｅｒ細胞への結合）。
実施例１０：ＴＩＭ−３を発現するＮＨＬ及びＭＭ細胞における抗ＴＩＭ−３抗体の細胞傷害活性
シュードモナス外毒素（ＰＥ２４）とコンジュゲートしたＴＩＭ３特異的抗体は、ＴＩＭ３発現細胞を効果的に死滅させる。
開示された抗ＴＩＭ３抗体及び１つの市販の入手可能な抗ＴＩＭ３参照抗体クローン１１Ｅ３６５（ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから入手可能）の細胞傷害活性を、Ｐｒｏｍｅｇａ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存アッセイで分析した。手短に言えば、５×１０３個（９８ウェルＭＴＰ中５０μｌ／ウェル、３通り）のヒトＴＩＭ−３を安定的に発現する組換えＣＨＯ Ｋ１又は２×１０４個の細胞（９８ウェルＭＴＰ中５０μｌ／ウェル、３通り）のヒトＴＩＭ３発現Ｂ細胞リンパ腫細胞（Ｐｆｅｉｆｆｅｒ細胞として例示される）又は多発性骨髄腫細胞（ＲＰＭＩ−８２２６細胞として例示される）に、１０μｇ／ｍｌの最高濃度を有する開示された抗ＴＩＭ−３抗体の２５μｌ／ウェル１：５連続希釈物を添加し、又は未処置細胞に対して適切な培地を、若しくは非標的化処置細胞に対してアイソタイプ対照を添加した。処置は３通りで１０μｇ／ｍｌから１ｎｇ／ｍｌの範囲にわたる。全ての抗体を完全長マウスＦｃγバージョンとして使用した。シュードモナス外毒素のコンジュゲーションのコンジュゲーションのために、ＰＥ２４とコンジュゲートしたマウスＦｃγ断片特異的Ｆａｂの１０μｇ／ｍｌを添加し、３７℃で３日間インキュベートした。真核生物における既知のタンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミドを陽性対照として用いた。処置細胞の生存率をＰｒｏｍｅｇａ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙを用いて測定した。
細胞傷害活性は以下のように計算された。
相対的（Ｒｅｌ．）阻害［％］＝（１−（Ｅ試料−Ｅ陰性対照）／（Ｅ陽性対照−Ｅ陰性対照））＊１００
結果は表１０に示される（サンドイッチフォーマットにおけるＴＩＭ−３発現組換えＮＨＬ及びＭＭ細胞株に対する抗ＴＩＭ３ ｍＡｂの細胞傷害活性）。
Figure 0006517357
試験した全てのＴＩＭ３クローンは、ヒトＴＩＭ−３を安定的に発現する組換えＣＨＯ Ｋ１並びに高レベル及び中レベルのＴＩＭ−３を発現するＰｆｅｉｆｆｅｒ細胞に対して非常に強力であり（ＩＣ５０は０．０１−０．２ｎＭの範囲）、かつ強力な内部移行参照抗ＴＩＭ−３ Ａｂクローン１１Ｅ３６５、ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌよりも細胞毒性活性が更に強力である。ＴＩＭ３クローン００１６、００１８、００２１、００２２、００３３及び００３８は、組換えＣＨＯ ＴＩＭ−３細胞と比較して５倍低いＴＩＭ−３レベルを発現するＲＰＭＩ−８２２６細胞に対しても強力である。
実施例１１：開示された抗ＴＩＭ３抗体対２つの抗ＴＩＭ３参照抗体１．７．Ｅ１０及び２７−１２Ｅ１２（国際公開第２０１３／０６４９０号に記載）の細胞傷害活性の比較。
開示された抗ＴＩＭ３抗体及び２つの抗ＴＩＭ３参照抗体、国際公開第２０１３／０６４９０号に記載のＴＩＭ３参照抗体１．７Ｅ１０及び２７．１２Ｅ１２の細胞傷害活性は、上記のようにＰｒｏｍｅｇａ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイにより分析した。全ての抗体は、ヒトＦｃガンマ部分を含む完全長ヒトＩｇＧ１フォーマットとして使用した。この実験では、シュードモナス外毒素のコンジュゲーションは、ＰＥ２４とコンジュゲートしたヒトＦｃγ断片特異的Ｆａｂ（１０μｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で５日間インキュベートすることにより達成された。
結果は表１１に示される。− ＴＩＭ−３発現ＮＨＬ及びＭＭ細胞株に対する抗ＴＩＭ３ ｍＡｂの細胞傷害活性の比較。
Figure 0006517357
開示された全てのＴＩＭ３クローンは、ＴＩＭ−３を発現するＰｆｅｉｆｆｅｒ細胞及びＲＰＭＩ−８２２６細胞に対して非常に強力であり（ＩＣ５０は０，０２−０，０８ｎＭの範囲）、かつ強力な内部移行参照抗ＴＩＭ−３ Ａｂクローン２７−１２よりも細胞毒性活性が更に強力である。全ての抗体を、同じ条件下で同じシュードモナス外毒素を用いてシュードモナス外毒素（ＰＥ２４）コンジュゲートとして比較した。
実施例１２：ＭＭ、ＮＨＬ及びＡＭＬ細胞株（ＴＩＭ３を発現するが、ＰＳＭＡは発現しない）に対する開示された抗ＴＩＭ３抗体のＦａｂ−ＰＥ２４構築物の細胞傷害活性。
細胞傷害活性を、上記のＰｒｏｍｅｇａ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存アッセイで分析した。５０μｇ／ｍｌの最高濃度を有するＰＥ２４に直接コンジュゲートした開示された抗ＴＩＭ３抗体のＦａｂ断片の１：５連続希釈物又は未処置細胞に対する適切な培地又は非標的化処置細胞に対する非結合抗ＰＳＭＡ Ｆａｂ−ＰＥ２４対照を、３７℃で４日間、７，５×１０３個のＰｆｅｉｆｆｅｒ細胞又は２×１０３個のＲＰＭＩ−８２２６細胞（９８ウェルＭＴＰ中５０μｌ／ウェル）と共にインキュベートした。処置は３通りで５０μｇ／ｍｌから８ｎｇ／ｍｌの範囲にわたる。シクロヘキシミドを陽性対照として用いた。
結果は表１２に示される。ＭＭ、ＮＨＬ及びＡＭＬ細胞株に対する開示された抗ＴＩＭ３抗体のＦａｂ−ＰＥ２４構築物の細胞傷害活性。
Figure 0006517357
開示された抗ＴＩＭ３抗体の全ての試験されたＦａｂ−ＰＥ２４コンストラクトは、中程度のレベルのＴＩＭ−３を発現するＭＭ（ＲＰＭＩ−８２２６）及びＮＨＬ（Ｋａｒｐａｓ−２９９）細胞に対して非常に強力であり（ＩＣ５０の範囲は１−１０ｎＭ）、非常に低レベルのＴＩＭ−３を発現するＡＭＬ細胞株（ＣＭＫ、ＴＦ−１、ＭＯＬＭ−１３）に対して有意な細胞傷害活性を実証する。
実施例１３：再発／難治性の患者由来の原発性白血病幹／前駆体ＡＭＬ細胞に対する、開示された抗ＴＩＭ３の免疫コンジュゲート（シュードモナス外毒素Ａコンジュゲート（Ｆａｂ−ＰＥ２４コンストラクト））の細胞傷害活性
再発／難治性の患者の末梢血からのＣＤ３４＋細胞は、ＡｌｌＣｅｌｌｓ、ＬＬＣ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡから入手した。
Figure 0006517357
全ての試料（純度の範囲は８４−９４％であり生存の範囲は９５−９９％）の純度及び生存率を確認した後、ＴＩＭ−３の発現レベルを、抗ＴＩＭ−３ ｍＡｂ ３４４８２３（Ｒ＆Ｄ）を用いて実施例７に記載のようにＦＡＣＳにより評価した。（図３を参照）
再発／難治性の患者由来の全ての試験された（４／４初代白血病幹／前駆細胞（ＣＤ３４＋）ＡＭＬ試料は、異なるレベルでＴＩＭ−３の均質な発現を示す。
初代ＣＤ３４＋ＡＭＬ細胞に対する開示された抗ＴＩＭ３クローン（００１６及び００２２）のＦａｂ−ＰＥ２４コンストラクトの細胞傷害活性の評価のために、１×１０４個の細胞（９８ウェルＭＴＰ中５０μｌ／ウェル、３通り）を、５０μｇ／ｍｌの最高濃度を有するＦａｂ断片の１：５連続希釈物、又は未処置細胞への適切な培地、又は非標的化処置細胞への非結合抗ＰＳＭＡ Ｆａｂ−ＰＥ２４対照とともに３７℃で３日間培養した。シクロヘキシミドを陽性対照として用いた。細胞傷害活性を、実施例１２に上記されるようにＰｒｏｍｅｇａ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存アッセイで分析した。
結果は表１４に示される。（初代ＣＤ３４＋ＡＭＬ細胞に対する開示された抗ＴＩＭ３抗体のＦａｂ−ＰＥ２４コンストラクトの細胞傷害活性）。
Figure 0006517357
抗ＴＩＭ３抗体のＦａｂ−ＰＥ２４コンストラクトＴｉｍ３＿００１６及びＴｉｍ３＿００２２は、（２／４）初代ＡＭＬ試料（ＰＢ０１４２及びＰＢ０１３５）（ＩＣ５０の範囲は３０−１１６ｎＭ）に対して非常に強力であり、異なるレベルのＴＩＭ−３を発現する全ての（４／４）初代白血病幹／前駆細胞（ＣＤ３４＋）ＡＭＬ細胞に対して有意な細胞傷害活性を実証する。
実施例１４：ＮＨＬ及びＭＭ細胞株に対する選択された抗ＴＩＭ３抗体のＦａｂ−ＰＥ２４コンストラクトの効力の比較
選択された開示された抗ＴＩＭ３抗体のソルターゼ結合Ｆａｂ−ＰＥ２４コンストラクトの細胞傷害活性の評価を、実施例１２に上記されるようにＰｒｏｍｅｇａ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイで分析した。
結果は表１５に示される。（ＮＨＬ及びＭＭ細胞に対する選択された抗ＴＩＭ３抗体のＦａｂ−ＰＥ２４コンストラクトの細胞傷害活性）。
Figure 0006517357
中程度のレベルのＴＩＭ−３を発現するＮＨＬ（Ｐｆｅｉｆｆｅｒ）及びＭＭ（ＲＰＭＩ−８２２６）細胞に対して全ての選択された抗ＴＩＭ３抗体（ＩＣ５０の範囲は０，３−５ｎＭ）のＦａｂ−ＰＥ２４コンストラクトで高い細胞毒性効力が示された。
最も高い細胞傷害活性は、開示された抗ＴＩＭ３抗体Ｔｉｍ３＿００２及びＴｉｍ３＿ ００３８のＦａｂ−ＰＥ２４コンストラクトで観察された。
実施例１５：Ｆａｂ−ＰＥ２４コンストラクト対開示された抗ＴＩＭ−３抗体の同じクローンの完全ＩｇＧ−アマトキシンコンジュゲートについてのＰｆｅｉｆｆｅｒ細胞に対する細胞傷害活性の比較
開示された抗ＴＩＭ３クローン００１６のコンジュゲートされたＦａｂ−ＰＥ２４コンストラクト対アマトキシンとコンジュゲートした同じクローンの完全ＩｇＧ（国際公開第２０１２／０４１５０４号に記載される手順に従い、アモトキシンアミノ酸４の６’Ｃ原子を介して、特に、アモトキシンアミノ酸の６’Ｃ原子に結合した酸素原子を介してコンジュゲートされたものであり、ここでＴＩＭ３抗体は、尿素部分を介してリンカーによって連結されている）についての細胞傷害活性の評価は、実施例１２に上記されるようにＰｒｏｍｅｇａ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイで分析した。
結果は表１６に示される。（Ｆａｂ−ＰＥ２４コンストラクト対抗ＴＩＭ３クローン００１６の完全ＩｇＧ−アマトキシンコンジュゲートについてのＮＨＬ細胞に対する細胞障害活性）。
Figure 0006517357
アマニチンコンジュゲート抗ＴＩＭ−３クローン（ＩＣ５０ ０．８ｎＭ）の細胞傷害活性は、中程度のレベルのＴＩＭ３を発現するＮＨＬ（Ｐｆｅｉｆｆｅｒ）細胞に対する同じクローンのＦａｂ−ＰＥ２４コンストラクト（ＩＣ５０ ０．３ｎＭ）の細胞傷害活性と同等である。
実施例１５：異なる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対するＴＩＭ３抗体の結合の直接比較
結合アッセイ
新たに単離されたＰＢＭＣ又は３日間ポリクローナルに活性化された（プレート結合抗ＣＤ３抗体及び可溶性抗ＣＤ２８抗体、それぞれ１μｇ／ｍｌ、両方ともＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製）ＣＤ４ Ｔ細胞を、Ａｌｅｘａ６４７−直接コンジュゲート型抗ＴＩＭ−抗体Ｔｉｍ３−００１８、Ｔｉｍ３−００２８、又はそのキメラ化若しくはヒト化バージョンで４℃で１時間染色した。次いで、細胞を洗浄して非結合抗体を除去し、単球（ＣＤ１４＋（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））、ＮＫ細胞（ＣＤ１６＋（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ５６＋（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びＣＤ３−）及びＴ細胞細胞（ＣＤ３＋（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））を識別するために４℃で３０分間表面マーカーについて染色し、その後ＢＤ Ｃｅｌｌ Ｆｉｘにより固定した。細胞は、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓで入手した。
結果を図４Ａから４Ｄに示す（図中、以下の名称が使用された：Ｔｉｍ３−００１８について：００１８（ａＴＩＭ−３），ヒト化Ｔｉｍ３−００１８バージョン Ｔｉｍ３−０４３４について：０４３４（ｈ００１８）、Ｔｉｍ３−００２８について：００２８（ａＴＩＭ−３）、キメラＴｉｍ３−００２８について：ｃｈｉ００２８、ヒト化Ｔｉｍ３−００２８バージョンＴｉｍ３−０４３８について：０４３８（ｈ００２８））。データは、ヒト化抗体は、親抗体と比較した場合、ＣＤ４ Ｔ細胞への結合及び結合特異性を改善していることを示している。

Claims (21)

  1. ＴＩＭ３に結合する単離された抗体であって、
    Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
    Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
    Ｃ）（ａ）（ｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン
    を含む、抗体。
  2. ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である、請求項１に記載の抗体。
  3. ＴＩＭ３に結合する抗体断片である、請求項１に記載の抗体。
  4. Ｆａｂ断片である、請求項３に記載の抗体断片。
  5. 抗体が、（ａ）（ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む、ヒトＴＩＭ３に結合する単離された抗体。
  6. 抗体が、
    ｉ）配列番号８３のＶＨ配列及び配列番号８４のＶＬ配列、又は
    ｉｉ）配列番号８５のＶＨ配列及び配列番号８６のＶＬ配列
    を含む、請求項５に記載の抗体。
  7. 抗体が、
    配列番号８３のＶＨ配列及び配列番号８４のＶＬ配列
    を含む、請求項５に記載の抗体。
  8. 抗体が、
    配列番号８５のＶＨ配列及び配列番号８６のＶＬ配列
    を含む、請求項５に記載の抗体。
  9. 完全長ＩｇＧ１抗体である、請求項１から８の何れか一項に記載の抗体。
  10. 変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する完全長ＩｇＧ１抗体である、請求項１から９の何れか一項に記載の抗体。
  11. 請求項１から１０の何れか一項に記載の抗体をコードする、単離された核酸。
  12. 請求項１１に記載の核酸を含む宿主細胞。
  13. 抗体が産生されるように、請求項１２に記載の宿主細胞を培養することを含む、請求項１から１０の何れか一項に記載の抗体を産生する方法。
  14. 抗体を宿主細胞から回収することを更に含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 請求項１から１０の何れか一項に記載の抗体と細胞傷害性剤とを含む、イムノコンジュゲート。
  16. 請求項１から１０の何れか一項に記載の抗体又は請求項１５に記載のイムノコンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含む、薬学的製剤。
  17. 医薬としての使用のための、請求項１から１０の何れか一項に記載の抗体又は請求項１５に記載のイムノコンジュゲート。
  18. がんを治療することにおける使用のための、請求項１から１０の何れか一項に記載の抗体又は請求項１５に記載のイムノコンジュゲート。
  19. 医薬の製造における使用のための、請求項１から１０の何れか一項に記載の抗体又は請求項１５に記載のイムノコンジュゲートの使用。
  20. 医薬はがんの治療のためのものである、請求項１９に記載の使用。
  21. がんを有する個体を治療するための医薬であって、請求項１から１０の何れか一項に記載の抗体又は請求項１５に記載のイムノコンジュゲートの有効量を含む、医薬。
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