DE69130561T2 - Hybride Reagenzien mit der Fähigkeit, Moleküle selektiv in Zellen freizusetzen - Google Patents
Hybride Reagenzien mit der Fähigkeit, Moleküle selektiv in Zellen freizusetzenInfo
- Publication number
- DE69130561T2 DE69130561T2 DE69130561T DE69130561T DE69130561T2 DE 69130561 T2 DE69130561 T2 DE 69130561T2 DE 69130561 T DE69130561 T DE 69130561T DE 69130561 T DE69130561 T DE 69130561T DE 69130561 T2 DE69130561 T2 DE 69130561T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- hybrid
- antibody
- antigen
- antibodies
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 44
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 97
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 44
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 44
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims description 44
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 claims description 29
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 claims description 27
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 claims description 27
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 27
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 27
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 26
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 22
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 20
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 20
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 claims description 20
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 16
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 12
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 claims description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 7
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 7
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 5
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 claims description 5
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 4
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 claims description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 claims description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 2
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 claims description 2
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims 5
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims 3
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 claims 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 claims 1
- -1 antibodies Proteins 0.000 claims 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 claims 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 claims 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 claims 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims 1
- 108010053406 CRM 107 Proteins 0.000 description 38
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 14
- 102000007238 Transferrin Receptors Human genes 0.000 description 11
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 description 10
- 230000008859 change Effects 0.000 description 9
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 9
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 9
- 230000004044 response Effects 0.000 description 9
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 8
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 8
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 6
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 6
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 6
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 102000003729 Neprilysin Human genes 0.000 description 5
- 108090000028 Neprilysin Proteins 0.000 description 5
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 5
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 5
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 4
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 4
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 3
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 3
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102100031334 Elongation factor 2 Human genes 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 description 2
- 108010077519 Peptide Elongation Factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 231100000742 Plant toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 201000010897 colon adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 2
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 2
- 231100000050 cytotoxic potential Toxicity 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003123 plant toxin Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N theophylline Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(C)C2=C1NC=N2 ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000024033 toxin binding Effects 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 2
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 2
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHUWZNTUIIFHAS-XPWSMXQVSA-N 9-octadecenoic acid 1-[(phosphonoxy)methyl]-1,2-ethanediyl ester Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC MHUWZNTUIIFHAS-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102100027723 Endogenous retrovirus group K member 6 Rec protein Human genes 0.000 description 1
- 101000830030 Enterobacteria phage T4 Baseplate hub assembly protein gp26 Proteins 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 101000830031 Escherichia phage Mu Uncharacterized protein gp26 Proteins 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 102000006481 HIV Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010083930 HIV Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101000904173 Homo sapiens Progonadoliberin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000766306 Homo sapiens Serotransferrin Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010007013 Melanocyte-Stimulating Hormones Proteins 0.000 description 1
- 102000000440 Melanoma-associated antigen Human genes 0.000 description 1
- 108050008953 Melanoma-associated antigen Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 102100027467 Pro-opiomelanocortin Human genes 0.000 description 1
- 102100024028 Progonadoliberin-1 Human genes 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 101000996723 Sus scrofa Gonadotropin-releasing hormone receptor Proteins 0.000 description 1
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical group C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 1
- 239000000039 congener Substances 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- XLXSAKCOAKORKW-UHFFFAOYSA-N gonadorelin Chemical compound C1CCC(C(=O)NCC(N)=O)N1C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(CO)NC(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C(CC=1NC=NC=1)NC(=O)C1NC(=O)CC1)CC1=CC=C(O)C=C1 XLXSAKCOAKORKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009206 nuclear medicine Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 108700028325 pokeweed antiviral Proteins 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004902 response to acidity Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229940047047 sodium arsenate Drugs 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000002764 solid phase assay Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 229960000278 theophylline Drugs 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 230000007888 toxin activity Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
- C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
- C07K16/1045—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2881—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD71
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/77—Internalization into the cell
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Oncology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
- Hybride Antikörper sind Antikörper oder Antikörper- Aggregate, die für zwei unterschiedliche Antigene spezifisch sind. Hybride Antikörper können einen einzelnen Antikörper oder ein Fragment mit einer bispezifischen Antigen-Bindungsregion (zwei unterschiedliche variable Regionen) oder Aggregate aus zwei oder mehreren Antikörpern unterschiedlicher Spezifitäten umfassen.
- Verschiedene Verfahren zur Herstellung von hybriden Antikörpern sind veröffentlicht worden. Auditore- Hargreaves zeigt Verfahren zur Herstellung von hybriden Antikörpern durch Bildung von "Halbmolekülen" aus zwei elterlichen Antikörpern und nachfolgender Assoziierung unterschiedlicher Halbmoleküle. Siehe U. S. Patente 4.470.925 (1984) und 4.479.895 (1984). Mit Hilfe dieses Verfahrens wurden verschiedene Antikörper mit Spezifitäten für Meerrettich-Peroxidase, Glucose-Oxidase und Theophyllin hergestellt. In WO-A-89/11863 sind ebenfalls bispezifische Antikörper offengelegt. In EP-A-0253202 ist ein Immunkonjugat offengelegt, das bei niedrigem pH sich spaltet. In WO-A-86/01941 ist ein Konjugat eines zellspezifischen Antikörpers, der an einem anti-Ricin Antikörper gebunden ist, offengelegt.
- Reading beschreibt die Herstellung von Antikörpern mit Bindungsspezifitäten für zwei gewünschte Antigene unter Verwendung einer Quadrom- oder Triomzelle. Siehe U. S. Patent 4.474.893 (1984). Die Quadromzelle ist das Fusionsprodukt zweier unterschiedlicher Hybridomzellen, wobei jede einen Antikörper mit einer unterschiedlichen Spezifität produziert. Eine Triomzelle ist das Fusionsprodukt eines Hybridoms mit einem Lymphocyten, die Antikörper mit zwei unterschiedlichen Bindungsspezifitäten produziert. In EP-A-0068763 sind bifunktionale Antikörper offengelegt, die von Triom- oder Quadromzellen, die durch somatische Zellfusion eines Hybridoms mit einem Lymphocyten oder einem anderen Hybridom gebildet worden sind, produziert werden.
- In WO-A-86/01409, WO-A-89/11867, J. Nuclear Medicine 30(1989) Oktober Nr. 10, Seiten 1693-1701 und J. Biol. Chem. (5. Sept. 1989) 264(25) 14653-61 sind Reagenzien mit einer kovalenten Verknüpfung an eine biologisch aktive Substanz, die gut im sauren aufzureinigen ist, veröffentlicht.
- Segal et al. beschreibt im U. S. Patent 4.678.980 (1987) zielspezifische vernetzte Heteroantikörper, die als cytotoxische Agenzien verwendet werden. Staerz et al. (1986), PNAS, 83: 1453-1457 zeigt die Verwendung eines hybriden Antikörpers, der wirksam auf T-Zell-Aktivität gerichtet werden kann und Milstein et al. (1983) Nature, 305: 537-539 beschreiben die Verwendung von hybriden Antikörpern in der Immunhistochemie.
- Raso et al., Cancer Research, 41: 2073-2078 (1981) veröffentlicht die Verwendung von Antikörpern mit dualer Spezifität für das Pflanzentoxin Ricin und Immunoglobulin-tragende Zielzellen. Die hybriden Antikörper wurden in vitro hergestellt und die Anheftung des hybrider Antikörper-Ricin Komplexes an die menschlichen Zielzellen wurde mit Hilfe von Fluorescein-markierten Antikörpern beobachtet. Bei Bindung wurden die menschlichen Zielzellen durch das Hybrid-überbrachte Toxin selektiv abgetötet.
- Vor der Verwendung von hybriden Antikörpern wurden chemische Vernetzungsverfahren oder unspezifische Absorptionsverfahren verwendet, um Medikamente und/oder Toxine an Antikörper-Träger zu koppeln. Diese Agenzien besitzen bestimmte Beschränkungen aufgrund der Natur der Verknüpfung. Die Verknüpfung kann das Medikament oder Toxin verändern, so daß die therapeutische oder toxische Aktivität vermindert ist. Außerdem kann ein Spalten der kovalenten Bindung geschwindigkeitslimitierend auf die Toxin-Wirkung innerhalb der Zelle sein.
- Die Verwendung von hybriden Antikörpern umging einige der Probleme, die mit den chemischen Vernetzungsverfahren oder nicht-spezifischen Absorptionsverfahren verbunden waren; obwohl neue Probleme auftraten. Weil das Medikament oder Toxin an den Antikörper gebunden ist, ist die therapeutische oder toxische Aktivität im allgemeinen gehemmt. Durch hybride Antikörper bereitgestellte Toxine oder Medikamente sind, wenn sie an den Antikörper gebunden sind, inaktiv und werden erst nach Freisetzung aktiv. Jedoch besitzen gegenwärtig erhältliche Antikörper keinen Mechanismus zur Freisetzung des Toxins oder Medikamentes von der entsprechenden Antikörperbindungsregion, wenn der hybride Antikörper die Zielstelle oder das Innere der Zelle erreicht. Statt dessen sind sie auf eine zufällige Dissoziation angewiesen. Folglich müssen relativ große Mengen an Medikament- oder Toxin-haltigen hybriden Antikörpern verabreicht werden, weil nur eine kleine Mengen des Medikaments oder Toxins dissoziieren und aktiv werden wird.
- Diese Erfindung betrifft hybride Reagenzien, die einen ersten Teil mit einer Affinität für ein zelluläres Ziel (z. B. Antikörper, Virus, Ligand, Rezeptor oder Molekül) und einen zweiten Teil mit einer Affinität für ein bioaktives Molekül (z. B. Toxin, Medikament, Enzym oder Metall) umfassen. Die hybriden Reagenzien können in vivo verabreicht werden, wo sie an die äußere Oberfläche einer Zelle binden. Wenn sie an die Zelle gebunden haben, dient eine Rezeptor-vermittelte Endozytose dazu, die Oberfläche der Zelle einzustülpen und ein Endosom zu bilden, das einen niedrigeren pH als außerhalb oder innerhalb der Zelle besitzt. Als Antwort auf die pH- Änderung innerhalb des Endosoms setzen die hybriden Reagenzien dieser Erfindung die bioaktiven Moleküle selektiv frei. Wenn das bioaktive Molekül frei ist, kann es seine Funktion erfüllen.
- Deshalb ist ein Hauptvorteil der hybriden Reagenzien dieser Erfindung gegenüber gegenwärtig verfügbaren hybriden Antikörpern, die auf eine zufällige Dissoziation bioaktiver Moleküle angewiesen sind, daß weniger von dem Hybrid und dem bioaktiven Molekül notwendigerweise verabreicht werden muß, um die gewünschte diagnostische oder therapeutische Wirkung zu erreichen.
- Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen, die besagte hybride Reagenzien mit einem daran gebundenen bioaktiven Molekül umfassen, und ein Verfahren zur Selektion von Antikörpern oder Fragmenten davon, die in der Lage sind, ein bioaktives Molekül bei einem pH zu binden und das Molekül als Antwort auf eine pH-Änderung freizusetzen.
- Abb. 1 ist ein schematisches Diagramm, das das Überbringen eines bioaktiven Moleküls von einem hybriden Reagenz an eine Zelle mittels Rezeptor-vermittelter Endocytose und Freisetzung des bioaktiven Moleküls als Antwort auf den innerhalb eines zellulären Endosoms vorgefundenen niedrigeren pH-Wert darstellt.
- Abb. 2 ist eine graphische Darstellung, die die prozentuale Dissoziation (d. h. Freisetzung) des monoklonalen Antikörpers 6B3 vom Diphtherietoxin über einen Zeitraum von 100 Minuten bei pH 4,5 und einer Temperatur von 22ºC und 37ºC darstellt.
- Abb. 3 ist eine graphische Darstellung, die die prozentuale Dissoziation des monoklonalen Antikörpers 6B3 vom Diphtherietoxin über einen Zeitraum von 30 Minuten bei pH 5,0 und 4,5 bei 37ºC darstellt.
- Abb. 4 ist eine graphische Darstellung, die die prozentuale Dissoziation der monoklonalen Antikörper 5A7 und 1F3 vom Diphtherietoxin über einen Zeitraum von 60 Minuten bei pH 5,0 und 37ºC darstellt
- Abb. 5 ist eine graphische Darstellung, die den prozentualen ³H-Leucin-Einbau über einen Zeitraum von 180 Minuten als ein Maß der Proteinsynthese-Inaktivierung durch natives Diphtherietoxin und Hybrid überbrachtes CRM107 in H-meso Zellen darstellt.
- Abb. 6 ist eine graphische Darstellung, die die Toxizitätsdosis-Antwortkurve für Hybride und Konjugate darstellt, die 16 Stunden mit Transferrin-Rezeptor positiven CEM Zellen inhibiert wurden.
- Abb. 7 ist eine graphische Darstellung, die die Toxizitätsdosis-Antwortkurve für HIV- und Transferrin-Rezeptor-gerichtete Hybride auf HIV-infizierte 8E5 Zellen darstellt.
- Die hybriden Reagenzien dieser Erfindung umfassen einen ersten Teil mit einer Affinität für ein zelluläres Ziel und einen zweiten Teil mit einer Affinität für ein bioaktives Molekül (z. B. ein Toxin, Medikament, Metall oder ein Enzym). Die hybriden Reagenzien können in vivo verabreicht werden, wo sie an die äußere Oberfläche einer Zelle binden. Wenn sie an die Zelle gebunden haben, dient eine Rezeptor-vermittelte Endocytose, die Oberfläche der Zelle einzustülpen und ein Endosom zu bilden, das einen geringeren pH-Wert hat als außerhalb oder innerhalb der restlichen Zelle. Als Antwort auf die pH-Änderung innerhalb des Endosoms setzen die hybriden Reagenzien das bioaktive Molekül selektiv frei. Der erste Teil des Hybrids kann zum Beispiel ein Ligand (z. B. Transportproteine wie beispielsweise Transferrin, Interleukin-2, LDL), ein Wachstumsfaktor (z. B. EGF, PDGF) ein Antikörper, ein Hormon, ein Rezeptor-Molekül (z. B. rekombinantes CD4), ein Virus oder ein Fragment davon sein und der zweite Teil ist ein Antikörper oder ein Antikörperfragment.
- Der erste Teil des hybriden Reagenzes besitzt eine Affinität für ein zelluläres Ziel, wie beispielsweise eine Antigen- oder Rezeptorstelle auf der Oberfläche oder im Innern einer Zelle (d. h. ein Zelloberfächenantigen oder Zelloberflächenrezeptor). Beispiele für zelluläre Ziele sind Ig, allgemeine akute lymphatische Leukämie Antigen (CALLA), B1, gp26, Ia, Transferrin-Rezeptor, EBV Transformationsantigen und die Rezeptoren für Liganden wie beispielsweise Interleukin-2, MSH, Insulin, Thyroglobulin, LHRH und NGF. Virale Proteine auf der Oberfläche infizierter Zellen (z. B. HIV-infizierte T- Lymphocyten) können ebenfalls als Ziele für Antikörper- und Rezeptor-geleitete hybride Reagenzien dienen.
- Der zweite Teil des hybriden Reagenzes ist ein Antikörper oder Antikörperfragment, der/das eine Affinität für ein bioaktives Molekül bei einem pH besitzt und das bioaktive Molekül als Antwort auf eine pH- Änderung freisetzt. Dieses Binden und Freisetzen kann auf mehreren Mechanismen beruhen. Zum Beispiel kann der zweite Teil des hybriden Reagenzes eine Affinität für ein bioaktives Molekül besitzen, das eine Konformationsänderung als Antwort auf eine pH-Änderung erfährt. Derartige Moleküle können mit Hilfe physikalischer oder anderer in der Technik bekannter Verfahren (z. B. Zirkulardichroismus, Fluoreszenz) identifiziert werden. Als weiteres Beispiel kann der zweite Teil des hybriden Reagenzes ionisch an ein bioaktives Molekül bei einem pH binden und die ionische Bindung kann als Antwort auf eine pH-Änderung gelöst werden.
- Ein Verfahren zur Isolierung von Antikörpern, die von Molekülen als Antwort auf eine pH-Änderung dissoziieren, ist detailliert im Beispiel 1 beschrieben. Im allgemeinen werden Antikörper gegen ein bioaktives Molekül mit Hilfe bekannter Techniken hergestellt. Klon- Überstände werden dann auf die Fähigkeit getestet, das Molekül bei dem gewählten ersten pH zu binden. Auf Bindungsfähigkeit positiv getestete Klone werden durchmustert, um diejenigen zu isolieren, die das Molekül bei einem gewählten zweiten pH freisetzen. Zum Beispiel können Antikörper, die ein bioaktives Molekül bei physiologischen pH (pH etwa 6,5 bis 7,5) binden, getestet werden, um diejenigen Klone zu isolieren, die die Moleküle bei saurem pH (pH geringer als 6,5) freisetzen.
- Beispiele für bioaktive Moleküle sind Pflanzen- oder Bakterientoxine, Medikamente, Enzyme und Metalle. Beispiele für zweckdienliche Toxine sind Diphtherietoxin, Pseudomonaden-Exotoxin, Ricin, antivirales Kermesbeeren- Peptid (PAP), Tricathecum. Die Toxine können ebenfalls genetisch oder chemisch verändert oder mutiert sein wie beispielsweise CRM107 (Laird J. Virol., 19: 220-227 (1976)) und HA48DT und HA51DT (Myers et al., J. Biol. Chem., 263: 17122-17127 (1988)). Medikamente, die in dieser Erfindung verwendet werden können, sind zum Beispiel Interferon, Insulin und Methotrexat. Beispiele für Metalle, die in dieser Erfindung verwendet werden können, sind Radiometalle (z. B., Tc-99 m, In-111, Cu-67, Pd-109, Pd-103, Re-188, Au-198, Au-199, Ru-97, Hg-197, Ag-111, Bi-212, Os-191 und Pb-203) und nicht-radioaktive Metalle (z. B. Zink).
- Abb. 1 stellt eine Rezeptor-vermittelte Endocytose eines hybrides Reagenz-Molekül Komplexes dar. Der erste Teil des hybriden Reagenzes bindet an die äußere Oberfläche der Zelle, die eingestülpt wird, um ein Endosom zu bilden. Endosome besitzen einen geringeren pH (z. B. etwa 4,5-5, 5) als der pH außerhalb oder innerhalb der restlichen Zelle (z. B. pH etwa 6,5-7,5) (Geisow, M. L. und W. H. Evans, Exn. Cell Res., 150: 36-46 (1984)). Deshalb kann bei Verwendung eines hybriden Reagenzes, wo der erste Teil eine Affinität für eine Zelloberflächenkomponente besitzt und der zweite Teil eine Affinität für ein bioaktives Molekül bei physiologischem pH besitzt und als Antwort auf einen sauren pH dissoziiert, ein Molekül in eine Zelle befördert werden und innerhalb saurer Kompartimente von Zellen, wie beispielsweise Endosome, freigesetzt werden.
- Die hybriden Reagenzien können mittels Verknüpfen des ersten und zweiten Teils unter Verwendung bekannter Verfahren (z. B. chemische Kopplung, Zellfusion oder gentechnologische Verfahren) hergestellt werden. Die hybriden Reagenzien werden vorzugsweise durch chemische Kopplung zweier Teile miteinander hergestellt. Zum Beispiel kann eine Disulfidbindung unter Verwendung von N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP) als das vernetzende Agens verwendet werden. (Raso et al., NATO Advanced Studies Institute, 82: 119-138 (1984)). Beide Teile werden mit Pyridyldisulfid-Gruppen, die in einem der Teile zu Thiolen reduziert werden, teilweise substituiert. Bei Mischen der beiden Teile reagieren die freien Thiole in einem Teil ohne weiteres mit den nichtreduzierten Gruppen in dem zweiten Teil und bilden Di sulfidbindungen. Die resultierenden Hybride können dann mittels Gelfiltration gereinigt werden.
- Wenn sowohl der erste als auch der zweite Teil des hybriden Reagenzes Antikörper sind, können zwei vollständige elterliche Antikörper miteinander verknüpft werden, um das hybride Reagenz (d. h. hybriden Antikörper) herzustellen. Eine Reihe an vernetzenden Agenzien, wie beispielsweise Protein A, Carbodiimid und N-Succinimidyl- 3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP) können verwendet werden, um die vollständigen elterlichen Antikörper zu verbinden (Kranz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 587 (1981); U. S. Patent 4.474.893)).
- Die hybriden Antikörper können ebenfalls mittels chemischer Verknüpfung elterlicher Antikörperfragmente hergestellt werden, die einen hinreichenden Anteil der Antigenbindungsregion enthalten, um dem Fragment ein Binden an seinem Antigen zu ermöglichen (Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys., 93: 460-467 (1961) und Raso et al., Cancer Research, 41: 2073-2078 (1981)). Die beiden elterlichen Antikörpertypen (d. h. ein Typ wird der erste Teil des hybriden Antikörpers und der andere Typ wird der zweite Teil) können dann separat mit Pepsin verdaut werden. Bivalente F(ab')&sub2; Moleküle werden nach einem Trennschritt wie beispielsweise Chromatographie erhalten. Gleiche Mengen der 2F(ab')&sub2; Typen können dann gemischt werden und nach Reduktion ihrer Disulfidbrücken zwischen den schweren Ketten dürfen die resultierenden Fab' Fragmenten sich in zufälliger Weise in F(ab')&sub2; Dimere mit dualer Spezifität zusammenfügen. Die dualen Spezifitäten des hybriden Produkts können mittels auf Zellen basierenden und Festphasen-Tests, wo radioaktive oder fluoreszierende Sonden verwendet werden, verifiziert werden (Raso, V., Immunol. Reviews, 62: 93-117(1982).
- Alternativ können die intrinsischen Disulfidbrücken der F(ab')&sub2; Moleküle zu Thiolen reduziert werden, und die entstandenen vicinalen Thiole können stabilisiert werden (z. B. mit Natriumarsenat). Ellmanns Reagenz kann verwendet werden, um in einem Typ der Fab' Fragmente die vicinalen Thiole zu aktivieren. Bei Mischen des reduzierten Fab' Fragments mit einem aktivierten Fab' Fragment wird ein ausschließlich bispezifisches Hybrid gebildet (Brennan, M., et al., Science, 228: 81-83 (1985)).
- Die hybriden Antikörper können ebenfalls unter Verwendung von Zellfusionsverfahren, wie im U. S. Patent 4.474.893 beschrieben, nach Reading hergestellt werden. In diesem Verfahren werden Hybridomzellen, die die elterlichen Antikörper sezernieren, miteinander fusioniert, um Quadrom- oder Triomzellen zu bilden. Diese Quadrom- oder Triomzellen sezernieren bispezifische Antikörper, die die Antigenbindungsregion beider elterlichen Antikörper besitzen.
- Außerdem können die hybriden Antikörper mit Hilfe gentechnischer Verfahren hergestellt werden. In diesen Verfahren wird DNS, die die schweren und leichten Ketten der variablen Regionen von jedem elterlichen Antikörper codiert, in eine geeignete Wirtszelle vorzugsweise eine Lymphoid-Zelle (z. B. eine Myelomzelle) eingeführt. Die transformierte Zelle kann dann den hybriden Antikörper synthetisieren, zusammenfügen und sezernieren.
- Die für die Herstellung des hybriden Antikörpers verwendeten elterlichen Antikörper können aus den gegenwärtig erhältlichen ausgewählt oder können speziell hergestellt werden. Die elterlichen Antikörper können unter Verwendung der konventionellen monoklonalen Antikörper-Methodik (z. B. das somatische Zellhybridisierungsstandardverfahren nach Köhler und Milstein, Nature, 254: 495 (1975)) erhalten werden.
- Geeignete Antikörper, die spezifisch gegen Tumorassoziierte Antigene sind und deshalb geeignet sind, den ersten Teil des hybriden Reagenzes zu umfassen, sind beispielsweise 7D3, gerichtet gegen den menschlichen Transferrin-Rezeptor, (Griffin et al., Cancer Res., 47: 4266 (1987)); C19, gerichtet gegen das karzinoembryonale Antigen, (Griffin et al., J. Biol. Resp. Modif., 1: 194 (1982)); 260F9, gerichtet gegen ein Brustkrebs-Antigen, (Bjorn et al., Cancer Res., 45: 1214 (1985)); 96.5, gerichtet gegen ein Melanom-assoziiertes Antigen, (Casellas et al., In. J. Cancer, 30: 437 (1982)); 45-2D9, gerichtet gegen ein Oncogenprodukt, (Roth et al., J. Immunol., 136: 2305 (1986) und J-5, gerichtet gegen das allgemeine akute lymphatische Leukämie Antigen, (Raso et al., Cancer Res., 42: 457 (1982)).
- Geeignete Antikörper, die spezifisch gegen Diphtherietoxin gerichtet sind und in der Lage sind, das Toxin als Antwort auf eine pH-Änderung, vom physiologischen zum sauren, freizusetzen, sind D5E8, D1F3, D3E1, D6B3, D5D5, D1D5, D5F5, und D4B7. Diese Antikörper sind deshalb geeignet, den zweiten Teil des hybriden Reagenzes zu umfassen.
- Die hier beschriebenen hybriden Reagenzien können für diagnostische Zwecke verwendet werden. Zum Beispiel können hybride Moleküle verwendet werden, die einen ersten Teil, der eine Affinität für eine Tumorzelle besitzt, und einen zweiten Teil, der eine Affinität für ein Radiometall besitzt, umfassen, um ein Radiometall innerhalb von Tumorzellen zu deponieren und auf diese Weise ein szintigraphisches Bild des Tumors zu erhalten.
- Hybride Reagenzien dieser Erfindung können ebenfalls für therapeutische Zwecke verwendet werden. Zum Beispiel können hybride Moleküle, die einen ersten Teil mit einer Affinität für ein Virus-assoziiertes Antigen (z. B. HIV-Antigen) oder für einen Virus-assoziierten Rezeptor und einen zweiten Teil mit einer Affinität für ein bioaktives Molekül umfassen, therapeutisch verwendet werden, um eine Virus-infizierte Zelle abzutöten oder Virus-infizierte Zellen anderweitig zu modifizieren. Ähnlich können hybride Moleküle, die einen ersten Teil mit einer Affinität für ein Tumor-assoziiertes Antigen oder einen Tumor-assoziierten Rezeptor und einen zweiten Teil mit einer Affinität für ein bioaktives Molekül umfassen, therapeutisch verwendet werden, um Tumorzellen abzutöten oder anderweitig zu modifizieren.
- Wenn das hier beschriebene hybride Reagenz in einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet wird, kann es auf vielfältige Art und Weise verabreicht werden. Zum Beispiel intravenös, parenteral, transdermal, subkutan oder über ein implantiertes Reservoir, das das hybride Moleküle enthält. Die Form, in der das hybride Molekül verabreicht wird (z. B. Lösung, Emulsion), hängt von dem Verabreichungspfad ab. Die Menge des zu verabreichenden hybriden Moleküls wird auf einer individuellen Grundlage bestimmt und berücksichtigt zumindest teilweise das individuelle Gewicht, die Schwere der zu behandelnden Symptome und das erstrebte Ergebnis.
- Diese Erfindung wird ferner durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
- Mäuse wurden mit schrittweise steigenden Dosen an aktivem Diphtherietoxin (1 ug - 3 ug I. P.) oder mit einer hohen Dosis an Formalin-inaktiviertem Diphtherietoxoid (100 ug I. P.) immunisiert. Nach einer Booster-Injektion des Immunogens wurde die Milz entfernt und mit NS-1 Zellen fusioniert, um Hybridome zu bilden (Köhler und Milstein, Nature, 256: 495 (1975)). Die Überstände aus Mikrotitervertiefungen mit Klonen wurden unter Verwendung eines Polyethylenglykolpräzipitationsverfahrens auf die Fähigkeit, ¹²&sup5;I Diphtherietoxin zu binden, getestet.
- Antikörperpositive Überstände banden üblicherweise 25.000 cpm, während negative und Kontrollen nur 4.000 cpm banden. Bei einer typischen Fusion wurden annähernd 35 positive Klone aus einer Milz eines einzigen Tieres erhalten.
- Ein zweiter Test wurde entwickelt, um den Einfluß des pH auf die Interaktion zwischen Diphtherietoxin und den verschiedenen monoklonalen Antikörpern zu untersuchen. Diphtherietoxin (100 ul mit 300 ug/ml) wurden an Polyvinylmikrotiter-Vertiefungen absorbiert, der Überschuß wurde mit PBS weggewaschen. Dann wurden Antikörper (100 ul mit 1-50 ug/ml) zugegeben, und zwei Stunden reagieren gelassen, und dann wurde die Platte mit PBS gewaschen. Anhaftender Antikörper wurde durch nachfolgende Zugabe eines ¹²&sup5;I-Ziege anti-Maus IgG Reagenzes (der Hintergrund lag annähernd bei 100 cpm, positive Klone banden annähernd 1.000-3.000 cpm) erkannt.
- Um die Wirkungen des pH auf die Toxin-Freisetzung zu testen, durfte der Antikörper an das immobilisierte Diphtherietoxin zwei Stunden in Replika-Vertiefungen binden und dann wurde eine kleines Volumen an konzentriertem Puffer zugegeben, um einen pH-Endwert von 7,0, 5,0, oder 4,5 zu liefern. Eine Dissoziation wurde für unterschiedliche Zeitintervalle (5-90 Minuten) entweder bei 23ºC oder 37ºC (normale Körpertemperatur) gestattet. Freigesetzter Antikörper wurde umgehend mit PBS von den Platten gewaschen und die verbliebene Menge wurde mit Hilfe einer ¹²&sup5;I-Ziege anti-Maus IgG Sonde bestimmt.
- Dieses Verfahren wurde verwendet, um 23 Klone, die einen Antikörper produzierten, der schnell vom Diphtherietoxin bei einem pH von 4.5 dissoziierte, und acht Klone mit einem Antikörper, der für eine Freisetzung bei einem pH von 5,0 sensitiv war, zu identifizieren. Eine Freisetzung bei einem pH von 7,0 fand nicht statt.
- Der zeitliche Verlauf der Dissoziation bei pH 4,5 für einen dieser monoklonalen Antikörper (D6B3) ist in Abb. 2 gezeigt. Bei 23ºC war die Freisetzungsrate langsamer und weniger vollständig als bei 37ºC. Annähernd 80 Prozent des anfänglich gebundenen Antikörpers dissoziierte vom Diphtherietoxin und das meiste dissoziierte innerhalb der ersten 5 Minuten. Es ist bekannt, daß das Diphtherietoxin an den Testplatten haften bleibt, da die Bindung von unterschiedlichen Klonen abgeleiteten monoklonalen Antikörpern vollständig unbeeinflußt bei den gleichen Säurebedingungen blieb.
- Abb. 3 zeigt, daß die Bindungsinteraktion von diesem D6B3 Antikörper mit nur 25 Prozent Dissoziation in 30 Minuten wesentlich weniger empfindlich gegenüber einer Freisetzung bei pH 5,0 war im Gegensatz zu 80 Prozent bei pH 4,5. Die Freisetzungskinetik für zwei monoklonale Antikörper, die bei pH 5,0 bei 37ºC dissoziierten, ist in Abb. 4 gezeigt. Die Bindungsinteraktion zwischen D5A7 und Diphtherietoxin wurde gerade bei pH Werten höher als 5,5 unterbrochen. Folglich wird ein wesentlicher Teil vom Diphtherietoxin schnell durch diese unterschiedlichen Antikörper bei den präzisen pH- und Temperaturbedingungen freigesetzt, die auch in endosomalen Vesikeln und anderen sauren Kompartimenten innerhalb der Zelle gefundenen werden (Geisow, J. L. und W. H. Evans, Exp. Cell Res., 150: 36-46 (1984)).
- Es wurde gezeigt, daß die pH-abhängige Spaltung von Antikörper und Toxin auf Konformationsänderungen in dem Toxin beruht. Folglich ist der t1/2 = 1-2 für die durch Säure-ausgelöste Dissoziation von Antikörper und Toxin nah bei dem t1/2 = 30 sec für die pH-induzierte Transition von freiem Toxin (Blewitt, M. G., et al. Biochem., 24: 5458-5464 (1985)). Außerdem band der D6B3 Antikörper bei pH 7,0 an Formalin-stabilisiertes Diphtherietoxoid, wurde aber nicht freigesetzt, wenn der pH auf 4,5 vermindert wurde. Offensichtlich verhinderte die chemische Vernetzung des Toxoids die pH-induzierte Transition, die D6B3 ein Dissoziieren vom nativen Toxin ermöglicht.
- Hybride Antikörper wurden mit verschiedenen anti- Diphtherietoxin Antikörpern durch deren Verknüpfung mit monoklonalen anti-Transferrin-Rezeptor Antikörpern mit Hilfe eines zuvor beschriebenen Verfahrens (Raso, F., et al., NATO Advanced Studies Institute, 82: 119-138 (1984)) gebildet. Die duale Spezifität und Fähigkeit dieser Hybride, auf eine Zelle zu zielen, wurde unter Verwendung von ¹²&sup5;I-Diphtherietoxin (hiernach ¹²&sup5;I-DT) gezeigt. Von einem Patienten mit T-Zell-Leukämie abstammende CEM Zellen (Foley, G. E., et al., Cancer, 18: 522-529 (1965)), die auf ihrer Oberfläche sehr viele Transferrin- Rezeptoren besitzen, wurden als eine Testlinie für anti- Transferrin-Rezeptor/anti-Diphtherietoxin Hybride und zwei unterschiedliche Überbringungswege getestet. Die Zellen wurden entweder mit dem Hybrid vorbehandelt und gewaschen, so daß die freien Toxin-Bindungsstellen der Oberflächen-gebundenen Hybride dann später zugegebenes ¹²&sup5;I-DT einfangen können; oder Hybrid plus ¹²&sup5;I-DT wurde vorkomplexiert und dann als einziges Agens für eine Reaktion mit den Zelloberflächen-Transferrin-Rezeptoren verwendet.
- CEM Zellen wurden mit den in Tabelle I bezeichneten Komponenten 30 Minuten bei 0ºC inkubiert und dann mit PBS gewaschen, um nicht gebundenes Hybrid zu entfernen. Sie wurden dann ¹²&sup5;I-DT 30 Minuten bei 0ºC ausgesetzt, mit PBS gewaschen und gezählt, um die an die Zellen gebundene Menge zu messen.
- Die Ergebnisse in Tabelle I zeigen, daß anti-Transferrin-Rezeptor/anti-Diphtherietoxin Hybrid (7D3/D1F3) ausgesetzte Zellen fünf mal höhere Mengen an ¹²&sup5;I-DT banden als unbehandelte Zellen. Dieses vermehrte Binden war Rezeptor-spezifisch, da ein Vorbesetzen der Zielepitope mit Hilfe eines Überschusses an nicht modifiziertem 7D3 Antikörper die Hybridanheftung und nachfolgendes Binden von ¹²&sup5;I-DT (Tabelle I) blockierte. Mit unterschiedlichen monoklonalen anti-Diphtherietoxin Antikörpern (D4B7 und D5E8) gebildete Hybride zeigten ähnliche Toxinbindungseigenschaften (Tabelle I)
- Vorbehandlung CPM gebunden
- Keine 888
- 7D3/D1F3 Hybrid 4.381
- 7D3 Überschuß plus 7D3/D1F3 Hybrid 973
- Keine 556
- 7D3/D4B7 Hybrid 4.306
- 7D3/D5E8 Hybrid 5.657
- CEM Zellen wurden 1 Stunde bei 0ºC mit einer äquivalenten Menge an ¹²&sup5;I-DT entweder nur in PBS behandelt oder bei 22ºC 15' mit Hybrid mit 10&supmin;&sup8; M vorkomplexiert (Tabelle II). Nach der Behandlung wurden die Zellen mit PBS gewaschen und gezählt. Tabelle II zeigt, daß ein signifikantes Überbringen über die Grundwerte erreicht wurde, selbst wenn die Konzentration des Komplexes, der für die Behandlung der Zellen verwendet wurde, relativ gering war (10&supmin;&sup8; M).
- Behandlung CPM gebunden
- nur ¹²&sup5;I-DT 1.649
- 7D3/D4B7 Hybrid- ¹²&sup5;I-DT Komplex 13.116
- 7D3/D5E8 Hybrid- ¹²&sup5;I-DT Komplex 15.297
- Ein anti-HIV monoklonaler Antikörper wurde mit Hilfe eines synthetischen Hüllproteins hergestellt und zur Bildung des HIV-spezifischen Hybrids (anti-HIV/D5E8) mittels Kopplung an einen anti-Diphtherietoxin Antikörper (D5E8) nach einem zuvor beschriebenen Verfahren (Raso, F., e al., NATO Advanced Studies Institute, 82: 119-138 (1984)) verwendet. Ein Festphasen-Radioimmunoassay wurde durch Adsorption des Hüllpeptid-Antigens an die Vertiefungen von Polyvinyl-Mikrotiterplatten entwickelt. PBS und entweder Antikörper oder Hybrid mit 6 · 10&supmin;&sup9; M wurde dann zu den Vertiefungen 2 Stunden gegeben und jegliches nicht gebundene Reagenz wurde unter Verwendung von PBS weggewaschen. Die duale Spezifität des Hybrids wurde, nachdem es an die beschichtete Platte über seine HIV- spezifische Verbindungsstellen binden durfte, gezeigt und dann seine Anwesenheit durch Binden von ¹²&sup5;I-CRM107 an freie Toxin-spezifische Stellen des zusammengesetzten Moleküls gezeigt. Tabelle III zeigt, daß das anti- HIV/D5E8 Hybrid ¹²&sup5;I-CPM107 band, während anti-HIV allein kein Toxin band, selbst wenn es als Nachweis mit Hilfe einer ¹²&sup5;I-Ziege anti-Maus IgG Sonde an die Platte geheftet war. Tabelle III Plattentest, um das Binden von anti-HIV Antikörper und Hybrid zu zeigen.
- Die Verfügbarkeit von genetisch oder chemisch veränderten Diphtherietoxin Congeneren (z. B. CRM107) ohne Fähigkeit zur Anheftung an Zellen liefert eine weitere Möglichkeit der Anwendung der Hybrid-Überbringung. Der Zellbindungsdefekt, der diese Analoga für Zellen nicht toxisch macht, kann über den hybriden Träger-Teil wiederhergestellt werden, so daß seine letale Wirkung ausschließlich auf das ausgewählte Zelloberfläche-Ziel gerichtet ist.
- Menschliche Mesothelioma-Zellen (H-meso) wurden verwendet, um die Wirksamkeit von anti-Transferrin-Rezeptor/anti-Diphtherietoxin Hybriden (7D3/D1F3 und 7D3/D5E8) zur Wiederherstellung des vollen cytotoxischen Potentials von CRM107 zu testen. Die H-meso Zellen wurden 2 Stunden bei 37ºC nur mit 4 · 10&supmin;&sup8; M CRM107; (4 · 10&supmin;&sup8; M) CRM107 in Kombination mit den Hybriden 7D3/D5E8 oder 7D3/D1F3 mit 1 · 10&supmin;&sup8; M, oder 4 · 10&supmin;&sup8; M CRM107 in Kombination mit den Hybriden (1 · 10&supmin;&sup8; M) plus einem Überschuß an anti-Rezeptor Antikörper (7D3) (10&supmin;&sup5; M) inkubiert. Die Zellen wurden dann mit ³H-Leucin für 30 min. pulsmarkiert. H-meso Zellen in Medium, zu dem 10 mM NH&sub4;Cl gegeben war, wurden ebenfalls mit den gleichen Komponenten inkubiert.
- Die Daten in Tabelle IV zeigen, daß während CRM107 allein nicht in der Lage war, in die Zellen einzudringen und die Proteinsynthese zu hemmen, es ein sehr potentes und schnell wirkendes Cytotoxin wurde, wenn es in Kombination mit den hybriden Antikörpern verwendet wurde. Diese letale Wirkung war abhängig von dem Hybrid-vermittelten Überbringen an Transferrin-Rezeptoren, da eine geringe Toxizität erhalten wurde, wenn diese Stellen mit einem Überschuß an freiem anti-Rezeptor Antikörper (7D3) während der zweistündigen Inkubationszeit (Tabelle IV) blockiert wurden.
- Das saure Milieu von intrazellulären Kompartimenten ist für die Cytotoxizität wesentlich, da dies die Freisetzung von CRM107 von dem Antikörper und Translokation in das Cytosol induziert, wo es den Elongationsfaktor 2 inaktiviert. Diese Bedingung wurde durch Zugabe von NH&sub4;Cl zu den Zellen demonstriert. Diese schwache Base, von der bekannt ist, daß sie den pH der Vesikel erhöht, verminderte außerordentlich die Fähigkeit der Hybrid-CRM107 Kombination, H-Meso Zellen abzutöten (Tabelle IV). Die gleichen Experimente wurden unter Verwendung des anti- HIV/D5E8 Hybrids (2 · 10&supmin;&sup8; M) plus CRM107 (4 · 10&supmin;&sup8; M) unter Verwendung von HIV-infizierten 8E5 Zellen als Ziel durchgeführt (Folks, T. M., et al., J. Exp. Med., 164: 280- 290 (1986)). Die gleiche Säure-Abhängigkeit wurde gezeigt (Tabelle V). Tabelle IV Hybrid-vermittelte Cytotoxizität von CRM107, getestet an menschlichen Mesothelioma Zellen (2 h Test); Transferrin- Rezeptor-Spezifität und Säure-Abhängigkeit Tabelle V Säure-Abhängigkeit der Hybrid-vermittelten Cytotoxizität von CRM107 auf HIV-positive 8E5 Zellen
- Der Transferrin-Rezeptor-gerichtete Hybrid-CRM107 Komplex wurde an menschlichen Colon-Adenocarcinomzellen getestet, um zu bestimmen, ob das gleich hohe cytotoxische Potential, das für die H-meso- und HIV-infizierten 8E5 Zellinien gefunden wurde, sich auf andere maligne Zelltypen erstreckte. Die gemeinsame Wirkung von CRM107 plus Hybrid mit 10&supmin;&sup8; M erzeugte eine umfangreiche Zellabtötung innerhalb von zwei Stunden und ihr Potential war mit 10&supmin;&sup7; M nativem Diphtherietoxin (Tabelle VI) vergleichbar. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Hybrid- Überbringung nicht nur CRM107 cytotoxisch für Zellen macht, sondern deutet ebenfalls darauf hin, daß sein Eindringen über den Transferrinpfad genauso effizient ist wie die Aufnahme von Diphtherietoxin über seinen üblichen Mechanismus. Außerdem wurde ein Transferrin/D5E8 Konjugat konstruiert, um zu untersuchen, ob Transferrin selbst das Überbringen von CRM107 in Zellen vermitteln würde. Tatsächlich lieferte dieser natürliche Ligand, gekoppelt an den monoklonalen anti-Diphtherietoxin Antikörper (D5E8), einen ähnlichen Toxizitätsgrad wie das anti- Transferrin-Rezeptor (7D3) geleitete Hybrid. Tabelle VI Letale Effekte von anti-Transferrin-Rezeptor-gerichtetem Hybrid plus CRM107 auf menschlichen Colon-Adenocarcinomzellen (2 h Test)
- Zusätzlich zur Verwendung des Transferrin-Rezeptors als ein Ziel der Hybrid-Überbringung, wurde das allgemeine akute lymphatische Leukämie Antigen (CALLA) als eine Eintrittstelle in CALLA-tragende Nalm-1 Leukämie- Zellen ähnlich getestet (Raso, V., et al., Cancer Res., 42: 457-464 (1982)). Ein anti-Calla/D5E8 Hybrid wurde gebildet und auf seine Fähigkeit, diese Zellen in Kombination mit CRM107 abzutöten, nach dem für H-meso- Zellen und anti-Transferrin-Rezeptor/anti-Diphtherietoxin bekannten Protokoll untersucht. Jedoch wurde die Inkubation 6 Stunden bei der gleichen Temperatur durchgeführt (Tabelle VII).
- Eine gute Zellabtötung wurde durch Zielen des Hybrid-CRM107 auf diese distinkte Membranstelle erreicht; jedoch läßt die erforderliche längere Inkubationszeit vermuten, daß das Eindringen und/oder die Freisetzung des Toxins langsamer ist als für Transferrin-Rezeptorgerichtete Agenzien. Tabelle VII CALLA-gerichtete cytotoxische Wirkung von Hybrid-CRM107 auf Nalm 1 Zellen (6 h Test)
- Eine der fundamentalen Voraussetzungen, die dem säure-ausgelösten hybriden Träger Konzept zugrunde liegt, sagt vorher, daß diese Art des Überbringens mit dem normalen Mechanismus der Toxin-Wirkung nicht interferiert, nachdem das spezifische Zielen erreicht worden ist. Ein kritisches Maß der Toxin-Wirkung kann durch Kontrolle der Hemmungskinetik der Proteinsynthese erhalten werden. Dieser Parameter zeigt genau, wie schnell das Toxin Zutritt zu seinem Ziel im Cytosol (z. B. Elongationsfaktor 2) gewinnt und wurde deshalb verwendet, um Hybrid überbrachtes CRM107 zu bewerten (Abb. 5).
- H-meso Zellen wurden bei 37ºC für die bezeichneten Intervalle entweder mit 10&supmin;&sup8; M Diphtherietoxin, 10&supmin;&sup8; M CRM107 oder mit der anti-Transferrin-Rezeptor/anti- Diphtherietoxin Hybrid (7D3/D3E1)-CRM107 Kombination mit 10&supmin;&sup8; M inkubiert. Die Zellen wurden dann mit ³H-Leucin 30 Minuten pulsmarkiert, um das Ausmaß des Einbaus in Protein verglichen mit unbehandelten Kontrollzellen zu messen. Der zeitliche Verlauf der Hemmung der Proteinsynthese, die den Einbau von ³H-Leucin widerspiegelt, wurde dann für H-meso Zellen, die ausschließlich mit 10&supmin;&sup8; M Diphtherietoxin, ausschließlich 10&supmin;&sup8; M CRM107 oder mit dem anti-Transferrin-Rezeptor/anti-Diphtherietoxin Hybrid (7D3/D3E1) plus CRM107 mit 10&supmin;&sup8; M inkubiert wurden, gemessen.
- Abb. 5 zeigt, daß sowohl natives Toxin als auch die CRM107 Hybrid Kombination identische Kinetik profile ergaben, die von einer 30-40 minütigen Lag- Periode und einer anschließenden schnellen Inaktivierungsphase mit t1/2 = 24 Minuten beziehungsweise t1/2 = 26 Minuten gekennzeichnet waren. Ungebundenes CRM107 allein mit 10&supmin;&sup8; M besaß keine Wirkung auf die Fähigkeit der Zellen, Protein zu synthetisieren. Die Tatsache, daß Hybrid überbrachtes CRM107 genauso schnell wie natives Diphtherietoxin Zellen abtötete, läßt vermuten, daß seine Freisetzung von der Antikörper- Bindungsstelle nicht behindert war und daß es keine Unterbrechung des für seine letale Wirkung benötigten normalen Ereignisablaufs gab.
- Schließlich wurde ein kovalent gekoppeltes anti- Transferrin-Rezeptor-CRM107 Konjugat (7D3-CRM107) mittels Disulfid-Verknüpfungsstandardverfahren konstruiert und seine cytotoxische Wirkung wurde mit der von dem 7D3/D5E8 Hybrid plus CRM107 erzeugten Wirkung verglichen. Transferrin-Rezeptor positive CEM Zellen wurden 16 Stunden bei 37ºC mit den bezeichneten Konzentrationen von 7D3/D5E8 Hybrid plus 10&supmin;&sup7; M CRM107, von 7D3-CRM107 Disulfid-verknüpftem kovalenten Konjugat und nativem Diphtherietoxin, CRM107 allein oder 7D3/D5E8 Hybrid allein inkubiert. Die Zellen wurden dann mit ³H-Leucin 30 Minuten pulsmarkiert und die in das Protein eingebaute Menge wurde mit unbehandelten Kontrollzellen verglichen.
- Abb. 6 zeigt die Toxizitätsdosis-Antwortkurven des Hybrids, des Konjugats und des nativen Diphtherietoxins. Das Konjugat, 7D3-CRM107, war cytotoxisch für Transferrin-Rezeptor positive Zellen, die Kinetik der Zellabtötung war wesentlich langsamer als die für Hybridüberbrachtes CRM107 gefundene Kinetik. CEM Zellen sind nicht besonders empfindlich für Diphtherietoxin, wie der mit nativem Toxin ID&sub5;&sub0; = 2 · 10&supmin;&sup9; M erhaltene Wert widerspiegelt. Das Transferrin-Rezeptor-gerichtete 7D3- CRM107 Konjugat war geringfügig wirksamer und ergab einen ID&sub5;&sub0; von 1 · 10&supmin;&sup9; M. Im Gegensatz dazu war Hybrid-überbrachtes CRM107 (ID&sub5;&sub0; = 4 · 10&supmin;¹² M) 250-fach potenter als die kovalenten Konjugate bezogen auf die Konzentration des zugefügten Hybrids. Weder das 7D3/D5E8 Hybrid allein noch CRM107 allein besaß eine Wirkung auf die Zellen. Diese Ergebnisse zeigen, daß eine kovalente Kopplung für die Toxin-Wirkung hinderlich sein kann, da das Disulfid-verknüpfte 7D3-CRM107 Konjugat langsamer wirkte und weniger potent war als das entsprechende 7D3/D5E8 Hybrid-überbrachte CRM107.
- Abb. 7 zeigt die Dosis-Antwortkurven für die Hemmung der Proteinsynthese in HIV-infizierten 8E5 Zellen nach 16 h Exposition von CRM107 plus Hybride, die entweder gegen HIV oder Transferrin-Rezeptoren auf der Zellmembran gerichtet waren. Der ID&sub5;&sub0; für das anti- HIV/D5E8 Hybrid plus CRM107 war 2 · 10&supmin;&sup9; M, aber dieses Reagenz wurde 10-fach potenter, wenn gespaltenes CRM107 (mit Hilfe von Trypsin an einer spezifischen Stelle gespalten) verwendet wurde (ID&sub5;&sub0; = 2 · 10&supmin;¹&sup0; M). Es wird angenommen, daß eine proteolytische Spaltung eine Voraussetzung für eine toxische Aktivität ist und normalerweise an der Zelloberfläche oder in subzellulären Kompartimenten stattfindet. Diese anti-HIV Hybridvermittelte Cytotoxizität wurde durch Neutralisierung intrazellulärer Kompartimente mit NH&sub4;Cl (Tabelle V) blockiert, und die nicht-infizierte Kontrollzellinie wurde durch Hybrid überbrachtes CRM107 nicht beeinflußt.
Claims (13)
1. Ein hybrides Reagenz, zum Beispiel ein hybrider
Antikörper, das einen ersten Teil, z. B. ein
Zelloberflächenantigen oder einen Zelloberflächenrezeptor (zum Beispiel
einen Tumor-assoziierten oder einen Virus-assoziierten
Rezeptor) und einen zweiten Teil umfaßt, worin der erste
Teil arrangiert ist, ein ausgewähltes zelluläres Ziel zu
binden und der zweite Teil arrangiert ist, ein ausgewähltes
bioaktives Molekül (z. B. ein Toxin, Enzym, Medikament oder
Metall) bei physiologischem pH zu binden, wobei das Binden
des bioaktiven Moleküls nicht in der Form kovalenter
Bindungen erfolgt, und der zweite Teil derart ausgewählt
ist, daß das Binden des bioaktiven Moleküls bei einem sauren
pH instabil ist, so daß ein gebundenes bioaktives Molekül
bei Verwendung in die Zelle freigesetzt wird, wenn der
hybride Antikörper in ein Endosom, das durch eine
Rezeptorvermittelte Endocytose gebildet wird, transferiert ist.
2. Ein hybrides Reagenz gemäß Anspruch 1, worin der
erste Teil aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Liganden,
Wachstumsfaktoren, Zellrezeptoren, Antikörpern,
Transportproteinen, Hormonen und Viren oder Fragmenten davon besteht,
und der zweite Teil ein Antikörper oder Antikörperfragment
ist.
3. Ein hybrides Reagenz gemäß Anspruch 1 oder Anspruch
2, worin der erste Teil der anti-Transferrin-Rezeptor
monoklonale Antikörper 7D3 oder Fragmente davon ist und der
zweite Teil ein spezifisch gegen Diphterietoxin monoklonaler
Antikörper ist.
4. Ein hybrides Reagenz gemäß Anspruch 1, worin (a) das
Zelloberflächenantigen ein Tumor-assoziiertes Antigen ist;
oder (b) das Zelloberflächenantigen ein Virus-assoziiertes
Antigen, zum Beispiel vom humanen Immunschwäche-Virus (HIV),
ist.
5. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das
hybride Reagenz nach Anspruch 1 mit dem daran gebundenen
bioaktiven Molekül umfaßt.
6. Ein hybrides Reagenz gemäß Anspruch 1, worin der
zweite Teil ein Antikörper oder Fragment davon ist, der zum
Binden eines Antigens, nicht in der Form kovalenter
Bindungen, bei einem ersten ausgewählten ph und Freisetzen
besagten Antigens bei einem zweiten ausgewählten pH adaptiert
ist, wobei der Antikörper zum Beispiel aus der Gruppe
gewählt ist, die aus D5E8, D1F3, D3E1, D6B3, D5F5, D1D5,
D5D5 und D4B7 besteht.
7. Das hybride Reagenz, Arzneimittel oder der
Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung
in Therapie oder Diagnose zum Beispiel: bei der Behandlung
oder Diagnose einer HIV Infektion; bei der Behandlung oder
Diagnose von Tumorleiden.
8. Das hybride Reagenz, Arzneimittel oder der
Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung
bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder
Diagnose von HIV oder bei der Behandlung oder Diagnose von
Tumorleiden.
9. Ein Verfahren zur Gewinnung einer szintigraphischen
Abbildung eines Tumors in einem Patienten, das umfaßt:
Einführen des hybriden Reagenzes gemäß einem der
Ansprüche 1 bis 6 in den Patienten, worin das zelluläre Ziel
ein Tumor-assoziiertes Antigen ist und das bioaktive Molekül
ein Radiometall ist, wobei dem hybriden Molekül ein
Anreichern am Tumor ermöglicht ist.
Abtasten des Patienten mit einer Gamma-Kamera, um
eine Abbildung des Tumors zu erhalten.
10. Ein Verfahren zur Selektion eines Antikörpers, um
den zweiten Teil des hybriden Reagenzes nach Anspruch 1 zu
bilden, wobei der Antikörper ein Antigen bei einem ersten
ausgewählten pH bindet und besagtes Antigen bei einem
zweiten ausgewählten pH freisetzt, wobei das Verfahren
umfaßt:
(a) Bereitstellen eines immobilisierten Antigens in einem
Verdünnungspuffer bei einem ersten ausgewählten pH und
in-Kontakt-Bringen besagten Antigens mit Antikörpern;
(b) Ermöglichen den Antikörpern und immobilisiertem Antigen
zu binden, aber nicht in der Form kovalenter Bindungen;
(c) Selektieren der Antikörper, die an das Antigen binden
und Zugabe eines geringen Volumens konzentrierten
Puffers zu besagten Antikörpern, um einen zweiten
ausgewählten pH bereitzustellen;
(d) Selektieren von Antikörpern, die gebundenes Antigen bei
dem zweiten pH freisetzen.
11. Das Verfahren nach Anspruch 10, das ferner die
Schritte umfaßt: (e) Kopplung besagter selektierter
Antikörper an einen ersten Teil, um ein hybrides Reagenz zu
bilden und (f) gegebenenfalls Binden eines bioaktiven
Moleküls an den selektierten Antikörper-Teil des hybriden
Reagenzes, um ein Arzneimittel zu bilden.
12. Das Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, worin das
bioaktive Molekül entweder ein Toxin, ein cytotoxisches
Agens oder Fragment davon, ein Enzym, ein Medikament oder
ein Metall ist; und/oder gegebenenfalls der erste Teil einen
Liganden, einen Wachstumsfaktor, einen Zellrezeptor oder
einen Antikörper umfaßt.
13. Ein hybrides Reagenz oder ein Arzneimittel, das mit
dem Verfahren nach Anspruch 10, 11 oder 12 herstellbar ist.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US48200190A | 1990-02-16 | 1990-02-16 | |
PCT/US1991/000971 WO1991012023A2 (en) | 1990-02-16 | 1991-02-13 | Hybrid reagents capable of selectively releasing molecules into cells |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE69130561D1 DE69130561D1 (de) | 1999-01-14 |
DE69130561T2 true DE69130561T2 (de) | 1999-06-24 |
Family
ID=23914241
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE69130561T Expired - Fee Related DE69130561T2 (de) | 1990-02-16 | 1991-02-13 | Hybride Reagenzien mit der Fähigkeit, Moleküle selektiv in Zellen freizusetzen |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US5501854A (de) |
EP (1) | EP0515571B1 (de) |
CA (1) | CA2075927A1 (de) |
DE (1) | DE69130561T2 (de) |
WO (1) | WO1991012023A2 (de) |
Families Citing this family (38)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8919607D0 (en) * | 1989-08-30 | 1989-10-11 | Wellcome Found | Novel entities for cancer therapy |
WO1992019973A1 (en) * | 1991-04-26 | 1992-11-12 | Surface Active Limited | Novel antibodies, and methods for their use |
US5505931A (en) * | 1993-03-04 | 1996-04-09 | The Dow Chemical Company | Acid cleavable compounds, their preparation and use as bifunctional acid-labile crosslinking agents |
GB9225453D0 (en) | 1992-12-04 | 1993-01-27 | Medical Res Council | Binding proteins |
US5994318A (en) * | 1993-10-04 | 1999-11-30 | Albany Medical College | Cochleate delivery vehicles |
US5830478A (en) * | 1995-06-07 | 1998-11-03 | Boston Biomedical Research Institute | Method for delivering functional domains of diphtheria toxin to a cellular target |
US5816259A (en) * | 1997-01-13 | 1998-10-06 | Rose; Samuel | Method for the diagnosis and treatment of cancer by the accumulation of radioactive precipitates in targeted cells |
JP2002500201A (ja) | 1998-01-05 | 2002-01-08 | ユニバーシティ オブ ワシントン | 膜破壊剤を使用する増強された輸送 |
WO2001051092A2 (en) * | 2000-01-07 | 2001-07-19 | University Of Washington | Enhanced transport of agents using membrane disruptive agents |
US6436948B1 (en) | 2000-03-03 | 2002-08-20 | University Of Georgia Research Foundation Inc. | Method for the treatment of psoriasis and genital warts |
EP1383492A4 (de) * | 2001-03-23 | 2008-12-24 | Napro Biotherapeutics Inc | Molekulare konjugate zur verwendung in der krebstherapie |
EP1404692A1 (de) | 2001-06-22 | 2004-04-07 | The University of British Columbia | Antimitotische eleutheside |
US7299805B2 (en) * | 2002-06-07 | 2007-11-27 | Marctec, Llc | Scaffold and method for implanting cells |
WO2007109584A1 (en) * | 2006-03-16 | 2007-09-27 | University Of Washington | Temperature-and ph-responsive polymer compositions |
US7981688B2 (en) | 2007-03-08 | 2011-07-19 | University Of Washington | Stimuli-responsive magnetic nanoparticles and related methods |
LT2708559T (lt) | 2008-04-11 | 2018-06-11 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigeną surišanti molekulė, galinti pakartotinai prisijungti prie dviejų ar daugiau antigeno molekulių |
TWI440469B (zh) | 2008-09-26 | 2014-06-11 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Improved antibody molecules |
US8426214B2 (en) * | 2009-06-12 | 2013-04-23 | University Of Washington | System and method for magnetically concentrating and detecting biomarkers |
US9080933B2 (en) | 2009-11-09 | 2015-07-14 | University Of Washington Through Its Center For Commercialization | Stimuli-responsive polymer diagnostic assay comprising magnetic nanoparticles and capture conjugates |
US20110117668A1 (en) * | 2009-11-09 | 2011-05-19 | University Of Washington Through Its Center For Commercialization | Self-powered smart diagnostic devices |
EP2647706B1 (de) | 2010-11-30 | 2023-05-17 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigenbindende moleküle zur wiederholten bindung an mehrere antigenmoleküle |
MX352889B (es) | 2011-02-25 | 2017-12-13 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anticuerpo de fc especifico para fcyriib. |
US20150050269A1 (en) | 2011-09-30 | 2015-02-19 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities |
MX358220B (es) | 2011-11-30 | 2018-08-10 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Portador que contiene fármaco en la célula para formar el inmunocomplejo. |
SG10201607727PA (en) | 2012-03-16 | 2016-11-29 | Regeneron Pharma | Mice that produce antigen-binding proteins with ph-dependent binding characteristics |
PT2825037T (pt) | 2012-03-16 | 2019-08-07 | Regeneron Pharma | Animais não humanos que expressam sequências de imunoglobulinas sensíveis ao ph |
HUE053310T2 (hu) | 2012-03-16 | 2021-06-28 | Regeneron Pharma | Hisztidinmódosított könnyûlánc antitestek és genetikailag módosított rágcsálók ugyanennek az elõállítására |
US20140013456A1 (en) | 2012-03-16 | 2014-01-09 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Histidine Engineered Light Chain Antibodies and Genetically Modified Non-Human Animals for Generating the Same |
WO2013140268A2 (en) | 2012-03-20 | 2013-09-26 | Novodigit Sarl | Mobile handset accessory supporting touchless and occlusion-free user interaction |
MY183415A (en) | 2014-12-19 | 2021-02-18 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anti-c5 antibodies and methods of use |
SG11201700841QA (en) | 2014-12-19 | 2017-03-30 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anti-myostatin antibodies, polypeptides containing variant fc regions, and methods of use |
KR102605798B1 (ko) | 2015-02-05 | 2023-11-23 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 이온 농도 의존적 항원 결합 도메인을 포함하는 항체, Fc 영역 개변체, IL-8에 결합하는 항체, 및 그들의 사용 |
BR112017014067B1 (pt) | 2015-02-27 | 2021-01-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | usos de um anticorpo receptor de il-6 para no tratamento de doenças relacionadas a il-6 |
US11359009B2 (en) | 2015-12-25 | 2022-06-14 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anti-myostatin antibodies and methods of use |
CN109843918B (zh) * | 2016-07-01 | 2023-08-25 | 旁分泌疗法公司 | 用于pdgf-cc抑制的方法和组合物 |
MX2019001448A (es) | 2016-08-05 | 2019-09-13 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Composicion para profilaxis o tratamiento de enfermedades relacionadas con interleucina 8 (il-8). |
JP7191833B2 (ja) | 2017-01-30 | 2022-12-19 | 中外製薬株式会社 | 抗スクレロスチン抗体およびその使用 |
JP7185884B2 (ja) | 2017-05-02 | 2022-12-08 | 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター | Il-6及び好中球の関連する疾患の治療効果の予測及び判定方法 |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4631190A (en) * | 1981-06-26 | 1986-12-23 | Shen Wei C | Acidity-sensitive spacer molecule to control the release of pharmaceuticals from molecular carriers |
US4474893A (en) | 1981-07-01 | 1984-10-02 | The University of Texas System Cancer Center | Recombinant monoclonal antibodies |
CA1213229A (en) * | 1982-04-12 | 1986-10-28 | Gary S. David | Antibodies having dual specificities, their preparation and uses therefor |
US4479895A (en) | 1982-05-05 | 1984-10-30 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Immunoglobulin half-molecules and process for producing hybrid antibodies |
US4470925A (en) | 1982-05-05 | 1984-09-11 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Immunoglobulin half-molecules and process for producing hybrid antibodies |
US4542225A (en) | 1984-08-29 | 1985-09-17 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Acid-cleavable compound |
US4699441A (en) | 1984-09-14 | 1987-10-13 | Amp Incorporated | Electrical connector for stranded wires |
US4698420A (en) * | 1985-02-25 | 1987-10-06 | Xoma Corporation | Antibody hybrid molecules and process for their preparation |
US4676980A (en) * | 1985-09-23 | 1987-06-30 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Target specific cross-linked heteroantibodies |
US4689311A (en) * | 1985-09-30 | 1987-08-25 | Rhode Island Hospital | Screening antibodies for capacity to deliver toxin to target cells |
US4997913A (en) | 1986-06-30 | 1991-03-05 | Oncogen | pH-sensitive immunoconjugates and methods for their use in tumor therapy |
US5066490A (en) | 1988-06-01 | 1991-11-19 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health & Human Services | Protein crosslinking reagents cleavable within acidified intracellular vesicles |
GB8813527D0 (en) | 1988-06-08 | 1988-07-13 | Glennie M J | Bispecific antibodies |
-
1991
- 1991-02-13 WO PCT/US1991/000971 patent/WO1991012023A2/en active IP Right Grant
- 1991-02-13 EP EP91906108A patent/EP0515571B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-13 DE DE69130561T patent/DE69130561T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-02-13 CA CA002075927A patent/CA2075927A1/en not_active Abandoned
-
1992
- 1992-12-28 US US07/998,754 patent/US5501854A/en not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-08-12 US US08/290,481 patent/US5599908A/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-08-12 US US08/289,881 patent/US5603931A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US5599908A (en) | 1997-02-04 |
WO1991012023A3 (en) | 1991-11-14 |
EP0515571A1 (de) | 1992-12-02 |
WO1991012023A2 (en) | 1991-08-22 |
DE69130561D1 (de) | 1999-01-14 |
CA2075927A1 (en) | 1991-08-17 |
EP0515571B1 (de) | 1998-12-02 |
US5501854A (en) | 1996-03-26 |
US5603931A (en) | 1997-02-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE69130561T2 (de) | Hybride Reagenzien mit der Fähigkeit, Moleküle selektiv in Zellen freizusetzen | |
DE69333574T2 (de) | Gegen c-erb b-2 (her-2/neu) vewandte oberflächenantigene gerichtete immuntoxine | |
DE69710911T2 (de) | Monoklonale Antikörper gegen Endoglin und ihre Verwendung in der anti-Angiogenese-Therapie | |
DE69333182T2 (de) | Therapeutische konjugate von toxinen und medikamenten | |
DE3751908T2 (de) | Chimärisches Murine-Mensch-Immunoglobulin, spezifisch für tumorassoziertes 17-1A Antigen | |
DE3751214T2 (de) | Monoklonale Antikörper gegen Immunglobulin G Fc-Rezeptoren auf humane mononukleare Phagozyten; bifunktionelle Antikörper; ziel-spezifische Effektorzellen; gezielte Makrophagen und Immunoassays. | |
DE69024057T2 (de) | Transferrinrezeptor-spezifische antikörper - neuropharmazeutisches mittel-konjugate. | |
DE69605181T3 (de) | Antikörper gegen cd30, die proteolytische spaltung und abgabe des membrangebundenen cd30 antigens verhindern | |
DE68929061T2 (de) | Herstellung humanähnlicher Immunoglobuline und entsprechender Polynukleotide | |
DE69430450T2 (de) | Zell- und serum- proteinanker und konjugate | |
DE69130709T2 (de) | Gezielte immunostimulierung mit bispezifischen stoffen | |
DE3853740T2 (de) | Bifunktionelle Antikörperkonstruktionen und Verfahren zur selektiven Tötung von Zellbeständen. | |
DE3685625T2 (de) | Antikoerperkomplexe von haptenmodifizierten diagnostischen oder therapeutischen mitteln. | |
DE69729283T2 (de) | GLYKOSYLIERTE IgG ANTIKÖRPER | |
DE69719529T2 (de) | Nichtantigenes toxinkonjugat und fusionsprotein eines internalisierendes rezeptorsystems | |
DE69808609T2 (de) | Antagonistische anti-avb3 integrin antikörper | |
DE69132045T2 (de) | Monoklonale Antikörper gegen menschlichen Tumornekrosefaktor alpha | |
DE60220719T2 (de) | Antikörper gegen das muc18-antigen | |
DE69216899T2 (de) | Zytomodulierte Konjugate enthaltend spezifische Bindungspaargliedern | |
DE69333800T2 (de) | Thioether enthaltende Konjugate | |
DE69226431T2 (de) | Zellrezeptor spezifische monoklonale antikörper gegen stammzell-faktor-rezeptor | |
DE69230994T2 (de) | Trivalent monospezifische antigen-bindende proteine | |
DE69326539T2 (de) | Zytotoxische arzneimittel therapie | |
DE69020182T2 (de) | Vernetzte Antikörper und Verfahren zu ihrer Herstellung. | |
EP0340604B1 (de) | Monoklonaler Antikörper und seine Verwendung |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |