JP2004511753A - タンパク質活性のスクリーニング用タンパク質チップ - Google Patents

Abstract

本発明は、タンパク質機能の大規模研究に有用なタンパク質チップであって、高密度に詰め込まれた反応ウェルを備えている該チップに関する。本発明はまた、１つのタンパク質サンプル中もしくは１つのタンパク質チップ上に存在するタンパク質の存在、量および／または機能を同時にアッセイするための、または該チップ上のタンパク質の各々に対するプローブ混合物中の各プローブの存在、相対的特異性および結合親和性をアッセイするための、タンパク質チップの使用方法に関する。本発明はまた、高密度で小容量の化学反応のための該タンパク質チップの使用方法に関する。また、本発明は、タンパク質チップ基材として有用なポリマーおよびタンパク質チップの製造方法に関する。本発明は更に、タンパク質チップ基材の誘導体化に有用な化合物に関する。

Description

【０００１】
本出願は、米国仮特許出願第６０／２０１，９２１号（２０００年５月４日出願）および米国仮特許出願第６０／２２１，０３４号（２０００年７月２７日出願）の３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ． １１９条（ｅ）に基づく優先権の利益を請求するものであり、それら仮特許出願の各々は参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする。
【０００２】
本発明は、交付番号ＤＡＲＰＡ／ＯＮＲ Ｒ１３１６４−４１６０００９９およびＮＩＨ（国立衛生研究所）ＲＯ１ＣＡ７７８０８として政府の支援を受けてなされたものである。政府は本発明においてある一定の権利を有する。
【０００３】
Ｉ．発明の分野
本発明は、タンパク質機能の大規模な研究に有用なタンパク質チップに関し、該チップは高密度に詰め込まれた反応ウェルを含んでいる。本発明は、タンパク質サンプル中またはタンパク質チップ上に存在するタンパク質の存在、量および／もしくは機能を同時にアッセイするため、またはチップ上の各々のタンパク質についてのプローブの混合物中の各プローブの存在、相対的特異性および結合親和性をアッセイするための、タンパク質チップの使用方法に関する。本発明はまた、高密度で少容量の化学反応のための上記タンパク質チップの使用方法に関する。また、本発明は、タンパク質チップ基材として有用なポリマー、ならびにタンパク質チップの製造方法に関する。本発明は更に、タンパク質チップ基材の誘導体化に有用な化合物に関する。
【０００４】
ＩＩ．発明の背景
ゲノム全体の配列決定によって、多数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が同定された。現在、ｍＲＮＡ発現パターンおよび遺伝子破壊表現型により遺伝子の機能を理解しようと相当な努力がなされている。こうした努力において大きな意義のある前進が可能になっているのは、一部には、遺伝子チップ技術を用いて１回の実験で何千もの遺伝子配列を分析することができるようになったためである。しかし、遺伝子機能に関する多くの情報が、コードされたタンパク質の生化学的活性の分析から得られる。
【０００５】
現在、これらのタイプの分析は、研究者一人一人が１回に１つのタンパク質を調べることによってなされている。これは非常に時間がかかる方法である。何故ならば、１つのタンパク質をその生化学的活性に基づいて精製および同定するには何年も要する場合があるからである。ゲノム配列全体が入手できれば、そのゲノムによってコードされるあらゆるタンパク質についての生化学的アッセイが実施できるようになる。
【０００６】
このためには、１つのタンパク質チップを用いて何百または何千ものタンパク質サンプルを分析することが有用であろう。そうしたアプローチは、大量のデータを生成および分析できるハイスループット実験に適している。当技術分野では多年にわたり、９６ウェルまたは３８４ウェルを含むマイクロタイタープレートが知られている。しかし、これらのプレートは、その大きさ（少なくとも１２．８ｃｍ×８．６ｃｍ）のために、タンパク質の大規模な分析には不適当であり、これはウェルの密度が十分に高くないからである。
【０００７】
上記で述べたように、ＤＮＡ合成およびハイブリダイゼーション反応で使用するための他のタイプのアレイが考案されており、例えばＷＯ８９／１０９７７に記載のものが挙げられる。しかし、これらのアレイは、別個の量のタンパク質分析には不適当である。何故ならば、これらのアレイは平坦な表面上に構築され、特徴物間で交差汚染しやすいからである。
【０００８】
平坦な表面上のオリゴヌクレオチドアレイ（Ｐｅａｓｅら， １９９４，「迅速なＤＮＡ配列分析用の光発生オリゴヌクレオチドアレイ（Ｌｉｇｈｔ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｒｒａｙｓ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）」，ＰＮＡＳ ９１：５０２２−５０２６）から、チャネル（ｃｈａｎｎｅｌｓ）のアレイ（米国特許第５，８４３，７６７号）、チャネルによって連結されているウェルのアレイ（Ｃｏｈｅｎら， １９９９，「プロテインキナーゼＡのマイクロチップに基づく酵素アッセイ（Ａ ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ−ｂａｓｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ）」， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２７３：８９−９７）に及ぶ種々のアレイの製造にフォトリソグラフィー技法が応用されている。更に、半導体製造の分野では、微細加工（ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ）技法およびマイクロリソグラフィー技法が周知である。例えば、Ｍｏｒｅａｕ，「半導体リソグラフィー：原理、実践および材料（Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ， Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）」， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， １９８８を参照されたい。
【０００９】
近年、出芽酵母サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内で、生化学的ゲノミックスに有用である可能性のある多数のタンパク質を発現させるために考案された方法が開発された。ＯＲＦを、ＧＡＬプロモーターを用い、かつタンパク質をポリヒスチジン（例えばＨＩＳＸ６）標識に融合させる発現ベクターにクローニングしている。したがって、この方法は、約２，０００の酵母タンパク質融合体の調製およびその発現の確認にずっと用いられてきた（Ｈｅｙｍａｎら， １９９９， 「トポイソメラーゼＩ介在連結を用いた個々のオープンリーディングフレームのゲノム規模のクローニングおよび発現（Ｇｅｎｏｍｅ−ｓｃａｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅｓ ｕｓｉｎｇ ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ Ｉ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ）」 Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ９：３８３−３９２）。組み換えストラテジーを用いて、酵母ＯＲＦの約８５％が、ＣＵＰ１プロモーター（銅により誘導可能）を含むベクター内でＧＳＴコード領域とインフレームでクローニングされており、そうしてＧＳＴ融合タンパク質を産生している（Ｍａｒｔｚｅｎら， １９９９，「遺伝子の、それらの産物の活性による同定のための生化学的ゲノミックスアプローチ（Ａ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｂｙ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）」 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：１１５３−１１５５）。Ｍａｒｔｚｅｎらは、融合タンパク質のコレクションを幾つかの生化学的活性（例えば、ホスホジエステラーゼ活性およびＡｐｐｒ−１−Ｐ−プロセッシング活性）についてスクリーニングするのにプーリング（ｐｏｏｌｉｎｇ）ストラテジーを用い、それらの活性をコードする関連遺伝子を同定した。しかし、多数の個々のタンパク質サンプルを分析するためのストラテジーは記載されていない。
【００１０】
したがって、先行技術のチップおよび方法と比較して費用および時間の面で有利となるようにウェルがチップ上に高密度に詰め込まれているタンパク質チップが必要とされている。
【００１１】
本出願の第ＩＩ節または他の節におけるいずれの参考文献の引用または照合も、そうした参考文献が本発明の先行技術として利用できることを認めるものとしてみなされるべきではない。
【００１２】
ＩＩＩ．発明の概要
本発明は、タンパク質機能の大規模研究に有用なタンパク質チップ、すなわち、固相支持体上のタンパク質の位置アドレス可能な（位置をアドレス可能である）アレイであって、高密度に詰め込まれた反応ウェルを備えている該タンパク質チップに関する。本発明はまた、少なくとも１つのサンプル中に存在するタンパクの存在、量および／または機能をアッセイするためのタンパク質チップの使用方法に関する。本発明はまた、高密度で小容量の化学反応のためのタンパク質チップの使用方法に関する。また、本発明は、タンパク質チップ基材として有用なポリマー、およびタンパク質チップの製造方法に関する。本発明は、タンパク質チップの誘導体化に有用な化合物に関する。
【００１３】
１つの実施形態において、本発明は、限定するものではないが例えばスライドガラスのような平坦表面を備えるタンパク質チップを提供する。高密度タンパク質アレイは、例えばスライドガラス上に作製されていて、化学反応およびアッセイを行うことによりタンパク質の存在、量および／または機能の大規模な並行分析ができるようなものである。１つの特定の実施形態において、その平坦表面アレイは、３−グリシドオキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＳ）リンカーを介してその表面に結合されているタンパク質を有する。
【００１４】
更に、別の特定の実施形態において、本発明は、高密度に詰め込まれたウェル（その中で化学反応およびアッセイを実施できる）を有するタンパク質チップを提供し、それによりタンパク質の存在、量および／または機能の大規模な並行分析ができるようにすることにより、当業界で公知の方法および装置の欠点や制限を克服している。
【００１５】
１つずつ行うアッセイと比較した場合のアレイに対するアッセイの全般的な利点としては、多数のタンパク質−プローブ相互作用を同時に同定できること、およびそれらの相互作用の相対的親和性を測定できること、が挙げられる。プローブの複合的混合物をチップに適用することの利点としては、細胞内での環境により近い環境で相互作用を検出できること、および多くの可能性のあるリガンドを同時に評価できること、が挙げられる。
【００１６】
１つの実施形態において、本発明は、タンパク質、該タンパク質の機能性ドメインを含む分子、細胞全体およびタンパク質含有細胞性物質からなる群から選ばれる複数種の異なる物質を固相支持体上に含んでなり、かつ、各々の異なる物質が固相支持体上の異なる位置に存在する位置アドレス可能なアレイであって、複数種の物質が１ｃｍ^２当たり少なくとも１００種の異なる物質から構成される上記アレイである。
【００１７】
別の実施形態において、本発明は、複数種の異なるタンパク質または該タンパク質の機能性ドメインを含む分子を固相支持体上に含んでなり、各々の異なるタンパク質または分子が固相支持体上の異なる位置に存在する位置アドレス可能なアレイであって、複数種の異なるタンパク質または分子が、生物のゲノム中の同タイプの生物学的活性を有する全ての発現タンパク質の少なくとも５０％から構成される上記アレイである。
【００１８】
更に別の実施形態において、本発明は、タンパク質、該タンパク質の機能性ドメインを含む分子、細胞全体およびタンパク質含有細胞性物質からなる群から選ばれる複数種の異なる物質を固相支持体上に含んでなり、かつ、各々の異なる物質が固相支持体上の異なる位置に存在する位置アドレス可能なアレイであって、固相支持体が、セラミック、非晶質炭化ケイ素、不定形酸化物、ポリイミド、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレンおよびシリコーンエラストマーからなる群から選ばれる、上記アレイである。
【００１９】
更に別の実施形態において、本発明は、タンパク質、該タンパク質の機能性ドメインを含む分子、細胞全体およびタンパク質含有細胞性物質からなる群から選ばれる複数種の異なる物質を固相支持体上に含んでなり、かつ、各々の異なる物質が固相支持体上の異なる位置に存在する位置アドレス可能なアレイであって、複数種の異なる物質が、３−グリシドオキシプロピルトリメトキシシランリンカーを介して固相支持体に結合されている、上記アレイである。
【００２０】
別の実施形態において、本発明は、固相支持体の表面に複数のウェルを備えるアレイであって、ウェルの密度が少なくとも１００ウェル／ｃｍ^２である上記アレイである。
【００２１】
また、本発明は、固相支持体の表面に複数のウェルを備えた位置アドレス可能なアレイの製造方法であって、固相表面に１００ウェル／ｃｍ^２を上回る密度となるように設計された微細加工鋳型からアレイを成型する工程を含む上記方法に関する。別の実施形態において、本発明は、固相支持体の表面に複数のウェルを備えた位置アドレス可能なアレイの製造方法であって、固相表面に１００ウェル／ｃｍ^２を上回る密度のウェルが形成されるように設計された微細加工鋳型から二次鋳型を成型し、その二次鋳型から少なくとも１つのアレイを成型する工程を含む上記方法である。
【００２２】
更に別の実施形態において、本発明は、タンパク質、該タンパク質の機能性ドメインを含む分子、細胞全体、およびタンパク質含有細胞性物質からなる群から選ばれる複数種の異なる物質を固相支持体上に含んでなり、かつ、各々の異なる物質が固相支持体上の異なる位置に存在し、複数種の異なる物質が１ｃｍ^２当たり少なくとも１００種の異なる物質から構成される位置アドレス可能なアレイの使用方法であって、プローブを上記アレイと接触させる工程、およびタンパク質／プローブ相互作用を検出する工程を含む上記方法である。
【００２３】
更に別の実施形態において、本発明は、複数種の異なるタンパク質または該タンパク質の機能性ドメインを含む分子を固相支持体上に含んでなり、かつ、各々の異なるタンパク質または分子が固相支持体上の異なる位置に存在し、複数種のタンパク質および分子が、生物のゲノム中の同タイプの生物学的活性を有する全ての発現タンパク質の少なくとも５０％から構成される位置アドレス可能なアレイの使用方法であって、プローブを上記アレイと接触させる工程、およびタンパク質／プローブ相互作用を検出する工程を含む上記方法である。
【００２４】
別の実施形態において、本発明は、タンパク質、該タンパク質の機能性ドメインを含む分子、細胞全体、およびタンパク質含有細胞性物質からなる群から選ばれる複数種の異なる物質を固相支持体上に含んでなり、かつ、各々の異なる物質が固相支持体上の異なる位置に存在し、固相支持体が、セラミックス、非晶質炭化ケイ素、不定形酸化物、ポリイミド、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレンおよびシリコーンエラストマーからなる群から選ばれる位置アドレス可能なアレイの使用方法であって、プローブを上記アレイと接触させる工程、およびタンパク質／プローブ相互作用を検出する工程を含む上記方法である。
【００２５】
更に別の実施形態において、本発明は、タンパク質、該タンパク質の機能性ドメインを含む分子、細胞全体、およびタンパク質含有細胞性物質からなる群から選ばれる複数種の異なる物質を固相支持体上に含んでなり、かつ、各々の異なる物質が固相支持体上の異なる位置に存在し、複数種の異なる物質が固相支持体に３−グリシドオキシプロピルトリメトキシシランリンカーを介して結合されている位置アドレス可能なアレイの使用方法であって、プローブを上記アレイと接触させる工程、およびタンパク質／プローブ相互作用を検出する工程を含む上記方法である。
【００２６】
更に別の実施形態において、本発明は、位置アドレス可能なアレイの使用方法であって、タンパク質、該タンパク質の機能性ドメインを含む分子、細胞全体、およびタンパク質含有細胞性物質からなる群から選ばれる複数種の異なる物質を固相支持体上に固着させる工程（但し、各々の異なる物質が固相支持体上の異なる位置に存在し、複数種の異なる物質が１ｃｍ^２当たり少なくとも１００種の異なる物質から構成される）、プローブを上記アレイと接触させる工程、およびタンパク質／プローブ相互作用を検出する工程を含む上記方法である。
【００２７】
１つの特定の実施形態において、本発明は、位置アドレス可能なアレイの使用方法であって、タンパク質、該タンパク質の機能性ドメインを含む分子、細胞全体、およびタンパク質含有細胞性物質からなる群から選ばれる複数種の異なる物質を固相支持体上に固着させる工程（但し、各々の異なる物質が固相支持体上の異なる位置に存在し、複数種の異なる物質が１ｃｍ^２当たり少なくとも１００種の異なる物質から構成され、固相支持体がスライドガラスである）、プローブを上記アレイと接触させる工程、およびタンパク質／プローブ相互作用を検出する工程を含む上記方法である。
【００２８】
別の実施形態において、本発明は、位置アドレス可能なアレイの使用方法であって、複数種の異なるタンパク質または該タンパク質の機能性ドメインを含む分子を固相支持体上に固着させる工程（但し、各々の異なるタンパク質または分子が固相支持体上の異なる位置に存在し、複数種の異なるタンパク質または分子が生物のゲノム中の同タイプの生物学的活性を有する全ての発現タンパク質の少なくとも５０％から構成される）、プローブを上記アレイと接触させる工程、およびタンパク質／プローブ相互作用を検出する工程を含む上記方法である。
【００２９】
別の実施形態において、本発明は、位置アドレス可能なアレイの使用方法であって、複数種の異なるタンパク質または該タンパク質の機能性ドメインを含む分子を固相支持体上に固着させる工程（但し、各々の異なるタンパク質または分子が固相支持体上の異なる位置に存在し、複数種の異なるタンパク質または分子が生物のゲノム中の同タイプの生物学的活性を有する全ての発現タンパク質の少なくとも５０％から構成され、固相支持体がスライドガラスである）、プローブを上記アレイと接触させる工程、およびタンパク質／プローブ相互作用を検出する工程を含む上記方法である。
【００３０】
別の実施形態において、本発明は、位置アドレス可能なアレイの製造方法であって、固相表面に１００ウェル／ｃｍ^２を上回る密度のウェルが形成されるように設計された微細加工鋳型からアレイを成型する工程、ウェル内で、タンパク質、該タンパク質の機能性ドメインを含む分子、細胞全体、およびタンパク質含有細胞性物質からなる群から選ばれる複数種の異なる物質を固相支持体上に固着させる工程（但し、各々の異なる物質が固相支持体上の異なるウェル内に存在する）を含む上記方法である。
【００３１】
別の実施形態において、本発明は、位置アドレス可能なアレイの製造方法であって、固相表面に１００ウェル／ｃｍ^２を上回る密度のウェルが形成されるように設計された微細加工鋳型から二次鋳型を成型する工程、その二次鋳型から少なくとも１つのアレイを成型する工程、およびウェル内で、タンパク質、該タンパク質の機能性ドメインを含む分子、細胞全体、およびタンパク質含有細胞性物質からなる群から選ばれる複数種の異なる物質を固相支持体に固着させる工程（但し、各々の異なる物質が固相支持体上の異なるウェル内に存在する）、を含む上記方法である。
【００３２】
別の実施形態において、本発明は、位置アドレス可能なアレイの製造方法であって、固相表面に１００ウェル／ｃｍ^２を上回る密度のウェルが形成されるように設計された微細加工鋳型から二次鋳型を成型する工程、その二次鋳型から少なくとも１つのアレイを成型する工程、およびウェル内で、タンパク質、該タンパク質の機能性ドメインを含む分子、細胞全体、およびタンパク質含有細胞性物質からなる群から選ばれる複数種の異なる物質を固着させる工程（但し、各々の異なる物質が異なるウェル内に存在する）、を含む上記方法である。
【００３３】
Ａ．定義
本出願において用いられる「タンパク質」とは、全長タンパク質、タンパク質の部分、またはペプチドをいう。タンパク質は、生物（好ましくは細菌、酵母、昆虫細胞または哺乳動物細胞）における組換えによる過剰発現により調製することもできるし、大きなタンパク質の断片化により作製することもできるし、あるいは化学的に合成することもできる。
【００３４】
本出願において用いられる「機能性ドメイン」とは、所望の機能活性をもたらすのに必要かつ十分なタンパク質のドメインである。機能性ドメインの例としては、特に、キナーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、グリコシダーゼ、アセチラーゼ、転移酵素、または他の酵素の活性を示すドメインが挙げられる。機能性ドメインの他の例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ホルモン、リガンドまたは抗原に対する結合活性を示すそれらのドメインが挙げられる。
【００３５】
本出願において用いられる「プローブ」とは、核酸（例えばＤＮＡもしくはＲＮＡ）またはタンパク質に結合する任意の化学的試薬をいう。プローブの例としては、特に、別のタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、小分子基質、ならびにインヒビター、薬剤候補、受容体、抗原、ホルモン、ステロイド、リン脂質、抗体、補因子、サイトカイン、グルタチオン、免疫グロブリンのドメイン、糖鎖、マルトース、ニッケル、ジヒドロトリプシンおよびビオチンが挙げられる。
【００３６】
チップ上の各タンパク質または各プローブは、好ましくは、固相支持体上の既知で予め決められている位置に置かれており、各タンパク質または各プローブの正体が固相支持体上のその位置から決定できるようになっている。更に、そのタンパク質またはプローブは、固相支持体上で位置アドレス可能なアレイを形成している。
【００３７】
ＩＶ．図面の説明
図１ａ。図示された組換え法を用いて、１１９種の酵母プロテインキナーゼを、ガラクトース誘導型ＧＡＬ１０プロモーターの制御下でＧＳＴ融合タンパク質を産生する高コピーＵＲＡ３発現ベクター（ｐＥＧＫＧ）にクローニングした。ＧＳＴ：：キナーゼ構築物を大腸菌にレスキューし、各構築物の５’末端での配列を決定した。突然変異が見つかったら、全ての手順を繰り返した。
【００３８】
図１ｂ。記載されているようにして精製したＧＳＴ：：キナーゼ融合タンパク質のイムノブロット。３回の試みから、１０６種のキナーゼタンパク質が精製された。繰り返し試みたにもかかわらず、１１９種のＧＳＴ融合体のうち最後の１４種はイムノブロット分析で検出できなかった（例えば、星印をつけたレーンのＭｐｓ１）。
【００３９】
図２ａ。キナーゼの研究に用いたタンパク質チップを、次のプロセス（概略的に図示されている）に従って作製した。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）をアクリル製のマスター鋳型に注いだ。硬化させた後、ウェルを備えた該チップを剥がし、スライドガラスに載せた。次に、該チップの表面を誘導体化し、次にタンパク質をウェルに結合させた。ウェルをまず１％ＢＳＡでブロックした後、キナーゼ、^３３Ｐ−γ−ＡＴＰおよび緩衝液を添加した。３０℃にて３０分間インキュベートした後、タンパク質チップを十分に洗浄し、Ｘ線フィルムおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（解像度が５０μｍ）の双方に暴露し、定量する。１２種の基質について、それぞれのキナーゼアッセイを少なくとも２回繰り返し、残りの５種の基質については、そのアッセイを１回実施した。
【００４０】
図２ｂ。タンパク質チップの拡大図である。
【００４１】
図３。タンパク質チップおよびキナーゼアッセイの結果。各チップの１９位は、ネガティブ対照のシグナルを示す。Ｂ４位のＭｐｓ１は、１２種のキナーゼ反応の全てにおいて強いキナーゼ活性を示したが、ウエスタンブロットでは目に見えるシグナルは検出できなかった（図１ｂ）。
【００４２】
図４ａ。プロテインキナーゼ反応の定量分析。キナーゼ活性は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒを用いて測定し、データをＥｘｃｅｌスプレッドシートにエクスポートした。次に、そのデータをネガティブ対照に対して標準化することにより、キナーゼのシグナルを増大率（倍）（ｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ）に変換した。４つの反応における１１９種のキナーゼのシグナルをｌｏｇスケールで示す。増大率（倍）は１〜１０００倍の範囲である。
【００４３】
図４ｂ。基質特異性を調べるために、次の式を用いて特異性指数（ＳＩ）を算出した：ＳＩ_ｉｒ＝Ｆ_ｉｒ／［（Ｆ_ｉ１＋Ｆ_ｉ２＋・・・＋Ｆ_ｉｒ）／ｒ］（式中、ｉは用いたキナーゼの正体を表わし、ｒは基質の正体を表わし、Ｆ_ｉｒはＧＳＴ単独の場合と比較した基質ｒについてのキナーゼｉの増大率（倍）を表わす）。キナーゼの特性の幾つかの例は、ＳＩが３より大きい場合に示される。
【００４４】
図５ａ。キナーゼのコアドメインの多重配列アライメントから得られた系統樹であり、ポリ（Ｔｙｒ−Ｇｌｕ）キナーゼの機能特異性とアミノ配列との相関関係を示している。ポリ（Ｔｙｒ−Ｇｌｕ）を基質として使用できるキナーゼは、配列比較系統樹の特定の領域にマッピングされることが多い。ポリ（Ｔｙｒ−Ｇｌｕ）を効率的にリン酸化できるキナーゼは、影付きで示す。この基質を微弱にしか使用しない２種のキナーゼは、四角に示す。Ｒａｄ５３およびＳｔｅ７（ポリ（Ｔｙｒ−Ｇｌｕ）をリン酸化できなかった）はアスタリスクで示す。図示のように、これらのキナーゼの７０％が４つの配列群（丸で囲まれている）に入っている。
【００４５】
図５ｂ。ウサギ筋肉のホスホリラーゼキナーゼ（ＰＨＫ）２８の構造。ポリ（Ｔｙｒ−Ｇｌｕ）を基質として使用できるキナーゼに特に見い出される３つの塩基性残基およびメチオニン（Ｍｅｔ）残基の位置を示している。アスパラギン（Ａｓｐ）残基は通常、ポリ（Ｔｙｒ−Ｇｌｕ）を使わないキナーゼに見い出される。
【００４６】
図６。タンパク質チップの製造プロセスにおけるリソグラフィー工程の断面図。
【００４７】
ａ．酸化物層の両面に２層のシリコンを有するシリコンウェハ。
【００４８】
ｂ．上面にレジスタントマスク層を有するシリコンウェハ。
【００４９】
ｃ．エッチングプロセスにより、表面がレジスタントマスクにより保護されていないシリコンを除去する。エッチングの深度は酸化物層の位置により調節する（すなさち、エッチングプロセスでは酸化物層は除去されない）。
【００５０】
ｄ．マスク層を取り除き、エッチングされたシリコンウェハを残す。
【００５１】
ｅ．タンパク質チップの材料を鋳型に塗布する。
【００５２】
ｆ．硬化させた後、タンパク質チップを鋳型から外す。タンパク質チップは鋳型の凹部（陰画）である像を有する。
【００５３】
図７。タンパク質チップ上でのキナーゼ／インヒビターアッセイ。ヒト・プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、ヒト・ｍａｐキナーゼ（ＭＡＰＫ）、３種の酵母ＰＫＡ相同体（ＴＰＫ１、ＴＰＫ２およびＴＰＫ３）、ならびに２種の他の酵母プロテインキナーゼ（ＨＳＬ１およびＲＣＫ１）を、各種濃度の特定のヒトＰＫＡインヒビターＰＫＩαまたはＭＡＰＫインヒビターＳＢ２０２１９０を用いて、２種の基質（すなわち、ＰＫＡのタンパク質基質および一般に用いられるキナーゼ基質ＭＢＰ）について試験した。図に示すように、ＰＫＩαは、双方のペプチドとＭＢＰを基質として用いて、ＰＫＡ活性を特異的に抑制できる。しかし、ＳＢ２０２１９０は、ＰＫＡ活性に対して抑制作用を示さなかった。また、興味深い点として、ＰＫＩαが、試験した３種の酵母ＰＫＡ相同体（ＴＰＫ１、ＴＰＫ２、ＴＰＫ３）または他の２種の酵母プロテインキナーゼ（ＨＳＬ１およびＲＣＫ１）を抑制しなかったことにも注目されたい。
【００５４】
Ｖ．詳細な説明
本発明は、タンパク質機能の大規模な研究に有用なタンパク質チップ、すなわち固相支持体上のタンパク質の位置アドレス可能なアレイに関するものであり、そのタンパク質チップは、高密度に詰め込まれた反応ウェルを含む。位置アドレス可能なアレイは、目的の各プローブまたは各タンパク質が固相支持体上の既知で所定の位置に配置されて、各プローブまたは各タンパク質の正体が該アレイ上でのその位置から決定できるような構成を提供する。本発明はまた、少なくとも１つのサンプル中に存在するタンパク質の存在、量および／または機能をアッセイするためのタンパク質チップの使用方法に関する。本発明はまた、高密度で小容量の化学反応のためのタンパク質チップの使用方法に関する。また、本発明は、タンパク質チップ基材として有用なポリマー、ならびにタンパク質チップの製造方法に関する。本発明は更に、タンパク質チップ基材の誘導体化に有用な化合物に関する。
【００５５】
１つの実施形態において、本発明は、タンパク質、該タンパク質の機能性ドメインを含む分子、細胞全体、およびタンパク質含有細胞性物質からなる群から選ばれる複数種の異なる物質を固相支持体上に含んでなり、かつ、各々の異なる物質が該固相支持体上の異なる位置に存在する位置アドレス可能なアレイであって、複数種の異なる物質が１ｃｍ^２当たり少なくとも１００種の異なる物質から構成される上記アレイである。１つの実施形態において、上記の複数種の異なる物質は、１ｃｍ^２当たり１００〜１，０００種の異なる物質から構成される。別の実施形態において、上記の複数種の異なる物質は、１ｃｍ^２当たり１，０００〜１０，０００種の異なる物質から構成される。別の実施形態において、上記の複数種の異なる物質は、１ｃｍ^２当たり１０，０００〜１００，０００種の異なる物質から構成される。更に別の実施形態において、上記の複数種の異なる物質は、１ｃｍ^２当たり１００，０００〜１，０００，０００種の異なる物質から構成される。更に別の実施形態において、上記の複数種の異なる物質は、１ｃｍ^２当たり１，０００，０００〜１０，０００，０００種の異なる物質から構成される。更に別の実施形態において、上記の複数種の異なる物質は、１ｃｍ^２当たり１０，０００，０００〜２５，０００，０００種の異なる物質から構成される。更に別の実施形態において、上記の複数種の異なる物質は、１ｃｍ^２当たり少なくとも２５，０００，０００種の異なる物質から構成される。更に別の実施形態において、上記の複数種の異なる物質は、１ｃｍ^２当たり少なくとも１０，０００，０００，０００種の異なる物質から構成される。更に別の実施形態において、上記の複数種の異なる物質は、１ｃｍ^２当たり少なくとも１０，０００，０００，０００，０００種の異なる物質から構成される。
【００５６】
別の実施形態において、本発明は、タンパク質、該タンパク質の機能性ドメインを含む分子、細胞全体、およびタンパク質含有細胞性物質からなる群から選ばれる複数種の異なる物質を固相支持体上に含んでなり、かつ、各々の異なる物質が固相支持体上の異なる位置に存在する位置アドレス可能なアレイであって、複数種の異なる物質が１ｃｍ^２当たり少なくとも１００種の異なる物質から構成され、かつ固相支持体がスライドガラスである上記アレイである。
【００５７】
別の実施形態において、本発明は、タンパク質、該タンパク質の機能性ドメインを含む分子、細胞全体、およびタンパク質含有細胞性物質からなる群から選ばれる複数種の異なる物質を固相支持体上に含んでなり、かつ、各々の異なる物質が固相支持体上の異なる位置に存在する位置アドレス可能なアレイであって、複数種の異なる物質が１ｃｍ^２当たり約３０〜１００種の異なる物質から構成される上記アレイである。１つの特定の実施形態において、上記の複数種の異なる物質は、１ｃｍ^２当たり３０種の異なる物質から構成される。１つの特定の実施形態において、上記の複数種の異なる物質は、１ｃｍ^２当たり３０〜５０種の異なる物質から構成される。別の特定の実施形態において、上記の複数種の異なる物質は、１ｃｍ^２当たり５０〜１００種の異なる物質から構成される。
【００５８】
種々の特定の実施形態において、本発明は、複数種の異なるタンパク質または該タンパク質の機能性ドメインを含む分子を固相支持体上に含んでなり、各々の異なるタンパク質または分子が固相支持体上の異なる位置に存在する位置アドレス可能なアレイであって、複数種の異なるタンパク質または分子が、生物のゲノム中の同タイプの生物学的活性を有する全ての発現タンパク質の少なくとも５０％、７５％、９０％または９５％から構成される上記アレイである。例えば、そのような生物は、真核生物でも原核生物でもよく、好ましくは、哺乳動物、ヒトまたはヒト以外の動物、霊長類、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ニワトリ、真菌（例えば酵母）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、線虫（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）などである。そのような目的の生物学的活性のタイプは、限定するものではないが、酵素活性（例えばキナーゼ活性、プロテアーゼ活性、ホスファターゼ活性、グリコシダーゼ、アセチラーゼ活性および他の化学基転移酵素活性）、核酸結合性、ホルモン結合性などとすることができる。
【００５９】
Ａ．タンパク質チップの製造
本発明のアレイに高密度のウェルを有するタンパク質チップは、好ましくは、慣用の微細加工技法またはマイクロリソグラフィー技法を用いて、型押しされ、ミリングまたはエッチング加工したマスター鋳型から成型される。好ましくは、慣用のマイクロリソグラフィー技法および材料が、マスター鋳型の製造に用いられる。マスター鋳型を製造したら、次にそのマスター鋳型を直接使用してタンパク質チップ自体を成型することができる。あるいはまた、マスター鋳型から二次または三次の鋳型を成型してもよく、これらの二次または三次の鋳型からタンパク質チップが成型される。
【００６０】
マスター鋳型は、微細加工またはマイクロリソグラフィーに適するどのような材料からも製造でき、シリコン、ガラス、石英、ポリイミドおよびポリメチルメタクリレート（ルーサイト）が好ましい。マイクロリソグラフィーの場合、好ましい材料はシリコンウェハ（ｓｉｌｉｃｏｎ ｗａｆｅｒｓ）である。
【００６１】
適切なマスター鋳型、二次鋳型または三次鋳型が製造されたら、タンパク質チップを成型する。タンパク質チップは、成型に適するいずれの固相支持体にも成型することができ、多孔質または非多孔質の固相支持体が挙げられる。セラミック、非晶質炭化ケイ素、硬化するとＳｉＯ_２の成型物を生じる不定形酸化物、ポリイミド、ポリメチルメタクリレートおよびポリスチレンが好ましい固相支持体であり、シリコーンエラストマー（ｓｉｌｉｃｏｎｅ ｅｌａｓｔｏｍｅｒｉｃ）材料が最も好ましい。シリコーンエラストマー材料の中でも、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）が最も好ましい固相支持体である。シリコーンエラストマー材料の利点は、それらの可撓性の性質のために、鋳型から外し易い点である。
【００６２】
図６に、本発明によるタンパク質チップ上のウェルの高密度アレイを実現するのに有用な方法の一例を示す。シリコンの層の間に酸化物層が挟まれているシリコンウェハを用意する（図６ａ）。シリコン−オン−インシュレーター（ｓｉｌｉｃｏｎ−ｏｎ−ｉｎｓｕｌａｔｏｒ；ＳＯＩ）ウェハとして知られているこれらのウェハは一般にウェハ供給会社（例えば、Ｂｅｌｌｅ Ｍｅａｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｂｅｌｌｅ Ｍｅａｄ， ＮＪおよびＶｉｒｇｉｎｉａ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ， Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｂｕｒｇ， ＶＡ）から入手可能である。
【００６３】
次に、そのシリコンウェハをパターニングし、エッチング工程によりエッチングする（図６ｂ〜ｄ）。埋設されている酸化物層は、非常に効果的なエッチングストップとして役立ち、ウェハ全体にわたり非常に均一なエッチング深度が得られる。エッチング深度はエッチング工程には依存せず、上部のシリコン層の厚みによってのみ決まる。
【００６４】
湿式化学的エッチング工程（例えばＫＯＨまたはテトラ−メチルヒドラジン（ＴＭＡＨ）を用いるもの）が利用できる。しかし、この技法は、シリコンウェハの結晶配向にわずかに依存する。したがって、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）において希ガス（典型的にはＳＦ_６）を用いる技法が好ましい。ＲＩＥエッチング技法は、シリコン中に、シリコンウェハの結晶配向に依存しない高度に異方性のウェルを実現することができる。参考文献、Ｇ． Ｋｏｖａｃｓ，「微細機械加工されたトランスデューサー資料集（Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｅｄ Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ）」， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９９８）およびＭ． Ｍａｄｏｕ，「微細加工の基礎（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ）」， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ （１９９７）にエッチング技法のバックグラウンドが載っている。
【００６５】
１つのチップに対して両タイプのマイクロリソグラフィーを用いて、所望のウェル形状の組合せを得ることができる。湿式化学的エッチングは、Ｕ字形のウェルが得られる等方性の工程であるが、ＲＩＡは底部が四角形のウェルが得られる異方性の工程である。
【００６６】
ウェハをエッチングしてマスター鋳型を得た後、それを用いてタンパク質チップを成型できる（図６ｅ〜ｆ）。これらの構造体をタンパク質チップとしてもよいし、あるいはそれら自体を、そこからタンパク質チップの更なる成型を行う二次もしくは三次鋳型としてもよい。
【００６７】
したがって、１つの実施形態において、複数のウェルを固相支持体の表面上に含む位置アドレス可能なアレイの製造方法は、固相表面に１００ウェル／ｃｍ^２を上回る密度のウェルが形成されるように設計された微細加工鋳型からアレイを成型することを含む。別の実施形態において、複数のウェルを固相支持体の表面に含む位置アドレス可能なアレイの製造方法は、固相表面に１００ウェル／ｃｍ^２を上回る密度のウェルが形成されるように設計された微細加工鋳型から二次鋳型を成型し、その二次鋳型から少なくとも１つのアレイを成型することを含む。更に別の実施形態において、位置アドレス可能なアレイの製造方法は、上記の鋳型を液体成型材料で被覆し、成型物が固形になるまでその成型材料を硬化させることを含む。液体成型材料は、好ましくはシリコーンエラストマー（ｓｉｌｉｃｏｎｅ ｅｌａｓｔｏｍｅｒ）であり、最も好ましくはポリジメチルシロキサンである。これらの位置アドレス可能なアレイのいずれにも、タンパク質、該タンパク質の機能性ドメインを含む分子、細胞全体およびタンパク質含有細胞性物質からなる群から選ばれる複数種の異なる物質を、各々の異なる物質が固相支持体上の異なるウェル内に見出されるように置くことができる。
【００６８】
Ｂ．タンパク質チップの特徴
本発明のタンパク質チップは、物理的な大きさに限定されるものではなく、簡便ないずれの大きさのものであってもよい。現行の実験室装置と適合させるためには、標準的な顕微鏡用スライドかまたはそれより小さい大きさのタンパク質チップが好ましい。最も好ましいのは、２つのチップが１枚の顕微鏡用スライドに取り付けられるような大きさのタンパク質チップである。また、質量分析計のサンプルチャンバーに適合する大きさのタンパク質チップも好ましい。
【００６９】
本発明のタンパク質チップにおけるウェルは、どのような形状であってもよく、例えば、矩形、正方形または楕円形が挙げられ、円形が好ましい。タンパク質チップにおけるウェルは四角形もしくは円形の底部、Ｖ字形の底部、またはＵ字形の底部を有することができる。四角形の底部はわずかに好ましい。何故ならば、好ましい反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）工程（異方性である）によって、底部が四角形のウェルが得られるからである。ウェル底部の形状は、特定のチップ上で均一である必要はないが、該チップ上で実施される特定のアッセイでの必要に応じて様々なものであり得る。
【００７０】
本発明のタンパク質チップのウェルは、いずれの幅−深度比のものであってもよく、約１０：１〜約１：１０の幅−深度比が好ましい。本発明のタンパク質チップのウェルは、いずれの容積のものであってもよく、１ｐｌ〜５μｌの容積を有するウェルが好ましく、１ｎｌ〜１μｌの容積を有するウェルがより好ましい。ウェルの最も好ましい容積は１００ｎｌ〜３００ｎｌである。非常に高密度のウェルを備えるタンパク質チップの場合、好ましいウェルの容積は１０ｐｌ〜１００ｎｌである。
【００７１】
本発明のタンパク質チップは、非常に様々なウェルの密度（ウェル／ｃｍ^２）を有することができる。好ましいウェルの密度は約２５ウェル／ｃｍ^２〜約１０，０００，０００，０００，０００ウェル／ｃｍ^２である。レーザーミリングしたルーサイトのマスター鋳型から成型されるタンパク質チップでのウェルの密度は、通常、１ウェル／ｃｍ^２〜２，５００ウェル／ｃｍ^２である。適切なミリング装置を使えば、直径が１００μｍと小さく１００μｍ間隔のウェルが得られる。湿式化学的マイクロリソグラフィー技法によりエッチングされたマスター鋳型から成型されるタンパク質チップでは、ウェルの密度が通常５０ウェル／ｃｍ^２〜１０，０００，０００，０００ウェル／ｃｍ^２である。湿式化学的エッチングでは、深さ１０μｍで１０μｍ間隔のウェルを得ることができ、そしてまた、直径が１０μｍ未満のウェルが得られる。ＲＩＥマイクロリソグラフィー技法によりエッチングされたマスター鋳型から成型されるタンパク質チップでは、ウェルの密度が通常１００ウェル／ｃｍ^２〜２５，０００，０００ウェル／ｃｍ^２である。ＲＩＥを光学的リソグラフィーと組み合わせれば、直径５００ｎｍで５００ｎｍ間隔のウェルを作製することができる。電子ビームリソグラフィーをＲＩＥと組み合わせて用いれば、直径５０ｎｍで５０ｎｍ間隔のウェルを作製することができる。この大きさおよびそれと等しい間隔を有するウェルでは、ウェルの密度が１０，０００，０００，０００，０００ウェル／ｃｍ^２のタンパク質チップが得られる。好ましくは、ＲＩＥを用いて、直径２０μｍで２０μｍ間隔のウェルを作製する。この大きさで間隔もそれと等しいウェルでは、２５，０００，０００ウェル／ｃｍ^２の密度となろう。
【００７２】
上記で記載した微細加工技法およびマイクロリソグラフィー技法は、ウェルの大きさが５６０μｍまたは２８０μｍで約１ｍｍ間隔であるシリコンウェハを湿式化学的にエッチングするのに成功裏に用いられている。ウェルと間隔のこの組合せにより、それぞれ約４１０，０００ウェル／ｃｍ^２および約６１０，０００ウェル／ｃｍ^２のアレイが得られる。ウェルの大きさと間隔が等しい場合、約３，１９０，０００ウェル／ｃｍ^２および１２，７５０，０００ウェル／ｃｍ^２のタンパク質チップが得られる。
【００７３】
１つの実施形態において、上記アレイは、固相支持体の表面に複数のウェルを含んでおり、ウェルの密度は少なくとも１００ウェル／ｃｍ^２である。別の実施形態において、上記のウェルの密度は１００〜１０００ウェル／ｃｍ^２である。別の実施形態において、上記のウェルの密度は１０００〜１０，０００ウェル／ｃｍ^２である。別の実施形態において、上記のウェルの密度は１０，０００〜１００，０００ウェル／ｃｍ^２である。更に別の実施形態において、上記のウェルの密度は１００，０００〜１，０００，０００ウェル／ｃｍ^２である。更に別の実施形態において、上記のウェルの密度は１，０００，０００〜１０，０００，０００ウェル／ｃｍ^２である。更に別の実施形態において、上記のウェルの密度は１０，０００，０００〜２５，０００，０００ウェル／ｃｍ^２である。更に別の実施形態において、上記のウェルの密度は少なくとも２５，０００，０００ウェル／ｃｍ^２である。更に別の実施形態において、上記のウェルの密度は少なくとも１０，０００，０００，０００ウェル／ｃｍ^２である。更に別の実施形態において、上記のウェルの密度は少なくとも１０，０００，０００，０００，０００ウェル／ｃｍ^２である。
【００７４】
Ｃ．タンパク質チップの利用
１つの実施形態において、本発明は、限定するものではないがスライドガラスのような平坦表面を含むタンパク質チップを提供する。高密度タンパク質アレイは、化学反応およびアッセイが実施できて、タンパク質（例えばプロテインキナーゼ）の存在、量および／または機能の大規模な平行分析が可能になるように、例えばスライドガラス上に作製することができる。タンパク質またはプローブは共有結合または非共有結合により固相支持体の平坦表面に結合させる。タンパク質またはプローブは、固相支持体の平坦表面に直接結合させてもよいし、あるいは固相支持体にリンカー分子または化合物を介して付着させてもよい。リンカーは、タンパク質またはプローブの固相支持体表面への付着を容易にするように固相支持体の表面を誘導体化するいずれかの分子または化合物とすることができる。リンカーは、タンパク質またはプローブを固相支持体表面に共有結合または非共有結合により結合させることができる。更に、リンカーは、無機分子でも有機分子でもよい。好ましいリンカーは、遊離アミンを有する化合物である。リンカーの中で最も好ましいものは３−グリシドオキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＳ）である。
【００７５】
別の実施形態において、本発明のタンパク質チップには、平坦表面アレイと比較して幾つかの利点がある。すなわち、ウェルを用いることにより、ウェルの内容物についての交差汚染の可能性が解消または軽減される。平坦表面と比較したもう１つの利点は、ノイズに対するシグナル比（ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｏｉｓｅ ｒａｔｉｏｓ）が増大することである。ウェルにより、大容量の反応溶液をより高密度の配置で使用できるようになり、したがって、より大きなシグナルが可能になる。更に、ウェルにより、平坦表面アレイと比較してチップからの反応溶液の蒸発速度が低下し、したがって、より長い反応時間が可能になる。
【００７６】
平坦表面と比較したウェルのもう１つの利点は、ウェルを使用すれば、チップ上の各ウェルについて固定かつ限定量のプローブを用いた関連研究が可能になるのに対し、平坦な表面を用いた場合には、通常、基材全体にわたりプローブが無差別に適用されてしまう点である。プローブ混合物中の１つのプローブが高い親和性を有するが特異性が低い場合、基材全体にわたってプローブ混合物が無差別に適用されることによって、タンパク質の多くがその高親和性のプローブで飽和されてしまうだろう。この飽和は、混合物中の他のタンパク質の検出を実質上制限する。ウェルを用いれば、チップ上の個々のウェルに限定量のプローブを適用できる。したがって、個々のタンパク質に適用されるプローブの量が制御でき、そのプローブは（異なるウェルに入っている）異なるタンパク質に対して個別のものとすることができる。
【００７７】
上記のようにしてタンパク質チップが製造されたら、それを用いて、アッセイおよび他の化学反応を行うことができる。アッセイの場合、タンパク質またはプローブは通常、ウェルに配置するだろう。タンパク質またはプローブの存在または不在は、タンパク質チップにそれぞれプローブまたはタンパク質を適用することにより検出されるだろう。タンパク質−プローブ相互作用は、当技術分野で公知の種々の技法を用いて可視化でき、それらの技法の幾つかは下記で述べる。
【００７８】
本発明において有用なタンパク質は、融合タンパク質（所定のドメインが種々の天然タンパク質の１つに結合されている）であってもよいし、または完全なままの状態の非融合タンパク質であってもよい。
【００７９】
別の実施形態では、タンパク質含有細胞性物質（限定するものではないが、例えば小胞、エンドソーム、細胞内小器官（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ）および膜断片）をタンパク質チップ（例えばウェル内）に配置することができる。別の実施形態では、細胞全体をタンパク質チップ（例えばウェル内）に配置する。さらなる実施形態では、タンパク質、タンパク質含有細胞性物質または細胞全体をタンパク質チップの固相支持体に付着させる。
【００８０】
タンパク質は、タンパク質チップに配置する前に精製してもよいし、あるいは、該チップに配置している間に、特定のタンパク質に結合する試薬（予めタンパク質チップに配置されている）を用いて精製してもよい。部分精製されたタンパク質含有細胞性物質または細胞は、標準的な技法（例えば、アフィニティーまたはカラムクロマトグラフィー）または遠心分離サンプル（例えばＰ１またはＰ２画分）の単離により得ることができる。
【００８１】
更に、タンパク質、タンパク質含有細胞性物質または細胞は、タンパク質チップに配置する前または配置する時点で、人工または天然の膜に埋設することができる。別の実施形態では、タンパク質、タンパク質含有細胞性物質または細胞は、タンパク質チップに配置する前または配置する時点で、細胞外マトリックス成分（例えばコラーゲンや基底板）に埋設することができる。本発明のタンパク質は、溶液の状態であってもよいし、固相支持体表面（例えばウェル内または平坦表面上）に結合されていてもよいし、あるいは固相支持体のウェルに配置されている基材（例えばビーズ）に結合させてもよい。
【００８２】
タンパク質またはプローブのウェル内での配置は、バブルジェット式もしくはインクジェット式プリンターヘッドなどのいずれの供給手段を用いて行うことができる。マイクロピペットディスペンサーが好ましい。タンパク質またはプローブの配置は、手作業で行うか、またはその工程を機械に接続したコンピューターを用いて自動的に行うことができる。
【００８３】
ウェルが内蔵されている（ｓｅｌｆ−ｃｏｎｔａｉｎｅｄ）ので、タンパク質またはプローブは固相支持体表面に付着または結合されている必要はなく、むしろタンパク質またはプローブは単にウェルに配置されているか、ウェル内に配置されている基材（例えばビーズ）に結合されていればよい。他の基材としては、限定するものではないが、ニトロセルロース粒子、ガラスビーズ、プラスチックビーズ、磁性粒子およびラテックス粒子が挙げられる。あるいはまた、タンパク質またはプローブは、ウェル内の固相支持体表面に共有結合または非共有結合により結合される。タンパク質またはプローブは、（ウェル内の）固相支持体表面に直接結合されてもよいし、またはリンカー分子もしくは化合物を介して固相支持体に付着されてもよい。リンカーは、タンパク質またはプローブの固相支持体表面への付着を容易にするように固相支持体表面を誘導体化するいずれの分子または化合物とすることもできる。リンカーは、タンパク質またはプローブを共有結合により固相支持体表面に結合させることができるか、あるいはリンカーは、非共有結合性の相互作用により結合させることができる。更に、リンカーは、無機または有機分子とすることもできる。好ましいリンカーは、遊離アミンを有する化合物である。リンカーの中で最も好ましいものは、３−グリシドオキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＳ）である。
【００８４】
ウェル表面に非共有結合により結合されているタンパク質またはプローブは、ウェル表面への付着を達成するために種々の分子相互作用を利用することができ、例えば、水素結合、ファンデルワールス結合、静電的、または金属キレート配位結合が挙げられる。更に、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよび受容体−リガンドの相互作用が、非共有結合による結合を利用する相互作用のタイプである。受容体−リガンド相互作用の例としては、抗体と抗原、ＤＮＡ結合タンパク質とＤＮＡ、酵素と基質、アビジン（またはストレプトアビジン）とビオチン（またはビオチン化分子）との間の相互作用、ならびに脂質結合タンパク質とリン脂質の膜もしくは小胞との相互作用が挙げられる。例えば、タンパク質は、ウェルの表面に付着されている基質に対して親和性を有する融合タンパク質ドメインと共に発現できる。融合タンパク質結合に対する好適な基質としては、トリプシン／アンヒドロトリプシン、グルタチオン、免疫グロブリンドメイン、マルトース、ニッケルまたはビオチンおよびその誘導体が挙げられ、それらはそれぞれウシ膵臓トリプシンインヒビター、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、抗原、マルトース結合タンパク質、ポリ−ヒスチジン（例えばＨｉｓＸ６タグ）およびアビジン／ストレプトアビジンに結合する。
【００８５】
Ｄ．タンパク質チップ上でのアッセイ
１つの実施形態において、タンパク質チップは、化学発光もしくは蛍光を生じる標準的な酵素アッセイを用いることによるアッセイに用いられる。種々のタンパク質および分子修飾の検出は、例えば光ルミネセンス、非タンパク質基質を用いる蛍光、酵素的発色、質量分析シグネチャーマーカー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｍａｒｋｅｒ）およびオリゴヌクレオチドタグの増幅（例えばＰＣＲによるもの）を用いて行うことができる。したがって、タンパク質／プローブ相互作用は、特に、化学発光、蛍光、放射性標識または原子間力顕微鏡法（ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）により検出できる。またアレイ中の特定の要素に結合するプローブは直接質量分析によっても同定できる。例えば、非分解的な方法（プローブをアレイの要素から解離させる）により溶液中に放出されるプローブは、質量分析によって同定できる（例えばＷＯ ９８／５９３６１を参照）。別の例では、アレイ要素の酵素消化により溶液中に放出されるペプチドまたは他の化合物を質量分析により同定できる。
【００８６】
アッセイの種類は幾つかの大まかなカテゴリーに分かれる。第１の例として、アレイ上の各ウェルは、その結合を検出および定量しようとする１つのプローブに暴露される。これらのアッセイの結果は、限定するものではないが以下の方法を含む方法により可視化される：１）放射性標識したリガンド、続いてオートラジオグラフィーおよび／またはホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）による分析を用いること；２）ハプテンを結合させ、次いでそれを蛍光標識または酵素標識した抗体または高親和性ハプテンリガンド（例えばビオチンまたはストレプトアビジン）により検出すること；３）質量分析；４）原子間力顕微鏡法；５）蛍光偏光法；６）ローリングサークル型増幅検出方法（Ｈａｔｃｈら， １９９９，「固相表面に固定されたＤＮＡのローリングサークル型増幅および多重突然変異検出へのその適用（Ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｏｎ ｓｏｌｉｄ ｓｕｒｆａｃｅｓ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）」， Ｇｅｎｅｔ． Ａｎａｌ． １５（２）：３５−４０）；７）競合的ＰＣＲ（Ｆｉｎｉら， １９９９，「マイクロプレートルミノメーターを用いるパルボウイルスＢ１９ ＤＮＡの検出および定量のための化学発光競合ＰＣＲの開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＰＣＲ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ Ｂ１９ ＤＮＡ ｕｓｉｎｇ ａ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）」， Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ． ４５（９）：１３９１−６；Ｋｒｕｓｅら， １９９９，「半ネスティド競合ＰＣＲアッセイを用いるトランスフォーミング増殖因子−β１（ＴＧＦ−β１）遺伝子発現の検出および定量的測定（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ １（ＴＧＦ−ｂｅｔａ １） ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ）」， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １１（２）：１７９−８５；ＧｕｅｎｔｈｎｅｒおよびＨａｒｔ， １９９８，「マイクロプレートに基づく検出系を用いるＨＩＶ−１についての定量的で競合的なＰＣＲアッセイ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ， ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ＨＩＶ−１ ｕｓｉｎｇ ａ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ−ｂａｓｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）」， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（５）：８１０−６）；８）比色法；および９）生物学的アッセイ（例えばウイルス力価についてのもの）。
【００８７】
第２の例として、アレイ上の各ウェルは、その結合を検出および定量しようとする複数種のプローブに同時に暴露される（幾つかの供給源からプローブをプールすることを含む）。これらのアッセイの結果は、限定するものではないが以下の方法を含む方法により可視化される：１）質量分析；２）原子間力顕微鏡法；３）赤外もしくは蛍光標識した化合物またはタンパク質；４）増幅可能なオリゴヌクレオチド、ペプチドまたは分子の質量標識；ならびに５）タンパク質酵素活性の刺激もしくは阻害。本発明のアレイには位置のアドレス可能な性質があるために、情報はプローブの混合物から収集される。すなわち、規定のタンパク質をタンパク質チップ上の既知の位置に配置することにより、結合したプローブが結合する相手についての情報が判る。そのように望まれる場合、次に、結合を示すアレイ上の位置を個々のプローブでプロービングして、目的の特定の相互作用を同定することができる。
【００８８】
有用な情報はまた、例えば、タンパク質チップを細胞抽出物と共にインキュベートすることによっても得ることができ、その場合、チップ上の各ウェルは、目的の酵素活性をアッセイするための反応混合物を含み、複数の異なる酵素活性および／または基質活性がアッセイされて、それによって、特定の酵素活性の細胞性レパートリーが同定および測定される。同様にして、タンパク質チップは、細胞全体または形質膜の調製物と共にインキュベートして、例えば膜関連タンパク質もしくは分子の発現または細胞表面タンパク質もしくは分子の結合特性についてアッセイすることができる。タンパク質チップ上の特定の位置に結合する細胞、細胞上のマーカーまたは細胞によって分泌される物質は、当技術分野で公知の技法を用いて検出できる。例えば、抗原のアレイを含むタンパク質チップは、Ｂ細胞またはＴ細胞を用いてスクリーニングでき、その場合、その抗原は、合成抗原、組織特異的抗原、疾患特異的抗原、病原体の抗原、および自己組織の抗原からなる群から選ばれる。リンパ球により認識される抗原または抗原決定基は、アレイ上のどの位置で抗原による細胞の活性化が起こるのかを確定することにより決定できる。リンパ球の活性化は、種々の手段によりアッセイでき、例えば、限定するものではないが、抗体の合成を検出すること、^３Ｈ−チミジンの取込みを検出もしくは測定すること、標識した抗体で細胞表面分子をプロービングして抗原認識および活性化により誘導または抑制される分子（例えばＩｇＤ、Ｃ３ｂ受容体、ＩＬ−２受容体、トランスフェリン受容体、膜クラスＩＩ ＭＨＣ分子、ＣＤ２３、ＣＤ３８、ＰＣＡ−１分子、ＨＬＡ−ＤＲ）を同定すること、および発現および／または分泌されるサイトカインを同定することが挙げられる。
【００８９】
別の例において、特定の細胞型についてのマイトジェンは、細胞を、推定のマイトジェンのアレイを含むタンパク質チップと共にインキュベートすることにより測定でき、位置アドレス可能なアレイを細胞集団と接触させ（但し、そのアレイは、タンパク質、該タンパク質の機能性ドメインを含む分子、細胞全体およびタンパク質含有細胞性物質からなる群から選ばれる複数種の異なる物質を固相支持体上に含んでなり、各々の異なる物質は固相支持体上の異なる位置に存在し、異なる物質の密度は１ｃｍ^２当たり少なくとも１００種の異なる物質である）；そして細胞においてマイトジェン活性が誘導される固相支持体上での位置を検出するステップを含む。細胞分裂は、例えば細胞による^３Ｈ−チミジンの取込みを検出もしくは測定することによりアッセイできる。細胞は同じ細胞型（すなわち、均質な集団）のものであってもよいし、または異なる細胞型のものであってもよい。
【００９０】
更に別の例において、タンパク質チップ上でのタンパク質の細胞取込みおよび／またはタンパク質のプロセッシングは、例えば、放射性標識したタンパク質基質を用い、放射性基質濃度の低下または細胞による放射性基質の取込みを測定することによりアッセイできる。これらのアッセイは、診断目的または治療目的で使用できる。当業者であれば、種々のタイプの細胞相互作用を検出するための多くの適切なアッセイを理解できる。
【００９１】
したがって、幾つかのクラスのプローブ（例えば、既知のプローブの混合物、細胞抽出物、細胞内小器官、細胞膜調製物、細胞全体など）を用いることにより、細胞活性の大規模または網羅的な分析が提供できる。特に、１種または数種のスクリーンが、細胞型または細胞、組織、器官もしくは系の生理学的状態の「フットプリント」の同定の基礎をなし得る。例えば、（形態学上または機能上）異なる細胞型は、タンパク質チップにより測定される細胞活性または発現のパターンにより区別できる。またこのアプローチは、例えば細胞周期の異なる段階、疾患状態、生理学的状態の変化（例えば低酸素症）、治療（例えば薬物治療）の前もしくは後での生理学的状態、代謝状態、分化もしくは発生の段階、環境的刺激（例えば光、熱）に対する応答、細胞−細胞相互作用、細胞特異的遺伝子および／もしくはタンパク質の発現、ならびに疾患特異的遺伝子および／もしくはタンパク質の発現を測定するのに使用できる。
【００９２】
酵素反応を行い、本発明のタンパク質チップを用いて酵素活性を測定することができる。１つの特定の実施形態では、チップ上のタンパク質（１つまたは複数）の酵素活性をモジュレートする化合物を同定できる。例えば、酵素活性レベルの変化が、タンパク質チップのウェル内での化合物もしくは化合物の混合物と酵素反応混合物とのインキュベーションにより検出および定量され、この場合、（例えば酵素活性により蛍光性になる基質から）シグナルが生じる。化合物の存在と不在との差異に注目する。更に、異なるタンパク質の酵素活性に対する化合物の効果の違いは、タンパク質チップ内およびチップ間で、サンプルに対するそれらの相対的効果を比較することによって容易に検出される。
【００９３】
上記で詳述した本発明の高密度タンパク質チップを用いる種々のストラテジーを用いて、タンパク質の種々の物理的および機能的特性を決定することができる。例えば、上記のタンパク質チップは、抗体でプロービングすることにより存在するタンパク質の存在および量を評価するのに使用できる。１つの実施形態において、ＧＳＴ融合タンパク質のポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）チップをプロービングして、タンパク質の存在および／またはその活性レベルを測定することができる。タンパク質は、発光法、化学発光法、蛍光法または化学蛍光法などの標準的な検出アッセイを用いて検出できる。例えば、目的のタンパク質に対する一次抗体は、蛍光標識した二次抗体により認識され、次にそれを、蛍光産物を光源で励起させてその後の蛍光を検出する機器（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓスキャナー）で測定する。より高い感度のためには、目的のタンパク質に対する一次抗体は、アルカリホスファターゼや西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素にコンジュゲートしている二次抗体により認識される。発光基質（化学発光法の場合）または蛍光発生性（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ）基質（化学蛍光法の場合）の存在下で、酵素で開裂させると、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓスキャナーを用いて検出および定量できる高度に発光性または蛍光性の産物が生じる。あるいはまた、蛍光標識した二次抗体のシグナルを、アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしている三次抗体を用いて増幅させることができる。
【００９４】
また、プロテインキナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、アセチラーゼまたは他の官能基転移酵素の基質の同定も、本発明のタンパク質チップで行うことができる。例えば、非常に様々な異なるプローブをタンパク質チップに付着させて、特定の酵素に対する基質として作用するそれらの能力についてアッセイする（例えばプロテインキナーゼによりリン酸化されるそれらの能力についてアッセイする）。キナーゼ活性の検出方法としては、限定するものではないが、放射性標識（例えば^３３Ｐ−ＡＴＰおよび^３５Ｓ−γ−ＡＴＰ）またはホスホアミノ酸に結合する蛍光抗体プローブの使用が挙げられる。例えば、１つのアッセイでは放射性標識したリンがタンパク質に取り込まれると、キナーゼ活性があることが示され、一方、別のアッセイでは、放射性標識したリンの媒体への放出が測定でき、それによってホスファターゼ活性が示される。別の例では、プロテアーゼ活性が、標準的なアッセイ（例えば質量分析、ペプチド断片に対する放射性標識した抗体、または蛍光タグ付けした基質からの蛍光シグナルの喪失）を用いて、プロテアーゼ活性により生じ媒体へ放出されるペプチド断片を同定することにより検出できる。こうして、官能基転移酵素の活性は、幾つかのアプローチおよび多くの独立した検出手段を用いて容易にアッセイでき、それらは当業者には理解されるだろう。
【００９５】
タンパク質チップは、該チップ上で特定の活性（例えば特定のキナーゼ活性、プロテアーゼ活性、核酸結合特性、ヌクレオチド加水分解、ホルモン結合性およびＤＮＡ結合性）を有するタンパク質を同定するのに使用できる。したがって、チップは、所望の活性の存在を示すプローブでプロービングできる。例えば、ＤＮＡ結合性が目的の活性である場合、候補のＤＮＡ結合タンパク質を含むチップをＤＮＡでプロービングする。
【００９６】
タンパク質のアレイのタンパク質リガンドもしくは核酸リガンドである（天然または合成の）プローブの探索は、タンパク質チップ上で並行して行うことができる。プローブは、細胞、タンパク質含有細胞性物質、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、小分子基質、薬剤候補、受容体、抗原、ステロイド、リン脂質、抗体、免疫グロブリンドメイン、グルタチオン、マルトース、ニッケル、ジヒドロトリプシンまたはビオチンであってよい。あるいは、プローブは、酵素の基質またはインヒビターであってもよい。例えば、プローブは、キナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、アセチラーゼおよび他の官能基転移酵素からなる群から選ばれる酵素の基質またはインヒビターであってよい。チップ上のタンパク質を核酸またはタンパク質のプローブと組み合わせてインキュベートした後、結合した核酸またはタンパク質のプローブを、質量分析により同定すればよい（Ｌａｋｅｙら， １９９８， “Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ（タンパク質−タンパク質相互作用の測定）”， Ｃｕｕｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ． ８：１１９−２３）。
【００９７】
病原体（例えばウイルス、細菌、真菌又は寄生虫などの感染性疾患原因）に由来する標的タンパク質の正体、または回復期にある患者もしくは回復期にない患者の免疫応答における抗原として作用する異常細胞（例えば新生物細胞、罹患細胞もしくは損傷細胞）に由来する標的タンパク質の特性を、本発明のタンパク質チップを用いて判定することができる。例えば、患者から単離されたリンパ球は、タンパク質チップ上に病原体のタンパク質のアレイを含むタンパク質チップをスクリーニングするのに使用できる。通常、これらのスクリーニングは、位置アドレス可能なアレイを複数種のリンパ球と接触させ（但し、そのアレイは、固相支持体上に複数種の可能性のある抗原を含んでおり、かつ、各々の異なる抗原は固相支持体上の異なる位置に存在し、異なる抗原の密度は、１ｃｍ^２当たり少なくとも１００種の異なる抗原である）、リンパ球の活性化が生じている固相支持体上での位置を検出することを含む。１つの特定の実施形態では、リンパ球をアレイ上の病原体のタンパク質と接触させ、その後、抗原もしくは抗原の混合物によるＢ細胞もしくはＴ細胞の活性化をアッセイして、病原体から誘導された標的抗原を同定する。
【００９８】
あるいはまた、タンパク質チップは、例えば可能性のある抗原のアレイをスクリーニングして患者のＢ細胞および／またはＴ細胞の標的を同定することにより、免疫応答の特性決定するのに使用できる。例えば、Ｂ細胞を可能性のある抗原（例えば抗原決定基を有する分子）のアレイと共にインキュベートして、体液による免疫の抗原標的を同定することができる。抗原の供給源は、例えば、自己組織、（例えば病原性微生物の）既知もしくは未知の抗原のコレクション、組織特異的もしくは疾患特異的な抗原のコレクション、または合成の抗原由来であってよい。
【００９９】
別の実施形態において、患者から単離したリンパ球を用いて、患者自身の組織から誘導したタンパク質のアレイを含むタンパク質チップをスクリーニングすることができる。そのようなスクリーニングは、自己免疫の基質またはアレルギーの原因となるタンパク質を同定し、それによって自己免疫またはアレルギー反応を診断し、かつ／または可能性のある標的薬剤の候補を同定することができる。
【０１００】
別の実施形態において、本発明のタンパク質チップは、Ｂ細胞またはＴ細胞を活性化できる物質を同定するのに使用できる。例えば、リンパ球をチップ上の試験分子もしくは試験タンパク質のアレイと接触させ、リンパ球の活性をアッセイして、Ｂ細胞もしくはＴ細胞またはリンパ球亜群（例えば細胞障害性Ｔ細胞）を総合的に活性化できる物質を同定する。
【０１０１】
抗原認識によるＢ細胞の活性化の誘導は、種々の手段によりアッセイできる。アッセイとしては、限定するものではないが、抗体の合成、^３Ｈ−チミジンの取込み、標識した抗体の新たに発現もしくは抑制された細胞表面分子への結合、およびＢ細胞活性化の指標となる因子（例えばサイトカイン）の分泌の検出または測定が挙げられる。同様に、本発明のタンパク質チップを用いるスクリーニングにおけるＴ細胞の活性化は、種々のアッセイにより調べることができる。例えば、クロム（^５１Ｃｒ）放出アッセイは、抗原の認識およびその後の細胞障害性Ｔ細胞の活性化を検出できる（例えば、Ｐａｌｌａｄｉｎｏら， １９８７， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４７：５０７４−９；Ｂｌａｃｈｅｒｅら， １９９３， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ １４：３５２−６を参照）。
【０１０２】
抗体調製物の特異性は、本発明のタンパク質チップを使用して調べることができ、該使用は、位置アドレス可能なアレイを抗体調製物と接触させ（但し、そのアレイは可能性のある複数種の抗原を固相支持体上に含んでなり、かつ、各々の異なる抗原は固相支持体上の異なる位置に存在し、異なる抗原の密度は１ｃｍ^２当たり少なくとも１００種の異なる抗原である）、抗体調製物中の抗体による結合が起こる固相支持体上での位置を検出することを含む。抗体調製物は、限定するものではないが、Ｆａｂフラグメント、抗血清、およびポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体もしくは合成抗体であってよい。例えば、抗血清は、疾患特異的抗原のコレクション、組織特異的抗原のコレクションまたは他の同定済みの抗原のコレクションをスクリーニングし、どの抗原が認識されるかを判定することにより特性決定できる。１つの特定の実施形態において、類似または関連する抗原を含むタンパク質チップアレイは、モノクローナル抗体を用いてスクリーニングし、該アレイ上のどの抗原にモノクローナル抗体が結合するかを判定することにより特異性の程度を評価する。
【０１０３】
特定の細胞活性の標的の正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は、タンパク質チップを複合的タンパク質混合物（例えば細胞抽出物）で処理し、タンパク質の活性を測定することによりアッセイできる。例えば、異なるキナーゼのアレイを含むタンパク質チップは、化合物（例えば薬剤）で処理した細胞からの細胞抽出物と接触させ、キナーゼ活性についてアッセイすることができる。別の例では、異なるキナーゼのアレイを含むタンパク質チップは、特定の細胞分化段階（例えば多能性期）にある細胞または特定の代謝段階（例えば有糸分裂期）にある細胞からの細胞抽出物と接触させ、キナーゼ活性についてアッセイできる。そうしたアッセイから得られた結果（例えば薬剤の存在下もしくは不在下にある細胞同士、または幾つかの分化段階にある細胞同士、または異なる代謝段階にある細胞同士を比較しての結果）から、異なる条件間での細胞における生理学的変化に関する情報を得ることができる。
【０１０４】
あるいはまた、特定の細胞活性の標的の正体は、多数の異なるタンパク質（例えばペプチドライブラリー）を含んでいる本発明のタンパク質チップを複合的タンパク質混合物（例えば細胞抽出物）で処理し、チップ上のタンパク質の改質についてアッセイすることによりアッセイできる。例えば、異なるタンパク質のアレイを含むタンパク質チップは、化合物（例えば薬剤）で処理した細胞からの細胞抽出物と接触させ、例えばキナーゼ、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、アセチラーゼ、ホスファターゼまたは他の転移酵素の活性についてアッセイできる。別の例では、異なるタンパク質のアレイを含むタンパク質チップは、特定の細胞分化段階（例えば多能性期）にある細胞または特定の代謝段階（例えば有糸分裂期）にある細胞からの細胞抽出物と接触させることができる。そうしたアッセイから得られた結果（例えば薬剤の存在下または不在下での細胞同士、幾つかの分化段階にある細胞同士、または異なる代謝段階にある細胞同士を比較した結果）から、これらの条件下で細胞に及ぼす生理学的作用に関する情報を得ることができる。
【０１０５】
上記タンパク質チップは、生物学的な目的の特定の分子（限定するものではないが、可能性のあるリガンド分子の受容体、ウイルス受容体、およびオーファン受容体のリガンドが挙げられる）に結合するプローブを同定するのに有用である。
【０１０６】
上記タンパク質チップはまた、タンパク質チップ上のタンパク質へのＤＮＡ結合またはＲＮＡ結合の検出、および結合特異性の判定にも有用である。更に、ＲＮＡ結合タンパク質またはＤＮＡ結合タンパク質の特定のクラス（例えば亜鉛フィンガータンパク質）が、上記タンパク質チップを用い、これらのタンパク質のアレイを核酸配列を用いてスクリーニングして結合特異性および結合強度を測定することにより調べることができる。
【０１０７】
同様の生物学的事象の機能、リガンド結合性または酵素活性が異なっているタンパク質の正体は、本発明のタンパク質チップを用いて分析できる。例えば、異なる対立遺伝子に由来するタンパク質アイソフォームの違いは、それらの活性について相互にアッセイされる。
【０１０８】
上記の高密度タンパク質チップは、薬剤の発見、薬剤の作用様式の分析、薬剤の特異性、および薬剤毒性の予測に使用できる。例えば、薬剤に結合するタンパク質の正体およびそれらの相対的親和性は、異なるアッセイ条件下でチップ上のタンパク質を薬剤または薬剤候補と共にインキュベートし、アレイ上のどこで薬剤が結合されているのかを調べ、各々の異なるタンパク質により結合されている薬剤の量を測定することによって薬剤特異性を判定することによりアッセイできる。あるいはまた、結合アッセイではなく生物学的活性をアッセイするバイオアッセイを、それと同じチップ上で、あるいは同一の第２のチップ上で行うことができる。したがって、本発明のタンパク質チップを用いるこれらのタイプのアッセイは、薬剤特異性の研究、薬剤の可能性のある副作用の予測、および薬剤の分類に有用である。更に、本発明のタンパク質チップは、薬剤候補の複合的ライブラリーのスクリーニングに適する。具体的には、チップ上のタンパク質を薬剤候補のライブラリーと共にインキュベートし、次に、結合している成分を（例えば質量分析により）同定して、タンパク質の特定のサブセットに優先的に結合する、またはチップ上の幾つかのタンパク質又は全てのタンパク質に結合する全てのライブラリー成分の同時同定が可能になる。更に、アレイ上の異なるタンパク質に対する薬剤候補の相対親和性が測定できる。
【０１０９】
更に、本発明のタンパク質チップは、前もって確認されている相互作用、酵素活性または生物学的応答の可能性のあるインヒビター、触媒、モジュレーターまたはエンハンサーの存在下でプロービングできる。このようにして、例えば、薬剤の結合の遮断、またはウイルスもしくは生理学的作用物質の特定のカテゴリーのタンパク質への破壊が、本発明のタンパク質チップを用いて分析できる。
【０１１０】
本発明のタンパク質チップは、複合的タンパク質混合物（例えば細胞全体、細胞抽出物、または組織ホモジネート）による複数の標的の改質に及ぼす薬剤の作用を調べるのに使用できる。薬剤の基本的な作用は、１つ以上のタンパク質チップを薬剤処理した細胞、組織または抽出物でスクリーニングすることにより分析でき、それにより、次にその薬剤処理した状態についての「シグネチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）」を得ることができ、未処理状態の「シグネチャー」と比較した場合、例えば効力、毒性および副作用についての予測値とすることができる。更に、薬剤の時間依存的作用は、例えばその薬剤を細胞、細胞抽出物、組織ホモジネートまたは生物全体に添加し、薬剤処理した細胞または抽出物を種々の処理時点にてタンパク質チップに適用することによりアッセイできる。
【０１１１】
ファージディスプレイライブラリーのスクリーニングは、ライブラリーを本発明のタンパク質チップと共にインキュベートすることにより実施できる。陽性クローンの結合は、当業界で公知の種々の方法（例えば質量分析）により測定でき、それによって、目的のクローンを同定した後で、その目的のクローンをコードするＤＮＡを標準的方法により同定することができる（例えば、Ａｍｅｓら， １９９５， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７−８６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら， １９９４， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４：９５２−８；Ｐｅｒｓｉｃら， １９９７， Ｇｅｎｅ １８７：９−１８を参照）。このようにして、上記チップは、チップ上の特定のタンパク質に結合する表面成分を有する細胞の選択に有用である。あるいはまた、ファージディスプレイライブラリーをチップに結合させて、該ライブラリーの位置アドレス可能なアレイが作製されるようにしてもよく、その後で、そのアレイはプローブの各種混合物で繰り返しスクリーニングすることができる。
【０１１２】
本発明はまた、本発明のアッセイレジュメを実施するためのキットを提供する。１つの特定の実施形態において、本発明のキットは、１つ以上の本発明のアレイを含む。そのようなキットは更に、１つ以上の容器内に、タンパク質もしくは分子の生物学的活性のアッセイに有用な試薬、プローブとタンパク質もしくは分子との相互作用のアッセイに有用な試薬、目的の生物学的活性を有するタンパク質もしくは分子の生物学的活性のアッセイに有用な試薬、および／または１種以上のプローブ、タンパク質もしくは他の分子を含んでなる。タンパク質もしくは分子の生物学的活性のアッセイまたはプローブとタンパク質もしくは分子との相互作用のアッセイに有用な試薬は、タンパク質チップ上の各ウェルまたは指定のウェルに含まれ得る。そのような試薬は、溶液または固体の状態であってよい。試薬としては、タンパク質もしくは分子と目的のアッセイを実施するのに必要なプローブのいずれか一方を含んでいてもよく、また両者が含まれていてもよい。
【０１１３】
１つの実施形態において、キットは、１以上のタンパク質チップ（すなわち、タンパク質、該タンパク質の機能性ドメインを含む分子、細胞全体およびタンパク質含有細胞性物質からなる群から選ばれる複数種の異なる物質を固相支持体上に含んでなり、かつ、各々の異なる物質が固相支持体上の異なる位置に存在する位置アドレス可能なアレイであって、複数種の異なる物質が１ｃｍ^２当たり少なくとも１００種の異なる物質から構成されている）と、１つ以上の容器内に、１種以上のプローブ、試薬または他の分子を含んでいる。アレイの物質は、固相支持体上のウェルの表面に結合させることができる。別の実施形態において、キット中のタンパク質チップは、既に固相支持体のウェルに結合させてあるタンパク質又はプローブを有することができる。更に別の実施形態では、キット中のタンパク質チップは、タンパク質もしくは分子の生物学的活性のアッセイ、またはプローブとタンパク質もしくは分子（既に固相支持体のウェルに結合させてある）との相互作用のアッセイに有用な試薬もしくは反応混合物を含むことができる。更に別の実施形態において、試薬は、固相支持体のウェルに結合されているのではなく、ウェル内に収容することができる。更に別の実施形態において、試薬は固相支持体のウェルに結合されているのではなく、１つ以上の容器内に収容することができ、固相支持体のウェルに添加することができる。更に別の実施形態において、上記キットは更に、タンパク質もしくは分子の生物学的活性をアッセイするための溶液状の反応混合物を入れている１つ以上の容器を含む。さらに別の実施形態において、上記キットは、プローブ、目的のタンパク質もしくは分子、および／または１つ以上のアッセイを実施するのに有用な他の試薬が結合できる基材（例えばビーズ）を提供し、その後で、プローブ、タンパク質または他の試薬が結合しているその基材をチップのウェルに入れることができる。
【０１１４】
別の実施形態において、上記キット中の１つ以上のタンパク質チップは、目的の生物学的活性を有するタンパク質を、該固相支持体のウェルに結合されている状態で含む。別の実施形態において、上記キット中の１つ以上のタンパク質チップは、生物のゲノム中の同タイプの生物学的活性を有する全ての発現タンパク質の少なくとも５０％、７５％、９０％または９５％を、固相支持体のウェルに結合されている状態で含む。１つの特定の実施形態において、上記キット中の１つ以上のタンパク質チップは、生物のゲノム中の全ての発現されたキナーゼ、ホスファターゼ、グリコシダーゼ、プロテアーゼ、アセチラーゼ、他の官能基転移酵素、核酸結合タンパク質、ホルモン結合タンパク質またはＤＮＡ結合タンパク質の少なくとも５０％、７５％、９０％または９５％を、固相支持体のウェルに結合されている状態で含む。
【０１１５】
Ｅ．タンパク質チップと共に有用なタンパク質
全長タンパク質、全長タンパク質の部分、およびペプチド（生物における組換え体の過剰発現から調製されたものでも、長めのタンパク質の断片化により作製されたものでも、化学的に合成されたものでもよい）を本発明において使用して、タンパク質チップを作製する。タンパク質が過剰発現される生物としては、限定するものではないが、細菌、酵母、昆虫、ヒトおよびヒト以外の哺乳動物（例えばマウス、ラット、ネコ、イヌ、ブタ、ウシおよびウマ）が挙げられる。更に、種々の天然または合成のタンパク質の１つに所定のドメインが結合している融合タンパク質が利用できる。本発明において用いられるタンパク質は、タンパク質チップのウェルに結合または固着させる前に精製してもよいし、あるいは、タンパク質チップのウェルに予め結合または固着させてある試薬の使用により結合させている間に精製してもよい。これらの試薬としては、通常タンパク質に特異的に結合するもの、またはタンパク質の特定の基に結合するものが挙げられる。タンパク質は、タンパク質チップへ結合させる前または結合させる時点に、人工または天然の膜（例えばリポソーム、膜小包）に包埋することができる。あるいはまた、タンパク質は、タンパク質チップのウェルに送達されてもよい。
【０１１６】
本発明のタンパク質チップに用いられるタンパク質は、好ましくは、当業界で公知の方法により発現される。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， カタログＮｏ． Ｋ８００−０１）のＩｎｓｅｃｔＳｅｌｅｃｔ系は、高品質のタンパク質の発現を簡素化し、ウイルスストックを作製し増幅しなくても済む、非溶解性の単一ベクター昆虫発現系であり、これが好ましい発現ベクターである。この系における好ましいベクターは、ｐＩＢ／Ｖ５−Ｈｉｓ ＴＯＰＯ ＴＡベクター（カタログＮｏ． Ｋ８９０−２０）である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の産物を、製造元により記載されているプロトコールを用いて、このベクターに直接クローニングすることができ、次に、そのタンパク質を、Ｎ末端ヒスチジン（Ｈｉｓ）標識（発現されたタンパク質を精製するのに使用できる）を用いて発現させる。
【０１１７】
ＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ（商標）系は、Ｌｉｆｅｔｅｃｈ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）から入手可能な昆虫細胞におけるもう１つの真核性発現系であり、これも好ましい発現系である。相同組換えを用いる場合とは違って、ＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ（商標）系は、大腸菌における部位指定転位に基づいて組換えバキュロウイルスを生じる。遺伝子発現は、非常に活性なポリヘドリンプロモーターにより駆動され、したがって、感染させた昆虫細胞における細胞性タンパク質の２５％以下となり得る。
【０１１８】
ＶＩ．実施例Ｉ：タンパク質チップを用いた酵母プロテインキナーゼの分析
Ａ．緒言
以下の実施例により、本発明のタンパク質チップの製造およびタンパク質チップの使用方法の様々な態様を例示する。本発明のタンパク質チップ技術は、多数のサンプルの迅速な分析に適し、したがって、このアプローチをほぼ全ての酵母プロテインキナーゼの分析に適用した。プロテインキナーゼは、タンパク質のリン酸化を触媒し、細胞周期の調節、シグナル伝達、ＤＮＡ複製、遺伝子転写、タンパク質翻訳およびエネルギー代謝などの基本的な細胞機能の調節において重要な役割を担っている^７。完全なゲノム配列が入手できれば、生物によってコードされる全てのプロテインキナーゼを分析し、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ基質を決定することが可能になる。
【０１１９】
酵母のゲノムは配列決定されており、長さが１００コドンを超える約６２００のオープンリーディングフレームを含む。これらのうちの１２２がプロテインキナーゼをコードすると推定される。これらのプロテインキナーゼ遺伝子のうち２４種はこれまで研究されていなかった^８。２種のヒスチジンプロテインキナーゼを除いて、全ての酵母プロテインキナーゼがＳｅｒ／Ｔｈｒファミリーのメンバーである。チロシンキナーゼファミリーのメンバーは存在しないが、セリン／トレオニンおよびチロシンをリン酸化する７種のプロテインキナーゼが報告されている^８。
【０１２０】
本発明のタンパク質チップ技術の開発により、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来するほぼ全てのプロテインキナーゼの生化学的活性のハイスループット分析を、本明細書に記載されているようにして行なった。用いたタンパク質チップは、顕微鏡用スライドガラスの上面に置いたシリコーンエラストマーシートの３００ｎｌ容ウェルの使い捨てアレイとした。このウェルは高密度で小サイズであるために、多くの個々のサンプルのハイスループットのバッチ処理および同時分析が可能になり、ほんの少量のタンパク質しか必要としない。本発明のタンパク質チップを用いて、サッカロミセス・セレビシエのキナーゼタンパク質（全部で１１９種の異なるキナーゼ）をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合させ、酵母内で過剰発現させ、精製し、１７種の異なる基質をリン酸化する能力についてアッセイした。これまでに特性決定されていなかった２４種のキナーゼのうちの１８種を含む被験キナーゼのほぼ全部（９３％）が、１種以上の基質について、対照よりも少なくとも５倍高い活性を示した。３２種のキナーゼが１種以上の基質の選択的リン酸化を示した。２７種のキナーゼは、ポリ（Ｔｙｒ−Ｇｌｕ）を容易にリン酸化した。これまでは、これらのキナーゼのうち５種だけが二重機能性キナーゼ（すなわち、Ｓｅｒ／ＴｈｒとＴｙｒの双方をリン酸化する）として分類されていたので、これらの発見から、チロシン残基をリン酸化できるキナーゼについての知見を大きく拡げた。興味深いことに、これらの二重特異性のキナーゼは、触媒領域の近傍に存在する共通するアミノ酸残基を有することが多い。これらの結果から、本発明のタンパク質チップ技術は、タンパク質の生化学的活性のハイスループットスクリーニング、ならびにプロテオーム全体の分析に有用であることが示される。
【０１２１】
Ｂ．方法
１．細胞培養、構築物およびタンパク質精製
Ｈｕｄｓｏｎら^９の組換え法を用いて、１２２種の酵母プロテインキナーゼ遺伝子のうち１１９種を高コピーＵＲＡ３発現ベクター（ｐＥＧ（ＫＧ））（ガラクトース誘導型ＧＡＬ１０プロモーター^１０の制御下でＧＳＴ融合タンパク質を産生する）にクローニングした。簡単に説明すると、各ＯＲＦの末端に相補的なプライマーをＲｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓから購入した。これらのプライマーの末端は、共通する２０ｂｐの配列を含んでいる。第２ラウンドのＰＣＲにおいて、これらの産物の末端を、上記ベクターに相同な配列を付加することにより修飾した。末端にそのベクター配列を含むＰＣＲ産物を該ベクターと共にｐｅｐ４酵母株（幾つかの酵母プロテアーゼを欠く）^１０に形質転換し、Ｕｒａ^＋コロニーを選択した。プラスミドを大腸菌にレスキューし、制限酵素消化よって確認し、該ベクターに相補的なプライマーを用いてベクター挿入物の連結点まで及ぶＤＮＡ配列を決定した。ＧＳＴ：：Ｃｌａ４構築物では、アミノ末端コード領域のポリ（Ａ）ストレッチにフレームシフト突然変異が見られた。３つの独立したクローンは、リーディングフレームを維持している正しいものを見つける必要があった。これらの遺伝子のうち５つでは、２種の重複ＰＣＲ産物が得られ、酵母細胞に導入した。キナーゼタンパク質の精製のために、確認したプラスミドをｐｅｐ４酵母株に再導入した。
【０１２２】
９６ウェルフォーマットを用いてサンプルを調製するために、０．７５ｍｌの細胞をラフィノースを含有する培地中でＯ．Ｄ．（６００）が約０．５になるまで、２ｍｌ容ウェルを含むボックス内で増殖させた。各株について２ウェルずつ用いた。ガラクトースを最終濃度４％まで添加して、タンパク質発現を誘導し、細胞を４時間インキュベートした。同じ株の培養物を合わせて１つにし、５００μｌの溶解緩衝液で１回洗浄し、２００μｌの溶解緩衝液に再懸濁し、１００μｌの冷却ガラスビーズを含む９６×０．５ｍｌのプレート（Ｄｏｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＵＳＡ）に移した。細胞を、４℃でボルテックス処理を繰り返すことにより該ボックス内で溶解させ、これらの株から、９６ウェルフォーマットでグルタチオンビーズおよび標準的プロトコール^２０を用いてＧＳＴ融合タンパク質を精製した。５種の精製されたＧＳＴ：：キナーゼタンパク質（Ｓｗｅｌ、Ｐｔｋ２、Ｐｋｈ１、Ｈｏｇ１、Ｐｂｓ２）の純度は、それら精製タンパク質のクーマシー染色パターンを、抗ＧＳＴ抗体を用いたイムノブロット分析により得られたパターンと比較することにより求めた。結果から、精製されたタンパク質が９０％を上回る純度であることが示された。Ｈｏｇ１の活性型を精製するために、上記の誘導の最後の５分間に細胞を０．４Ｍ ＮａＣｌでチャレンジした。プロテインキナーゼの活性は、−７０℃で少なくとも２ヶ月は安定であり、キナーゼ活性の喪失はほとんど、あるいは全くなかった。
【０１２３】
２．チップの製造およびタンパク質の結合
チップを、シリコーンエラストマー、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）（Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， ＵＳＡ）から製造したが、それらは微細加工鋳型に対して成型された。液状のＰＤＭＳを該鋳型に注ぎ、硬化させた後（６５℃で少なくとも４時間）、再使用可能な鋳型から可撓性のシリコーンエラストマーのアレイシートを剥がした。ＰＤＭＳはマイクロリソグラフィーにより作製された構造体に対して容易に成型されうるが、本明細書に記載されているキナーゼアッセイのためには、アクリル系のシートから作製した、コンピューター制御レーザーミリング装置（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｌａｓｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ＵＳＡ）でパターニングした鋳型で十分だった。
【０１２４】
３０種を超える各種アレイを試験した。試験した変数は、ウェルの幅と深さ（幅は１００μｍ〜２．５ｍｍ、深さは１００μｍ〜１ｍｍ）、ウェル間の間隔（１００μｍ〜１ｍｍ）、構成（矩形のアレイ、または最も密に詰め込まれているもの）、およびウェルの形状（四角形ｖｓ丸形）とした。レーザーでミリングしたアクリル系鋳型を使用することにより、様々なパラメーターの多数のひな型を実現するための迅速で安価な方法が得られた。
【０１２５】
ウェルへのタンパク質の結合を最大にする条件を決定するために、ＰＤＭＳを、５Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４、１０Ｍ ＮａＯＨ、過酸化水素または３−グリシドオキシプロピルメトキシシランリンカー（ＧＰＴＳ）（Ａｌｄｒｉｃｈ， ＵＳＡ）のいずれかで処理した^{１１，１２}。ＧＰＴＳ処理により、未処理のＰＤＭＳまたは別のやり方で処理されたＰＤＭＳと比較して、ウェルへのタンパク質の吸着が最大になった。簡単に述べると、１００％ＥｔＯＨで室温にて３回洗浄した後、チップを１％ＧＰＴＳ溶液（９５％ＥｔＯＨ、１６ｍＭ ＨＯＡｃ）に室温で１時間、振盪しながら浸漬した。９５％ＥｔＯＨで３回洗浄した後、チップを減圧下で１３５℃で２時間硬化させた。硬化させたチップは乾燥アルゴン中で数ヶ月間は保存できる^１２。タンパク質をチップに結合させるために、タンパク質溶液をウェルに添加し、氷上で１〜２時間インキュベートした。冷ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ， ｐＨ ７．０）で３回濯いだ後、ウェルをＢＳＡの１％ＰＢＳ溶液（Ｓｉｇｍａ， ＵＳＡ）で氷上で１時間より長くブロッキングした。ＧＰＴＳを使用したので、第１級アミン基を含む試薬は避けた。
【０１２６】
処理したＰＤＭＳに結合できるタンパク質の濃度を決定するために、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抗マウスＩｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ， ＵＳＡ）を酵素の連続希釈液を用いてチップに結合させた。ＰＢＳで十分に洗浄した後、結合した抗体を、増強化学発光（ＥＣＬ）検出法（Ａｍｅｒｓｈａｍ， ＵＳＡ）を用いて検出した。最大８×１０^−９μｇ／μｍ^２のタンパク質が表面に結合でき、本発明者らの免疫染色法による検出には、最低でも８×１０^−１３μｇ／μｍ^２が必要である。
【０１２７】
３．イムノブロッティング、キナーゼアッセイおよびデータの獲得
イムノブロット分析は記載^３４されているようにして実施した。ＧＳＴ：：プロテインキナーゼは、^３３Ｐ−γ−ＡＴＰを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼ活性^１３について試験した。自動リン酸化アッセイでは、ＧＳＴ：：キナーゼは、ＧＰＴＳ処理したＰＤＭＳに直接結合させ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ反応を、適当な緩衝液中の^３３Ｐ−γ−ＡＴＰを用いて行った。基質反応において、基質はＧＰＴＳを介してウェルに結合させ、ウェルはＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄し、１％ＢＳＡでブロッキングした後で、キナーゼ、^３３Ｐ−γ−ＡＴＰおよび緩衝液を添加した。全体の反応容量は、反応当たり０．５μｌ以下に維持した。３０℃で３０分間インキュベートした後、チップを十分に洗浄し、Ｘ線フィルムおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｍａｎｉｃｓ ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（解像度が５０μｍで、定量用である）の双方に暴露した。１２種の基質については、各キナーゼアッセイを少なくとも２度繰り返し、残りの５種については、アッセイは一度行った。
【０１２８】
基質特異性を調べるために、次の式を用いて特異性指数（ＳＩ）を算出した：ＳＩ_ｉｒ＝Ｆ_ｉｒ／［（Ｆ_ｉ１＋Ｆ_ｉ２＋・・・＋Ｆ_ｉｒ）／ｒ］（式中、ｉは用いたキナーゼのＩＤを表わし、ｒは基質のＩＤを表わし、Ｆ_ｉｒはＧＳＴ単独の場合と比較した基質ｒに対するキナーゼｉの増大率（倍）を表わす）。
【０１２９】
４．キナーゼの配列アライメントおよび系統樹
１０７種のプロテインキナーゼのコアキナーゼ触媒ドメインの配列に基づく多重配列アライメントを、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズム^３５により、Ｇｏｎｎｅｔ２５０スコアリング用マトリックス^３６を用いて作製した。キナーゼの触媒ドメインの配列は、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ^３７、ＰＩＲ^３８およびＧｅｎＢａｎｋ^３９のデータベースから入手した。触媒ドメインが判っていないキナーゼ（ＤＢＦ４／ＹＤＲ０５２ＣおよびＳＬＩＮ１／ＹＩＬ１４７Ｃ）では、可能性の高いキナーゼ配列を、ＦＡＳＴＡアルゴリズム^{４０，４１}を用いて設定されたデータにおける他のキナーゼ配列とのアライメントから、ＢＬＯＳＵＭ５０スコアリング用マトリックス^４２を用いて推定した。１１種のコア触媒サブドメイン^４３に対応するタンパク質サブ配列は上記のアライメントから抽出し、ＰＲＯＴＰＡＲＳ^４４プログラムを用いてコンピューターにより系統樹を構築した（図５ａ）。
【０１３０】
５．タンパク質チップのデータの機能的グルーピング
実験データに基づくプロテインキナーゼ同士のおおよその機能的相関関係を可視化するために、キナーゼを、１２種の異なる基質をリン酸化する能力（２０００年８月１７日現在のウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｍｂｂ．ｙａｌｅ．ｅｄｕ／ｇｅｎｏｍｅ／ｙｅａｓｔ／ｃｈｉｐで入手可能なデータ）に基づいて、分類体系的に順序付けした。基質の各々に対する１０７種のプロテインキナーゼの−／＋活性に対応するプロフィールを記録し、［０，１］で打切り値とした。マトリックスは、実験プロフィール間のペアワイズハミング距離から導き、無根系統樹をＦｉｔｃｈ−Ｍａｒｇｏｌｉａｓｈの最小二乗推定法^４５を用いて、ＰＨＹＬＩＰソフトウェアパッケージ^４４のＦＩＴＣＨプログラム^３４で実行されているようにして算出した。それぞれの場合、データセットの体系化における固有のバイアスをなくすために、分類群の入力順序は無作為にし、最適なカテゴリーは、系統樹構造の全体的な再配列により得た。
【０１３１】
Ｃ．結果
１．酵母キナーゼのクローニングおよびタンパク質の精製
組換え特異的クローニング法^９を用いて、高コピー発現ベクター（ｐＥＧ（ＫＧ））（ガラクトース誘導型ＧＡＬ１０プロモーター^１０の制御下でＧＳＴ融合タンパク質を産生するもの）における１２２種の酵母プロテインキナーゼ遺伝子のコード領域全体のクローニングを試みた（図１ａ）。ＧＳＴ：：キナーゼ構築物を大腸菌にレスキューし、各構築物の５’末端における配列を決定した。この方法を用いて、１２２種の酵母キナーゼ遺伝子のうち１１９種がインフレームでクローニングされた。クローニングされなかった３種のキナーゼ遺伝子は非常に大きいものである（４．５〜８．３ｋｂ）。
【０１３２】
ＧＳＴ：：キナーゼ融合タンパク質を酵母内で過剰産生させ、５０ｍｌの培養物からグルタチオンビーズおよび標準的プロトコール^１１を用いて精製した。Ｈｏｇ１の場合、酵母細胞を高塩で処理して、誘導の少なくとも最後の５分間で該酵素を活性化した。残りのキナーゼでは、合成培地（ＵＲＡ⁻／ラフィノース）を用いた。抗ＧＳＴ抗体を用いて１１９種の融合体全てのイムノブロット分析をしたところ、酵母株のうち１０５種が検出可能なＧＳＴ：：融合タンパク質を産生し、多くの場合、その融合体は全長であることが明らかになった。出発培養物１ｍｌ当たり最大１μｇの融合タンパク質が得られた（図１ｂ）。しかし、１１９種のＧＳＴ：：キナーゼサンプルのうち１４種はイムノブロット分析では検出されなかった。おそらく、これらのタンパク質は、使用したｐｅｐ４プロテアーゼ欠損株において安定に過剰産生されていないか、あるいは、これらのタンパク質は本発明者らの方法を用いて精製されない不溶性の凝集物を形成している可能性がある、と考えられる。この方法はうまくいったが、培養物５０ｍｌを用いたＧＳＴ融合タンパク質の精製は時間がかかる方法であり、何千ものサンプルの調製には適用できない。したがって、９６ウェルフォーマットで細胞を増殖させる方法を開発した（「方法」を参照）。この方法を用いて、１１９種のＧＳＴ融合体を調製し、６時間で精製した。出発培養物１ｍｌ当たり、上記の５０ｍｌ法と比較して約２倍高い収率となった。
【０１３３】
２．タンパク質チップの設計
タンパク質チップは、１１９種の酵母プロテインキナーゼのハイスループット生化学アッセイを実施するように開発した（図２）。これらのチップは、使い捨て用シリコーンエラストマーポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）上のウェルのアレイからなる^１１。ウェルのアレイにより、少容量の異なるプローブが１つのチップ上に高密度に充填されるが、その後のバッチ式処理の間は物理的に隔離されたままとすることができる。タンパク質は、リンカー３−グリシドオキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＳ）^１２を用いて共有結合によりウェルに結合させた。最大８×１０^−９μｇ／μｍ^２のタンパク質が表面に結合できる（「方法」を参照）。
【０１３４】
プロテインキナーゼアッセイのために、タンパク質チップ技術を、標準的なサンプル取扱い／記録装置に適合するように設定した。放射性同位体による標識化（^３３Ｐ）を用いて、後述するキナーゼアッセイ、および手作業によるローディング、種々のアレイ構造を試験した。以下のチップは、最良の結果をもたらした：直径１．４ｍｍで深さ３００μｍ（約３００ｎｌ）の丸形ウェルで、ピッチが１．８ｍｍの１０×１４個の矩形のアレイ構造。これらのアレイの１２枚のマスター鋳型を製造し、プロテインキナーゼ分析用に多数のアレイを繰り返し成型した。チップを顕微鏡用スライドガラスの上面に載せ（図２ａ）；このアレイを標準的な顕微鏡用スライドガラスの１／３をわずかに多めに被覆し、典型的にはスライドガラス当たり２つのアレイを使用した（図２ｂ）。タンパク質を各ウェル内に入れるために手作業によるピペット法を用いたが、自動化法も使用可能である。さらに、このタンパク質チップの構造は、他の標識方法（例えばリンタンパク質に対する蛍光標識した抗体によるもの）およびその後の免疫蛍光の検出と共に用いることができる。
【０１３５】
３．タンパク質チップを用いた大規模キナーゼアッセイ
１１９種のＧＴＳ：：キナーゼの全てを、^３３Ｐ−γ−ＡＴＰを用いる１７種の異なるアッセイおよび１７種の異なるチップにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイ^１３について試験した。各チップは、次のような異なる基質を用いてアッセイした：１）自己リン酸化、２）ウシ・ヒストンＨ１（一般的なキナーゼ基質）、３）ウシ・カゼイン（一般的な基質）、４）ミエリン塩基性タンパク質（一般的な基質）、５）Ａｘ１２ Ｃ末端ＧＳＴ（Ａｘ１２は出芽に関与する膜貫通リンタンパク質）^１４、６）Ｒａｄ９（ＤＮＡ損傷チェックポイントに関与するリンタンパク質）^１５、７）Ｇｉｃ２（出芽に関与するリンタンパク質）^１６、８）Ｒａｄ１（染色体対合にとって重要な減数分裂リンタンパク質）^１７、９）Ｍｅｋ１（染色体の対合にとって重要な減数分裂タンパク質キナーゼ）^１８、１０）ポリ（チロシン−グルタミン酸１：４）（ポリ（Ｔｙｒ−Ｇｌｕ）；チロシンキナーゼの基質）^１９、１１）Ｐｔｋ２（小分子輸送タンパク質）^２０、１２）Ｈｓｌ１（細胞周期の調節に関与するプロテインキナーゼ）^２１、１３）Ｓｗｉ６（Ｇ１／Ｓの調節に関与するホスホ転写因子）^２２、１４）Ｔｕｂ４（微小細の核形成に関与するタンパク質）^２３、１５）Ｈｏｇ１（浸透調節に関与するプロテインキナーゼ）^２４、１６）Ｈｏｇ１（該キナーゼの非活性型）、および１７）ＧＳＴ（対照）。自己リン酸化アッセイでは、キナーゼを処理済みのＰＤＭＳウェルに直接結合させ、^３３Ｐ−γ−ＡＴＰを添加した。基質反応では、基質をウェルに結合させ、次にキナーゼおよび^３３Ｐ−γ−ＡＴＰを添加した。反応が完了したら、スライドを洗浄し、リン酸化シグナルを得て、高解像度ホスホイメージャーを用いて定量した。図３に例を示す。キナーゼ活性を同定するために、定量したシグナルを、ＧＳＴ対照に対する増大率（倍）に変換し、更なる分析のためにプロットした（図４ａ）。
【０１３６】
図４ａに示すように、大部分（９３．３％）のキナーゼが、少なくとも１種の基質に対し、バックグラウンドと比較して５倍以上の活性を示した。予想どおり、Ｈｒｒ２５、Ｐｂｓ２およびＭｅｋ１はそれらの既知の基質^{２５−２７}であるＳｗｉ６（ＧＳＴ対照よりも４００倍高い）、Ｈｏｇ１（１０倍高い）およびＲｅｄ１（１０倍高い）をそれぞれをリン酸化した。このアッセイの結果から、ヒスチジンキナーゼ（Ｓｌｎ１、Ｙｉｌ１０４２ｃ）およびリン脂質キナーゼ（例えばＭｅｃ１）を含むこれまで研究されていなかった２４種の推定プロテインキナーゼのうち１８種が、幾つかの一般的でないキナーゼ^８と同様に、１種以上の基質をリン酸化することが実証された。
【０１３７】
基質特異性を調べるために、特定のキナーゼの活性を、全ての基質に対するその活性の平均に対して更に標準化した。いくつかの例を図４ｂに示す。全てのデータは、で入手可能である。３２種のキナーゼが特定の基質に対して基質特異性を示し、その際の特異性指数（ＳＩ：「方法」を参照）は２以上であり、同様に、大部分の基質は、特定のプロテインキナーゼまたは一連のプロテインキナーゼによって優先的にリン酸化される。例えば、Ａｘ１２（酵母細胞の出芽に関与するタンパク質）のＣ末端は、他のタンパク質よりもＤｂｆ２０、Ｋｉｎ２、Ｙａｋ１およびＳｔｅ２０によって優先的にリン酸化される。興味深いことに、従来の研究では、Ｓｔｅ２０はＡｘ１２と同様に出芽途中にある芽の先端に存在することが判っており、ｓｔｅ２０Δ／ｃｌａ４^ｔｓ突然変異体は、出芽もできず、十分に分極化されたアクチンのパッチもしくはケーブルを形成することもできない^２８。もう１つの例は、リンタンパク質であるＧｉｃ２（これも出芽に関与する）^１６である。Ｓｔｅ２０およびＳｋｍ１はＧｉｃ２を強くリン酸化する（図４ｂ）。従来の研究から、Ｃｄｃ４２がＧｉｃ２、Ｃｌａ４^２９、Ｓｔｅ２０およびＳｋｍ１と相互作用することが示唆された。本発明者らの結果から、Ｃｄｃ４２がＳｔｅ２０および／またはＳｋｍ１をリクルートすることによってＧｉｃ２のリン酸化を促進するように機能する可能性が出てきた。
【０１３８】
４．酵母は多くの二重特異性キナーゼを含む
特に関心が持たれるのは、二重特異性キナーゼ、すなわち、Ｓｅｒ／Ｔｈｒおよびチロシンの双方をリン酸化する酵素である。配列分析に基づくと、２種を除く全ての酵母プロテインキナーゼがプロテインキナーゼのＳｅｒ／Ｔｈｒファミリーに属する。しかし、本研究の時点で、７種のプロテインキナーゼ（Ｍｐｓ１、Ｒａｄ５３、Ｓｗｅ１、Ｉｍｅ２、Ｓｔｅ７、Ｈｒｒ２５およびＭｃｋ１）は二重特異性キナーゼであることが報告された^１９。本発明者らは、Ｓｗｅ１、Ｍｐｓ１、Ｉｍｅ２およびＨｒｒ２５がポリ（Ｔｙｒ−Ｇｌｕ）を容易にリン酸化することを確認したが、Ｓｔｅ７、Ｒａｄ５３またはＭｃｋ１についてはチロシンキナーゼ活性は検出されなかった。Ｍｃｋ１は本発明者らのアッセイのいずれにおいても強い活性を示さなかった。しかし、Ｓｔｅ７およびＲａｄ５３は他のアッセイでは非常に活性である。したがって、それらがポリ（Ｔｙｒ−Ｇｌｕ）をリン酸化できないことから、それらが全般的に非常に弱いチロシンキナーゼであるか、あるいは少なくともポリ（Ｔｙｒ−Ｇｌｕ）基質には弱いことが示される。後者の可能性と一致して、他の研究者らは、ポリ（Ｔｙｒ−Ｇｌｕ）がＲａｄ５３にとって非常に不十分な基質であること見い出した（参考文献１９；Ｄ． Ｓｔｅｒｎ， ｐｅｒｓ． ｃｏｍｍ．）。興味深いことに、本発明者らは、２３種の他のキナーゼもまた、ポリ（Ｔｙｒ−Ｇｌｕ）を基質として効率的に使用することを見い出し、このことは、酵母にはｉｎ ｖｉｔｒｏで二重特異性キナーゼとして作用できる少なくとも２７種のキナーゼが存在することを示している。それらのうちの１種であるＲｉｍ１は、近年、そのｉｎ ｖｉｖｏ基質のＴｙｒ残基をリン酸化することが示され、Ｉｍｅ２については、それが真の二重特異性キナーゼであることが示された^３０。つまり、この実験では、二重特異性キナーゼとして作用できるキナーゼの数がほぼ３倍になり、そのようなキナーゼとして分類されたものの中には問題があることも提示された。
【０１３９】
５．ポリ（ Ｔｙｒ−Ｇｌｕ ）キナーゼの機能特異性とアミノ酸配列との相互関係
酵母プロテインキナーゼの大規模分析により、プロテインキナーゼ同士の機能的な関係の比較が可能になる。本発明者らは、ポリ（Ｔｙｒ−Ｇｌｕ）をリン酸化するキナーゼの多くがそれらのアミノ酸配列において互いに関連があることを見い出した。ポリ（Ｔｙｒ−Ｇｌｕ）キナーゼの７０％が、樹状図（キナーゼはそれらの保存されたプロテインキナーゼドメインの配列類似性に基づいて互いに系統付けられている）の異なる４つのグループに分けられる（図５ａ）。アミノ酸配列を更に調べたところ、基質としてポリ（Ｔｙｒ−Ｇｌｕ）を使用しないキナーゼと比較してポリ（Ｔｙｒ−Ｇｌｕ）クラスのキナーゼの方に専ら見い出される４種のアミノ酸が明らかになる（３つはリシンで１つはメチオニン）。１つの残基（アスパラギン）は主に基質としてポリ（Ｔｙｒ−Ｇｌｕ）を容易に使用しないキナーゼに存在した（図５ｂ）。残基の大部分は分子の触媒位置の近傍に存在し（図５ｂ）^３１、それらが基質の認識においてある役割を担っていることを示唆している。
【０１４０】
Ｄ．考察
１．プロテインキナーゼの大規模分析
この研究は、新規なタンパク質チップ技術を用いて、１７種の異なる基質に対する１１９種のキナーゼの活性を特性決定した。特定のタンパク質が特定のプロテインキナーゼにとって好ましい基質であり、逆に特定のプロテインキナーゼが特定のタンパク質にとって好ましく、多くのプロテインキナーゼが特定の基質にとって好ましいことが判った。これらの研究の１つの懸念は、目的とする酵素以外のキナーゼが調製物中に混入している可能性があることである。これは厳密には除外することはできないが、本発明者らのサンプルのうち５種のクーマシー染色および抗ＧＳＴを用いたイムノブロット染色による分析では、ＧＳＴ融合体ではない本発明者らのサンプル中に検出可能なバンドは見られない（「方法」を参照）。
【０１４１】
ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける特定のキナーゼの基質がｉｎ ｖｉｖｏで同じキナーゼによってリン酸化されることを保証しないいことに注目することが重要である。その代わり、これらの実験から、特定のタンパク質が特定のキナーゼの基質となり得、そのため、更なる分析が可能になることが示される。これに関して、これらのアッセイは、候補の相互作用を検出するツーハイブリッド研究と類似している。このプロセスが通常ｉｎ ｖｉｖｏでも起こるのか否かを判定するためには、更なる実験が必要である。
【０１４２】
基質の多くがｉｎ ｖｉｖｏでの真の基質である可能性がある、という考え方と一致しているのは、本発明者らのアッセイにおいて、３種のキナーゼ（Ｈｒｒ２５、Ｐｂｓ２およびＭｅｋ１）がそれらの既知の基質をリン酸化するという知見である。更に、キナーゼの多く（例えばＳｔｅ２０）がそれらのｉｎ ｖｉｔｒｏでの基質（例えばＡｘ１２）と共に局在している。したがって、本発明者らのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて基質をリン酸化するキナーゼの多くがおそらくｉｎ ｖｉｖｏでもそのようにリン酸化するであろうことが予想される。
【０１４３】
本発明者らのアッセイでは上記キナーゼの大部分が活性であったが、幾つかは活性ではなかった。おそらく、これらの後者のキナーゼの本発明者らの調製物は、十分な量のアクチベーターがなかったか、あるいは活性化条件下で精製されなかったと考えられる。例えば、Ｃｄｃ２８は、本発明者らのアッセイでは活性ではなく、その活性化サイクリンを欠いていたと思われる。Ｈｏｇ１の場合、細胞は高塩で処理してその酵素を活性化した。本発明者らのキナーゼ調製物のほぼ全部が活性を示さなかったので、それらの調製物中の酵素の少なくとも幾つかが適切に活性化されていたか、かつ／または必須の補因子を含んでいたと予測される。これらの酵素がそれらの本来の生物において過剰発現されることが、活性な酵素を得ることに大成功するのに大きく関与していると考えられる。
【０１４４】
タンパク質チップ上でのアッセイを用いて、ポリ（Ｔｙｒ−Ｇｌｕ）を利用する多くのキナーゼが同定された。多くのキナーゼの大規模分析により、ポリ（Ｔｙｒ−Ｇｌｕ）キナーゼの機能特異性と特定のアミノ酸配列とを互いに関連付ける新規なアプローチが可能になる。ポリ（Ｔｙｒ−Ｇｌｕ）をリン酸化するキナーゼの残基の多くが塩基性残基を含む。これが予期できるのは、キナーゼ残基とＧｌｕ残基との間に静電的相互作用がある場合である。しかし、幾つかの他の残基の役割、例えば、ポリ（Ｔｙｒ−Ｇｌｕ）をリン酸化するキナーゼに対するＭｅｔ残基の役割や、ポリ（Ｔｙｒ−Ｇｌｕ）をリン酸化そないキナーゼに対するＡｓｎの役割などは明らかではない。これらのキナーゼの残基は、それ以外の機構によって基質特異性を付与するのかもしれない。それでも、他の基質の分析は、全てのプロテインキナーゼについての機能特異性とキナーゼ配列との更なる相関関係を可能にするはずである。
【０１４５】
２．タンパク質チップ技術
多数のサンプルの迅速な分析に加えて、本明細書に記載されているタンパク質チップ技術は、慣用の方法と比較して重要な利点を有する。１）チップによるアッセイは、高いシグナル−ノイズ比を有する。本発明者らは、このタンパク質チップを用いて示されるシグナル−ノイズ比が、従来のマイクロタイターディッシュアッセイで見られるもの（データは示さず）よりもずっと良好である（１０倍以上）ことを見い出した。おそらく、これは、^３３Ｐ−γ−ＡＴＰがマイクロタイターディッシュほどにはＰＤＭＳを結合しない、という事実によるものと考えられる。２）必要とされる物質の量が非常に少なくて済む。反応物の容量は、３８４ウェルマイクロタイターディッシュで用いられる量の１／２０〜１／４０である。各反応において、２０ｎｇ未満のプロテインキナーゼが使用された。３）タンパク質チップを用いる酵素アッセイは感度が非常に高い。イムノブロット分析ではたった１０５種の融合体だけが検出可能であったが、１１２種が、少なくとも１種の基質について、バックグラウンドと比較して５倍を上回る酵素活性を示した。例えば、Ｍｐｓ１は、イムノブロット分析ではこの融合タンパク質を検出することはできなかったが、キナーゼアッセイの多くでは一貫して最大の活性を示す（図１ｂおよび３ａを参照）。４）最後に、このチップは安価である。各アレイにつき、材料の費用は８セント未満である。微細加工された鋳型もまた、製造が容易で、かつ安価である。
【０１４６】
プロテインキナーゼの分析に加え、このタンパク質チップ技術は、ＡＴＰおよびＧＴＰの結合アッセイ、ヌクレアーゼアッセイ、ヘリカーゼアッセイ、タンパク質−タンパク質相互作用アッセイなどの多種多様な他のアッセイにも適用できる。近年、別の研究において、Ｐｈｉｚｉｃｋｙとその共同研究者達は、ずっと弱いＣＵＰ１プロモーター下で酵母タンパク質をＧＳＴ融合体として発現させた^６。それらのクローンの質は立証されていないが、それらは、この融合タンパク質を含む酵母株のプールを用いて生化学的活性を同定できた。本発明者らのタンパク質チップアプローチの利点は、全てのサンプルが１回の実験で分析できることである。更に、この研究では、サンプルを隔離するという利点を持つウェルを使用したが、別のアッセイには平坦なＰＤＭＳチップおよびスライドガラスも使用できる。これらには、標準的なピニングツール（ｐｉｎｎｉｎｇ ｔｏｏｌ）マイクロアレイと共に使用できる、という利点がある。この技術はまた、目的の遺伝子産物の酵素活性を抑制もしくは活性化する化合物をスクリーニングできるハイスループットな薬剤スクリーニングを容易にするのにも適用できる。これらのアッセイは、タンパク質レベルで行うことができるので、結果はより直接的であり、タンパク質の分子機能に大きな意味を持つ。
【０１４７】
一般に利用可能なサンプル処理・記録装置を用いた特定のプロテインキナーゼアッセイのためのタンパク質チップ技術を構成した。この目的のために、アレイの大きさは、微細加工したシリコーンエラストマー構造体と共に容易に利用可能な大きさと比較して相対的に大きなままとした^３２。本発明者らはマイクロリソグラフィーにより製造した鋳型を用いて、本明細書において報告したものよりも特徴サイズが２桁小さいＰＤＭＳ構造体を成型したが、その他の研究者達は、微細加工された構造体においてミクロン以下の特徴サイズを報告している^３３。これらの結果から、微細加工されたタンパク質チップのウェル密度は、数桁分も容易に増大させることができることが示される。本明細書において報告されているタンパク質チップ技術は拡大縮小が容易に可能である。
【０１４８】
結論として、タンパク質の生化学的活性のハイスループットスクリーニングのための、安価で使い捨てのタンパク質チップ技術が開発された。有用性は、１７種の各種の基質のリン酸化についてアッセイされたサッカロミセス・セレビシエ由来の１１９種のキナーゼの分析により実証された。これらのタンパク質チップは、何百ものタンパク質サンプルの同時測定を可能にする。このチップ技術に基づく微細加工されたウェルのアレイの使用により、ウェルの密度を数桁分だけ容易に高くすることができる。適切なサンプル処理・測定技術を開発すれば、これらのタンパク質チップは、数千〜数百万ものサンプルの同時アッセイに適用できる。
【０１４９】
Ｅ．参考文献
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３６． Ｇｏｎｎｅｔ， Ｇ．Ｈ．， Ｃｏｈｅｎ， Ｍ．Ａ．，およびＢｅｎｎｅｒ， Ｓ．Ａ． Ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ ｍａｔｃｈｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｔｉｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅ（全タンパク質配列データベースの網羅的マッチング）． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２５６， １４４３−１４４５ （１９９２）．
３７． Ｂａｉｒｏｃｈ， Ａ． ＆ Ａｐｗｅｉｌｅｒ， Ｒ． Ｔｈｅ ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａ ｂａｎｋ ａｎｄ ｉｔｓ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ＴｒＭＥＢＬ（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データバンクおよびその補足ＴｒＭＥＢＬ）． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２７， ４９−５４ （１９９９）．
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４２． Ｄａｙｈｏｆｆ， Ｍ．Ｏ．， Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｒ．Ｍ．，およびＯｒｃｕｔｔ， Ｂ．Ｃ． Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ（タンパク質の進化上の変化のモデル）． Ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｒｕｃｔｕｒｅ， Ｍ．Ｏ． Ｄａｙｈｏｆｆ， 編． Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．： Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， ｐｐ． ３４５−３５２ （１９７８）．
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ＶＩＩ．実施例 ＩＩ ：タンパク質チップを用いた酵母プロテインキナーゼ活性の分析Ａ．緒言
以下の実施例では、プロテインキナーゼ活性をアッセイするための本発明のタンパク質チップを用いた異なる方法を提供する３つのプロトコールを示すが、それらはそれらは単に説明のためにすぎない。
【０１５０】
１．プロテインキナーゼ活性のアッセイ方法
ｉ．自己リン酸化活性
（１）タンパク質チップを、１００％ＥｔＯＨで室温で３回洗浄した。次に、そのチップを、リンカーＧＰＴＳ（９５％ＥｔＯＨ中の１％溶液）で室温で１時間振盪してコーティングした。１００％ＥｔＯＨで３回洗浄した後、チップを減圧下で１３０℃で１．５時間乾燥した。
【０１５１】
（２）ＧＳＴ：：酵母プロテインキナーゼ（ウェル当たり１種のキナーゼ）を、少なくとも１時間インキュベートすることによりタンパク質チップのウェルに結合させた。チップを更に１％ＢＳＡでブロッキングした。
【０１５２】
（３）キナーゼ緩衝液および^３３Ｐ−γ−ＡＴＰプローブを各ウェルに加え、３０℃で３０分間インキュベートした。リン酸化反応が完了した後、チップを十分に洗浄した。
【０１５３】
（４）特異的な^３３Ｐ−γ−ＡＴＰシグナル（自己リン酸化を示す）を検出し、ホスホイメージャーで定量した。
【０１５４】
ｉｉ．キナーゼ活性−プロトコールＩ
（１）タンパク質チップを、１００％ＥｔＯＨで室温で３回洗浄した。次に、そのチップを、リンカーＧＰＴＳ（９５％ＥｔＯＨ中の１％溶液）で室温で１時間振盪してコーティングした。１００％ＥｔＯＨで３回洗浄した後、チップを減圧下で１３０℃で１．５時間乾燥した。
【０１５５】
（２）基質（例えばＧＳＴ：：酵母タンパク質）を、１時間以上インキュベートすることによりチップに結合させた。チップを更に１％ＢＳＡでブロッキングし、チップを洗浄した。
【０１５６】
（３）異なるプロテインキナーゼを、タンパク質チップの各ウェルに、キナーゼ緩衝液および^３３Ｐ−γ−ＡＴＰと共に加え、３０℃で３０分間インキュベートした。リン酸化反応が完了した後、チップを十分に洗浄した。
【０１５７】
（４）特異的な^３３Ｐ−γ−ＡＴＰシグナル（プロテインキナーゼプローブによる基質タンパク質のリン酸化を表わす）を検出し、ホスホイメージャーで定量した。
【０１５８】
ｉｉｉ．キナーゼ活性−プロトコール ＩＩ
（１）タンパク質チップを、１００％ＥｔＯＨで室温で３回洗浄した。次に、そのチップを、リンカーＧＰＴＳ（９５％ＥｔＯＨ中の１％溶液）で室温で１時間振盪してコーティングした。１００％ＥｔＯＨで３回洗浄した後、チップを減圧下で１３０℃で１．５時間乾燥した。
【０１５９】
（２）基質（例えばＧＳＴ：：酵母タンパク質）を、１時間以上インキュベートすることによりチップに結合させた。チップを更に１％ＢＳＡでブロッキングし、チップを洗浄した。
【０１６０】
（３）異なるプロテインキナーゼを、タンパク質チップの各ウェルに、キナーゼ緩衝液および^３３Ｐ−γ−ＡＴＰと共に加え、３０℃で３０分間インキュベートした。リン酸化反応が完了した後、チップを十分に洗浄した。チップをヨードアセチル−ＬＣ−ビオチンと共に、暗所にて室温で一夜インキュベートした。
【０１６１】
（４）洗浄した後、チップを蛍光標識アビジンでプロービングして、リン酸化シグナルを検出した。
【０１６２】
（５）次に、チップを、Ａｘｏｎ Ｇｅｎｅｐｉｘ ４０００Ａスキャナー（約３００〜４００ミクロンに焦点深度を増大させたレンズに変更した）でスキャンした。この変更により、スライド（例えば本発明のＰＤＭＳマイクロアレイ）上に載っている表面のスキャンが可能になる（あるいは、焦点面から外れていてもよい）。変更を加えたＡｘｏｎ Ｇｅｎｅｐｉｘ ４０００Ａスキャナーを用いて、アレイをスキャンして、蛍光シグナルを得て定量した。
【０１６３】
ＶＩＩＩ．実施例 ＩＩＩ ：タンパク質チップを用いたタンパク質−タンパク質相互作用の分析
目的のタンパク質（「プローブタンパク質」）を、標準的なプロトコールを用いて、標識した融合タンパク質として大腸菌から組換え発現させて精製する。標的タンパク質を各ウェルが異なる標的タンパク質を含むようにチップのウェルに結合させる。精製したプローブタンパク質をチップの各ウェルに導入し、数時間以上インキュベートする。チップを洗浄し、ａ）プローブタンパク質に対する抗体またはｂ）融合タンパク質の標識に対する抗体のいずれかでプロービングする。抗体は、Ｃｙ３またはＣｙ５などの蛍光標識で標識するか、あるいは、第１の抗体を検出する蛍光標識した二次抗体を用いて検出する。
【０１６４】
次の実施例は、単に説明のためにすぎないが、本発明のタンパク質チップを用いてプロテアーゼ、ヌクレアーゼまたはＧタンパク質受容体についてアッセイする方法を提供する。タンパク質−タンパク質相互作用は、通常、以下の方法または同様の方法を用いてアッセイできる。
【０１６５】
Ａ．プロテアーゼ活性の分析
プロテアーゼ活性は、次のようにしてアッセイする。まず、種々のアミノ酸の組合せからなり、Ｃ末端またはＮ末端に質量分析用標識を結合させてあるタンパク質プローブを調製する。この際の唯一の条件は、標識の分子量を、タンパク質の全ての標識された分解産物が検出できるように十分に大きなものにしなくてはならないことである。タンパク質プローブを、タンパク質チップに結合させたプロテアーゼと３７℃で接触させる。３７℃で適当な時間にわたりインキュベートし、アセトニトリルおよびフルオロ酢酸で洗浄した後、タンパク質分解性生成物を質量分析により検出することによってプロテアーゼ活性を測定する。このアッセイにより、タンパク質溶解活性とタンパク質チップに結合したプロテアーゼの特異性の双方に関する情報が得られる。
【０１６６】
プロテアーゼ活性分析のためのもう１つの迅速なアッセイは、既知配列のタンパク質をチップに結合させることである。基質タンパク質は、チップに結合されていない方の末端で蛍光標識する。目的のプロテアーゼと共にインキュベートすると、タンパク質分解により蛍光標識が喪失して、蛍光の低下がプロテアーゼ活性の存在および程度を示すようになっている。タンパク質基質がチップのウェルに入っているビーズに結合されている同じタイプのアッセイも行うことができる。
【０１６７】
Ｂ．ヌクレアーゼ活性の分析
ヌクレアーゼ活性は、タンパク質プローブ／基質を核酸プローブ／基質で置き換える以外は上記でプロテアーゼ活性について記載されているのと同様にして評価される。そのようにして、ヌクレアーゼ活性により放出される蛍光タグ付け核酸断片が蛍光により検出できるか、あるいは、その核酸断片は質量分析により直接検出できる。
【０１６８】
Ｃ．Ｇタンパク質を結合させた受容体の分析
もう１つのタイプのアッセイにおいて、Ｇタンパク質結合受容体を結合する化合物が同定される。最初に、Ｇタンパク質受容体をＧＳＴ融合タンパク質としてクローニングし、その際、ＧＳＴタンパク質は、Ｇタンパク質のＣ末端に結合される。何故ならば、そのＣ末端は一般に、プローブ特性の決定には関与しないからである。Ｇタンパク質：：ＧＳＴ融合タンパク質をウェルに、好ましくはグルタチオンと結合させることにより結合させる。次に、Ｇタンパク質受容体をコンビナトリアル化学ライブラリーまたはペプチドライブラリーのような化合物の混合物と共にインキュベートする。洗浄した後、結合したプローブを（例えば２５％アセトニトリル／０．０５％トリクロロ酢酸の添加により）溶出させる。次に、溶出した物質をＭＡＬＤＩ質量分析計にローディングし、結合したプローブの性質を同定する。
【０１６９】
ＩＸ．実施例 ＩＶ ：タンパク質チップを用いた特異的インヒビターによるプロテインキナーゼ抑制の分析
以下の説明は、単に例示の目的にすぎないが、プロテインキナーゼをプロテインキナーゼインヒビターに対する感度について調べるための本発明のタンパク質チップの使用方法を提供する。タンパク質−タンパク質相互作用は通常、以下の方法または類似の方法によりアッセイできる。
【０１７０】
基質を、タンパク質チップ上のＧＰＴＳ処理マイクロウェルの表面に室温で１時間結合させ、次に１％ＢＳＡおよび１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）でブロッキングし、ＴＢＳ緩衝液で３回洗浄した。キナーゼおよび各種濃度のキナーゼインヒビターを、^３３Ｐ−γ−ＡＴＰの存在下でマイクロウェルに加えた。リン酸化反応を３０℃で３０分間行った。反応が完了した後、タンパク質チップを室温でＴＢＳ緩衝液で十分に洗浄し、次に乾燥させた。タンパク質チップをＸ線フィルムまたはホスホイメージャーに暴露することにより、リン酸化シグナルを得た。
【０１７１】
ヒト・プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、ヒト・ｍａｐキナーゼ（ＭＡＰＫ）、３種の酵母ＰＫＡ相同体（ＴＰＫ１、ＴＰＫ２およびＴＰＫ３）、ならびに２種の他の酵母プロテインキナーゼ（ＨＳＬ１およびＲＣＫ１）を、２種の基質（すなわちＰＫＡのタンパク質基質および一般に用いられるキナーゼ基質であるＭＢＰ）について、各種濃度のＰＫＩα（特異的なヒトＰＫＡインヒビター）またはＳＢ２０２１９０（ＭＡＰＫインヒビター）を用いて試験した。図７に示すように、ＰＫＩαは、両者のペプチドおよびＭＢＰ基質に対するＰＫＡ活性を特異的に抑制した。しかし、ＰＫＩαは試験した３種の酵母ＰＫＡ相同体（ＴＰＫ１、ＴＰＫ２、ＴＰＫ３）も他の２種の酵母プロテインキナーゼ（ＨＳＬ１およびＲＣＫ１）も抑制しなかった。更に、ＳＢ２０２１９０はＰＫＡ活性を抑制しなかった。
【０１７２】
Ｘ．実施例Ｖ：ガラス表面でのキナーゼアッセイ
１．スライドガラス（Ｆｉｓｈｅｒ， ＵＳＡ）を２８〜３０％の水酸化アンモニウムに室温（「ＲＴ」）で一夜、振盪しながら浸漬した。
【０１７３】
２．そのスライドを超純水で４回、それぞれ５分間すすぎ、次に大容量の１００％エタノール（「ＥｔＯＨ」）で濯いで、水を完全に除去した。次に、スライドを９５％エタノールで３回濯いだ。
【０１７４】
３．スライドを１％ ３−グリシドオキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＳＴ）溶液（９５％ ＥｔＯＨ中）、１６ｍＭ酢酸（「ＨＯＡｃ」）に、振盪しながら室温で１時間浸漬した。スライドを９５％エタノールで室温で３回濯いだ。
【０１７５】
４．スライドを１３５℃で２時間、減圧下で硬化させた。冷却した後、スライドは、使用するまで、アルゴン中で数ヶ月間保存した。
【０１７６】
５．約１０μｌの各タンパク質基質（４０％グリセロール中）を、氷上の９６ウェルＰＣＲプレートに並べた。手動式のスポッティング装置（Ｖ＆Ｐ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＵＳＡ）を用いて、約３ｎｌの各サンプルをＧＰＴＳ処理スライドガラスにスポットした。１つの実施形態では、７６８のサンプルを１つのスライドに室温でスポットする。スライドを、覆いがかかっている清潔なチャンバー内で室温で１時間インキュベートした。
【０１７７】
６．スライドを１０ｍｌのブロック用緩衝液（１００ｍＭ グリシン、１００ｎＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８．０、５０ｎＭ ＮａＣｌ）で室温で１時間ブロックした。スライドをＴＢＳ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で３回洗浄し、１５００ｒｐｍで５分間遠心乾燥した。
【０１７８】
７．スライド上の基質表面を、ＨｙｂｒｉＷｅｌｌ Ｓｅａｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ，ドイツ）で被覆し、プロテインキナーゼおよび標識試薬としての^３３Ｐ−γ−ＡＴＰを含有する４０μｌのキナーゼ混合物を氷上の基質に添加した。
【０１７９】
８．反応物を、加湿チャンバー内で３０℃で３０分間インキュベートした。スライドからシールを剥がし、スライドを大容量の５０ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ緩衝液に浸漬した。スライドを、同じ緩衝液で更にで３回×１５分間、室温で洗浄した。次に、洗浄したスライドをキムワイプで乾燥した。
【０１８０】
９．シグナルを得るために、スライドをホスホイメージャースクリーンに暴露し、データをＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを用いて解析した。
【０１８１】
ＸＩ．引用した参考文献
本明細書中で引用した全ての参考文献は、それぞれ個々の刊行物、特許または特許出願があらゆる目的で参照によりその全体が組み入れられる、と具体的かつ個々に示されているのと同程度に、あらゆる目的で参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。
【０１８２】
当業者であれば理解するように、本発明の多くの改変および種々の変法が、その精神および範囲から逸脱することなしに可能である。本明細書に記載されている特定の実施形態は単なる例にすぎず、本発明は、添付の請求の範囲ならびにそのような請求の範囲が権利を有する等価物の全範囲によってのみ限定されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａは、組換え法を用いて、１１９種の酵母プロテインキナーゼを、ガラクトース誘導型ＧＡＬ１０プロモーターの制御下でＧＳＴ融合タンパク質を産生する高コピーＵＲＡ３発現ベクター（ｐＥＧＫＧ）にクローニングすることを説明する概略図であり、
図１Ｂは、記載されているようにして精製したＧＳＴ：：キナーゼ融合タンパク質のイムノブロットを示す。
【図２】
図２Ａは、キナーゼの研究に用いたタンパク質チップの製造の概略的な説明図であり、図２Ｂは、タンパク質チップの拡大図である。
【図３】
タンパク質チップおよびキナーゼアッセイの結果を示す図である。
【図４】
図４Ａは、プロテインキナーゼ反応の定量分析の結果を示すグラフであり、図４Ｂは、基質特異性を調べるために算出された特異性指数（ＳＩ）を示すグラフである。
【図５】
図５Ａは、キナーゼのコアドメインの多重配列アライメントから誘導された系統樹であり、図５Ｂは、ウサギ筋肉のホスホリラーゼキナーゼ（ＰＨＫ）２８の構造の概略図である。
【図６】
図６は、タンパク質チップの製造プロセスにおけるリソグラフィー工程の断面図である。
【図７】
図７は、タンパク質チップ上でのキナーゼ／インヒビターアッセイの結果を示す図である。

Claims (105)

1. タンパク質、該タンパク質の機能性ドメインを含む分子、細胞全体、およびタンパク質含有細胞性物質からなる群から選ばれる複数種の異なる物質を固相支持体上に含んでなり、かつ、各々の異なる物質が固相支持体上の異なる位置に存在する位置アドレス可能なアレイであって、複数種の異なる物質が１ｃｍ^２当たり少なくとも１００種の異なる物質から構成される、上記アレイ。
2. 複数種の異なる物質が、１ｃｍ^２当たり１００〜１，０００種の異なる物質から構成される、請求項１に記載のアレイ。
3. 複数種の異なる物質が、１ｃｍ^２当たり１，０００〜１０，０００種の異なる物質から構成される、請求項１に記載のアレイ。
4. 複数種の異なる物質が、１ｃｍ^２当たり１０，０００〜１００，０００種の異なる物質から構成される、請求項１に記載のアレイ。
5. 複数種の異なる物質が、１ｃｍ^２当たり１００，０００〜１，０００，０００種の異なる物質から構成される、請求項１に記載のアレイ。
6. 複数種の異なる物質が、１ｃｍ^２当たり１，０００，０００〜１０，０００，０００種の異なる物質から構成される、請求項１に記載のアレイ。
7. 複数種の異なる物質が、１ｃｍ^２当たり１０，０００，０００〜２５，０００，０００種の異なる物質から構成される、請求項１に記載のアレイ。
8. 複数種の異なる物質が、１ｃｍ^２当たり少なくとも２５，０００，０００種の異なる物質から構成される、請求項１に記載のアレイ。
9. 複数種の異なる物質が、１ｃｍ^２当たり少なくとも１０，０００，０００，０００種の異なる物質から構成される、請求項１に記載のアレイ。
10. 複数種の異なる物質が、１ｃｍ^２当たり少なくとも１０，０００，０００，０００，０００種の異なる物質から構成される、請求項１に記載のアレイ。
11. 固相支持体がスライドガラスである、請求項１に記載のアレイ。
12. 各々の異なる物質が、固相支持体の表面の異なるウェル内に存在する、請求項１に記載のアレイ。
13. 異なるウェル内の各々の異なる物質が、固相支持体の表面に結合されている、請求項１２に記載のアレイ。
14. 異なるウェル内の各々の異なる物質が、固相支持体の表面に結合されていない、請求項１２に記載のアレイ。
15. 異なるウェル内の各々の異なる物質が、溶液の状態である、請求項１２に記載のアレイ。
16. 各ウェルが、タンパク質または分子の生物学的活性をアッセイするための試薬を含む、請求項１２に記載のアレイ。
17. 複数種の異なるタンパク質または該タンパク質の機能性ドメインを含む分子を固相支持体上に含んでなり、かつ、各々の異なるタンパク質または分子が固相支持体上の異なる位置に存在する位置アドレス可能なアレイであって、複数種のタンパク質または分子が、生物のゲノム中の同タイプの生物学的活性を有する全ての発現タンパク質の少なくとも５０％から構成される、上記アレイ。
18. 複数種のタンパク質または分子が、生物のゲノム中の同タイプの生物学的活性を有する全ての発現タンパク質の少なくとも７５％から構成される、請求項１７に記載のアレイ。
19. 複数種のタンパク質または分子が、生物のゲノム中の同タイプの生物学的活性を有する全ての発現タンパク質の少なくとも９０％から構成される、請求項１７に記載のアレイ。
20. 生物が細菌、酵母、昆虫および哺乳動物からなる群から選ばれる、請求項１７に記載のアレイ。
21. 目的の生物学的活性を有する発現タンパク質が、キナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、アセチラーゼ、他の官能基転移酵素、核酸結合タンパク質、ホルモン結合タンパク質、およびＤＮＡ結合タンパク質からなる群から選ばれる、請求項１７に記載のアレイ。
22. タンパク質、該タンパク質の機能性ドメインを含む分子、細胞全体、およびタンパク質含有細胞性物質からなる群から選ばれる複数種の異なる物質を固相支持体上に含んでなり、かつ、各々の異なる物質が固相支持体上の異なる位置に存在する位置アドレス可能なアレイであって、固相支持体が、セラミック、非晶質炭化ケイ素、不定形酸化物、ポリイミド、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレンおよびシリコーンエラストマーからなる群から選ばれる、上記アレイ。
23. 固相支持体がシリコーンエラストマーである、請求項２２に記載のアレイ。
24. 固相支持体がポリジメチルシロキサンである、請求項２３に記載のアレイ。
25. タンパク質、該タンパク質の機能性ドメインを含む分子、細胞全体、およびタンパク質含有細胞性物質からなる群から選ばれる複数種の異なる物質を固相支持体上に含んでなり、かつ、各々の異なる物質が固相支持体上の異なる位置に存在する位置アドレス可能なアレイであって、複数種の異なる物質が、固相支持体に３−グリシドオキシプロピルトリメトキシシランリンカーを介して結合されている、上記アレイ。
26. 固相支持体の表面に複数のウェルを備えたアレイであって、ウェルの密度が少なくとも１００ウェル／ｃｍ^２である上記アレイ。
27. ウェルの密度が１００〜１，０００ウェル／ｃｍ^２である、請求項２６に記載のアレイ。
28. ウェルの密度が１，０００〜１０，０００ウェル／ｃｍ^２である、請求項２６に記載のアレイ。
29. ウェルの密度が１０，０００〜１００，０００ウェル／ｃｍ^２である、請求項２６に記載のアレイ。
30. ウェルの密度が１００，０００〜１，０００，０００ウェル／ｃｍ^２である、請求項２６に記載のアレイ。
31. ウェルの密度が１，０００，０００〜１０，０００，０００ウェル／ｃｍ^２である、請求項２６に記載のアレイ。
32. ウェルの密度が１０，０００，０００〜２５，０００，０００ウェル／ｃｍ^２である、請求項２６に記載のアレイ。
33. ウェルの密度が少なくとも２５，０００，０００ウェル／ｃｍ^２である、請求項２６に記載のアレイ。
34. ウェルの密度が少なくとも１０，０００，０００，０００ウェル／ｃｍ^２である、請求項２６に記載のアレイ。
35. ウェルの密度が少なくとも１０，０００，０００，０００，０００ウェル／ｃｍ^２である、請求項２６に記載のアレイ。
36. タンパク質、該タンパク質の機能性ドメインを含む分子、細胞全体、およびタンパク質含有細胞性物質からなる群から選ばれる複数種の異なる物質がウェル内に存在し、かつ、各々の異なる物質が異なるウェル内に存在する、請求項２６に記載のアレイ。
37. 異なるウェル内の各々の異なる物質が固相支持体の表面に結合されている、請求項３６に記載のアレイ。
38. 異なるウェル内の各々の異なる物質が、共有結合により固相支持体の表面に結合されている、請求項３７に記載のアレイ。
39. 異なるウェル内の各々の異なる物質が、リンカーを介して共有結合により固相支持体の表面に結合されている、請求項３８に記載のアレイ。
40. リンカーが３−グリシドオキシプロピルトリメトキシシランである、請求項３９に記載のアレイ。
41. 異なるウェル内の各々の異なる物質が、非共有結合により固相支持体の表面に結合されている、請求項３６に記載のアレイ。
42. 異なるウェル内の各々の異なる物質が、固相支持体の表面に結合されていない、請求項３６に記載のアレイ。
43. 異なるウェル内の各々の異なる物質が溶液の状態である、請求項３６に記載のアレイ。
44. 各ウェルが、タンパク質または分子の生物学的活性をアッセイするための試薬を含んでいる、請求項２６に記載のアレイ。
45. ウェルの容積が１ｐｌ〜５μｌである、請求項２６に記載のアレイ。
46. ウェルの容積が１ｎｌ〜１μｌである、請求項２６に記載のアレイ。
47. ウェルの容積が１００ｎｌ〜３００ｎｌである、請求項２６に記載のアレイ。
48. ウェルの底部が四角形、丸形、Ｖ字形またはＵ字形である、請求項２６に記載のアレイ。
49. 固相支持体の表面に複数のウェルを備えた位置アドレス可能なアレイの製造方法であって、
    固相表面に１００ウェル／ｃｍ^２を上回る密度のウェルが形成されるように設計された微細加工鋳型からアレイを成型する工程
    を含む上記方法。
50. 固相支持体の表面に複数のウェルを備えた位置アドレス可能なアレイの製造方法であって、
    （ａ）固相表面に１００ウェル／ｃｍ^２を上回る密度のウェルが形成されるように設計された微細加工鋳型から二次鋳型を成型する工程、および
    （ｂ）その二次鋳型から少なくとも１つのアレイを成型する工程
    を含む上記方法。
51. アレイの成型工程が更に、
    （ａ）前記鋳型を液体成型材料で被覆する工程、および
    （ｂ）成型物が固体になるまで、その成型材料を硬化させる工程
    を含む、請求項４９または５０に記載の方法。
52. ウェルの密度が１００〜１，０００ウェル／ｃｍ^２である、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の方法。
53. ウェルの密度が１，０００〜１０，０００ウェル／ｃｍ^２である、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の方法。
54. ウェルの密度が１０，０００〜１００，０００ウェル／ｃｍ^２である、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の方法。
55. ウェルの密度が１００，０００〜１，０００，０００ウェル／ｃｍ^２である、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の方法。
56. ウェルの密度が１，０００，０００〜１０，０００，０００ウェル／ｃｍ^２である、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の方法。
57. ウェルの密度が１０，０００，０００〜２５，０００，０００ウェル／ｃｍ^２である、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の方法。
58. ウェルの密度が２５，０００，０００ウェル／ｃｍ^２よりも高い、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の方法。
59. ウェルの密度が１０，０００，０００，０００ウェル／ｃｍ^２よりも高い、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の方法。
60. ウェルの密度が１０，０００，０００，０００，０００ウェル／ｃｍ^２よりも高い、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の方法。
61. アレイがシリコーンエラストマーから成型される、請求項４９または５０に記載の方法。
62. アレイがポリジメチルシロキサンから成型される、請求項４９または５０に記載の方法。
63. 液体成型材料がシリコーンエラストマーである、請求項５１に記載の方法。
64. 液体成型材料がポリジメチルシロキサンである、請求項５１に記載の方法。
65. タンパク質、該タンパク質の機能性ドメインを含む分子、細胞全体、およびタンパク質含有細胞性物質からなる群から選ばれる複数種の異なる物質を固相支持体上に含んでなり、かつ、各々の異なる物質が固相支持体上の異なる位置に存在し、複数種の異なる物質が１ｃｍ^２当たり少なくとも１００種の異なる物質からなる位置アドレス可能なアレイの使用方法であって、
    （ａ）プローブを上記アレイと接触させる工程、および
    （ｂ）タンパク質／プローブ相互作用を検出する工程
    を含む上記方法。
66. 複数種の異なるタンパク質または該タンパク質の機能性ドメインを含む分子を固相支持体上に含んでなり、かつ、各々の異なるタンパク質または分子が固相支持体上の異なる位置に存在し、複数種の異なるタンパク質または分子が、生物のゲノム中の同タイプの生物学的活性を有する全ての発現タンパク質の少なくとも５０％から構成される位置アドレス可能なアレイの使用方法であって、
    （ａ）プローブを上記アレイと接触させる工程、および
    （ｂ）タンパク質／プローブ相互作用を検出する工程
    を含む上記方法。
67. タンパク質、該タンパク質の機能性ドメインを含む分子、細胞全体、およびタンパク質含有細胞性物質からなる群から選ばれる複数種の異なる物質を固相支持体上に含んでなり、かつ、各々の異なる物質が固相支持体上の異なる位置に存在し、固相支持体が、セラミックス、非晶質炭化ケイ素、不定形酸化物、ポリイミド、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレンおよびシリコーンエラストマーからなる群から選ばれる、位置アドレス可能なアレイの使用方法であって、
    （ａ）プローブを上記アレイと接触させる工程、および
    （ｂ）タンパク質／プローブ相互作用を検出する工程
    を含む上記方法。
68. タンパク質、該タンパク質の機能性ドメインを含む分子、細胞全体、およびタンパク質含有細胞性物質からなる群から選ばれる複数種の異なる物質を固相支持体上に含んでなり、かつ、各々の異なる物質が固相支持体上の異なる位置に存在し、複数種の異なる物質が固相支持体に３−グリシドオキシプロピルトリメトキシシランリンカーを介して結合されている位置アドレス可能なアレイの使用方法であって、
    （ａ）プローブを上記アレイと接触させる工程、および
    （ｂ）タンパク質／プローブ相互作用を検出する工程
    を含む上記方法。
69. プローブが酵素の基質またはインヒビターである、請求項６５〜６８のいずれか１項に記載の方法。
70. プローブが、キナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、アセチラーゼ、および他の官能基転移酵素からなる群から選ばれる酵素の基質またはインヒビターである、請求項６９に記載の方法。
71. プローブが、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、小分子基質、薬剤候補、受容体、抗原、ステロイド、リン脂質、抗体、グルタチオン、免疫グロブリンのドメイン、マルトース、ニッケル、ジヒドロトリプシン、およびビオチンからなる群から選ばれる、請求項６５〜６８のいずれか１項に記載の方法。
72. タンパク質／プローブ相互作用の検出が質量分析による、請求項６５〜６８のいずれか１項に記載の方法。
73. タンパク質／プローブ相互作用の検出が、化学発光法、蛍光法、放射性標識法および原子間力顕微鏡法からなる群から選ばれる方法による、請求項６５〜６８のいずれか１項に記載の方法。
74. 位置アドレス可能なアレイの使用方法であって、
    （ａ）タンパク質、該タンパク質の機能性ドメインを含む分子、細胞全体、およびタンパク質含有細胞性物質からなる群から選ばれる複数種の異なる物質を固相支持体上に固着させる工程であって、但し、各々の異なる物質が固相支持体上の異なる位置に存在し、複数種の異なる物質が１ｃｍ^２当たり少なくとも１００種の異なる物質から構成される、該工程
    （ｂ）プローブを上記アレイと接触させる工程、および
    （ｃ）タンパク質／プローブ相互作用を検出する工程
    を含む上記方法。
75. 固相支持体がスライドガラスである、請求項７４に記載の方法。
76. 位置アドレス可能なアレイの使用方法であって、
    （ａ）複数種の異なるタンパク質または該タンパク質の機能性ドメインを含む分子を固相支持体上に固着させる工程であって、但し、各々の異なるタンパク質または分子が固相支持体上の異なる位置に存在し、複数種のタンパク質または分子が生物のゲノム中の同タイプの生物学的活性を有する全ての発現タンパク質の少なくとも５０％から構成される、該工程
    （ｂ）プローブを上記アレイと接触させる工程、および
    （ｃ）タンパク質／プローブ相互作用を検出する工程
    を含む上記方法。
77. 固相支持体がスライドガラスである、請求項７６に記載の方法。
78. 位置アドレス可能なアレイの製造方法であって、
    （ａ）固相支持体上に１００ウェル／ｃｍ^２を上回る密度のウェルが形成されるように設計された微細加工鋳型からアレイを成型する工程、および
    （ｂ）ウェル内で、タンパク質、該タンパク質の機能性ドメインを含む分子、細胞全体、およびタンパク質含有細胞性物質からなる群から選ばれる複数種の異なる物質を固相支持体上に固着させる工程であって、但し、各々の異なる物質が固相支持体上の異なるウェル内に存在する、該工程
    を含む上記方法。
79. 位置アドレス可能なアレイの製造方法であって、
    （ａ）固相支持体上に１００ウェル／ｃｍ^２を上回る密度のウェルが形成されるように設計された微細加工鋳型から二次鋳型を成型する工程、
    （ｂ）その二次鋳型から少なくとも１つのアレイを成型する工程、および
    （ｃ）ウェル内で、タンパク質、該タンパク質の機能性ドメインを含む分子、細胞全体、およびタンパク質含有細胞性物質からなる群から選ばれる複数種の異なる物質を固相支持体上に固着させる工程であって、但し、各々の異なる物質が固相支持体上の異なるウェル内に存在する、該工程
    を含む上記方法。
80. リンパ球を活性化する抗原の同定方法であって、
    （ａ）位置アドレス可能なアレイを複数種のリンパ球と接触させる工程であって、但し、該アレイが複数種の可能性のある抗原を固相支持体上に含んでなり、各々の異なる抗原が固相支持体上の異なる位置に存在し、異なる抗原の密度が１ｃｍ^２当たり少なくとも１００種の異なる抗原である該工程、および
    （ｂ）リンパ球の活性化が起こっている固相支持体上での位置を検出する工程を含む上記方法。
81. リンパ球が患者に由来する、請求項８０に記載の方法。
82. 抗原が、病原体の抗原、自家組織の抗原、組織特異的抗原、疾患特異的抗原、および合成抗原からなる群から選ばれる、請求項８０に記載の方法。
83. リンパ球の活性化が、抗体合成を測定することにより検出される、請求項８０に記載の方法。
84. リンパ球の活性化が、リンパ球による^３Ｈ−チミジンの取込みを測定することにより検出される、請求項８０に記載の方法。
85. リンパ球の活性化が、リンパ球の活性化により誘導または抑制される細胞表面分子の発現を測定することにより検出される、請求項８０に記載の方法。
86. リンパ球の活性化が、リンパ球の活性化により誘導される分泌型分子の発現を測定することにより検出される、請求項８０に記載の方法。
87. リンパ球の活性化が、^５１クロムの放出を測定することにより検出される、請求項８０に記載の方法。
88. 抗体調製物の特異性の判定方法であって、
    （ａ）位置アドレス可能なアレイを抗体調製物と接触させる工程であって、但し、該アレイが複数種の可能性のある抗原を固相支持体上に含んでなり、各々の異なる抗原が固相支持体上の異なる位置に存在し、異なる抗原の密度が１ｃｍ^２当たり少なくとも１００種の異なる抗原である該工程、および
    （ｂ）該抗体調製物中の抗体による結合が起こっている固相支持体上での位置を検出する工程
    を含む上記方法。
89. 抗体調製物が、抗血清、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含む、請求項８８に記載の方法。
90. 抗体調製物が、Ｆａｂ断片、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体または合成抗体を含む、請求項８８に記載の方法。
91. 抗体の結合が、前記抗体調製物中の抗体に結合する蛍光標識した二次抗体に前記アレイを接触させ、未結合の二次抗体を除去し、該アレイ上の結合標識を検出することにより検出される、請求項８８に記載の方法。
92. マイトジェンの同定方法であって、
    （ａ）位置アドレス可能なアレイを細胞の集団と接触させる工程であって、但し、該アレイがタンパク質、該タンパク質の機能性ドメインを含む分子、細胞全体、およびタンパク質含有細胞性物質からなる群から選ばれる複数種の異なる物質を固相支持体上に含んでなり、各々の異なる物質が固相支持体上の異なる位置に存在し、異なる物質の密度が１ｃｍ^２当たり少なくとも１００種の異なる物質である該工程、および
    （ｂ）細胞内でマイトジェン活性が誘導されている固相支持体上での位置を検出する工程
    を含む上記方法。
93. 下記（ａ）および（ｂ）を含むキット。
    （ａ）固相支持体の表面に複数のウェルを備えた１以上のアレイであって、但し、該ウェルの密度が少なくとも１００ウェル／ｃｍ^２である該アレイ、および
    （ｂ）１つ以上の容器中の、１種以上のプローブ、試薬または他の分子
94. １つ以上の容器が、タンパク質の生物学的活性をアッセイするのに有用な試薬を含む、請求項９３に記載のキット。
95. １つ以上の容器が、プローブとタンパク質との間の相互作用をアッセイするのに有用な試薬を含む、請求項９３に記載のキット。
96. 試薬が溶液の状態である、請求項９４または９５に記載のキット。
97. 試薬が固体の状態である、請求項９４または９５に記載のキット。
98. 試薬が前記アレイの各ウェル内に収容されている、請求項９４または９５に記載のキット。
99. 試薬が前記アレイの選択されたウェル内に収容されている、請求項９４または９５に記載のキット。
100. １つ以上の容器が、タンパク質または分子の生物学的活性をアッセイするための溶液状の反応混合物を収容している、請求項９３に記載のキット。
101. １つ以上の容器が、前記生物学的活性をアッセイするための１種以上の基質を収容している、請求項１００に記載のキット。
102. 下記（ａ）および（ｂ）を含むキット。
     （ａ）タンパク質、該タンパク質の機能性ドメインを含む分子、細胞全体、およびタンパク質含有細胞性物質からなる群から選ばれる複数種の異なる物質を固相支持体上に含んでなり、かつ、各々の異なる物質が固相支持体上の異なる位置に存在し、複数種の異なる物質が１ｃｍ^２当たり少なくとも１００種の異なる物質から構成される、１つ以上の位置アドレス可能なアレイ、および
     （ｂ）１つ以上の容器中の、１種以上のプローブ、試薬または他の分子
103. 前記物質が、固相支持体上のウェルの表面に結合されている、請求項１０２に記載のキット。
104. 前記物質がタンパク質であり、かつ該タンパク質が、生物において同タイプの生物学的活性を有する全ての発現タンパク質の少なくとも５０％である、請求項１０３に記載のキット。
105. 前記物質がタンパク質または該タンパク質の機能性ドメインを含む分子であり、かつ、該タンパク質または該分子が、キナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、アセチラーゼ、核酸結合タンパク質およびホルモン結合タンパク質からなる群から選ばれる、請求項１０４に記載のキット。

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