WO2023286854A1 - 抗Ｔｉｍ－３抗原抗体または抗体誘導体およびその用途 - Google Patents
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Definitions
- the present invention provides an antibody or antibody derivative that has binding properties to the Tim-3 antigen expressed in cancer cells, immune cells, etc., and has the effect of removing the suppressive signal of the body's immune system against cancer cells, and the The present invention relates to compositions and methods for cancer therapy and cancer detection comprising antibodies or antibody derivatives.
- cancer cells use immune checkpoint molecules in addition to regulatory T cells (Treg) and myeloid-derived suppressor cells (MDSC). It actively utilizes its suppressive function to escape from the immune system.
- Treg regulatory T cells
- MDSC myeloid-derived suppressor cells
- Immune checkpoint inhibitors inhibit the binding of these immune checkpoint molecules to their ligands, inhibiting the transmission of immunosuppressive signals, thereby inhibiting T cells that have been suppressed by immune checkpoint molecules in cancer cells. It can release suppression of activation, reactivate immune function, and generate immune action against cancer cells. By utilizing this function, it is possible to treat cancer cells by a mechanism different from conventionally used anticancer drugs and molecular-targeted drugs.
- drugs marketed as immune checkpoint inhibitors include the PD-1/PD-L1 inhibitors nivolumab and pembrolizumab (anti-PD-1 antibodies), as well as atezolizumab and durvalumab (anti-PD-L1 antibodies). and CTLA-4/B7 (CD80/CD86) inhibitor ipilimumab (anti-CTLA-4 antibody) are known. These antibody-based drugs have shown high efficacy in several cancer types, either alone or in combination with other anticancer drugs.
- the response rate of conventional immune checkpoint inhibitors is said to be about 5-30%, and it is clear that individual differences in the immune status of cancer patients are particularly related to the effects of immune checkpoint inhibitors. It's becoming This individual difference in cancer immunity is mainly caused by genetic abnormalities in cancer cells, and is caused by the patient's immune constitution (genetic background such as HLA type), various environmental factors (intestinal bacteria, smoking, ultraviolet rays, etc.). , diet, stress, etc.) and is thought to be influenced by these existing immune checkpoint inhibitors. There are patients who cannot respond.
- Tim-3 (also known as HAVCR2) is known as one of the immune checkpoint molecules. Tim-3 is one of the T cell Ig and mucin domain containing molecule superfamily. Tim3 is a key regulatory molecule in T cell tolerance and has been shown to play a pivotal role in autoimmunity and T cell exhaustion during chronic viral infection. (Non-Patent Document 1).
- Tim-3 is expressed on Th1 cells (type 1 T helper cells), dendritic cells, CD8+ T cells and other lymphocyte subsets. Tim-3 interacts with many ligands such as Phosphatidylserine (PS), CEACAM1 (Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1), Galectin-9, and HMGB1 (High mobility group box 1). Since the galectin-9 pathway negatively regulates Th1 cell (type 1 T helper cell) immunity (Non-Patent Document 2), inhibition of Tim-3 is expected to enhance innate and acquired immunity. ing.
- PS Phosphatidylserine
- CEACAM1 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1
- Galectin-9 Galectin-9
- HMGB1 High mobility group box
- Tim-3 which is expressed in some cancer cells, plays an important role in the process of cancer progression.
- Tim-3 expressed in tumor cells binds to Galectin-9, which is secreted by the tumor cells themselves.
- the present invention provides antibodies or antibody derivatives that target the Tim-3 antigen and have higher functions (hereinafter collectively referred to as "antibodies or antibody derivatives" are referred to as antibodies, etc.), more specifically, An object of the present invention is to develop an antibody or the like having a high immunosuppressive signal-removing activity, and to develop a composition for cancer treatment containing such an antibody or the like.
- the present invention has discovered an antibody or the like that has binding properties to the Tim-3 antigen and has the effect of removing the suppressive signal of the body's immune system against cancer cells, and has shown that the above problems can be solved.
- a heterodimeric antibody or antibody derivative that is a combination of two different half-molecules that has binding properties to Tim-3 antigen and enhances immune activity against cancer cells.
- One of the half molecules of the antibody or the half molecule of the antibody derivative binds to the first region of the Tim-3 antigen, and the other half molecule of the antibody or the half molecule of the antibody derivative binds to the Tim-3 antigen.
- the antibody or antibody derivative of [1] which binds to the second region.
- a half molecule of an antibody or a half molecule of an antibody derivative is (1) the complementarity determining region of the heavy chain, CDR1 (SYYMS, SEQ ID No: 1), CDR2 (TISNSGGSIYYLDSVKD, SEQ ID No: 2) and CDR3 (DPYYSNYVPMDY, SEQ ID No: 3), and complementation of the light chain; sex-determining regions, CDR1 (KASQYVDTYVA, SEQ ID No: 4), CDR2 (SASTRHT, SEQ ID No: 5) and CDR3 (AQYSSSPLT, SEQ ID No: 6); (2) the complementarity determining region of the heavy chain, CDR1 (DYYMD, SEQ ID No: 9), CDR2 (YIYPNNGGTSYNQKFKG, SEQ ID No: 10) and CDR3 (SGYGNYYTMDY, SEQ ID No: 11), and complementation of the light chain; sex-determining regions, CDR1 (KASQY
- the antibody derivative is selected from humanized antibody, chimeric antibody, single chain Fv antibody (scFv antibody), Fab, Fab', F(ab')2, Fc effector function modified antibody, IgG1LALA, IgG1_N297A, IgG4_S228P.
- the amino acid sequence of the heavy chain variable region VH domain of the half molecule of the antibody or the half molecule of the antibody derivative is (VH-1a) the amino acid sequence of SEQ ID No: 7 or, in the amino acid sequence of SEQ ID No: 7, CDR1 (SEQ ID No: 1), CDR2 (SEQ ID No: 2), and CDR3 (SEQ ID No: 2); Amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than : 3), (VH-1b) the amino acid sequence of SEQ ID No: 49, or CDR1 (SEQ ID No: 1), CDR2 (SEQ ID No: 2), and CDR3 (SEQ ID No: 2) in the amino acid sequence of SEQ ID No: 49; Amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than : 3), (VH-1c) the amino acid sequence of
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VH-2b) the amino acid sequence of SEQ ID No: 62, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 62, CDR1 (SEQ ID No: 9), CDR2 (SEQ ID No: 10), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VH-3a) the amino acid sequence of SEQ ID No: 23, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 23, CDR1 (SEQ ID No: 17), CDR2 (SEQ ID No: 18), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VH-3b) the amino acid sequence of SEQ ID No: 66, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 66, CDR1 (SEQ ID No: 17), CDR2 (SEQ ID No: 18), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VH-4a) the amino acid sequence of SEQ ID No: 31, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 31, CDR1 (SEQ ID No: 25), CDR2 (SEQ ID No: 26), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than (VH-4b) the amino acid sequence of SEQ ID No: 70, or SEQ Among the amino acid sequences of ID No: 70, one or several amino acid substitutions ( (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions, and (VH-5a) the amino acid sequence of SEQ ID No: 36, or the amino acid sequence of SEQ ID No: 36, CDR1 (SEQ ID No: 33), CDR2 (SEQ ID No: 34), and CDR3 (SEQ ID No: 35), amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions , (VH-5b) the amino acid sequence of SEQ ID No: 51, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 51, CDR1 (SEQ ID No: 33), CDR2 (SEQ ID No: 34), and CDR3 (
- amino acid sequence of SEQ ID No: 75 or in the amino acid sequence of SEQ ID No: 75, CDR1 (SEQ ID No: 9), CDR2 (SEQ ID No: 74), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VH-8) the amino acid sequence of SEQ ID No: 77, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 77, CDR1 (SEQ ID No: 9), CDR2 (SEQ ID No: 76), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VH-9) the amino acid sequence of SEQ ID No: 79, or, in the amino acid sequence of SEQ ID No: 79, CDR1 (SEQ ID No: 17), CDR2 (SEQ ID No: 78), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequence of SEQ ID No: 81 or in the amino acid sequence of SEQ ID No: 81, CDR1 (SEQ ID No: 17), CDR2 (SEQ ID No: 80), and CDR3 (SEQ ID No.
- the antibody or antibody derivative according to any one of [1] to [5], which is selected from the group consisting of [7] the amino acid sequence of the light chain variable region VL domain of a half molecule of an antibody or a half molecule of an antibody derivative is (VL-1a) the amino acid sequence of SEQ ID No: 8, or in the amino acid sequence of SEQ ID No: 8, CDR1 (SEQ ID No: 4), CDR2 (SEQ ID No: 5), and CDR3 (SEQ ID No.
- Amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than : 6
- VL-1b the amino acid sequence of SEQ ID No: 58, or in the amino acid sequence of SEQ ID No: 58, CDR1 (SEQ ID No: 4), CDR2 (SEQ ID No: 5), and CDR3 (SEQ ID No.
- Amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than : 6
- VL-1c the amino acid sequence of SEQ ID No: 50, or, in the amino acid sequence of SEQ ID No: 50, CDR1 (SEQ ID No: 4), CDR2 (SEQ ID No: 5), and CDR3 (SEQ ID No.
- Amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than : 6
- VL-2a the amino acid sequence of SEQ ID No: 16, or CDR1 (SEQ ID No: 12), CDR2 (SEQ ID No: 13), and CDR3 (SEQ ID No: 13) in the amino acid sequence of SEQ ID No: 16; : 14) amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than (VL-2b) the amino acid sequence of SEQ ID No: 63, or CDR1 (SEQ ID No: 12), CDR2 (SEQ ID No: 13), and CDR3 (SEQ ID No: 13) in the amino acid sequence of SEQ ID No: 63; : 14) amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than (VL-2c)
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VL-3c) the amino acid sequence of SEQ ID No: 68, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 68, CDR1 (SEQ ID No: 20), CDR2 (SEQ ID No: 21), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VL-3d) the amino acid sequence of SEQ ID No: 69, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 69, CDR1 (SEQ ID No: 20), CDR2 (SEQ ID No: 21), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VL-4a) the amino acid sequence of SEQ ID No: 32, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 32, CDR1 (SEQ ID No: 28), CDR2 (SEQ ID No: 29), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions
- Amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than : 6
- VL-5c the amino acid sequence of SEQ ID No: 50, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 50, CDR1 (SEQ ID No: 4), CDR2 (SEQ ID No: 5), and CDR3 (SEQ ID No.
- Amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than : 6
- VL-6a the amino acid sequence of SEQ ID No: 56, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 56, CDR1 (SEQ ID NO: 52), CDR2 (SEQ ID NO: 53), and CDR3 (SEQ ID NO: 53); : 54) containing one or several amino acid substitutions (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in parts other than (VL-6b) the amino acid sequence of SEQ ID No: 60, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 60, CDR1 (SEQ ID NO: 52), CDR2 (SEQ ID NO: 53), and CDR3 (SEQ ID NO: 53); : 54) containing one or several amino acid substitutions (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in parts other than (VL-6c) the amino acid sequence of SEQ ID No
- Cancer cells are selected from the group consisting of melanoma, breast cancer, lung cancer, colon cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, liver cancer, blood cancer, any one of [1] to [10] The antibody or antibody derivative according to the paragraph.
- CDR1 heavy chain complementarity determining regions
- CDR2 TISNSGGSIYYLDSVKD, SEQ ID No: 2)
- CDR3 DYYSNYVPMDY, SEQ ID No: 3
- CDR1 KASQYVDTYVA, SEQ ID No: 4
- CDR2 SASTRHT, SEQ ID No: 5
- CDR3 AQYSSSPLT, SEQ ID No: 6
- the complementarity determining region of the heavy chain CDR1 (DYYMD, SEQ ID No: 9), CDR2 (YIYPNNGGTSYNQKFKG, SEQ ID No: 10) and CDR3 (SGYGNYYTMDY, SEQ ID No: 11), and complementation of the light chain; sex-determining regions, CDR1 (KASQSVGNNVA, SEQ ID No: 12), CDR2 (YASNRY
- the amino acid sequence of the heavy chain variable region VH domain of a half molecule of an antibody or a half molecule of an antibody derivative is (VH-1a) the amino acid sequence of SEQ ID No: 7 or, in the amino acid sequence of SEQ ID No: 7, CDR1 (SEQ ID No: 1), CDR2 (SEQ ID No: 2), and CDR3 (SEQ ID No: 2); Amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than : 3), (VH-1b) the amino acid sequence of SEQ ID No: 7 or, in the amino acid sequence of SEQ ID No: 7, CDR1 (SEQ ID No: 1), CDR2 (SEQ ID No: 2), and CDR3 (SEQ ID No: 2); Amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than : 3), (VH-1b) the amino acid sequence of
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VH-2b) the amino acid sequence of SEQ ID No: 62, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 62, CDR1 (SEQ ID No: 9), CDR2 (SEQ ID No: 10), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VH-3a) the amino acid sequence of SEQ ID No: 23, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 23, CDR1 (SEQ ID No: 17), CDR2 (SEQ ID No: 18), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VH-3b) the amino acid sequence of SEQ ID No: 66, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 66, CDR1 (SEQ ID No: 17), CDR2 (SEQ ID No: 18), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VH-4a) the amino acid sequence of SEQ ID No: 31, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 31, CDR1 (SEQ ID No: 25), CDR2 (SEQ ID No: 26), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than (VH-4b) the amino acid sequence of SEQ ID No: 70, or SEQ Among the amino acid sequences of ID No: 70, one or several amino acid substitutions ( (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions, and (VH-5a) the amino acid sequence of SEQ ID No: 36, or the amino acid sequence of SEQ ID No: 36, CDR1 (SEQ ID No: 33), CDR2 (SEQ ID No: 34), and CDR3 (SEQ ID No: 35), amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions , (VH-5b) the amino acid sequence of SEQ ID No: 51, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 51, CDR1 (SEQ ID No: 33), CDR2 (SEQ ID No: 34), and CDR3 (
- amino acid sequence of SEQ ID No: 75 or in the amino acid sequence of SEQ ID No: 75, CDR1 (SEQ ID No: 9), CDR2 (SEQ ID No: 74), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VH-8) the amino acid sequence of SEQ ID No: 77, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 77, CDR1 (SEQ ID No: 9), CDR2 (SEQ ID No: 76), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VH-9) the amino acid sequence of SEQ ID No: 79, or, in the amino acid sequence of SEQ ID No: 79, CDR1 (SEQ ID No: 17), CDR2 (SEQ ID No: 78), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequence of SEQ ID No: 81 or in the amino acid sequence of SEQ ID No: 81, CDR1 (SEQ ID No: 17), CDR2 (SEQ ID No: 80), and CDR3 (SEQ ID No.
- the amino acid sequence of the light chain variable region VL domain of a half molecule of an antibody or a half molecule of an antibody derivative is (VL-1a) the amino acid sequence of SEQ ID No: 8, or in the amino acid sequence of SEQ ID No: 8, CDR1 (SEQ ID No: 4), CDR2 (SEQ ID No: 5), and CDR3 (SEQ ID No.
- Amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than : 6
- VL-1b the amino acid sequence of SEQ ID No: 58, or in the amino acid sequence of SEQ ID No: 58, CDR1 (SEQ ID No: 4), CDR2 (SEQ ID No: 5), and CDR3 (SEQ ID No.
- Amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than : 6
- VL-1c the amino acid sequence of SEQ ID No: 50, or, in the amino acid sequence of SEQ ID No: 50, CDR1 (SEQ ID No: 4), CDR2 (SEQ ID No: 5), and CDR3 (SEQ ID No.
- Amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than : 6
- VL-2a the amino acid sequence of SEQ ID No: 16, or CDR1 (SEQ ID No: 12), CDR2 (SEQ ID No: 13), and CDR3 (SEQ ID No: 13) in the amino acid sequence of SEQ ID No: 16; : 14) amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than (VL-2b) the amino acid sequence of SEQ ID No: 63, or CDR1 (SEQ ID No: 12), CDR2 (SEQ ID No: 13), and CDR3 (SEQ ID No: 13) in the amino acid sequence of SEQ ID No: 63; : 14) amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than (VL-2c)
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VL-3c) the amino acid sequence of SEQ ID No: 68, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 68, CDR1 (SEQ ID No: 20), CDR2 (SEQ ID No: 21), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VL-3d) the amino acid sequence of SEQ ID No: 69, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 69, CDR1 (SEQ ID No: 20), CDR2 (SEQ ID No: 21), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VL-4a) the amino acid sequence of SEQ ID No: 32, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 32, CDR1 (SEQ ID No: 28), CDR2 (SEQ ID No: 29), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions
- Amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than : 6
- VL-5c the amino acid sequence of SEQ ID No: 50, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 50, CDR1 (SEQ ID No: 4), CDR2 (SEQ ID No: 5), and CDR3 (SEQ ID No.
- Amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than : 6
- VL-6a the amino acid sequence of SEQ ID No: 56, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 56, CDR1 (SEQ ID NO: 52), CDR2 (SEQ ID NO: 53), and CDR3 (SEQ ID NO: 53); : 54) containing one or several amino acid substitutions (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in parts other than (VL-6b) the amino acid sequence of SEQ ID No: 60, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 60, CDR1 (SEQ ID NO: 52), CDR2 (SEQ ID NO: 53), and CDR3 (SEQ ID NO: 53); : 54) containing one or several amino acid substitutions (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in parts other than (VL-6c) the amino acid sequence of SEQ ID No
- Antibodies or antibody derivatives (such as antibodies) obtained by the present invention suppress the function of Tim-3 antigen expressed in cancer cells or immune cells, and via various mechanisms, for example, immune cells (particularly T cells). ), it activates immune cells and exerts tumor growth inhibitory and cancer therapeutic effects.
- the present invention can be widely used as a therapeutic/diagnostic agent for cancer. Since the antibody according to the present invention has the effect of relieving exhaustion of immune cells, it is expected to be particularly effective in combination therapy with other immunotherapies.
- FIG. 1 is a diagram showing the results of epitope binning of antibodies for confirming competition/non-competition between antibodies obtained in Example 1.
- FIG. FIG. 2 shows the results of binding analysis of the anti-human Tim-3 antibodies selected in Example 2 using Jurkat cells stably expressing human Tim-3 or Expi293 cells transiently expressing human Tim-3. be.
- FIG. 3 shows the results of flow cytometry analysis of the binding of the anti-human Tim-3 antibody selected in Example 2 to human Tim-3 on the membrane of activated T cells.
- FIG. 4 shows the results of ELISA analysis of the ability of the anti-human Tim-3 antibodies selected in Example 2 to inhibit the binding of human Tim-3 and human Galectin-9.
- FIG. 5 shows the results of flow cytometry analysis of the ability of the anti-human Tim-3 antibody selected in Example 2 to inhibit the binding of human Tim-3 to Phosphatidylserine.
- FIG. 6 shows the binding analysis using the anti-human Tim-3 biparatopic antibody prepared in Example 5 and Jurkat cells stably expressing human Tim-3 or expi293 cells transiently expressing human Tim-3.
- FIG. 10 is a diagram showing the results of the experiment.
- FIG. 7 shows the results of flow cytometry analysis of the binding of the anti-human Tim-3 biparatopic antibody prepared in Example 5 to human Tim-3 on the membrane of activated T cells.
- FIG. 8 shows the results of ELISA analysis of the ability of the anti-human Tim-3 biparatopic antibody prepared in Example 5 to inhibit the binding of human Tim-3 and human Galectin-9.
- FIG. 9 is a diagram showing the results of flow cytometry analysis of the ability of the anti-human Tim-3 biparatopic antibody prepared in Example 5 to inhibit the binding of human Tim-3 and phosphatidylserine.
- Figure 10-1 shows the effect of the anti-human Tim-3 monoclonal antibody or anti-human Tim-3 biparatopic antibody of the present invention on human peripheral blood T cell activation by Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB).
- SEB Staphylococcus aureus enterotoxin B
- FIG. 4 shows changes in the number of IFN-g-positive T cells as assessed by activation of nucleospheres (PBMCs).
- FIG. 10-2 shows the effect of the anti-human Tim-3 monoclonal antibody or anti-human Tim-3 biparatopic antibody of the present invention on human peripheral blood T cell activation by Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB).
- FIG. 10 is a diagram showing Tim-3 expression level (MFI value) on IFN-g-positive T cells when evaluated by activation of nuclear spheres (PBMC).
- Figure 11-1 shows the results of evaluating whether the anti-human Tim-3 monoclonal antibody or anti-human Tim-3 biparatopic antibody of the present invention suppresses apoptosis induction of human peripheral blood T cells by Galectin-9. It is a diagram.
- Figure 11-2 shows the results of evaluating whether the anti-human Tim-3 monoclonal antibody or anti-human Tim-3 biparatopic antibody of the present invention suppresses the apoptosis induction of human peripheral blood T cells by Galectin-9. It is a diagram.
- Figure 12 shows the binding analysis using the humanized anti-human Tim-3 antibody of the present invention prepared in Example 11 and Jurkat cells stably expressing human Tim-3 or expi293 cells transiently expressing human Tim-3. is a diagram showing the result of performing.
- FIG. 13 shows the results of flow cytometry analysis of the binding of the humanized anti-human Tim-3 antibody of the present invention prepared in Example 11 to human Tim-3 on the membrane of activated T cells.
- FIG. 14 shows the results of ELISA analysis of the ability of the humanized anti-human Tim-3 antibody of the present invention produced in Example 11 to inhibit the binding of human Tim-3 and human Galectin-9.
- FIG. 15 shows the results of flow cytometry analysis of the humanized anti-human Tim-3 antibody of the present invention produced in Example 11 to inhibit the binding of human Tim-3 to Phosphatidylserine.
- Figure 16-1 shows the effect of the humanized anti-human Tim-3 antibody of the present invention prepared in Example 11 on human peripheral blood T cell activation.
- FIG. 10 is a diagram showing changes in the number of IFN-g-positive T cells when evaluated by activation of PBMC).
- FIG. 10 is a diagram showing Tim-3 expression level (MFI value) on IFN-g-positive T cells when evaluated by activation of PBMC.
- Figure 17 shows a binding analysis using the humanized anti-human Tim-3 biparatopic antibody prepared in Example 15 and Jurkat cells stably expressing human Tim-3 or expi293 cells transiently expressing human Tim-3. is a diagram showing the result of performing.
- FIG. 18 shows the results of flow cytometry analysis of the binding of the humanized anti-human Tim-3 biparatopic antibody prepared in Example 15 to human Tim-3 on the membrane of activated T cells.
- FIG. 19 shows the results of ELISA analysis of the humanized anti-human Tim-3 biparatopic antibody prepared in Example 15 for its ability to inhibit the binding of human Tim-3 and human Galectin-9.
- FIG. 20 shows the results of flow cytometry analysis of the humanized anti-human Tim-3 biparatopic antibody prepared in Example 15 to inhibit the binding of human Tim-3 to Phosphatidylserine.
- FIG. 21-1 shows the effect of the humanized anti-human Tim-3 monoclonal antibody or humanized anti-human Tim-3 biparatopic antibody of the present invention on human peripheral blood T-cell activation by Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB).
- FIG. 2 shows changes in the number of IFN-g-positive T cells as assessed by activation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by .
- Figure 21-2 shows the effect of the humanized anti-human Tim-3 monoclonal antibody or humanized anti-human Tim-3 biparatopic antibody of the present invention on the activation of human peripheral blood T cells by Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB).
- SEB Staphylococcus aureus enterotoxin B
- FIG. 22 is a diagram showing Tim-3 expression level (MFI value) on IFN-g-positive T cells when evaluated by peripheral blood mononuclear cell (PBMC) activation by .
- FIG. 22 shows the results of evaluating whether the humanized anti-human Tim-3 monoclonal antibody or humanized anti-human Tim-3 biparatopic antibody of the present invention suppresses the apoptosis induction of human peripheral blood T cells by Galectin-9. It is a figure which shows.
- Figure 23 shows the effect of the humanized anti-human Tim-3 monoclonal antibody or humanized anti-human Tim-3 biparatopic antibody of the present invention on activation of human peripheral blood T cells evaluated by activation of PBMC by CMV antigenic peptide.
- FIG. 22 shows the results of evaluating whether the humanized anti-human Tim-3 monoclonal antibody or humanized anti-human Tim-3 biparatopic antibody of the present invention suppresses the apoptosis induction of human peripheral blood T cells by Galectin-9. It is a figure which shows
- FIG. 10 shows the positive rate of CMV-tetramer-positive cells and the IFN ⁇ and TNF ⁇ concentrations in the culture supernatant when cultured.
- Figure 24 shows the effect of the anti-human Tim-3 biparatopic antibody of the present invention on peripheral blood T cell activation and antitumor activity in a co-culture system of PBMC and tumor cells by ATP derived from live tumor cells.
- FIG. 10 is a diagram showing the results of examination by the amount of luminescence and the concentrations of IFN ⁇ and TNF ⁇ in the culture supernatant.
- FIG. 25 is a diagram showing changes in average tumor volume and changes in tumor volume of individual mice in each treatment group as antitumor effects of the humanized anti-human Tim-3 biparatopic antibody of the present invention in a mouse model. be.
- FIG. 26 is a diagram showing the analysis results of lymphocytes infiltrating tumor tissues collected from mice as antitumor effects of the humanized anti-human Tim-3 biparatopic antibody of the present invention in mouse models.
- Figure 27 shows the structure of the human Tim-3 IgV domain obtained from the complex of the human Tim-3 IgV domain and the Hu003_13_F20_scFv antibody and the epitope site of the Hu003_13_F20_scFv antibody.
- Figure 28 shows the structure of the human Tim-3 IgV domain obtained from the complex of the human Tim-3 IgV domain and the Hu149_83_scFv antibody and the epitope site of the Hu149_83_scFv antibody.
- FIG. 29 shows the results of creating a binding model of the humanized biparatopic antibody Hu149003 against human Tim-3.
- a binding substance to the Tim-3 antigen which has a binding property to the Tim-3 antigen on cancer cells or immune cells and an immunosuppressive signal-removing activity against cancer cells, particularly Antibodies or human antibody derivatives (hereinafter simply referred to as "antibodies, etc.") can be provided.
- This antibody, etc. may be of the homodimeric type of antibody half molecules or of the heterodimeric type.
- the binding substances of the present invention particularly antibodies and the like, remove immunosuppressive signals to cancer cells, enhance immune activity against cancer cells, and consequently inhibit cancer cell proliferation for treatment of cancer cells. Therefore, it can be used to shrink or eliminate tumors, and can also be used to activate T cells that are toxic to cancer cells when they are exhausted. can be done.
- homodimeric antibodies, etc. having binding properties to the Tim-3 antigen.
- This homodimeric antibody or the like is characterized by binding to the Tim-3 antigen and activating T cells that are toxic to cancer cells.
- the homodimeric antibody or the like in the first aspect of the present invention binds to the Tim-3 antigen to suppress the function of the Tim-3 antigen, removes immunosuppressive signals against cancer cells, and suppresses immune cells (In particular, it may be in a mode of suppressing the function of Tim-3 antigen expressed in T cells), activating immune cells, and exhibiting tumor growth inhibitory effects and cancer therapeutic effects.
- the antibody when simply referred to as an "antibody", the antibody may be derived from any animal species of mammals, and the origin of the antibody is not limited to humans, including mice, rats, guinea pigs, hamsters, VHH antibodies (variable domain of heavy chain of heavy chain antibodies) derived from rabbits, camelids (camels, alpacas), ostrich antibodies, and the like may also be used.
- human antibodies include those of various isotypes such as IgG, IgM, IgA, IgD and IgE.
- the antibody “antibody derivative”.
- one embodiment includes, for example, the amino acid sequences of six CDRs (heavy chain complementarity determining region CDR1 ⁇ CDR3 and light chain CDR1 to CDR3), and the amino acid sequence of a constant region derived from a human antibody, and the other amino acid sequences are a combination of the amino acid sequence derived from the original antibody and the amino acid sequence derived from the human antibody.
- Derivatives of antibodies characterized by certain characteristics can be provided.
- antibody derivatives include humanized antibodies in which amino acid sequences derived from human antibodies are substituted for regions other than the complementarity determining regions (CDRs) of the above-mentioned "antibody", or variable regions of the above antibodies are replaced with human antibody constant regions.
- CDRs complementarity determining regions
- variable regions of the above antibodies are replaced with human antibody constant regions.
- They include, but are not limited to, chimeric antibodies, such as those linked to regions, and single-chain antibodies (eg, scFv, etc.) in which heavy and light chains are joined by a linker.
- the homodimeric antibody, etc. of the present invention is, for example, the same heavy chain CDRs 1 to 3 and light chain CDRs 1 to 3 that are the same as the antibody that binds to the Tim-3 antigen, with a total of 6 amino acid sequences.
- Examples of amino sequences of specific six CDRs of a half molecule such as an antibody having binding affinity to Tim-3 antigen are as follows (1) to (12): (1) the complementarity determining region of the heavy chain, CDR1 (SYYMS, SEQ ID No: 1), CDR2 (TISNSGGSIYYLDSVKD, SEQ ID No: 2) and CDR3 (DPYYSNYVPMDY, SEQ ID No: 3), and complementation of the light chain; sex-determining regions, CDR1 (KASQYVDTYVA, SEQ ID No: 4), CDR2 (SASTRHT, SEQ ID No: 5) and CDR3 (AQYSSSPLT, SEQ ID No: 6); (2) the complementarity determining region of the heavy chain, CDR1 (DYYMD, SEQ ID No: 9), CDR2 (YIYPNNGGTSYNQKFKG, SEQ ID No: 10) and CDR3 (SGYGNYYTMDY, SEQ ID No: 11
- the antibodies, etc. include, for example, the following heavy chain variable regions (VH-1) to (VH-12) (and branch numbers of respective numbers) Amino acid sequence of VH domain: (VH-1a) the amino acid sequence of SEQ ID No: 7 or, in the amino acid sequence of SEQ ID No: 7, CDR1 (SEQ ID No: 1), CDR2 (SEQ ID No: 2), and CDR3 (SEQ ID No: 2); Amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than : 3), (VH-1b) the amino acid sequence of SEQ ID No: 49, or CDR1 (SEQ ID No: 1), CDR2 (SEQ ID No: 2), and CDR3 (SEQ ID No: 2) in the amino acid sequence of SEQ ID No: 49; Amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions (e.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VH-2b) the amino acid sequence of SEQ ID No: 62, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 62, CDR1 (SEQ ID No: 9), CDR2 (SEQ ID No: 10), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VH-3a) the amino acid sequence of SEQ ID No: 23, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 23, CDR1 (SEQ ID No: 17), CDR2 (SEQ ID No: 18), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VH-3b) the amino acid sequence of SEQ ID No: 66, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 66, CDR1 (SEQ ID No: 17), CDR2 (SEQ ID No: 18), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VH-4a) the amino acid sequence of SEQ ID No: 31, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 31, CDR1 (SEQ ID No: 25), CDR2 (SEQ ID No: 26), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than (VH-4b) the amino acid sequence of SEQ ID No: 70, or SEQ Among the amino acid sequences of ID No: 70, one or several amino acid substitutions ( (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions, and (VH-5a) the amino acid sequence of SEQ ID No: 36, or the amino acid sequence of SEQ ID No: 36, CDR1 (SEQ ID No: 33), CDR2 (SEQ ID No: 34), and CDR3 (SEQ ID No: 35), amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions , (VH-5b) the amino acid sequence of SEQ ID No: 51, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 51, CDR1 (SEQ ID No: 33), CDR2 (SEQ ID No: 34), and CDR3 (
- amino acid sequence of SEQ ID No: 75 or in the amino acid sequence of SEQ ID No: 75, CDR1 (SEQ ID No: 9), CDR2 (SEQ ID No: 74), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VH-8) the amino acid sequence of SEQ ID No: 77, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 77, CDR1 (SEQ ID No: 9), CDR2 (SEQ ID No: 76), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VH-9) the amino acid sequence of SEQ ID No: 79, or, in the amino acid sequence of SEQ ID No: 79, CDR1 (SEQ ID No: 17), CDR2 (SEQ ID No: 78), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequence of SEQ ID No: 81 or in the amino acid sequence of SEQ ID No: 81, CDR1 (SEQ ID No: 17), CDR2 (SEQ ID No: 80), and CDR3 (SEQ ID No.
- the numbers (VH-1) to (VH-12) correspond to the numbers (1) to (12) of the combination of the sequences of the heavy chain CDR1 to CDR3 described above.
- (VH-1) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 means a sequence encompassing the amino acid sequences of (1) heavy chain CDR1-CDR3 identified in SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 3 .
- the branch numbers for each heavy chain variable region VH domain (for example, (VH-1a) and (VH-1b)) have a combination of CDRs of the same sequence, but have different framework sequences. It means that it corresponds to the variation of the heavy chain variable region composed of.
- the amino acid sequence of the heavy chain variable region framework can be that of an existing antibody.
- each CDR1 to CDR3 is essential for binding to the target antigen, while in the portions other than CDR1 to CDR3, one or several Even amino acid sequences containing substitutions (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions of , can be used in the present invention as long as they can constitute antibodies or antibody derivatives thereof.
- the antibody, etc. of the present invention has the following (VL-1) to (VL-6) (and branch numbers for each number) of the light chain variable region VL domain amino acid sequences: (VL-1a) the amino acid sequence of SEQ ID No: 8, or in the amino acid sequence of SEQ ID No: 8, CDR1 (SEQ ID No: 4), CDR2 (SEQ ID No: 5), and CDR3 (SEQ ID No.
- Amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than : 6
- VL-1b the amino acid sequence of SEQ ID No: 58, or in the amino acid sequence of SEQ ID No: 58, CDR1 (SEQ ID No: 4), CDR2 (SEQ ID No: 5), and CDR3 (SEQ ID No.
- Amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than : 6
- VL-1c the amino acid sequence of SEQ ID No: 50, or, in the amino acid sequence of SEQ ID No: 50, CDR1 (SEQ ID No: 4), CDR2 (SEQ ID No: 5), and CDR3 (SEQ ID No.
- Amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than : 6
- VL-2a the amino acid sequence of SEQ ID No: 16, or CDR1 (SEQ ID No: 12), CDR2 (SEQ ID No: 13), and CDR3 (SEQ ID No: 13) in the amino acid sequence of SEQ ID No: 16; : 14) amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than (VL-2b) the amino acid sequence of SEQ ID No: 63, or CDR1 (SEQ ID No: 12), CDR2 (SEQ ID No: 13), and CDR3 (SEQ ID No: 13) in the amino acid sequence of SEQ ID No: 63; : 14) amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than (VL-2c)
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VL-3c) the amino acid sequence of SEQ ID No: 68, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 68, CDR1 (SEQ ID No: 20), CDR2 (SEQ ID No: 21), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VL-3d) the amino acid sequence of SEQ ID No: 69, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 69, CDR1 (SEQ ID No: 20), CDR2 (SEQ ID No: 21), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VL-4a) the amino acid sequence of SEQ ID No: 32, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 32, CDR1 (SEQ ID No: 28), CDR2 (SEQ ID No: 29), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions
- Amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than : 6
- VL-5c the amino acid sequence of SEQ ID No: 50, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 50, CDR1 (SEQ ID No: 4), CDR2 (SEQ ID No: 5), and CDR3 (SEQ ID No.
- Amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than : 6
- VL-6a the amino acid sequence of SEQ ID No: 56, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 56, CDR1 (SEQ ID NO: 52), CDR2 (SEQ ID NO: 53), and CDR3 (SEQ ID NO: 53); : 54) containing one or several amino acid substitutions (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in parts other than (VL-6b) the amino acid sequence of SEQ ID No: 60, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 60, CDR1 (SEQ ID NO: 52), CDR2 (SEQ ID NO: 53), and CDR3 (SEQ ID NO: 53); : 54) containing one or several amino acid substitutions (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in parts other than (VL-6c) the amino acid sequence of SEQ ID No
- (VL-1) the amino acid sequence of SEQ ID NO:8 means a sequence encompassing the amino acid sequences of (1) the light chain CDR1-CDR3 identified in SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:6.
- branch numbers e.g., (VL-1a) and (VL-1b)
- VL-1a and VL-1b branch numbers for each light chain variable region VL domain have the same combination of CDR sequences, but different framework sequences. It means that it corresponds to the variation of the light chain variable region composed of
- the light chain variable region of the combination of the light chain CDR1 to CDR3 sequences in (7) and (8) above is the light chain variable region of the combination of the light chain CDR1 to CDR3 sequences in (2) above (that is, (VL-2) or the light chain variable region defined by its branch number)
- - The light chain variable region of the combination of the light chain CDR1 to CDR3 sequences in (9) and (10) above is the light chain variable region of the combination of the light chain CDR1 to CDR3 sequences in (3) above (that is, (VL-3) or the light chain variable region defined by its branch number)
- the light chain variable region of the combination of the light chain CDR1 to CDR3 sequences in (11) and (12) above is the light chain variable region of the combination of the light chain CDR1 to CDR3 sequences in (4) above (that is, (VL-4) or the light chain variable region defined by its branch number).
- the amino acid sequence of the light chain variable region framework can be that of an existing antibody.
- each CDR1 to CDR3 is known to be essential for binding to the target antigen, while in the portion other than CDR1 to CDR3, one or several Even amino acid sequences containing substitutions (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions of , antibodies, etc., can be used in the present invention.
- the antibody derivatives of the present invention also include functional fragments and modified antibodies such as the antibodies described above.
- Functional fragments such as antibodies in the present invention include F (ab') 2, Fab', Fab, single chain Fv (scFv) and the like, and modified antibodies include Fc effector function modified antibodies, IgG1LALA, IgG1_N297A, IgG4_S228P etc. are included.
- Functional fragments or modified antibodies that can be used in the present invention are capable of binding to the Tim-3 antigen and inhibiting the binding of Tim-3-Galectin-9, resulting in Tim-3-Galectin- If it is characterized by being able to remove immunosuppressive signals based on 9 pathways, functioning as a so-called immune checkpoint inhibitor, or being able to induce cytotoxicity against cancer cells as a result, these any fragment or modified antibody of, for example, single-chain Fv (scFv) and the like can be used as such functional fragments.
- scFv single-chain Fv
- half molecules of the antibody of the present invention are composed of the following heavy chain variable region VH domain amino acid sequence and the following light chain variable region VL A domain can be identified as a single chain by concatenating the amino acid sequences of: (1) the heavy chain variable region of (VH-1a), (VH-1b) or (VH-1c) and the light chain variable region of (VL-1a), (VL-1b) or (VL-1c) and linked via a linker, (2) the heavy chain variable region of (VH-2a) or (VH-2b) and the light chain variable region of (VL-2a), (VL-2b), (VL-2c) or (VL-2d) and linked via a linker, (3) the heavy chain variable region of (VH-3a) or (VH-3b) and the light chain variable region of (VL-3a), (VL-3b), (VL-3c) or (VL-3d)
- the numbers (1) to (12) correspond to the combination number of the heavy chain CDR1 to CDR3 sequences described above and the combination number of the light chain CDR1 to CDR3 sequences described above.
- the amino acid sequence of a single-chain Fv antibody is (1) the amino acid sequences of heavy chain CDR1-CDR3 identified in SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4-SEQ ID NO: A sequence that includes the amino acid sequences of the light chain CDR1-CDR3 identified by 6.
- the heavy chain variable region and the light chain variable region in scFv may be joined so that either one is on the N-terminal side, and from the N-terminal side to the C-terminal side, the heavy chain variable region-linker-light chain variable region or the order of light chain variable region-linker-heavy chain variable region.
- the linker that connects the heavy chain variable region and the light chain variable region may be any linker known to be usable in the art. can use GGGGS ⁇ 4 (ie, a linker composed of an amino acid sequence in which four GGGGS are consecutive).
- the scFv antibody exemplified here can be used as a single chain, but the Fc region of an antibody commonly used in the art is further bound via a linker to form scFv-Fc. Thus, it can also be produced as a double strand.
- the Fc region can have a structure in which it is bound to the C-terminal side of scFv via a linker (for example, a linker consisting of GGGG).
- heterodimeric antibodies and antibody derivatives such as antibodies
- An antibody or antibody derivative is provided. This heterodimeric antibody or the like is characterized by enhancing immune activity against cancer cells.
- the heterodimeric antibody or the like in the second aspect of the present invention binds to the Tim-3 antigen to suppress the function of the Tim-3 antigen, removes immunosuppressive signals against cancer cells, and suppresses immune cells It may be in a mode of suppressing the function of Tim-3 antigen expressed in (especially T cells), activating immune cells, and exhibiting tumor growth inhibitory effect and cancer therapeutic effect.
- the antibody when simply referred to as an "antibody", the antibody may be derived from any animal species of mammals, and the origin of the antibody is not limited to humans, including mice, rats, guinea pigs, hamsters, VHH antibodies (variable domain of heavy chain of heavy chain antibodies) derived from rabbits, camelids (camels, alpacas), ostrich antibodies, and the like may also be used.
- human antibodies include those of various isotypes such as IgG, IgM, IgA, IgD and IgE.
- the antibody “antibody derivative”.
- one embodiment includes, for example, the amino acid sequences of six CDRs (heavy chain complementarity determining region CDR1 ⁇ CDR3 and light chain CDR1 to CDR3), and the amino acid sequence of a constant region derived from a human antibody, and the other amino acid sequences are a combination of the amino acid sequence derived from the original antibody and the amino acid sequence derived from the human antibody.
- Derivatives of antibodies characterized by certain characteristics can be provided.
- antibody derivatives include humanized antibodies in which amino acid sequences derived from human antibodies are substituted for regions other than the complementarity determining regions (CDRs) of the above-mentioned "antibody", or variable regions of the above antibodies are replaced with human antibody constant regions.
- CDRs complementarity determining regions
- variable regions of the above antibodies are replaced with human antibody constant regions.
- They include, but are not limited to, chimeric antibodies, such as those linked to regions, and single-chain antibodies (eg, scFv, etc.) in which heavy and light chains are joined by a linker.
- half molecule of an antibody or the like in the present invention means one molecule or a fragment thereof when the bond between heavy chains in an antibody or the like is dissociated.
- a half molecule of an antibody or the like refers to a combination of antibody heavy (H) and light (L) chains derived from various isotypes such as IgG, IgM, IgA, IgD and IgE.
- the half molecule when the antibody or the like is an IgG antibody, the half molecule includes, for example, a complex consisting of one IgG H chain and one IgG L chain.
- Half molecules such as antibodies may also be derived from antibody derivatives such as chimeric antibodies and humanized antibodies as described above.
- the half molecule of the antibody etc. may contain any of the half molecules of the antibody etc. other than those mentioned above.
- Chain (H chain) Antibody (heavy-chain antibody) also called VHH (VH originating from heavy-chain antibody) antibody.
- single domain antibody a single-chain Fv molecule (scFv molecule) that can bind to another scFv molecule, a molecule with an additional Fc region added to the single-chain Fv molecule (scFv -Fc molecule), a molecule with a Knob structure for applying the Knob-into-hole technique to the Fc part of the scFv-Fc molecule, a Hole for applying the Knob-into-hole technique to the Fc part of the scFv-Fc molecule A molecule having a structure, etc. may also be included.
- the heterodimeric antibody or the like is characterized in that it is composed of half molecules of two different antibodies or the like, and the first epitope to which the half molecules of the first antibody or the like binds, and the second The second epitope bound by a half molecule such as an antibody of can be the same or different.
- Antibodies and the like that have binding properties to the Tim-3 antigen have the property that one or both of the half molecules of the antibody or the like bind to Tim-3.
- the antibody or the like of this embodiment is a bispecific antibody type antibody or the like.
- Antibodies of this embodiment when both bind to different epitope portions of Tim-3 are biparatopic antibodies.
- the antibody is such that both half molecules bind to different epitope portions of Tim-3 (biparatopic antibody).
- the heterodimeric antibody or the like includes a half molecule of the first antibody or the like having a binding property to the Tim-3 antigen, and an antigen other than the Tim-3 antigen. It may also be an antibody or the like composed of a combination with a half molecule of a second antibody or the like having specificity (ie, a bispecific antibody).
- the structure of the antibody or the like is such that the half molecule of the first antibody or the like has a total of 6 positions of CDRs 1 to 3 of the heavy chain and CDRs 1 to 3 of the light chain having the specific sequences disclosed herein. It is preferably a half molecule of an antibody or the like specified by its amino acid sequence.
- an antibody or the like capable of realizing simultaneous binding of a half molecule of a first antibody or the like to a Tim-3 antigen and a half molecule of a second antibody or the like to an antigen other than the Tim-3 antigen.
- the half molecule of the second antibody etc. may bind to any antigen as long as the half molecule of the first antibody etc. binds to the Tim-3 antigen.
- the first antibody or the like having binding property to the Tim-3 antigen is a biparatopic antibody
- the first antibody or the like are preferably half molecules such as an antibody that binds to the region of the Tim-3 antigen, and the first region that the half molecule such as the first antibody binds
- the (epitope) and the second region (epitope) bound by a half molecule such as a second antibody may be the same region or different regions of the Tim-3 protein.
- the antibodies that bind to the epitope site of the Tim-3 antigen can be divided into five groups, Group 1 to Group 5 (Fig. 1). . Classifying these antibodies according to their functionality, there are groups that inhibit PtdSer (antibodies belonging to Group 1 and antibodies belonging to Group 2), and groups that do not or partially inhibit PtdSer (antibodies belonging to Group 3 and Group 4). Antibodies and antibodies belonging to Group 5). In addition, when these antibodies are classified in terms of competition for binding to Tim-3, the antibodies belonging to Group 1 and Group 2 are in a non-competitive relationship with the antibodies belonging to Group 4 and Group 5.
- Antibodies belonging to Group 1 and antibodies belonging to Group 2 compete, antibodies belonging to Group 4 and antibodies belonging to Group 5 compete, while antibodies belonging to Group 3 compete with antibodies belonging to Group 1.
- Antibodies belonging to Group 2, Group 4 and Group 5 are in competition with each other. Based on these analysis results, if one molecule of the biparatopic antibody in this aspect of the present invention is to be bound to two sites on one molecule of Tim-3 protein, half of the first antibody, etc.
- the first region (epitope) to which the molecule binds and the second region (epitope) to which the half molecule such as the second antibody binds are preferably different, and one of the half molecules such as the antibody is Group 1 or It is preferable that the half molecule of the antibody belongs to Group 2 and the other half molecule of the antibody belongs to Group 3, Group 4 and Group 5.
- the structure of the antibody, etc. in this aspect of the present invention includes the first antibody, etc. that binds to the Tim-3 protein, which has a total of 6 amino acid sequences of specific heavy chain CDRs 1 to 3 and light chain CDRs 1 to 3. and a half molecule such as the second antibody that binds to the Tim-3 protein having a total of 6 amino acid sequences of specific heavy chain CDRs 1 to 3 and light chain CDRs 1 to 3, Both half-molecules such as the first antibody and half-molecules such as the second antibody can form antibodies such as antibodies that bind to the Tim-3 antigen (ie, biparatopic antibodies (BpAbs)).
- BpAbs biparatopic antibodies
- examples of amino sequences of specific 6 CDRs of a half molecule such as an antibody having binding affinity to Tim-3 antigen are as follows (1) to (12): (1) the complementarity determining region of the heavy chain, CDR1 (SYYMS, SEQ ID No: 1), CDR2 (TISNSGGSIYYLDSVKD, SEQ ID No: 2) and CDR3 (DPYYSNYVPMDY, SEQ ID No: 3), and complementation of the light chain; sex-determining regions, CDR1 (KASQYVDTYVA, SEQ ID No: 4), CDR2 (SASTRHT, SEQ ID No: 5) and CDR3 (AQYSSSPLT, SEQ ID No: 6); (2) the complementarity determining region of the heavy chain, CDR1 (DYYMD, SEQ ID No: 9), CDR2 (YIYPNNGGTSYNQKFKG, SEQ ID No: 10) and CDR3 (SGYGNYYTMDY, SEQ ID No: 11), and complement
- (1), (5) and (6) antibodies and other half molecules are derived from antibodies belonging to Group 2, and (2) to (4) ) and (7) to (12) are half molecules derived from antibodies belonging to Group 5. Therefore, in the second aspect of the present invention, for example, in order for the biparatopic antibody in the second aspect of the present invention to bind to two different epitope sites of the Tim-3 protein, , one of the half molecules of the antibody etc. is the half molecule of (1), (5) or (6) exemplified above, and the other half molecule of the antibody etc. is (2) to (4) or (7) An antibody or the like that is a half molecule of any one of (12) can be provided.
- half molecules such as antibodies have, for example, the following heavy chain variable region VH domain amino acid sequences (VH-1) to (VH-12) (and their respective numbered subnumbers): (VH-1a) the amino acid sequence of SEQ ID No: 7 or, in the amino acid sequence of SEQ ID No: 7, CDR1 (SEQ ID No: 1), CDR2 (SEQ ID No: 2), and CDR3 (SEQ ID No: 2); Amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than : 3), (VH-1b) the amino acid sequence of SEQ ID No: 49, or CDR1 (SEQ ID No: 1), CDR2 (SEQ ID No: 2), and CDR3 (SEQ ID No: 2) in the amino acid sequence of SEQ ID No: 49; Amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VH-2b) the amino acid sequence of SEQ ID No: 62, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 62, CDR1 (SEQ ID No: 9), CDR2 (SEQ ID No: 10), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VH-3a) the amino acid sequence of SEQ ID No: 23, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 23, CDR1 (SEQ ID No: 17), CDR2 (SEQ ID No: 18), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VH-3b) the amino acid sequence of SEQ ID No: 66, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 66, CDR1 (SEQ ID No: 17), CDR2 (SEQ ID No: 18), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VH-4a) the amino acid sequence of SEQ ID No: 31, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 31, CDR1 (SEQ ID No: 25), CDR2 (SEQ ID No: 26), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than (VH-4b) the amino acid sequence of SEQ ID No: 70, or SEQ Among the amino acid sequences of ID No: 70, one or several amino acid substitutions ( (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions, and (VH-5a) the amino acid sequence of SEQ ID No: 36, or the amino acid sequence of SEQ ID No: 36, CDR1 (SEQ ID No: 33), CDR2 (SEQ ID No: 34), and CDR3 (SEQ ID No: 35), amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions , (VH-5b) the amino acid sequence of SEQ ID No: 51, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 51, CDR1 (SEQ ID No: 33), CDR2 (SEQ ID No: 34), and CDR3 (
- amino acid sequence of SEQ ID No: 75 or in the amino acid sequence of SEQ ID No: 75, CDR1 (SEQ ID No: 9), CDR2 (SEQ ID No: 74), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VH-8) the amino acid sequence of SEQ ID No: 77, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 77, CDR1 (SEQ ID No: 9), CDR2 (SEQ ID No: 76), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VH-9) the amino acid sequence of SEQ ID No: 79, or, in the amino acid sequence of SEQ ID No: 79, CDR1 (SEQ ID No: 17), CDR2 (SEQ ID No: 78), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequence of SEQ ID No: 81 or in the amino acid sequence of SEQ ID No: 81, CDR1 (SEQ ID No: 17), CDR2 (SEQ ID No: 80), and CDR3 (SEQ ID No.
- the numbers (VH-1) to (VH-12) correspond to the numbers (1) to (12) of the combination of the sequences of the heavy chain CDR1 to CDR3 described above.
- (VH-1) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 means a sequence encompassing the amino acid sequences of (1) heavy chain CDR1-CDR3 identified in SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 3 .
- the branch numbers for each heavy chain variable region VH domain (for example, (VH-1a) and (VH-1b)) have a combination of CDRs of the same sequence, but have different framework sequences. It means that it corresponds to the variation of the heavy chain variable region composed of.
- the amino acid sequence of the heavy chain variable region framework can be that of an existing antibody.
- each CDR1 to CDR3 is essential for binding to the target antigen, while in the portions other than CDR1 to CDR3, one or several Even amino acid sequences containing substitutions (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions of , can be used in the present invention as long as they can constitute antibodies or antibody derivatives thereof.
- the half molecule of the antibody or the like of the present invention has the following amino acid sequences of the light chain variable region VL domain (VL-1) to (VL-6) (and the branch numbers of each number): (VL-1a) the amino acid sequence of SEQ ID No: 8, or in the amino acid sequence of SEQ ID No: 8, CDR1 (SEQ ID No: 4), CDR2 (SEQ ID No: 5), and CDR3 (SEQ ID No.
- Amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than : 6
- VL-1b the amino acid sequence of SEQ ID No: 58, or in the amino acid sequence of SEQ ID No: 58, CDR1 (SEQ ID No: 4), CDR2 (SEQ ID No: 5), and CDR3 (SEQ ID No.
- Amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than : 6
- VL-1c the amino acid sequence of SEQ ID No: 50, or, in the amino acid sequence of SEQ ID No: 50, CDR1 (SEQ ID No: 4), CDR2 (SEQ ID No: 5), and CDR3 (SEQ ID No.
- Amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than : 6
- VL-2a the amino acid sequence of SEQ ID No: 16, or CDR1 (SEQ ID No: 12), CDR2 (SEQ ID No: 13), and CDR3 (SEQ ID No: 13) in the amino acid sequence of SEQ ID No: 16; : 14) amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than (VL-2b) the amino acid sequence of SEQ ID No: 63, or CDR1 (SEQ ID No: 12), CDR2 (SEQ ID No: 13), and CDR3 (SEQ ID No: 13) in the amino acid sequence of SEQ ID No: 63; : 14) amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than (VL-2c)
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VL-3c) the amino acid sequence of SEQ ID No: 68, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 68, CDR1 (SEQ ID No: 20), CDR2 (SEQ ID No: 21), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VL-3d) the amino acid sequence of SEQ ID No: 69, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 69, CDR1 (SEQ ID No: 20), CDR2 (SEQ ID No: 21), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions, insertions, or deletions in portions other than (VL-4a) the amino acid sequence of SEQ ID No: 32, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 32, CDR1 (SEQ ID No: 28), CDR2 (SEQ ID No: 29), and CDR3 (SEQ ID No.
- amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions
- Amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than : 6
- VL-5c the amino acid sequence of SEQ ID No: 50, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 50, CDR1 (SEQ ID No: 4), CDR2 (SEQ ID No: 5), and CDR3 (SEQ ID No.
- Amino acid sequences containing one or several amino acid substitutions e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in portions other than : 6
- VL-6a the amino acid sequence of SEQ ID No: 56, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 56, CDR1 (SEQ ID NO: 52), CDR2 (SEQ ID NO: 53), and CDR3 (SEQ ID NO: 53); : 54) containing one or several amino acid substitutions (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in parts other than (VL-6b) the amino acid sequence of SEQ ID No: 60, or of the amino acid sequence of SEQ ID No: 60, CDR1 (SEQ ID NO: 52), CDR2 (SEQ ID NO: 53), and CDR3 (SEQ ID NO: 53); : 54) containing one or several amino acid substitutions (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions in parts other than (VL-6c) the amino acid sequence of SEQ ID No
- (VL-1) the amino acid sequence of SEQ ID NO:8 means a sequence encompassing the amino acid sequences of (1) the light chain CDR1-CDR3 identified in SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:6.
- the branch numbers e.g., (VL-1a) and (VL-1b)
- VL-1a and VL-1b branch numbers for each light chain variable region VL domain have the same combination of CDR sequences, but different framework sequences. It means that it corresponds to the variation of the light chain variable region composed of
- the light chain variable region of the combination of the light chain CDR1 to CDR3 sequences in (7) and (8) above is the light chain variable region of the combination of the light chain CDR1 to CDR3 sequences in (2) above (that is, (VL-2) or the light chain variable region defined by its branch number)
- - The light chain variable region of the combination of the light chain CDR1 to CDR3 sequences in (9) and (10) above is the light chain variable region of the combination of the light chain CDR1 to CDR3 sequences in (3) above (that is, (VL-3) or the light chain variable region defined by its branch number)
- the light chain variable region of the combination of the light chain CDR1 to CDR3 sequences in (11) and (12) above is the light chain variable region of the combination of the light chain CDR1 to CDR3 sequences in (4) above (that is, (VL-4) or the light chain variable region defined by its branch number).
- the amino acid sequence of the light chain variable region framework can be that of an existing antibody.
- each CDR1 to CDR3 is known to be essential for binding to the target antigen, while in the portion other than CDR1 to CDR3, one or several Even amino acid sequences containing substitutions (e.g., conservative substitutions), insertions, or deletions of , antibodies, etc., can be used in the present invention.
- the antibody derivatives of the present invention also include functional fragments and modified antibodies such as the antibodies described above.
- Functional fragments such as antibodies in the present invention include F (ab') 2, Fab', Fab, single chain Fv (scFv) and the like, and modified antibodies include Fc effector function modified antibodies, IgG1LALA, IgG1_N297A, IgG4_S228P etc. are included.
- Functional fragments or modified antibodies that can be used in the present invention are capable of binding to the Tim-3 antigen and inhibiting the binding of Tim-3-Galectin-9, resulting in Tim-3-Galectin- If it is characterized by being able to remove immunosuppressive signals based on 9 pathways, functioning as a so-called immune checkpoint inhibitor, or being able to induce cytotoxicity against cancer cells as a result, these any fragment or modified antibody of, for example, single-chain Fv (scFv) and the like can be used as such functional fragments.
- scFv single-chain Fv
- the half molecule of the antibody of the present invention has the following (1) to (12) heavy chain variable region VH domain amino acid sequences and the following light chain variable region VL domain amino acid sequence to identify it as a single chain: (1) the heavy chain variable region of (VH-1a), (VH-1b) or (VH-1c) and the light chain variable region of (VL-1a), (VL-1b) or (VL-1c) and linked via a linker, (2) the heavy chain variable region of (VH-2a) or (VH-2b) and the light chain variable region of (VL-2a), (VL-2b), (VL-2c) or (VL-2d) and linked via a linker, (3) the heavy chain variable region of (VH-3a) or (VH-3b) and the light chain variable region of (VL-3a), (VL-3b), (VL-3c) or (VL-3d) and linked via a linker
- the numbers (1) to (12) correspond to the combination number of the heavy chain CDR1 to CDR3 sequences described above and the combination number of the light chain CDR1 to CDR3 sequences described above.
- the amino acid sequence of the variable region of the half molecule of the 003 single chain antibody of (1) is the amino acid sequence of the heavy chain CDR1-CDR3 identified by (1) SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 3 and the amino acid sequences of the light chain CDR1-CDR3 identified in ID NO:4 through SEQ ID NO:6.
- the heavy chain variable region and the light chain variable region in scFv may be joined so that either one is on the N-terminal side, and from the N-terminal side to the C-terminal side, the heavy chain variable region-linker-light chain variable region or the order of light chain variable region-linker-heavy chain variable region.
- the linker that connects the heavy chain variable region and the light chain variable region may be any linker known to be usable in the art. can use GGGGS ⁇ 4 (ie, a linker composed of an amino acid sequence in which four GGGGS are consecutive).
- the scFv antibody which is two different half molecules, is further linked to the Fc region of an antibody commonly used in the art. to form a scFv-Fc, which can also be assembled to form a heterodimeric duplex.
- the Fc region can have a structure in which it is bound to the C-terminal side of scFv via a linker (for example, a linker consisting of GGGG).
- the antibodies , etc. of the present invention are produced by administering the Tim-3 antigen as an immunogen to an animal of the above-mentioned species of origin, and extracting the antibody-producing cells from the animal body as myeloma cells. It can also be obtained by fusion and culturing (so-called hybridoma method), or by designing a vector for protein expression containing a DNA sequence that can define an amino acid sequence such as an antibody, and introducing the vector into a cell for protein production.
- variable region of an antibody or the like can be expressed as a single chain antibody (scFv) on the surface of a phage to obtain a phage that binds to an antigen.
- Good so-called phage display method.
- the DNA sequence that can define the amino acid sequence of the antibody or the like of the present invention can be obtained from cells that produce the desired antibody or the like.
- the prepared DNA sequence is incorporated into an expression vector suitable for the cell type for protein expression (e.g., CHO cells) in which the antibody or the like is to be expressed, It can be obtained using techniques well known to those skilled in the art, such as obtaining by introducing into a cell type for protein expression.
- a homodimeric antibody When a homodimeric antibody is produced by the recombinant DNA method, it has a structure that combines one type of heavy chain and one type of light chain.
- Antibodies can be produced by introducing a vector containing both a DNA sequence that defines a DNA sequence and a DNA sequence that defines a light chain amino acid sequence, and expressing both proteins in cells to produce antibodies in cells.
- a heterodimeric antibody When a heterodimeric antibody is produced by the recombinant DNA method, it has a structure that combines two types of heavy chains and two types of light chains.
- a vector containing a DNA sequence defining a chain amino acid sequence, a vector containing a DNA sequence defining a second heavy chain amino acid sequence, a vector containing a DNA sequence defining a first light chain amino acid sequence, and a second light chain A vector containing a DNA sequence defining the amino acid sequence is introduced to express four proteins (first and second heavy chains, first and second light chains) intracellularly to produce antibodies intracellularly. It can be produced by a method of producing.
- the antibody or the like of the present invention is produced by the phage display method
- a library in which the DNA sequences of the produced H-chain variable region and L-chain variable region are linked by short amino acid sequences and displayed on phage is used to target molecules. It is a method of selecting antibodies that have affinity for.
- a homodimeric antibody When a homodimeric antibody is produced by the phage display method, one type of heavy chain and one type of light chain can be expressed as a single chain Fv (scFv) by linking it with a short amino acid sequence.
- a homodimeric antibody or the like can be produced by binding the Fc region to the main chain and converting it into an scFv-Fc antibody.
- a homodimeric antibody or the like can also be produced by cutting off the VH and VL of scFv and binding them to the constant regions (CH, CL) respectively.
- heterodimeric antibody In the case of a method for producing a heterodimeric antibody, etc., two proteins (first heavy chain and first light chain, second heavy chain and second light chain) are randomly combined to obtain the desired The probability of obtaining a heterodimeric antibody with . Therefore, it is preferred to use the "knobs-into-holes" technique for the production of heterodimeric antibodies (see, eg, the method described in US7183076B2).
- the half molecule constant region CH3 domain of one of the two antibodies etc. has a "Knob” structure
- the half molecule constant region CH3 domain of the other antibody etc. has a "Hole" structure.
- Both the antibody, etc. of the first aspect and the antibody, etc. of the second aspect above suppress the function of the Tim-3 antigen expressed on cancer cells.
- suppress the function of Tim-3 antigen expressed in immune cells especially T cells and antigen-presenting cells
- remove immunosuppressive signals to cancer cells and relieve exhaustion of immune cells (especially T cells)
- Immune cells especially T cells
- proliferation of immune cells especially T cells
- increased cytotoxicity of immune cells especially T cells
- release suppression of maturation/activation of immune cells especially dendritic cells
- Tim-3 antigen (also known as HAVCR2) is one of the immune checkpoint molecules expressed on Th1 cells (type 1 T helper cells), dendritic cells, CD8+ T cells and other lymphocyte subsets. Tim-3 is a key regulatory molecule in T cell tolerance and plays a pivotal role in autoimmunity and T cell exhaustion during chronic viral infection. I know that I am in charge. Tim-3 interacts with many ligands such as Phosphatidylserine (PtdSer), CEACAM1 (Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1), Galectin-9, and HMGB1 (High mobility group box 1). The 3-Galectin-9 pathway is known to negatively regulate Th1 cell (type 1 T helper cell) immunity.
- Phosphatidylserine Phosphatidylserine
- CEACAM1 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1
- Galectin-9 Galectin-9
- the antibody, etc. of the present invention has a direct function of binding to the Tim-3 antigen, suppressing the function of the Tim-3 antigen, and inhibiting the binding of Tim-3-Galectin-9 to -3-Galectin-9 pathway can remove immunosuppressive signals that negatively regulate immunity, especially immunosuppressive signals against cancer cells.
- the antibody or the like of the present invention binds to the Tim-3 antigen expressed in cancer cells or immune cells and removes immunosuppressive signals based on the Tim-3-Galectin-9 pathway in which the Tim-3 antigen is involved. can function as a so-called immune checkpoint inhibitor.
- the antibody, etc. of the present invention can bind to the Tim-3 antigen, suppress the function of the Tim-3 antigen, and inhibit the binding of Tim-3 to Phosphatidylserine (PtdSer) as a direct function. can.
- the antibodies that bind to the Tim-3 protein are divided into a group that inhibits PtdSer (antibodies belonging to Group 1 and antibodies belonging to Group 2) and a group that does not or partially inhibits PtdSer (Group 3 , Group 4, and Group 5). Also, nothing is known that can completely inhibit Galectin-9. Therefore, among the antibodies, etc. of the present invention, homodimeric antibodies, etc. partially inhibit the binding of Tim-3-Galectin-9 because there is only one site on Tim-3 to which the antibody, etc. binds. or partially inhibits the binding of Tim-3-Galectin-9 and inhibits the binding of Tim-3 to Phosphatidylserine (PtdSer). On the other hand, among the antibodies, etc.
- heterodimeric antibodies, etc. can bind to two different sites on Tim-3 where the antibody, etc. binds, depending on the combination. , which can inhibit the binding of Tim-3-Galectin-9 and inhibit the binding of Tim-3 to Phosphatidylserine (PtdSer).
- immune cells especially T cells
- T cells can activate cells and, as a result, exhibit tumor growth inhibitory effects and cancer therapeutic effects.
- Immune checkpoints involving Tim-3 are distinct from other known immune checkpoint molecules such as PD-1/PD-L1 and CTLA-4/B7 (CD80/CD86) Since it functions by the mechanism, the antibody etc. of the present invention is a PD-1/PD-L1 inhibitor (e.g., nivolumab, pembrolizumab (anti-PD-1 antibody), atezolizumab, durvalumab (anti-PD-L1 antibody)) , can also be used as a backup when CTLA-4/B7 (CD80/CD86) inhibitors (ipilimumab (anti-CTLA-4 antibody)) are ineffective, or these existing immune checkpoint inhibitors can also be used in combination with PD-1/PD-L1 and CTLA-4/B7 (CD80/CD86) inhibitors (ipilimumab (anti-CTLA-4 antibody)) are ineffective, or these existing immune checkpoint inhibitors can also be used in combination with
- the antibody or the like of the present invention suppresses the function of Tim-3 expressed in cancer cells or immune cells and relieves exhaustion of immune cells (especially T cells), thereby activating immune cells, It is preferable to exert a cancer growth inhibitory effect and a cancer therapeutic effect.
- T cell activation may occur in vitro or in vivo.
- Tim-3 it can be obtained by screening antibodies that actually activate T cells from antibodies having binding properties to the antigen.
- the exhaustion of immune cells refers to a state in which immune cells are dysfunctional. Specifically, decreased cytokine secretion and cytotoxicity in T cells, decreased cytokine secretion and cytotoxicity in NK cells, decreased antigen-presenting ability of dendritic cells, activation of regulatory T cells, etc. be. In this state, an individual's cancer immunity against cancer cells does not function or its function is reduced, and the activity to eliminate cancer cells is reduced.
- Such exhaustion of immune cells is caused by the increase of checkpoint proteins (PD-1, CTLA-4, Tim-3, etc.) on the surface of T cells, and by continuously proliferating cancer cells, the immune system is suppressed for a long time. It is known that effector T cells are activated when they are forced to activate over a period of time, but this is a reversible state, and it is thought that it is possible to eliminate the state of exhaustion by activating the same cells. ing.
- checkpoint proteins PD-1, CTLA-4, Tim-3, etc.
- the activation of T cells can be understood as indices such as proliferation of T cells, increased cytotoxicity of T cells to cancer cells, cytokine secretion from T cells, and the like.
- the antibody or the like of the present invention inhibits the activity of Tim-3 in T cells, resulting in a state in which tumor growth inhibitory effects and cancer therapeutic effects can be exhibited. indicates that there is
- Screening for the ability of the antibody of the present invention to activate T cells can be performed in vivo or in vitro. Screening performed in vivo involves transplanting target cancer cells into animals such as wild-type mice, or mice into which immune cells have been transplanted into immunodeficient mice such as nude mice and SCID mice, and the antibodies of the present invention. By measuring changes in the size of tumor masses in the body upon administration, or by anatomically examining the infiltration of T cells around tumor masses in the body upon administration of the antibody, etc. of the present invention. ,It can be carried out.
- Screening performed in vitro involves contacting peripheral blood T cells with the antibody or the like of the present invention under culture conditions, and measuring the proliferation of the T cells, measuring cytokine secretion of the T cells, or This can be done by examining whether it causes cell death for cancer cells.
- antibodies, etc. Since the antibodies, etc. of the present invention have the above-mentioned functions, they can be used for one purpose based on the characteristic that they have the ability to activate immune cells (especially T cells) that have cytotoxicity against cancer cells.
- immune cells especially T cells
- a pharmaceutical composition can be provided in a subject in need of treatment or prevention of cancer.
- the antibodies, etc. of the present invention bind only to cells expressing Tim-3 protein on their surface, and can selectively inhibit the binding of Tim-3 to its ligands.
- the antibodies, etc. of the present invention are consequently characterized by specifically inhibiting the binding of Tim-3-Galectin-9 to overcome the negative regulation of immunity. Therefore, the antibody, etc. of the present invention will eventually remove the immunosuppressive signal against cancer cells via the Tim-3 antigen expressed in immune cells (especially T cells), and will have an anticancer effect. Therefore, it is characterized in that it induces cytotoxicity against cancer cells but does not induce cytotoxicity against so-called normal cells, which are not targeted by immunity.
- the cancer cells that can be the therapeutic target of the antibody or the like of the present invention are cancer cells expressing Tim-3 protein.
- Any cancer cell evading attack e.g., leukemia (including acute myelogenous leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic lymphocytic leukemia, acute lymphocytic leukemia), lymphoma (non-Hodgkin's lymphoma, Hodgkin's lymphoma , T-cell lymphoma, B-cell lymphoma, Burkitt's lymphoma, malignant lymphoma, diffuse lymphoma, follicular lymphoma), myeloma (including multiple myeloma), melanoma, lung cancer, breast cancer, colorectal cancer, Kidney cancer, gastric cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, endometrial cancer, endometrial cancer, esophageal cancer, liver cancer, head and neck cancer,
- the antibodies, etc. of the present invention are characterized by activating immune cells (particularly T cells) that have cytotoxicity against target cancer cells.
- immune cells especially T cells
- activation of immune cells occurs only for immune cells that express the target Tim-3 antigen and have cytotoxicity against cancer cells.
- normal cells that express 3 antigens it is required not to induce cytotoxicity that could be a clinical problem.
- the antibody, etc. of the present invention can also be provided as a composition in combination with other antibodies or other agents such as anticancer agents.
- the antibodies, etc. of the present invention can also be conjugated to drugs to form antibody-drug conjugates (ADCs).
- formulations containing the antibody, etc. of the present invention together with a physiologically acceptable diluent or carrier can also be provided.
- suitable carriers include buffers (phosphate buffer, citrate buffer, acetate buffer, etc.), salts (sodium chloride, etc.), sugars (glucose, trehalose, mannitol, sorbitol, etc.), additives (arginine, etc.). amino acids, surfactants such as polysorbates, etc.), but are not limited to these.
- the antibody, etc. of the present invention can be lyophilized (freeze-dried) and reconstituted by adding an aqueous buffer solution as described above when necessary.
- Formulations containing the antibody, etc. of the present invention can be administered in various dosage forms, for example, parenteral administration via injections, drip infusions, and the like.
- the dosage of the antibody, etc. of the present invention varies depending on symptoms, age, body weight, etc., but in parenteral administration, it is usually 0.01 mg to 1000 mg per kg of body weight, preferably 0.05 mg to 500 mg per kg of body weight per day. , in the range of 0.05 mg to 100 mg, 0.05 mg to 50 mg, 0.05 mg to 20 mg, more preferably in the range of 0.1 mg to 10 mg per kg of body weight per day, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, It can be administered through an appropriate administration route, such as intratumoral injection or intravenous injection, depending on the type of cancer.
- a method of treating or preventing cancer in a subject can also be provided comprising administering to the subject an effective amount of an antibody or the like of the invention.
- Treatment or prevention of cancer by the antibody etc. of the present invention occurs when the antibody etc. activates immune cells (especially T cells) that have cytotoxicity against cancer cells in the body.
- an adjuvant for example, Clin.Microbiol.Rev., 7:277-289, 1994
- particulate formulations such as liposome formulations, particulate formulations bound to beads with a diameter of several ⁇ m, formulations bound to lipids, etc. It can also be administered as
- the antibody, etc. of the present invention can be used to detect the Tim-3 antigen in a sample based on its ability to bind to the Tim-3 antigen.
- the antibodies and the like of the present invention are obtained by applying antibodies such as immunoprecipitation, agglutination, and magnetic bead methods to samples containing cancer cells or immune cells (for example, T cells) collected from a subject. It can be used to perform a variety of detection methods for Tim-3 antigen that can be performed using antibodies, including immunoassays such as ELISA, Western blotting, immunohistochemistry, and immunocytochemistry such as flow cytometry. can do.
- the antibodies, etc. of the present invention can be detected using detectable labels (eg, fluorescence, enzymes, etc.) commonly known to those skilled in the art.
- the antibody, etc. of the present invention also has a binding property to the Tim-3 antigen and activates immune cells (especially T cells) that are toxic to cancer cells. etc., can be used to measure cytotoxicity against cancer cells in a subject.
- a method for predicting increased cytotoxicity against cancer cells in such a subject includes the following steps: a step of contacting cancer cells collected from a subject with an antibody or the like of the present invention under culture conditions (i.e., in vitro); Under culture conditions, measuring whether the cell viability of cancer cells is reduced, or measuring whether the secretion of immunostimulatory substances is enhanced, Examples include methods for predicting enhanced cytotoxicity against cancer cells using the antibodies and the like of the present invention.
- the secretion of immunostimulatory substances to be measured can be examined by measuring cytokines secreted from T cells, and can be examined by measuring the secretion of IL-2, IFN- ⁇ , and TNF ⁇ . I can do it. Preferably, IFN- ⁇ is measured.
- lymphocytes cause a decrease in the cell viability of cancer cells.
- cancer cells collected from a subject are brought into contact with the antibody or the like of the present invention in vitro, and whether the cell viability decreases under culture conditions. Cytotoxicity against cancer cells can be examined by measuring More specifically, cancer cells collected from a subject are brought into contact with the antibody of the present invention in the presence of peripheral blood lymphocytes from the same subject, and under culture conditions (i.e., in vitro) Enhancement of cytotoxicity to cancer cells in vivo when the antibody, etc. of the present invention is administered to the subject by measuring whether the cell viability of cancer cells is reduced can be predicted.
- Cytotoxicity to cancer cells can be examined by measuring whether or not More specifically, cancer cells collected from a subject are brought into contact with the antibody of the present invention in the presence of peripheral blood lymphocytes from the same subject, and under culture conditions (i.e., in vitro), peripheral blood
- lymph nodes having cytotoxicity in vivo when the antibody, etc. of the present invention is administered to the subject It is possible to predict the activation of immune cells such as spheres and the resulting increase in cytotoxicity to cancer cells.
- IFN- ⁇ , TNF ⁇ , etc. can be exemplified as immunostimulatory substances measured to determine cytotoxicity to cancer cells.
- IFN ⁇ is known to activate immune cells such as NK cells and exert antitumor effects.
- the present invention also provides an in vitro assay for measuring cytotoxicity against cancer cells collected from a subject, secretion of an immunostimulatory substance, or activation of immune cells, including the antibody of the present invention. Kits can also be provided.
- the assay kit for measuring cytotoxicity includes known means for measuring cell proliferation (e.g., thymidine incorporation, BrdU incorporation, free lactate dehydrogenase (LDH) activity measurement, measurement of living cell-derived substances (reductase activity, esterase activity, ATP, etc.) can be included.
- known means for measuring cell proliferation e.g., thymidine incorporation, BrdU incorporation, free lactate dehydrogenase (LDH) activity measurement, measurement of living cell-derived substances (reductase activity, esterase activity, ATP, etc.
- a measurement kit for measuring the secretion of an immunostimulatory substance includes, in addition to the antibody or the like of the present invention, a means for detecting the immunostimulatory substance to be measured (e.g., a primary antibody against the immunostimulatory substance and the primary secondary antibodies for antibody detection, etc.).
- a means for detecting the immunostimulatory substance to be measured e.g., a primary antibody against the immunostimulatory substance and the primary secondary antibodies for antibody detection, etc.
- a measurement kit for measuring immune cell activation can contain, in addition to the antibody of the present invention, a labeling reagent for measuring immune cell division with a flow cytometer.
- Example 1 Preparation of anti-human Tim-3 monoclonal antibody
- antibody genes were obtained from the spleens of mice immunized with human Tim-3, and phage display methods were used to generate antibodies specific to human Tim-3.
- mice were immunized with Expi293 cells transiently expressing recombinant human Tim-3 (rhTim-3-His: SinoBological, 0390-H08H) and human Tim-3 antigen (Accession No. JX049979.1), Spleens were collected after confirming an increase in serum antibody titer.
- the amplified VH gene and V ⁇ gene PCR amplification products were connected with a linker (GGGGS ⁇ 4) to form a single chain Fv (hereinafter scFv), which was inserted into a pTZ19R-derived Phagemid (ThermoFisher Sceintific).
- the scFv-inserted Phagemid was transformed into Escherichia coli strain DH12S (ThermoFisher Sceintific) and further infected with helper phage (M13KO7, New England Biolabs) to prepare a scFv phage library (size: about 1 ⁇ 10 8 types).
- the scFv antibody phage library was panned with recombinant human Tim-3, and E. coli infected with the panned phage was IPTG induced to express scFv, and human Tim-3 (Accession No. JX049979.1) was stably expressed.
- scFv clones that specifically bind to Jurkat cells were screened.
- scFv-Fc-LALA linked to a modified antibody Fc region Fc-LALA with L234A mutation and L235A mutation in the IgG1 Fc region
- a linker was determined for the scFv that was positive in the screening.
- type antibody or IgG1-LALA type IgG1 antibody with LALA L234A mutation and L235A mutation introduced into the Fc region of IgG1, expressed in ExpiCHO cells (Thermo Fisher Scientific), and affinity using Protein A column Refined.
- Example 2 Epitope Binning
- the antibodies obtained in Example 1 were subjected to epitope binning
- the anti-human Tim-3 antibodies of the present invention were grouped from the epitope sites, and their competitive relationships were confirmed. rice field.
- Epitope binning was analyzed by intermolecular interaction analysis using surface plasmon resonance (SPR) using Biacore8K (Cytiva). Capture commercially available recombinant human Tim-3 (SinoBological, 10390-H08H) on the Ni-NTA Sensor chip, and scFv-Fc-LALA type monoclonal antibody (primary antibody) obtained in Example 1 until saturated combined. Subsequently, a scFv-Fc-LALA type monoclonal antibody (secondary antibody) different from the primary antibody obtained in Example 1 was allowed to bind, and the presence or absence of the binding reaction was determined.
- SPR surface plasmon resonance
- Biacore8K Biacore8K
- Figure 1 shows the results of epitope binning.
- the tested antibodies could be classified into Group 1 to Group 5 according to the results of competition/non-competition between antibodies.
- the Group 2 and Group 4 antibodies did not compete, and the Group 2 and Group 5 antibodies did not compete.
- the results revealed that Group 4 and Group 5 antibodies do not compete with the Epitope site of the Group 2 antibody, Ch003 antibody, and can therefore be used in combination to form biparatopic antibodies. .
- Group 2 Ch003 antibody, Group 5 Ch149 antibody, Ch428 antibody, and Ch621 antibody were selected.
- the CDRs (heavy chain and light chain CDR1 to CDR3) of each antibody had the following sequences (Table 1).
- VH region EVMLMESGGG LVKLGGSLKL SCAASGFTFS SYYMS WVRQT PEKRLEWVA T ISNSGGSIYY LDSVKD RFTI SRDNAKNTLY LQMSSLNSED TAVYYCAR DP YYSNYVPMDY WGQGTSVTVS S (SEQ ID NO: 7)
- VL region SIVMTQTPKF MSTSVGDRVS VTC KASQYVD TYVA WYQQKP GQSPKPLIY S ASTRHT GVPA RFTGSGSGTD FTLTISNVQS EDLAEYFC AQ YSSSPLT FGA GTKLELK (SEQ ID NO: 8)
- Ch149 antibody VH region: QVQLQQSGPE RVKPGDSVKM SCKASGYTFT DYYMD WVKQ
- Example 3 Binding Analysis of Monoclonal Antibodies
- the monoclonal antibodies produced in Example 1 and selected in Example 2 were subjected to binding analysis.
- the binding affinities of these antibodies to human Tim-3 were measured by surface plasmon resonance (SPR) interaction analysis using Biacore8K.
- Anti-human Tim-3 antibody was captured on a sensor chip immobilized with anti-human IgG antibody (Cytiva, cat#29234600), and recombinant human Tim-3 (rhTim-3-His: SinoBological, 10390-H08H) was used as an analyte. bottom.
- the dissociation constant (KD kd/ka) was calculated based on the binding rate constant (ka) and dissociation rate constant (kd) of each antibody for human Tim-3 obtained by surface plasmon resonance.
- Table 2 shows the results. It was shown that the monoclonal antibody of the present invention bound to recombinant human Tim-3 with the following dissociation constant (KD value).
- the scFv_Fc_LALA type antibodies (Ch003_sc antibody, Ch149_sc antibody, Ch428_sc antibody, Ch621_sc antibody) produced in Example 1 were used.
- An isotype control antibody was used as a negative control.
- Binding analysis was performed as follows. Human Tim-3-expressing cells, either human Tim-3-expressing stable Jurkat cells or human Tim-3-transient-expressing Expi293 cells, were aliquoted into 96-well V-bottom plates at 2 ⁇ 10 5 cells/well and added to 200 ⁇ l of PBS. Washed once with (-). As dead cell staining, 50 ⁇ l of Zombie NIR TM dye (Biolegend, 423106) diluted 500 to 1000 times with PBS( ⁇ ) was added and stained at room temperature for 15 minutes. After that, 50 ⁇ l of Human TruStain FcX (Biolegend, 422302) diluted 20-fold with PBS(-) was added and treated at room temperature for 20 minutes. Washed once.
- the dilution series of the anti-human Tim-3 antibody and the isotype control antibody were adjusted in five 10-fold dilutions with the staining buffer, and added to the cells at 100 ⁇ l/well. After standing at 4°C for 1 hour, wash once with staining buffer and apply secondary antibody (PE-Goat Anti-human IgG/Jackson Immuno Research Laboratories, 109-116-170) diluted 500-fold with staining buffer. 100 ⁇ l/well was added to the cells. After allowing to stand at 4°C for 30 minutes, the cells were washed twice with staining buffer, 50 ⁇ l of fixing buffer (Biolegend, 420801) was added, and the cells were allowed to stand at room temperature for 20 minutes for fixation. Stained cells were suspended in a staining buffer and analyzed with a flow cytometer. From the results, the mean fluorescence intensity (MFI) corresponding to the antibody concentration was plotted to calculate the KD value.
- MFI mean fluorescence intensity
- Fig. 2 shows the results of analysis by flow cytometry
- Table 3 shows the dissociation constant KD (nM) of each antibody calculated based on the data. It was shown that the monoclonal antibody of the present invention specifically bound to human Tim-3 expressed on the cell membrane.
- Example 3 Activated T-cell binding analysis Furthermore, the anti-human Tim-3 monoclonal antibody of the present invention prepared in Example 1 and selected in Example 2 binds to human Tim-3 on activated T-cell membranes. Binding was analyzed by flow cytometry.
- the scFv_Fc_LALA type antibodies (Ch003_sc antibody, Ch149_sc antibody, Ch428_sc antibody, Ch621_sc antibody) produced in Example 1 were used.
- An isotype control antibody was used as a negative control.
- T cells were prepared as follows. T cells were isolated from 1 ⁇ 10 7 cells of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) collected from healthy volunteers using a Pan T cells isolation kit, human (Miltenyi biotec, 130-096-535). T cells were suspended at 1 ⁇ 10 6 cells/ml in RPMI-1640 medium supplemented with 10% FCS, 100 unit/ml penicillin, and 100 ⁇ g/ml streptomycin, and Dynabeads TM Human T-Activator CD3/CD28 (VERITAS, DB11132) was added at 1 : 1 and cultured for 4 days at 37°C, 5% CO2 .
- PBMC peripheral blood mononuclear cells
- Binding analysis was performed as follows. Activated T cells were collected at 1 ⁇ 10 5 cells/well in a 96-well V-bottom plate and washed once with 200 ⁇ l of PBS(-). For dead cell staining, 50 ⁇ l of Zombie Violet TM Dye (Biolegend, 423114) diluted 500 to 1000 times with PBS(-) was added and stained at room temperature for 15 minutes. Subsequently, 50 ⁇ l of Human TruStain FcX diluted 20-fold with PBS(-) was added, treated at room temperature for 20 minutes, and washed once with a staining buffer. .
- the dilution series of the anti-Tim-3 antibody and isotype control antibody was adjusted in five 10-fold dilutions with the staining buffer, and added to the cells at 100 ⁇ l/well. After allowing to stand at 4°C for 1 hour, wash once with staining buffer and apply secondary antibody (PE-Goat Anti-human IgG) and T-cell marker staining antibody (Biolegend, anti-CD3: UCHT1, anti-CD4:RPA-T4, anti-CD8a:HIT8a) was added to the cells at 100 ⁇ l/well. After standing at 4°C for 30 minutes, the cells were washed twice with staining buffer, 50 ⁇ l of fixing buffer was added, and left at room temperature for 20 minutes for fixation. Stained cells were suspended in a staining buffer and analyzed with a flow cytometer.
- MFI mean fluorescence intensity
- Fig. 3 shows the results of analysis by flow cytometry
- Table 4 shows the dissociation constant KD (nM) of each antibody calculated based on the data.
- the monoclonal antibody of the invention specifically bound to human Tim-3 expressed on primary T cells.
- Example 4 Ligand Binding Inhibitory Activity of Monoclonal Antibodies
- the monoclonal antibodies produced in Example 1 and selected in Example 2 were subjected to an experiment for the purpose of functional analysis.
- the scFv_Fc_LALA type antibodies (Ch003_sc antibody, Ch149_sc antibody, Ch428_sc antibody, Ch621_sc antibody) produced in Example 1 were used.
- An isotype control antibody was used as a negative control.
- Human Galectin-9 (R&D Systems, 2045-GA) was adjusted to 2.5 ⁇ g/ml in 50 mM Carbonate Buffer, pH 9.4, added at 50 ⁇ l/well to a 96-well ELISA plate (Corning, 9018), and incubated at 4°C. Let stand overnight. The next day, the plate was washed three times with washing buffer [PBS(-), 0.1% Tween20] and blocked for 2 hours at room temperature (Nacalai Tesque, Blocking One: 0395395).
- the plate was washed three times with washing buffer, 50 ⁇ l/well of Streptavidin-HRP (Abcam, ab7403) diluted 15,000 times with binding buffer was added, and allowed to stand at room temperature for 30 minutes. After that, the plate was washed three times with a washing buffer, TMB+ (Dako, S1599) was added at 50 ⁇ l/well, and the plate was allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Finally, 0.5N sulfuric acid was added at 50 ⁇ l/well to stop color development, and absorbance at 450 nM was measured.
- Streptavidin-HRP Abcam, ab7403
- Figure 4 shows the results of antibody binding (%) to human Galectin-9. None of the monoclonal antibodies produced in the present invention could completely inhibit the binding of human Tim-3 and human Galectin-9, but the maximum inhibition rate was 69.5% to 77.0% (specifically, Ch003_sc 69.5% for Ch149_sc, 76.1% for Ch149_sc, 77.0% for Ch428_sc, and 74.0% for Ch621_sc).
- the scFv_Fc_LALA type antibodies (Ch003_sc antibody, Ch149_sc antibody, Ch428_sc antibody, Ch621_sc antibody) produced in Example 1 were used.
- An isotype control antibody was used as a negative control.
- Jurkat cells were adjusted to 5 ⁇ 10 5 cells/ml in RPMI-1640 medium supplemented with 10% FCS, 100 unit/ml penicillin and 100 ⁇ g/ml streptomycin, and anti-Fas (CD95) mAb (MBL, SY-001) was added at 100 ng/ml and reacted in a 37°C incubator for 3 hours.
- an antigen/antibody mixed solution was added at 50 ⁇ l/well and allowed to stand at room temperature for 30 minutes. After that, it was washed once with Annexin V binding buffer, PE-Streptavidin (Biolegend, 405204) 0.3 ⁇ l/1 ⁇ 10 6 cells was adjusted with Annexin V binding buffer, added 50 ⁇ l, and allowed to stand at room temperature for 15 minutes. .
- Annexin V binding buffer 100 ⁇ l of APC-Annexin V (Biolegend, 640920) adjusted to 2 ⁇ l/1 ⁇ 10 6 cells with Annexin V binding buffer (Biolegend), It was allowed to stand at 4°C for 15 minutes. Finally, 200 ⁇ l of Annexin V binding buffer was added and analyzed with a flow cytometer.
- Fig. 5 shows the results of analysis by flow cytometry
- Table 5 shows the IC50 values (nM) of each antibody calculated based on the results of this analysis.
- the Ch003_sc antibody almost completely inhibited the binding of human Tim-3 to Phosphatidylserine.
- Ch149_sc antibody, Ch428_sc antibody, and Ch621_sc antibody showed partial inhibition.
- the results of epitope binning in Example 2 showed that the Ch003 antibody belonging to Group 2 and the Ch149, Ch428, and Ch621 antibodies belonging to Group 5 target non-competing epitope sites. The results show a correlation between the epitope site and function of each antibody.
- Example 5 Generation of Anti-Human Tim-3 Biparatopic Antibodies
- biparatopic antibodies that bind to human Tim-3 are generated based on the monoclonal antibodies generated in Example 1 and selected in Example 2. was made.
- Group 2 Ch003 antibody, Group 5 Ch149 antibody, Ch428 antibody, and Ch621 antibody that do not compete in binding to Tim-3 as shown in Example 2 were selected.
- Knob-into-Hole (US7183076B2) technology was used, and the Fc portion of the Group 2 Ch003 antibody was Knob type, and a C-tag was added to the C-terminus.
- the Fc portion was of the Hole type, and two types of DNA encoding the two types of antibodies were inserted into the vector.
- An expression vector was prepared in combination with Each of these expression vectors was transfected into ExpiCHO cells (Thermo Fisher Scientific), expressed, and intracellularly produced as a scFv-Fc heterodimeric biparatopic antibody.
- the biparatopic antibody was directly purified using an anti-C-tag column.
- Ch149003ct antibody (combination of Ch149 antibody half molecule and Ch003 antibody half molecule), Ch428003ct antibody (combination of Ch428 antibody half molecule and Ch003 antibody half molecule), Ch621003ct antibody (combination of Ch621 antibody half molecule and Ch003 antibody half molecule) was gotten.
- Example 6 Binding Analysis of Biparatopic Antibody
- an experiment was conducted for the purpose of analyzing the binding of the anti-human Tim-3 biparatopic antibody of the present invention produced in Example 5. .
- Example 3 Analysis of the binding affinities of these biparatopic antibodies to human Tim-3 was performed in Example 3 (3-1 ) in the same manner as described in .
- Table 6 shows the results.
- the biparatopic antibody of the present invention has improved binding affinity compared to the original monoclonal antibody (Example 3 (3-1) Table 2). This is because the biparatopic antibody was able to bind to the analyte at two sites, resulting in an avidity effect. From this result, it was confirmed that the biparatopic antibody was successfully produced.
- Example 3 (3-2 ) Analysis of the binding affinities of these biparatopic antibodies to human Tim-3 was performed in Example 3 (3-2 ) in the same manner as described in .
- the Ch003_sc antibody whose binding analysis was performed in Example 3 (3-2) was used.
- Fig. 6 shows the results of analysis by flow cytometry
- Table 7 shows the dissociation constant KD (nM) of each antibody calculated based on the data.
- the biparatopic antibody of the present invention like the monoclonal antibody of Example 3, specifically bound to human Tim-3 expressed on the cell membrane. Also, the biparatopic antibody had an increased MFI for saturation binding compared to the original monoclonal antibody. This is probably because the biparatopic antibody binds to one antigen molecule on the cell membrane with one molecule, whereas the monoclonal antibody binds to two antigen molecules on the cell membrane with one molecule. Similar to Example 6 (6-1), this result also confirmed that the biparatopic antibody was successfully produced.
- Example 3 Analysis of the binding affinity of these biparatopic antibodies to human Tim-3 was performed in Example 3 (3-3 ) in the same manner as described in .
- the Ch003_sc antibody whose binding analysis was performed in Example 3 (3-3) was used.
- Fig. 7 shows the results of analysis by flow cytometry
- Table 8 shows the dissociation constant KD (nM) of each antibody calculated based on the data.
- the biparatopic antibody of the present invention is specific to human Tim-3 expressed in primary T cells, similar to the monoclonal antibody of the present invention whose binding was shown in Example 3 (3-3) coupled to Also, the biparatopic antibody had an increased MFI for saturation binding compared to the original monoclonal antibody.
- Example 7 Ligand Binding Inhibitory Activity of Biparatopic Antibody
- the biparatopic antibody prepared in Example 5 was subjected to an experiment for the purpose of functional analysis.
- biparatopic antibodies to inhibit the binding of human Tim-3 and human Galectin-9 was confirmed by using biparatopic antibodies (Ch149003ct antibody, Ch428003ct antibody, Ch621003ct antibody) except that the antibodies used were Example 4. It was carried out by the same method as described in (4-1). As a control, the Ch003_sc antibody whose binding analysis was performed in Example 4 (4-1) was used.
- Figure 8 shows the binding (%) of the antibody to human Galectin-9
- Table 9 shows the IC50 value (nM) of each biparatopic antibody calculated based on the analysis results.
- the biparatopic antibody produced in the present invention was able to inhibit the binding of human Tim-3 and human Galectin-9 by 90% or more. These results indicated that the biparatopic antibody produced in the present invention was stronger than the monoclonal antibody of the present invention and was capable of inhibiting the binding of human Tim-3 and human Galectin-9.
- the anti-human Tim-3 biparatopic antibodies (Ch149003ct antibody, Ch428003ct antibody, Ch621003ct antibody) of the present invention prepared in Example 5 inhibit binding of human Tim-3 and Phosphatidylserine. Potency was analyzed by flow cytometry.
- Example 4 The activity of these biparatopic antibodies to inhibit the binding of human Tim-3 and Phosphatidylserine was confirmed in Example 4 (4- 2) was carried out in the same manner as described in 2). As a comparative control, the Ch003_sc antibody whose binding analysis was performed in Example 4 (4-2) was used.
- Fig. 9 shows the analysis results by flow cytometry
- Table 10 shows the IC50 values (nM) of each antibody calculated based on the analysis results.
- the biparatopic antibody of the present invention almost completely inhibits the binding of human Tim-3 to Phosphatidylserine, although the IC50 value is approximately double that of the Ch003_sc antibody shown in Example 4 (4-2). did it.
- the biparatopic antibody prepared in the present invention strongly inhibits the binding of human Galectin-9 and Phosphatidylserine, which are ligands of human Tim-3, at the same time. It was shown to be an antibody.
- Example 8 Staphylococcus aureus Enterotoxin B (SEB) Stimulation Assay of Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs)
- PBMCs peripheral blood mononuclear cells
- SEB Staphylococcus aureus enterotoxin B
- the scFv_Fc_LALA-type antibodies (Ch003_sc antibody, Ch149_sc antibody, Ch428_sc antibody, Ch621_sc antibody) produced in Example 1 and the biparatopic antibodies (Ch149003ct antibody, Ch428003ct antibody, Ch621003ct antibody) produced in Example 5 were used.
- An isotype control antibody was used as a negative control.
- PBMCs collected from blood of healthy volunteers were suspended in RPMI-1640 medium supplemented with 10% FCS, 100 unit/ml penicillin, 100 ⁇ g/ml streptomycin, and 1 ⁇ GlutaMax (Gibco, 35050-061), and placed in a 96-well U-bottom plate. Seeded at 0.7-0.8 ⁇ 10 5 cells/well. An anti-human Tim-3 antibody was added to a final concentration of 10 ⁇ g/ml and reacted with PBMC for 30 minutes at 37° C. and 5% CO 2 . After that, SEB (Toxin Technology Inc., BT202RED) was added to a final concentration of 1 ng/ml, and cultured for 10 days at 37°C and 5% CO 2 .
- SEB Toxin Technology Inc., BT202RED
- a biotinylated anti-human Tim-3 antibody (prepared in-house) that does not compete with the test antibody was diluted with staining buffer to 1 ⁇ g/ml, 50 ⁇ l was added, and left standing at 4°C for 30 minutes. After washing once with staining buffer, T cell marker staining antibodies (Biolegend, anti-CD3:UCHT1, anti-CD4:RPA-T4, anti-CD8a:HIT8a) and fluorescently-labeled streptavidin are appropriately applied with staining buffer. Diluted and added in 100 ⁇ l aliquots.
- the cells were washed once with staining buffer, added with 50 ⁇ l of fixing buffer, and left at room temperature for 20 minutes for fixation. Next, wash twice with Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer (Bioleged), dilute IFN- ⁇ staining antibody (Biolegend, anti-IFN- ⁇ : B27) appropriately with Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer, add 100 ⁇ l and add 4 °C for 40 minutes in the dark. After washing twice with Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer, the cells were suspended in staining buffer, added with beads for counting cells (ThermoFisher Scientific, C36950), and analyzed with a flow cytometer.
- Tim- Fig. 10 shows the results of analysis by flow cytometry.
- Tim- Fig. 10-2 shows the results of calculating the expression level (MFI value) as a percentage with the isotype control as 100% and the staining negative control as 0%.
- the anti-human Tim-3 monoclonal antibody produced by the present invention amplified the number of CD8-positive IFN- ⁇ -positive cells. Furthermore, this effect was enhanced with the human Tim-3 biparatopic antibody of the present invention. This indicated that inhibition of not only Phosphatidylserine binding to human Tim-3 but also human Galectin-9 binding enhanced the activation of effector T cells.
- Example 9 Evaluation of suppression of apoptosis induction of T cells by Galectin-9 It was evaluated whether it suppresses the apoptosis induction of T cells.
- PBMC Peripheral blood mononuclear cells collected from the blood of healthy volunteers were suspended in RPMI-1640 medium supplemented with 10% FCS, 100 unit/ml penicillin, 100 ⁇ g/ml streptomycin, and 1 ⁇ GlutaMax (Gibco, 35050-061).
- Dynabeads TM Human T-Activator CD3/CD28 was added at 1:1 and cultured for 4 days. After that, the cells were seeded in a 96-well U-bottom plate at 1.0 ⁇ 10 5 cells/well, anti-human Tim-3 antibody was added to a final concentration of 10 ⁇ g/ml, and the conditions were 37° C., 5% CO 2 . for 30 minutes, Galectin-9 was added to a final concentration of 62.5 nM, and cultured for 8 hours at 37°C and 5% CO 2 .
- T cell marker staining antibodies Biolegend, anti-CD3:UCHT1, anti-CD4:RPA-T4, anti-CD8a:HIT8a
- fluorescently-labeled streptavidin are appropriately applied with staining buffer. Diluted and added in 100 ⁇ l aliquots. After standing at 4°C for 30 minutes in the dark, the cells were washed once with staining buffer and further washed with Annexin V binding buffer (Biolegend). Next, fluorescently-labeled Annexin V (Biolegend) was appropriately diluted with Annexin V binding buffer, and 100 ⁇ l of each was added.
- the results are shown in Fig. 11.
- the anti-human Tim-3 monoclonal antibody produced in the present invention was shown to suppress Galctin-9-induced apoptosis of T cells. Furthermore, this effect was further enhanced by the biparatopic antibody prepared in Example 5, and in CD4-positive T cells, it suppressed to the same level as under Galectin-9-free conditions, and all added Galectin-9 was nullified. turned into In addition, in CD8-positive T cells, apoptosis was suppressed even more than under Galectin-9-free conditions, and it is possible that not only the added Galectin-9 but also the Galectin-9 secreted from the cells was invalidated. sex is inferred. The enhanced inhibition of binding of human Tim-3 and human Galctin-9 by biparatopic antibodies was also confirmed as enhanced suppression of apoptosis-inducing signals on T cells.
- Example 10 CDR optimization of Ch003 antibody
- the anti-human Tim-3 antibody Ch003 antibody obtained in the present invention had multiple similar variations in the CDR sequences of V H and V ⁇ .
- Antibodies were generated in the scFv-Fc-LALA format with all combinations of five variations a to e for the chain variable region and three variations A1, A2 and B2 for the light chain variable region, with the highest binding affinity. determined a high combination of
- Table 11 shows the CDR sequences of VH and V ⁇
- Table 12 shows the binding affinity KD values of each combination for human Tim-3.
- the heavy chain variable region is a combination of d and the light chain variable region is A1 and A2
- the combination of the heavy chain variable region is e and the light chain variable region is A1 and A2 shows particularly high binding affinity. revealed (Table 12).
- an antibody having a heavy chain variable region of d and a light chain variable region of A1 was used as the Ch003_F20 antibody
- an antibody having a heavy chain variable region of d and the light chain variable region of B2 was used as the Ch072 antibody. .
- Ch003_F20 antibody VH region: EVMLMESGGG LVKLGGSLKL SCAASGFTFS SYYMS WVRQT PEKRLEWVA T ISNSGGSTYY PDSVKD RFTI SRDNAKNTLY LQMSSLNSED TAVYYCAR DP YYTNYVPMDY WGQGTSVTVS S (SEQ ID NO: 36)
- Ch072 antibody VH region: EVKLVESGGG LVKLGGSLKL
- Example 11 Humanization of Mouse Antibodies
- the antibodies obtained in Examples 1 and 10 were subjected to CDR grafting to humanize mouse antibodies.
- Example 2 the Ch003 antibody analyzed in Example 2 and the Ch003_F20 antibody CDR-optimized in Example 10 were selected and humanized.
- CDRs were defined by the Kabat numbering method. Sequences with high homology to the framework sequences of VH and V ⁇ of each mouse antibody were selected from known human antibody sequences, and the CDRs of mouse antibodies were grafted to produce humanized VH and V ⁇ . Where necessary, structurally important sites (Canonical, Vernier, Interface) in the framework were appropriately replaced with the sequence of the original mouse antibody.
- Ch003 antibody was used as a representative to create multiple humanized VH and V ⁇ . and each was combined with the originating murine VH and V ⁇ .
- Humanized VH1, VH2 and humanized V ⁇ 2, V ⁇ 3 were selected from the obtained antibodies based on the index of maintaining a binding affinity equal to or higher than that of the original mouse antibody.
- These multiple humanized VH and V ⁇ combinations (see Table 13 below) all had an affinity for human Tim-3 equal to or greater than that of the originating murine antibody.
- the humanization of the Ch003_F20 antibody was carried out by selecting the VH1 and V ⁇ 3 framework sequences from the humanized sequences selected for Ch003 (see Table 13).
- the resulting heavy and light chain sequences of the humanized antibodies (Hu003_12 antibody, Hu003_13 antibody, Hu003_22 antibody, Hu003_23 antibody, and Hu003_13_F20 antibody) based on the Ch003 and Ch003_F20 antibodies are shown in Table 14 below. (The sequences of the Hu003 antibody are shown in Table 14-1, and the sequences of the Hu003_F20 antibody are shown in Tables 14-2 and 14-3).
- Example 10 Humanization of Ch072 antibody
- the Ch072 antibody (heavy chain variable region d and light chain variable region B2) obtained in Example 10 was subjected to CDR grafting to obtain mouse Humanization of the antibody was performed.
- humanized VH1 and humanized V ⁇ 1 and V ⁇ 3 were selected for the obtained antibodies, using the index of maintaining a binding affinity equal to or higher than that of the original mouse antibody (see Table 15). These multiple humanized VH and V ⁇ combinations all had an affinity for human Tim-3 equal to or greater than that of the originating murine antibody.
- Table 16 shows the resulting heavy and light chain sequences of the humanized antibodies (Hu072_11 antibody and Hu072_13 antibody) obtained based on the Ch072 antibody.
- Ch149 antibody, Ch428 antibody, Ch621 antibody humanization and heavy chain CDR2 sequence alteration was performed by CDR grafting method.
- Ch149 antibody, Ch428 antibody, and Ch621 antibody are similar in the VH and V ⁇ sequences of the original mouse antibody, so the Ch428 antibody was used as a representative.
- humanized sequences for each of the heavy chain and light chain are created, and the humanized light chain is combined with the chimeric sequence heavy chain, and the chimeric sequence light chain is combined with the humanized heavy chain. , raised antibodies.
- the combination of chimeric sequence heavy chain and humanized V ⁇ 1, V ⁇ 3, and V ⁇ 4, and humanized VH4 were selected based on the objective of maintaining a binding affinity equal to or higher than that of the original mouse antibody. Combinations of chimeric sequence light chains were selected (see Table 17).
- the humanized Ch428 antibody was combined with the VH4 sequence of the Hu428 antibody as the heavy chain and the V ⁇ 1, V ⁇ 3, and V ⁇ 4 of the Hu428 antibody as the light chain to produce Hu428_41, Hu428_43, and Hu428_44 antibodies.
- the heavy chain amino acid sequences and light chain amino acid sequences of the obtained Hu428_41 antibody, Hu428_43 antibody, and Hu428_44 antibody were as shown in the table below (see Table 19).
- the framework obtained with the Hu428 antibody was then combined with the CDR sequences of the Ch149 and Ch621 antibodies and humanized for the Ch149 and Ch621 antibodies (see Table 20). Specifically, Table 21 shows the sequences of the heavy and light chains of the humanized antibodies (Hu149 antibody and Hu621 antibody) for Ch149 antibody and Ch621 antibody obtained based on the sequences obtained for the Hu428 antibody.
- CDR2 sequence modification was performed on the heavy chain (heavy chain V4 for each antibody) of the resulting humanized antibodies (Hu149 antibody, Hu428 antibody, and Hu621 antibody), - Alter CDR2 of heavy chain VH4 of Hu149 antibody with YIYPNNAGTS YNQKFKG (SEQ ID No: 74) to construct heavy chain VH7 (SEQ ID No: 75), or alter with YIYPNKGGTS YNQKFKG (SEQ ID No: 76) to constitute heavy chain VH8 (SEQ ID No: 77), - Alter CDR2 of heavy chain VH4 of Hu428 antibody with YIYPNNAGTS YNQKFKG (SEQ ID No: 78) to construct heavy chain VH7 (SEQ ID No: 79), or alter with YIYPNKGGTS YNQKFKG (SEQ ID No: 80) to construct heavy chain VH8 (SEQ ID No: 81), and modify CDR2 of heavy chain VH
- ⁇ About Hu149 antibody Hu149_71 antibody, Hu149_81 antibody, Hu149_73 antibody, Hu149_83 antibody, Hu149_74 antibody, Hu149_84 antibody ⁇ Hu428 antibody: Hu428_71 antibody, Hu428_81 antibody, Hu428_73 antibody, Hu428_83 antibody, Hu428_74 antibody, Hu428_84 antibody was made (see Table 22).
- the heavy chain sequences of the heavy chain CDR2-modified humanized antibodies prepared above are shown in Table 23 (Table 23-1 for Hu149 series antibodies, Table 23-2 for 428 series antibodies, and Table 23-3 for Hu621 series antibodies). show.
- Example 12 Binding Analysis of Humanized Antibody
- the humanized anti-human Tim-3 antibody of the present invention produced in Example 11 was subjected to an experiment for the purpose of binding analysis.
- the binding affinities of these humanized antibodies to human Tim-3 were analyzed by the method described in Example 3 (3-1), except that the antibodies used were humanized antibodies (Hu003_13_F20_sc antibody, Hu003_13_F20_LA antibody). did in the same way.
- the results are shown in Table 24.
- the humanized antibody obtained in the present invention has a lower KD value than the binding affinity to human recombinant Tim-3 shown by the original monoclonal antibodies (Ch003-LA antibody and Ch003_sc antibody). Improvement was confirmed.
- Example 11 the other humanized antibodies produced in Example 11 were also analyzed for binding to recombinant human Tim-3 in the same manner as above.
- Each humanized antibody was produced in the same manner as described in Example 1, except that the humanized antibody sequences described in Example 11 were used as the variable region sequences.
- Table 25 shows the binding affinities of Hu003_12_sc antibody, Hu003_13_sc antibody, Hu003_22_sc antibody, and Hu003_23_sc antibody to human Tim-3 as Hu003 antibodies.
- the humanized antibody obtained in the present invention has an equivalent KD value compared to the binding affinity to human recombinant Tim-3 shown by the original monoclonal antibody (Ch003_sc antibody), and maintains the affinity was confirmed.
- Table 26 shows the binding affinities of each of the Hu072_11 antibody and the Hu072_13 antibody to human Tim-3 as Hu072 series antibodies.
- the humanized antibody obtained in the present invention has an equivalent KD value compared to the binding affinity to human recombinant Tim-3 shown by the original monoclonal antibody (Ch072_sc antibody), and maintains the affinity was confirmed.
- Table 27 shows the binding affinities for Compared to the binding affinity to human recombinant Tim-3 shown by the original monoclonal antibody (Ch149_sc antibody), the KD value was the same or lower, confirming that the affinity was maintained or improved.
- Hu428_41_sc antibody, Hu428_43_sc antibody, and Hu428_44_sc antibody as Hu428-based antibodies and Hu428_71_sc antibody, Hu428_73_sc antibody, Hu428_74_sc antibody, Hu428_81_sc antibody, Hu428_83_sc antibody, and Hu428_84_sc antibody as human Tim-3 antibody of heavy chain CDR2 of Hu428-based antibody
- Table 28 shows the binding affinities for The KD value was almost the same as the binding affinity to human recombinant Tim-3 shown by the original monoclonal antibody (Ch428_sc antibody), confirming that the affinity was maintained.
- Table 29 shows the binding affinities for The KD value was lower than the binding affinity to human recombinant Tim-3 shown by the original monoclonal antibody (Ch621_sc antibody), confirming the improved affinity.
- the binding affinities of these humanized antibodies to human Tim-3 were analyzed except that the antibodies used were humanized antibodies (Hu003_13_F20_sc antibody, Hu003_13_F20_LA antibody, Hu149_83_sc antibody, Hu428_83_sc antibody, and Hu621_83_sc antibody). It was carried out by the same method as described in 3 (3-2). As comparative controls, Ch003_sc antibody was used against Hu003_13_F20_sc antibody, Ch003_LA antibody was used against Hu003_13_F20_LA antibody, and isotype control antibody was used as a negative control.
- Flow cytometry analysis results are shown in Figure 12 ( Figure 12 upper and middle panels for Hu003_13_F20_sc antibody and Hu003_13_F20_LA antibody, Figure 12 lower panel for Hu149_83_sc antibody, Hu428_83_sc antibody, and Hu621_83_sc antibody), and Hu003_13_F20_sc antibody calculated based on the data. and Hu003_13_F20_LA antibodies are shown in Table 30-1, and the dissociation constants KD (nM) of Hu149_83_sc antibody, Hu428_83_sc antibody, and Hu621_83_sc antibody are shown in Table 30-2, respectively.
- the humanized antibody of the present invention like the monoclonal antibody used as a control, specifically bound to human Tim-3 expressed on the cell membrane. This result also confirmed that the humanized antibody was successfully produced.
- the humanized anti-human Tim-3 antibodies of the present invention (Hu003_13_F20 antibody, Hu149_83 antibody, Hu428_83 antibody, and Hu621_83 antibody) produced in Example 11 show human Tim-3 on activated T cell membranes. binding was analyzed by flow cytometry.
- Example 11 Humanized anti-human Tim-3 antibodies of the present invention prepared in Example 11 (Hu003_13_F20_sc antibody, Hu003_13_F20_LA antibody, Hu149_83_sc antibody, Hu428_83_sc antibody and Hu621_83_sc antibody) were used in the same manner as described in Example 3 (3-3).
- Ch003_sc antibody was used against Hu003_13_F20_sc antibody
- Ch003_LA antibody was used against Hu003_13_F20_LA antibody
- isotype control antibody was used as a negative control.
- FIG. 13 Flow cytometry analysis results are shown in Figure 13 (Hu003_13_F20_sc antibody and Hu003_13_F20_LA antibody Figure 13 upper and middle panels, Hu149_83_sc antibody, Hu428_83_sc antibody, and Hu621_83_sc antibody Figure 13 lower panel), and Hu003_13_F20_sc antibody and Hu003_13_F20_sc antibody calculated based on the data
- Table 31-1 shows the dissociation constant KD (nM) of each of the Hu003_13_F20_LA antibodies
- Table 31-2 shows the dissociation constant KD (nM) of each of the Hu149_83_sc, Hu428_83_sc, and Hu621_83_sc antibodies.
- the humanized antibody of the present invention like the monoclonal antibody of the present invention used as a control, specifically bound to human Tim-3 expressed in primary T cells.
- Example 13 Ligand-binding inhibitory activity of humanized antibody
- the humanized anti-human Tim-3 antibody of the present invention produced in Example 11 was subjected to an experiment for the purpose of functional analysis.
- Human Tim-3 and human Galectin-9 binding inhibitory activity of these humanized antibodies was confirmed by using humanized antibodies (Hu003_13_F20_sc antibody, Hu003_13_F20 antibody_LA, Hu149_83_sc antibody, Hu428_83_sc antibody, and Hu621_83_sc antibody). It was carried out in the same manner as described in Example 4 (4-1) except that As comparative controls, Ch003_sc antibody was used against Hu003_13_F20_sc antibody, Ch003_LA antibody was used against Hu003_13_F20_LA antibody, and isotype control antibody was used as a negative control.
- Fig. 14 shows the results of antibody binding (%) to human Galectin-9. It was shown that the humanized antibodies produced by the present invention are antibodies capable of inhibiting the binding of human Tim-3 and human Galectin-9 to the same extent as the monoclonal antibodies of the present invention from which the respective humanized antibodies are derived.
- the maximal inhibition rate was 71.2% for Ch003_sc antibody, 65.1% for Hu003_13_F20_sc antibody, 58.8% for Ch003_LA antibody, 59.6% for Hu003_13_F20_LA_sc antibody, 61.5% for Hu149_83_sc antibody, 56.8% for Hu428_83_sc antibody, and 53.8% for Hu621_83_1sc antibody).
- the human Tim-3 and Phosphatidylserine binding inhibitory activity of these humanized antibodies was confirmed except that the antibodies used were humanized antibodies (Hu003_13_F20_sc antibody, Hu003_13_F20_LA antibody, Hu149_83_sc antibody, Hu428_83_sc antibody, and Hu621_83_sc antibody). It was carried out in the same manner as described in Example 4 (4-2). As controls, Ch003_sc antibody was used against Hu003_13_F20_sc antibody, Ch003_LA antibody was used against Hu003_13_F20_LA antibody, and isotype control antibody was used as a negative control.
- IC50 values (nM) of each of the Hu003_13_F20_sc antibody and Hu003_13_F20_LA antibody calculated based on this analysis result are shown in Table 32-1
- Hu149_83_sc antibody, Hu428_83_sc antibody, and the IC50 values (nM) of each of the Hu621_83_sc antibodies are shown in Table 32-2.
- the humanized antibodies produced in the present invention were able to inhibit the binding of human Tim-3 to Phosphatidylserine to the same extent as the monoclonal antibody of the present invention, which is the source of each humanized antibody.
- Example 14 Staphylococcus aureus Enterotoxin B (SEB) Stimulation Assay of Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC) Effects on T-cell activation were assessed by activation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) by Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB).
- SEB Staphylococcus aureus Enterotoxin B
- Example 11 The same method as described in Example 8 was used, except that the humanized anti-human Tim-3 antibody (Hu003_13_F20_sc antibody) of the present invention produced in Example 11 was used as the antibody.
- the Ch003_sc antibody was used as a comparative control, the isotype control antibody as a negative control, and the antibody described in US9605070B2 (ABTIM3-hum21 VH:Seq No.26/VL:Seq No.20) as a reference antibody, respectively.
- Fig. 16 shows the results of analysis by flow cytometry.
- Figure 16-1 shows the changes in the number of CD4-positive/IFN ⁇ -positive cells and the changes in the number of CD8-positive/IFN ⁇ -positive cells.
- Figure 16-2 shows the results of calculating the expression level (MFI value) as a percentage with the isotype control as 100% and the staining negative control as 0%.
- the humanized anti-human Tim-3 antibody produced by the present invention increased the number of CD8-positive IFN- ⁇ -positive cells. This feature was significantly higher than the positive control, the reference antibody.
- the humanized anti-human Tim-3 antibody produced in the present invention suppressed the expression level of human Tim-3 on CD8-positive, IFN- ⁇ -positive cells.
- the humanized anti-human Tim-3 antibody produced in the present invention inhibits the binding of human Galectin-9 and Phosphatidylserine to human Tim-3, and suppresses the expression of human Tim-3 on effector cells, resulting in effector T An antibody that contributes to cell activation.
- Example 15 Production of anti-human Tim-3 biparatopic antibody using humanized antibody Based on this, a biparatopic antibody was generated that binds to human Tim-3.
- the Fc portion was Knob type and a C-tag was added to the C-terminus.
- the Fc portion was of the Hole type, and two DNAs encoding the two antibodies were inserted into the vector. i.e.
- Example 16 Binding Analysis of Biparatopic Antibodies Derived from Humanized Antibodies
- binding analysis was performed on the humanized anti-human Tim-3 biparatopic antibody of the present invention produced in Example 15. An experiment was conducted with the aim of
- the results are shown in Table 33.
- the humanized biparatopic antibodies of the present invention have improved binding affinities compared to the original humanized monoclonal antibodies (Example 12 (12-1) Tables 24-29). This is because the biparatopic antibody was able to bind to the analyte at two sites, resulting in an avidity effect. From this result, it was confirmed that the biparatopic antibody was successfully produced.
- the analysis results by flow cytometry are shown in Fig. 17, and the dissociation constant KD (nM) of each antibody calculated based on the data is shown in Table 34.
- the humanized biparatopic antibody of the present invention like the humanized monoclonal antibody of Example 12, specifically bound to human Tim-3 expressed on the cell membrane. Also, the humanized biparatopic antibody had an increased MFI for saturation binding compared to the original humanized monoclonal antibody. This is probably because the biparatopic antibody binds with one molecule to one antigen molecule on the cell membrane, while the humanized monoclonal antibody binds with one molecule to two antigen molecules on the cell membrane. Similar to Example 16 (16-1), this result also confirmed that the humanized biparatopic antibody was successfully produced.
- the humanized anti-human Tim-3 biparatopic antibody of the present invention (Hu149003ct antibody, Hu428003ct antibody, and Hu621003ct antibody) produced in Example 15, human Tim-3 on the activated T cell membrane binding was analyzed by flow cytometry.
- the analysis results by flow cytometry are shown in Fig. 18, and the dissociation constant KD (nM) of each antibody calculated based on the data is shown in Table 35.
- the humanized biparatopic antibody of the present invention like the humanized monoclonal antibody of the present invention whose binding was shown in Example 12, is specific to human Tim-3 expressed in primary T cells. Combined. Also, the humanized biparatopic antibody had an increased MFI for saturation binding compared to the original humanized monoclonal antibody. These results indicated that the humanized biparatopic antibodies produced in the present invention functioned also in primary cells.
- Example 17 Ligand-binding inhibitory activity of humanized biparatopic antibody
- the humanized biparatopic antibody prepared in Example 15 was subjected to an experiment for the purpose of functional analysis.
- Human Tim-3 and human Galectin-9 binding inhibitory activities of these humanized biparatopic antibodies were confirmed except that the antibodies used were humanized biparatopic antibodies (Hu149003ct antibody, Hu428003ct antibody, and Hu621003ct antibody). was performed in the same manner as described in Example 4 (4-1). As comparative controls, half molecules of these humanized biparatopic antibodies were derived, binding analysis was performed in Example 12 (12-2), and Galectin-9 binding inhibition evaluation was performed in Example 13 (13-1). We used the Hu003_13_F20_sc antibody.
- the results of binding (%) of antibodies to human Galectin-9 are shown in Figure 19, and the IC50 values (nM) of each humanized biparatopic antibody calculated based on the analysis results are shown in Table 36.
- the humanized biparatopic antibody produced in the present invention was able to inhibit the binding of human Tim-3 and human Galectin-9 by 90% or more. From this result, the humanized biparatopic antibody produced in the present invention is stronger than the humanized monoclonal antibody produced in Example 11 of the present invention, and the chimeric biparatopic antibody shown in Example 7 (7-1). It was shown to be an antibody that can inhibit the binding of human Tim-3 and human Galectin-9 equivalently to the antibody.
- Human Tim-3 and Phosphatidylserine binding inhibition activity of these humanized biparatopic antibodies was confirmed except that the antibodies used were humanized biparatopic antibodies (Hu149003ct antibody, Hu428003ct antibody, and Hu621003ct antibody). It was carried out in the same manner as described in Example 4 (4-2). As a comparative control, Hu003_13_F20_sc, which is derived from half molecules of these biparatopic antibodies, was subjected to binding analysis in Example 12 (12-2), and to evaluation of Phophatidylserine binding inhibition in Example 13 (13-2). antibody was used.
- Fig. 20 shows the analysis results by flow cytometry
- Table 37 shows the IC50 values (nM) of each antibody calculated based on the analysis results.
- the humanized biparatopic antibody of the present invention has an IC50 value that is about twice as high as that of the Hu003_13_F20_sc antibody shown in Example 13 (13-2), it is shown in Example 7 (7-2). It almost completely inhibited the binding of human Tim-3 to Phosphatidylserine, comparable to the chimeric biparatopic antibody.
- the humanized biparatopic antibody prepared in the present invention strongly binds to human Tim-3 ligands human Galectin-9 and Phosphatidylserine at the same time. It was shown to be an inhibitory antibody.
- Example 18 Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Staphylococcus aureus Enterotoxin B (SEB) Stimulation Assay Using Humanized Antibodies
- PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cell
- SEB Staphylococcus aureus Enterotoxin B
- SEB Staphylococcus aureus Enterotoxin B
- the humanized anti-human Tim-3 monoclonal antibodies (Hu003_13_F20_sc antibody, Hu149_83_sc antibody, Hu428_83_sc antibody, and Hu621_83_sc antibody) generated in Example 11, and the humanized anti-human Tim-3 biparatopic antibody generated in Example 15
- the antibodies Hu149003ct antibody, Hu428003ct antibody, and Hu621003ct antibody
- An isotype control antibody was used as a negative control.
- Fig. 21 shows the results of analysis by flow cytometry.
- Tim- Fig. 21-2 shows the results of calculating the expression level (MFI value) as a percentage, with the isotype control as 100% and the staining negative control as 0%.
- the humanized anti-human Tim-3 monoclonal antibody produced in the present invention amplified the number of CD8-positive, IFN- ⁇ -positive cells, and this effect was further enhanced by the humanized anti-human Tim-3 biparatopic antibody.
- humanized anti-human Tim-3 monoclonal antibodies Hu003_13_F20_sc antibody, Hu149_83_sc antibody, Hu428_83_sc antibody, and Hu621_83_sc antibody
- humanized anti-human Tim-3 biparatopic antibodies Hu149003ct antibody, Hu428003ct antibody) prepared in the present invention , and Hu621003ct antibody
- Hu149003ct antibody, Hu428003ct antibody prepared in the present invention
- Hu621003ct antibody can enhance the activation of effector T cells against human Tim-3, similar to the chimeric monoclonal antibody prepared in Example 2 and the chimeric biparatopic antibody prepared in Example 5. shown.
- Example 19 Evaluation of suppression of apoptosis induction of T cells by Galectin-9 It was evaluated whether to suppress.
- the humanized anti-human Tim-3 monoclonal antibody (Hu003_13_F20_sc antibody) prepared in Example 11, and the humanized anti-human Tim-3 biparatopic antibody prepared in Example 15 (Hu149003ct antibody, Hu428003ct antibody, and Hu621003ct Antibody) was used, and the experiment was performed by the method described in Example 9, except that the amount of Galectin-9 added was 125 nM.
- An isotype control antibody was used as a negative control.
- the chimeric anti-human Tim-3 monoclonal antibody (Ch003_sc antibody) prepared in Example 1 and the chimeric anti-human Tim-3 biparatopic antibody prepared in Example 5 (Ch149003ct antibody, Ch428003ct antibody, and Ch621003ct antibody ) under the same conditions as for the biparatopic antibody above.
- Fig. 22 The results are shown in Fig. 22. It was shown that the humanized anti-human Tim-3 monoclonal antibody (Hu003_13_F20_sc antibody) produced in the present invention slightly inhibits Galctin-9-induced apoptosis of T cells. This effect was enhanced with the humanized biparatopic antibodies (Hu149003ct antibody, Hu428003ct antibody, and Hu621003ct antibody) produced in Example 15.
- the humanized biparatopic antibody like the chimeric biparatopic antibody, suppressed the apoptosis-inducing signal of T cells by enhancing the binding inhibition of human Tim-3 and human Galctin-9.
- Example 20 Evaluation of effects on CMV peptide antigen-specific T cell responses The effects of the anti-human Tim-3 biparatopic antibodies of the present invention on CMV peptide antigen-specific T cell responses were evaluated.
- the evaluation antibodies used in this example were Hu149003ct, Hu428003ct, and Hu621003ct as biparatopic antibodies. A combination of seeds was used.
- PBMC derived from healthy volunteers whose HLA type is HLA-A02 were suspended in RPMI-1640 medium supplemented with 10% FCS, 100 unit/ml penicillin, 100 ⁇ g/ml streptomycin, 1 ⁇ GlutaMax (Gibco, 35050-061), and 10 mM HEPES. Turbid, seeded in 96-well U-bottom plates (2-5 ⁇ 10 5 cells/well), and assay antibody was added at a final concentration of 10 ⁇ g/ml.
- HLA-selective CMV antigen peptides HLA-A02: NLVPMVATV, HLA-DRB1*11: EHPTFTSQYRIQGKL, HLA-DQB1*06: LLQTGIHVRVSQPSL, were added at 1 ⁇ g/ It was added at a concentration of mL and cultured for 6 days under conditions of 37°C and 5% CO 2 .
- HLA-A*02:01 CMV pp65 Tetramer-NLVPMVATV-PE MBL, TS-0010-1C
- T cell marker staining antibodies Biolegend, anti-CD3: UCHT1, anti-CD4: RPA-T4, Cell staining was performed using anti-CD8a:HIT8a).
- the stained cells were analyzed by flow cytometry, and the ratio of CMV antigen-specific T cells among CD8-positive cells was calculated. Also, the IFN ⁇ concentration and TNF ⁇ concentration in the collected culture supernatant were quantified by the Luminex method.
- Fig. 23 shows the calculated ratio of CMV antigen-specific T cells among CD8-positive cells and the IFN ⁇ and TNF ⁇ concentrations in the culture supernatant measured by Luminex.
- Hu003_13_F20_sc A humanized anti-human Tim-3 monoclonal antibody, Hu003_13_F20_sc, evaluated as a control, increased the percentage of CMV antigen-specific T cells and the IFN ⁇ and TNF ⁇ concentrations in the culture supernatant compared to the group to which the isotype control antibody was added.
- Hu149_sc was comparable to the isotype control antibody, but in the system to which both (Hu003_13_F20_sc and Hu149_83_sc) were added, the percentage and culture of CMV antigen-specific T cells were higher than in the group to which Hu003_13_F20_sc was added alone. IFN ⁇ and TNF ⁇ concentrations in the serum were further increased.
- Example 21 Evaluation of the Impact of Endogenous Antigens on Antigen-Specific T-Cell Responses and Anti-Tumor Effects activation and anti-tumor effects were evaluated by co-culture of CMV antigen-expressing tumor cells and PBMCs.
- the evaluation antibodies used in this example were Ch428003ct as an anti-human Tim-3 biparatopic antibody and isotype control antibody CN2_cs as a control.
- MDA-MB-231 cell line (ATCC: HTB- 26) was suspended in RPMI-1640 medium supplemented with 10% FCS, 100 unit/ml penicillin, 100 ⁇ g/ml streptomycin, 1 ⁇ GlutaMax (Gibco, 35050-061), and 10 mM HEPES, and seeded in a 96-well plate. , 37°C, 5% CO 2 for 1 day.
- PBMCs derived from healthy volunteers whose HLA type is HLA-A02 were added with 10% FCS, 100 unit/ml penicillin, 100 ⁇ g/ml streptomycin, 1 ⁇ GlutaMax (Gibco, 35050-061), and 10 mM HEPES. After being suspended in the added RPMI-1640 medium, the PBMCs were added to a 96-well plate so that the number of PBMCs was 5 times that of the tumor cells seeded the previous day. An evaluation antibody or isotype control antibody at a final concentration of 10 ⁇ g/ml was added to the wells to which tumor cells and PBMCs had been added, and coculture was performed for 5 days at 37° C. and 5% CO 2 .
- the culture supernatant and non-adherent cells were collected, and after washing the wells twice with PBS, 70 ⁇ L of 10% FCS, 100 unit/ml penicillin, 100 ⁇ g/ml streptomycin, 1 ⁇ GlutaMax (Gibco, 35050-061), RPMI-1640 medium supplemented with 10 mM HEPES was added. An additional 70 ⁇ L of Cell Titer Glo solution (Promega: G7570) was added and shaken at room temperature for 10 minutes, then 100 ⁇ L of the well contents were dispensed into a white 96-well plate and the luminescence level was measured using a luminescence plate reader.
- the collected culture supernatant was centrifuged to remove cellular components, and then the IFN ⁇ and TNF ⁇ concentrations were quantified using Luminex.
- Fig. 24 shows the concentrations of IFN ⁇ and TNF ⁇ in the culture supernatant on day 5 of co-culture, and the amount of light emitted by ATP derived from live tumor cells on day 5 of co-culture.
- the concentrations of IFN ⁇ and TNF ⁇ in the culture supernatant of the group to which the anti-human Tim-3 biparatopic antibody Ch428003ct of the present invention was added were significantly increased compared to the group to which the isotype control antibody was added. It was confirmed that the 3-biparatopic antibody enhanced the activation of antigen-specific T cells even with endogenous antigens presented on the cell membrane.
- Ch428003ct inhibited tumor cell proliferation by 20% compared to an isotype control antibody in co-culture with PBMCs, suggesting that the anti-human Tim-3 biparatopic antibody is activated by endogenous antigens. It was shown to enhance the antitumor effect of T cells against tumor cells expressing the antigen.
- Example 22 Efficacy test using human Tim-3 knock-in mice
- the anti-tumor efficacy of the humanized anti-human Tim-3 bispecific antibody of the present invention was evaluated in a mouse model.
- Tumor volume major axis x minor axis x minor axis/2
- Atezolizumab PubChem SID 312642102
- mice were adjusted in-house in the form of IgG1LALA-type IgG1 antibodies.
- mice body weight and tumor volume were carried out until the 31st day of the test, and all test animals were euthanized on the 32nd day of the test.
- Tumor tissues were excised from all test individuals, and tumor-infiltrating lymphocytes were analyzed as described below.
- the resected tumor was cut into pieces of about 3 mm square using a clean razor, immersed in an enzyme liquid cocktail (Miltenyi Biotech: MACS Tumor Dissociation kit), and then treated with Gentle MACS (Miltenyi Biotech).
- Tumor single cells were prepared.
- the prepared tumor single cells were treated with fluorescence-labeled antibodies for mouse surface antigens (BioLegend: anti-mouse CD3, 17A2; anti-mouse CD4, GK1.5, MBL; anti-mouse CD8, KT14) and OVA-tetramer (MBL: T -Select H-2Kb OVA Tetramer-SIINFEKL-APC) and flow cytometry was used to detect tumor-infiltrating lymphocytes.
- Fig. 25 shows changes in average tumor volume in each treatment group and changes in tumor volume in individual mice in each treatment group.
- the group treated with anti-mouse PD-L1 antibody alone had a tumor growth inhibition rate of 43%
- the group treated with anti-mouse PD-L1 antibody and Hu149003ct showed , the tumor growth inhibition rate was 69%, and an additional effect on the action of the anti-mouse PD-L1 antibody was observed.
- the anti-human Tim-3 bispecific antibody of the present invention has an anti-tumor effect on subcutaneously inoculated tumors in mice, both when used alone and when used in combination with an anti-mouse PD-L1 antibody. rice field.
- Fig. 26 shows the analysis results of lymphocytes infiltrating tumor tissues collected from these four groups of mice.
- the analysis results are shown as the number of OVA tetramer-positive CD8-positive T cells contained per 1 g of tumor (left) and the percentage of OVA tetramer-positive cells among CD8-positive tumor-infiltrating T cells (right).
- the average number of OVA tetramer-positive CD8-positive T cells per tumor unit weight was higher in Group 2 than in Group 1, and in Group 4 than in Group 3.
- the ratio of OVA tetramer-positive cells in CD8-positive tumor-infiltrating T cells was also significantly increased in groups 2 and 4 compared to group 1.
- Example 23 Epitope Mapping
- the epitopes of the anti-human Tim-3 antibodies Hu003_13_F20_scFv and Hu149_83_scFv of the invention were determined by X-ray crystallography.
- Inclusion bodies were then denatured with 6 M Gdm-HCl, 50 mM Tris, pH 8.0 and 10 mM DTT and unwound with 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 3.73 mM cystamine, 6.73 mM cysteamine, 2 mM EDTA. did
- the human Tim-3 IgV domain (aa. 22-130) protein with a polyhistidine tag added to the N-terminus after unwinding was equilibrated with TBS, pH 7.4, and purified by gel filtration on Superdex-75.
- human Tim-3 IgV domain (aa. 22-130) protein with a C-tag added to the C-terminus after unwinding was subjected to an anti-C-tag antibody column (Thermo, 494307201) and treated with TBS (pH 7.4). After washing and elution with 2 M MgCl 2 , gel filtration purification was performed with Superdex-75 equilibrated with TBS, pH 7.4.
- the prepared antigen and scFv were mixed, and the complex was purified by gel filtration. Crystallization conditions were screened and optimized using the purified complex, and diffraction experiments were performed using the obtained crystals. Diffraction data with a resolution of 2.05 ⁇ for Hu003_13_F20 and 2.11 ⁇ for Hu149_83 were obtained, respectively, and the structure of the complex was determined by the molecular replacement method. The interaction site was identified from the obtained structure, and the epitope was determined.
- Figure 27 shows the structure of the human Tim-3 IgV domain obtained by X-ray crystallography and the epitope sites of the Hu003_13_F20_scFv antibody
- Table 39 shows the epitope of the Hu003_13_F20_scFv antibody.
- Phosphatidylserine-binding sites for human Tim-3 are 111R and 118M, which bind between the F-G and C-C' loops.
- the epitope of the Hu003_13_F20_scFv antibody spans the F-G loop and the C-C' loop, indicating that it can inhibit the binding of Phosphatidylserine. This result agrees with the result of Example 13.
- the binding site of human Galectin-9 to human Tim-3 is the N-type sugar chain that binds to 99N, and the Hu003_13_F20_scFv antibody does not directly bind to that binding site.
- the results of Example 13 show that the Hu003_13_F20_sc antibody can inhibit human Galectin-9 binding by about 60%, suggesting that steric hindrance due to binding to human Tim-3 inhibits human Galectin-9 binding. .
- Figure 28 shows the structure of the human Tim-3 IgV domain obtained by X-ray crystal structure analysis and the epitope site of the Hu149_83_scFv antibody
- Table 40 shows the epitope of the Hu149_83_scFv antibody.
- Phosphatidylserine-binding sites for human Tim-3 are 111R and 118M, which bind between the F-G and C-C' loops.
- the epitope of the Hu149_83_scFv antibody is not involved in the F-G loop and the C-C' loop, consistent with the result of Example 13 that it does not inhibit the binding of Phosphatidylserine.
- the binding site of human Galectin-9 to human Tim-3 is the N-type sugar chain that binds to 99N, and the Hu149_83_scFv antibody does not directly bind to that binding site.
- the results of Example 13 show that the Hu149_83_sc antibody can suppress human Galectin-9 binding by about 60%, suggesting that steric hindrance due to binding to human Tim-3 inhibits human Galectin-9 binding. .
- FIG. 29 shows the results of creating a binding model for the biparatopic antibody Hu149003 based on the analysis results (22-4). From this model, the humanized biparatopic antibody binds human Tim-3 sandwiching the two constituent scFv arms without competition, thereby allowing Hu003_13_F20_scFv to bind human Tim-3 to Phosphatidylserine. While completely inhibiting Galectin-9 binding between both arms, it effectively inhibits the binding of human Tim-3 and Galectin-9 either by conformational change of Tim-3 or by steric hindrance. It is speculated that
- Antibodies and the like obtained by the present invention suppress the function of Tim-3 expressed in cancer cells or immune cells, release the exhaustion of immune cells (especially T cells), activate immune cells, and suppress tumors. It exerts an antiproliferative effect and a cancer therapeutic effect.
- the present invention can be widely used as a therapeutic/diagnostic agent for cancer. Since the antibody according to the present invention has the effect of relieving exhaustion of immune cells, it is expected to be particularly effective in combination therapy with other immunotherapies.
Abstract
【課題】 本発明は、Tim-3抗原を標的としたより高い機能を有する抗体または抗体誘導体、より具体的にはより高い免疫抑制シグナル除去活性を有する抗体等を開発すること、ならびにそのような抗体等を含むがん治療用組成物を開発することを課題とする。 【解決手段】 本発明は、特定のアミノ酸配列を有する重鎖・軽鎖の相補性決定領域を含む、Tim- 3抗原に対して結合性を有し、がん細胞に対する傷害性を有するT細胞を活性化する、抗体等を見出し、上記課題を解決することができることを示した。
Description
本発明は、がん細胞や免疫細胞などに発現するTim-3抗原に対して結合性を有し、がん細胞に対する生体免疫系の抑制シグナルを除去する効果を有する抗体または抗体誘導体、および該抗体または抗体誘導体を含むがん治療用およびがん検査用の組成物および方法に関する。
がん細胞は免疫系からの攻撃を回避するために、制御性T細胞（Regulatory T cell：Treg）や骨髄由来抑制細胞（Myeloid-derived suppressor cell：MDSC）に加えて、免疫チェックポイント分子による免疫抑制機能も積極的に活用し、免疫系から逃避している。これまでに、さまざまな免疫チェックポイント分子とそのリガンドが同定されている。
免疫チェックポイント阻害剤は、この免疫チェックポイント分子とそのリガンドとの結合を阻害して、免疫抑制シグナルの伝達を阻害することにより、がん細胞の免疫チェックポイント分子によって抑制されていたT細胞の活性化抑制を解除し、免疫機能を再活性化させ、がん細胞に対する免疫作用を発生させることができる。この機能を利用して、従来から使用されてきた抗がん薬や分子標的薬とは異なるメカニズムでがん細胞を治療することができる。
これまでに、免疫チェックポイント阻害薬として上市された医薬品としては、PD-1/PD-L1の阻害剤であるニボルマブ、ペムブロリズマブ（抗PD-1抗体）およびアテゾリズマブ、デュルバルマブ（抗PD-L1抗体）や、CTLA-4/B7（CD80/CD86）の阻害剤であるイピリムマブ（抗CTLA-4抗体）などが知られている。これらの抗体を主成分とする医薬品は、いくつかのがん種において、単剤もしくは他の抗がん剤との併用で、高い有効性を示している。
しかしながら、従来の免疫チェックポイント阻害薬の奏効率は5～30％程度と言われており、特に患者のがんの免疫状態の個人差が免疫チェックポイント阻害薬の効果に関係することが明らかになっている。このがん免疫状態の個人差は、がん細胞の遺伝子異常の状態を主な原因として、患者の免疫体質（HLAタイプなどの遺伝的背景）、様々な環境因子（腸内細菌、喫煙、紫外線、食事、ストレスなど）によって左右されると考えられており、これらの既存の免疫チェックポイント阻害薬では。対応できない患者が存在している。
免疫チェックポイント分子の一つとして、Tim-3（別名：HAVCR2）が知られている。Tim-3は、T細胞免疫グロブリン-ムチンドメイン含有分子スーパーファミリー（T cell Ig and mucin domain containing molecule superfamily）の一つである。Tim3は、T細胞トレランス（T cell tolerance）で重要な調節分子であり、慢性のウイルス感染時の自己免疫とT細胞の疲弊（T cell exhaustion）に極めて重要な役割を担っていることがわかっている（非特許文献1）。
Tim-3は、Th1細胞（1型Tヘルパー細胞）、樹状細胞、CD8+T細胞および他のリンパ球サブセットで発現される。Tim-3は、Phosphatidylserine（PS）、CEACAM1（Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1）、Galectin-9、HMGB1（High mobility group box 1）などの多くのリガンドと相互作用し、この中でもTim-3-Galectin-9経路は、Th1細胞（1型Tヘルパー細胞）免疫を負に調節するため（非特許文献2）、Tim-3を阻害することにより、自然免疫および獲得免疫を増強することが予想されている。
また、一部のがん細胞に発現するTim-3は、がんの進展過程において重要な役割を演じていることが報告されている。例えば骨髄系腫瘍では、腫瘍細胞に発現するTim-3に、腫瘍細胞自身が分泌するGalectin-9が結合することにより、Tim-3発現がん幹細胞に自己複製に重要なシグナルを伝え、クローンサイズを拡大することが示唆されている（非特許文献3）。
Isabel Sada-Ovalle, et al., J. Immunol., 2012, 189(12):5896-902
Chen Zhu, et al., Nat. Immunol., 2005, 6(12):1245-52
Yoshikane Kikushige,et al., Cell Stem Cell., 2015, 17:341-352
本発明は、Tim-3抗原を標的としたより高い機能を有する抗体または抗体誘導体（以下、総称的にいう場合には「抗体または抗体誘導体」を抗体等と呼ぶ）、より具体的にはより高い免疫抑制シグナル除去活性を有する抗体等を開発すること、ならびにそのような抗体等を含むがん治療用組成物を開発することを課題とする。
本発明は、Tim-3抗原に対して結合性を有し、がん細胞に対する生体免疫系の抑制シグナルを除去する効果を有する抗体等を見出し、上記課題を解決することができることを示した。
より具体的には、本件出願は、前述した課題を解決するため、以下の態様を提供する：
［1］ Tim-3抗原に対して結合性を有し、がん細胞に対する免疫活性を増強する、2種の異なる半分子の組み合わせであるヘテロダイマー型の抗体または抗体誘導体。
［2］ 抗体の半分子または抗体誘導体の半分子の一方が、Tim-3抗原の第一の領域と結合し、抗体の半分子または抗体誘導体の半分子のもう一方が、Tim-3抗原の第二の領域と結合する、［1］に記載の抗体または抗体誘導体。
［3］ 抗体の半分子または抗体誘導体の半分子が、
（1） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（SYYMS、SEQ ID No: 1）、CDR2（TISNSGGSIYYLDSVKD、SEQ ID No: 2）、およびCDR3（DPYYSNYVPMDY、SEQ ID No: 3）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQYVDTYVA、SEQ ID No: 4）、CDR2（SASTRHT、SEQ ID No: 5）、およびCDR3（AQYSSSPLT、SEQ ID No: 6）；
（2） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No: 9）、CDR2（YIYPNNGGTSYNQKFKG、SEQ ID No: 10）、およびCDR3（SGYGNYYTMDY、SEQ ID No: 11）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No: 12）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No: 13）、およびCDR3（QQHYSSPST、SEQ ID No:14）；
（3） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:17）、CDR2（YIYPNNGGTSYNQKFKG、SEQ ID No:18）、およびCDR3（GGYYSYYSYDY、SEQ ID No:19）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:20）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:21）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:22）；
（4） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:25）、CDR2（YIYPNNGGTSYNQKFKG、SEQ ID No:26）、およびCDR3（SGYKAYYAMDY、SEQ ID No:27）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:28）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:29）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:30）；
（5） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（SYYMS、SEQ ID No:33）、CDR2（TISNSGGSTYYPDSVKD、SEQ ID No:34）、およびCDR3（DPYYTNYVPMDY、SEQ ID No:35）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQYVDTYVA、SEQ ID No:4）、CDR2（SASTRHT、SEQ ID No:5）、およびCDR3（AQYSSSPLT、SEQ ID No: 6）；
（6） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（SYYMS、SEQ ID No: 33）、CDR2（TISNSGGSTYYPDSVKD、SEQ ID NO: 34）、およびCDR3（DPYYTNYVPMDY、SEQ ID NO: 35）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASENVGTYVS、SEQ ID NO: 52）、CDR2（GASNRYT、SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（GQSYSYPLT、SEQ ID NO: 54）；
（7） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No: 9）、CDR2（YIYPNNAGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 74）、およびCDR3（SGYGNYYTMDY、SEQ ID No: 11）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No: 12）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No: 13）、およびCDR3（QQHYSSPST、SEQ ID No:14）；
（8） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No: 9）、CDR2（YIYPNKGGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 76）、およびCDR3（SGYGNYYTMDY、SEQ ID No: 11）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No: 12）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No: 13）、およびCDR3（QQHYSSPST、SEQ ID No:14）；
（9） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:17）、CDR2（YIYPNNAGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 78）、およびCDR3（GGYYSYYSYDY、SEQ ID No:19）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:20）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:21）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:22）；
（10） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:17）、CDR2（YIYPNKGGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 80）、およびCDR3（GGYYSYYSYDY、SEQ ID No:19）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:20）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:21）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:22）；
（11） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:25）、CDR2（YIYPNNAGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 82）、およびCDR3（SGYKAYYAMDY、SEQ ID No:27）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:28）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:29）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:30）；
（12） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:25）、CDR2（YIYPNKGGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 84）、およびCDR3（SGYKAYYAMDY、SEQ ID No:27）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:28）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:29）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:30）；
からなる群から選択されるいずれかの重鎖・軽鎖の相補性決定領域を含む抗体の半分子または抗体誘導体の半分子の異なる2種の組み合わせである、［1］または［2］に記載の抗体または抗体誘導体。
［4］ 抗体の半分子または抗体誘導体の半分子の一方が（1）、（5）または（6）の半分子であり、抗体の半分子または抗体誘導体の半分子のもう一方が（2）～（4）、（7）～（12）のいずれかの半分子である、［1］～［3］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体。
［5］ 抗体誘導体が、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖Fv抗体（scFv抗体）、Fab、Fab’、 F(ab’)2、Fcエフェクター機能改変抗体、IgG1LALA、IgG1_N297A、IgG4_S228Pから選択される抗体改変体またはその機能的断片から選択される、［1］～［4］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体。
［6］ 抗体の半分子または抗体誘導体の半分子の重鎖可変領域VHドメインのアミノ酸配列が、
（VH-1a）SEQ ID No: 7のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 7のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 1）、CDR2（SEQ ID No: 2）、およびCDR3（SEQ ID No: 3）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-1b）SEQ ID No: 49のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 49のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 1）、CDR2（SEQ ID No: 2）、およびCDR3（SEQ ID No: 3）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-1c）SEQ ID No: 57のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 57のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 1）、CDR2（SEQ ID No: 2）、およびCDR3（SEQ ID No: 3）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-2a）SEQ ID No: 15のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 15のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 10）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-2b）SEQ ID No: 62のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 62のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 10）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-3a）SEQ ID No: 23のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 23のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 17）、CDR2（SEQ ID No: 18）、およびCDR3（SEQ ID No: 19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-3b）SEQ ID No: 66のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 66のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 17）、CDR2（SEQ ID No: 18）、およびCDR3（SEQ ID No: 19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-4a）SEQ ID No: 31のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 31のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 25）、CDR2（SEQ ID No: 26）、およびCDR3（SEQ ID No: 27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VH-4b）SEQ ID No: 70のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 70のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 25）、CDR2（SEQ ID No: 26）、およびCDR3（SEQ ID No: 27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VH-5a）SEQ ID No: 36のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 36のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-5b）SEQ ID No: 51のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 51のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-5c）SEQ ID No: 59のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 59のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-6a）SEQ ID No: 55のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 55のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-6b）SEQ ID No: 51のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 51のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-6c）SEQ ID No: 59のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 59のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-7）SEQ ID No: 75のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 75のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 74）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-8）SEQ ID No: 77のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 77のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 76）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-9）SEQ ID No: 79のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 79のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:17）、CDR2（SEQ ID No: 78）、およびCDR3（SEQ ID No:19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-10）SEQ ID No: 81のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 81のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:17）、CDR2（SEQ ID No: 80）、およびCDR3（SEQ ID No:19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-11）SEQ ID No: 83のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 83のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:25）、CDR2（SEQ ID No: 82）、およびCDR3（SEQ ID No:27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-12）SEQ ID No: 85のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 85のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:25）、CDR2（SEQ ID No: 84）、およびCDR3（SEQ ID No:27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
からなる群から選択される、［1］～［5］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体。
［7］ 抗体の半分子または抗体誘導体の半分子の軽鎖可変領域VLドメインのアミノ酸配列が、
（VL-1a）SEQ ID No: 8のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 8のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-1b）SEQ ID No: 58のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 58のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-1c）SEQ ID No: 50のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 50のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2a）SEQ ID No: 16のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 16のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2b）SEQ ID No: 63のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 63のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2c）SEQ ID No: 64のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 64のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2d）SEQ ID No: 65のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 65のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3a）SEQ ID No: 24のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 24のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3b）SEQ ID No: 67のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 67のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3c）SEQ ID No: 68のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 68のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3d）SEQ ID No: 69のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 69のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-4a）SEQ ID No: 32のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 32のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-4b）SEQ ID No: 71のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 71のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-4c）SEQ ID No: 72のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 72のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-4d）SEQ ID No: 73のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 73のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-5a）SEQ ID No: 8のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 8のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-5b）SEQ ID No: 58のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 58のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-5c）SEQ ID No: 50のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 50のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-6a）SEQ ID No: 56のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 56のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID NO: 52）、CDR2（SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（SEQ ID NO: 54）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-6b）SEQ ID No: 60のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 60のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID NO: 52）、CDR2（SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（SEQ ID NO: 54）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-6c）SEQ ID No: 61のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 61のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID NO: 52）、CDR2（SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（SEQ ID NO: 54）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
からなる群から選択される、［1］～［6］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体。
［8］ 抗体誘導体が、一本鎖Fv抗体（scFv）を構成する半分子の可変領域：
（1）前記（VH-1a）、（VH-1b）または（VH-1c）の重鎖可変領域と前記（VL-1a）、（VL-1b）または（VL-1c）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合した結合したもの、
（2）前記（VH-2a）または（VH-2b）の重鎖可変領域と前記（VL-2a）、（VL-2b）、（VL-2c）または（VL-2d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（3）前記（VH-3a）または（VH-3b）の重鎖可変領域と前記（VL-3a）、（VL-3b）、（VL-3c）または（VL-3d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（4）前記（VH-4a）または（VH-4b）の重鎖可変領域と前記（VL-4a）、（VL-4b）、（VL-4c）または（VL-4d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、および
（5）前記（VH-5a）、（VH-5b）または（VH-5c）の重鎖可変領域と前記（VL-5a）、（VL-5b）または（VL-5c）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（6）前記（VH-6a）、（VH-6b）または（VH-6c）の重鎖可変領域と前記（VL-6a）、（VL-6b）または（VL-6c）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（7）前記（VH-7）の重鎖可変領域と前記（VL-2a）、（VL-2b）、（VL-2c）または（VL-2d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（8）前記（VH-8）の重鎖可変領域と前記（VL-2a）、（VL-2b）、（VL-2c）または（VL-2d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（9）前記（VH-9）の重鎖可変領域と前記（VL-3a）、（VL-3b）、（VL-3c）または（VL-3d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（10）前記（VH-10）の重鎖可変領域と前記（VL-3a）、（VL-3b）、（VL-3c）または（VL-3d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（11）前記（VH-11）の重鎖可変領域と前記（VL-4a）、（VL-4b）、（VL-4c）または（VL-4d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（12）前記（VH-12）の重鎖可変領域と前記（VL-4a）、（VL-4b）、（VL-4c）または（VL-4d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
から選択される、［1］～［4］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体。
［9］ 免疫活性の増強が、免疫抑制シグナル除去、T細胞の疲弊の解除、T細胞の増殖、T細胞のがん細胞に対する細胞傷害性の上昇、およびT細胞のサイトカイン分泌促進からなる群から選択されるT細胞の活性化である、［1］～［8］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体。
［10］ がん細胞に対する細胞傷害性を誘導するが、正常細胞に対する細胞傷害性を誘導しない、［1］～［9］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体。
［11］ がん細胞が、メラノーマ、乳がん、肺がん、大腸がん、胃がん、膵臓がん、肝臓がん、血液がんからなる群から選択される、［1］～［10］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体。
［12］ （1） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（SYYMS、SEQ ID No: 1）、CDR2（TISNSGGSIYYLDSVKD、SEQ ID No: 2）、およびCDR3（DPYYSNYVPMDY、SEQ ID No: 3）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQYVDTYVA、SEQ ID No: 4）、CDR2（SASTRHT、SEQ ID No: 5）、およびCDR3（AQYSSSPLT、SEQ ID No: 6）；
（2） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No: 9）、CDR2（YIYPNNGGTSYNQKFKG、SEQ ID No: 10）、およびCDR3（SGYGNYYTMDY、SEQ ID No: 11）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No: 12）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No: 13）、およびCDR3（QQHYSSPST、SEQ ID No:14）；
（3） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:17）、CDR2（YIYPNNGGTSYNQKFKG、SEQ ID No:18）、およびCDR3（GGYYSYYSYDY、SEQ ID No:19）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:20）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:21）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:22）；
（4） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:25）、CDR2（YIYPNNGGTSYNQKFKG、SEQ ID No:26）、およびCDR3（SGYKAYYAMDY、SEQ ID No:27）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:28）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:29）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:30）；
（5） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（SYYMS、SEQ ID No:33）、CDR2（TISNSGGSTYYPDSVKD、SEQ ID No:34）、およびCDR3（DPYYTNYVPMDY、SEQ ID No:35）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQYVDTYVA、SEQ ID No:4）、CDR2（SASTRHT、SEQ ID No:5）、およびCDR3（AQYSSSPLT、SEQ ID No: 6）；
（6） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（SYYMS、SEQ ID No: 33）、CDR2（TISNSGGSTYYPDSVKD、SEQ ID NO: 34）、およびCDR3（DPYYTNYVPMDY、SEQ ID NO: 35）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASENVGTYVS、SEQ ID NO: 52）、CDR2（GASNRYT、SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（GQSYSYPLT、SEQ ID NO: 54）；
（7） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No: 9）、CDR2（YIYPNNAGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 74）、およびCDR3（SGYGNYYTMDY、SEQ ID No: 11）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No: 12）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No: 13）、およびCDR3（QQHYSSPST、SEQ ID No:14）；
（8） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No: 9）、CDR2（YIYPNKGGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 76）、およびCDR3（SGYGNYYTMDY、SEQ ID No: 11）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No: 12）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No: 13）、およびCDR3（QQHYSSPST、SEQ ID No:14）；
（9） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:17）、CDR2（YIYPNNAGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 78）、およびCDR3（GGYYSYYSYDY、SEQ ID No:19）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:20）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:21）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:22）；
（10） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:17）、CDR2（YIYPNKGGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 80）、およびCDR3（GGYYSYYSYDY、SEQ ID No:19）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:20）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:21）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:22）；
（11） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:25）、CDR2（YIYPNNAGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 82）、およびCDR3（SGYKAYYAMDY、SEQ ID No:27）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:28）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:29）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:30）；
（12） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:25）、CDR2（YIYPNKGGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 84）、およびCDR3（SGYKAYYAMDY、SEQ ID No:27）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:28）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:29）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:30）；
からなる群から選択されるいずれかの重鎖・軽鎖の相補性決定領域を含む、Tim-3抗原に対して結合性を有し、がん細胞に対する免疫活性を増強する、ホモダイマー型の抗体または抗体誘導体。；
［13］： 抗体誘導体が、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖Fv抗体（scFv抗体）、Fab、Fab’、 F(ab’)2、Fcエフェクター機能改変抗体、IgG1LALA、IgG1_N297A、IgG4_S228Pから選択される抗体改変体またはその機能的断片から選択される、［12］に記載の抗体または抗体誘導体；
［14］： 抗体の半分子または抗体誘導体の半分子の重鎖可変領域VHドメインのアミノ酸配列が、
（VH-1a）SEQ ID No: 7のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 7のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 1）、CDR2（SEQ ID No: 2）、およびCDR3（SEQ ID No: 3）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-1b）SEQ ID No: 49のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 49のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 1）、CDR2（SEQ ID No: 2）、およびCDR3（SEQ ID No: 3）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-1c）SEQ ID No: 57のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 57のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 1）、CDR2（SEQ ID No: 2）、およびCDR3（SEQ ID No: 3）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-2a）SEQ ID No: 15のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 15のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 10）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-2b）SEQ ID No: 62のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 62のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 10）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-3a）SEQ ID No: 23のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 23のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 17）、CDR2（SEQ ID No: 18）、およびCDR3（SEQ ID No: 19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-3b）SEQ ID No: 66のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 66のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 17）、CDR2（SEQ ID No: 18）、およびCDR3（SEQ ID No: 19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-4a）SEQ ID No: 31のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 31のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 25）、CDR2（SEQ ID No: 26）、およびCDR3（SEQ ID No: 27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VH-4b）SEQ ID No: 70のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 70のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 25）、CDR2（SEQ ID No: 26）、およびCDR3（SEQ ID No: 27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VH-5a）SEQ ID No: 36のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 36のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-5b）SEQ ID No: 51のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 51のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-5c）SEQ ID No: 59のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 59のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-6a）SEQ ID No: 55のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 55のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-6b）SEQ ID No: 51のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 51のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-6c）SEQ ID No: 59のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 59のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-7）SEQ ID No: 75のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 75のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 74）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-8）SEQ ID No: 77のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 77のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 76）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-9）SEQ ID No: 79のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 79のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:17）、CDR2（SEQ ID No: 78）、およびCDR3（SEQ ID No:19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-10）SEQ ID No: 81のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 81のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:17）、CDR2（SEQ ID No: 80）、およびCDR3（SEQ ID No:19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-11）SEQ ID No: 83のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 83のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:25）、CDR2（SEQ ID No: 82）、およびCDR3（SEQ ID No:27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-12）SEQ ID No: 85のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 85のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:25）、CDR2（SEQ ID No: 84）、およびCDR3（SEQ ID No:27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
からなる群から選択される、［12］または［13］に記載の抗体または抗体誘導体；
［15］： 抗体の半分子または抗体誘導体の半分子の軽鎖可変領域VLドメインのアミノ酸配列が、
（VL-1a）SEQ ID No: 8のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 8のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-1b）SEQ ID No: 58のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 58のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-1c）SEQ ID No: 50のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 50のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2a）SEQ ID No: 16のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 16のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2b）SEQ ID No: 63のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 63のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2c）SEQ ID No: 64のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 64のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2d）SEQ ID No: 65のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 65のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3a）SEQ ID No: 24のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 24のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3b）SEQ ID No: 67のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 67のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3c）SEQ ID No: 68のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 68のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3d）SEQ ID No: 69のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 69のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-4a）SEQ ID No: 32のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 32のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-4b）SEQ ID No: 71のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 71のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-4c）SEQ ID No: 72のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 72のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-4d）SEQ ID No: 73のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 73のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-5a）SEQ ID No: 8のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 8のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-5b）SEQ ID No: 58のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 58のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-5c）SEQ ID No: 50のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 50のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-6a）SEQ ID No: 56のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 56のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID NO: 52）、CDR2（SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（SEQ ID NO: 54）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-6b）SEQ ID No: 60のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 60のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID NO: 52）、CDR2（SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（SEQ ID NO: 54）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-6c）SEQ ID No: 61のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 61のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID NO: 52）、CDR2（SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（SEQ ID NO: 54）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
からなる群から選択される、［12］～［14］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体；
［16］ 一本鎖Fv抗体（scFv）を構成する半分子の可変領域が、
（1）前記（VH-1a）、（VH-1b）または（VH-1c）の重鎖可変領域と前記（VL-1a）、（VL-1b）または（VL-1c）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合した結合したもの、
（2）前記（VH-2a）または（VH-2b）の重鎖可変領域と前記（VL-2a）、（VL-2b）、（VL-2c）または（VL-2d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（3）前記（VH-3a）または（VH-3b）の重鎖可変領域と前記（VL-3a）、（VL-3b）、（VL-3c）または（VL-3d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（4）前記（VH-4a）または（VH-4b）の重鎖可変領域と前記（VL-4a）、（VL-4b）、（VL-4c）または（VL-4d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、および
（5）前記（VH-5a）、（VH-5b）または（VH-5c）の重鎖可変領域と前記（VL-5a）、（VL-5b）または（VL-5c）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（6）前記（VH-6a）、（VH-6b）または（VH-6c）の重鎖可変領域と前記（VL-6a）、（VL-6b）または（VL-6c）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（7）前記（VH-7）の重鎖可変領域と前記（VL-2a）、（VL-2b）、（VL-2c）または（VL-2d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（8）前記（VH-8）の重鎖可変領域と前記（VL-2a）、（VL-2b）、（VL-2c）または（VL-2d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（9）前記（VH-9）の重鎖可変領域と前記（VL-3a）、（VL-3b）、（VL-3c）または（VL-3d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（10）前記（VH-10）の重鎖可変領域と前記（VL-3a）、（VL-3b）、（VL-3c）または（VL-3d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（11）前記（VH-11）の重鎖可変領域と前記（VL-4a）、（VL-4b）、（VL-4c）または（VL-4d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（12）前記（VH-12）の重鎖可変領域と前記（VL-4a）、（VL-4b）、（VL-4c）または（VL-4d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
から選択される、［12］または［13］に記載の抗体または抗体誘導体。
［17］： 免疫活性の増強が、免疫抑制シグナル除去、T細胞の疲弊の解除、T細胞の増殖、T細胞のがん細胞に対する細胞傷害性の上昇、およびT細胞のサイトカイン分泌促進からなる群から選択されるT細胞の活性化である、［12］～［16］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体；
［18］： がん細胞に対する細胞傷害性を誘導するが、正常細胞に対する細胞傷害性を誘導しない、［12］～［17］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体；
［19］： がん細胞が、メラノーマ、乳がん、肺がん、大腸がん、胃がん、膵臓がん、肝臓がん、血液がんからなる群から選択される、［12］～［18］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体；
［20］： ［1］～［19］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体を含む、がん治療のための医薬組成物；
［21］： がんが、メラノーマ、乳がん、肺がん、大腸がん、胃がん、膵臓がん、肝臓がん、血液がんからなる群から選択される、［20］に記載の医薬組成物；
［22］： 被験体から採取されたがん細胞を、in vitroにおいて［1］～［19］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体と接触させる工程、
培養条件下で、がん細胞の細胞生存率が低下するかどうかを測定する工程、若しくは免疫活性化物質の分泌が亢進するかどうかを測定する工程、
を含む、がん細胞に対する細胞傷害性の亢進を予測する方法；
［23］： 同一被験体の末梢血リンパ球の存在下で、がん細胞の細胞生存率が低下するかどうか、若しくは末梢血リンパ球由来の免疫細胞が活性化するかどうかを測定する、［22］に記載の方法；
［24］： 被験体から採取されたがん細胞に対するin vitroでの細胞傷害性から、［1］～［19］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体をその被験体に投与した場合のがん細胞に対する細胞傷害性の亢進を予測する、［22］または［23］に記載の方法；
［25］： in vitroでの免疫活性化物質の分泌の亢進から、［1］～［19］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体をその被験体に投与した場合のがん細胞に対する細胞傷害性の亢進を予測する、［22］または［23］に記載の方法；
［26］： ［1］～［19］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体の、被験体から採取されたがん細胞に対する細胞傷害性、免疫活性化物質の分泌、若しくは免疫細胞の活性化を、in vitroにおいて測定するための、前記抗体を含む測定キット。
［1］ Tim-3抗原に対して結合性を有し、がん細胞に対する免疫活性を増強する、2種の異なる半分子の組み合わせであるヘテロダイマー型の抗体または抗体誘導体。
［2］ 抗体の半分子または抗体誘導体の半分子の一方が、Tim-3抗原の第一の領域と結合し、抗体の半分子または抗体誘導体の半分子のもう一方が、Tim-3抗原の第二の領域と結合する、［1］に記載の抗体または抗体誘導体。
［3］ 抗体の半分子または抗体誘導体の半分子が、
（1） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（SYYMS、SEQ ID No: 1）、CDR2（TISNSGGSIYYLDSVKD、SEQ ID No: 2）、およびCDR3（DPYYSNYVPMDY、SEQ ID No: 3）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQYVDTYVA、SEQ ID No: 4）、CDR2（SASTRHT、SEQ ID No: 5）、およびCDR3（AQYSSSPLT、SEQ ID No: 6）；
（2） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No: 9）、CDR2（YIYPNNGGTSYNQKFKG、SEQ ID No: 10）、およびCDR3（SGYGNYYTMDY、SEQ ID No: 11）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No: 12）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No: 13）、およびCDR3（QQHYSSPST、SEQ ID No:14）；
（3） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:17）、CDR2（YIYPNNGGTSYNQKFKG、SEQ ID No:18）、およびCDR3（GGYYSYYSYDY、SEQ ID No:19）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:20）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:21）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:22）；
（4） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:25）、CDR2（YIYPNNGGTSYNQKFKG、SEQ ID No:26）、およびCDR3（SGYKAYYAMDY、SEQ ID No:27）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:28）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:29）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:30）；
（5） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（SYYMS、SEQ ID No:33）、CDR2（TISNSGGSTYYPDSVKD、SEQ ID No:34）、およびCDR3（DPYYTNYVPMDY、SEQ ID No:35）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQYVDTYVA、SEQ ID No:4）、CDR2（SASTRHT、SEQ ID No:5）、およびCDR3（AQYSSSPLT、SEQ ID No: 6）；
（6） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（SYYMS、SEQ ID No: 33）、CDR2（TISNSGGSTYYPDSVKD、SEQ ID NO: 34）、およびCDR3（DPYYTNYVPMDY、SEQ ID NO: 35）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASENVGTYVS、SEQ ID NO: 52）、CDR2（GASNRYT、SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（GQSYSYPLT、SEQ ID NO: 54）；
（7） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No: 9）、CDR2（YIYPNNAGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 74）、およびCDR3（SGYGNYYTMDY、SEQ ID No: 11）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No: 12）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No: 13）、およびCDR3（QQHYSSPST、SEQ ID No:14）；
（8） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No: 9）、CDR2（YIYPNKGGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 76）、およびCDR3（SGYGNYYTMDY、SEQ ID No: 11）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No: 12）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No: 13）、およびCDR3（QQHYSSPST、SEQ ID No:14）；
（9） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:17）、CDR2（YIYPNNAGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 78）、およびCDR3（GGYYSYYSYDY、SEQ ID No:19）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:20）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:21）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:22）；
（10） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:17）、CDR2（YIYPNKGGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 80）、およびCDR3（GGYYSYYSYDY、SEQ ID No:19）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:20）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:21）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:22）；
（11） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:25）、CDR2（YIYPNNAGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 82）、およびCDR3（SGYKAYYAMDY、SEQ ID No:27）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:28）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:29）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:30）；
（12） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:25）、CDR2（YIYPNKGGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 84）、およびCDR3（SGYKAYYAMDY、SEQ ID No:27）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:28）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:29）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:30）；
からなる群から選択されるいずれかの重鎖・軽鎖の相補性決定領域を含む抗体の半分子または抗体誘導体の半分子の異なる2種の組み合わせである、［1］または［2］に記載の抗体または抗体誘導体。
［4］ 抗体の半分子または抗体誘導体の半分子の一方が（1）、（5）または（6）の半分子であり、抗体の半分子または抗体誘導体の半分子のもう一方が（2）～（4）、（7）～（12）のいずれかの半分子である、［1］～［3］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体。
［5］ 抗体誘導体が、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖Fv抗体（scFv抗体）、Fab、Fab’、 F(ab’)2、Fcエフェクター機能改変抗体、IgG1LALA、IgG1_N297A、IgG4_S228Pから選択される抗体改変体またはその機能的断片から選択される、［1］～［4］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体。
［6］ 抗体の半分子または抗体誘導体の半分子の重鎖可変領域VHドメインのアミノ酸配列が、
（VH-1a）SEQ ID No: 7のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 7のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 1）、CDR2（SEQ ID No: 2）、およびCDR3（SEQ ID No: 3）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-1b）SEQ ID No: 49のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 49のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 1）、CDR2（SEQ ID No: 2）、およびCDR3（SEQ ID No: 3）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-1c）SEQ ID No: 57のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 57のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 1）、CDR2（SEQ ID No: 2）、およびCDR3（SEQ ID No: 3）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-2a）SEQ ID No: 15のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 15のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 10）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-2b）SEQ ID No: 62のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 62のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 10）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-3a）SEQ ID No: 23のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 23のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 17）、CDR2（SEQ ID No: 18）、およびCDR3（SEQ ID No: 19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-3b）SEQ ID No: 66のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 66のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 17）、CDR2（SEQ ID No: 18）、およびCDR3（SEQ ID No: 19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-4a）SEQ ID No: 31のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 31のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 25）、CDR2（SEQ ID No: 26）、およびCDR3（SEQ ID No: 27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VH-4b）SEQ ID No: 70のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 70のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 25）、CDR2（SEQ ID No: 26）、およびCDR3（SEQ ID No: 27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VH-5a）SEQ ID No: 36のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 36のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-5b）SEQ ID No: 51のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 51のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-5c）SEQ ID No: 59のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 59のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-6a）SEQ ID No: 55のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 55のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-6b）SEQ ID No: 51のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 51のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-6c）SEQ ID No: 59のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 59のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-7）SEQ ID No: 75のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 75のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 74）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-8）SEQ ID No: 77のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 77のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 76）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-9）SEQ ID No: 79のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 79のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:17）、CDR2（SEQ ID No: 78）、およびCDR3（SEQ ID No:19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-10）SEQ ID No: 81のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 81のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:17）、CDR2（SEQ ID No: 80）、およびCDR3（SEQ ID No:19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-11）SEQ ID No: 83のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 83のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:25）、CDR2（SEQ ID No: 82）、およびCDR3（SEQ ID No:27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-12）SEQ ID No: 85のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 85のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:25）、CDR2（SEQ ID No: 84）、およびCDR3（SEQ ID No:27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
からなる群から選択される、［1］～［5］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体。
［7］ 抗体の半分子または抗体誘導体の半分子の軽鎖可変領域VLドメインのアミノ酸配列が、
（VL-1a）SEQ ID No: 8のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 8のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-1b）SEQ ID No: 58のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 58のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-1c）SEQ ID No: 50のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 50のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2a）SEQ ID No: 16のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 16のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2b）SEQ ID No: 63のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 63のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2c）SEQ ID No: 64のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 64のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2d）SEQ ID No: 65のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 65のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3a）SEQ ID No: 24のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 24のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3b）SEQ ID No: 67のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 67のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3c）SEQ ID No: 68のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 68のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3d）SEQ ID No: 69のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 69のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-4a）SEQ ID No: 32のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 32のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-4b）SEQ ID No: 71のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 71のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-4c）SEQ ID No: 72のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 72のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-4d）SEQ ID No: 73のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 73のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-5a）SEQ ID No: 8のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 8のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-5b）SEQ ID No: 58のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 58のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-5c）SEQ ID No: 50のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 50のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-6a）SEQ ID No: 56のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 56のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID NO: 52）、CDR2（SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（SEQ ID NO: 54）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-6b）SEQ ID No: 60のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 60のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID NO: 52）、CDR2（SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（SEQ ID NO: 54）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-6c）SEQ ID No: 61のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 61のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID NO: 52）、CDR2（SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（SEQ ID NO: 54）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
からなる群から選択される、［1］～［6］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体。
［8］ 抗体誘導体が、一本鎖Fv抗体（scFv）を構成する半分子の可変領域：
（1）前記（VH-1a）、（VH-1b）または（VH-1c）の重鎖可変領域と前記（VL-1a）、（VL-1b）または（VL-1c）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合した結合したもの、
（2）前記（VH-2a）または（VH-2b）の重鎖可変領域と前記（VL-2a）、（VL-2b）、（VL-2c）または（VL-2d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（3）前記（VH-3a）または（VH-3b）の重鎖可変領域と前記（VL-3a）、（VL-3b）、（VL-3c）または（VL-3d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（4）前記（VH-4a）または（VH-4b）の重鎖可変領域と前記（VL-4a）、（VL-4b）、（VL-4c）または（VL-4d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、および
（5）前記（VH-5a）、（VH-5b）または（VH-5c）の重鎖可変領域と前記（VL-5a）、（VL-5b）または（VL-5c）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（6）前記（VH-6a）、（VH-6b）または（VH-6c）の重鎖可変領域と前記（VL-6a）、（VL-6b）または（VL-6c）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（7）前記（VH-7）の重鎖可変領域と前記（VL-2a）、（VL-2b）、（VL-2c）または（VL-2d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（8）前記（VH-8）の重鎖可変領域と前記（VL-2a）、（VL-2b）、（VL-2c）または（VL-2d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（9）前記（VH-9）の重鎖可変領域と前記（VL-3a）、（VL-3b）、（VL-3c）または（VL-3d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（10）前記（VH-10）の重鎖可変領域と前記（VL-3a）、（VL-3b）、（VL-3c）または（VL-3d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（11）前記（VH-11）の重鎖可変領域と前記（VL-4a）、（VL-4b）、（VL-4c）または（VL-4d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（12）前記（VH-12）の重鎖可変領域と前記（VL-4a）、（VL-4b）、（VL-4c）または（VL-4d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
から選択される、［1］～［4］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体。
［9］ 免疫活性の増強が、免疫抑制シグナル除去、T細胞の疲弊の解除、T細胞の増殖、T細胞のがん細胞に対する細胞傷害性の上昇、およびT細胞のサイトカイン分泌促進からなる群から選択されるT細胞の活性化である、［1］～［8］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体。
［10］ がん細胞に対する細胞傷害性を誘導するが、正常細胞に対する細胞傷害性を誘導しない、［1］～［9］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体。
［11］ がん細胞が、メラノーマ、乳がん、肺がん、大腸がん、胃がん、膵臓がん、肝臓がん、血液がんからなる群から選択される、［1］～［10］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体。
［12］ （1） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（SYYMS、SEQ ID No: 1）、CDR2（TISNSGGSIYYLDSVKD、SEQ ID No: 2）、およびCDR3（DPYYSNYVPMDY、SEQ ID No: 3）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQYVDTYVA、SEQ ID No: 4）、CDR2（SASTRHT、SEQ ID No: 5）、およびCDR3（AQYSSSPLT、SEQ ID No: 6）；
（2） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No: 9）、CDR2（YIYPNNGGTSYNQKFKG、SEQ ID No: 10）、およびCDR3（SGYGNYYTMDY、SEQ ID No: 11）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No: 12）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No: 13）、およびCDR3（QQHYSSPST、SEQ ID No:14）；
（3） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:17）、CDR2（YIYPNNGGTSYNQKFKG、SEQ ID No:18）、およびCDR3（GGYYSYYSYDY、SEQ ID No:19）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:20）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:21）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:22）；
（4） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:25）、CDR2（YIYPNNGGTSYNQKFKG、SEQ ID No:26）、およびCDR3（SGYKAYYAMDY、SEQ ID No:27）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:28）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:29）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:30）；
（5） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（SYYMS、SEQ ID No:33）、CDR2（TISNSGGSTYYPDSVKD、SEQ ID No:34）、およびCDR3（DPYYTNYVPMDY、SEQ ID No:35）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQYVDTYVA、SEQ ID No:4）、CDR2（SASTRHT、SEQ ID No:5）、およびCDR3（AQYSSSPLT、SEQ ID No: 6）；
（6） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（SYYMS、SEQ ID No: 33）、CDR2（TISNSGGSTYYPDSVKD、SEQ ID NO: 34）、およびCDR3（DPYYTNYVPMDY、SEQ ID NO: 35）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASENVGTYVS、SEQ ID NO: 52）、CDR2（GASNRYT、SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（GQSYSYPLT、SEQ ID NO: 54）；
（7） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No: 9）、CDR2（YIYPNNAGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 74）、およびCDR3（SGYGNYYTMDY、SEQ ID No: 11）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No: 12）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No: 13）、およびCDR3（QQHYSSPST、SEQ ID No:14）；
（8） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No: 9）、CDR2（YIYPNKGGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 76）、およびCDR3（SGYGNYYTMDY、SEQ ID No: 11）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No: 12）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No: 13）、およびCDR3（QQHYSSPST、SEQ ID No:14）；
（9） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:17）、CDR2（YIYPNNAGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 78）、およびCDR3（GGYYSYYSYDY、SEQ ID No:19）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:20）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:21）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:22）；
（10） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:17）、CDR2（YIYPNKGGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 80）、およびCDR3（GGYYSYYSYDY、SEQ ID No:19）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:20）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:21）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:22）；
（11） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:25）、CDR2（YIYPNNAGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 82）、およびCDR3（SGYKAYYAMDY、SEQ ID No:27）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:28）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:29）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:30）；
（12） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:25）、CDR2（YIYPNKGGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 84）、およびCDR3（SGYKAYYAMDY、SEQ ID No:27）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:28）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:29）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:30）；
からなる群から選択されるいずれかの重鎖・軽鎖の相補性決定領域を含む、Tim-3抗原に対して結合性を有し、がん細胞に対する免疫活性を増強する、ホモダイマー型の抗体または抗体誘導体。；
［13］： 抗体誘導体が、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖Fv抗体（scFv抗体）、Fab、Fab’、 F(ab’)2、Fcエフェクター機能改変抗体、IgG1LALA、IgG1_N297A、IgG4_S228Pから選択される抗体改変体またはその機能的断片から選択される、［12］に記載の抗体または抗体誘導体；
［14］： 抗体の半分子または抗体誘導体の半分子の重鎖可変領域VHドメインのアミノ酸配列が、
（VH-1a）SEQ ID No: 7のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 7のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 1）、CDR2（SEQ ID No: 2）、およびCDR3（SEQ ID No: 3）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-1b）SEQ ID No: 49のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 49のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 1）、CDR2（SEQ ID No: 2）、およびCDR3（SEQ ID No: 3）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-1c）SEQ ID No: 57のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 57のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 1）、CDR2（SEQ ID No: 2）、およびCDR3（SEQ ID No: 3）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-2a）SEQ ID No: 15のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 15のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 10）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-2b）SEQ ID No: 62のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 62のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 10）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-3a）SEQ ID No: 23のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 23のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 17）、CDR2（SEQ ID No: 18）、およびCDR3（SEQ ID No: 19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-3b）SEQ ID No: 66のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 66のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 17）、CDR2（SEQ ID No: 18）、およびCDR3（SEQ ID No: 19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-4a）SEQ ID No: 31のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 31のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 25）、CDR2（SEQ ID No: 26）、およびCDR3（SEQ ID No: 27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VH-4b）SEQ ID No: 70のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 70のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 25）、CDR2（SEQ ID No: 26）、およびCDR3（SEQ ID No: 27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VH-5a）SEQ ID No: 36のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 36のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-5b）SEQ ID No: 51のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 51のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-5c）SEQ ID No: 59のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 59のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-6a）SEQ ID No: 55のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 55のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-6b）SEQ ID No: 51のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 51のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-6c）SEQ ID No: 59のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 59のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-7）SEQ ID No: 75のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 75のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 74）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-8）SEQ ID No: 77のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 77のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 76）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-9）SEQ ID No: 79のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 79のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:17）、CDR2（SEQ ID No: 78）、およびCDR3（SEQ ID No:19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-10）SEQ ID No: 81のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 81のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:17）、CDR2（SEQ ID No: 80）、およびCDR3（SEQ ID No:19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-11）SEQ ID No: 83のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 83のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:25）、CDR2（SEQ ID No: 82）、およびCDR3（SEQ ID No:27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-12）SEQ ID No: 85のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 85のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:25）、CDR2（SEQ ID No: 84）、およびCDR3（SEQ ID No:27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
からなる群から選択される、［12］または［13］に記載の抗体または抗体誘導体；
［15］： 抗体の半分子または抗体誘導体の半分子の軽鎖可変領域VLドメインのアミノ酸配列が、
（VL-1a）SEQ ID No: 8のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 8のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-1b）SEQ ID No: 58のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 58のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-1c）SEQ ID No: 50のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 50のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2a）SEQ ID No: 16のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 16のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2b）SEQ ID No: 63のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 63のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2c）SEQ ID No: 64のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 64のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2d）SEQ ID No: 65のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 65のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3a）SEQ ID No: 24のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 24のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3b）SEQ ID No: 67のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 67のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3c）SEQ ID No: 68のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 68のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3d）SEQ ID No: 69のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 69のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-4a）SEQ ID No: 32のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 32のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-4b）SEQ ID No: 71のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 71のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-4c）SEQ ID No: 72のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 72のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-4d）SEQ ID No: 73のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 73のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-5a）SEQ ID No: 8のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 8のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-5b）SEQ ID No: 58のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 58のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-5c）SEQ ID No: 50のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 50のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-6a）SEQ ID No: 56のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 56のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID NO: 52）、CDR2（SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（SEQ ID NO: 54）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-6b）SEQ ID No: 60のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 60のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID NO: 52）、CDR2（SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（SEQ ID NO: 54）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-6c）SEQ ID No: 61のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 61のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID NO: 52）、CDR2（SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（SEQ ID NO: 54）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
からなる群から選択される、［12］～［14］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体；
［16］ 一本鎖Fv抗体（scFv）を構成する半分子の可変領域が、
（1）前記（VH-1a）、（VH-1b）または（VH-1c）の重鎖可変領域と前記（VL-1a）、（VL-1b）または（VL-1c）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合した結合したもの、
（2）前記（VH-2a）または（VH-2b）の重鎖可変領域と前記（VL-2a）、（VL-2b）、（VL-2c）または（VL-2d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（3）前記（VH-3a）または（VH-3b）の重鎖可変領域と前記（VL-3a）、（VL-3b）、（VL-3c）または（VL-3d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（4）前記（VH-4a）または（VH-4b）の重鎖可変領域と前記（VL-4a）、（VL-4b）、（VL-4c）または（VL-4d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、および
（5）前記（VH-5a）、（VH-5b）または（VH-5c）の重鎖可変領域と前記（VL-5a）、（VL-5b）または（VL-5c）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（6）前記（VH-6a）、（VH-6b）または（VH-6c）の重鎖可変領域と前記（VL-6a）、（VL-6b）または（VL-6c）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（7）前記（VH-7）の重鎖可変領域と前記（VL-2a）、（VL-2b）、（VL-2c）または（VL-2d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（8）前記（VH-8）の重鎖可変領域と前記（VL-2a）、（VL-2b）、（VL-2c）または（VL-2d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（9）前記（VH-9）の重鎖可変領域と前記（VL-3a）、（VL-3b）、（VL-3c）または（VL-3d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（10）前記（VH-10）の重鎖可変領域と前記（VL-3a）、（VL-3b）、（VL-3c）または（VL-3d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（11）前記（VH-11）の重鎖可変領域と前記（VL-4a）、（VL-4b）、（VL-4c）または（VL-4d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（12）前記（VH-12）の重鎖可変領域と前記（VL-4a）、（VL-4b）、（VL-4c）または（VL-4d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
から選択される、［12］または［13］に記載の抗体または抗体誘導体。
［17］： 免疫活性の増強が、免疫抑制シグナル除去、T細胞の疲弊の解除、T細胞の増殖、T細胞のがん細胞に対する細胞傷害性の上昇、およびT細胞のサイトカイン分泌促進からなる群から選択されるT細胞の活性化である、［12］～［16］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体；
［18］： がん細胞に対する細胞傷害性を誘導するが、正常細胞に対する細胞傷害性を誘導しない、［12］～［17］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体；
［19］： がん細胞が、メラノーマ、乳がん、肺がん、大腸がん、胃がん、膵臓がん、肝臓がん、血液がんからなる群から選択される、［12］～［18］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体；
［20］： ［1］～［19］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体を含む、がん治療のための医薬組成物；
［21］： がんが、メラノーマ、乳がん、肺がん、大腸がん、胃がん、膵臓がん、肝臓がん、血液がんからなる群から選択される、［20］に記載の医薬組成物；
［22］： 被験体から採取されたがん細胞を、in vitroにおいて［1］～［19］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体と接触させる工程、
培養条件下で、がん細胞の細胞生存率が低下するかどうかを測定する工程、若しくは免疫活性化物質の分泌が亢進するかどうかを測定する工程、
を含む、がん細胞に対する細胞傷害性の亢進を予測する方法；
［23］： 同一被験体の末梢血リンパ球の存在下で、がん細胞の細胞生存率が低下するかどうか、若しくは末梢血リンパ球由来の免疫細胞が活性化するかどうかを測定する、［22］に記載の方法；
［24］： 被験体から採取されたがん細胞に対するin vitroでの細胞傷害性から、［1］～［19］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体をその被験体に投与した場合のがん細胞に対する細胞傷害性の亢進を予測する、［22］または［23］に記載の方法；
［25］： in vitroでの免疫活性化物質の分泌の亢進から、［1］～［19］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体をその被験体に投与した場合のがん細胞に対する細胞傷害性の亢進を予測する、［22］または［23］に記載の方法；
［26］： ［1］～［19］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体の、被験体から採取されたがん細胞に対する細胞傷害性、免疫活性化物質の分泌、若しくは免疫細胞の活性化を、in vitroにおいて測定するための、前記抗体を含む測定キット。
本発明により得られた抗体または抗体誘導体（抗体等）は、がん細胞あるいは免疫細胞に発現するTim-3抗原の機能を抑制し、種々の機序を介して、例えば免疫細胞（特にT細胞）の疲弊を解除することにより、免疫細胞を活性化し、腫瘍増殖抑制効果とがん治療効果を発揮する。
本発明は、がんの治療・診断薬として幅広く使用可能である。本発明による抗体は免疫細胞の疲弊を解除する効果を有することから、特に他の免疫治療との併用治療において有効となることが期待される。
本発明は、一態様において、がん細胞あるいは免疫細胞上のTim-3抗原に対して結合性を有し、がん細胞に対する免疫抑制シグナル除去活性を有する、Tim-3抗原に対する結合物質、特に抗体またはヒト型抗体誘導体（以下において、単に「抗体等」という）を提供することができる。この抗体等は、抗体半分子のホモダイマー型のものであっても、ヘテロダイマー型のものであってもよい。本発明の結合物質、特に抗体等は、がん細胞に対する免疫抑制シグナルを除去して、がん細胞に対する免疫活性を高め、結果的にがん細胞に対する治療のため、がん細胞の増殖を阻害するため、腫瘍を縮小・消失させるために使用することができるとともに、がん細胞に対する傷害性を有するT細胞が疲弊してしまっている場合にそのT細胞を活性化するためにも使用することができる。
ホモダイマー型の抗体および抗体誘導体（抗体等）の構造
本発明は、第一の態様において、Tim-3抗原に対して結合性を有する、ホモダイマー型の抗体等を提供する。このホモダイマー型の抗体等は、Tim-3抗原に対して結合して、がん細胞に対する傷害性を有するT細胞を活性化することを特徴としている。
本発明は、第一の態様において、Tim-3抗原に対して結合性を有する、ホモダイマー型の抗体等を提供する。このホモダイマー型の抗体等は、Tim-3抗原に対して結合して、がん細胞に対する傷害性を有するT細胞を活性化することを特徴としている。
本発明の第一の態様におけるホモダイマー型の抗体等は、Tim-3抗原に対して結合してTim-3抗原の機能を抑制し、がん細胞に対する免疫抑制シグナルを除去して、免疫細胞（特にT細胞）に発現するTim-3抗原の機能を抑制し、免疫細胞を活性化し、腫瘍増殖抑制効果とがん治療効果を発揮する態様によるものであってもよい。
本発明において単に「抗体」という場合、その抗体は哺乳動物のどのような動物種由来のものであってもよく、その抗体の由来種はヒトに限定されず、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ラクダ科動物（ラクダ、アルパカ）由来VHH抗体（variable domain of heavy chain of heavy chain antibody）、ダチョウ抗体などであってもよい。例えば、ヒトの抗体の場合、IgG、IgM、IgA、IgD、IgEなどの各種アイソタイプのもの、を包含する。
本発明の第一の態様においてはまた、Tim-3抗原に対して結合性を有し、がん細胞に対する免疫抑制シグナル除去活性を有するという機能的な特徴を有する限りにおいて、上述の抗体の「抗体誘導体」であってもよい。本発明において抗体誘導体という場合、一態様として、例えば、上記抗体の内、IgG、IgM、IgA、IgD、IgEなどのいずれかについての6箇所のCDRのアミノ酸配列（重鎖の相補性決定領域CDR1～CDR3および軽鎖のCDR1～CDR3）、及びヒト抗体由来の定常領域のアミノ酸配列を有し、それ以外のアミノ酸配列は、元の抗体由来のアミノ酸配列とヒト抗体由来のアミノ酸配列との組み合わせであることを特徴とした抗体の誘導体を提供することができる。このような抗体誘導体の例としては、上述した「抗体」の相補性決定領域（CDR）以外をヒトの抗体由来のアミノ酸配列に置き換えたヒト化抗体、または上記抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域に連結したものなどのキメラ抗体、重鎖と軽鎖をリンカーで結合させた一本鎖抗体（例えば、scFvなど）が含まれるが、これら以外のものも含まれる。
本発明のホモダイマー型の抗体等は、例示的には、Tim-3抗原に対して結合性を有する抗体と同一の重鎖のCDR1～3および軽鎖のCDR1～3の合計6箇所のアミノ酸配列を有することにより特徴づけられるものである。そのようなTim-3抗原に対して結合性を有する抗体等の半分子の特定の6箇所のCDRのアミノ配列の例としては、以下の（1）から（12）：
（1） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（SYYMS、SEQ ID No: 1）、CDR2（TISNSGGSIYYLDSVKD、SEQ ID No: 2）、およびCDR3（DPYYSNYVPMDY、SEQ ID No: 3）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQYVDTYVA、SEQ ID No: 4）、CDR2（SASTRHT、SEQ ID No: 5）、およびCDR3（AQYSSSPLT、SEQ ID No: 6）；
（2） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No: 9）、CDR2（YIYPNNGGTSYNQKFKG、SEQ ID No: 10）、およびCDR3（SGYGNYYTMDY、SEQ ID No: 11）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No: 12）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No: 13）、およびCDR3（QQHYSSPST、SEQ ID No:14）；
（3） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:17）、CDR2（YIYPNNGGTSYNQKFKG、SEQ ID No:18）、およびCDR3（GGYYSYYSYDY、SEQ ID No:19）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:20）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:21）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:22）；
（4） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:25）、CDR2（YIYPNNGGTSYNQKFKG、SEQ ID No:26）、およびCDR3（SGYKAYYAMDY、SEQ ID No:27）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:28）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:29）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:30）；
（5） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（SYYMS、SEQ ID No:33）、CDR2（TISNSGGSTYYPDSVKD、SEQ ID No:34）、およびCDR3（DPYYTNYVPMDY、SEQ ID No:35）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQYVDTYVA、SEQ ID No:4）、CDR2（SASTRHT、SEQ ID No:5）、およびCDR3（AQYSSSPLT、SEQ ID No: 6）；
（6） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（SYYMS、SEQ ID No: 33）、CDR2（TISNSGGSTYYPDSVKD、SEQ ID NO: 34）、およびCDR3（DPYYTNYVPMDY、SEQ ID NO: 35）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASENVGTYVS、SEQ ID NO: 52）、CDR2（GASNRYT、SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（GQSYSYPLT、SEQ ID NO: 54）；
（7） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No: 9）、CDR2（YIYPNNAGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 74）、およびCDR3（SGYGNYYTMDY、SEQ ID No: 11）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No: 12）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No: 13）、およびCDR3（QQHYSSPST、SEQ ID No:14）；
（8） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No: 9）、CDR2（YIYPNKGGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 76）、およびCDR3（SGYGNYYTMDY、SEQ ID No: 11）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No: 12）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No: 13）、およびCDR3（QQHYSSPST、SEQ ID No:14）；
（9） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:17）、CDR2（YIYPNNAGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 78）、およびCDR3（GGYYSYYSYDY、SEQ ID No:19）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:20）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:21）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:22）；
（10） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:17）、CDR2（YIYPNKGGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 80）、およびCDR3（GGYYSYYSYDY、SEQ ID No:19）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:20）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:21）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:22）；
（11） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:25）、CDR2（YIYPNNAGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 82）、およびCDR3（SGYKAYYAMDY、SEQ ID No:27）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:28）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:29）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:30）；
（12） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:25）、CDR2（YIYPNKGGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 84）、およびCDR3（SGYKAYYAMDY、SEQ ID No:27）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:28）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:29）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:30）；
からなる群から選択されるいずれかの重鎖・軽鎖の相補性決定領域を含むものが考えられるが、Tim-3抗原に対して結合性を有するという特徴を有する限りにおいて、上記のCDRの組み合わせ以外のCDRの組み合わせで特定される抗体等もまた含まれる。
（1） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（SYYMS、SEQ ID No: 1）、CDR2（TISNSGGSIYYLDSVKD、SEQ ID No: 2）、およびCDR3（DPYYSNYVPMDY、SEQ ID No: 3）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQYVDTYVA、SEQ ID No: 4）、CDR2（SASTRHT、SEQ ID No: 5）、およびCDR3（AQYSSSPLT、SEQ ID No: 6）；
（2） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No: 9）、CDR2（YIYPNNGGTSYNQKFKG、SEQ ID No: 10）、およびCDR3（SGYGNYYTMDY、SEQ ID No: 11）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No: 12）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No: 13）、およびCDR3（QQHYSSPST、SEQ ID No:14）；
（3） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:17）、CDR2（YIYPNNGGTSYNQKFKG、SEQ ID No:18）、およびCDR3（GGYYSYYSYDY、SEQ ID No:19）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:20）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:21）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:22）；
（4） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:25）、CDR2（YIYPNNGGTSYNQKFKG、SEQ ID No:26）、およびCDR3（SGYKAYYAMDY、SEQ ID No:27）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:28）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:29）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:30）；
（5） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（SYYMS、SEQ ID No:33）、CDR2（TISNSGGSTYYPDSVKD、SEQ ID No:34）、およびCDR3（DPYYTNYVPMDY、SEQ ID No:35）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQYVDTYVA、SEQ ID No:4）、CDR2（SASTRHT、SEQ ID No:5）、およびCDR3（AQYSSSPLT、SEQ ID No: 6）；
（6） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（SYYMS、SEQ ID No: 33）、CDR2（TISNSGGSTYYPDSVKD、SEQ ID NO: 34）、およびCDR3（DPYYTNYVPMDY、SEQ ID NO: 35）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASENVGTYVS、SEQ ID NO: 52）、CDR2（GASNRYT、SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（GQSYSYPLT、SEQ ID NO: 54）；
（7） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No: 9）、CDR2（YIYPNNAGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 74）、およびCDR3（SGYGNYYTMDY、SEQ ID No: 11）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No: 12）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No: 13）、およびCDR3（QQHYSSPST、SEQ ID No:14）；
（8） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No: 9）、CDR2（YIYPNKGGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 76）、およびCDR3（SGYGNYYTMDY、SEQ ID No: 11）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No: 12）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No: 13）、およびCDR3（QQHYSSPST、SEQ ID No:14）；
（9） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:17）、CDR2（YIYPNNAGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 78）、およびCDR3（GGYYSYYSYDY、SEQ ID No:19）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:20）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:21）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:22）；
（10） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:17）、CDR2（YIYPNKGGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 80）、およびCDR3（GGYYSYYSYDY、SEQ ID No:19）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:20）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:21）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:22）；
（11） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:25）、CDR2（YIYPNNAGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 82）、およびCDR3（SGYKAYYAMDY、SEQ ID No:27）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:28）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:29）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:30）；
（12） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:25）、CDR2（YIYPNKGGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 84）、およびCDR3（SGYKAYYAMDY、SEQ ID No:27）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:28）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:29）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:30）；
からなる群から選択されるいずれかの重鎖・軽鎖の相補性決定領域を含むものが考えられるが、Tim-3抗原に対して結合性を有するという特徴を有する限りにおいて、上記のCDRの組み合わせ以外のCDRの組み合わせで特定される抗体等もまた含まれる。
第一の態様の具体的な抗体等
本発明のこの態様において、抗体等は、例えば、以下の（VH-1）～（VH-12）（およびそれぞれの番号の枝番）の重鎖可変領域VHドメインのアミノ酸配列：
（VH-1a）SEQ ID No: 7のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 7のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 1）、CDR2（SEQ ID No: 2）、およびCDR3（SEQ ID No: 3）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-1b）SEQ ID No: 49のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 49のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 1）、CDR2（SEQ ID No: 2）、およびCDR3（SEQ ID No: 3）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-1c）SEQ ID No: 57のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 57のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 1）、CDR2（SEQ ID No: 2）、およびCDR3（SEQ ID No: 3）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-2a）SEQ ID No: 15のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 15のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 10）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-2b）SEQ ID No: 62のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 62のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 10）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-3a）SEQ ID No: 23のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 23のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 17）、CDR2（SEQ ID No: 18）、およびCDR3（SEQ ID No: 19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-3b）SEQ ID No: 66のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 66のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 17）、CDR2（SEQ ID No: 18）、およびCDR3（SEQ ID No: 19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-4a）SEQ ID No: 31のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 31のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 25）、CDR2（SEQ ID No: 26）、およびCDR3（SEQ ID No: 27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VH-4b）SEQ ID No: 70のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 70のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 25）、CDR2（SEQ ID No: 26）、およびCDR3（SEQ ID No: 27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VH-5a）SEQ ID No: 36のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 36のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-5b）SEQ ID No: 51のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 51のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-5c）SEQ ID No: 59のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 59のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-6a）SEQ ID No: 55のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 55のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-6b）SEQ ID No: 51のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 51のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-6c）SEQ ID No: 59のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 59のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-7）SEQ ID No: 75のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 75のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 74）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-8）SEQ ID No: 77のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 77のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 76）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-9）SEQ ID No: 79のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 79のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:17）、CDR2（SEQ ID No: 78）、およびCDR3（SEQ ID No:19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-10）SEQ ID No: 81のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 81のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:17）、CDR2（SEQ ID No: 80）、およびCDR3（SEQ ID No:19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-11）SEQ ID No: 83のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 83のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:25）、CDR2（SEQ ID No: 82）、およびCDR3（SEQ ID No:27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-12）SEQ ID No: 85のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 85のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:25）、CDR2（SEQ ID No: 84）、およびCDR3（SEQ ID No:27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
からなる群から選択するものを有するものとして特定することができる。ここで、（VH-1）から（VH-12）の番号は、前述した重鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの（1）～（12）の番号と対応したものである。例えば、（VH-1）SEQ ID NO: 7のアミノ酸配列は、（1）SEQ ID NO: 1～SEQ ID NO: 3で特定される重鎖CDR1～CDR3のアミノ酸配列を包含する配列を意味する。また、それぞれの重鎖可変領域VHドメインについての枝番（例えば、（VH-1a）や（VH-1b））は、同一の配列のCDRの組み合わせを有するが、フレームワークの配列が種々の配列から構成される重鎖可変領域のバリエーションと対応したものであることを意味する。
本発明のこの態様において、抗体等は、例えば、以下の（VH-1）～（VH-12）（およびそれぞれの番号の枝番）の重鎖可変領域VHドメインのアミノ酸配列：
（VH-1a）SEQ ID No: 7のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 7のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 1）、CDR2（SEQ ID No: 2）、およびCDR3（SEQ ID No: 3）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-1b）SEQ ID No: 49のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 49のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 1）、CDR2（SEQ ID No: 2）、およびCDR3（SEQ ID No: 3）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-1c）SEQ ID No: 57のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 57のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 1）、CDR2（SEQ ID No: 2）、およびCDR3（SEQ ID No: 3）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-2a）SEQ ID No: 15のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 15のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 10）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-2b）SEQ ID No: 62のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 62のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 10）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-3a）SEQ ID No: 23のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 23のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 17）、CDR2（SEQ ID No: 18）、およびCDR3（SEQ ID No: 19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-3b）SEQ ID No: 66のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 66のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 17）、CDR2（SEQ ID No: 18）、およびCDR3（SEQ ID No: 19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-4a）SEQ ID No: 31のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 31のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 25）、CDR2（SEQ ID No: 26）、およびCDR3（SEQ ID No: 27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VH-4b）SEQ ID No: 70のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 70のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 25）、CDR2（SEQ ID No: 26）、およびCDR3（SEQ ID No: 27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VH-5a）SEQ ID No: 36のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 36のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-5b）SEQ ID No: 51のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 51のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-5c）SEQ ID No: 59のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 59のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-6a）SEQ ID No: 55のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 55のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-6b）SEQ ID No: 51のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 51のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-6c）SEQ ID No: 59のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 59のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-7）SEQ ID No: 75のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 75のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 74）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-8）SEQ ID No: 77のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 77のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 76）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-9）SEQ ID No: 79のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 79のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:17）、CDR2（SEQ ID No: 78）、およびCDR3（SEQ ID No:19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-10）SEQ ID No: 81のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 81のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:17）、CDR2（SEQ ID No: 80）、およびCDR3（SEQ ID No:19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-11）SEQ ID No: 83のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 83のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:25）、CDR2（SEQ ID No: 82）、およびCDR3（SEQ ID No:27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-12）SEQ ID No: 85のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 85のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:25）、CDR2（SEQ ID No: 84）、およびCDR3（SEQ ID No:27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
からなる群から選択するものを有するものとして特定することができる。ここで、（VH-1）から（VH-12）の番号は、前述した重鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの（1）～（12）の番号と対応したものである。例えば、（VH-1）SEQ ID NO: 7のアミノ酸配列は、（1）SEQ ID NO: 1～SEQ ID NO: 3で特定される重鎖CDR1～CDR3のアミノ酸配列を包含する配列を意味する。また、それぞれの重鎖可変領域VHドメインについての枝番（例えば、（VH-1a）や（VH-1b））は、同一の配列のCDRの組み合わせを有するが、フレームワークの配列が種々の配列から構成される重鎖可変領域のバリエーションと対応したものであることを意味する。
この場合において、重鎖可変領域フレームワークのアミノ酸配列は、既存の抗体のものを利用することができ、例えば、ヒトのいずれかの抗体の可変領域のアミノ酸配列や、そのようなアミノ酸配列に改変を加えたアミノ酸配列を利用することができる。具体的には、重鎖可変領域のアミノ酸配列のうち、それぞれのCDR1～CDR3が標的抗原との結合に必須であることが知られており、一方CDR1～CDR3以外の部分においては1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列であっても、Tim-3に対して結合性を有し、がん細胞に対する免疫活性を増強する作用を有する、抗体またはその抗体誘導体を構成することができる限りにおいて、本発明において使用することができる。
本発明のこの一態様において、本発明の抗体等は、以下の（VL-1）～（VL-6）（およびそれぞれの番号の枝番）の軽鎖可変領域VLドメインのアミノ酸配列：
（VL-1a）SEQ ID No: 8のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 8のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-1b）SEQ ID No: 58のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 58のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-1c）SEQ ID No: 50のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 50のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2a）SEQ ID No: 16のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 16のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2b）SEQ ID No: 63のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 63のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2c）SEQ ID No: 64のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 64のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2d）SEQ ID No: 65のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 65のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3a）SEQ ID No: 24のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 24のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3b）SEQ ID No: 67のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 67のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3c）SEQ ID No: 68のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 68のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3d）SEQ ID No: 69のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 69のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-4a）SEQ ID No: 32のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 32のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-4b）SEQ ID No: 71のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 71のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-4c）SEQ ID No: 72のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 72のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-4d）SEQ ID No: 73のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 73のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-5a）SEQ ID No: 8のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 8のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-5b）SEQ ID No: 58のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 58のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-5c）SEQ ID No: 50のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 50のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-6a）SEQ ID No: 56のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 56のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID NO: 52）、CDR2（SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（SEQ ID NO: 54）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-6b）SEQ ID No: 60のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 60のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID NO: 52）、CDR2（SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（SEQ ID NO: 54）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-6c）SEQ ID No: 61のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 61のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID NO: 52）、CDR2（SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（SEQ ID NO: 54）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
からなる群から選択するものを有するものとして特定することができる。ここで、（VL-1）から（VL-6）の番号は、前述した軽鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの（1）～（6）の番号と対応したものである。例えば、（VL-1）SEQ ID NO: 8のアミノ酸配列は、（1）SEQ ID NO: 4～SEQ ID NO: 6で特定される軽鎖CDR1～CDR3のアミノ酸配列を包含する配列を意味する。また、それぞれの軽鎖可変領域VLドメインについての枝番（例えば、（VL-1a）や（VL-1b））は、同一の配列のCDRの組み合わせを有するが、フレームワークの配列が種々の配列から構成される軽鎖可変領域のバリエーションと対応したものであることを意味する。
（VL-1a）SEQ ID No: 8のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 8のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-1b）SEQ ID No: 58のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 58のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-1c）SEQ ID No: 50のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 50のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2a）SEQ ID No: 16のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 16のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2b）SEQ ID No: 63のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 63のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2c）SEQ ID No: 64のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 64のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2d）SEQ ID No: 65のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 65のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3a）SEQ ID No: 24のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 24のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3b）SEQ ID No: 67のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 67のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3c）SEQ ID No: 68のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 68のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3d）SEQ ID No: 69のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 69のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-4a）SEQ ID No: 32のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 32のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-4b）SEQ ID No: 71のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 71のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-4c）SEQ ID No: 72のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 72のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-4d）SEQ ID No: 73のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 73のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-5a）SEQ ID No: 8のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 8のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-5b）SEQ ID No: 58のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 58のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-5c）SEQ ID No: 50のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 50のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-6a）SEQ ID No: 56のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 56のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID NO: 52）、CDR2（SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（SEQ ID NO: 54）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-6b）SEQ ID No: 60のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 60のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID NO: 52）、CDR2（SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（SEQ ID NO: 54）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-6c）SEQ ID No: 61のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 61のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID NO: 52）、CDR2（SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（SEQ ID NO: 54）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
からなる群から選択するものを有するものとして特定することができる。ここで、（VL-1）から（VL-6）の番号は、前述した軽鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの（1）～（6）の番号と対応したものである。例えば、（VL-1）SEQ ID NO: 8のアミノ酸配列は、（1）SEQ ID NO: 4～SEQ ID NO: 6で特定される軽鎖CDR1～CDR3のアミノ酸配列を包含する配列を意味する。また、それぞれの軽鎖可変領域VLドメインについての枝番（例えば、（VL-1a）や（VL-1b））は、同一の配列のCDRの組み合わせを有するが、フレームワークの配列が種々の配列から構成される軽鎖可変領域のバリエーションと対応したものであることを意味する。
なお、
・前述した（7）および（8）における軽鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの軽鎖可変領域は、前述した（2）における軽鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの軽鎖可変領域（すなわち、（VL-2）またはその枝番で規定される軽鎖可変領域）と同一であり、
・前述した（9）および（10）における軽鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの軽鎖可変領域は、前述した（3）における軽鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの軽鎖可変領域（すなわち、（VL-3）またはその枝番で規定される軽鎖可変領域）と同一であり、
・前述した（11）および（12）における軽鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの軽鎖可変領域は、前述した（4）における軽鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの軽鎖可変領域（すなわち、（VL-4）またはその枝番で規定される軽鎖可変領域）と同一である。
・前述した（7）および（8）における軽鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの軽鎖可変領域は、前述した（2）における軽鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの軽鎖可変領域（すなわち、（VL-2）またはその枝番で規定される軽鎖可変領域）と同一であり、
・前述した（9）および（10）における軽鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの軽鎖可変領域は、前述した（3）における軽鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの軽鎖可変領域（すなわち、（VL-3）またはその枝番で規定される軽鎖可変領域）と同一であり、
・前述した（11）および（12）における軽鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの軽鎖可変領域は、前述した（4）における軽鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの軽鎖可変領域（すなわち、（VL-4）またはその枝番で規定される軽鎖可変領域）と同一である。
この場合において、軽鎖可変領域フレームワークのアミノ酸配列は、既存の抗体のものを利用することができ、例えば、ヒトのいずれかの抗体の可変領域のアミノ酸配列や、そのようなアミノ酸配列に改変を加えたアミノ酸配列を利用することができる。具体的には、軽鎖可変領域のアミノ酸配列のうち、それぞれのCDR1～CDR3が標的抗原との結合に必須であることが知られており、一方CDR1～CDR3以外の部分においては1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列であっても、Tim-3に対して結合性を有し、がん細胞に対する免疫活性を増強する作用を有する、抗体等を構成することができる限りにおいて、本発明において使用することができる。
本発明においては、本発明の抗体誘導体には、上述した抗体等の機能的断片や改変抗体も含まれる。本発明における抗体等の機能的断片は、F（ab'）2、Fab'、Fab、一本鎖Fv（scFv）などが含まれ、改変抗体には、Fcエフェクター機能改変抗体、IgG1LALA、IgG1_N297A、IgG4_S228Pなどが含まれる。本発明において使用することができる機能性断片または改変抗体は、Tim-3抗原に結合して、Tim-3-Galectin-9の結合を阻害することができ、結果的にTim-3-Galectin-9経路に基づく免疫抑制シグナルを除去することができる、いわゆる免疫チェックポイント阻害剤として機能すること、あるいはその結果としてがん細胞に対する細胞傷害性を誘導することができること、を特徴としていれば、これらのうちのどのような断片または改変抗体であってもよく、例えば、一本鎖Fv（scFv）などを、そのような機能的断片として使用することができる。
例えば、本発明の抗体等として一本鎖Fv（scFv）抗体を使用する場合、本発明の抗体等の半分子は、以下の重鎖可変領域VHドメインのアミノ酸配列と以下の軽鎖可変領域VLドメインのアミノ酸配列とを連結して一本鎖として特定することができる：
（1）前記（VH-1a）、（VH-1b）または（VH-1c）の重鎖可変領域と前記（VL-1a）、（VL-1b）または（VL-1c）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合した結合したもの、
（2）前記（VH-2a）または（VH-2b）の重鎖可変領域と前記（VL-2a）、（VL-2b）、（VL-2c）または（VL-2d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（3）前記（VH-3a）または（VH-3b）の重鎖可変領域と前記（VL-3a）、（VL-3b）、（VL-3c）または（VL-3d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（4）前記（VH-4a）または（VH-4b）の重鎖可変領域と前記（VL-4a）、（VL-4b）、（VL-4c）または（VL-4d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、および
（5）前記（VH-5a）、（VH-5b）または（VH-5c）の重鎖可変領域と前記（VL-5a）、（VL-5b）または（VL-5c）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（6）前記（VH-6a）、（VH-6b）または（VH-6c）の重鎖可変領域と前記（VL-6a）、（VL-6b）または（VL-6c）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（7）前記（VH-7）の重鎖可変領域と前記（VL-2a）、（VL-2b）、（VL-2c）または（VL-2d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（8）前記（VH-8）の重鎖可変領域と前記（VL-2a）、（VL-2b）、（VL-2c）または（VL-2d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（9）前記（VH-9）の重鎖可変領域と前記（VL-3a）、（VL-3b）、（VL-3c）または（VL-3d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（10）前記（VH-10）の重鎖可変領域と前記（VL-3a）、（VL-3b）、（VL-3c）または（VL-3d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（11）前記（VH-11）の重鎖可変領域と前記（VL-4a）、（VL-4b）、（VL-4c）または（VL-4d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（12）前記（VH-12）の重鎖可変領域と前記（VL-4a）、（VL-4b）、（VL-4c）または（VL-4d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの。ここで、（1）から（12）の番号は、前述した重鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの番号と前述した軽鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの番号と対応したものである。例えば、（1）一本鎖Fv抗体のアミノ酸配列は、（1）SEQ ID NO: 1～SEQ ID NO: 3で特定される重鎖CDR1～CDR3のアミノ酸配列とSEQ ID NO: 4～SEQ ID NO: 6で特定される軽鎖CDR1～CDR3のアミノ酸配列とを包含する配列を意味する。
（1）前記（VH-1a）、（VH-1b）または（VH-1c）の重鎖可変領域と前記（VL-1a）、（VL-1b）または（VL-1c）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合した結合したもの、
（2）前記（VH-2a）または（VH-2b）の重鎖可変領域と前記（VL-2a）、（VL-2b）、（VL-2c）または（VL-2d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（3）前記（VH-3a）または（VH-3b）の重鎖可変領域と前記（VL-3a）、（VL-3b）、（VL-3c）または（VL-3d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（4）前記（VH-4a）または（VH-4b）の重鎖可変領域と前記（VL-4a）、（VL-4b）、（VL-4c）または（VL-4d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、および
（5）前記（VH-5a）、（VH-5b）または（VH-5c）の重鎖可変領域と前記（VL-5a）、（VL-5b）または（VL-5c）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（6）前記（VH-6a）、（VH-6b）または（VH-6c）の重鎖可変領域と前記（VL-6a）、（VL-6b）または（VL-6c）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（7）前記（VH-7）の重鎖可変領域と前記（VL-2a）、（VL-2b）、（VL-2c）または（VL-2d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（8）前記（VH-8）の重鎖可変領域と前記（VL-2a）、（VL-2b）、（VL-2c）または（VL-2d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（9）前記（VH-9）の重鎖可変領域と前記（VL-3a）、（VL-3b）、（VL-3c）または（VL-3d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（10）前記（VH-10）の重鎖可変領域と前記（VL-3a）、（VL-3b）、（VL-3c）または（VL-3d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（11）前記（VH-11）の重鎖可変領域と前記（VL-4a）、（VL-4b）、（VL-4c）または（VL-4d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（12）前記（VH-12）の重鎖可変領域と前記（VL-4a）、（VL-4b）、（VL-4c）または（VL-4d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの。ここで、（1）から（12）の番号は、前述した重鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの番号と前述した軽鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの番号と対応したものである。例えば、（1）一本鎖Fv抗体のアミノ酸配列は、（1）SEQ ID NO: 1～SEQ ID NO: 3で特定される重鎖CDR1～CDR3のアミノ酸配列とSEQ ID NO: 4～SEQ ID NO: 6で特定される軽鎖CDR1～CDR3のアミノ酸配列とを包含する配列を意味する。
scFvにおける重鎖可変領域と軽鎖可変領域の結合は、いずれがN末端側になるように結合させてもよく、N末端側からC末端側に、重鎖可変領域-リンカー-軽鎖可変領域の順番であっても、軽鎖可変領域-リンカー-重鎖可変領域の順番であってもよい。また、これらの重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間をつなぐリンカーは、当該技術分野において使用できることが知られているリンカーであればいずれであってもよく、例えば、後述する本願実施例においては、GGGGS×4（すなわち、GGGGSが4回連続するアミノ酸配列から構成されるリンカー）を使用することができる。
ここで例示したscFv抗体は、一本鎖のまま使用することもできるが、当該技術分野において一般的に使用されている抗体のFc領域をさらにリンカーを介して結合してscFv-Fcを形成することにより、二本鎖として作製することもできる。この場合、例えば、Fc領域は、scFvのC末端側にリンカー（例えば、GGGGからなるリンカー）を介して結合させた構造とすることができる。
ヘテロダイマー型の抗体および抗体誘導体（抗体等）の構造
本発明は、別の一態様において、Tim-3抗原に対して結合性を有する、2種の異なる半分子の組み合わせであるヘテロダイマー型の抗体または抗体誘導体を提供する。このヘテロダイマー型の抗体等は、がん細胞に対する免疫活性を亢進することを特徴としている。
本発明は、別の一態様において、Tim-3抗原に対して結合性を有する、2種の異なる半分子の組み合わせであるヘテロダイマー型の抗体または抗体誘導体を提供する。このヘテロダイマー型の抗体等は、がん細胞に対する免疫活性を亢進することを特徴としている。
本発明の第二の態様におけるヘテロダイマー型の抗体等は、Tim-3抗原に対して結合してTim-3抗原の機能を抑制し、がん細胞に対する免疫抑制シグナルを除去して、免疫細胞（特にT細胞）に発現するTim-3抗原の機能を抑制し、免疫細胞を活性化し、腫瘍増殖抑制効果とがん治療効果を発揮する態様によるものであってもよい。
本発明において単に「抗体」という場合、その抗体は哺乳動物のどのような動物種由来のものであってもよく、その抗体の由来種はヒトに限定されず、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ラクダ科動物（ラクダ、アルパカ）由来VHH抗体（variable domain of heavy chain of heavy chain antibody）、ダチョウ抗体などであってもよい。例えば、ヒトの抗体の場合、IgG、IgM、IgA、IgD、IgEなどの各種アイソタイプのもの、を包含する。
本発明の第二の態様においてはまた、Tim-3抗原に対して結合性を有し、がん細胞に対する免疫抑制シグナル除去活性を有するという機能的な特徴を有する限りにおいて、上述の抗体の「抗体誘導体」であってもよい。本発明において抗体誘導体という場合、一態様として、例えば、上記抗体の内、IgG、IgM、IgA、IgD、IgEなどのいずれかについての6箇所のCDRのアミノ酸配列（重鎖の相補性決定領域CDR1～CDR3および軽鎖のCDR1～CDR3）、及びヒト抗体由来の定常領域のアミノ酸配列を有し、それ以外のアミノ酸配列は、元の抗体由来のアミノ酸配列とヒト抗体由来のアミノ酸配列との組み合わせであることを特徴とした抗体の誘導体を提供することができる。このような抗体誘導体の例としては、上述した「抗体」の相補性決定領域（CDR）以外をヒトの抗体由来のアミノ酸配列に置き換えたヒト化抗体、または上記抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域に連結したものなどのキメラ抗体、重鎖と軽鎖をリンカーで結合させた一本鎖抗体（例えば、scFvなど）が含まれるが、これら以外のものも含まれる。
本発明における抗体等の「半分子」という場合、抗体等における重鎖間の結合を解離させた場合の一分子およびその断片を意味する。一例において、抗体等の半分子は、IgG、IgM、IgA、IgD、IgEなどの各種アイソタイプに由来する抗体の重鎖（H鎖）と軽鎖（L鎖）の組み合わせのことをいう。例えば、これらのうち、抗体等がIgGの抗体の場合の半分子としては、例えば、IgGのH鎖１鎖とIgGのL鎖１鎖からなる複合体が挙げられる。抗体等の半分子は、また、前述したキメラ抗体やヒト化抗体などの抗体誘導体に由来するものであってもよい。
さらに、抗体等の半分子には、上述したもの以外の抗体等の半分子のいずれが含まれていてもよく、例えば、ラクダ科等の抗体で見られるH鎖2本からなる抗体、いわゆる重鎖（H鎖）抗体（heavy-chain antibody）（VHH（VH originating from heavy-chain antibody）抗体とも呼ばれる。）のH鎖間の結合を解離させた、H鎖１鎖からなる分子（これらを「単一ドメイン抗体」と総称する）、一本鎖Fv分子（scFv分子）であって別のscFv分子と結合可能であるもの、一本鎖Fv分子に対してさらにFc領域を付加した分子（scFv-Fc分子）、scFv-Fc分子のFc部分にKnob-into-hole技術を適用するためのKnob構造を有する分子、scFv-Fc分子のFc部分にKnob-into-hole技術を適用するためのHole構造を有する分子、などが包含されていてもよい。
この態様において、ヘテロダイマー型の抗体等は、2種の異なる抗体等の半分子から構成されることを特徴としており、第一の抗体等の半分子が結合する第一のエピトープと、第二の抗体等の半分子が結合する第二エピトープは同一であっても異なっていてもよい。Tim-3抗原に対して結合性を有する抗体等は、その性質上、抗体等の半分子の一方または両方がTim-3と結合するものである。ここで半分子の一方がTim-3に結合し、半分子のもう一方がTim-3以外の物質に結合する場合の本態様の抗体等は、バイスペシフィック抗体型の抗体等となり、半分子の両方ともがTim-3の異なるエピトープ部分に結合する場合の本態様の抗体等はバイパラトピック抗体型の抗体等となる。本発明の第二の態様において、半分子の両方ともがTim-3の異なるエピトープ部分に結合する場合の抗体等（バイパラトピック抗体）であることが好ましい。
すなわち、本発明の抗体等のうちヘテロダイマー型の抗体等としては、Tim-3抗原に対して結合性を有する第一の抗体等の半分子と、Tim-3抗原以外の抗原に対して結合性を有する第二の抗体等の半分子との組み合わせから構成される抗体等（すなわち、バイスペシフィック抗体）であってもよい。この場合の抗体等の構造としては、上記第一の抗体等の半分子は、本明細書において開示する特定の配列を有する重鎖のCDR1～3および軽鎖のCDR1～3の合計6箇所のアミノ酸配列で特定される抗体等の半分子であることが好ましい。第一の抗体等の半分子によるTim-3抗原に対する結合と、第二の抗体等の半分子によるTim-3抗原以外の抗原に対する結合を同時に実現することができる抗体等を形成することができる。この態様において、第一の抗体等の半分子がTim-3抗原に対して結合する限りにおいて、第二の抗体等の半分子はどのような抗原に結合するものであってもよい。
本発明においては、Tim-3抗原に対して結合性を有する抗体等がバイパラトピック抗体である場合において、Tim-3抗原に対するより強力な結合を実現するためには、第一の抗体等の半分子および第二の抗体等の半分子がともにTim-3抗原の領域に対して結合する抗体等の半分子であることが好ましく、第一の抗体等の半分子が結合する第一の領域（エピトープ）と、第二の抗体等の半分子が結合する第二の領域（エピトープ）はTim-3タンパク質の同一の領域であっても異なる領域であってもよい。
Tim-3タンパク質に対して抗体等が結合する際の競合関係を解析した結果、Tim-3抗原のエピトープ部位と結合する抗体をGroup 1からGroup 5の5グループに分けることができる（図1）。これらの抗体を機能性で分類すると、PtdSerを阻害する群（Group 1に属する抗体およびGroup 2に属する抗体）と、PtdSerを阻害しないか部分阻害する群（Group 3に属する抗体、Group 4に属する抗体およびGroup 5に属する抗体）に分類される。また、これらの抗体をTim-3に対する結合性の競合の観点で分類すると、Group 1およびGroup 2に属する抗体は、Group 4およびGroup 5に属する抗体とは相互に競合しない関係にあり、一方、Group 1に属する抗体とGroup 2に属する抗体は競合し、Group 4に属する抗体とGroup 5に属する抗体は競合する関係にあり、一方、Group 3に属する抗体は、Group 1に属する抗体とは相互に競合しない関係にあるが、Group2、Group 4およびGroup 5に属する抗体とは相互に競合する関係にある。これらの解析結果に基づき、本発明におけるこの態様におけるバイパラトピック抗体1分子を、1分子のTim-3タンパク質上の2か所の部位に結合させたい場合には、第一の抗体等の半分子が結合する第一の領域（エピトープ）と、第二の抗体等の半分子が結合する第二の領域（エピトープ）は異なっていることが好ましく、抗体等の半分子の一方がGroup 1またはGroup 2に属する抗体等の半分子であり、抗体等の半分子のもう一方がGroup3、Group 4およびGroup 5に属する抗体等の半分子であることが好ましい。
本発明のこの態様における抗体等の構造としては、特定の重鎖のCDR1～3および軽鎖のCDR1～3の合計6箇所のアミノ酸配列を有するTim-3タンパク質に結合する上記第一の抗体等の半分子と、特定の重鎖のCDR1～3および軽鎖のCDR1～3の合計6箇所のアミノ酸配列を有するTim-3タンパク質に結合する上記第二の抗体等の半分子との組み合わせにより、第一の抗体等の半分子も第二の抗体等の半分子もTim-3抗原に結合する抗体等（すなわち、バイパラトピック抗体（BpAb））を形成することができる。
例えば、そのようなTim-3抗原に対して結合性を有する抗体等の半分子の特定の6箇所のCDRのアミノ配列の例としては、以下の（1）から（12）：
（1） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（SYYMS、SEQ ID No: 1）、CDR2（TISNSGGSIYYLDSVKD、SEQ ID No: 2）、およびCDR3（DPYYSNYVPMDY、SEQ ID No: 3）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQYVDTYVA、SEQ ID No: 4）、CDR2（SASTRHT、SEQ ID No: 5）、およびCDR3（AQYSSSPLT、SEQ ID No: 6）；
（2） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No: 9）、CDR2（YIYPNNGGTSYNQKFKG、SEQ ID No: 10）、およびCDR3（SGYGNYYTMDY、SEQ ID No: 11）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No: 12）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No: 13）、およびCDR3（QQHYSSPST、SEQ ID No:14）；
（3） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:17）、CDR2（YIYPNNGGTSYNQKFKG、SEQ ID No:18）、およびCDR3（GGYYSYYSYDY、SEQ ID No:19）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:20）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:21）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:22）；
（4） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:25）、CDR2（YIYPNNGGTSYNQKFKG、SEQ ID No:26）、およびCDR3（SGYKAYYAMDY、SEQ ID No:27）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:28）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:29）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:30）；
（5） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（SYYMS、SEQ ID No:33）、CDR2（TISNSGGSTYYPDSVKD、SEQ ID No:34）、およびCDR3（DPYYTNYVPMDY、SEQ ID No:35）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQYVDTYVA、SEQ ID No:4）、CDR2（SASTRHT、SEQ ID No:5）、およびCDR3（AQYSSSPLT、SEQ ID No: 6）；
（6） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（SYYMS、SEQ ID No: 33）、CDR2（TISNSGGSTYYPDSVKD、SEQ ID NO: 34）、およびCDR3（DPYYTNYVPMDY、SEQ ID NO: 35）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASENVGTYVS、SEQ ID NO: 52）、CDR2（GASNRYT、SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（GQSYSYPLT、SEQ ID NO: 54）；
（7） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No: 9）、CDR2（YIYPNNAGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 74）、およびCDR3（SGYGNYYTMDY、SEQ ID No: 11）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No: 12）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No: 13）、およびCDR3（QQHYSSPST、SEQ ID No:14）；
（8） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No: 9）、CDR2（YIYPNKGGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 76）、およびCDR3（SGYGNYYTMDY、SEQ ID No: 11）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No: 12）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No: 13）、およびCDR3（QQHYSSPST、SEQ ID No:14）；
（9） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:17）、CDR2（YIYPNNAGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 78）、およびCDR3（GGYYSYYSYDY、SEQ ID No:19）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:20）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:21）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:22）；
（10） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:17）、CDR2（YIYPNKGGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 80）、およびCDR3（GGYYSYYSYDY、SEQ ID No:19）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:20）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:21）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:22）；
（11） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:25）、CDR2（YIYPNNAGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 82）、およびCDR3（SGYKAYYAMDY、SEQ ID No:27）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:28）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:29）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:30）；
（12） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:25）、CDR2（YIYPNKGGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 84）、およびCDR3（SGYKAYYAMDY、SEQ ID No:27）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:28）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:29）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:30）；
からなる群から選択されるいずれかの重鎖・軽鎖の相補性決定領域を含むものが考えられるが、Tim-3抗原に対して結合性を有するという特徴を有する限りにおいて、上記のCDRの組み合わせ以外のCDRの組み合わせで特定される抗体等もまた含まれる。
（1） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（SYYMS、SEQ ID No: 1）、CDR2（TISNSGGSIYYLDSVKD、SEQ ID No: 2）、およびCDR3（DPYYSNYVPMDY、SEQ ID No: 3）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQYVDTYVA、SEQ ID No: 4）、CDR2（SASTRHT、SEQ ID No: 5）、およびCDR3（AQYSSSPLT、SEQ ID No: 6）；
（2） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No: 9）、CDR2（YIYPNNGGTSYNQKFKG、SEQ ID No: 10）、およびCDR3（SGYGNYYTMDY、SEQ ID No: 11）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No: 12）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No: 13）、およびCDR3（QQHYSSPST、SEQ ID No:14）；
（3） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:17）、CDR2（YIYPNNGGTSYNQKFKG、SEQ ID No:18）、およびCDR3（GGYYSYYSYDY、SEQ ID No:19）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:20）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:21）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:22）；
（4） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:25）、CDR2（YIYPNNGGTSYNQKFKG、SEQ ID No:26）、およびCDR3（SGYKAYYAMDY、SEQ ID No:27）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:28）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:29）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:30）；
（5） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（SYYMS、SEQ ID No:33）、CDR2（TISNSGGSTYYPDSVKD、SEQ ID No:34）、およびCDR3（DPYYTNYVPMDY、SEQ ID No:35）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQYVDTYVA、SEQ ID No:4）、CDR2（SASTRHT、SEQ ID No:5）、およびCDR3（AQYSSSPLT、SEQ ID No: 6）；
（6） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（SYYMS、SEQ ID No: 33）、CDR2（TISNSGGSTYYPDSVKD、SEQ ID NO: 34）、およびCDR3（DPYYTNYVPMDY、SEQ ID NO: 35）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASENVGTYVS、SEQ ID NO: 52）、CDR2（GASNRYT、SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（GQSYSYPLT、SEQ ID NO: 54）；
（7） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No: 9）、CDR2（YIYPNNAGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 74）、およびCDR3（SGYGNYYTMDY、SEQ ID No: 11）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No: 12）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No: 13）、およびCDR3（QQHYSSPST、SEQ ID No:14）；
（8） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No: 9）、CDR2（YIYPNKGGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 76）、およびCDR3（SGYGNYYTMDY、SEQ ID No: 11）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No: 12）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No: 13）、およびCDR3（QQHYSSPST、SEQ ID No:14）；
（9） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:17）、CDR2（YIYPNNAGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 78）、およびCDR3（GGYYSYYSYDY、SEQ ID No:19）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:20）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:21）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:22）；
（10） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:17）、CDR2（YIYPNKGGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 80）、およびCDR3（GGYYSYYSYDY、SEQ ID No:19）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:20）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:21）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:22）；
（11） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:25）、CDR2（YIYPNNAGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 82）、およびCDR3（SGYKAYYAMDY、SEQ ID No:27）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:28）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:29）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:30）；
（12） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:25）、CDR2（YIYPNKGGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 84）、およびCDR3（SGYKAYYAMDY、SEQ ID No:27）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:28）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:29）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:30）；
からなる群から選択されるいずれかの重鎖・軽鎖の相補性決定領域を含むものが考えられるが、Tim-3抗原に対して結合性を有するという特徴を有する限りにおいて、上記のCDRの組み合わせ以外のCDRの組み合わせで特定される抗体等もまた含まれる。
第二の態様の具体的な抗体等
本発明の第二の態様において、前述したように、第一の抗体等の半分子が結合する第一のエピトープと、第二の抗体等の半分子が結合する第二エピトープはTim-3タンパク質の同一の部位であっても異なる部位であってもよいことから、上記で例示した（1）～（5）の抗体等の半分子は、どのような組み合わせで使用してもよい。すなわち、本発明におけるバイパラトピック抗体である抗体等は、異なる2種の抗体等の半分子のどのような組み合わせから構成される抗体等であってもよい。
本発明の第二の態様において、前述したように、第一の抗体等の半分子が結合する第一のエピトープと、第二の抗体等の半分子が結合する第二エピトープはTim-3タンパク質の同一の部位であっても異なる部位であってもよいことから、上記で例示した（1）～（5）の抗体等の半分子は、どのような組み合わせで使用してもよい。すなわち、本発明におけるバイパラトピック抗体である抗体等は、異なる2種の抗体等の半分子のどのような組み合わせから構成される抗体等であってもよい。
前述したとおり、これらの半分子のうち、（1）、（5）および（6）の抗体等の半分子は、Group 2に属する抗体等に由来する半分子であり、（2）～（4）および（7）～（12）の抗体等の半分子は、Group 5に属する抗体等に由来する半分子である。このことから、本発明の第二の態様において、例えば、本発明の第2の態様におけるバイパラトピック抗体を、Tim-3タンパク質の2か所の異なるエピトープ部位に結合するものとするためには、抗体等の半分子の一方が上記で例示した（1）、（5）または（6）の半分子であり、抗体等の半分子のもう一方が（2）～（4）または（7）～（12）のいずれかの半分子である抗体等を提供することができる。
本発明のこの態様において、抗体等の半分子は、例えば、以下の（VH-1）～（VH-12）（およびそれぞれの番号の枝番）の重鎖可変領域VHドメインのアミノ酸配列：
（VH-1a）SEQ ID No: 7のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 7のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 1）、CDR2（SEQ ID No: 2）、およびCDR3（SEQ ID No: 3）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-1b）SEQ ID No: 49のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 49のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 1）、CDR2（SEQ ID No: 2）、およびCDR3（SEQ ID No: 3）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-1c）SEQ ID No: 57のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 57のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 1）、CDR2（SEQ ID No: 2）、およびCDR3（SEQ ID No: 3）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-2a）SEQ ID No: 15のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 15のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 10）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-2b）SEQ ID No: 62のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 62のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 10）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-3a）SEQ ID No: 23のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 23のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 17）、CDR2（SEQ ID No: 18）、およびCDR3（SEQ ID No: 19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-3b）SEQ ID No: 66のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 66のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 17）、CDR2（SEQ ID No: 18）、およびCDR3（SEQ ID No: 19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-4a）SEQ ID No: 31のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 31のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 25）、CDR2（SEQ ID No: 26）、およびCDR3（SEQ ID No: 27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VH-4b）SEQ ID No: 70のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 70のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 25）、CDR2（SEQ ID No: 26）、およびCDR3（SEQ ID No: 27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VH-5a）SEQ ID No: 36のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 36のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-5b）SEQ ID No: 51のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 51のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-5c）SEQ ID No: 59のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 59のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-6a）SEQ ID No: 55のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 55のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-6b）SEQ ID No: 51のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 51のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-6c）SEQ ID No: 59のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 59のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-7）SEQ ID No: 75のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 75のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 74）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-8）SEQ ID No: 77のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 77のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 76）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-9）SEQ ID No: 79のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 79のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:17）、CDR2（SEQ ID No: 78）、およびCDR3（SEQ ID No:19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-10）SEQ ID No: 81のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 81のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:17）、CDR2（SEQ ID No: 80）、およびCDR3（SEQ ID No:19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-11）SEQ ID No: 83のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 83のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:25）、CDR2（SEQ ID No: 82）、およびCDR3（SEQ ID No:27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-12）SEQ ID No: 85のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 85のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:25）、CDR2（SEQ ID No: 84）、およびCDR3（SEQ ID No:27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
からなる群から選択するものを有するものとして特定することができる。ここで、（VH-1）から（VH-12）の番号は、前述した重鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの（1）～（12）の番号と対応したものである。例えば、（VH-1）SEQ ID NO: 7のアミノ酸配列は、（1）SEQ ID NO: 1～SEQ ID NO: 3で特定される重鎖CDR1～CDR3のアミノ酸配列を包含する配列を意味する。また、それぞれの重鎖可変領域VHドメインについての枝番（例えば、（VH-1a）や（VH-1b））は、同一の配列のCDRの組み合わせを有するが、フレームワークの配列が種々の配列から構成される重鎖可変領域のバリエーションと対応したものであることを意味する。
（VH-1a）SEQ ID No: 7のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 7のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 1）、CDR2（SEQ ID No: 2）、およびCDR3（SEQ ID No: 3）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-1b）SEQ ID No: 49のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 49のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 1）、CDR2（SEQ ID No: 2）、およびCDR3（SEQ ID No: 3）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-1c）SEQ ID No: 57のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 57のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 1）、CDR2（SEQ ID No: 2）、およびCDR3（SEQ ID No: 3）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-2a）SEQ ID No: 15のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 15のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 10）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-2b）SEQ ID No: 62のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 62のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 10）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-3a）SEQ ID No: 23のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 23のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 17）、CDR2（SEQ ID No: 18）、およびCDR3（SEQ ID No: 19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-3b）SEQ ID No: 66のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 66のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 17）、CDR2（SEQ ID No: 18）、およびCDR3（SEQ ID No: 19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-4a）SEQ ID No: 31のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 31のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 25）、CDR2（SEQ ID No: 26）、およびCDR3（SEQ ID No: 27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VH-4b）SEQ ID No: 70のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 70のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 25）、CDR2（SEQ ID No: 26）、およびCDR3（SEQ ID No: 27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VH-5a）SEQ ID No: 36のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 36のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-5b）SEQ ID No: 51のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 51のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-5c）SEQ ID No: 59のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 59のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-6a）SEQ ID No: 55のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 55のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-6b）SEQ ID No: 51のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 51のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-6c）SEQ ID No: 59のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 59のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-7）SEQ ID No: 75のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 75のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 74）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-8）SEQ ID No: 77のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 77のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 76）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-9）SEQ ID No: 79のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 79のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:17）、CDR2（SEQ ID No: 78）、およびCDR3（SEQ ID No:19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-10）SEQ ID No: 81のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 81のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:17）、CDR2（SEQ ID No: 80）、およびCDR3（SEQ ID No:19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-11）SEQ ID No: 83のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 83のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:25）、CDR2（SEQ ID No: 82）、およびCDR3（SEQ ID No:27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-12）SEQ ID No: 85のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 85のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:25）、CDR2（SEQ ID No: 84）、およびCDR3（SEQ ID No:27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
からなる群から選択するものを有するものとして特定することができる。ここで、（VH-1）から（VH-12）の番号は、前述した重鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの（1）～（12）の番号と対応したものである。例えば、（VH-1）SEQ ID NO: 7のアミノ酸配列は、（1）SEQ ID NO: 1～SEQ ID NO: 3で特定される重鎖CDR1～CDR3のアミノ酸配列を包含する配列を意味する。また、それぞれの重鎖可変領域VHドメインについての枝番（例えば、（VH-1a）や（VH-1b））は、同一の配列のCDRの組み合わせを有するが、フレームワークの配列が種々の配列から構成される重鎖可変領域のバリエーションと対応したものであることを意味する。
この場合において、重鎖可変領域フレームワークのアミノ酸配列は、既存の抗体のものを利用することができ、例えば、ヒトのいずれかの抗体の可変領域のアミノ酸配列や、そのようなアミノ酸配列に改変を加えたアミノ酸配列を利用することができる。具体的には、重鎖可変領域のアミノ酸配列のうち、それぞれのCDR1～CDR3が標的抗原との結合に必須であることが知られており、一方CDR1～CDR3以外の部分においては1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列であっても、Tim-3に対して結合性を有し、がん細胞に対する免疫活性を増強する作用を有する、抗体またはその抗体誘導体を構成することができる限りにおいて、本発明において使用することができる。
本発明のこの態様において、本発明の抗体等の半分子は、以下の（VL-1）～（VL-6）（およびそれぞれの番号の枝番）の軽鎖可変領域VLドメインのアミノ酸配列：
（VL-1a）SEQ ID No: 8のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 8のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-1b）SEQ ID No: 58のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 58のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-1c）SEQ ID No: 50のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 50のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2a）SEQ ID No: 16のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 16のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2b）SEQ ID No: 63のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 63のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2c）SEQ ID No: 64のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 64のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2d）SEQ ID No: 65のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 65のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3a）SEQ ID No: 24のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 24のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3b）SEQ ID No: 67のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 67のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3c）SEQ ID No: 68のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 68のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3d）SEQ ID No: 69のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 69のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-4a）SEQ ID No: 32のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 32のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-4b）SEQ ID No: 71のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 71のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-4c）SEQ ID No: 72のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 72のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-4d）SEQ ID No: 73のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 73のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-5a）SEQ ID No: 8のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 8のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-5b）SEQ ID No: 58のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 58のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-5c）SEQ ID No: 50のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 50のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-6a）SEQ ID No: 56のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 56のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID NO: 52）、CDR2（SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（SEQ ID NO: 54）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-6b）SEQ ID No: 60のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 60のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID NO: 52）、CDR2（SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（SEQ ID NO: 54）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-6c）SEQ ID No: 61のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 61のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID NO: 52）、CDR2（SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（SEQ ID NO: 54）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
からなる群から選択するものを有するものとして特定することができる。ここで、（VL-1）から（VL-5）の番号は、前述した軽鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの（1）～（6）の番号と対応したものである。例えば、（VL-1）SEQ ID NO: 8のアミノ酸配列は、（1）SEQ ID NO: 4～SEQ ID NO: 6で特定される軽鎖CDR1～CDR3のアミノ酸配列を包含する配列を意味する。また、それぞれの軽鎖可変領域VLドメインについての枝番（例えば、（VL-1a）や（VL-1b））は、同一の配列のCDRの組み合わせを有するが、フレームワークの配列が種々の配列から構成される軽鎖可変領域のバリエーションと対応したものであることを意味する。
（VL-1a）SEQ ID No: 8のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 8のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-1b）SEQ ID No: 58のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 58のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-1c）SEQ ID No: 50のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 50のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2a）SEQ ID No: 16のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 16のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2b）SEQ ID No: 63のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 63のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2c）SEQ ID No: 64のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 64のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2d）SEQ ID No: 65のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 65のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3a）SEQ ID No: 24のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 24のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3b）SEQ ID No: 67のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 67のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3c）SEQ ID No: 68のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 68のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3d）SEQ ID No: 69のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 69のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-4a）SEQ ID No: 32のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 32のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-4b）SEQ ID No: 71のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 71のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-4c）SEQ ID No: 72のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 72のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-4d）SEQ ID No: 73のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 73のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-5a）SEQ ID No: 8のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 8のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-5b）SEQ ID No: 58のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 58のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-5c）SEQ ID No: 50のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 50のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-6a）SEQ ID No: 56のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 56のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID NO: 52）、CDR2（SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（SEQ ID NO: 54）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-6b）SEQ ID No: 60のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 60のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID NO: 52）、CDR2（SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（SEQ ID NO: 54）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-6c）SEQ ID No: 61のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 61のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID NO: 52）、CDR2（SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（SEQ ID NO: 54）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
からなる群から選択するものを有するものとして特定することができる。ここで、（VL-1）から（VL-5）の番号は、前述した軽鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの（1）～（6）の番号と対応したものである。例えば、（VL-1）SEQ ID NO: 8のアミノ酸配列は、（1）SEQ ID NO: 4～SEQ ID NO: 6で特定される軽鎖CDR1～CDR3のアミノ酸配列を包含する配列を意味する。また、それぞれの軽鎖可変領域VLドメインについての枝番（例えば、（VL-1a）や（VL-1b））は、同一の配列のCDRの組み合わせを有するが、フレームワークの配列が種々の配列から構成される軽鎖可変領域のバリエーションと対応したものであることを意味する。
なお、
・前述した（7）および（8）における軽鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの軽鎖可変領域は、前述した（2）における軽鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの軽鎖可変領域（すなわち、（VL-2）またはその枝番で規定される軽鎖可変領域）と同一であり、
・前述した（9）および（10）における軽鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの軽鎖可変領域は、前述した（3）における軽鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの軽鎖可変領域（すなわち、（VL-3）またはその枝番で規定される軽鎖可変領域）と同一であり、
・前述した（11）および（12）における軽鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの軽鎖可変領域は、前述した（4）における軽鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの軽鎖可変領域（すなわち、（VL-4）またはその枝番で規定される軽鎖可変領域）と同一である。
・前述した（7）および（8）における軽鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの軽鎖可変領域は、前述した（2）における軽鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの軽鎖可変領域（すなわち、（VL-2）またはその枝番で規定される軽鎖可変領域）と同一であり、
・前述した（9）および（10）における軽鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの軽鎖可変領域は、前述した（3）における軽鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの軽鎖可変領域（すなわち、（VL-3）またはその枝番で規定される軽鎖可変領域）と同一であり、
・前述した（11）および（12）における軽鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの軽鎖可変領域は、前述した（4）における軽鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの軽鎖可変領域（すなわち、（VL-4）またはその枝番で規定される軽鎖可変領域）と同一である。
この場合において、軽鎖可変領域フレームワークのアミノ酸配列は、既存の抗体のものを利用することができ、例えば、ヒトのいずれかの抗体の可変領域のアミノ酸配列や、そのようなアミノ酸配列に改変を加えたアミノ酸配列を利用することができる。具体的には、軽鎖可変領域のアミノ酸配列のうち、それぞれのCDR1～CDR3が標的抗原との結合に必須であることが知られており、一方CDR1～CDR3以外の部分においては1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列であっても、Tim-3に対して結合性を有し、がん細胞に対する免疫活性を増強する作用を有する、抗体等を構成することができる限りにおいて、本発明において使用することができる。
本発明においては、本発明の抗体誘導体には、上述した抗体等の機能的断片や改変抗体も含まれる。本発明における抗体等の機能的断片は、F（ab'）2、Fab'、Fab、一本鎖Fv（scFv）などが含まれ、改変抗体には、Fcエフェクター機能改変抗体、IgG1LALA、IgG1_N297A、IgG4_S228Pなどが含まれる。本発明において使用することができる機能性断片または改変抗体は、Tim-3抗原に結合して、Tim-3-Galectin-9の結合を阻害することができ、結果的にTim-3-Galectin-9経路に基づく免疫抑制シグナルを除去することができる、いわゆる免疫チェックポイント阻害剤として機能すること、あるいはその結果としてがん細胞に対する細胞傷害性を誘導することができること、を特徴としていれば、これらのうちのどのような断片または改変抗体であってもよく、例えば、一本鎖Fv（scFv）などを、そのような機能的断片として使用することができる。
例えば、本発明の抗体等として一本鎖Fv（scFv）抗体を使用する場合、本発明の抗体等の半分子は、以下の（1）～（12）の重鎖可変領域VHドメインのアミノ酸配列と以下の軽鎖可変領域VLドメインのアミノ酸配列とを連結して一本鎖として特定することができる：
（1）前記（VH-1a）、（VH-1b）または（VH-1c）の重鎖可変領域と前記（VL-1a）、（VL-1b）または（VL-1c）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合した結合したもの、
（2）前記（VH-2a）または（VH-2b）の重鎖可変領域と前記（VL-2a）、（VL-2b）、（VL-2c）または（VL-2d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（3）前記（VH-3a）または（VH-3b）の重鎖可変領域と前記（VL-3a）、（VL-3b）、（VL-3c）または（VL-3d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（4）前記（VH-4a）または（VH-4b）の重鎖可変領域と前記（VL-4a）、（VL-4b）、（VL-4c）または（VL-4d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、および
（5）前記（VH-5a）、（VH-5b）または（VH-5c）の重鎖可変領域と前記（VL-5a）、（VL-5b）または（VL-5c）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（6）前記（VH-6a）、（VH-6b）または（VH-6c）の重鎖可変領域と前記（VL-6a）、（VL-6b）または（VL-6c）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（7）前記（VH-7）の重鎖可変領域と前記（VL-2a）、（VL-2b）、（VL-2c）または（VL-2d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（8）前記（VH-8）の重鎖可変領域と前記（VL-2a）、（VL-2b）、（VL-2c）または（VL-2d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（9）前記（VH-9）の重鎖可変領域と前記（VL-3a）、（VL-3b）、（VL-3c）または（VL-3d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（10）前記（VH-10）の重鎖可変領域と前記（VL-3a）、（VL-3b）、（VL-3c）または（VL-3d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（11）前記（VH-11）の重鎖可変領域と前記（VL-4a）、（VL-4b）、（VL-4c）または（VL-4d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（12）前記（VH-12）の重鎖可変領域と前記（VL-4a）、（VL-4b）、（VL-4c）または（VL-4d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの。ここで、（1）から（12）の番号は、前述した重鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの番号と前述した軽鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの番号と対応したものである。例えば、（1）の003一本鎖抗体の半分子の可変領域のアミノ酸配列は、（1）SEQ ID NO: 1～SEQ ID NO: 3で特定される重鎖CDR1～CDR3のアミノ酸配列とSEQ ID NO: 4～SEQ ID NO: 6で特定される軽鎖CDR1～CDR3のアミノ酸配列とを包含する配列を意味する。
（1）前記（VH-1a）、（VH-1b）または（VH-1c）の重鎖可変領域と前記（VL-1a）、（VL-1b）または（VL-1c）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合した結合したもの、
（2）前記（VH-2a）または（VH-2b）の重鎖可変領域と前記（VL-2a）、（VL-2b）、（VL-2c）または（VL-2d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（3）前記（VH-3a）または（VH-3b）の重鎖可変領域と前記（VL-3a）、（VL-3b）、（VL-3c）または（VL-3d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（4）前記（VH-4a）または（VH-4b）の重鎖可変領域と前記（VL-4a）、（VL-4b）、（VL-4c）または（VL-4d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、および
（5）前記（VH-5a）、（VH-5b）または（VH-5c）の重鎖可変領域と前記（VL-5a）、（VL-5b）または（VL-5c）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（6）前記（VH-6a）、（VH-6b）または（VH-6c）の重鎖可変領域と前記（VL-6a）、（VL-6b）または（VL-6c）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（7）前記（VH-7）の重鎖可変領域と前記（VL-2a）、（VL-2b）、（VL-2c）または（VL-2d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（8）前記（VH-8）の重鎖可変領域と前記（VL-2a）、（VL-2b）、（VL-2c）または（VL-2d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（9）前記（VH-9）の重鎖可変領域と前記（VL-3a）、（VL-3b）、（VL-3c）または（VL-3d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（10）前記（VH-10）の重鎖可変領域と前記（VL-3a）、（VL-3b）、（VL-3c）または（VL-3d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（11）前記（VH-11）の重鎖可変領域と前記（VL-4a）、（VL-4b）、（VL-4c）または（VL-4d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（12）前記（VH-12）の重鎖可変領域と前記（VL-4a）、（VL-4b）、（VL-4c）または（VL-4d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの。ここで、（1）から（12）の番号は、前述した重鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの番号と前述した軽鎖CDR1～CDR3の配列の組み合わせの番号と対応したものである。例えば、（1）の003一本鎖抗体の半分子の可変領域のアミノ酸配列は、（1）SEQ ID NO: 1～SEQ ID NO: 3で特定される重鎖CDR1～CDR3のアミノ酸配列とSEQ ID NO: 4～SEQ ID NO: 6で特定される軽鎖CDR1～CDR3のアミノ酸配列とを包含する配列を意味する。
scFvにおける重鎖可変領域と軽鎖可変領域の結合は、いずれがN末端側になるように結合させてもよく、N末端側からC末端側に、重鎖可変領域-リンカー-軽鎖可変領域の順番であっても、軽鎖可変領域-リンカー-重鎖可変領域の順番であってもよい。また、これらの重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間をつなぐリンカーは、当該技術分野において使用できることが知られているリンカーであればいずれであってもよく、例えば、後述する本願実施例においては、GGGGS×4（すなわち、GGGGSが4回連続するアミノ酸配列から構成されるリンカー）を使用することができる。
また、第二の態様のヘテロダイマー型の抗体等においてscFvを使用する場合、異なる2種類の半分子であるscFv抗体を、当該技術分野において一般的に使用されている抗体のFc領域をさらにリンカーを介して結合してscFv-Fcを形成し、それらを会合させてヘテロダイマー型の二本鎖として作製することもできる。この場合、例えば、Fc領域は、scFvのC末端側にリンカー（例えば、GGGGからなるリンカー）を介して結合させた構造とすることができる。
抗体等または抗体等の半分子の取得
本発明の抗体等は、前述した由来種の動物に対してTim-3抗原を免疫原として投与し、その動物体内から採取した抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させて培養することにより取得することもでき（いわゆるハイブリドーマ法）、あるいは抗体等のアミノ酸配列を規定できるDNA配列を含むタンパク質発現用のベクターを設計し、そのベクターをタンパク質産生用の細胞に導入し、組換え的に取得することもでき（いわゆる組換えDNA法）、抗体等の可変領域を一本鎖抗体（scFv）としてファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを取得してもよい（いわゆるファージディスプレイ方法）。
本発明の抗体等は、前述した由来種の動物に対してTim-3抗原を免疫原として投与し、その動物体内から採取した抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させて培養することにより取得することもでき（いわゆるハイブリドーマ法）、あるいは抗体等のアミノ酸配列を規定できるDNA配列を含むタンパク質発現用のベクターを設計し、そのベクターをタンパク質産生用の細胞に導入し、組換え的に取得することもでき（いわゆる組換えDNA法）、抗体等の可変領域を一本鎖抗体（scFv）としてファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを取得してもよい（いわゆるファージディスプレイ方法）。
これらの方法はいずれも当該技術分野において一般的に使用される方法であるが、
・ハイブリドーマ法であれば、例えば、KohlerおよびMilsteinら， Nature (1975)， Vol. 256, p.495-97、Hongoら, Hybridoma (1995), Vol. 14, No. 3, p.253-260、Harlowら, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988), Vol. 2)およびHammerlingら, Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, p.563-681(Elsevier, N.Y., 1981)などを参照して、
・組換えDNA法であれば、例えば、US4816567などを参照して、
・ファージディスプレイ方法であれば、例えば、LadnerらのUS5223409、US5403484およびUS5571698、DowerらのUS5427908およびUS5580717、McCaffertyらのUS5969108およびUS6172197およびGriffithsらのUS5885793、US6521404、US6544731、US6555313、US6582915およびUS6593081などを参照して、抗体等を作製することができる。
・ハイブリドーマ法であれば、例えば、KohlerおよびMilsteinら， Nature (1975)， Vol. 256, p.495-97、Hongoら, Hybridoma (1995), Vol. 14, No. 3, p.253-260、Harlowら, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988), Vol. 2)およびHammerlingら, Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, p.563-681(Elsevier, N.Y., 1981)などを参照して、
・組換えDNA法であれば、例えば、US4816567などを参照して、
・ファージディスプレイ方法であれば、例えば、LadnerらのUS5223409、US5403484およびUS5571698、DowerらのUS5427908およびUS5580717、McCaffertyらのUS5969108およびUS6172197およびGriffithsらのUS5885793、US6521404、US6544731、US6555313、US6582915およびUS6593081などを参照して、抗体等を作製することができる。
組換えDNA法またはファージディスプレイ法により本発明の抗体等を作製する場合、本発明の抗体等のアミノ酸配列を規定できるDNA配列は、目的とする抗体等を産生する細胞から取得する方法、アミノ酸配列に基づき発現系で使用される動物種に最適化したコドンに基づき設計する方法、あるいはこれらの方法を組み合わせて使用する方法により作製することができる。
組換えDNA法により本発明の抗体等を作製する場合、作製したDNA配列は、その抗体等を発現させようとするタンパク質発現用細胞種（例えば、CHO細胞など）に適した発現ベクターに組み込み、タンパク質発現用細胞種に導入することにより取得するなど、当業者によく知られた手法を用いて取得することができる。
ホモダイマー型の抗体を組換えDNA法により作製する場合、一種類の重鎖と一種類の軽鎖を組み合わせた構造になっていることから、タンパク質発現用細胞種に対して、重鎖アミノ酸配列を規定するDNA配列を含むベクターと軽鎖アミノ酸配列を規定するDNA配列を含むベクターとを導入して両方のタンパク質を細胞内で発現させて細胞内で抗体を産生する方法、あるいは重鎖アミノ酸配列を規定するDNA配列と軽鎖アミノ酸配列を規定するDNA配列とを両方含むベクターを導入して両方のタンパク質を細胞内で発現させて細胞内で抗体を産生する方法、などにより作製することができる。
ヘテロダイマー型の抗体を組換えDNA法により作製する場合、二種類の重鎖と二種類の軽鎖を組み合わせた構造になっていることから、タンパク質発現用細胞種に対して、第一の重鎖アミノ酸配列を規定するDNA配列を含むベクター、第二の重鎖アミノ酸配列を規定するDNA配列を含むベクター、第一の軽鎖アミノ酸配列を規定するDNA配列を含むベクター、および第二の軽鎖アミノ酸配列を規定するDNA配列を含むベクターを導入して、4種のタンパク質（第一および第二の重鎖、第一および第二の軽鎖）を細胞内で発現させて、細胞内で抗体を産生する方法などにより作製することができる。
ファージディスプレイ法により本発明の抗体等を作製する場合、作製したH鎖可変領域とL鎖可変領域のDNA配列を短いアミノ酸配列で繋いでファージ上に提示させたライブラリーを用いて、標的分子に対して親和性を有する抗体を選択する方法である。
ホモダイマー型の抗体をファージディスプレイ法により作製する場合、一種類の重鎖と一種類の軽鎖を短いアミノ酸配列で繋いで一本鎖Fv（scFv）として発現させることができることから、その後、その一本鎖にFc領域を結合させてscFv-Fc抗体に変換することによりホモダイマー型の抗体等を作製することができる。さらに、scFvのVH、VLを切り離して、それぞれに定常領域（CH、CL）を結合して会合させることによっても、ホモダイマー型の抗体等を作製することができる。
ヘテロダイマー型の抗体等の作製方法の場合、2種のタンパク質（第一の重鎖および第一の軽鎖、第二の重鎖および第二の軽鎖）が無作為に組み合わされることにより目的とするヘテロダイマー型の抗体が得られる確率は低い。そのため、ヘテロダイマー型の抗体の産生のためには、「knobs-into-holes」技術を使用すると好ましい（US7183076B2に記載される方法などを参照）。この技術では、2つの抗体等のうちの一方の抗体等の半分子の定常領域CH3ドメインには「Knob」構造を、もう一方の抗体等の半分子の定常領域CH3ドメインには「Hole」構造を導入し、定常領域に「Knob」構造を有する抗体等の半分子と、定常領域に「Hole」構造を有する抗体等の半分子とを組み合わせることで、非対称の2種の重鎖を形成する際に重鎖ヘテロダイマーを形成させやすくすることができる。この「Knob」構造および「Hole」構造は、前述した重鎖可変領域あるいは一本鎖Fv（scFv）抗体可変領域と組み合わせて使用することができる。
本発明の抗体等の機能
本発明の抗体等は、上記の第一の態様の抗体等も第二の態様の抗体等もいずれも、がん細胞に発現するTim-3抗原の機能を抑制したり、あるいは免疫細胞（特にT細胞や抗原提示細胞）に発現するTim-3抗原の機能を抑制し、がん細胞に対する免疫抑制シグナルを除去して、免疫細胞（特にT細胞）の疲弊を解除することにより、免疫細胞（特にT細胞）の増殖、免疫細胞（特にT細胞）のがん細胞に対する細胞傷害性の上昇、および免疫細胞（特にT細胞）のサイトカイン分泌促進など免疫細胞（特にT細胞）を活性化し、あるいは免疫細胞(特に樹状細胞)の成熟・活性化の抑制を解除し、その結果として、腫瘍増殖抑制効果やがん治療効果を発揮することを特徴とする。
本発明の抗体等は、上記の第一の態様の抗体等も第二の態様の抗体等もいずれも、がん細胞に発現するTim-3抗原の機能を抑制したり、あるいは免疫細胞（特にT細胞や抗原提示細胞）に発現するTim-3抗原の機能を抑制し、がん細胞に対する免疫抑制シグナルを除去して、免疫細胞（特にT細胞）の疲弊を解除することにより、免疫細胞（特にT細胞）の増殖、免疫細胞（特にT細胞）のがん細胞に対する細胞傷害性の上昇、および免疫細胞（特にT細胞）のサイトカイン分泌促進など免疫細胞（特にT細胞）を活性化し、あるいは免疫細胞(特に樹状細胞)の成熟・活性化の抑制を解除し、その結果として、腫瘍増殖抑制効果やがん治療効果を発揮することを特徴とする。
Tim-3抗原（別名：HAVCR2）は、Th1細胞（1型Tヘルパー細胞）、樹状細胞、CD8+T細胞および他のリンパ球サブセットで発現される免疫チェックポイント分子の一つとして知られている分子であり、Tim-3は、T細胞トレランス（T cell tolerance）で重要な調節分子であり、慢性のウイルス感染時の自己免疫とT細胞の疲弊（T cell exhaustion）に極めて重要な役割を担っていることがわかっている。Tim-3は、Phosphatidylserine（PtdSer）、CEACAM1（Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1）、Galectin-9、HMGB1（High mobility group box 1）などの多くのリガンドと相互作用するが、この中でも、Tim-3-Galectin-9経路が、Th1細胞（1型Tヘルパー細胞）免疫を負に調節することが知られている。
そのため、本発明の抗体等は、直接的な機能として、Tim-3抗原に結合して、Tim-3抗原の機能を抑制し、Tim-3-Galectin-9の結合を阻害することにより、Tim-3-Galectin-9経路が免疫を負に調節する免疫抑制シグナル、特にがん細胞に対する免役抑制シグナルを除去することができる。
すなわち、本発明の抗体等は、がん細胞あるいは免疫細胞に発現するTim-3抗原に結合して、Tim-3抗原が関与するTim-3-Galectin-9経路に基づく免疫抑制シグナルを除去することができる、いわゆる免疫チェックポイント阻害剤として機能することができる。
また、本発明の抗体等は、直接的な機能として、Tim-3抗原に結合して、Tim-3抗原の機能を抑制し、Tim-3とPhosphatidylserine（PtdSer）との結合を阻害することができる。
前述したように、Tim-3タンパク質に対して結合する抗体等は、PtdSerを阻害する群（Group 1に属する抗体およびGroup 2に属する抗体）と、PtdSerを阻害しないか部分阻害する群（Group 3に属する抗体、Group 4に属する抗体およびGroup 5に属する抗体）に分類される。また、Galectin-9を完全に阻害できるものは知られていない。そのため、本発明の抗体等のうち、ホモダイマー型の抗体等は、抗体等が結合するTim-3上の部位が1か所であることから、Tim-3-Galectin-9の結合を部分阻害するか、またはTim-3-Galectin-9の結合を部分阻害し、かつTim-3とPhosphatidylserine（PtdSer）との結合を阻害するか、いずれかの機能を発揮する。一方、本発明の抗体等のうち、ヘテロダイマー型の抗体等（バイパラトピック抗体）は、その組み合わせにより、抗体等が結合するTim-3上の部位が異なる2か所に結合することができ、Tim-3-Galectin-9の結合を阻害し、かつTim-3とPhosphatidylserine（PtdSer）との結合を阻害することができるものを提供することができる。
また、上述した、免疫細胞に発現するTim-3抗原の機能を抑制するという直接的な機能の結果、副次的な効果として、免疫細胞（特にT細胞）の疲弊を解除することにより、免疫細胞を活性化し、その結果として、腫瘍増殖抑制効果やがん治療効果を発揮することができる。
Tim-3が関与する免疫チェックポイントは、他の公知の免疫チェックポイント分子（例えば、PD-1/PD-L1や、CTLA-4/B7（CD80/CD86）などのチェックポイント分子）とは異なる機序で機能することから、本発明の抗体等は、PD-1/PD-L1の阻害剤（例えば、ニボルマブ、ペムブロリズマブ（抗PD-1抗体）およびアテゾリズマブ、デュルバルマブ（抗PD-L1抗体））、CTLA-4/B7（CD80/CD86）の阻害剤（イピリムマブ（抗CTLA-4抗体））により効果が得られない場合のバックアップとして使用することもでき、あるいはこれらの既存の免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用することもできる。
このように、本発明の抗体等は、がん細胞あるいは免疫細胞に発現するTim-3の機能を抑制し、免疫細胞（特にT細胞）の疲弊を解除することにより、免疫細胞を活性化し、がん増殖抑制効果とがん治療効果を発揮することが好ましい。かかるT細胞の活性化は、in vitroにおいて生じるものであっても、in vivoにおいて生じるものであってもよい。例えば、生体（in vivo）においてTim-3抗原に対する抗体がこのようながん細胞に対する傷害性を有するT細胞を活性化する能力を有するかどうかを事前に知るため、in vitroにおいて、Tim-3抗原に対して結合性を有する抗体の中から、実際にT細胞を活性化する抗体をスクリーニングすることにより得ることができる。
本発明において、免疫細胞（特にT細胞）の疲弊という場合、免疫細胞が機能不全に陥った状態を指す。具体的には、T細胞におけるサイトカイン分泌能や細胞傷害性の低下、NK細胞におけるサイトカイン分泌能や細胞傷害性の低下、樹状細胞の抗原提示能の低下、制御性T細胞の活性化等である。この状態にある場合、がん細胞に対する個体のがん免疫は機能しないか機能が低下し、がん細胞を排除する活性が低下することとなる。このような免疫細胞の疲弊は、チェックポイントタンパク質（PD-1やCTLA-4、Tim-3など）がT細胞表面に増加することにより生じたり、増殖し続けるがん細胞により免疫系が長期間にわたり活性を強いられた場合にエフェクターT細胞に生じたりすることが知られているが、可逆的な状態であり、同じ細胞を活性化させることにより疲弊の状態を解消することも可能と考えられている。
本発明においてT細胞の活性化という場合、T細胞の増殖、T細胞のがん細胞に対する細胞傷害性の上昇、T細胞からのサイトカイン分泌などを指標として把握することができる。これらのT細胞の活性化がみられる場合には、本発明の抗体等により、T細胞におけるTim-3の活性が阻害され、腫瘍増殖抑制効果やがん治療効果を発揮することができる状態にあることを示す。
本発明の抗体等のT細胞を活性化する能力のスクリーニングは、生体内（in vivo）で行うこともでき、あるいは生体外（in vitro）で行うこともできる。生体内で行うスクリーニングは、野生型マウス、あるいはヌードマウスやSCIDマウス等の免疫不全マウスに免疫細胞を移植したマウスなどの動物に、標的とするがん細胞を移植し、本発明の抗体等を投与したときの体内での腫瘍塊のサイズの変化を測定することにより、あるいは本発明の抗体等を投与したときの体内での腫瘍塊周辺へのT細胞の浸潤を解剖学的に調べることにより、行うことができる。生体外で行うスクリーニングは、末梢血T細胞を培養条件下で本発明の抗体等と接触させ、当該T細胞の増殖を測定するか、T細胞のサイトカイン分泌を測定するか、あるいはT細胞ががん細胞に対する細胞死を引き起こすかどうかを調べることにより行うことができる。
抗体等の用途
本発明の抗体等は、前述の機能を有することから、上述したがん細胞に対する細胞傷害性を有する免疫細胞（特にT細胞）を活性化する能力を有するという特徴に基づき、一態様において、がんの治療または予防を必要としている被験体において、がん細胞に対する傷害性を有する免疫細胞（特にT細胞）を活性化する、本発明の抗体等を含むがん治療のための医薬組成物、を提供することができる。
本発明の抗体等は、前述の機能を有することから、上述したがん細胞に対する細胞傷害性を有する免疫細胞（特にT細胞）を活性化する能力を有するという特徴に基づき、一態様において、がんの治療または予防を必要としている被験体において、がん細胞に対する傷害性を有する免疫細胞（特にT細胞）を活性化する、本発明の抗体等を含むがん治療のための医薬組成物、を提供することができる。
本発明の抗体等は、Tim-3タンパク質を表面に発現している細胞にのみ結合するものであり、Tim-3とそのリガンドとの結合を選択的に阻害することができる。その結果、本発明の抗体等は、結果的には、特にTim-3-Galectin-9の結合を阻害して、免疫の負の調節を解消することを特徴としている。そのため、本発明の抗体等は、結果的に、免疫細胞（特にT細胞）に発現するTim-3抗原を介したがん細胞に対する免疫抑制シグナルを除去して、抗がん作用を有することになることから、がん細胞に対する細胞傷害性は誘導するが、免疫の標的とならない、いわゆる正常細胞に対する細胞傷害性を誘導しないことを特徴としている。
本発明において、本発明の抗体等の治療標的とすることができるがん細胞は、Tim-3タンパク質を発現しているがん細胞であるか、Tim-3タンパク質を発現する免疫細胞の監視・攻撃を回避しているがん細胞のいずれかであり、例えば、白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病を含む）、リンパ腫（非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、T細胞系リンパ腫、B細胞系リンパ腫、バーキットリンパ腫、悪性リンパ腫、びまん性リンパ腫、濾胞性リンパ腫を含む）、骨髄腫（多発性骨髄腫を含む）、メラノーマ、肺がん、乳がん、大腸がん、腎臓がん、胃がん、卵巣がん、膵臓がん、子宮頚がん、子宮体がん、子宮内膜がん、食道がん、肝臓がん、頭頚部がん、頭頚部扁平上皮がん、皮膚がん、尿路がん、前立腺がん、絨毛がん、咽頭がん、喉頭がん、きょう膜腫、男性胚腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、網膜芽腫、星状細胞腫、神経線維腫、稀突起謬腫、髄芽腫、神経芽腫、神経膠腫、横紋筋肉腫、謬芽腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、甲状肉腫及びウィルムス腫瘍からなる群から選択されるがん由来の細胞が含まれる。
本発明の抗体等は、上述するように標的となるがん細胞に対する細胞傷害性を有する免疫細胞（特にT細胞）を活性化することを特徴とする。すなわち、生体に投与した場合、免疫細胞（特にT細胞）の活性化は、標的となるTim-3抗原を発現し、がん細胞に対する細胞傷害性を有する免疫細胞に対してのみ生じ、Tim-3抗原を発現するものの正常細胞である場合には、臨床上問題となりうる細胞傷害性を誘導しないことが求められる。
本発明において、本発明の抗体等を、他の抗体または抗がん剤のような他の薬剤と組み合わせて組成物として提供することもできる。一態様において、本発明の抗体等を、薬物と結合し、抗体薬物複合体（ADC）を形成することもできる。
本発明において、本発明の抗体等を、生理学的に許容され得る希釈剤またはキャリアとともに含む製剤もまた提供することができる。適切なキャリアとしては、緩衝剤（リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液等）、塩（塩化ナトリウム等）、糖（グルコース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール等）、添加物（アルギニン等のアミノ酸、ポリソルベート等の界面活性剤等）、を含むものが含まれるが、これらに限定されるものではない。あるいは、本発明の抗体等は、凍結乾燥（フリーズドライ）し、必要とされるときに上記のような緩衝水溶液を添加することにより再構成して使用することもできる。本発明の抗体等を含む製剤は、種々の剤型で投与することができ、例えば、注射剤、点滴剤等による非経口投与剤とすることができる。
本発明の抗体等の投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、通常、非経口投与では、１回体重kgあたり0.01 mg～1000 mg、好ましくは1日体重kgあたり0.05 mg～500 mg、0.05 mg～100 mg、0.05 mg～50 mg、0.05 mg～20 mgなどの範囲で、より好ましくは1日体重kgあたり0.1 mg～10 mgの範囲で、腹腔内注射、皮下注射、筋肉注射、腫瘍内注射、または静脈注射など、がんの種類によって適切な投与経路から投与することができる。
本発明は、上述したがん細胞に対する細胞傷害性を有する免疫細胞（特にT細胞）を活性化する能力を有するという特徴に基づき、別の一態様において、がんの治療または予防を必要としている被験体に、本発明の抗体等の有効量を投与することを含む、被験体中のがんを治療または予防する方法もまた提供することができる。本発明の抗体等によるがんの治療または予防は、この抗体等が、体内においてがん細胞に対する細胞傷害性を有する免疫細胞（特にT細胞）を活性化することにより生じる。
本発明の抗体等をがんの治療または予防のために生体に投与する場合、生体内で細胞性免疫あるいは液性免疫が効果的に成立するようにアジュバント（例えば、Clin. Microbiol. Rev., 7:277-289, 1994に記載のものなど）とともに投与したり、また、リポソーム製剤、直径数μmのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤など、粒子状の剤型にして投与することもできる。
抗体等の生体外での用途
本発明の抗体等は、Tim-3抗原に対して結合性を有するという特徴に基づき、試料中のTim-3抗原を検出するために使用することができる。具体的には、本発明の抗体等は、被験体から採取したがん細胞あるいは免疫細胞（例えばT細胞）を含む試料に対して、免疫沈降法、凝集反応、磁気ビーズ法などの抗体を用いた精製法、ELISA法、ウェスタンブロット、免疫組織化学などのイムノアッセイ、フローサイトメトリーなどの免疫細胞化学等、抗体を用いて行うことができるTim-3抗原の様々な検出方法を実施する際に使用することができる。それぞれの場合において、本発明の抗体等は、当業者に一般的に知られている検出用標識（例えば、蛍光、酵素、など）を用いて検出することができる。
本発明の抗体等は、Tim-3抗原に対して結合性を有するという特徴に基づき、試料中のTim-3抗原を検出するために使用することができる。具体的には、本発明の抗体等は、被験体から採取したがん細胞あるいは免疫細胞（例えばT細胞）を含む試料に対して、免疫沈降法、凝集反応、磁気ビーズ法などの抗体を用いた精製法、ELISA法、ウェスタンブロット、免疫組織化学などのイムノアッセイ、フローサイトメトリーなどの免疫細胞化学等、抗体を用いて行うことができるTim-3抗原の様々な検出方法を実施する際に使用することができる。それぞれの場合において、本発明の抗体等は、当業者に一般的に知られている検出用標識（例えば、蛍光、酵素、など）を用いて検出することができる。
本発明の抗体等はまた、Tim-3抗原に対して結合性を有し、がん細胞に対する傷害性を有する免疫細胞（特にT細胞）を活性化する、という特徴に基づき、本発明の抗体等の、被験体におけるがん細胞に対する細胞傷害性を測定するために使用することができる。このような被験体におけるがん細胞に対する細胞傷害性の亢進を予測するための方法としては、以下の工程：
被験体から採取されたがん細胞を、培養条件下（すなわち、in vitro）において本発明の抗体等と接触させる工程、
培養条件下で、がん細胞の細胞生存率が低下するかどうかを測定する工程、若しくは免疫活性化物質の分泌が亢進するかどうかを測定する工程、
を含む、本発明の抗体等を用いてがん細胞に対する細胞傷害性の亢進を予測する方法を例として挙げることができる。
被験体から採取されたがん細胞を、培養条件下（すなわち、in vitro）において本発明の抗体等と接触させる工程、
培養条件下で、がん細胞の細胞生存率が低下するかどうかを測定する工程、若しくは免疫活性化物質の分泌が亢進するかどうかを測定する工程、
を含む、本発明の抗体等を用いてがん細胞に対する細胞傷害性の亢進を予測する方法を例として挙げることができる。
ここで、測定対象である免疫活性化物質の分泌という場合、T細胞から分泌されるサイトカインを測定することにより調べることができ、IL-2、IFN-γ、TNFαの分泌を測定することにより調べることができるができる。好ましくは、IFN-γを測定する。
生体内において、リンパ球により、がん細胞の細胞生存率の低下が生じる。この現象を利用して、本発明の一態様において、被験体から採取されたがん細胞を、in vitroにおいて本発明の抗体等と接触させ、培養条件下で、細胞生存率が低下するかどうかを測定することにより、がん細胞に対する細胞傷害性を調べることができる。より具体的には、被検体から採取されたがん細胞を、同一被験体の末梢血リンパ球の存在下で、本発明の抗体等と接触させ、培養条件下（すなわち、in vitro）においてがん細胞の細胞生存率が低下するかどうかを測定することにより、本発明の抗体等をその被験体に投与した場合の、被験体内（in vivo）でのがん細胞への細胞傷害性の亢進を予測することができる。
生体内において、リンパ球からの免疫活性化物質の分泌が亢進されると、T細胞が活性化されたり、腫瘍が縮小したりする現象が知られており、がん細胞に対するがん免疫が活性化されると考えられている。この現象を利用して、本発明の一態様において、被験体から採取されたがん細胞を、in vitroにおいて本発明の抗体等と接触させ、培養条件下で、免疫活性化物質の分泌が亢進するかどうかを測定することにより、がん細胞に対する細胞傷害性を調べることができる。より具体的には、被検体から採取されたがん細胞を、同一被験体の末梢血リンパ球の存在下で本発明の抗体等と接触させ、培養条件下（すなわち、in vitro）において末梢血リンパ球からの免疫活性化物質の分泌が亢進されるかどうかを測定することにより、本発明の抗体等をその被験体に投与した場合の、被験体内（in vivo）において細胞傷害性を有するリンパ球などの免疫細胞の活性化や、その結果として生じるがん細胞に対する細胞傷害性の亢進を予測することができる。
この態様において、がん細胞への細胞傷害性を判断するために測定する免疫活性化物質としては、IFN-γ、TNFαなどを例として挙げることができる。IFNγはNK細胞などの免疫細胞を活性化し、抗腫瘍効果を発揮させることが知られている。
本発明はまた、本発明の抗体等を含む、被験体から採取されたがん細胞に対する細胞傷害性、免疫活性化物質の分泌、若しくは免疫細胞の活性化を、in vitroにおいて測定するための測定キットもまた提供することができる。
細胞傷害性を測定するための測定キットには、本発明の抗体等に加えて、公知の細胞増殖性を測定するための手段（例えば、チミジンの取り込み、BrdUの取り込み、遊離の乳酸脱水素酵素（LDH）活性の測定、生細胞由来物質の測定（還元酵素活性、エステラーゼ活性、ATPなど）を含むことができる。
免疫活性化物質の分泌を測定するための測定キットには、本発明の抗体等に加えて、測定する免疫活性化物質の検出のための手段（例えば、免疫活性化物質に対する一次抗体と当該一次抗体の検出のための二次抗体など）を含むことができる。
免疫細胞の活性化を測定するための測定キットには、本発明の抗体等に加えて、フローサイトメーターで免疫細胞の分裂を測定するための標識試薬を含むことができる。
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示す。下記に示す実施例はいかなる方法によっても本発明を限定するものではない。
実施例1：抗ヒトTim-3モノクローナル抗体の作製
本実施例において、ヒトTim-3を免疫したマウスの脾臓から抗体の遺伝子を取得し、ファージディスプレイ法を用いて、ヒトTim-3に特異的に結合するモノクローナル抗体を作製した。
本実施例において、ヒトTim-3を免疫したマウスの脾臓から抗体の遺伝子を取得し、ファージディスプレイ法を用いて、ヒトTim-3に特異的に結合するモノクローナル抗体を作製した。
マウス（MRL/lpr）に、リコンビナントヒトTim-3（rhTim-3-His：SinoBological、0390-H08H）およびヒトTim-3抗原（Accession No. JX049979.1）一過性発現Expi293細胞を免疫し、血清抗体価の上昇を確認して、脾臓を回収した。
免疫マウスの脾臓からtotal RNAを抽出し、cDNAに変換して抗体遺伝子配列（VH及びVκ）をPCRで増幅した。増幅されたVH遺伝子とVκ遺伝子のPCR増幅産物を、リンカー（GGGGS×4）でつないでsingle chain Fv（以下scFv）とし、pTZ19R由来のPhagemid（ThermoFisher Sceintific）に挿入した。scFv挿入Phagemidは、大腸菌DH12S株(ThermoFisher Sceintific）に形質転換し、さらにヘルパファージ（M13KO7, New England Biolabs）を感染させてscFvファージライブラリー（サイズ：約1×108種類）を作製した。
scFv抗体ファージライブラリーは、リコンビナントヒトTim-3によるパニングを実施し、パニング後のファージを感染させた大腸菌はIPTG誘導によりscFvを発現させ、ヒトTim-3（Accession No. JX049979.1）安定発現Jurkat細胞に特異的に結合するscFvクローンをスクリーニングした。
続いて、スクリーニングで陽性だったscFvについて塩基配列を決定し、リンカーで改変型の抗体Fc領域（IgG1のFc領域にL234A変異とL235A変異とを持つFc-LALA）とつないだscFv-Fc-LALA型の抗体もしくはIgG1のFc領域にLALA（L234A変異とL235A変異）を導入したIgG1-LALA型のIgG1抗体の形状で、ExpiCHO細胞（Thermo Fisher Scientific）に発現させ、Protein Aカラムを使用してアフィニティー精製した。
実施例2：エピトープビニング
本実施例において、実施例1において取得した抗体についてエピトープビニングを実施して、本発明の抗ヒトTim-3抗体をエピトープ部位からグループ分けし、その競合関係の確認を行った。
本実施例において、実施例1において取得した抗体についてエピトープビニングを実施して、本発明の抗ヒトTim-3抗体をエピトープ部位からグループ分けし、その競合関係の確認を行った。
エピトープビニングは、Biacore8K（Cytiva）を使用し、表面プラズモン共鳴（SPR）による分子間相互作用解析により解析した。Ni-NTA Sensor chipに、市販のリコンビナントヒトTim-3（SinoBological、10390-H08H）をキャプチャーし、実施例1において得られたscFv-Fc-LALA型のモノクローナル抗体（1次抗体）を飽和するまで結合させた。続いて、実施例1において得られた1次抗体とは別のscFv-Fc-LALA型のモノクローナル抗体（2次抗体）を結合させ、その結合反応の有無を判定した。
図1にエピトープビニングの結果を示す。この図に示すように、抗体間の競合・非競合の結果により、試験した抗体はGroup 1からGroup 5に分類できた。これらの分類された抗体のうち、Group 2の抗体とGroup 4の抗体は競合せず、またGroup 2の抗体とGroup 5の抗体は競合しないことが明らかになった。すなわち、この結果から、Group 4およびGroup 5の抗体は、Group 2の抗体であるCh003抗体のEpitope部位と競合せず、したがってバイパラトピック抗体を形成する際の組み合わせとして使用できることが明らかになった。
これらの抗体の中から、Group 2のCh003抗体、Group 5のCh149抗体、Ch428抗体、Ch621抗体を選択した。それぞれの抗体のCDR（重鎖および軽鎖のCDR1～CDR3）は以下の通りの配列であった（表１）。
また、これらの抗体のVH領域およびVL領域のアミノ酸配列は、以下の通りであった（下線はCDRの配列を示す）。
Ch003抗体：
VH領域：EVMLMESGGG LVKLGGSLKL SCAASGFTFS SYYMSWVRQT PEKRLEWVAT ISNSGGSIYY LDSVKDRFTI SRDNAKNTLY LQMSSLNSED TAVYYCARDP YYSNYVPMDY WGQGTSVTVS S（SEQ ID NO: 7）
VL領域：SIVMTQTPKF MSTSVGDRVS VTCKASQYVD TYVAWYQQKP GQSPKPLIYS ASTRHTGVPA RFTGSGSGTD FTLTISNVQS EDLAEYFCAQ YSSSPLTFGA GTKLELK（SEQ ID NO: 8）
Ch149抗体：
VH領域：QVQLQQSGPE RVKPGDSVKM SCKASGYTFT DYYMDWVKQS HGKSLEWIGY IYPNNGGTSY NQKFKGKATL TVDKSSSTAY MELHSLTSED SAVYYCARSG YGNYYTMDYW GQGTSVTVSA（SEQ ID NO: 15）
VL領域：SIVMTQTPKF MPVSAGDRVT MTCKASQSVG NNVAWYQQKP GQSPKLLIYY ASNRYTGVPD RFTGSGSGTD FTFTISSVQV EDLAVYFCQQ HYSSPSTFGT GTKLEIK（SEQ ID NO: 16）
Ch428抗体：
VH領域：QVQLQQSGPE LVKPGDSVKM SCKASGYTFT DYYMDWVKQS HGKSLEWIGY IYPNNGGTSY NQKFKGKATL TVDKSSSTAY MELHSLTSED SAVYYCARGG YYSYYSYDYW GQGTTLTVSS（SEQ ID NO: 23）
VL領域：SIVMTQTPKF LPVSAGDRVT MTCKASQSVG NNVAWYQQKP GQSPKLLIYY ASNRYTGVPD RFTGSGSGTD FTFTISSVQV EDLAVYFCQQ HYSSPYTFGT GTKLEIK（SEQ ID NO: 24）
Ch621抗体：
VH領域：QIQLQQSGPE LVKPGDSVKM SCKASGYTFT DYYMDWVKQS HGKSLEWIGY IYPNNGGTSY NQKFKGKATL TVDKSSSTAY MELHSLTSED SAVYYCARSG YKAYYAMDYW GQGTTLTVSS（SEQ ID NO: 31）
VL領域：SIVMTQTPKF LPVSAGDRVT MTCKASQSVG NNVAWYQQKP GQSPKLLIYY ASNRYTGVPD RFTGSGSGTD FTFTISSVQV EDLAVYFCQQ HYSSPYTFGS GTKLEIK（SEQ ID NO: 32）
Ch003抗体：
VH領域：EVMLMESGGG LVKLGGSLKL SCAASGFTFS SYYMSWVRQT PEKRLEWVAT ISNSGGSIYY LDSVKDRFTI SRDNAKNTLY LQMSSLNSED TAVYYCARDP YYSNYVPMDY WGQGTSVTVS S（SEQ ID NO: 7）
VL領域：SIVMTQTPKF MSTSVGDRVS VTCKASQYVD TYVAWYQQKP GQSPKPLIYS ASTRHTGVPA RFTGSGSGTD FTLTISNVQS EDLAEYFCAQ YSSSPLTFGA GTKLELK（SEQ ID NO: 8）
Ch149抗体：
VH領域：QVQLQQSGPE RVKPGDSVKM SCKASGYTFT DYYMDWVKQS HGKSLEWIGY IYPNNGGTSY NQKFKGKATL TVDKSSSTAY MELHSLTSED SAVYYCARSG YGNYYTMDYW GQGTSVTVSA（SEQ ID NO: 15）
VL領域：SIVMTQTPKF MPVSAGDRVT MTCKASQSVG NNVAWYQQKP GQSPKLLIYY ASNRYTGVPD RFTGSGSGTD FTFTISSVQV EDLAVYFCQQ HYSSPSTFGT GTKLEIK（SEQ ID NO: 16）
Ch428抗体：
VH領域：QVQLQQSGPE LVKPGDSVKM SCKASGYTFT DYYMDWVKQS HGKSLEWIGY IYPNNGGTSY NQKFKGKATL TVDKSSSTAY MELHSLTSED SAVYYCARGG YYSYYSYDYW GQGTTLTVSS（SEQ ID NO: 23）
VL領域：SIVMTQTPKF LPVSAGDRVT MTCKASQSVG NNVAWYQQKP GQSPKLLIYY ASNRYTGVPD RFTGSGSGTD FTFTISSVQV EDLAVYFCQQ HYSSPYTFGT GTKLEIK（SEQ ID NO: 24）
Ch621抗体：
VH領域：QIQLQQSGPE LVKPGDSVKM SCKASGYTFT DYYMDWVKQS HGKSLEWIGY IYPNNGGTSY NQKFKGKATL TVDKSSSTAY MELHSLTSED SAVYYCARSG YKAYYAMDYW GQGTTLTVSS（SEQ ID NO: 31）
VL領域：SIVMTQTPKF LPVSAGDRVT MTCKASQSVG NNVAWYQQKP GQSPKLLIYY ASNRYTGVPD RFTGSGSGTD FTFTISSVQV EDLAVYFCQQ HYSSPYTFGS GTKLEIK（SEQ ID NO: 32）
実施例3：モノクローナル抗体の結合性解析
本実施例においては、実施例1で作製され、実施例2で選択されたモノクローナル抗体に関して、結合性解析を行った。
本実施例においては、実施例1で作製され、実施例2で選択されたモノクローナル抗体に関して、結合性解析を行った。
（3-1）結合親和性解析
まず、抗体として、実施例1において作製したIgG1_LALA型抗体（Ch003-LA）、scFv_Fc_LALA型抗体（Ch003_sc抗体、Ch149_sc抗体、Ch428_sc抗体、Ch621_sc抗体）を使用し、リコンビナントヒトTim-3に対する結合解析を行った。
まず、抗体として、実施例1において作製したIgG1_LALA型抗体（Ch003-LA）、scFv_Fc_LALA型抗体（Ch003_sc抗体、Ch149_sc抗体、Ch428_sc抗体、Ch621_sc抗体）を使用し、リコンビナントヒトTim-3に対する結合解析を行った。
これらの抗体のヒトTim-3への結合親和性は、Biacore8Kを使用し、表面プラズモン共鳴（SPR）による相互作用解析で測定した。抗ヒトTim-3抗体は抗ヒトIgG抗体を固定化したセンサーチップにキャプチャーし（Cytiva、cat#29234600）、リコンビナントヒトTim-3（rhTim-3-His：SinoBological、10390-H08H）をアナライトとした。表面プラズモン共鳴により得られたそれぞれの抗体のヒトTim-3に対する結合速度定数（ka）および解離速度定数（kd）に基づいて、解離定数（KD＝kd／ka）を算出した。
表2に結果を示す。本発明のモノクローナル抗体は、リコンビナントヒトTim-3に対して下記の解離定数（KD値）で結合したことが示された。
（3-2）ヒトTim-3結合解析
次に、実施例1において作製し、実施例2において選択したモノクローナル抗体に関して、ヒトTim-3安定発現Jurkat細胞もしくはヒトTim-3一過性発現Expi293細胞を使用した結合解析を行った。
次に、実施例1において作製し、実施例2において選択したモノクローナル抗体に関して、ヒトTim-3安定発現Jurkat細胞もしくはヒトTim-3一過性発現Expi293細胞を使用した結合解析を行った。
抗体として、実施例1において作製したscFv_Fc_LALA型抗体（Ch003_sc抗体、Ch149_sc抗体、Ch428_sc抗体、Ch621_sc抗体）を使用した。陰性対照として、アイソタイプコントロール抗体を使用した。
結合解析は次のように実施した。ヒトTim-3発現細胞は、ヒトTim-3発現安定Jurkat細胞もしくはヒトTim-3一過性発現Expi293細胞とも、2×105 cells/wellで96 well V底プレートに分取し、200μlのPBS（-）で1回洗浄した。死細胞染色としてPBS（-）で500～1000倍希釈したZombie NIRTM dye（Biolegend、423106）、50μlを添加し、室温で15分間染色した。その後、PBS（-）で20倍希釈したHuman TruStain FcX（Biolegend、422302）を50μl添加して室温で20分間処理し、染色用バッファー［PBS（-）、1％BSA、0.09％NaN3］で1回洗浄した。
次に、染色用バッファーで抗ヒトTim-3抗体とアイソタイプコントロール抗体の希釈系列を10倍希釈5段階で調整し、100μl/wellずつ細胞に添加した。4℃、1時間静置後、染色用バッファーで1回洗浄し、染色用バッファーで500倍希釈した2次抗体（PE-Goat Anti-human IgG/Jackson Immuno Research Laboratories、109-116-170）を100μl/wellずつ細胞に添加した。4℃、30分間静置後、染色用バッファーで2回洗浄し、固定用バッファー（Biolegend、420801）を50μl添加し、室温20分静置して固定化した。染色細胞は染色用バッファーに懸濁し、フローサイトメーターで解析した。結果から抗体濃度に対応する平均蛍光強度（MFI）をプロットし、KD値を算出した。
フローサイトメトリーでの解析結果を図2に、そしてそのデータに基づいて算出された各抗体の解離定数KD（nM）を表3に、それぞれ示す。本発明のモノクローナル抗体は、細胞膜上に発現しているヒトTim-3に対して特異的に結合したことが示された。
（3-3）活性化T細胞結合解析
さらに、実施例1において作製し、実施例2において選択した本発明の抗ヒトTim-3モノクローナル抗体の、活性化T細胞膜上のヒトTim-3への結合をフローサイトメトリーで解析した。
さらに、実施例1において作製し、実施例2において選択した本発明の抗ヒトTim-3モノクローナル抗体の、活性化T細胞膜上のヒトTim-3への結合をフローサイトメトリーで解析した。
抗体として、実施例1において作製したscFv_Fc_LALA型抗体（Ch003_sc抗体、Ch149_sc抗体、Ch428_sc抗体、Ch621_sc抗体）を使用した。陰性対照として、アイソタイプコントロール抗体を使用した。
活性化T細胞は次のように調製した。健常人ボランティアから採取した末梢血単核球（PBMC）１×107 cellsからPan T cells isolation Kit、human（Miltenyi biotec、130-096-535）を使用し、T細胞を単離した。T細胞は10％FCS、100 unit/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン添加RPMI-1640培地に1×106 cells/mlで懸濁し、DynabeadsTM Human T-Activator CD3/CD28（VERITAS、DB11132）を1：1で添加し、37℃、5％CO2の条件下で4日間培養した。
結合解析は次のように実施した。活性化T細胞は1×105 cells/wellで96 well V底プレートに分取し、200μlのPBS（-）で1回洗浄した。死細胞染色としてPBS（-）で500～1000倍希釈したZombie VioletTM Dye（Biolegend、423114）50μlを添加し、室温で15分間染色した。その後、PBS（-）で20倍希釈したHuman TruStain FcXを50μl添加して室温で20分間処理し、染色用バッファーで1回洗浄した。
。
。
次に、染色用バッファーで抗Tim-3抗体とアイソタイプコントール抗体の希釈系列を10倍希釈5段階で調整し、100μl/wellずつ細胞に添加した。4℃、1時間静置後、染色用バッファーで1回洗浄し、染色用バッファーで適宜希釈した2次抗体（PE-Goat Anti-human IgG）およびT細胞マーカー染色抗体（Biolegend、anti-CD3:UCHT1、anti-CD4:RPA-T4、anti-CD8a:HIT8a）を100μl/wellずつ細胞に添加した。4℃、30分間静置後、染色用バッファーで2回洗浄し、固定用バッファーを50μl添加し、室温20分静置して固定化した。染色細胞は染色用バッファーに懸濁し、フローサイトメーターで解析した。
解析結果から抗体濃度に対応する平均蛍光強度（MFI）をプロットし、KD値を算出した。
フローサイトメトリーでの解析結果を図3に、そしてそのデータに基づいて算出した各抗体の解離定数KD（nM）を表4に、それぞれ示す。本発明のモノクローナル抗体は、プライマリーT細胞に発現しているヒトTim-3に対して特異的に結合した。
実施例4：モノクローナル抗体のリガンド結合阻害活性
本実施例においては、実施例1で作製され、実施例2で選択されたモノクローナル抗体に関して、機能解析することを目的として実験を行った。
本実施例においては、実施例1で作製され、実施例2で選択されたモノクローナル抗体に関して、機能解析することを目的として実験を行った。
（4-1）Galectin-9結合阻害
実施例1において作製し、実施例2において選択した本発明の抗ヒトTim-3抗体の、ヒトTim-3とヒトGalectin-9の結合阻害能をELISAで解析した。
実施例1において作製し、実施例2において選択した本発明の抗ヒトTim-3抗体の、ヒトTim-3とヒトGalectin-9の結合阻害能をELISAで解析した。
抗体として、実施例1において作製したscFv_Fc_LALA型抗体（Ch003_sc抗体、Ch149_sc抗体、Ch428_sc抗体、Ch621_sc抗体）を使用した。陰性対照として、アイソタイプコントロール抗体を使用した。
ヒトGalectin-9（R&D Systems、2045-GA）は50 mM Carbonate Buffer、pH9.4で2.5μg/mlに調整し、50μl/wellで96 well ELISA plate（Corning、9018）に添加し、4℃で一晩静置した。翌日、プレートは洗浄用バッファー［PBS（-）、0.1％Tween20］で3回洗浄し、室温で2時間ブロッキングした（Nacalai Tesque、Blocking One:0395395）。
ブロッキングの間に、結合用バッファー［PBS（-）、0.05％Tween20、1/5 vol. Blocking One］で抗ヒトTim-3抗体を4倍希釈系列7段階、ビオチン化ヒトTim-3-Fc抗原（社内調製品、SEQ ID NO: 86）を200 ng/mlに調整し、1：1で混合して室温で1時間静置した。ブロッキング後のプレートに抗原・抗体混合液を50μl/wellで添加し、室温で1時間静置した。
次に、plateは洗浄用バッファーで3回洗浄し、結合用バッファーで15000倍に希釈したStreptavidin-HRP（Abcam、ab7403）を50μl/wellで添加し、室温で30分間静置した。その後、プレートは洗浄用バッファーで3回洗浄し、TMB+（Dako、S1599）を50μl/wellで添加し、室温で10分間静置した。最後に、0.5N硫酸を50μl/wellで添加し、発色を停止させ、450 nMの吸光度を測定した。
図4に、抗体のヒトGalectin-9への結合（％）の結果を示す。本発明で作製したモノクローナル抗体はいずれも、ヒトTim-3とヒトGalectin-9の結合を完全に阻害することはできなかったが、最大阻害率は69.5％から77.0％（具体的には、Ch003_scで69.5％、Ch149_scで76.1％、Ch428_scで77.0％、Ch621_scで74.0％）と高い阻害活性を有することが示された。
（4-2）Phosphatidylserine結合阻害
次に、実施例1において作製し、実施例2において選択した本発明の抗ヒトTim-3抗体の、ヒトTim-3とPhosphatidylserineの結合阻害能をフローサイトメトリーで解析した。
次に、実施例1において作製し、実施例2において選択した本発明の抗ヒトTim-3抗体の、ヒトTim-3とPhosphatidylserineの結合阻害能をフローサイトメトリーで解析した。
抗体として、実施例1において作製したscFv_Fc_LALA型抗体（Ch003_sc抗体、Ch149_sc抗体、Ch428_sc抗体、Ch621_sc抗体）を使用した。陰性対照として、アイソタイプコントロール抗体を使用した。
Jurkat細胞を10％FCS、100 unit/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン添加RPMI-1640培地で5×105 cell/mlに調整し、アポトーシス誘導を起こすため、Anti-Fas (CD95) mAb（MBL、SY-001）を100 ng/mlで添加し、37℃インキュベーターで3時間反応させた。
アポトーシス誘導の間に、Annexin V結合用バッファー（Biolegend）で抗ヒトTim-3抗体を7段階希釈系列、ビオチン化ヒトTim-3-Fc抗原を8μg/mlに調整し、1:1で混合して室温で1時間静置した。
アポトーシス誘導後の細胞は96 well V底プレートに分取し、PBS（-）で洗浄後、PBS（-）で1000倍希釈したZombie VioletTM Dye 50μlを添加し、室温で15分静置した。PBS（-）で一度洗浄後、Annexin V結合用バッファーで20倍希釈したHuman TruStain FcX 50μl/wellを添加し、室温で10分静置した。
次に、抗原・抗体混合液を50μl/wellで添加し、室温で30分静置した。その後、Annexin V結合用バッファーで1回洗浄し、PE-Streptavidin(Biolegend、405204）0.3μl/1×106 cellsをAnnexin V結合用バッファーで調整して50μl添加し、室温で15分間静置した。
その後、Annexin V結合用バッファーで1回洗浄し、APC-Annexin V（Biolegend、640920）を2μl/1×106 cellsとなるようにAnnexin V結合用バッファー（Biolegend）で調整して100μl添加し、4℃で15分間静置した。最後にAnnexin V結合用バッファーを200μl添加して、フローサイトメーターで解析を行った。
フローサイトメトリーでの解析結果を図5に、この解析結果に基づいて算出されたそれぞれの抗体のIC50値（nM）を表5に、それぞれ示す。本発明で作製したモノクローナル抗体において、Ch003_sc抗体はヒトTim-3とPhosphatidylserineの結合をほぼ完全に阻害した。Ch149_sc抗体、Ch428_sc抗体、Ch621_sc抗体は部分阻害であった。実施例2におけるエピトープビニングの結果から、Group 2に属するCh003抗体と、Group 5に属するCh149抗体、Ch428抗体、およびCh621抗体が競合しないエピトープ部位を標的としていることを示したが、本実施例の結果は、それぞれの抗体のエピトープ部位と機能とのあいだでの相関関係を示している。
実施例5：抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体の作製
本実施例において、実施例1で作製し、実施例2で選択したモノクローナル抗体に基づいて、ヒトTim-3に結合するバイパラトピック抗体を作製した。
本実施例において、実施例1で作製し、実施例2で選択したモノクローナル抗体に基づいて、ヒトTim-3に結合するバイパラトピック抗体を作製した。
実施例1のスクリーニングで陽性だったscFvのうち、実施例2で示したようにTim-3への結合で競合しないGroup 2のCh003抗体、Group 5のCh149抗体、Ch428抗体、Ch621抗体を選択し、Knob-into-Hole（US7183076B2）の技術を使用し、Group 2のCh003抗体についてはFc部分をKnob型とし、C末端にC-tagを付加した。Group 5のCh149抗体、Ch428抗体、Ch621抗体についてはFc部分をHole型とし、2種類の抗体をコードする2種類のDNAをベクターに挿入した。すなわち、Ch003抗体をコードするDNAとCh149抗体をコードするDNAとの組み合わせ、Ch003抗体をコードするDNAとCh428抗体をコードするDNAとの組み合わせと、Ch003抗体をコードするDNAとCh621抗体をコードするDNAとの組み合わせで発現ベクターを調製した。これらの発現ベクターのそれぞれをExpiCHO細胞（Thermo Fisher Scientific）にトランスフェクションして発現させ、細胞内でscFv-Fcのヘテロダイマーのバイパラトピック抗体として産生させた。
バイパラトピック抗体は、抗C-tagカラムを使用し、直接精製した。
この結果、Ch149003ct抗体（Ch149抗体半分子とCh003抗体半分子の組み合わせ）、Ch428003ct抗体（Ch428抗体半分子とCh003抗体半分子の組み合わせ）、Ch621003ct抗体（Ch621抗体半分子とCh003抗体半分子の組み合わせ）が得られた。
実施例6：バイパラトピック抗体の結合性解析
本実施例において、実施例5で作製された本発明の抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体に関して、結合性解析することを目的として実験を行った。
本実施例において、実施例5で作製された本発明の抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体に関して、結合性解析することを目的として実験を行った。
（6-1）結合親和性解析
まず、抗体として、実施例6において作製したバイパラトピック抗体（Ch149003ct抗体、Ch428003ct抗体、Ch621003ct抗体）を使用し、リコンビナントヒトTim-3に対する結合解析を行った。
まず、抗体として、実施例6において作製したバイパラトピック抗体（Ch149003ct抗体、Ch428003ct抗体、Ch621003ct抗体）を使用し、リコンビナントヒトTim-3に対する結合解析を行った。
これらのバイパラトピック抗体のヒトTim-3への結合親和性の解析は、使用する抗体をバイパラトピック抗体（Ch149003ct抗体、Ch428003ct抗体、Ch621003ct抗体）とした以外は、実施例3（3-1）に記載した方法と同じ方法で行った。
表6に結果を示す。本発明のバイパラトピック抗体は、オリジナルのモノクローナル抗体（実施例3（3-1）表2）と比較して、結合親和性が向上した。これは、バイパラトピック抗体がアナライトに2か所で結合できており、Avidity効果が得られたためであり、この結果から、バイパラトピック抗体の作製に成功したことが確認された。
（6-2）ヒトTim-3結合解析
次に、実施例5において作製した本発明の抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体（Ch149003ct抗体、Ch428003ct抗体、Ch621003ct抗体）を使用して、ヒトTim-3安定発現Jurkat細胞もしくはヒトTim-3一過性発現Expi293細胞を使用した結合解析を行った。
次に、実施例5において作製した本発明の抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体（Ch149003ct抗体、Ch428003ct抗体、Ch621003ct抗体）を使用して、ヒトTim-3安定発現Jurkat細胞もしくはヒトTim-3一過性発現Expi293細胞を使用した結合解析を行った。
これらのバイパラトピック抗体のヒトTim-3への結合親和性の解析は、使用する抗体をバイパラトピック抗体（Ch149003ct抗体、Ch428003ct抗体、Ch621003ct抗体）とした以外は、実施例3（3-2）に記載した方法と同じ方法で行った。比較対照として、実施例3（3-2）で結合解析を行ったCh003_sc抗体を使用した。
フローサイトメトリーでの解析結果を図6に、そしてそのデータに基づいて算出された各抗体の解離定数KD（nM）を表7に、それぞれ示す。本発明のバイパラトピック抗体は、実施例3のモノクローナル抗体と同様に、細胞膜上に発現しているヒトTim-3に対して特異的に結合した。また、バイパラトピック抗体は、オリジナルのモノクローナル抗体と比較して、飽和結合のMFIが上昇した。これは、バイパラトピック抗体が細胞膜上の抗原1分子に1分子で結合する一方、モノクローナル抗体は細胞膜上の抗原2分子に1分子で結合しているためと考えられる。実施例6（6-1）と同様にこの結果からも、バイパラトピック抗体の作製に成功したことが確認された。
（6-3）さらに、実施例5において作製した本発明の抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体（Ch149003ct抗体、Ch428003ct抗体、Ch621003ct抗体）の、活性化T細胞膜上のヒトTim-3への結合をフローサイトメトリーで解析した。
これらのバイパラトピック抗体のヒトTim-3への結合親和性の解析は、使用する抗体をバイパラトピック抗体（Ch149003ct抗体、Ch428003ct抗体、Ch621003ct抗体）とした以外は、実施例3（3-3）に記載した方法と同じ方法で行った。比較対照として、実施例3（3-3）で結合解析を行ったCh003_sc抗体を使用した。
フローサイトメトリーでの解析結果を図7に、そしてそのデータに基づいて算出した各抗体の解離定数KD（nM）を表8に、それぞれ示す。本発明のバイパラトピック抗体は、実施例3（3-3）において結合性が示された本発明のモノクローナル抗体と同様に、プライマリーT細胞に発現しているヒトTim-3に対して特異的に結合した。また、バイパラトピック抗体は、オリジナルのモノクローナル抗体と比較して、飽和結合のMFIが上昇した。この結果から、プライマリー細胞においても本発明で作製したバイパラトピック抗体は機能していることが示された。
実施例7：バイパラトピック抗体のリガンド結合阻害活性
本実施例においては、実施例5で作製されたバイパラトピック抗体に関して、機能解析することを目的として実験を行った。
本実施例においては、実施例5で作製されたバイパラトピック抗体に関して、機能解析することを目的として実験を行った。
（7-1）Galectin-9結合阻害
実施例5において作製した本発明の抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体（Ch149003ct抗体、Ch428003ct抗体、Ch621003ct抗体）の、ヒトTim-3とヒトGalectin-9の結合阻害能をELISAで解析した。
実施例5において作製した本発明の抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体（Ch149003ct抗体、Ch428003ct抗体、Ch621003ct抗体）の、ヒトTim-3とヒトGalectin-9の結合阻害能をELISAで解析した。
これらのバイパラトピック抗体のヒトTim-3とヒトGalectin-9の結合阻害活性の確認は、使用する抗体をバイパラトピック抗体（Ch149003ct抗体、Ch428003ct抗体、Ch621003ct抗体）とした以外は、実施例4（4-1）に記載した方法と同じ方法で行った。比較対照として、実施例4（4-1）で結合解析を行ったCh003_sc抗体を使用した。
抗体のヒトGalectin-9への結合（％）の結果を図8に、この解析結果に基づいて算出されたそれぞれのバイパラトピック抗体のIC50値（nM）を表9に、それぞれ示す。本発明で作製したバイパラトピック抗体は、ヒトTim-3とヒトGalectin-9の結合を90％以上阻害することができた。この結果から、本発明で作製したバイパラトピック抗体は、本発明のモノクローナル抗体よりも強く、ヒトTim-3とヒトGalectin-9の結合を阻害できる抗体であることが示された。
（7-2）Phosphatidylserine結合阻害
次に、実施例5において作製した本発明の抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体（Ch149003ct抗体、Ch428003ct抗体、Ch621003ct抗体）の、ヒトTim-3とPhosphatidylserineの結合阻害能をフローサイトメトリーで解析した。
次に、実施例5において作製した本発明の抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体（Ch149003ct抗体、Ch428003ct抗体、Ch621003ct抗体）の、ヒトTim-3とPhosphatidylserineの結合阻害能をフローサイトメトリーで解析した。
これらのバイパラトピック抗体のヒトTim-3とPhosphatidylserineの結合阻害活性の確認は、使用する抗体をバイパラトピック抗体（Ch149003ct抗体、Ch428003ct抗体、Ch621003ct抗体）とした以外は、実施例4（4-2）に記載した方法と同じ方法で行った。比較対照として、実施例4（4-2）で結合解析を行ったCh003_sc抗体を使用した。
フローサイトメトリーでの解析結果を図9に、この解析結果に基づいて算出されたそれぞれの抗体のIC50値（nM）を表10、それぞれ示す。本発明のバイパラトピック抗体は、実施例4（4-2）で示したCh003_sc抗体と比較して、IC50値は2倍程度上昇するものの、ヒトTim-3とPhosphatidylserineの結合をほぼ完全に阻害できた。
実施例7（7-1）および（7-2）の結果から、本発明で作製したバイパラトピック抗体は、ヒトTim-3のリガンドであるヒトGalectin-9およびPhosphatidylserineの結合を同時に強く阻害する抗体であることが示された。
実施例8：末梢血単核球（PBMC）の黄色ブドウ球菌エンテロトキシンB（SEB）刺激アッセイ
本実施例において、実施例1において作製した本発明の抗ヒトTim-3モノクローナル抗体および実施例5において作製した本発明の抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体の、ヒト末梢血T細胞活性化に対する影響を黄色ブドウ球菌エンテロトキシンB（SEB）による末梢血単核球（PBMC）の活性化で評価した。
本実施例において、実施例1において作製した本発明の抗ヒトTim-3モノクローナル抗体および実施例5において作製した本発明の抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体の、ヒト末梢血T細胞活性化に対する影響を黄色ブドウ球菌エンテロトキシンB（SEB）による末梢血単核球（PBMC）の活性化で評価した。
抗体として、実施例1において作製したscFv_Fc_LALA型抗体（Ch003_sc抗体、Ch149_sc抗体、Ch428_sc抗体、Ch621_sc抗体）、そして実施例5で作製したバイパラトピック抗体（Ch149003ct抗体、Ch428003ct抗体、Ch621003ct抗体）を使用した。陰性対照として、アイソタイプコントロール抗体を使用した。
健常人ボランティア血液から採取したPBMCを、10％FCS、100 unit/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、1×GlutaMax（Gibco、35050-061）添加RPMI-1640培地に懸濁し、96 well U底プレートに0.7～0.8×105 cells/wellで播種した。抗ヒトTim-3抗体を最終濃度10μg/mlになるように添加し、37℃、5％CO2の条件下でPBMCと30分間反応させた。その後、SEB（Toxin Technology Inc.、BT202RED）を最終濃度1 ng/mlとなるよう添加し、37℃、5％CO2の条件下で10日間培養した。
培養10日目にBrefeldin A（Biolegend）を最終濃度1×となるように、SEBを最終濃度10ng/mlとなるように添加し、ピペッティングにて混合し、8時間さらに培養した。その後、細胞を96 well V底プレートに回収し、200μlのPBS（-）で1回洗浄した。死細胞染色としてPBS（-）で500～1000倍希釈したZombie-NIRTM（Biolegend）を50μl添加し、室温で15分間染色した。その後、PBS（-）で20倍希釈したHuman TruStain FcX（Biolegend）を50μl添加して室温で20分間処理した。
次に、テスト抗体と競合しないビオチン化抗ヒトTim-3抗体（社内調製品）を染色用バッファーで1μg/mlに希釈し、50μlを添加して4℃で30分間、静置した。染色用バッファーで1回洗浄後、T細胞マーカー染色抗体（Biolegend、anti-CD3:UCHT1、anti-CD4:RPA-T4、anti-CD8a:HIT8a）および蛍光標識したストレプトアビジンをを染色用バッファーで適宜希釈し、100μlずつ添加した。4℃で30分間、暗所で静置後、染色用バッファーで1回洗浄し、固定用バッファーを50μl添加し、室温20分静置して固定化した。次に、Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer（Bioleged）で2回洗浄し、IFN-γ染色抗体（Biolegend、anti-IFN-γ:B27）をIntracellular Staining Permeabilization Wash Bufferで適宜希釈し、100μlを添加して4℃で40分間、暗所で静置した。Intracellular Staining Permeabilization Wash Bufferで2回洗浄後、染色用バッファーに懸濁し、細胞数計測用のビーズ（ThermoFisher Scientific、C36950）を添加して、フローサイトメーターで解析した。
図10に、フローサイトメトリーでの解析結果を示す。ここで、CD4陽性・IFNγ陽性の細胞数の変動およびCD8陽性・IFNγ陽性の細胞数の変動を図10-1に、CD4陽性・IFNγ陽性細胞およびCD8陽性・IFNγ陽性細胞の細胞上のTim-3発現量（MFI値）をアイソタイプコントロールを100％、染色の陰性コントロールを0％として百分率で算出した結果を図10-2に、それぞれ示す。本発明で作製した抗ヒトTim-3モノクローナル抗体は、CD8陽性IFN-γ陽性細胞数を増幅した。さらにこの効果は、本発明のヒトTim-3バイパラトピック抗体でより増強された。このことから、ヒトTim-3に対してPhosphatidylserineの結合のみならず、ヒトGalectin-9の結合を阻害することにより、エフェクターT細胞の活性化が増強されることが示された。
実施例9：Galectin-9によるT細胞のアポトーシス誘導の抑制評価
本実施例において、本発明の抗ヒトTim-3モノクローナル抗体または抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体が、Galectin-9によるヒト末梢血T細胞のアポトーシス誘導を抑制するかを評価した。
本実施例において、本発明の抗ヒトTim-3モノクローナル抗体または抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体が、Galectin-9によるヒト末梢血T細胞のアポトーシス誘導を抑制するかを評価した。
健常人ボランティア血液から採取した末梢血単核球（PBMC）を、10％FCS、100 unit/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、1×GlutaMax（Gibco、35050-061）添加RPMI-1640培地に懸濁し、DynabeadsTM Human T-Activator CD3/CD28を1:1で加えて、4日間培養した。その後細胞は、96 well U底プレートに1.0×105 cells/wellで播種し、抗ヒトTim-3抗体を最終濃度10μg/mlになるように添加し、37℃、5％CO2の条件下で30分間反応させ、次にGalectin-9を最終濃度62.5 nMになるよう添加し、37℃、5％CO2の条件下で8時間培養した。
細胞を96 well V底プレートに回収し、200μlのPBS（-）で1回洗浄した。死細胞染色としてPBS（-）で500～1000倍希釈したZombie-NIRTM（Biolegend）を50μl添加し、室温で15分間染色した。その後、PBS（-）で20倍希釈したHuman TruStain FcX（Biolegend）を50μl添加して室温で20分間処理した。次に、テスト抗体と競合しないビオチン化抗ヒトTim-3抗体（社内調製品）を染色用バッファーで1μg/mlに希釈し、50μlを添加して4℃で30分間、静置した。染色用バッファーで1回洗浄後、T細胞マーカー染色抗体（Biolegend、anti-CD3:UCHT1、anti-CD4:RPA-T4、anti-CD8a:HIT8a）および蛍光標識したストレプトアビジンをを染色用バッファーで適宜希釈し、100μlずつ添加した。4℃で30分間、暗所で静置後、染色用バッファーで1回洗浄し、Annexin V結合用バッファー（Biolegend）でさらに洗浄した。次に蛍光標識したAnnexin V（Biolegend）をAnnexin V結合用バッファーで適宜希釈し、100μlずつ添加した。室温で15分間、暗所に静置後、Annexin V結合用バッファーで1回洗浄した。最後に、固定用バッファーを50μl添加し、室温20分静置して固定化し、染色用バッファーに懸濁してフローサイトメーターで解析した。
図11に結果を示す。本発明で作製した抗ヒトTim-3モノクローナル抗体は、Galctin-9によるT細胞のApoptosis誘導を抑制することが示された。さらにこの効果は、実施例5において作製したバイパラトピック抗体でより増強されており、CD4陽性T細胞においては、Galectin-9無添加条件と同レベルまで抑制し、添加したGalectin-9をすべて無効化した。また、CD8陽性T細胞においてはGalectin-9無添加条件よりさらに、Apoptosisを抑制しており、添加したGalectin-9の無効化のみならず、細胞から分泌されるGalectin-9も無効化している可能性が推察される。バイパラトピック抗体によるヒトTim-3とヒトGalctin-9の結合阻害の増強は、T細胞上においてもApoptosis誘導シグナルの抑制の増強として確認された。
実施例10：Ch003抗体のCDR最適化
本発明で取得した抗ヒトTim-3抗体Ch003抗体はVH及びVκのCDR配列の類似するバリエーションが複数得られたことから、本実施例において、重鎖可変領域に関してaからeの5種バリエーションと、軽鎖可変領域に関してA1、A2およびB2の3種のバリエーションとのすべての組み合わせで抗体をscFv-Fc-LALA型で作製し、もっとも結合親和性の高い組み合わせを決定した。
本発明で取得した抗ヒトTim-3抗体Ch003抗体はVH及びVκのCDR配列の類似するバリエーションが複数得られたことから、本実施例において、重鎖可変領域に関してaからeの5種バリエーションと、軽鎖可変領域に関してA1、A2およびB2の3種のバリエーションとのすべての組み合わせで抗体をscFv-Fc-LALA型で作製し、もっとも結合親和性の高い組み合わせを決定した。
表11にVH及びVκのCDR配列を、表12に各組合せのヒトTim-3に対する結合親和性KD値を示す。この結果、重鎖可変領域がd＆軽鎖可変領域がA1およびA2の組み合わせの場合、重鎖可変領域がe＆軽鎖可変領域がA1およびA2の組み合わせの場合に特に高い結合親和性を示すことが明らかになった（表12）。以下の実施例において、重鎖可変領域がd＆軽鎖可変領域がA1の場合の抗体をCh003_F20抗体として、重鎖可変領域がd＆軽鎖可変領域がB2の場合の抗体をCh072抗体として、使用した。
また、Ch003_F20抗体およびCH072抗体のVH領域およびVL領域のアミノ酸配列は、以下の通りであった（下線はCDRの配列を示す）。
Ch003_F20抗体：
VH領域：EVMLMESGGG LVKLGGSLKL SCAASGFTFS SYYMSWVRQT PEKRLEWVAT ISNSGGSTYY PDSVKDRFTI SRDNAKNTLY LQMSSLNSED TAVYYCARDP YYTNYVPMDY WGQGTSVTVS S（SEQ ID NO: 36）
VL領域：SIVMTQTPKF MSTSVGDRVS VTCKASQYVD TYVAWYQQKP GQSPKPLIYS ASTRHTGVPA RFTGSGSGTD FTLTISNVQS EDLAEYFCAQ YSSSPLTFGA GTKLELK（SEQ ID NO: 8）
Ch072抗体：
VH領域：EVKLVESGGG LVKLGGSLKL SCAASGFTFS SYYMSWVRQT PEKRLEWVAT ISNSGGSTYY PDSVKDRFTI SRDNAKNTLY LQMSSLNSED TAVYYCARDP YYTNYVPMDY WGQGTSVTVS S（SEQ ID NO: 55）
VL領域：NIVMTQSPKS MSMSVGERVT LSCKASENVG TYVSWYQQKP EQSPKLLIYG ASNRYTGVPD RFTGSGSATD FTLTISSVQA EDLADYYCGQ SYSYPLTFGA GTKLELK（SEQ ID NO: 56）
Ch003_F20抗体：
VH領域：EVMLMESGGG LVKLGGSLKL SCAASGFTFS SYYMSWVRQT PEKRLEWVAT ISNSGGSTYY PDSVKDRFTI SRDNAKNTLY LQMSSLNSED TAVYYCARDP YYTNYVPMDY WGQGTSVTVS S（SEQ ID NO: 36）
VL領域：SIVMTQTPKF MSTSVGDRVS VTCKASQYVD TYVAWYQQKP GQSPKPLIYS ASTRHTGVPA RFTGSGSGTD FTLTISNVQS EDLAEYFCAQ YSSSPLTFGA GTKLELK（SEQ ID NO: 8）
Ch072抗体：
VH領域：EVKLVESGGG LVKLGGSLKL SCAASGFTFS SYYMSWVRQT PEKRLEWVAT ISNSGGSTYY PDSVKDRFTI SRDNAKNTLY LQMSSLNSED TAVYYCARDP YYTNYVPMDY WGQGTSVTVS S（SEQ ID NO: 55）
VL領域：NIVMTQSPKS MSMSVGERVT LSCKASENVG TYVSWYQQKP EQSPKLLIYG ASNRYTGVPD RFTGSGSATD FTLTISSVQA EDLADYYCGQ SYSYPLTFGA GTKLELK（SEQ ID NO: 56）
実施例11：マウス抗体のヒト化
本実施例において、実施例1および実施例10において得られた抗体に対してCDRグラフティング法を行うことにより、マウス抗体のヒト化を実施した。
本実施例において、実施例1および実施例10において得られた抗体に対してCDRグラフティング法を行うことにより、マウス抗体のヒト化を実施した。
（11-1）Ch003抗体およびCh003_F20抗体のヒト化
本実施例において、実施例1および実施例10において得られた抗体に対してCDRグラフティング法を行うことにより、マウス抗体のヒト化を実施した。
本実施例において、実施例1および実施例10において得られた抗体に対してCDRグラフティング法を行うことにより、マウス抗体のヒト化を実施した。
抗体として実施例2で解析した上記のCh003抗体および実施例10においてCDR最適化を施したCh003_F20抗体を選択し、ヒト化した。CDRはKabat numbering法で定義した。各マウス抗体のVH及びVκのフレームワーク配列に対して、既知のヒト抗体配列からホモロジーが高い配列を選出し、マウス抗体のCDRをグラフティングしてヒト化VH及びVκを作製した。必要に応じて、フレームワークの中で構造に重要な部位（Canonical、Vernier、Interface）を適宜、起源となるマウス抗体の配列に置換した。
上記の2抗体（Ch003抗体およびCh003_F20抗体）は、起源となるマウス抗体のVH及びVκの配列が類似していることから、Ch003抗体を代表として使用して、複数のヒト化VHとVκを作製し、それぞれを起源となるマウスVHおよびVκと組み合わせた。得られた抗体について、起源となるマウス抗体と同等以上の結合親和性を維持することを指標として、ヒト化VH1、VH2およびヒト化Vκ2、Vκ3を選択した。これらの複数のヒト化VHとVκの組み合わせ（下記表13参照）は、すべて起源となるマウス抗体と同等以上のヒトTim-3に対する親和性があった。
Ch003_F20抗体のヒト化は、Ch003で選択したヒト化配列の中から、VH1およびVκ3のフレームワーク配列を選択し、実施した（表13参照）。
結果として得られた、Ch003抗体およびCh003_F20抗体に基づいて得られたヒト化抗体（Hu003_12抗体、Hu003_13抗体、Hu003_22抗体、Hu003_23抗体、およびHu003_13_F20抗体）の重鎖および軽鎖の配列を以下の表14（表14-1にHu003抗体の配列、表14-2および表14-3にHu003_F20抗体の配列）に示す。
（11-2）Ch072抗体のヒト化
本実施例において、実施例10において得られたCh072抗体（重鎖可変領域dおよび軽鎖可変領域B2）に対してCDRグラフティング法を行うことにより、マウス抗体のヒト化を実施した。
本実施例において、実施例10において得られたCh072抗体（重鎖可変領域dおよび軽鎖可変領域B2）に対してCDRグラフティング法を行うことにより、マウス抗体のヒト化を実施した。
この抗体のヒト化は、対象の抗体をCh072抗体とする以外は、（1）に記載した方法と同じ方法で行った。
最終的に、得られた抗体について、起源となるマウス抗体と同等以上の結合親和性を維持することを指標として、ヒト化VH1およびヒト化Vκ1、Vκ3を選択した（表15を参照）。これらの複数のヒト化VHとVκの組み合わせは、すべて起源となるマウス抗体と同等以上のヒトTim-3に対する親和性があった。
結果として得られた、Ch072抗体に基づいて得られたヒト化抗体（Hu072_11抗体、およびHu072_13抗体）の重鎖および軽鎖の配列を表16に示す。
（11-3）Ch149抗体、Ch428抗体、Ch621抗体のヒト化および重鎖CDR2配列改変
本実施例において、実施例1で作製し、実施例2で選択したCh149抗体、Ch428抗体およびCh621抗体に対してCDRグラフティング法を行うことにより、マウス抗体のヒト化を実施した。
本実施例において、実施例1で作製し、実施例2で選択したCh149抗体、Ch428抗体およびCh621抗体に対してCDRグラフティング法を行うことにより、マウス抗体のヒト化を実施した。
これらの抗体のヒト化は、対象の抗体をCh149抗体、Ch428抗体、Ch621抗体とする以外は、（1）に記載した方法と同じ方法で行った。
上記の3抗体（Ch149抗体、Ch428抗体、Ch621抗体）は、起源となるマウス抗体のVH及びVκの配列が類似していることから、Ch428抗体を代表として使用した。具体的には、Ch428抗体について、重鎖および軽鎖それぞれのヒト化配列を作成し、キメラ配列重鎖に対してヒト化軽鎖を、ヒト化重鎖に対してキメラ配列軽鎖をそれぞれ組み合わせ、抗体を作製した。最終的に、得られた抗体について、起源となるマウス抗体と同等以上の結合親和性を維持することを指標として、キメラ配列重鎖とヒト化Vκ1、Vκ3、Vκ4の組み合わせ、およびヒト化VH4とキメラ配列軽鎖の組み合わせを選択した（表17を参照）。
この結果に基づいて、Ch428抗体のヒト化抗体を、重鎖としてHu428抗体のVH4配列、軽鎖としてHu428抗体のVκ1、Vκ3、Vκ4を組み合わせることで、Hu428_41抗体、Hu428_43抗体、Hu428_44抗体を作製した（表18を参照）。得られたHu428_41抗体、Hu428_43抗体、Hu428_44抗体の、重鎖のアミノ酸配列、軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ以下の表に記載の通りであった（表19を参照）。
続いて、Hu428抗体で得られたフレームワークを、Ch149抗体およびCh621抗体のCDR配列と組み合わせて、Ch149抗体およびCh621抗体についてヒト化した（表20を参照）。すなわち、Hu428抗体に関して得られた配列に基づいて得られたCh149抗体およびCh621抗体についてのヒト化抗体（Hu149抗体、およびHu621抗体）の重鎖および軽鎖の配列を表21に示す。
さらに、得られたヒト化抗体（Hu149抗体、Hu428抗体、およびHu621抗体）の重鎖（各抗体についての重鎖V4）に関してCDR2の配列改変を実施し、
・Hu149抗体の重鎖VH4のCDR2をYIYPNNAGTS YNQKFKG（SEQ ID No: 74）と改変して重鎖VH7（SEQ ID No: 75）を構成するか、またはYIYPNKGGTS YNQKFKG（SEQ ID No: 76）と改変して重鎖VH8（SEQ ID No: 77）を構成し、
・Hu428抗体の重鎖VH4のCDR2をYIYPNNAGTS YNQKFKG（SEQ ID No: 78）と改変して重鎖VH7（SEQ ID No: 79）を構成するか、またはYIYPNKGGTS YNQKFKG（SEQ ID No: 80）と改変して重鎖VH8（SEQ ID No: 81）を構成し、および
・Hu621抗体の重鎖VH4のCDR2をYIYPNNAGTS YNQKFKG（SEQ ID No: 82）と改変して重鎖VH7（SEQ ID No: 83）を構成するか、またはYIYPNKGGTS YNQKFKG（SEQ ID No: 84）と改変して重鎖VH8（SEQ ID No: 85）を構成した。
・Hu149抗体の重鎖VH4のCDR2をYIYPNNAGTS YNQKFKG（SEQ ID No: 74）と改変して重鎖VH7（SEQ ID No: 75）を構成するか、またはYIYPNKGGTS YNQKFKG（SEQ ID No: 76）と改変して重鎖VH8（SEQ ID No: 77）を構成し、
・Hu428抗体の重鎖VH4のCDR2をYIYPNNAGTS YNQKFKG（SEQ ID No: 78）と改変して重鎖VH7（SEQ ID No: 79）を構成するか、またはYIYPNKGGTS YNQKFKG（SEQ ID No: 80）と改変して重鎖VH8（SEQ ID No: 81）を構成し、および
・Hu621抗体の重鎖VH4のCDR2をYIYPNNAGTS YNQKFKG（SEQ ID No: 82）と改変して重鎖VH7（SEQ ID No: 83）を構成するか、またはYIYPNKGGTS YNQKFKG（SEQ ID No: 84）と改変して重鎖VH8（SEQ ID No: 85）を構成した。
それぞれのヒト化抗体の重鎖に基づいて得られた改変抗体について、起源となるマウス抗体と同等以上の結合親和性を維持することを指標として、
・Hu149抗体についてHu149_71抗体、Hu149_81抗体、Hu149_73抗体、Hu149_83抗体、Hu149_74抗体、Hu149_84抗体、
・Hu428抗体についてHu428_71抗体、Hu428_81抗体、Hu428_73抗体、Hu428_83抗体、Hu428_74抗体、Hu428_84抗体、および
・Hu621抗体についてHu621_71抗体、Hu428_81抗体、Hu621_73抗体、Hu428_83抗体、Hu428_74抗体、Hu428_84抗体、
を作製した（表22を参照）。
・Hu149抗体についてHu149_71抗体、Hu149_81抗体、Hu149_73抗体、Hu149_83抗体、Hu149_74抗体、Hu149_84抗体、
・Hu428抗体についてHu428_71抗体、Hu428_81抗体、Hu428_73抗体、Hu428_83抗体、Hu428_74抗体、Hu428_84抗体、および
・Hu621抗体についてHu621_71抗体、Hu428_81抗体、Hu621_73抗体、Hu428_83抗体、Hu428_74抗体、Hu428_84抗体、
を作製した（表22を参照）。
上記で作製したそれぞれの重鎖CDR2改変ヒト化抗体の重鎖の配列を表23（Hu149系抗体について表23-1、428系抗体について表23-2、Hu621系抗体について表23-3）に示す。
実施例12：ヒト化抗体の結合性解析
本実施例において、実施例11で作製された本発明のヒト化抗ヒトTim-3抗体に関して、結合性解析することを目的として実験を行った。
本実施例において、実施例11で作製された本発明のヒト化抗ヒトTim-3抗体に関して、結合性解析することを目的として実験を行った。
（12-1）結合親和性解析
まず、抗体として、実施例11において作製したヒト化抗体（Hu003_13_F20抗体）を使用し、リコンビナントヒトTim-3に対する結合解析を行った。Hu003_13_F20抗体は、可変領域の配列を実施例11に記載のHu003_13_F20とする以外は実施例1に記載した方法と同じ方法で作製した。
まず、抗体として、実施例11において作製したヒト化抗体（Hu003_13_F20抗体）を使用し、リコンビナントヒトTim-3に対する結合解析を行った。Hu003_13_F20抗体は、可変領域の配列を実施例11に記載のHu003_13_F20とする以外は実施例1に記載した方法と同じ方法で作製した。
これらのヒト化抗体のヒトTim-3への結合親和性の解析は、使用する抗体をヒト化抗体（Hu003_13_F20_sc抗体、Hu003_13_F20_LA抗体）とした以外は、実施例3（3-1）に記載した方法と同じ方法で行った。
表24に結果を示す。本発明において得られたヒト化抗体は、オリジナルのモノクローナル抗体（Ch003-LA抗体およびCh003_sc抗体）で示されたヒト組換えTim-3への結合親和性よりもKD値が低くなり、親和性の向上が確認された。
次に、実施例11において作製した他のヒト化抗体についても、上記と同様の方法で、リコンビナントヒトTim-3に対する結合解析を行った。それぞれのヒト化抗体は、可変領域の配列を実施例11に記載のヒト化抗体配列とする以外は実施例1に記載した方法と同じ方法で作製した。
Hu003系抗体として、Hu003_12_sc抗体、Hu003_13_sc抗体、Hu003_22_sc抗体、およびHu003_23_sc抗体のヒトTim-3に対する結合親和性を表25に示す。本発明において得られたヒト化抗体は、オリジナルのモノクローナル抗体（Ch003_sc抗体）で示されたヒト組換えTim-3への結合親和性と比較してKD値は同等であり、親和性を維持することが確認された。
Hu072系抗体として、Hu072_11抗体、およびHu072_13抗体のそれぞれの抗体のヒトTim-3に対する結合親和性を表26に示す。本発明において得られたヒト化抗体は、オリジナルのモノクローナル抗体（Ch072_sc抗体）で示されたヒト組換えTim-3への結合親和性と比較してKD値は同等であり、親和性を維持することが確認された。
Hu149系抗体として、Hu149_41_sc抗体、Hu149_43_sc抗体、およびHu149_44_sc抗体、およびHu149系抗体の重鎖CDR2改変抗体として、Hu149_71_sc抗体、Hu149_73_sc抗体、Hu149_74_sc抗体、Hu149_81_sc抗体、Hu149_83_sc抗体、およびHu149_84_sc抗体のヒトTim-3に対する結合親和性を表27に示す。オリジナルのモノクローナル抗体（Ch149_sc抗体）で示されたヒト組換えTim-3への結合親和性と比較してKD値は同等か低くなり、親和性を維持・向上することが確認された。
Hu428系抗体として、Hu428_41_sc抗体、Hu428_43_sc抗体、およびHu428_44_sc抗体、およびHu428系抗体の重鎖CDR2改変抗体として、Hu428_71_sc抗体、Hu428_73_sc抗体、Hu428_74_sc抗体、Hu428_81_sc抗体、Hu428_83_sc抗体、およびHu428_84_sc抗体のヒトTim-3に対する結合親和性を表28に示す。オリジナルのモノクローナル抗体（Ch428_sc抗体）で示されたヒト組換えTim-3への結合親和性と比較してKD値はほぼ同等であり、親和性を維持することが確認された。
Hu621系抗体として、Hu621_41_sc抗体、Hu621_43_sc抗体、およびHu621_44_sc抗体、およびHu621系抗体の重鎖CDR2改変抗体として、Hu621_71_sc抗体、Hu621_73_sc抗体、Hu621_74_sc抗体、Hu621_81_sc抗体、Hu621_83_sc抗体、およびHu621_84_sc抗体のヒトTim-3に対する結合親和性を表29に示す。オリジナルのモノクローナル抗体（Ch621_sc抗体）で示されたヒト組換えTim-3への結合親和性と比較してKD値は低くなり、親和性を向上することが確認された。
（12-2）ヒトTim-3結合解析
次に、実施例11において作製した本発明のヒト化抗ヒトTim-3抗体（Hu003_13_F20抗体、Hu149_83抗体、Hu428_83抗体、およびHu621_83抗体）を使用して、ヒトTim-3安定発現Jurkat細胞もしくはヒトTim-3一過性発現Expi293細胞を使用した結合解析を行った。
次に、実施例11において作製した本発明のヒト化抗ヒトTim-3抗体（Hu003_13_F20抗体、Hu149_83抗体、Hu428_83抗体、およびHu621_83抗体）を使用して、ヒトTim-3安定発現Jurkat細胞もしくはヒトTim-3一過性発現Expi293細胞を使用した結合解析を行った。
これらのヒト化抗体のヒトTim-3への結合親和性の解析は、使用する抗体をヒト化抗体（Hu003_13_F20_sc抗体、Hu003_13_F20_LA抗体、Hu149_83_sc抗体、Hu428_83_sc抗体、およびHu621_83_sc抗体）とした以外は、実施例3（3-2）に記載した方法と同じ方法で行った。比較対照として、Hu003_13_F20_sc抗体に対してはCh003_sc抗体を、Hu003_13_F20_LA抗体に対してはCh003_LA抗体を、そして陰性対照としてアイソタイプコントロール抗体を、それぞれ使用した。また、Hu149_83_sc抗体、Hu428_83_sc抗体、およびHu621_83_sc抗体に対しては、異なるタイミングで実施されたHu003_13_F20_sc抗体およびHu003_13_F20_LA抗体についての実験と、同様の結果を示すことの確認のための比較対照としてHu003_13_F20_sc抗体を、そして陰性対照としてアイソタイプコントロール抗体を、それぞれ使用した。
フローサイトメトリーでの解析結果を図12（Hu003_13_F20_sc抗体およびHu003_13_F20_LA抗体について図12上段および中段、Hu149_83_sc抗体、Hu428_83_sc抗体、およびHu621_83_sc抗体について図12下段）に、そしてそのデータに基づいて算出されたHu003_13_F20_sc抗体およびHu003_13_F20_LA抗体の各抗体の解離定数KD（nM）を表30-1に、そしてHu149_83_sc抗体、Hu428_83_sc抗体、およびHu621_83_sc抗体の各抗体の解離定数KD（nM）を表30-2に、それぞれ示す。本発明のヒト化抗体は、比較対照としたモノクローナル抗体と同様に、細胞膜上に発現しているヒトTim-3に対して特異的に結合した。この結果からも、ヒト化抗体の作製に成功したことが確認された。
（12-3）さらに、実施例11において作製した本発明のヒト化抗ヒトTim-3抗体（Hu003_13_F20抗体、Hu149_83抗体、Hu428_83抗体、およびHu621_83抗体）の、活性化T細胞膜上のヒトTim-3への結合をフローサイトメトリーで解析した。
これらのヒト化抗体のヒトTim-3への結合親和性の解析は、使用する抗体を実施例11において作製した本発明のヒト化抗ヒトTim-3抗体（Hu003_13_F20_sc抗体、Hu003_13_F20_LA抗体、Hu149_83_sc抗体、Hu428_83_sc抗体、およびHu621_83_sc抗体）とした以外は、実施例3（3-3）に記載した方法と同じ方法で行った。比較対照として、Hu003_13_F20_sc抗体に対してはCh003_sc抗体を、Hu003_13_F20_LA抗体に対してはCh003_LA抗体を、そして陰性対照としてアイソタイプコントロール抗体を、それぞれ使用した。また、Hu149_83_sc抗体、Hu428_83_sc抗体、およびHu621_83_sc抗体に対しては、異なるタイミングで実施されたHu003_13_F20_sc抗体およびHu003_13_F20_LA抗体についての実験と、同様の結果を示すことの確認のための比較対照としてHu003_13_F20_sc抗体を、そして陰性対照としてアイソタイプコントロール抗体を、それぞれ使用した。
フローサイトメトリーでの解析結果を図13（Hu003_13_F20_sc抗体およびHu003_13_F20_LA抗体について図13上段および中段、Hu149_83_sc抗体、Hu428_83_sc抗体、およびHu621_83_sc抗体について図13下段）に、そしてそのデータに基づいて算出したHu003_13_F20_sc抗体およびHu003_13_F20_LA抗体の各抗体の解離定数KD（nM）を表31-1に、そしてHu149_83_sc抗体、Hu428_83_sc抗体、およびHu621_83_sc抗体の各抗体の解離定数KD（nM）を表31-2に、それぞれ示す。本発明のヒト化抗体は、比較対照とした本発明のモノクローナル抗体と同様に、プライマリーT細胞に発現しているヒトTim-3に対して特異的に結合した。
実施例13：ヒト化抗体のリガンド結合阻害活性
本実施例においては、実施例11で作製された本発明のヒト化抗ヒトTim-3抗体に関して、機能解析することを目的として実験を行った。
本実施例においては、実施例11で作製された本発明のヒト化抗ヒトTim-3抗体に関して、機能解析することを目的として実験を行った。
（13-1）Galectin-9結合阻害
実施例11において作製した本発明のヒト化抗ヒトTim-3抗体（Hu003_13_F20抗体、Hu149_83抗体、Hu428_83抗体、およびHu621_83抗体）の、ヒトTim-3とヒトGalectin-9の結合阻害能をELISAで解析した。
実施例11において作製した本発明のヒト化抗ヒトTim-3抗体（Hu003_13_F20抗体、Hu149_83抗体、Hu428_83抗体、およびHu621_83抗体）の、ヒトTim-3とヒトGalectin-9の結合阻害能をELISAで解析した。
これらのヒト化抗体のヒトTim-3とヒトGalectin-9の結合阻害活性の確認は、使用する抗体をヒト化抗体（Hu003_13_F20_sc抗体、Hu003_13_F20抗体_LA、Hu149_83_sc抗体、Hu428_83_sc抗体、およびHu621_83_sc抗体）とした以外は、実施例4（4-1）に記載した方法と同じ方法で行った。比較対照として、Hu003_13_F20_sc抗体に対してはCh003_sc抗体を、Hu003_13_F20_LA抗体に対してはCh003_LA抗体を、そして陰性対照としてアイソタイプコントロール抗体を、それぞれ使用した。また、Hu149_83_sc抗体、Hu428_83_sc抗体、およびHu621_83_sc抗体に対しては、異なるタイミングで実施されたHu003_13_F20_sc抗体およびHu003_13_F20_LA抗体についての実験と、同様の結果を示すことの確認のための比較対照としてHu003_13_F20_sc抗体を、そして陰性対照としてアイソタイプコントロール抗体を、それぞれ使用した。
抗体のヒトGalectin-9への結合（％）の結果を図14に示す。本発明で作製したヒト化抗体は、それぞれのヒト化抗体の起源となる本発明のモノクローナル抗体と同程度にヒトTim-3とヒトGalectin-9の結合を阻害できる抗体であることが示された（最大阻害率は、Ch003_sc抗体で71.2％、Hu003_13_F20_sc抗体で65.1％、Ch003_LA抗体で58.8％、Hu003_13_F20_LA_sc抗体で59.6％、Hu149_83_sc抗体で61.5％、Hu428_83_sc抗体で56.8％、そしてHu621_83_sc抗体で53.1％）。
（13-2）Phosphatidylserine結合阻害
次に、実施例11において作製した本発明のヒト化抗ヒトTim-3抗体（Hu003_13_F20抗体、Hu149_83抗体、Hu428_83抗体、およびHu621_83抗体）の、ヒトTim-3とPhosphatidylserineの結合阻害能をフローサイトメトリーで解析した。
次に、実施例11において作製した本発明のヒト化抗ヒトTim-3抗体（Hu003_13_F20抗体、Hu149_83抗体、Hu428_83抗体、およびHu621_83抗体）の、ヒトTim-3とPhosphatidylserineの結合阻害能をフローサイトメトリーで解析した。
これらのヒト化抗体のヒトTim-3とPhosphatidylserineの結合阻害活性の確認は、使用する抗体をヒト化抗体（Hu003_13_F20_sc抗体、Hu003_13_F20_LA抗体、Hu149_83_sc抗体、Hu428_83_sc抗体、およびHu621_83_sc抗体）とした以外は、実施例4（4-2）に記載した方法と同じ方法で行った。比較対照として、Hu003_13_F20_sc抗体に対してはCh003_sc抗体を、Hu003_13_F20_LA抗体に対してはCh003_LA抗体を、陰性対照としてアイソタイプコントロール抗体を、それぞれ使用した。また、Hu149_83_sc抗体、Hu428_83_sc抗体、およびHu621_83_sc抗体に対しては、異なるタイミングで実施されたHu003_13_F20_sc抗体およびHu003_13_F20_LA抗体についての実験と、同様の結果を示すことの確認のための比較対照としてHu003_13_F20_sc抗体を、そして陰性対照としてアイソタイプコントロール抗体を、それぞれ使用した。
フローサイトメトリーでの解析結果を図15に、この解析結果に基づいて算出されたHu003_13_F20_sc抗体およびHu003_13_F20_LA抗体のそれぞれの抗体のIC50値（nM）を表32-1に、そしてHu149_83_sc抗体、Hu428_83_sc抗体、およびHu621_83_sc抗体のそれぞれの抗体のIC50値（nM）を表32-2に、それぞれ示す。本発明で作製したヒト化抗体は、それぞれのヒト化抗体の起源となる本発明のモノクローナル抗体と同程度にヒトTim-3とPhosphatidylserineの結合を阻害できた。
実施例14：末梢血単核球（PBMC）の黄色ブドウ球菌エンテロトキシンB（SEB）刺激アッセイ
本実施例において、実施例11において作製した本発明のヒト化抗ヒトTim-3抗体の、ヒト末梢血T細胞活性化に対する影響を黄色ブドウ球菌エンテロトキシンB（SEB）による末梢血単核球（PBMC）の活性化で評価した。
本実施例において、実施例11において作製した本発明のヒト化抗ヒトTim-3抗体の、ヒト末梢血T細胞活性化に対する影響を黄色ブドウ球菌エンテロトキシンB（SEB）による末梢血単核球（PBMC）の活性化で評価した。
抗体として、実施例11において作製した本発明のヒト化抗ヒトTim-3抗体（Hu003_13_F20_sc抗体）を使用した以外は、実施例8に記載した方法と同じ方法で行った。比較対照として、Ch003_sc抗体を、陰性対照としてアイソタイプコントロール抗体を、そして参照抗体としてUS9605070B2に記載される抗体（ABTIM3-hum21 VH:Seq No.26/VL:Seq No.20）を、それぞれ使用した。
図16に、フローサイトメトリーでの解析結果を示す。ここで、CD4陽性・IFNγ陽性の細胞数の変動およびCD8陽性・IFNγ陽性の細胞数変動を図16-1に、CD4陽性・IFNγ陽性細胞およびCD8陽性・IFNγ陽性細胞の細胞上のTim-3発現量（MFI値）をアイソタイプコントロールを100％、染色の陰性コントロールを0％として百分率で算出した結果を図16-2に、それぞれ示す。本発明で作製したヒト化抗ヒトTim-3抗体は、CD8陽性IFN-γ陽性細胞数を増幅した。この特徴は、陽性対照である参照抗体と比較しても有意に高いものであった。また、本発明で作製したヒト化抗ヒトTim-3抗体は、CD8陽性IFN-γ陽性細胞上のヒトTim-3の発現量を抑制した。この特徴は、陽性対照である参照抗体では認められない機能であった。本発明で作製したヒト化抗ヒトTim-3抗体は、ヒトTim-3に対するヒトGalectin-9およびPhosphatidylserineの結合を阻害し、エフェクター細胞上のヒトTim-3の発現を抑制することで、エフェクターT細胞の活性化に寄与する抗体である。
実施例15：ヒト化抗体を使用した抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体の作製
本実施例において、実施例11で作製し、実施例12、実施例13で性能を確認したヒト化モノクローナル抗体に基づいて、ヒトTim-3に結合するバイパラトピック抗体を作製した。
本実施例において、実施例11で作製し、実施例12、実施例13で性能を確認したヒト化モノクローナル抗体に基づいて、ヒトTim-3に結合するバイパラトピック抗体を作製した。
実施例11で作製した抗体のうち、Tim-3への結合で競合しないGroup 2に属するHu003系抗体およびHu072系抗体の半分子と、Group 5に属するHu149系抗体、Hu428系抗体、Hu621系抗体の半分子とから構成されるバイパラトピック抗体を作製した。具体的には、一方の半分子としてHu003_13_F20抗体を、もう一方の半分子として、Hu149_83抗体、Hu428_83抗体、またはHu621_83抗体を選択し、Knob-into-Hole（US7183076B2）の技術を使用し、バイパラトピック抗体を作製した。
具体的には、Group 2に属するHu003_13_F20抗体の半分子については、Fc部分をKnob型とし、C末端にC-tagを付加した。Group 5に属するHu149_83抗体、Hu428_83抗体、およびHu621_83抗体についてはFc部分をHole型とし、2種類の抗体をコードする2種類のDNAをベクターに挿入した。すなわち、
・Hu003_13_F20抗体をコードするDNAと、Hu149_83抗体をコードするDNAとの組み合わせ、
・Hu003_13_F20抗体をコードするDNAと、Hu428_83抗体をコードするDNAとの組み合わせと、
・Hu003_13_F20抗体をコードするDNAとHu621_83抗体をコードするDNAとの組み合わせ、
で発現ベクターを調製した。これらの発現ベクターのそれぞれをExpiCHO細胞（Thermo Fisher Scientific）にトランスフェクションして発現させ、細胞内でscFv-Fcのヘテロダイマーのバイパラトピック抗体として産生させた。これらのバイパラトピック抗体は、抗C-tagカラムを使用し、直接精製した。
・Hu003_13_F20抗体をコードするDNAと、Hu149_83抗体をコードするDNAとの組み合わせ、
・Hu003_13_F20抗体をコードするDNAと、Hu428_83抗体をコードするDNAとの組み合わせと、
・Hu003_13_F20抗体をコードするDNAとHu621_83抗体をコードするDNAとの組み合わせ、
で発現ベクターを調製した。これらの発現ベクターのそれぞれをExpiCHO細胞（Thermo Fisher Scientific）にトランスフェクションして発現させ、細胞内でscFv-Fcのヘテロダイマーのバイパラトピック抗体として産生させた。これらのバイパラトピック抗体は、抗C-tagカラムを使用し、直接精製した。
この結果、Hu149003ct抗体（Hu149_83抗体半分子とHu003_13_F20抗体半分子の組み合わせ）、Hu428003ct抗体（Hu428_83抗体半分子とHu003_13_F20抗体半分子の組み合わせ）、Hu621003ct抗体（Hu621_83抗体半分子とHu003_13_F20抗体半分子の組み合わせ）が得られた。
実施例16：ヒト化抗体由来のバイパラトピック抗体の結合性解析
本実施例において、実施例15で作製された本発明のヒト化抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体に関して、結合性解析することを目的として実験を行った。
本実施例において、実施例15で作製された本発明のヒト化抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体に関して、結合性解析することを目的として実験を行った。
（16-1）結合親和性解析
まず、抗体として、実施例15において作製したヒト化バイパラトピック抗体（Hu149003ct抗体、Hu428003ct抗体、およびHu621003ct抗体）を使用し、リコンビナントヒトTim-3に対する結合解析を行った。
まず、抗体として、実施例15において作製したヒト化バイパラトピック抗体（Hu149003ct抗体、Hu428003ct抗体、およびHu621003ct抗体）を使用し、リコンビナントヒトTim-3に対する結合解析を行った。
これらのヒト化バイパラトピック抗体のヒトTim-3への結合親和性の解析は、使用する抗体をヒト化バイパラトピック抗体（Hu149003ct抗体、Hu428003ct抗体、およびHu621003ct抗体）とした以外は、実施例3（3-1）に記載した方法と同じ方法で行った。
表33に結果を示す。本発明のヒト化バイパラトピック抗体は、オリジナルのヒト化モノクローナル抗体（実施例12（12-1）表24～29）と比較して、結合親和性が向上した。これは、バイパラトピック抗体がアナライトに2か所で結合できており、Avidity効果が得られたためであり、この結果から、バイパラトピック抗体の作製に成功したことが確認された。
（16-2）ヒトTim-3結合解析
次に、実施例15において作製した本発明のヒト化抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体（Hu149003ct抗体、Hu428003ct抗体、およびHu621003ct抗体）を使用して、ヒトTim-3安定発現Jurkat細胞もしくはヒトTim-3一過性発現Expi293細胞を使用した結合解析を行った。
次に、実施例15において作製した本発明のヒト化抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体（Hu149003ct抗体、Hu428003ct抗体、およびHu621003ct抗体）を使用して、ヒトTim-3安定発現Jurkat細胞もしくはヒトTim-3一過性発現Expi293細胞を使用した結合解析を行った。
これらのヒト化バイパラトピック抗体のヒトTim-3への結合親和性の解析は、使用する抗体をヒト化バイパラトピック抗体（Hu149003ct抗体、Hu428003ct抗体、およびHu621003ct抗体）とした以外は、実施例3（3-2）に記載した方法と同じ方法で行った。比較対照として、これらのヒト化バイパラトピック抗体の半分子の由来であり、実施例12（12-2）で結合解析を行った、Hu003_13_F20_sc抗体を使用した。
フローサイトメトリーでの解析結果を図17に、そしてそのデータに基づいて算出された各抗体の解離定数KD（nM）を表34に、それぞれ示す。本発明のヒト化バイパラトピック抗体は、実施例12のヒト化モノクローナル抗体と同様に、細胞膜上に発現しているヒトTim-3に対して特異的に結合した。また、ヒト化バイパラトピック抗体は、オリジナルのヒト化モノクローナル抗体と比較して、飽和結合のMFIが上昇した。これは、バイパラトピック抗体が細胞膜上の抗原1分子に1分子で結合する一方、ヒト化モノクローナル抗体は細胞膜上の抗原2分子に1分子で結合しているためと考えられる。実施例16（16-1）と同様にこの結果からも、ヒト化バイパラトピック抗体の作製に成功したことが確認された。
（16-3）さらに、実施例15において作製した本発明のヒト化抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体（Hu149003ct抗体、Hu428003ct抗体、およびHu621003ct抗体）の、活性化T細胞膜上のヒトTim-3への結合をフローサイトメトリーで解析した。
これらのヒト化バイパラトピック抗体のヒトTim-3への結合親和性の解析は、使用する抗体をヒト化バイパラトピック抗体（Hu149003ct抗体、Hu428003ct抗体、およびHu621003ct抗体）とした以外は、実施例3（3-3）に記載した方法と同じ方法で行った。比較対照として、これらのバイパラトピック抗体の半分子の由来であり、実施例12（12-3）で結合解析を行った、Hu003_13_F20_sc抗体を使用した。
フローサイトメトリーでの解析結果を図18に、そしてそのデータに基づいて算出した各抗体の解離定数KD（nM）を表35に、それぞれ示す。本発明のヒト化バイパラトピック抗体は、実施例12において結合性が示された本発明のヒト化モノクローナル抗体と同様に、プライマリーT細胞に発現しているヒトTim-3に対して特異的に結合した。また、ヒト化バイパラトピック抗体は、オリジナルのヒト化モノクローナル抗体と比較して、飽和結合のMFIが上昇した。この結果から、プライマリー細胞においても本発明で作製したヒト化バイパラトピック抗体は機能していることが示された。
実施例17：ヒト化バイパラトピック抗体のリガンド結合阻害活性
本実施例においては、実施例15で作製されたヒト化バイパラトピック抗体に関して、機能解析することを目的として実験を行った。
本実施例においては、実施例15で作製されたヒト化バイパラトピック抗体に関して、機能解析することを目的として実験を行った。
（17-1）Galectin-9結合阻害
実施例15において作製した本発明のヒト化抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体（Hu149003ct抗体、Hu428003ct抗体、およびHu621003ct抗体）の、ヒトTim-3とヒトGalectin-9の結合阻害能をELISAで解析した。
実施例15において作製した本発明のヒト化抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体（Hu149003ct抗体、Hu428003ct抗体、およびHu621003ct抗体）の、ヒトTim-3とヒトGalectin-9の結合阻害能をELISAで解析した。
これらのヒト化バイパラトピック抗体のヒトTim-3とヒトGalectin-9の結合阻害活性の確認は、使用する抗体をヒト化バイパラトピック抗体（Hu149003ct抗体、Hu428003ct抗体、およびHu621003ct抗体）とした以外は、実施例4（4-1）に記載した方法と同じ方法で行った。比較対照として、これらのヒト化バイパラトピック抗体の半分子の由来であり、実施例12（12-2）で結合解析を行い、実施例13（13-1）でGalectin-9結合阻害評価を行った、Hu003_13_F20_sc抗体を使用した。
抗体のヒトGalectin-9への結合（％）の結果を図19に、この解析結果に基づいて算出されたそれぞれのヒト化バイパラトピック抗体のIC50値（nM）を表36に、それぞれ示す。本発明で作製したヒト化バイパラトピック抗体は、ヒトTim-3とヒトGalectin-9の結合を90％以上阻害することができた。この結果から、本発明で作製したヒト化バイパラトピック抗体は、本発明の実施例11で作製したヒト化モノクローナル抗体よりも強く、また実施例7（7-１）で示したキメラバイパラトピック抗体と同等に、ヒトTim-3とヒトGalectin-9の結合を阻害できる抗体であることが示された。
（17-2）Phosphatidylserine結合阻害
次に、実施例15において作製した本発明のヒト化抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体（Hu149003ct抗体、Hu428003ct抗体、およびHu621003ct抗体）の、ヒトTim-3とPhosphatidylserineの結合阻害能をフローサイトメトリーで解析した。
次に、実施例15において作製した本発明のヒト化抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体（Hu149003ct抗体、Hu428003ct抗体、およびHu621003ct抗体）の、ヒトTim-3とPhosphatidylserineの結合阻害能をフローサイトメトリーで解析した。
これらのヒト化バイパラトピック抗体のヒトTim-3とPhosphatidylserineの結合阻害活性の確認は、使用する抗体をヒト化バイパラトピック抗体（Hu149003ct抗体、Hu428003ct抗体、およびHu621003ct抗体）とした以外は、実施例4（4-2）に記載した方法と同じ方法で行った。比較対照として、これらのバイパラトピック抗体の半分子の由来であり、実施例12（12-2）で結合解析を行い、実施例13（13-2）でPhophatidylserine結合阻害評価を行った、Hu003_13_F20_sc抗体を使用した。
フローサイトメトリーでの解析結果を図20に、この解析結果に基づいて算出されたそれぞれの抗体のIC50値（nM）を表37にそれぞれ示す。本発明のヒト化バイパラトピック抗体は、実施例13（13-2）で示したHu003_13_F20_sc抗体と比較して、IC50値は2倍程度上昇するものの、実施例7（7-2）で示したキメラバイパラトピック抗体と同等に、ヒトTim-3とPhosphatidylserineの結合をほぼ完全に阻害できた。
実施例17（17-1）および（17-2）の結果から、本発明で作製したヒト化バイパラトピック抗体は、ヒトTim-3のリガンドであるヒトGalectin-9およびPhosphatidylserineの結合を同時に強く阻害する抗体であることが示された。
実施例18：ヒト化抗体を利用した末梢血単核球（PBMC）の黄色ブドウ球菌エンテロトキシンB（SEB）刺激アッセイ
本実施例において、実施例11で作製された本発明のヒト化抗ヒトTim-3モノクローナル抗体および実施例15で作製された本発明のヒト化抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体に関して、ヒト末梢血T細胞活性化に対する影響を黄色ブドウ球菌エンテロトキシンB（SEB）による末梢血単核球（PBMC）の活性化で評価した。
本実施例において、実施例11で作製された本発明のヒト化抗ヒトTim-3モノクローナル抗体および実施例15で作製された本発明のヒト化抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体に関して、ヒト末梢血T細胞活性化に対する影響を黄色ブドウ球菌エンテロトキシンB（SEB）による末梢血単核球（PBMC）の活性化で評価した。
抗体として、実施例11において作製したヒト化抗ヒトTim-3モノクローナル抗体（Hu003_13_F20_sc抗体、Hu149_83_sc抗体、Hu428_83_sc抗体、およびHu621_83_sc抗体）、そして実施例15で作製したヒト化抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体（Hu149003ct抗体、Hu428003ct抗体、およびHu621003ct抗体）を使用した以外は、実施例8に記載した方法で実験を行った。陰性対照として、アイソタイプコントロール抗体を使用した。
図21に、フローサイトメトリーでの解析結果を示す。ここで、CD4陽性・IFNγ陽性の細胞数の変動およびCD8陽性・IFNγ陽性の細胞数の変動を図21-1に、CD4陽性・IFNγ陽性細胞およびCD8陽性・IFNγ陽性細胞の細胞上のTim-3発現量（MFI値）をアイソタイプコントロールを100％、染色の陰性コントロールを0％として百分率で算出した結果を図21-2に、それぞれ示す。
本発明で作製したヒト化抗ヒトTim-3モノクローナル抗体は、CD8陽性IFN-γ陽性細胞数を増幅したが、この効果は、ヒト化抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体によりさらに増強された。このことから、本発明で作製したヒト化抗ヒトTim-3モノクローナル抗体（Hu003_13_F20_sc抗体、Hu149_83_sc抗体、Hu428_83_sc抗体、およびHu621_83_sc抗体）およびヒト化抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体（Hu149003ct抗体、Hu428003ct抗体、およびHu621003ct抗体）は、実施例2で作製したキメラモノクローナル抗体および実施例5で作製したキメラバイパラトピック抗体と同様に、ヒトTim-3に対してエフェクターT細胞の活性化を増強することが示された。
実施例19：Galectin-9によるT細胞のアポトーシス誘導の抑制評価
本実施例において、本発明のヒト化抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体が、Galectin-9によるヒト末梢血T細胞のアポトーシス誘導を抑制するかを評価した。
本実施例において、本発明のヒト化抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体が、Galectin-9によるヒト末梢血T細胞のアポトーシス誘導を抑制するかを評価した。
抗体として、実施例11において作製したヒト化抗ヒトTim-3モノクローナル抗体（Hu003_13_F20_sc抗体）、そして実施例15で作製したヒト化抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体（Hu149003ct抗体、Hu428003ct抗体、およびHu621003ct抗体）を使用し、Galectin-9の添加量を125 nMとした以外は、実施例9に記載した方法で実験を行った。陰性対照として、アイソタイプコントロール抗体を使用した。同様の条件で、実施例1において作製したキメラ抗ヒトTim-3モノクローナル抗体（Ch003_sc抗体）そして実施例5で作製したキメラ抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体（Ch149003ct抗体、Ch428003ct抗体、およびCh621003ct抗体）を使用して、上記のバイパラトピック抗体の場合と同条件で実験を行った。
図22に結果を示す。本発明で作製したヒト化抗ヒトTim-3モノクローナル抗体（Hu003_13_F20_sc抗体）は、Galctin-9によるT細胞のApoptosis誘導をわずかに抑制することが示された。この効果は、実施例15において作製したヒト化バイパラトピック抗体（Hu149003ct抗体、Hu428003ct抗体、およびHu621003ct抗体）ではより増強された。同様の結果は、キメラ抗体の場合も同様であり、キメラ抗ヒトTim-3モノクローナル抗体（Ch003_sc抗体）はGalctin-9によるT細胞のApoptosis誘導をわずかに抑制し、一方キメラ抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体（Ch149003ct抗体、Ch428003ct抗体、およびCh621003ct抗体）ではより増強された。
ヒト化バイパラトピック抗体は、キメラバイパラトピック抗体と同様に、ヒトTim-3とヒトGalctin-9の結合阻害の増強によって、T細胞のApoptosis誘導シグナルを抑制することが確認された。
実施例20：CMVペプチド抗原特異的T細胞応答に対する影響評価
本発明の抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体のCMVペプチド抗原特異的T細胞応答に対する影響を評価した。
本発明の抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体のCMVペプチド抗原特異的T細胞応答に対する影響を評価した。
本実施例において使用した評価用抗体は、バイパラトピック抗体として、Hu149003ct、Hu428003ct、Hu621003ctを使用し、比較対照として、これらのバイパラトピック抗体の半分子の由来であるHu003_13_F20_scおよびHu149_83_scと、これら2種の組み合わせを使用した。
HLA型がHLA-A02の健常人ボランティア由来のPBMCを10％FCS、100 unit/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、1×GlutaMax（Gibco、35050-061）、10 mM HEPES添加RPMI-1640培地に懸濁し、96 well U底プレートへ播種（2～5×105 cells/well）し、終濃度10μg/mlの評価抗体を添加した。37℃、5％CO2の条件下で30分間インキュベート後に、HLA選択的CMV抗原ペプチド（HLA-A02：NLVPMVATV、HLA-DRB1*11: EHPTFTSQYRIQGKL、HLA-DQB1*06：LLQTGIHVRVSQPSL、）を各1μg/mLの濃度で添加し、37℃、5％CO2の条件下で6日間培養した。
培養終了後、HLA-A*02:01 CMV pp65 Tetramer-NLVPMVATV-PE（MBL、TS-0010-1C）、T細胞マーカー染色抗体（Biolegend、anti-CD3:UCHT1、anti-CD4:RPA-T4、anti-CD8a:HIT8a）を用いて細胞染色を行った。染色した細胞についてフローサイトメトリー解析を行い、CD8陽性細胞中のCMV抗原特異的T細胞の割合を算出した。また、回収した培養上清中のIFNγ濃度、TNFα濃度をLuminex法により定量した。
算出したCD8陽性細胞中のCMV抗原特異的T細胞の割合と、培養上清中のIFNγおよびTNFα濃度をLuminexにより測定した結果を図23に示す。
対照として評価したヒト化抗ヒトTim-3モノクローナル抗体、Hu003_13_F20_scは、アイソタイプコントロール抗体を添加した群と比較して、CMV抗原特異的T細胞の割合および培養上清中のIFNγ、TNFα濃度を増加させたのに対し、Hu149_scはアイソタイプコントロール抗体と同程度であったが、両方（Hu003_13_F20_scおよびHu149_83_sc）を添加した系では、Hu003_13_F20_scを単独で添加した群より、CMV抗原特異的T細胞の割合および培養上清中のIFNγ、TNFα濃度をさらに増加させた。
Hu149003ct、Hu428003ct、Hu621003ctは、二つのモノクローナル抗体同時に添加した群同様、いずれもCMV抗原特異的T細胞の割合および培養上清中のIFNγ、TNFα濃度で、Hu003_13_F20_scを単独で添加した群に対して同等以上の増加を示した。
実施例21：内在性抗原による抗原特異的T細胞応答および抗腫瘍作用に対する影響評価
本実施例において、抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体の、細胞上のHLAに提示された内在性抗原によるPBMCの活性化と抗腫瘍作用への影響を、CMV抗原を発現する腫瘍細胞とPBMCの共培養系により評価した。
本実施例において、抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体の、細胞上のHLAに提示された内在性抗原によるPBMCの活性化と抗腫瘍作用への影響を、CMV抗原を発現する腫瘍細胞とPBMCの共培養系により評価した。
本実施例において使用した評価用抗体は、抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体としてCh428003ctを使用し、対照としてアイソタイプコントロール抗体CN2_cs使用した。
評価開始前日に、Human cytomegalovirus（CMV）（strain AD169）由来のpp65たんぱく質（accession number: P06725）およびmRFP（Origene: PS100041）を恒常的に発現させたMDA-MB-231細胞株（ATCC：HTB-26）を、10％FCS、100 unit/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、1×GlutaMax（Gibco、35050-061）、10 mM HEPESを添加したRPMI-1640培地に懸濁し、96ウェルプレートに播種し、37℃、5％CO2の条件下で１日間培養した。
評価開始日に、HLA型がHLA-A02の健常人ボランティア由来のPBMCを、10％FCS、100 unit/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、1×GlutaMax（Gibco、35050-061）、10 mM HEPESを添加したRPMI-1640培地に懸濁後、PBMCの数が前日播種した腫瘍細胞の5倍の細胞数となるように96ウェルプレートに添加した。腫瘍細胞とPBMCを添加したウェルに終濃度10μg/mlの評価抗体あるいはアイソタイプコントロール抗体を添加し、37℃、5％CO2の条件で5日間、共培養を行った。
共培養終了後、培養上清と非付着細胞を回収し、さらにPBSで2回ウェルを洗浄した後、70μLの10％FCS、100 unit/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、1×GlutaMax（Gibco、35050-061）、10 mM HEPESを添加したRPMI-1640培地を添加した。さらに70μLのCell Titer Glo溶液 (Promega: G7570) を添加し室温で10分間振盪した後、ウェルの内容物各100μLを白色の96ウェルプレートに分取し、発光プレートリーダーで発光量を測定した。
回収した培養上清は、遠心により細胞成分を除去後、IFNγ、TNFα濃度をLuminexにより定量した。
図24に、共培養5日目の培養上清中のIFNγ、TNFα濃度、および、共培養5日目の生腫瘍細胞に由来するATPによる発光量を示す。
本発明の抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体Ch428003ctを添加した群の培養上清中のIFNγ、TNFα濃度は、アイソタイプコントロール抗体を添加した群と比較して顕著に増加しており、ヒトTim-3バイパラトピック抗体が、細胞膜上に提示された内在性抗原によっても、抗原特異的なT細胞の活性化を亢進することが確認された。
さらに、Ch428003ctは、PBMCとの共培養下で、アイソタイプコントロール抗体と比較して腫瘍細胞の増殖を20%抑制したことから、抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体は、内在性抗原により活性化されたT細胞の当該抗原を発現する腫瘍細胞への抗腫瘍作用を増強することが示された。
実施例22：ヒトTim-3ノックインマウスを使用した有効性試験
本実施例において、本発明のヒト化抗ヒトTim-3二重特性抗体のマウスモデルでの抗腫瘍効果を評価した。
本実施例において、本発明のヒト化抗ヒトTim-3二重特性抗体のマウスモデルでの抗腫瘍効果を評価した。
評価は、本発明で開発したヒト化抗ヒトTim-3バイパラトピック抗体がヒトTim-3を標的としているため、マウスTim-3をヒトTim-3に遺伝子的に置き換えたヒトTim-3ノックインマウス(Biocytogen: B-hTim3 mice)を使用した。
試験0日目に、1 mLのHBSS＋matrigel中のMC38_OVA細胞数が5×107個になるように懸濁し、hTim-3ノックインマウスの腹部皮下へ、細胞懸濁液100μL（5×106個／マウス)を移植した。細胞接種日より週2回の頻度でマウス体重および腫瘍体積を計測した。なお腫瘍体積は以下の式にて算出した：
腫瘍体積＝長径×短径×短径／2
腫瘍体積＝長径×短径×短径／2
試験6日目に、腫瘍測定に基づき、4群（1群あたり6匹）に群分けを実施した。群分けを実施した日より、下記表（表38）に記載した内容に従い、抗体の投与を開始した。投与は腹腔内投与で実施した。
下記表38中の抗PD-L1 IgG1LALA抗体はヒトおよびマウスに交差性のあるAtezolizumab（PubChem SID 312642102）の可変領域をIgG1LALA型のIgG1抗体の形状で社内調整したものを使用した。
マウス体重および腫瘍体積の計測は、試験31日目まで実施し、試験32日目に全試験個体に安楽死を施した。全試験個体より腫瘍組織を切除し、以下に示すように腫瘍浸潤リンパ球の解析を実施した。
切除した腫瘍は、清浄な剃刀を使用し約3 mm角程度に細断し、酵素液カクテル（ミルテニーバイオテク：MACS Tumor Dissociation kit）に浸漬後、Gentle MACS（ミルテニーバイオテク）を使用して、腫瘍シングルセルを調製した。調製した腫瘍シングルセルは、マウス表面抗原用蛍光標識抗体（BioLegend: anti-mouse CD3、17A2；anti-mouse CD4、GK1.5、MBL；anti-mouse CD8、KT14）およびOVA-tetramer（MBL：T-Select H-2Kb OVA Tetramer-SIINFEKL-APC）を用いて染色し、フローサイトメトリーを使用して腫瘍浸潤リンパ球を検出した。
図25に、各治療群の平均腫瘍体積の推移および各治療群の個別マウスの腫瘍体積の推移を示す。本発明のヒト化抗ヒトTim-3二重特異性抗体、Hu149003ct、を単独で投与した群（群2）は、アイソタイプコントロール抗体のみを投与した群（群1）に比較して、エンドポイント（試験31日目）の腫瘍体積を平均で31％増殖を抑制した。また抗マウスPD-L1抗体単独で治療を行った群（群3）の腫瘍増殖抑制率が43％であったのに対し、抗マウスPD-L1抗体とHu149003ctを併用した群（群4）では、腫瘍増殖抑制率が69％となり、抗マウスPD-L1抗体の作用への上乗せ効果が観察された。以上より本発明の抗ヒトTim-3二重特異性抗体は、単独使用の場合、あるいは抗マウスPD-L1抗体との併用の場合ともに、マウス皮下に接種した腫瘍への抗腫瘍効果が確認された。
図26に、これら4群のマウスより採取した腫瘍組織に浸潤したリンパ球の解析結果を示す。解析結果は腫瘍1 g当たりに含まれるOVA tetramer陽性CD8陽性T細胞数（左）および、CD8陽性腫瘍浸潤T細胞内のOVA tetramer陽性細胞の割合（右）として示した。腫瘍単位重量当たりの平均OVA tetramer陽性CD8陽性T細胞数は群1に対して群2が、また群3に対して群4が高値を示した。またCD8陽性腫瘍浸潤T細胞内のOVA tetramer陽性細胞の割合も、群2、群4で群1に対して有意に亢進した。これらの結果より、本発明の抗ヒトTim-3二重特異性抗体は、腫瘍に提示される抗原に特異的なCD8陽性T細胞の腫瘍への浸潤あるいは腫瘍内での増殖を促すことが示唆され、これが抗腫瘍作用の機序の一つであると推測された。
実施例23：エピトープマッピング
本実施例において、本発明の抗ヒトTim-3抗体Hu003_13_F20_scFvおよびHu149_83_scFvのエピトープを、X線結晶構造解析により決定した。
本実施例において、本発明の抗ヒトTim-3抗体Hu003_13_F20_scFvおよびHu149_83_scFvのエピトープを、X線結晶構造解析により決定した。
（22-1）抗原調製
N末端にポリヒスチジンタグを付加したヒトTim-3 IgVドメイン（aa. 22～130）（SEQ ID NO: 87）またはC末端にCタグを付加したヒトTim-3 IgVドメイン（aa. 22～130）（SEQ ID NO: 88）ををコードするDNAをpET47bベクターに挿入し、Rosetta-2(DE3)ｐLysSを形質転換して、2×YT培地において20℃で培養し、発現させた。封入体をTris-HCl、pH8.0およびTris-HCl、pH8.0、0.05％Triton X-100で洗浄した。封入体はその後、6 M Gdm-HCl、50 mM Tris、pH 8.0および10 mM DTTで変性させ、100 mM Tris-HCl、pH8.0、3.73 mM cystamine、6.73 mM cysteamine、2 mM EDTAにて巻き戻しを行った。
N末端にポリヒスチジンタグを付加したヒトTim-3 IgVドメイン（aa. 22～130）（SEQ ID NO: 87）またはC末端にCタグを付加したヒトTim-3 IgVドメイン（aa. 22～130）（SEQ ID NO: 88）ををコードするDNAをpET47bベクターに挿入し、Rosetta-2(DE3)ｐLysSを形質転換して、2×YT培地において20℃で培養し、発現させた。封入体をTris-HCl、pH8.0およびTris-HCl、pH8.0、0.05％Triton X-100で洗浄した。封入体はその後、6 M Gdm-HCl、50 mM Tris、pH 8.0および10 mM DTTで変性させ、100 mM Tris-HCl、pH8.0、3.73 mM cystamine、6.73 mM cysteamine、2 mM EDTAにて巻き戻しを行った。
巻き戻し後のN末端にポリヒスチジンタグを付加したヒトTim-3 IgVドメイン（aa. 22～130）タンパク質は、TBS、pH7.4にて平衡化し、Superdex-75にてゲルろ過精製した。また、巻き戻し後のC末端にCタグを付加したヒトTim-3 IgVドメイン（aa. 22～130）タンパク質は、抗Cタグ抗体カラム（Thermo, 494307201）に供し、TBS（pH7.4）で洗浄、2 M MgCl2で溶出を行った後、TBS、pH7.4にて平衡化したSuperdex-75にてゲルろ過精製した。
（22-2）Hu003_13_F20のscFv調製
Hu003_13_F20はscFvとして大量発現および精製するため、N末端にpelB、C末端にFLAGタグとポリヒスチジンタグを付加し、lac promoterを組み込んだpTZ19Rベクターに挿入し、大腸菌DH12S株を形質転換し、100μg/mLアンピシリンおよび1％グルコース含有LB寒天培地に播種後、37℃で一晩培養した。得られたコロニーを最終的に100μg/mLアンピシリン及び1 mM IPTG含有Terrific Broth（TB）培地にて30℃で24時間振盪培養し、scFvタンパク質を培養上清中に分泌発現させた。遠心分離した培養液上清は0.22μmフィルターろ過を行った。
Hu003_13_F20はscFvとして大量発現および精製するため、N末端にpelB、C末端にFLAGタグとポリヒスチジンタグを付加し、lac promoterを組み込んだpTZ19Rベクターに挿入し、大腸菌DH12S株を形質転換し、100μg/mLアンピシリンおよび1％グルコース含有LB寒天培地に播種後、37℃で一晩培養した。得られたコロニーを最終的に100μg/mLアンピシリン及び1 mM IPTG含有Terrific Broth（TB）培地にて30℃で24時間振盪培養し、scFvタンパク質を培養上清中に分泌発現させた。遠心分離した培養液上清は0.22μmフィルターろ過を行った。
フィルターろ過後の上清は抗FLAGタグ抗体カラムに供し、PBS（pH7.4）で洗浄、0.1 mg/mL FLAGタグペプチド含有PBS（pH7.4）で溶出を行った。その後TBS（pH7.4）にて平衡化したSuperdex-75にてゲルろ過精製した。
（22-3）Hu149_83のscFv調製
Hu149_83はscFvとして大量発現および精製するため、N末端にpelB、C末端にCタグを付加し、lac promoterを組み込んだpTZ19Rベクターに挿入し、大腸菌DH12S株を形質転換し、100μg/mLアンピシリンおよび1％グルコース含有LB寒天培地に播種後、37℃で一晩培養した。得られたコロニーを最終的に100μg/mLアンピシリン及び1 mM IPTG含有Terrific Broth（TB）培地にて30℃で24時間振盪培養し、scFvタンパク質を培養上清中に分泌発現させた。遠心分離した培養液上清は0.22μmフィルターろ過を行った。
Hu149_83はscFvとして大量発現および精製するため、N末端にpelB、C末端にCタグを付加し、lac promoterを組み込んだpTZ19Rベクターに挿入し、大腸菌DH12S株を形質転換し、100μg/mLアンピシリンおよび1％グルコース含有LB寒天培地に播種後、37℃で一晩培養した。得られたコロニーを最終的に100μg/mLアンピシリン及び1 mM IPTG含有Terrific Broth（TB）培地にて30℃で24時間振盪培養し、scFvタンパク質を培養上清中に分泌発現させた。遠心分離した培養液上清は0.22μmフィルターろ過を行った。
フィルターろ過後の上清は抗Cタグ抗体カラム（Thermo, 494307201）に供し、TBS（pH7.4）で洗浄、2 M MgCl2で溶出を行った。その後TBS（pH7.4）にて平衡化したSuperdex-75にてゲルろ過精製した。
（22-4）X線構造解析によるエピトープ決定
X線構造解析によるエピトープ決定はProteros biostructures GmbHに委託した。詳細は次の通りである。
X線構造解析によるエピトープ決定はProteros biostructures GmbHに委託した。詳細は次の通りである。
調製した抗原およびscFvを混合し、ゲルろ過で複合体を精製した。精製した複合体を用いて結晶化条件のスクリーニングおよび最適化を行い、得られた結晶を用いて回折実験を行った。Hu003_13_F20については分解能2.05Åの、そしてHu149_83については分解能2.11Åの回折データがそれぞれ得られ、分子置換法により複合体の構造を決定した。得られた構造から相互作用部位を同定し、エピトープを決定した。
図27にX線結晶構造解析により得られたヒトTim-3 IgVドメインの構造とHu003_13_F20_scFv抗体のエピトープ部位、表39にHu003_13_F20_scFv抗体のエピトープを、それぞれ示す。ヒトTim-3に対するPhosphatidylserine結合部位は111Rと118Mであり、F-GループとC-C’ループの間に結合する。Hu003_13_F20_scFv抗体のエピトープはF-GループとC-C’ループにまたがっており、Phosphatidylserineの結合を阻害できることがわかる。この結果は実施例13の結果と一致する。
ヒトTim-3に対するヒトGalectin-9の結合部位は99Nに結合するN型糖鎖であり、Hu003_13_F20_scFv抗体はその結合部位に直接結合していない。しかし、実施例13の結果ではHu003_13_F20_sc抗体はヒトGalectin-9結合を60％程度抑制できることから、ヒトTim-3への結合による立体障害によりヒトGalectin-9の結合を阻害していると推察される。
図28にＸ線結晶構造解析により得られたヒトTim-3 IgVドメインの構造とHu149_83_scFv抗体のエピトープ部位、表40にHu149_83_scFv抗体のエピトープを、それぞれ示す。ヒトTim-3に対するPhosphatidylserine結合部位は111Rと118Mであり、F-GループとC-C’ループの間に結合する。Hu149_83_scFv抗体のエピトープはF-GループとC-C’ループには関与しておらず、Phosphatidylserineの結合を阻害しないという実施例13の結果と一致する。
ヒトTim-3に対するヒトGalectin-9の結合部位は99Nに結合するN型糖鎖であり、Hu149_83_scFv抗体はその結合部位に直接結合していない。しかし、実施例13の結果ではHu149_83_sc抗体はヒトGalectin-9結合を60％程度抑制できることから、ヒトTim-3への結合による立体障害によりヒトGalectin-9の結合を阻害していると推察される。
（22-5）バイパラトピック抗体とヒトTim-3との結合モデル
上述したHu003_13_F20_scFv抗体とヒトTim-3との結合構造解析結果（22-3）、およびHu149_83_scFvとヒトTim-3との結合構造解析結果（22-4）をもとに、バイパラトピック抗体Hu149003の結合モデルを作成した結果を図29に示す。このモデルから、ヒト化バイパラトピック抗体は、構成する2つのscFvアームが競合することなく、ヒトTim-3をはさむように結合しており、それによりHu003_13_F20_scFvでヒトTim-3とPhosphatidylserineとの結合を完全に阻害しつつ、両アームで挟むように結合することで、Tim-3の構造変化によるものか、もしくは立体障害によってヒトTim-3とGalectin-9の結合を効果的に阻害していると推察される。
上述したHu003_13_F20_scFv抗体とヒトTim-3との結合構造解析結果（22-3）、およびHu149_83_scFvとヒトTim-3との結合構造解析結果（22-4）をもとに、バイパラトピック抗体Hu149003の結合モデルを作成した結果を図29に示す。このモデルから、ヒト化バイパラトピック抗体は、構成する2つのscFvアームが競合することなく、ヒトTim-3をはさむように結合しており、それによりHu003_13_F20_scFvでヒトTim-3とPhosphatidylserineとの結合を完全に阻害しつつ、両アームで挟むように結合することで、Tim-3の構造変化によるものか、もしくは立体障害によってヒトTim-3とGalectin-9の結合を効果的に阻害していると推察される。
本発明により得られた抗体等は、がん細胞あるいは免疫細胞に発現するTim-3の機能を抑制し、免疫細胞（特にT細胞）の疲弊を解除することにより、免疫細胞を活性化し、腫瘍増殖抑制効果とがん治療効果を発揮する。
本発明は、がんの治療・診断薬として幅広く使用可能である。本発明による抗体は免疫細胞の疲弊を解除する効果を有することから、特に他の免疫治療との併用治療において有効となることが期待される。
Claims (26)
- Tim-3抗原に対して結合性を有し、がん細胞に対する免疫活性を増強する、2種の異なる半分子の組み合わせであるヘテロダイマー型の抗体または抗体誘導体。
- 抗体の半分子または抗体誘導体の半分子の一方が、Tim-3抗原の第一の領域と結合し、抗体の半分子または抗体誘導体の半分子のもう一方が、Tim-3抗原の第二の領域と結合する、請求項1に記載の抗体または抗体誘導体。
- 抗体の半分子または抗体誘導体の半分子が、
（1） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（SYYMS、SEQ ID No: 1）、CDR2（TISNSGGSIYYLDSVKD、SEQ ID No: 2）、およびCDR3（DPYYSNYVPMDY、SEQ ID No: 3）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQYVDTYVA、SEQ ID No: 4）、CDR2（SASTRHT、SEQ ID No: 5）、およびCDR3（AQYSSSPLT、SEQ ID No: 6）；
（2） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No: 9）、CDR2（YIYPNNGGTSYNQKFKG、SEQ ID No: 10）、およびCDR3（SGYGNYYTMDY、SEQ ID No: 11）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No: 12）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No: 13）、およびCDR3（QQHYSSPST、SEQ ID No:14）；
（3） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:17）、CDR2（YIYPNNGGTSYNQKFKG、SEQ ID No:18）、およびCDR3（GGYYSYYSYDY、SEQ ID No:19）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:20）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:21）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:22）；
（4） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:25）、CDR2（YIYPNNGGTSYNQKFKG、SEQ ID No:26）、およびCDR3（SGYKAYYAMDY、SEQ ID No:27）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:28）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:29）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:30）；
（5） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（SYYMS、SEQ ID No:33）、CDR2（TISNSGGSTYYPDSVKD、SEQ ID No:34）、およびCDR3（DPYYTNYVPMDY、SEQ ID No:35）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQYVDTYVA、SEQ ID No:4）、CDR2（SASTRHT、SEQ ID No:5）、およびCDR3（AQYSSSPLT、SEQ ID No: 6）；
（6） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（SYYMS、SEQ ID No: 33）、CDR2（TISNSGGSTYYPDSVKD、SEQ ID NO: 34）、およびCDR3（DPYYTNYVPMDY、SEQ ID NO: 35）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASENVGTYVS、SEQ ID NO: 52）、CDR2（GASNRYT、SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（GQSYSYPLT、SEQ ID NO: 54）；
（7） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No: 9）、CDR2（YIYPNNAGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 74）、およびCDR3（SGYGNYYTMDY、SEQ ID No: 11）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No: 12）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No: 13）、およびCDR3（QQHYSSPST、SEQ ID No:14）；
（8） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No: 9）、CDR2（YIYPNKGGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 76）、およびCDR3（SGYGNYYTMDY、SEQ ID No: 11）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No: 12）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No: 13）、およびCDR3（QQHYSSPST、SEQ ID No:14）；
（9） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:17）、CDR2（YIYPNNAGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 78）、およびCDR3（GGYYSYYSYDY、SEQ ID No:19）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:20）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:21）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:22）；
（10） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:17）、CDR2（YIYPNKGGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 80）、およびCDR3（GGYYSYYSYDY、SEQ ID No:19）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:20）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:21）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:22）；
（11） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:25）、CDR2（YIYPNNAGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 82）、およびCDR3（SGYKAYYAMDY、SEQ ID No:27）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:28）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:29）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:30）；
（12） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:25）、CDR2（YIYPNKGGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 84）、およびCDR3（SGYKAYYAMDY、SEQ ID No:27）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:28）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:29）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:30）；
からなる群から選択されるいずれかの重鎖・軽鎖の相補性決定領域を含む抗体の半分子または抗体誘導体の半分子の異なる2種の組み合わせである、請求項1または2に記載の抗体または抗体誘導体。 - 抗体の半分子または抗体誘導体の半分子の一方が（1）、（5）または（6）の半分子であり、抗体の半分子または抗体誘導体の半分子のもう一方が（2）～（4）、（7）～（12）のいずれかの半分子である、請求項3に記載の抗体または抗体誘導体。
- 抗体誘導体が、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖Fv抗体（scFv抗体）、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fcエフェクター機能改変抗体、IgG1LALA、IgG1_N297A、IgG4_S228Pから選択される抗体改変体またはその機能的断片から選択される、請求項1～4のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体。
- 抗体の半分子または抗体誘導体の半分子の重鎖可変領域VHドメインのアミノ酸配列が、
（VH-1a）SEQ ID No: 7のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 7のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 1）、CDR2（SEQ ID No: 2）、およびCDR3（SEQ ID No: 3）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-1b）SEQ ID No: 49のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 49のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 1）、CDR2（SEQ ID No: 2）、およびCDR3（SEQ ID No: 3）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-1c）SEQ ID No: 57のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 57のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 1）、CDR2（SEQ ID No: 2）、およびCDR3（SEQ ID No: 3）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-2a）SEQ ID No: 15のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 15のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 10）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-2b）SEQ ID No: 62のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 62のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 10）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-3a）SEQ ID No: 23のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 23のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 17）、CDR2（SEQ ID No: 18）、およびCDR3（SEQ ID No: 19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-3b）SEQ ID No: 66のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 66のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 17）、CDR2（SEQ ID No: 18）、およびCDR3（SEQ ID No: 19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-4a）SEQ ID No: 31のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 31のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 25）、CDR2（SEQ ID No: 26）、およびCDR3（SEQ ID No: 27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VH-4b）SEQ ID No: 70のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 70のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 25）、CDR2（SEQ ID No: 26）、およびCDR3（SEQ ID No: 27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VH-5a）SEQ ID No: 36のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 36のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-5b）SEQ ID No: 51のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 51のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-5c）SEQ ID No: 59のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 59のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-6a）SEQ ID No: 55のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 55のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-6b）SEQ ID No: 51のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 51のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-6c）SEQ ID No: 59のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 59のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-7）SEQ ID No: 75のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 75のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 74）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-8）SEQ ID No: 77のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 77のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 76）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-9）SEQ ID No: 79のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 79のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:17）、CDR2（SEQ ID No: 78）、およびCDR3（SEQ ID No:19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-10）SEQ ID No: 81のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 81のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:17）、CDR2（SEQ ID No: 80）、およびCDR3（SEQ ID No:19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-11）SEQ ID No: 83のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 83のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:25）、CDR2（SEQ ID No: 82）、およびCDR3（SEQ ID No:27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-12）SEQ ID No: 85のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 85のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:25）、CDR2（SEQ ID No: 84）、およびCDR3（SEQ ID No:27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
からなる群から選択される、請求項1～5のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体。 - 抗体の半分子または抗体誘導体の半分子の軽鎖可変領域VLドメインのアミノ酸配列が、
（VL-1a）SEQ ID No: 8のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 8のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-1b）SEQ ID No: 58のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 58のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-1c）SEQ ID No: 50のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 50のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2a）SEQ ID No: 16のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 16のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2b）SEQ ID No: 63のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 63のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2c）SEQ ID No: 64のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 64のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2d）SEQ ID No: 65のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 65のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3a）SEQ ID No: 24のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 24のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3b）SEQ ID No: 67のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 67のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3c）SEQ ID No: 68のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 68のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3d）SEQ ID No: 69のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 69のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-4a）SEQ ID No: 32のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 32のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-4b）SEQ ID No: 71のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 71のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-4c）SEQ ID No: 72のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 72のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-4d）SEQ ID No: 73のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 73のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-5a）SEQ ID No: 8のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 8のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-5b）SEQ ID No: 58のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 58のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-5c）SEQ ID No: 50のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 50のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-6a）SEQ ID No: 56のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 56のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID NO: 52）、CDR2（SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（SEQ ID NO: 54）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-6b）SEQ ID No: 60のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 60のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID NO: 52）、CDR2（SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（SEQ ID NO: 54）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-6c）SEQ ID No: 61のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 61のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID NO: 52）、CDR2（SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（SEQ ID NO: 54）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
からなる群から選択される、請求項1～6のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体。 - 抗体誘導体が、一本鎖Fv抗体（scFv）を構成する半分子の可変領域：
（1）前記（VH-1a）、（VH-1b）または（VH-1c）の重鎖可変領域と前記（VL-1a）、（VL-1b）または（VL-1c）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合した結合したもの、
（2）前記（VH-2a）または（VH-2b）の重鎖可変領域と前記（VL-2a）、（VL-2b）、（VL-2c）または（VL-2d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（3）前記（VH-3a）または（VH-3b）の重鎖可変領域と前記（VL-3a）、（VL-3b）、（VL-3c）または（VL-3d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（4）前記（VH-4a）または（VH-4b）の重鎖可変領域と前記（VL-4a）、（VL-4b）、（VL-4c）または（VL-4d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、および
（5）前記（VH-5a）、（VH-5b）または（VH-5c）の重鎖可変領域と前記（VL-5a）、（VL-5b）または（VL-5c）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（6）前記（VH-6a）、（VH-6b）または（VH-6c）の重鎖可変領域と前記（VL-6a）、（VL-6b）または（VL-6c）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（7）前記（VH-7）の重鎖可変領域と前記（VL-2a）、（VL-2b）、（VL-2c）または（VL-2d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（8）前記（VH-8）の重鎖可変領域と前記（VL-2a）、（VL-2b）、（VL-2c）または（VL-2d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（9）前記（VH-9）の重鎖可変領域と前記（VL-3a）、（VL-3b）、（VL-3c）または（VL-3d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（10）前記（VH-10）の重鎖可変領域と前記（VL-3a）、（VL-3b）、（VL-3c）または（VL-3d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（11）前記（VH-11）の重鎖可変領域と前記（VL-4a）、（VL-4b）、（VL-4c）または（VL-4d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（12）前記（VH-12）の重鎖可変領域と前記（VL-4a）、（VL-4b）、（VL-4c）または（VL-4d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
から選択される、請求項1～4のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体。 - 免疫活性の増強が、免疫抑制シグナル除去、T細胞の疲弊の解除、T細胞の増殖、T細胞のがん細胞に対する細胞傷害性の上昇、およびT細胞のサイトカイン分泌促進からなる群から選択されるT細胞の活性化である、請求項1～8のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体。
- がん細胞に対する細胞傷害性を誘導するが、正常細胞に対する細胞傷害性を誘導しない、請求項1～9のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体。
- がん細胞が、メラノーマ、乳がん、肺がん、大腸がん、胃がん、膵臓がん、肝臓がん、血液がんからなる群から選択される、請求項1～10のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体。
- （1） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（SYYMS、SEQ ID No: 1）、CDR2（TISNSGGSIYYLDSVKD、SEQ ID No: 2）、およびCDR3（DPYYSNYVPMDY、SEQ ID No: 3）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQYVDTYVA、SEQ ID No: 4）、CDR2（SASTRHT、SEQ ID No: 5）、およびCDR3（AQYSSSPLT、SEQ ID No: 6）；
（2） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No: 9）、CDR2（YIYPNNGGTSYNQKFKG、SEQ ID No: 10）、およびCDR3（SGYGNYYTMDY、SEQ ID No: 11）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No: 12）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No: 13）、およびCDR3（QQHYSSPST、SEQ ID No:14）；
（3） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:17）、CDR2（YIYPNNGGTSYNQKFKG、SEQ ID No:18）、およびCDR3（GGYYSYYSYDY、SEQ ID No:19）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:20）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:21）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:22）；
（4） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:25）、CDR2（YIYPNNGGTSYNQKFKG、SEQ ID No:26）、およびCDR3（SGYKAYYAMDY、SEQ ID No:27）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:28）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:29）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:30）；
（5） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（SYYMS、SEQ ID No:33）、CDR2（TISNSGGSTYYPDSVKD、SEQ ID No:34）、およびCDR3（DPYYTNYVPMDY、SEQ ID No:35）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQYVDTYVA、SEQ ID No:4）、CDR2（SASTRHT、SEQ ID No:5）、およびCDR3（AQYSSSPLT、SEQ ID No: 6）；
（6） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（SYYMS、SEQ ID No: 33）、CDR2（TISNSGGSTYYPDSVKD、SEQ ID NO: 34）、およびCDR3（DPYYTNYVPMDY、SEQ ID NO: 35）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASENVGTYVS、SEQ ID NO: 52）、CDR2（GASNRYT、SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（GQSYSYPLT、SEQ ID NO: 54）；
（7） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No: 9）、CDR2（YIYPNNAGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 74）、およびCDR3（SGYGNYYTMDY、SEQ ID No: 11）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No: 12）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No: 13）、およびCDR3（QQHYSSPST、SEQ ID No:14）；
（8） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No: 9）、CDR2（YIYPNKGGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 76）、およびCDR3（SGYGNYYTMDY、SEQ ID No: 11）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No: 12）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No: 13）、およびCDR3（QQHYSSPST、SEQ ID No:14）；
（9） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:17）、CDR2（YIYPNNAGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 78）、およびCDR3（GGYYSYYSYDY、SEQ ID No:19）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:20）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:21）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:22）；
（10） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:17）、CDR2（YIYPNKGGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 80）、およびCDR3（GGYYSYYSYDY、SEQ ID No:19）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:20）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:21）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:22）；
（11） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:25）、CDR2（YIYPNNAGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 82）、およびCDR3（SGYKAYYAMDY、SEQ ID No:27）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:28）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:29）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:30）；
（12） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（DYYMD、SEQ ID No:25）、CDR2（YIYPNKGGTS YNQKFKG、SEQ ID No: 84）、およびCDR3（SGYKAYYAMDY、SEQ ID No:27）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（KASQSVGNNVA、SEQ ID No:28）、CDR2（YASNRYT、SEQ ID No:29）、およびCDR3（QQHYSSPYT、SEQ ID No:30）；
からなる群から選択されるいずれかの重鎖・軽鎖の相補性決定領域を含む、Tim-3抗原に対して結合性を有し、がん細胞に対する免疫活性を増強する、ホモダイマー型の抗体または抗体誘導体。 - 抗体誘導体が、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖Fv抗体（scFv抗体）、Fab、Fab’、 F(ab’)2、Fcエフェクター機能改変抗体、IgG1LALA、IgG1_N297A、IgG4_S228Pから選択される抗体改変体またはその機能的断片から選択される、請求項12に記載の抗体または抗体誘導体。
- 抗体の半分子または抗体誘導体の半分子の重鎖可変領域VHドメインのアミノ酸配列が、
（VH-1a）SEQ ID No: 7のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 7のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 1）、CDR2（SEQ ID No: 2）、およびCDR3（SEQ ID No: 3）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-1b）SEQ ID No: 49のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 49のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 1）、CDR2（SEQ ID No: 2）、およびCDR3（SEQ ID No: 3）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-1c）SEQ ID No: 57のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 57のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 1）、CDR2（SEQ ID No: 2）、およびCDR3（SEQ ID No: 3）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-2a）SEQ ID No: 15のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 15のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 10）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-2b）SEQ ID No: 62のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 62のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 10）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-3a）SEQ ID No: 23のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 23のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 17）、CDR2（SEQ ID No: 18）、およびCDR3（SEQ ID No: 19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-3b）SEQ ID No: 66のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 66のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 17）、CDR2（SEQ ID No: 18）、およびCDR3（SEQ ID No: 19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-4a）SEQ ID No: 31のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 31のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 25）、CDR2（SEQ ID No: 26）、およびCDR3（SEQ ID No: 27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VH-4b）SEQ ID No: 70のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 70のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 25）、CDR2（SEQ ID No: 26）、およびCDR3（SEQ ID No: 27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VH-5a）SEQ ID No: 36のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 36のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-5b）SEQ ID No: 51のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 51のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-5c）SEQ ID No: 59のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 59のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-6a）SEQ ID No: 55のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 55のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-6b）SEQ ID No: 51のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 51のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-6c）SEQ ID No: 59のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 59のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 33）、CDR2（SEQ ID No: 34）、およびCDR3（SEQ ID No: 35）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-7）SEQ ID No: 75のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 75のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 74）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-8）SEQ ID No: 77のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 77のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 9）、CDR2（SEQ ID No: 76）、およびCDR3（SEQ ID No: 11）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-9）SEQ ID No: 79のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 79のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:17）、CDR2（SEQ ID No: 78）、およびCDR3（SEQ ID No:19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-10）SEQ ID No: 81のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 81のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:17）、CDR2（SEQ ID No: 80）、およびCDR3（SEQ ID No:19）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-11）SEQ ID No: 83のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 83のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:25）、CDR2（SEQ ID No: 82）、およびCDR3（SEQ ID No:27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VH-12）SEQ ID No: 85のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 85のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:25）、CDR2（SEQ ID No: 84）、およびCDR3（SEQ ID No:27）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
からなる群から選択される、請求項12または13に記載の抗体または抗体誘導体。 - 抗体または抗体誘導体の軽鎖可変領域VLドメインのアミノ酸配列が、
（VL-1a）SEQ ID No: 8のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 8のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-1b）SEQ ID No: 58のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 58のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-1c）SEQ ID No: 50のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 50のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2a）SEQ ID No: 16のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 16のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2b）SEQ ID No: 63のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 63のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2c）SEQ ID No: 64のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 64のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-2d）SEQ ID No: 65のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 65のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No:12）、CDR2（SEQ ID No:13）、およびCDR3（SEQ ID No: 14）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3a）SEQ ID No: 24のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 24のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3b）SEQ ID No: 67のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 67のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3c）SEQ ID No: 68のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 68のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-3d）SEQ ID No: 69のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 69のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 20）、CDR2（SEQ ID No: 21）、およびCDR3（SEQ ID No: 22）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-4a）SEQ ID No: 32のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 32のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-4b）SEQ ID No: 71のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 71のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-4c）SEQ ID No: 72のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 72のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-4d）SEQ ID No: 73のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 73のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 28）、CDR2（SEQ ID No: 29）、およびCDR3（SEQ ID No: 30）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、および
（VL-5a）SEQ ID No: 8のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 8のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-5b）SEQ ID No: 58のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 58のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-5c）SEQ ID No: 50のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 50のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID No: 4）、CDR2（SEQ ID No: 5）、およびCDR3（SEQ ID No: 6）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-6a）SEQ ID No: 56のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 56のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID NO: 52）、CDR2（SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（SEQ ID NO: 54）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-6b）SEQ ID No: 60のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 60のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID NO: 52）、CDR2（SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（SEQ ID NO: 54）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
（VL-6c）SEQ ID No: 61のアミノ酸配列、またはSEQ ID No: 61のアミノ酸配列のうち、CDR1（SEQ ID NO: 52）、CDR2（SEQ ID NO: 53）、およびCDR3（SEQ ID NO: 54）以外の部分において1または数個のアミノ酸の置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列、
からなる群から選択される、請求項12～14のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体。 - 一本鎖Fv抗体（scFv）を構成する半分子の可変領域が、
（1）前記（VH-1a）、（VH-1b）または（VH-1c）の重鎖可変領域と前記（VL-1a）、（VL-1b）または（VL-1c）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合した結合したもの、
（2）前記（VH-2a）または（VH-2b）の重鎖可変領域と前記（VL-2a）、（VL-2b）、（VL-2c）または（VL-2d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（3）前記（VH-3a）または（VH-3b）の重鎖可変領域と前記（VL-3a）、（VL-3b）、（VL-3c）または（VL-3d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（4）前記（VH-4a）または（VH-4b）の重鎖可変領域と前記（VL-4a）、（VL-4b）、（VL-4c）または（VL-4d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、および
（5）前記（VH-5a）、（VH-5b）または（VH-5c）の重鎖可変領域と前記（VL-5a）、（VL-5b）または（VL-5c）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（6）前記（VH-6a）、（VH-6b）または（VH-6c）の重鎖可変領域と前記（VL-6a）、（VL-6b）または（VL-6c）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（7）前記（VH-7）の重鎖可変領域と前記（VL-2a）、（VL-2b）、（VL-2c）または（VL-2d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（8）前記（VH-8）の重鎖可変領域と前記（VL-2a）、（VL-2b）、（VL-2c）または（VL-2d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（9）前記（VH-9）の重鎖可変領域と前記（VL-3a）、（VL-3b）、（VL-3c）または（VL-3d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（10）前記（VH-10）の重鎖可変領域と前記（VL-3a）、（VL-3b）、（VL-3c）または（VL-3d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（11）前記（VH-11）の重鎖可変領域と前記（VL-4a）、（VL-4b）、（VL-4c）または（VL-4d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
（12）前記（VH-12）の重鎖可変領域と前記（VL-4a）、（VL-4b）、（VL-4c）または（VL-4d）の軽鎖可変領域とをリンカーを介して結合したもの、
からなる群から選択される、請求項12または13に記載の抗体または抗体誘導体。 - 免疫活性の増強が、免疫抑制シグナル除去、T細胞の疲弊の解除、T細胞の増殖、T細胞のがん細胞に対する細胞傷害性の上昇、およびT細胞のサイトカイン分泌促進からなる群から選択されるT細胞の活性化である、請求項12～16のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体。
- がん細胞に対する細胞傷害性を誘導するが、正常細胞に対する細胞傷害性を誘導しない、請求項12～17のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体。
- がん細胞が、メラノーマ、乳がん、肺がん、大腸がん、胃がん、膵臓がん、肝臓がん、血液がんからなる群から選択される、請求項12～18のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体。
- 請求項1～19のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体を含む、がん治療のための医薬組成物。
- がんが、メラノーマ、乳がん、肺がん、大腸がん、胃がん、膵臓がん、肝臓がん、血液がんからなる群から選択される、請求項20に記載の医薬組成物。
- 被験体から採取されたがん細胞を、in vitroにおいて請求項1～19のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体と接触させる工程、
培養条件下で、がん細胞の細胞生存率が低下するかどうかを測定する工程、若しくは免疫活性化物質の分泌が亢進するかどうかを測定する工程、
を含む、がん細胞に対する細胞傷害性の亢進を予測する方法。 - 同一被験体の末梢血リンパ球の存在下で、がん細胞の細胞生存率が低下するかどうか、若しくは末梢血リンパ球由来の免疫細胞が活性化するかどうかを測定する、請求項22に記載の方法。
- 被験体から採取されたがん細胞に対するin vitroでの細胞傷害性から、請求項1～19のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体をその被験体に投与した場合のがん細胞に対する細胞傷害性の亢進を予測する、請求項22又は23に記載の方法。
- in vitroでの免疫活性化物質の分泌の亢進から、請求項1～19のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体をその被験体に投与した場合のがん細胞に対する細胞傷害性の亢進を予測する、請求項22または23に記載の方法。
- 請求項1～19のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体の、被験体から採取されたがん細胞に対する細胞傷害性、免疫活性化物質の分泌、若しくは免疫細胞の活性化を、in vitroにおいて測定するための、前記抗体を含む測定キット。
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