KR20190020106A - 자가면역 질환의 차별적 진단 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자가면역 질환의 진행에 대한 차별적 진단 및 검출을 위한 방법, 분석법 및 장비를 제공한다. 본 발명에서 제공하는 방법, 분석법 및 장비는 자가면역 질환을 구별하는 모의 펩타이드 어레이 상에 말초혈액 항체의 결합 패턴을 생성 및 분석하며, 간질성 폐질환(ILD) 및 위전정부 혈관확장증(GAVE) 또는 신장 관련 질환과 같은 내부 장기의 합병증으로 환자가 진행하는지를 확인하게 해준다.

Description

자가면역 질환의 차별적 진단 방법

본 발명의 자가면역 질환의 차별적 진단 방법에 관한 것이다.

상호 참조 출원

본 출원은 미국 특허출원번호 제62/352,525호(2016년 6월 20일 출원) 및 제62/421,180(2016년 11월 11일 출원)을 우선권으로 주장하며, 이의 내용은 본원에 참고 인용된다.

본 발명의 배경

자가면역 질환 환자는 만성적으로 활성인 질환, 완화와 발적(flare) 순환의 반복, 또는 오랜 기간의 무활동을 경험할 수 있다. 환자 상태를 정확하게 검출하고 결정하는 것은 자가면역 질환으로 고생하는 환자의 치료적 성과를 개선시키기 위해 적절한 약물 요법을 처방하고, 치료 성과를 평가하며, 환자 하위그룹을 규정하고, 발적의 개시 또는 질환의 진행을 초기에 검출하는데 있어서 핵심이다.

본 발명의 요약

본 발명에서 제공하는 것은 자가면역 질환의 차별적 진단을 수행하기 위한 방법, 장비 및 분석법을 제공하는 것이며, 상기 방법은 (a) 대상자로부터 얻은 샘플을, 계내(in situ) 합성된 적어도 10,000개의 다른 펩타이드를 포함하는 펩타이드 어레이에 접촉시키는 단계; (b) 상기 어레이 상에 있는 적어도 25개의 펩타이드에 대한, 상기 샘플에 존재하는 항체의 결합을 검출하여 결합 신호의 조합을 얻는 단계; 및 (c) 기준 결합 신호의 조합 중 하나 이상의 그룹과 상기 결합 신호의 조합을 비교하는 단계로서, 상기 기준 결합 신호의 조합의 각 그룹의 적어도 하나는 자가면역 질환 대상자와는 다른 질환을 가지고 있는 것으로 알려진 복수의 기준 대상자로부터 얻어지며, 이로 인해 상기 대상자의 자가면역 질환에 대해 차별적 진단을 가능하게 하고, 방법의 수행능(performance)은 자가면역 질환 환자와 각 기준 결합 신호의 조합 그룹 사이의 수신기 작동 특성(ROC) 곡선 하 면적(AUC)이 0.6보다 큰 것을 특징으로 하는 단계를 포함한다.

어떤 실시양태에서 본 발명의 방법, 장비 및 분석법은 계내 합성된 적어도 10,000개의 다른 펩타이드를 포함하는 펩타이드 어레이 상에 있는 상기 적어도 25개의 펩타이드에 대해 상기 기준 그룹에서 상기 복수의 대상자 각각으로부터의 샘플에 존재하는 항체의 결합을 검출함으로써 얻어지는 단계를 추가로 포함한다. 어떤 실시양태에서, 상기 적어도 25개의 펩타이드에 대한 상기 기준 결합 신호의 조합과 상기 결합 신호의 조합 사이의 차이가 상기 차별적 진단을 결정한다. 일 실시양태에서, 상기 다른 질환은 자가면역 질환이다. 어떤 실시양태에서 상기 방법, 장비 및 분석법은 (d) 자가면역 질환을 가진것으로 알려져 있는 복수의 기준 대상자로부터 얻은 기준 결합 신호와 상기 결합 신호의 조합을 비교하는 단계를 추가로 포함한다.

다른 실시양태에서, 상기 자가면역 질환은 피부근육염(DM)이며, 상기 다른 자가면역 질환은 피부경화증(SSc)이다. 여전히 다른 실시양태에서, 상기 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 상기 어레이에 있는 적어도 10,000개의 펩타이드와 비교시 세린, 글리신, 티로신, 아르기닌, 알라닌, 글루타민 및 발린으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 적어도 100% 압축(enrich)된다. 다른 실시양태에서, 상기 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 상기 어레이에 있는 적어도 10,000개의 펩타이드와 비교시 도 13a에 나열된 하나 이상의 모티프로 압축된다.

어떤 실시양태에서, 본 발명의 방법은 건강한 대상자로부터 얻은 기준 결합 신호의 조합과 상기 대상자로부터의 결합 신호를 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 어떤 실시양태에서, 상기 자가면역 질환은 SSc이며, 상기 건강한 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 티로신, 리신, 아르기닌, 페닐알라닌, 세린, 트립토판, 글리신, 및 알라닌으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 적어도 100% 압축된다. 다른 실시양태에서, 상기 자가면역 질환은 SSc이며, 상기 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 상기 어레이에 있는 적어도 10,000개의 펩타이드와 비교시 도 5a에 나열된 하나 이상의 모니프로 압축된다.

일 실시양태에서, 상기 자가면역 질환은 피부근육염(DM)이며, 상기 건강한 대상자의 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 티로신, 트립토판, 세린, 글리신, 아스파르트산 및 페닐알라닌으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 적어도 100% 압축된다. 다른 실시양태에서, 상기 자가면역 질환은 DM이며, 상기 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 상기 어레이에 있는 적어도 10,000개의 펩타이드와 비교시 도 17a에 나열된 하나 이상의 모니프로 압축된다.

어떤 실시양태에서, 상기 자가면역 질환은 SSc이며, 상기 기준 결합 신호의 한 그룹은 복합 결합조직 질환(MCTD), 미분화 결합조직 질환(UCTD), 근육염, 다발근육염, 전신 홍반성 루푸스 및 국소피부경화증을 포함하는 다른 자가면역 질환을 가진 복수의 대상자로부터 얻은 결합 신호의 조합을 포함한다. 어떤 실시양태에서, 상기 자가면역 질환은 SSc이며, 상기 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 아스파르트산, 글루탐산, 프롤린, 발린, 글리신 및 세린으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 적어도 100% 압축된다. 다른 실시양태에서, 상기 자가면역 질환은 SSc이며, 상기 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 상기 어레이에 있는 적어도 10,000개의 펩타이드와 비교시 도 7a에 나열된 하나 이상의 모니프로 압축된다.

어떤 실시양태에서, 상기 자가면역 질환은 DM이며, 상기 기준 결합 신호의 한 그룹은 복합 결합조직 질환, 미분화 결합조직 질환, 근육염, 다발근육염, 전신 홍반성 루푸스 및 국소피부경화증을 포함하는 다른 자가면역 질환을 가진 복수의 대상자로부터 얻은 결합 신호의 조합을 포함한다. 어떤 실시양태에서, 상기 자가면역 질환은 DM이며, 상기 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 리신, 히스티딘, 세린, 아르기닌, 글루탐산, 알라닌 및 글리신으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 적어도 100% 압축된다. 다른 실시양태에서, 상기 자가면역 질환은 DM이며, 상기 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 상기 어레이에 있는 적어도 10,000개의 펩타이드와 비교시 도 19a에 나열된 하나 이상의 모니프로 압축된다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 본 발명의 방법, 장비 및 분석법은 적어도 한명의 건강한 대상자로부터 얻은 결합 신호에 대하여 상기 환자로부터 얻은 결합 신호를 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 어떤 실시양태에서, 상기 방법의 수행능은 ROC 곡선 하 면적(AUC)이 0.60 내지 0.70, 0.70 내지 0.79, 0.80 내지 0.89, 또는 0.90 내지 1.00 범위인 것을 특징으로 한다.

또한, 본원에서는 자가면역 질환을 가진 것으로 알려진 대상자에서의 질환 진행을 결정하는 방법, 장비 및 분석법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 대상자로부터 얻은 샘플을, 계내 합성된 적어도 10,000개의 다른 펩타이드를 포함하는 펩타이드 어레이에 접촉시키는 단계; (b) 상기 어레이 상에 있는 적어도 25개의 펩타이드에 대한, 상기 샘플에 존재하는 항체의 결합을 검출하여 결합 신호의 첫번째 조합을 얻는 단계; 및 (c) 적어도 기준 결합 신호의 두번째 조합과 상기 결합 신호의 첫번째 조합을 비교하는 단계로서, 상기 기준 결합 신호의 두번째 조합은 상기 자가면역 질환의 진행을 가리키는 임상 증상을 가진 복수의 대상자를 포함하는 기준 그룹으로 얻은 결합 신호의 조합을 포함하며, 이로 인해 차별적 진단을 실시하고, 방법의 수행능은 ROC 곡선 하 면적(AUC)이 0.6보다 큰 것을 특징으로 하는 단계를 포함한다. 어떤 실시양태에서, 상기 방법, 장비 및 분석법은 (d) 자가면역 질환을 가진것으로 알려져 있는 복수의 기준 대상자로부터 얻은 기준 결합 신호와 결합 신호의 조합을 비교하는 단계를 추가로 포함한다.

어떤 실시양태에서 상기 기준 결합 신호의 조합 각각은 계내 합성된 적어도 10,000개의 다른 펩타이드를 포함하는 펩타이드 어레이 상에 있는 상기 적어도 25개의 펩타이드에 대한, 상기 기준 그룹에서 상기 복수의 대상자 각각으로부터의 샘플에 존재하는 항체의 결합을 검출함으로써 얻어진다. 일 실시양태에서는, 상기 적어도 25개의 펩타이드에 대한 상기 기준 결합 신호의 조합과 상기 결합 신호의 조합 사이의 차이가 상기 질환의 진행을 결정한다. 다른 실시양태에서, 상기 질환의 진행은 피부경화증(SSc)에서 결정된다. 또 다른 실시양태에서 상기 질환의 진행은 SSc에서 결정하고, 상기 임상 증상은 신장 위기(renal crisis), 간질성 폐질환(ILD) 및 위전정부 혈관확장증(GAVE)으로부터 선택된다.

일 실시양태에서, 상기 질환의 진행은 SSc를 가진 대상자에서 결정될 수 있으며, 상기 임상 증상은 신장 위기이다. 어떤 실시양태에서, 상기 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 상기 어레이 내에 있는 적어도 10,000개의 펩타이드와 비교시 프롤린, 아스파르트산 및 글루탐산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 적어도 100% 압축된다. 다른 실시양태에서, 상기 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 상기 어레이에 있는 적어도 10,000개의 펩타이드와 비교시 도 9a에 나열된 하나 이상의 모니프로 압축된다.

다른 실시양태에서, 상기 질환의 진행은 SSc에서 결정하고, 상기 임상 증상은 ILD이다. 어떤 실시양태에서, 상기 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 상기 어레이에 있는 적어도 10,000개의 펩타이드와 비교시 적어도 프롤린, 아르기닌, 리신, 히스티딘 및 아스파르트산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 압축된다. 다른 실시양태에서, 상기 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 상기 어레이에 있는 적어도 10,000개의 펩타이드와 비교시 도 15a에 나열된 하나 이상의 모니프로 압축된다.

다른 실시양태에서, 상기 질환의 진행은 SSc에서 결정하고, 상기 임상 증상은 GAVE이다. 일 실시양태에서, 상기 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 상기 어레이에 있는 적어도 10,000개의 펩타이드와 비교시 아르기닌, 티로신, 세린, 히스티딘, 리신 및 페닐알라닌으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 압축된다. 다른 실시양태에서, 상기 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 상기 어레이에 있는 적어도 10,000개의 펩타이드와 비교시 도 11a에 나열된 하나 이상의 모니프로 압축된다.

다른 실시양태에서, 상기 질환의 진행은 피부근육염(DM)을 가진 환자에서 결정하며, 상기 임상 증상은 간질성 폐질환(ILD)이다. 일 실시양태에서, 상기 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 상기 어레이에 있는 적어도 10,000개의 펩타이드와 비교시 프롤린, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 글리신 및 글루타민으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 압축된다. 다른 실시양태에서, 상기 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 상기 어레이에 있는 적어도 10,000개의 펩타이드와 비교시 도 21a에 나열된 하나 이상의 모니프로 압축된다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법의 수행능은 ROC 곡선 하 면적(AUC)이 0.60 내지 0.70, 0.70 내지 0.79, 0.80 내지 0.89, 또는 0.90 내지 1.00 범위인 것을 특징으로 한다.

어떤 실시양태에서, 상기 대상자는 인간이다. 다른 실시양태에서, 샘플은 혈액 샘플이다. 또 다른 실시양태에서, 혈액 샘플은 전혈, 혈장 또는 혈청으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 샘플은 혈청 샘플이다. 일 실시양태에서, 샘플은 혈장 샘플이다. 다른 실시양태에서 샘플은 건조된 혈액 샘플이다. 또 다른 실시양태에서, 펩타이드 어레이 상에 있는 적어도 10,000개의 다른 펩타이드는 적어도 5개의 아미노산 길이를 갖는다. 다른 실시양태에서, 펩타이드 어레이 상에 있는 적어도 10,000개의 다른 펩타이드는 5 내지 15개의 아미노산 길이를 갖는다. 어떤 실시양태에서, 적어도 10,000개의 다른 펩타이드는 20개 미만의 아미노산으로부터 합성된다. 다른 실시양태에서 펩타이드 어레이 상에 있는 적어도 10,000개의 다른 펩타이드는 시스테인, 메티오닌, 이소류신 및 트레오닌 중 하나 이상을 제외하고 합성된다.

다른 측면에서, 본 발명에는 자가면역 질환에 대한 후보 단백질 바이오마커를 확인하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 하나 이상의 다른 건강 상태로부터 상기 자가면역 질환을 구별하는 식별 펩타이드 세트를 확인하는 단계; (b) 상기 (식별) 펩타이드 세트를 프로테옴 내에 있는 단백질에 정렬하여 상기 프로테옴의 하나 이상의 단백질에 대한 식별 펩타이드 세트의 정렬 점수를 얻는 단계; (d) 통계적 유의성에 따라 상기 확인된 단백질의 순위를 매기는 단계; 및 (e) 상기 자가면역 질환을 치료하기 위한 후보 단백질 바이오마커로서의 상기 단백질을 확인하는 단계를 포함한다. 어떤 실시양태에서, 상기 방법은 건강한 상태로부터 상기 자가면역 질환을 구별하는 식별 펩타이드 세트를 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 어떤 실시양태에서, 후보 단백질 바이오마커는 표 3에 나열된 표적으로부터 선택된다.

어떤 실시양태에서, 식별 펩타이드는 10^-5 미만, 10^-6 미만, 10^-7 미만, 10^-8 미만, 10^-9 미만, 10^-10 미만, 10^-11 미만, 10^-12 미만, 10^-13 미만, 10^-14 미만 또는 10^-15 미만의 p-값을 갖는 것으로 확인된다. 다른 실시양태에서, 상기 후보 단백질 바이오마커는 10^-3 미만, 10^-4 미만, 10^-5 미만, 또는 10^-6 미만의 p-값에 따라 순위가 매겨진다.

문헌의 원용

개별 논문, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되어진 것과 같이 본 명세서에 언급된 모든 논문, 특허 및 특허 출원은 본원에 참조로서 포함된다.

특허 또는 출원된 파일은 적어도 하나의 색상이 있는 도면을 포함한다. 색채 도면을 포함하는 이 특허 또는 특허 출원 공개공보는 심사청구 및 필요한 관납료를 지불함으로서 제공된다.
본 발명의 신규한 특징은 첨부된 청구항에 구체적으로 기재되어 있다. 본 발명의 보다 바람직한 특징과 이점의 이해는 이하에 기술되는 실시예에 자세히 기술된 실시예에 따라 참조로서 이해되며, 실시예에는 본 발명의 원칙이 이용되고 있고 하기에 첨부되는 도면에 대한 설명이 있다.
도 1a는 SSc의 임상 증상과 생리학적 징후에 대한 나열이다.
도 1b는 SSc의 임상 증상과 생리학적 징후에 대해 계속 나열한 것이다.
도 2는 SSc의 진단과 평가를 평가하는데 사용되는 임상 징후의 목록 예이다.
도 3은 다발근육염과 피부근육염에 대한 임상 증상과 징후의 목록 및 이 양자간의 임상적 차이점을 나타낸 것이다.
도 4는 자가 단백질/항체가 펩타이드 마이크로어레이에 있는 면역특징을 상향조절 및 하향조절로 어떻게 이끌어내는지를 보여주는 과정이다.
도 5는 SSc를 가진 환자와 건강한 대상자를 비교시 상위로 차이나는 펩타이드를 기술한 표이다.
도 5의 (A)는 상위의 서브-모티프를 기술한다.
도 5의 (B)는 상위 1000개의 차이나는 펩타이드 중에서 압축된 펩타이드를 기술한다.
도 6은 도 5의 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6a는 펩타이드 결합 강도를 통해 건강한 대조군으로부터 피부경화증(SSc)을 가진 환자의 차이를 나타낸 볼케이노 플롯(Volcano Plot)이다. 대조군 환자의 평균 강도에 대한 피부경화증을 가진 환자로부터의 샘플의 평균 강도의 비율이 t 검정을 통해 얻은 평균의 차이에 대한 p-값으로 표시되어 있다.
도 6b는 건강한 대조군으로부터 피부경화증을 가진 환자를 확인하기 위한 피부경화증 면역특징 모델에 대한 ROC 곡선이다. 녹색 선(맨위)은 분류기(중간)의 95% 이상의 신뢰 구간을 나타내며 빨간 선(맨아래)은 95% 이하의 신뢰 구간을 나타낸다. 민감도 추정은 90%의 특이도를 가진 테스트에 제공되며, 특이도 추정은 90% 민감도를 가진 테스트에 제공된다. 정확도는 민감도와 특이도를 매치하는 한계치로 추정된다.　
도 6c는 입력 크기에 다른 입력 펩타이드 크기 모델에 제공되는 ROC 곡선 아래 구역(+/- 95% CI)을 4배 교차한 ROC 측정치이다. 펩타이드는 피부경화증과 건강한 대조군을 구분하기 위해 만들어진 지지 벡터 머신에 사용되는 T 검정과 상위 k 특징값을 기본으로 하여 선별되었다. 특징값의 선별과 모델 구축은 편견을 방지하기 위해 교차 검증 루프 내에서 수행되었다.
도 7은 SSc와 다른 자가면역 질환을 가진 것으로 진단된 환자를 비교시 면역특징 내에서 상위로 차이나는 펩타이드를 나타낸 표이다.
도 7의 (A)는 상위 서브-모티프를 나타낸다.
도 7의 (B)는 상위 1000개의 구별되는 펩타이드 중에서 압축된 펩타이드를 나타낸다.
도 8은 도 7에 나타낸 결과를 보여주는 그래프이다.
도 8a는 펩타이드 결합 강도를 통해 다른 자가면역 유사 질환("다른 AI")으로부터 SSc를 가진 환자의 차이점을 나타낸 볼케이노 플롯이다. 다른 자가면역 질환 환자의 평균 강도에 대한 SSc를 가진 환자로부터의 샘플의 평균 강도의 비율이 T 검정을 통해 얻은 평균의 차이에 대한 p-값으로 표시되어 있다.
도 8b는 다른 자가면역 질환자로부터 SSc를 가진 환자를 확인하기 위한 면역특징 모델에 대한 ROC 곡선이다. 녹색 선(맨위)은 분류기(중간)의 95% 이상의 신뢰 구간을 나타내며 빨간 선(맨아래)은 95% 이하의 신뢰 구간을 나타낸다. 민감도 추정은 90%의 특이도를 가진 테스트에 제공되며, 특이도 추정은 90% 민감도를 가진 테스트에 제공된다. 정확도는 민감도와 특이도를 매치하는 한계치로 추정된다.
도 8c는 입력 크기에 다른 입력 펩타이드 크기 모델에 제공되는 ROC 곡선 아래 구역(+/- 95% CI)을 4배 교차한 ROC 측정치이다. 펩타이드는 SSc와 다른 자가면역 질환을 구분하기 위해 만들어진 지지 벡터 머신에 사용되는 T 검정과 상위 k 특징값을 기본으로 하여 선별되었다. 특징값의 선별과 모델 구축은 편견을 방지하기 위해 교차 검증 루프 내에서 수행되었다.
도 9는 SSc로 진단된 환자와 신장 위기를 가진 환자를 비교시 면역특징에서 상위로 차이나는 펩타이드를 나타낸 표이다.
도 9의 (A)는 상위 서브-모티프를 나타낸다.
도 9의 (B)는 상위 1000개의 구별되는 펩타이드 중에서 압축된 펩타이드를 나타낸다.
도 10은 도 9에 나타낸 결과를 보여주는 그래프이다.
도 10a는 펩타이드 결합 강도를 통해 신장 위기가 없는(-) SSc 환자로부터 신장 위기가 있는(+) SSc 환자의 차이점을 나타낸 볼케이노 플롯이다. 신장 위기가 없는 SSc를 가진 환자의 평균 강도에 대한 신장 위기가 있는 SSc를 가진 환자로부터의 샘플의 평균 강도의 비율이 T 검정을 통해 얻은 평균의 차이에 대한 p-값으로 표시되어 있다.
도 10b는 신장 위기가 없는 SSc 환자로부터 신장 위기가 있는 SSc를 가진 환자를 확인하기 위한 면역특징 모델에 대한 ROC 곡선이다. 녹색 선(맨위)은 분류기(중간)의 95% 이상의 신뢰 구간을 나타내며 빨간 선(맨아래)은 95% 이하의 신뢰 구간을 나타낸다. 민감도 추정은 90%의 특이도를 가진 테스트에 제공되며, 특이도 추정은 90% 민감도를 가진 테스트에 제공된다. 정확도는 민감도와 특이도를 매치하는 한계치로 추정된다.
도 10c는 입력 크기에 다른 입력 펩타이드 크기 모델에 제공되는 ROC 곡선 아래 구역(+/- 95% CI)을 4배 교차한 ROC 측정치이다. 펩타이드는 신장 위기가 있는 SSc와 신장 위기가 없는 SSc를 구분하기 위해 만들어진 지지 벡터 머신에 사용되는 T 검정과 상위 k 특징값을 기본으로 하여 선별되었다. 특징값의 선별과 모델 구축은 편견을 방지하기 위해 교차 검증 루프 내에서 수행되었다.
도 11은 SSc로 진단된 환자와 위전정부 혈관확장증(GAVE) 환자를 비교시 면역특징에서 상위로 차이나는 펩타이드를 나타낸 표이다.
도 11의 (A)는 상위 서브-모티프를 나타낸다.
도 11의 (B)는 상위 1000개의 구별되는 펩타이드 중에서 압축된 펩타이드를 나타낸다.
도 12는 도 11에 나타낸 결과를 보여주는 그래프이다.
도 12a는 펩타이드 결합 강도를 통해 GAVE가 없는 SSc 환자로부터 GAVE가 있는 SSc 환자의 차이점을 나타낸 볼케이노 플롯이다. GAVE가 없는 SSc을 가진 환자의 평균 강도에 대한 GAVE가 있는 SSc를 가진 환자로부터의 샘플의 평균 강도의 비율이 T 검정을 통해 얻은 평균의 차이에 대한 p-값으로 표시되어 있다.
도 12b는 GAVE가 없는 SSc 환자로부터 GAVE가 있는 SSc을 가진 환자를 확인하기 위한 면역특징 모델에 대한 ROC 곡선이다. 녹색 선(맨위)은 분류기(중간)의 95% 이상의 신뢰 구간을 나타내며 빨간 선(맨아래)은 95% 이하의 신뢰 구간을 나타낸다. 민감도 추정은 90%의 특이도를 가진 테스트에 제공되며, 특이도 추정은 90% 민감도를 가진 테스트에 제공된다. 정확도는 민감도와 특이도를 매치하는 한계치로 추정된다.
도 12c는 입력 크기에 다른 입력 펩타이드 크기 모델에 제공되는 ROC 곡선 아래 구역(+/- 95% CI)을 4배 교차한 ROC 측정치이다. 펩타이드는 GAVE가 있는 SSc와 GAVE가 없는 SSc를 구분하기 위해 만들어진 지지 벡터 머신에 사용되는 T 검정과 상위 k 특징값을 기본으로 하여 선별되었다. 특징값의 선별과 모델 구축은 편견을 방지하기 위해 교차 검증 루프 내에서 수행되었다.
도 13은 SSc로 진단된 환자와 DM 환자를 비교시 면역특징에서 상위로 차이나는 펩타이드를 나타낸 표이다.
도 13의 (A)는 상위 서브-모티프를 나타낸다.
도 13의 (B)는 상위 1000개의 구별되는 펩타이드 중에서 압축된 펩타이드를 나타낸다.
도 14는 도 13에 나타낸 결과를 보여주는 그래프이다.
도 14a는 펩타이드 결합 강도를 통해 DM을 가진 환자로부터 SSc를 가진 환자의 차이점을 나타낸 볼케이노 플롯이다. DM을 가진 환자로부터의 샘플의 평균 강도에 대한 SSc를 가진 환자의 평균 강도의 비율이 T 검정을 통해 얻은 평균의 차이에 대한 p-값으로 표시되어 있다.
도 14b는 DM 환자로부터 SSc를 가진 환자를 확인하기 위한 면역특징 모델에 대한 ROC 곡선이다. 녹색 선(맨위)은 분류기(중간)의 95% 이상의 신뢰 구간을 나타내며 빨간 선(맨아래)은 95% 이하의 신뢰 구간을 나타낸다. 민감도 추정은 90%의 특이도를 가진 테스트에 제공되며, 특이도 추정은 90% 민감도를 가진 테스트에 제공된다. 정확도는 민감도와 특이도를 매치하는 한계치로 추정된다.
도 14c는 입력 크기에 다른 입력 펩타이드 크기 모델에 제공되는 ROC 곡선 아래 구역(+/- 95% CI)을 4배 교차한 ROC 측정치이다. 펩타이드는 SSc와 DM을 구분하기 위해 만들어진 지지 벡터 머신에 사용되는 T 검정과 상위 k 특징값을 기본으로 하여 선별되었다. 특징값의 선별과 모델 구축은 편견을 방지하기 위해 교차 검증 루프 내에서 수행되었다.
도 15는 간질성 폐질환을 가진(ILD+) 피부경화증으로 진단된 환자와 간질성 폐질환을 가지지 않은(ILD-) 피부경화증 환자를 비교시 면역특징에서 상위로 차이나는 펩타이드를 나타낸 표이다.
도 15의 (A)는 상위 서브-모티프를 나타낸다.
도 15의 (B)는 상위 1000개의 구별되는 펩타이드 중에서 압축된 펩타이드를 나타낸다.
도 16은 도 15에 나타낸 결과를 보여주는 그래프이다.
도 16a는 펩타이드 결합 강도를 통해 ILD- SSc 환자로부터 ILD+ SSc를 가진 환자의 차이점을 나타낸 볼케이노 플롯이다. ILD- SSc를 가진 환자의 평균 강도에 대한 ILD+ SSc를 가진 환자로부터의 샘플의 평균 강도의 비율이 T 검정을 통해 얻은 평균의 차이에 대한 p-값으로 표시되어 있다.
도 16b는 ILD- SSc 환자로부터 ILD+ SSc 환자를 확인하기 위한 면역특징 모델에 대한 ROC 곡선이다. 녹색 선(맨위)은 분류기(중간)의 95% 이상의 신뢰 구간을 나타내며 빨간 선(맨아래)은 95% 이하의 신뢰 구간을 나타낸다. 민감도 추정은 90%의 특이도를 가진 테스트에 제공되며, 특이도 추정은 90% 민감도를 가진 테스트에 제공된다. 정확도는 민감도와 특이도를 매치하는 한계치로 추정된다.
도 16c는 입력 크기에 다른 입력 펩타이드 크기 모델에 제공되는 ROC 곡선 아래 구역(+/- 95% CI)을 4배 교차한 ROC 측정치이다. 펩타이드는 ILD+ 피부경화증을 가진 환자과 ILD- 피부경화증을 구분하기 위해 만들어진 지지 벡터 머신에 사용되는 T 검정과 상위 k 특징값을 기본으로 하여 선별되었다. 특징값의 선별과 모델 구축은 편견을 방지하기 위해 교차 검증 루프 내에서 수행되었다.
도 17은 DM으로 진단된 환자와 건강한 대상자를 비교시 면역특징에서 상위로 차이나는 펩타이드를 나타낸 표이다.
도 17의 (A)는 상위 서브-모티프를 나타낸다.
도 17의 (B)는 상위 1000개의 구별되는 펩타이드 중에서 압축된 펩타이드를 나타낸다.
도 18은 도 17에 나타낸 결과를 보여주는 그래프이다.
도 18a는 펩타이드 결합 강도를 통해 건강한 대상자로부터 DM을 가진 환자의 차이점을 나타낸 볼케이노 플롯이다. 건강한 대조군의 평균 강도에 대한 DM을 가진 환자로부터의 샘플의 평균 강도의 비율이 T 검정을 통해 얻은 평균의 차이에 대한 p-값으로 표시되어 있다.
도 18b는 건강한 대상자로부터 DM을 가진 환자를 확인하기 위한 면역특징 모델에 대한 ROC 곡선이다. 녹색 선(맨위)은 분류기(중간)의 95% 이상의 신뢰 구간을 나타내며 빨간 선(맨아래)은 95% 이하의 신뢰 구간을 나타낸다. 민감도 추정은 90%의 특이도를 가진 테스트에 제공되며, 특이도 추정은 90% 민감도를 가진 테스트에 제공된다. 정확도는 민감도와 특이도를 매치하는 한계치로 추정된다.
도 18c는 입력 크기에 다른 입력 펩타이드 크기 모델에 제공되는 ROC 곡선 아래 구역(+/- 95% CI)을 4배 교차한 ROC 측정치이다. 펩타이드는 DM을 가진 환자와 건강한 대조군을 구분하기 위해 만들어진 지지 벡터 머신에 사용되는 T 검정과 상위 k 특징값을 기본으로 하여 선별되었다. 특징값의 선별과 모델 구축은 편견을 방지하기 위해 교차 검증 루프 내에서 수행되었다.
도 19는 DM으로 진단된 환자와 다른 AI 질환자를 비교시 면역특징에서 상위로 차이나는 펩타이드를 나타낸 표이다.
도 19의 (A)는 상위 서브-모티프를 나타낸다.
도 19의 (B)는 상위 1000개의 구별되는 펩타이드 중에서 압축된 펩타이드를 나타낸다.
도 20은 도 19에 나타낸 결과를 보여주는 그래프이다.
도 20a는 펩타이드 결합 강도를 통해 다른 AI 질환자로부터 DM을 가진 환자의 차이점을 나타낸 볼케이노 플롯이다. 다른 AI 질환자의 평균 강도에 대한 DM을 가진 환자로부터의 샘플의 평균 강도의 비율이 T 검정을 통해 얻은 평균의 차이에 대한 p-값으로 표시되어 있다.
도 20b는 다른 AI 질환자로부터 DM을 가진 환자를 확인하기 위한 면역특징 모델에 대한 ROC 곡선이다. 녹색 선(맨위)은 분류기(중간)의 95% 이상의 신뢰 구간을 나타내며 빨간 선(맨아래)은 95% 이하의 신뢰 구간을 나타낸다. 민감도 추정은 90%의 특이도를 가진 테스트에 제공되며, 특이도 추정은 90% 민감도를 가진 테스트에 제공된다. 정확도는 민감도와 특이도를 매치하는 한계치로 추정된다.
도 20c는 입력 크기에 다른 입력 펩타이드 크기 모델에 제공되는 ROC 곡선 아래 구역(+/- 95% CI)을 4배 교차한 ROC 측정치이다. 펩타이드는 DM을 가진 환자와 다른 AI 질환자를 구분하기 위해 만들어진 지지 벡터 머신에 사용되는 T 검정과 상위 k 특징값을 기본으로 하여 선별되었다. 특징값의 선별과 모델 구축은 편견을 방지하기 위해 교차 검증 루프 내에서 수행되었다.
도 21은 간질성 폐질환을 가진(ILD+) DM으로 진단된 환자와 간질성 폐질환을 가지지 않은(ILD-) DM 환자를 비교시 면역특징에서 상위로 차이나는 펩타이드를 나타낸 표이다.
도 21의 (A)는 상위 서브-모티프를 나타낸다.
도 21의 (B)는 상위 1000개의 구별되는 펩타이드 중에서 압축된 펩타이드를 나타낸다.
도 22는 도 21에 나타낸 결과를 보여주는 그래프이다.
도 22a는 펩타이드 결합 강도를 통해 ILD- DM 환자로부터 ILD+ DM 환자의 차이점을 나타낸 볼케이노 플롯이다. ILD- DM을 가진 환자의 평균 강도에 대한 ILD+ DM을 가진 환자로부터의 샘플의 평균 강도의 비율이 T 검정을 통해 얻은 평균의 차이에 대한 p-값으로 표시되어 있다.
도 22b는 ILD- DM 환자로부터 ILD+ DM을 가진 환자를 확인하기 위한 면역특징 모델에 대한 ROC 곡선이다. 녹색 선(맨위)은 분류기(중간)의 95% 이상의 신뢰 구간을 나타내며 빨간 선(맨아래)은 95% 이하의 신뢰 구간을 나타낸다. 민감도 추정은 90%의 특이도를 가진 테스트에 제공되며, 특이도 추정은 90% 민감도를 가진 테스트에 제공된다. 정확도는 민감도와 특이도를 매치하는 한계치로 추정된다.
도 22c는 입력 크기에 다른 입력 펩타이드 크기 모델에 제공되는 ROC 곡선 아래 구역(+/- 95% CI)을 4배 교차한 ROC 측정치이다. 펩타이드는 ILD+ DM을 가진 환자과 ILD- DM을 구분하기 위해 만들어진 지지 벡터 머신에 사용되는 T 검정과 상위 k 특징값을 기본으로 하여 선별되었다. 특징값의 선별과 모델 구축은 편견을 방지하기 위해 교차 검증 루프 내에서 수행되었다.
도 23a는 펩타이드 중첩 차이 점수를 보여주며, 이 점수 s는 RNA 폴리머라제 II 서브유닛 L aa 위치에 나란히 플롯된 IMS 펩타이드-모티프를 정렬하는데 계산된 것이다.
도 23b는 인간 프로테옴 내에 있는 각 단백질 vs SSc vs 건강한 대상자의 펩타이드 각각에 대한 단백질 에피토프 점수(S)의 분포를 나타낸 막대그래프이다.
도 24는 GAVE- SSc 환자로부터 GAVE+ SSc 환자를 구분하는 식별 펩타이드 IS 정렬 빈도를 나타내는 막대그래프이다.

본 발명의 실시양태는 건강한 개개인에 대하여 자가면역 질환을 진단하고, 다른 자가면역, 비-자가면역 유사 질환 및 다른 중첩 질환에 대하여 자가면역 질환을 차별적으로 진단하며, 자가면역 질환의 진행을 결정하기 위해, 생물학적 샘플로부터 항체 결합 프로파일을 수득하고 정량화하기 위한 방법, 장비 및 시스템에 관한 것이다.

본원에서 다르게 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 업계의 통상적인 기술자 중의 하나에 의해 일반적으로 이해될 수 있는 정도의 유사한 의미를 가진다. 본원에 포함된 용어를 포함하는 다양한 과학 사전은 당업계에서 잘 알려진 것이며 잘 사용되는 것이다. 비록 본원에 기술된 방법과 재료와 유사하거나 동등한 것으로 본 발명의 실제 또는 시험에 사용된다고 하더라도, 일부 바람직한 방법과 재료가 기술되어 있다.

수치 범위에는 범위를 정의하는 숫자가 포함된다. 본 명세서를 걸쳐 제시된 모든 최대 수치 한계치는, 본원에 수치의 낮은 하한선이 표현되는 것처럼 모든 낮은 수치 한계치를 포함한다. 본 명세서를 걸쳐 제시된 모든 적어도 수치 한계치는, 본원에 수치의 높은 상한선이 표현되는 것처럼 모든 높은 수치 한계치를 포함한다. 본 명세서를 걸쳐 제시된 모든 수치 범위는, 본원에 이런 좁은 범위의 수치 범위가 모두 표현되는 것처럼 모든 넓은 수치 범위 내에 있는 것이다.

본원에 제공되는 제목은 전체적으로 명세서를 참조하여 얻어질 수 있는 본 발명의 다양한 측면 또는 실시양태를 제한하는 것은 아니다.

아래에서 바로 정의한 용어는 명세서를 전체적으로 참조함으로써 보다 상세히 기술된다. 본 발명은 당해기술 분야의 당업자에 의해 사용되는 상황에 따라 달라질 수 있기 때문에 본원에 기술된 각각의 방법론, 프로토콜 및 시약에만 국한되지 않는다는 것을 이해하여야 한다.

정의

용어 "상태" 및 "건강한 상태"는 질환과 장애를 포함한 모든 질병을 포함하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용되지만, 사람의 건강에 영향을 미치거나, 의료 보조의 혜택을 주거나, 치료에 영향을 미칠 수 있는, 임신과 같은 정상적 건강 상황과 손상을 포함할 수 있다.

본원의 용어 "면역특징(immunosignature)"은 기준 샘플에 있는 항체가 펩타이드 어레이에 결합하는 것에 비교하여 실험군으로부터의 샘플에 있는 항체가 펩타이드 어레이에 차별적으로 결합하는지를 확인하는 결합 신호의 조합을 의미한다.

본원의 용어 "대상자(subject)"는 인간 대상자 뿐만 아니라 비-인간 포유동물과 같은 비-인간 대상자를 의미한다. 따라서, 수의학 용어가 고려될 수 있는데, 이 경우는 대상자는 비-인간 포유동물(예, 고양이, 돼지, 소 등)이 될 수 있다. 본원에 기재된 개념은 또한 식물에도 적용될 수 있다.

용어 "환자 샘플" 및 "대상자 샘플"은 환자, 즉 의료, 관리 또는 치료를 받는 사람으로부터 얻어진 샘플, 예를 들어 생물학적 체액 샘플을 의미한다. 대상 샘플은 본원에 기술된 모든 샘플이 될 수 있다. 어떤 실시양태에서, 대상자 샘플은 비-침습성 과정을 통해 얻어진 것, 즉 말초 혈액 샘플이다.

본원에 사용된 용어 "마이크로어레이 시스템"은 일반적으로 유리, 플라스틱 또는 실리콘 칩과 같은 단단한 평면 표면에 포맷된 어레이 펩타이드, 샘플을 다루는 데 필요한 하나 이상의 장비(자동화된 로봇), 리포터 분자를 읽고(스캐너) 데이터를 분석하는(바이오정보 도구) 기구로 구성된 시스템을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "어레이 펩타이드"는 마이크로어레이 상에 고정된 펩타이드를 의미한다.

본원에 사용된 용어 "식별하는" 및 "구별하는"은 실험 대상자의 건강 상태를 결정하기 위해 기준 대상이나 대상자와 비교하여 실험 대상자의 샘플에 있는 항체가 차별적으로 결합하는, 항체 결합 프로파일/패턴을 갖는 펩타이드에 대해 상호 교환적으로 사용된다.

본원에 사용된 용어 "정확도"는 본 발명의 방법에 의해 정확한 결과로 분류되는 비율을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "민감도"는 샘플이 테스트되는 조건에 대해 양성인 것으로 정확하게 확인되는 비율을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "특이도"는 샘플이 테스트되는 조건에 대해 음성인 것으로 정확하게 확인되는 비율을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "아미노산"은 알라닌(3글자 코드: ala, 1글자 코드: A), 아르기닌(arg, R), 아스파라긴(asn, N), 아스파르트산(asp, D), 시스테인(cys, C), 글루타민(gln, Q), 글루탐산(glu, E), 글리신(gly, G), 히스티딘(his, H), 이소류신(ile, I), 류신(leu, L), 리신(lys, K), 메티오닌(met, M), 페닐알라닌(phe, F), 프롤린(pro, P), 세린(ser, S), 트레오닌(thr, T), 트립토판(tip, W), 티로신(tyr, Y), 및 발린(val, V)을 포함하는 자연발생적으로 생기는 카복시-아미노산을 의미한다.

자가면역 질환과 같은 면역관련 질환을 검출하고 진단하는 것은, 확실하거나정확한 진단을 받기가 어려운 환자들에 대해서는 도전의식을 북돋게 한다. 많은 경우, 환자들은 종종 다른 자가면역 상태를 가진 것으로 오진되는데, 이는 이러한 질병들이 유사하게 관련되어 있기 때문이다. 자가면역 질환 또는 장애를 진단하고 평가하는에 사용될 수 있는 믿을만한 바이오마커가 아직은 존재하고 있지 않다.

예를들어, 전신경화증 또는 피부경화증(SSc)은 섬유모세포의 활성이 증가하여 비정상적으로 결합조직이 성장하는 복합시스템 자가면역 질환이다. SSc는 다른 유사 질환과의 밀접한 관련성 때문에 질환의 상태를 진단하거나 예측하기가 어렵다. SSc는 피부, 위장(GI) 기관 및 기타 내부 장기에 혈관 손상 및 섬유증을 유발하며, 피부 두꺼움, 종창성 또는 종대성 손가락, 손의 경직, 그리고 아픈 증상의 손가락 궤양을 가진 환자에게 있는 것으로 의심된다. 레이노 현상의 징후(RP; 혈관에 발생하는 질환, 대부분은 팔다리(손가락 및 발가락); 춥거나 스트레스 상황에서 혈관이 좁아지게 하여, 발생한 팔다리에서 느낌이 마비되게 함) 및 위식도역류가 주로 나타난다. 도 1a 및 1b는 전신경화증의 임상 증상의 예를 나타내며, 이는 질환의 종류(제한적 또는 분산적) 및 장기 관련성의 결과에 따라 이질적이고 다양하다.

전신경화증의 진단은 피부두께의 특징적인 발견에 기초해 이루어질 수 있으며, 레이노 현상과 내부 장기 개입의 다양한 정도와 관련이 있을 수 있다. 질환의 초기 단계에서, 레이노 징후는 오직 한개의 임상 증상이 있을 수 있다. 이 경우는 레이노 징후가 SSc에 대해 일차 또는 이차적인 것인지 결정하기 위해 손톱주름 모세혈관현미경(Nailfold capillarscopy)이 도움이 된다. 미국의 류마티스학과에서 제안한 SSc를 위한 진단 기준이 도 2에 나열되어 있으나, 전문가들도 이러한 기준의 유용성에 대해서는 다른 의견을 갖고 있으며, 질환의 임상 증상도 종종 이런 기준을 만족하는 환자에 있어서 시간이 지남에 따라 진화하게 되었다. 또한, 임상 증상의 이질성, 내부 장기 개입의 범위, 질병 진행률의 차이로 인해 각 개별 환자의 질병에 대한 상담 및 관리에 어려움이 있다.

피부경화증은 단독으로 발생하거나 다른 결합조직 질환(전신 홍반성 루푸스, 피부근육염 및 류마티스관절염)을 가지는 증후군과 중첩되어 발생할 수 있다. 관련된 다른 질환에 따라, 질환의 상태는 "중첩 증후군(overlap syndrome)"으로 불릴수 있다. 피부경화증과 관련된 중첩 질환은 유사 질환 즉 피부경화증 증상과 쉽게 구분될수 없는 피부경화증을 함께 동반하는 다른 질환인 유사 질환일 수 있다.

피부근육염은 특발 염증성 근육병으로, 피부에 특징적인 임상 증상을 나타낸다. 비록 이런 상태가 드물지만(성인 백만명당 1 내지 10건), 전신 합병증이 질환의 이환율을 증가시킬 수 있기 때문에, 초기 진단과 치료가 중요하다. 염증성 근육병을 포함하는 다발근육염은 질환에서 피부쪽에 이상이 없는 것으로 발견되는 환자에서 보인다. 질환의 분류는 1975년도에 맨처음 서술되었고, 도 3에 나타나 있다. 다른 피부 및 결합조직 질환으로부터 피부경화증과 같은 질환의 진단의 어려움은 질환을 정확하게 진단하게 하는데 중요한 차별적인 진단 가이드라인과 분석법을 만들게 했다. 다발근육염의 차별적 진단은 환자가 예를들어 HIV 감염, 편평태선, 다형광발진, 지루피부염, 전신 홍반성 루푸스, 건선, 접촉성 피부염, 아토피 피부염, 선모충증, 페니실라민, 비스테로이드성 항염증약제, 하이드록시유레아, 프라바스타틴, 클로피브레이트 및 이페칵(ipecac)을 포함하는 약물 영향 뿐만 아니라 일반적인 알코올 영향을 가지는지를 평가하는 것을 포함한다.

따라서, 본 발명은 피부근육염, SSc, 근육염, 전신 홍반성 루푸스 및 다른 자가면역 질환을 포함하는 밀접하게 관련된 자가면역 질환을 차별적으로 진단하기 위한 방법, 분석법 및 장비를 개발하는데 유용하고 바람직할 수 있다. 본 발명은 정확하게 기저 질환 또는 장애을 초기에 인지할 수 있기 때문에 질환의 진행을 감소시키거나 지연시키는데 도움이 될 수 있어 특히 필요하다. 예를 들어, 간질성 폐질환은 피부근육염 환자의 20-40%에서 발병하므로; 초기 인지는 향상된 환자 관리와 치료적 효과를 향상시키는데 기여할 수 있다.

본원에는 펩타이드 어레이에 결합하는 말초혈액 항체 결합의 차별적 패턴을 확인하는 방법, 분석법 및 장비를 기술한다. 어레이에 대한 환자 샘플의 차별적 결합은 환자의 질환 상태를 나타내어 주는 특정 결합 패턴 또는 특징이다. 이 결합 특징은 자가면역 질환 또는 장애로 다르게 구분되는 것으로 제한되지 않은 것을 포함하는 밀접하게 관련된 질환의 활성으로부터 질환의 활성을 정확하게 차별화할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 방법, 장비 및 분석법은 이에 반드시 한정되는 것은 아니지만 복합 결합조직 질환(MCTD), 미분화 결합조직 질환(UCTD), 전신성 홍반 루푸스(SLE), 다발근육염 및 국소 피부경화증 및 다른 자가면역 질환을 포함하는 다른 자가면역 질환들 사이에서 피부근육염(DM), 및 전신피부경화증(SSc) 및 전신 홍반성 루푸스를 차별적으로 구분하게 한다. 또한, 본원에 기술된 방법, 장비 및 시스템은 전신성 피부경화증 및 피부근육증에서의 질환의 진행을 나타내어 줄 수 있는, 간질성 폐질환 및 위전정부 혈관확장증과 같은 특정 내부 장기 합병증이 환자에게 있는지 또는 없는지를 구분해주는 특징이 될 수 있다.

본 발명의 방법은 샘플, 예를 들어 혈액 샘플에 있는 항체의 복합 혼합물이 펩타이드 어레이에 결합하는 것을 전제로 한다. 본원에 기술된 기술은 화학 서열 공간에서 디자인된 적어도 수천 개의 독특한 펩타이드 어레이를 사용하여 작은 샘플에서 추출한 항체 결합 레퍼토리의 광범위한 조사를 가능하게 한다. 다른 샘플은 어레이 펩타이드의 다른 세트나 조합에 결합하는 항체의 다른 혼합물을 포함한다. 이러한 다른 결합은 특이적 결합 패턴의 결과를 나타내며, 본원에서는 이를 면역특징(IS)이라고 일컫으며, 샘플을 얻은 대상자의 상태를 나타내어 준다. 일반적으로, 상태의 면역특징의 특성은 하나 이상의 기준 면역특징에 대해 상대적으로 결정되며, 이 기준 면역특징은 하나 이상의 기준 대상 그룹으로부터 얻어진 하나 이상의 서로 다른 기준 샘플 집합에서 얻어진 것이며, 각 그룹은 서로 다른 조건을 가지고 있다. 예를 들어, 실험 대상자로부터 획득한 면역특징은 예를 들어, 질병의 발생, 약물 치료, 환경 영향 등에 의해 유발될 수 있는 다른 조건을 가진 기준 대상자의 면역특징과 비교했을 때 실험 대상자의 상태를 확인하게 한다. 따라서, 기준 대상자로부터 실험 대상자의 면역특징을 비교함으로써 실험 대상자의 상태를 결정할 수 있다. 기준 그룹은 건강한 대상자 그룹이 될 수 있으며, 본원에 언급된 상태는 건강한 상태이다. 일반적으로 건강한 대상자는 테스트되는 대상의 상태를 가지고 있지 않은 사람이다.

어떤 실시양태에서, 본 발명의 방법은 차별적 진단법을 제공한다. 차별적 진단법은 공통 인자를 기반으로 한 진단을 제거하는 프로세스이다. 예를 들어, 차별적 진단은 다른 질환에 흔하게 나타나는 다른 질환으로 쉽게 구분할 수 없는 유사 질환을 구별한다. 이 질환은 종종 중첩 질환이라고도 불린다. 결론적으로, 이런 질환에 대한 정확한 진단은 확진하는데에 수개월 또는 수년이 걸릴 수 있다. 일반적으로 의료 기록 검토, 여러 신체 검사, 수많은 실험실 테스트, 그리고 종종 스캔이 필요하다. 전형적으로, 이러한 질병에 대한 바이오 마커는 이용할 수 없으며, 진단은 다른 질병들에 기인하는 정보가 있는 혈청 검사에 의존한다. 어떤 자가면역 질환의 차별적 진단은 특히 달성하기 어렵다. 진단하기 어려운 유사 질환의 예는 반드시 하기에 제한되는 것은 아니지만 류마티스 관절염을 동반하는 중접 징후를 포함하는 전신성 홍반 루푸스, 혼합 결합조직 질환, 쇼그렌 증후군, 레이노 증후군, 피부경화증 및 전신경화증과 같은 자가면역 질환이다. 예를 들어, 전신경화증(SSc)과 피부근육염은 피부의 임상 증상을 가질 수 있다. 다른 피부 및 결합조직 질환으로부터 이러한 질병 중 하나를 진단하는 것이 어렵기 때문에 정확한 진단을 위해 차별적 진단 가이드라인과 분석법이 중요해진다.

일 측면에서, 본 발명의 방법은 대상자에게 자가면역 질환이 있는지 없는지를 진단 또는 확인하기 위한 방법이며, 이 방법은 하기의 단계를 포함한다: a. 개별 환자 또는 대상자로부터 얻은 첫번째 생물학적 샘플을 펩타이드 어레이에 접촉시키는 단계; b. 상기 첫번째 생물학적 샘플에 존재하는 항체가 펩타이드 어레이 상에 결합하는지를 검출하여 첫번째 면역특징 프로파일을 얻는 단계; c. 자가면역 질환을 가진것으로 알려진 하나 이상의 개개인으로부터 얻은 대조군 샘플을 펩타이드 어레이에 접촉시키는 단계; d. 대조군 샘플에 있는 항체가 펩타이드 어레이에 결합하는 지를 검출하여 두번째 면역특징 프로파일을 얻는 단계; 및 e. 상기 첫번째 면역특징 프로파일을 두번째 면역특징 프로파일과 비교해서 환자 또는 대상자가 자가면역 질환 또는 장애가 있는지를 결정하는 단계.

일 양태에서, 자가면역 질환의 차별적 진단을 수행하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 대상자로부터 얻은 샘플을, 계내 합성된 적어도 10,000개의 다른 펩타이드를 포함하는 펩타이드 어레이에 접촉시키는 단계; (b) 상기 어레이 상에 있는 적어도 25개의 펩타이드에 대한, 상기 샘플에 존재하는 항체의 결합을 검출하여 결합 신호의 조합을 얻는 단계; 및 (c) 기준 결합 신호의 조합 중 하나 이상의 그룹과 상기 결합 신호의 조합을 비교하는 단계로서, 상기 기준 결합 신호의 조합의 그룹의 각각은 다른 질환을 가지고 있는 것으로 알려진 다수의 대상자로부터 얻어진 기준 결합 신호의 조합을 포함하며, 이로 인해 상기 차별적 진단을 할 수 있게 하며, 상기 방법의 수행능은 수신기 작동 특성(ROC) 곡선 하 면적(AUC)이 0.6보다 큰 것을 특징으로 한다. 어떤 실시양태에서, 다른 질환은 자가면역 질환이다. 일 실시양태에서, 진단은 피부경화증과 피부근육염 사이에서 수행될 수 있다. 다른 실시양태에서, 진단은 SSc와 다른 자가면역 질환의 조합 사이를 차별화한다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 복합 결합조직 질환, 미분화 결합조직 질환, 근육염, 다발 근육염, 전신 홍반성 루푸스 및 국소피부경화증을 포함하는 다른 질환을 가지는 기준 대상자 군으로부터 SSc를 가진 대상자를 차별화할 수 있게 한다.

다른 측면에서, 건강한 대상자 그룹으로부터 얻은 기준 결합 신호의 조합에 대해 자가면역 질환을 가지거나 가진 것으로 의심되는 환자로부터 얻은 면역특징 을 비교함으로써, 자가면역 질환의 존재를 확인하기 위한 방법이 제공된다. 어떤 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법은 자가면역 질환을 가지거나 가지지 않은 환자를 진단하기 위해 사용되며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: 자가면역 질환의 진단 방법, 상기 방법은 하기 단계를 포함함: (a) 대상자로부터 얻은 샘플을, 계내 합성된 적어도 10,000개의 다른 펩타이드를 포함하는 펩타이드 어레이에 접촉시키는 단계; (b) 상기 어레이 상에 있는 적어도 25개의 펩타이드에 대한, 상기 샘플에 존재하는 항체의 결합을 검출하여 결합 신호의 조합을 얻는 단계; 및 (c) 기준 결합 신호의 조합 중 하나 이상의 그룹과 상기 결합 신호의 조합을 비교하는 단계, 상기 기준 결합 신호의 조합의 그룹의 각각은 다양한 건강한 대상자로부터 얻은 결합 신호의 조합을 포함하며, 이로 인해 상기 대상자에서 자가면역 질환의 존재 또는 부재를 결정하는 단계. 일 실시양태에서, 자가면역 질환은 SSc이다. 다른 실시양태에서 자가면역 질환은 DM이다. 일 실시양태에서 상기 방법의 수행능은 ROC의 면적(AUC)이 0.6보다 큰 것을 특징으로 한다.

대상자 샘플, 즉 실험 샘플로부터 건강한 상태를 특징짓는 결합 정보는 어레이 펩타이드의 조합에 대해 샘플에 있는 항체 혼합물의 결합을 반영하는 검출가능하고 정량화 가능한 결합 신호의 조합으로 얻어진다. 실험 대상자의 샘플에 있는 항체의 결합 신호 조합은 알려진 상태를 가진 기준 대상자 그룹에 대해 공통적인 하나 이상의 결합 신호 조합과 비교하며, 이를 통해 다른 건강 상태를 식별할 수 있게 하는 결합 신호의 조합을 결정하게 한다.

결합 분석법

대상자의 IS는 어레이 펩타이드에 결합된 항체의 결합 패턴으로 식별된다. 펩타이드 어레이는 어레이에 고정되는 펩타이드에 대하여 혈청에 있는 항체 결합을 촉진하는 모든 적절한 조건하에서 혈청과 접촉될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 제공되는 결합 조건의 특정한 형태에 제한되지 않는다. 이러한 조건은 사용되는 어레이, 기질 유형, 기질에 배열된 펩타이드의 밀도, 결합 상호작용의 바람직한 변형성 및 결합 용액 내 경쟁 재료의 특성에 따라 달라진다. 바람직한 실시양태에서, 상기 조건은 주소지정가능 어레이로부터 결합하지 않은 항체를 제거하는 단계를 포함한다. 이러한 단계에 필요한 결정 및 이러한 단계를 위한 적당한 조건은 당업계의 수준 내에 있다.

모든 적절한 검출 기법은 혈청에 있는 항체가 어레이 상에 있는 펩타이드에 결합하는지 검출하여 질병 면역 프로파일을 생성하는 본 발명의 검출 방법에 사용될 수 있으며; 일 실시양태에서, 모든 검출가능한 라벨의 형태는 어레이상의 라벨 펩타이드로 사용될 수 있으며, 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 방사성동위원소 라벨, 형광 라벨, 발광 라벨 및 전기화학 라벨(즉, 서로 다른 전극 중간점 전위를 가진 리간드 라벨로서, 여기서 검출은 라벨의 전위를 감지하는 것을 포함함)을 포함한다. 또한, 결합한 항체가 검출될 수 있는데, 예를 들어 검출가능하게 라벨된 이차 항체를 사용하여 검출된다.

검출가능한 라벨로부터 신호를 검출하는 것은 당업자의 수준에서 용이하다. 예를 들어, 형광 어레이 판독기는 당업계에 잘 알려져 있으며, 기판 상에 전위를 기록하는 장비이다(전기화학적 검출을 위한 예, J. Wang (2000) Analytical Electrochemistry, Vol., 2nd ed., Wiley--VCH, New York). 또한 결합 상관성은 SPR 및 질량 분광분석기와 같은 다른 라벨-프리 방법을 사용해 검출될 수 있다. SPR은 분리 상수 및 분리 비율을 측정하는 것을 제공할 수 있다. 예를 들어 A-100 Biocore/GE 장비는 이런 형태의 분석에 적합하다. FLEX 칩은 동일한 기판 상에 400개 까지의 결합 반응을 하는데 사용될 수 있다.

또는, 어레이 상에서의 샘플의 항체와 펩타이드 간의 결합 상호작용을 경쟁 형식으로 검출할 수 있다. 결합의 경쟁적 저해제가 존재하거나 부재하는 샘플에 대한 어레이의 결합 프로파일의 차별성은 샘플의 특성화에 유용할 수 있다.

분류 알고리즘

항체 결합 신호 데이터의 분석, 즉 면역특징의 분석 및 이로부터 유도되는 진단은 다양한 컴퓨터 알고리즘 및 프로그램을 사용하여 수행된다. 라벨된 이차 항체에 의해 형성된 항체 결합 패턴은 예를 들어 레이저 스케너를 사용해 스캔된다. 스캐너에 의해 얻어진 결합 신호의 이미지는 GenePix Pro 8 소프트웨어(Molecular Devices, Santa Clara, CA)와 같은 소프트웨어를 이용해 가져오고 가공되며, 각 펩타이드에 대해 0 내지 65,000의 연속적인 값으로 표 형식의 정보를 제공한다. 표 형식의 데이터는 예를 들어 Agilent's GeneSpring 7.3.1(Agilent, Santa Clara, CA)를 사용해 가져오기와 통계학적 분석을 할 수 있다.

서로 다른 건강 상태를 가진 대상자에서 얻은 샘플들 사이에서 차별적 신호 패턴을 보이는 펩타이드들은 Welch-보정된 T 검정 또는 ANOVA와 같은 알려진 통계 테스트를 통해 확인할 수 있다. 예를 들어, 어레이 펩타이드에 대한 항체 결합 패턴은 테스트 환자, 즉 질환을 가진 대상자 군으로부터의 샘플 및 기준 대상자, 즉 건강한 환자 군으로부터의 샘플을 포함하는 샘플 세트에 대해 얻어질 수 있다. 두가지 상태 즉 사전에 지정된 가혹 레벨에서 실험군과 기준군을 구별하는 차별적 펩타이드를 선별하기 위해 결합 신호 정보가 비교되며, 통계적으로 분석된다. 대부분의 차별화 펩타이드 목록은 이의 p-값에 따라 펩타이드를 순위 매김으로써 얻어진다. 차별화 펩타이드는 적어도 10^-30, 적어도 10^-29, 적어도 10^-28, 적어도 10^-27, 적어도 10^-26, 적어도 10^-25, 적어도 10^-24, 적어도 10^-23, 적어도 10^-22, 적어도 10^-21, 적어도 10^-20, 적어도 10^-19, 적어도 10^-18, 적어도 10^-17, 적어도 10^-16, 적어도 10^-15, 적어도 10^-14, 적어도 10^-13, 적어도 10^-12, 적어도 10^-11, 적어도 10^-10, 적어도 10^-9, 적어도 10^-8, 적어도 10^-7, 적어도 10^-6, 또는 적어도 10^-5의 p-값을 갖는 것으로 순위가 매겨지며, 확인된다.

또는, 통계적 분석 후 선택된 식별 펩타이드의 결합 신호 정보를 기계 학습 알고리즘 및 본원에 기재된 기타 애플리케이션으로 가져와 원하는 정확도, 민감도 및 특이도로 항체 프로필 데이터를 분류하며, 질병의 존재 또는 부재, 질병의 심각도, 질병의 진행을 결정하는 모델을 얻을 수 있다. 기본 분류 알고리즘인 LDA(Linear Discriminant Analysis)는 두개 이상의 질환 군을 분류하기 위해 생체의료 데이터를 분석하는데 널리 사용된다. LDA는 예를 들어 알고리즘 분류에 사용될 수 있다. 좀 더 복잡한 분류 방법인 SVM(Support Vector Machine)은 수학 커널을 사용하여 하이퍼플레인으로 클래스를 구분하고 원래 예측 변수를 고차원 공간에 투영한다. 일반적인 커널은 선형, 다항식, S자형 또는 방사형 기본 함수을 포함한다. 당업계에 공지된 공통 분류자에 대한 비교 연구가 문헌에 개시되어 있다(Kukreja et al, BMC Bioinformatics. 2012; 13: 139). 항체 결합 프로필의 데이터를 기반으로 하는 데이터 분석 및 예측 모델링을 위한 기타 알고리즘은 Bayes Net, Logistic Regression, Simple Logistic, Multilayer Perceptron, KNearest neighbor, K Star, Attribute Selected Classifier(ACS), Classification via clustering, Classification via Regression, Hyper Pipes, Voting Feature Interval Classifier, J48(Java implementation of C4.5 algorithm), Random Trees 및 Random Forest를 포함한다.

어떤 실시양태에서, 항체 결합 프로파일은 샘플의 훈련 세트로부터 얻어지는데, 이 세트는 SVM 분석에 기초한 제거 알고리즘을 적용하여 가장 식별가능한 펩타이드의 조합을 확인하는 데 사용된다. 다양한 유의 수준에서 알고리즘의 정확도는 교차 검증에 의해 결정될 수 있다. 가능한 수의 식별 펩타이드에 대한 항체 결합 프로파일을 생성 및 평가하기 위해 다수의 식별 펩타이드를 사용하여 만든 복수 모델을 이용하여 최적의 성능을 가진 모델을 확인할 수 있다. 일 실시양태에서는 특정 질환-분류 모델을 훈련시키기 위해 적어도 25, 적어도 50, 적어도 75, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1000, 적어도 1500, 적어도 2000, 적어도 3000, 적어도 4000, 적어도 5000, 적어도 6000, 적어도 7000, 적어도 8000, 적어도 9000, 적어도 10,000, 적어도 11,000 적어도 12,000 적어도 13,000 적어도 14,000 적어도 15,000 적어도 16,000 적어도 17,000 적어도 18,000 적어도 19,000 적어도 20,000개 또는 그 이상의 차별적 펩타이드가 사용된다. 어떤 실시양태에서 어레이상에 있는 전체 펩타이드 수 중에서 적어도 0.00001%, 적어도 0.0001%, 적어도 0.0005%, 적어도 0.001%, 적어도 0.005%, 적어도 0.01%, 적어도 0.05%, 적어도 0.1%, 적어도 0.5%, 적어도 1.0%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%가 차별적 펩타이드이며, 대응되는 결합 신호 정보는 특정 상태-분류 모델을 훈련시키기 위해 사용된다. 일 실시양태에서, 어레이상의 모든 펩타이드로부터 얻어진 신호 정보는 상태-특이적 모델을 훈련시키기 위해 사용된다.

다른 수의 차별적 펩타이드를 포함하는 복합 모델이 생성될 수 있으며, 각 모델의 수행은 교차-검증 과정에 의해 평가될 수 있다. SVM 분류자는 훈련 샘플의 각 샘플을 교차 검증 그룹의 복수 표본 중 하나에 할당하여 교육 및 교차 검증할 수 있다. 예를 들어, 4배 교차 검증의 경우, 각 샘플은 실험군과 대조군, 즉 참조 샘플을 포함하는 4개의 교차 검증 그룹 중 하나에 할당되며; 교차 검증 그룹 중의 하나 예를 들어 그룹 1은 보류되고, SVM 분류자 모델은 그룹 2-4의 표본을 사용하여 훈련된다. 훈련 그룹에서 테스트 사례 및 기준 샘플을 구별하는 펩타이드가 p-값별로 분석되고 순위가 매겨지며; 상위 k 펩타이드가 SVM 모델의 예측 변수로 사용된다. 입력 예측 변수 수와 모델 성능 사이의 관계를 설명하고 과적응을 방지하기 위해, sub=loop는 k 범위, 예를 들어 25, 50, 100, 250, 1000, 200, 3000 상위 펩타이드 또는 그이상에 대해 반복된다. 예측, 즉 그룹 1에 있는 샘플의 분류는 그룹 2-4를 사용하여 생성된 모델을 고려하여 이루어진다. 4개 그룹 각각에 대한 모델을 생성하며, 실제 질환 샘플로부터의 신호 결합 데이터를 사용하는 4개 모델의 예측을 모두 사용하여 성과(AUC, 민감도 및/또는 특이도)를 계산한다. 교차 검증 단계는 적어도 100회 반복되며, 평균 성능은 신뢰 구간 예를 들어 95%를 기준으로 계산된다. 볼케이노 플롯, ROC(수신기 작동 특성) 곡선 및 입력 펩타이드 수에 따른 모델 성능을 사용하여 진단의 시각화를 할 수 있다.

식별 입력 펩타이드 세트(가장 구별되는 펩타이드 목록, k)에 대한 항체 결합 정보를 기반으로 한 최적의 모델이 선택되며, 이는 실험 세트의 질병 상태를 예측하는데 사용된다. 다른 분류기의 성능은 검증 세트 및 샘플의 시험 세트를 사용하여 결정되며, 정확도, 민감도, 특이도 및 F-측정과 같은 성능 특성은 가장 큰 성능을 가진 모델에서 얻을 수 있다. 다른 식별 펩타이드 세트는 다른 상태를 구별하는 것으로 확인된다. 따라서, 가장 식별가능한 입력 펩타이드 세트를 기반으로 하는 최적의 모델을 확립하여 환자의 건강 상태를 판단한다.

일 실시양태에서, 결과 분류 성과는 수신기 작동 특성(ROC) 곡선으로 제공될 수 있다. 분류의 특이도, 민감도 및 정확도 지표는 ROC 곡선 하 면적(AUC)에 의해 결정될 수 있다. 어떤 실시양태에서, 본 발명의 방법은 ROC 곡선 하 면적(AUC)이 0.6보다 큰 것을 특징으로 하는 방법 성능 이나 정확도를 가진 대상자의 건강상태를 결정/분류한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법의 수행능은 ROC 곡선 하 면적(AUC)이 0.70 초과, 0.80 초과, 0.90 초과, 0.95 초과인 것을 특징으로 하고, 방법의 수행능은 ROC 곡선 하 면적(AUC)이 0.97 초과, 방법의 수행능은 ROC 곡선 하 면적(AUC)이 0.99 초과인 것을 특징으로 한다. 다른 실시양태에서, 방법의 수행능은 ROC 곡선 하 면적(AUC)이 0.60 내지 0.70, 0.70 내지 0.79, 0.80 내지 0.89, 또는 0.90 내지 1.0의 범위인 것을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서 방법의 수행능은 민감도, 특이도, 예측값 또는 공산비(LR)의 용어로 표현된다.

어떤 실시양태에서, 본 발명의 방법은 적어도 60%의 민감도, 예를 들어 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 민감도를 가진다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 적어도 60%의 특이도, 예를 들어 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 특이도를 가진다.

특정 건강상태 또는 질병에 대한 최적의 분류모델을 수립하는데 있어서, 대상자의 건강상태를 결정하기 위해 본 발명의 방법을 적용한다. 샘플은 진단이 필요한 대상자로부터 얻는다. 샘플을 펩타이드 어레이에 접촉하고, 대상 샘플에 있는 항체가 어레이 상의 다양한 펩타이드에 결합함으로써 얻어지는 결합 신호는 스캐너를 사용하여 검출하며, 이 결과를 소프트웨어로 가져와 대상 샘플의 결합 항체에서 발생하는 결합 신호를 최적 분류 모델을 위해 이전에 확인한 식별 펩타이드와 비교한다. 모델의 식별 펩타이드와 샘플에서 얻은 대응되는 펩타이드의 결합 신호 간의 신호 차이를 설명하는 종합 점수가 제공되며, 질병의 존재 또는 부재를 나타내는 출력이 제공된다.

일 양태에서, 대상자의 상태는 하나 이상의 기준 그룹과 비교하여 결정되는데, 방법의 수행능은 ROC 곡선 하 면적(AUC)이 0.70 초과, 0.80 초과, 0.90 초과, 0.95 초과인 것을 특징으로 하며, 방법의 수행능은 ROC 곡선 하 면적(AUC)이 0.97 초과인 것을 특징으로 하며, 방법의 수행능은 ROC 곡선 하 면적(AUC)이 0.99 초과인 것을 특징으로 한다. 다른 실시양태에서 상기 방법의 수행능은 ROC 곡선 하 면적(AUC)이 0.60 내지 0.70, 0.70 내지 0.79, 0.80 내지 0.89, 또는 0.90 내지 1.0의 범위인 것을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 방법의 수행능은 민감도, 특이도, 예측값 또는 공산비(LRs)의 용어로 표현된다.

일 실시양태에서, 본 발명의 방법은 적어도 60%의 민감도, 예를 들어 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 민감도를 가진다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 적어도 60%의 특이도, 예를 들어 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 특이도를 가진다.

식별 펩타이드는 하나 이상의 특정 아미노산의 압축 및/또는 하나 이상의 서열 모티프의 압축으로 특징지어질 수 있다. 아미노산 및 모티프 내용물의 압축은 어레이 라이브러리에 있는 모든 펩타이드의 해당 총 아미노산 및 모티프 내용물에 비례한다. 해당 목록이 100 펩타이드 길이 이하인 것을 제외하고 유의성이 있는 펩타이드 목록으로부터 압축된 모티프를 확인하였으며, 이 경우 Welch의 t 검정과 관련된 p-값을 기반으로 했을때 상위 500 펩타이드가 확인되었다. 이 펩타이드 목록에 있는 다른 n-mer는 어떤것이 압축되든지 간에 전체 라이브러리에서 동일한 크기의 n-mer와 비교하여 압축되는지를 결정하였다. 압축 배수는 목록에서 발생하는 모티프(예: ABCD)의 횟수를 라이브러리에서 발생하는 모티프(ABCD)의 수로 나눈 값으로 계산한다. 이 값은 라이브러리에 나타나는 모티프 유형(예: 테트라머)의 상대적 횟수(즉, 목록에 있는 모든 테트라머의 총 수를 라이브러리의 총 테트라머 수로 나눈 값)로 더 나누어진다. 이 압축 배수(E) 계산은 하기 식으로 나타낼 수 있다:

E=(m/M)/(t/T)

상기 식에서 (m)은 식별 펩타이드 목록의 일부로 모티프가 발생하는 횟수; (M)은 라이브러리에서 모티프가 발생하는 총 횟수; (t)는 목록에 모티프 형태가 나타나는 횟수; 및 (T)는 라이브러리에서 모티프가 발생하는 횟수이다. 또한 압축 배수는 압축 백분율로 보고될 수 있으며, 즉, 100을 곱하기 한 "압축 값"이다.

어떤 실시양태에서, 본원에 개시된 방법과 어레이를 사용하여 대상자에 있는 자가면역 질환을 진단 또는 검출하는데 있어서, 기준 건강 대상자로부터 자가면역 질환을 가진 대상자를 구별하게 하는 면역특징 결합 패턴의 식별 펩타이드는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 다른 아미노산으로 압축된다. 아미노산의 압축은 자가면역 질환에 대한 면역특징을 포함하는 펩타이드에 대한 적어도 한개의 아미노산에서 적어도 100%, 적어도 125%, 적어도 150%, 적어도 175%, 적어도 200%, 적어도 225%, 적어도 250%, 적어도 275%, 적어도 300%, 적어도 350%, 적어도 400%, 적어도 450%, 또는 적어도 500%로 될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 자가면역 질환은 SSc 또는 DM이다. 일 실시양태에서 건강한 기준 대상자로부터 SSc를 구별하는 식별 펩타이드는 하나 이상의 티로신, 리신, 아르기닌, 페닐알라닌, 세린, 트립토판, 글리신 및 알라닌으로 압축된다. 어떤 실시양태에서, 건강한 기준 대상자로부터 DM을 구별하는 식별 펩타이드는 하나 이상의 티로신, 트립토판, 세린, 글리신, 아스파르트산 및 페닐알라닌으로 압축된다.

일 실시양태에서, 본원에 개시된 방법과 어레이를 사용하여 대상자에 있는 자가면역 질환을 진단 또는 검출하기 위한 면역특징 결합 패턴의 식별 펩타이드는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 다른 서열 모티프로 압축된다. 서열 모티프의 압축은 자가면역 질환에 대한 면역특징을 포함하는 펩타이드에 대한 적어도 한개의 모티프에서 적어도 100%, 적어도 125%, 적어도 150%, 적어도 175%, 적어도 200%, 적어도 225%, 적어도 250%, 적어도 275%, 적어도 300%, 적어도 350%, 적어도 400%, 적어도 450%, 또는 적어도 500%로 될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 자가면역 질환은 SSc 또는 DM이다. 어떤 실시양태에서, 건강한 기준 대상자로부터 SSc를 구별하는 식별 펩타이드는 도 5a에 제공되는 하나 이상의 모티프로 압축된다. 어떤 실시양태에서, 건강한 기준 대상자로부터 DM을 구별하는 식별 펩타이드는 도 17a에 제공되는 하나 이상의 모티프로 압축된다.

일 실시양태에서, 본원에 개시된 방법과 어레이를 사용하여 대상자에 있는 자가면역 질환을 진단 또는 검출하기 위한 면역특징 결합 패턴의 식별 펩타이드는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 다른 아미노산으로 압축된다. 아미노산의 압축은 자가면역 질환에 대한 면역특징을 포함하는 펩타이드에 대한 적어도 한개의 아미노산에서 적어도 100%, 적어도 125%, 적어도 150%, 적어도 175%, 적어도 200%, 적어도 225%, 적어도 250%, 적어도 275%, 적어도 300%, 적어도 350%, 적어도 400%, 적어도 450%, 또는 적어도 500%로 될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 차별적 진단은 SSc와 DM 사이에서 수행한다. 일 실시양태에서 DM 기준 대상자로부터 SSc를 구별하는 식별 펩타이드는 하나 이상의 세린, 글리신, 티로신, 아르기닌, 알라닌, 글루타민 및 발린으로 압축된다.

일 실시양태에서, 본원에 개시된 방법과 어레이를 사용하여 대상자에 있는 자가면역 질환을 차별적으로 진단하기 위한 면역특징 결합 패턴의 식별 펩타이드는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 다른 서열 모티프로 압축된다. 서열 모티프의 압축은 자가면역 질환에 대한 면역특징을 포함하는 펩타이드에 대한 적어도 한개의 모티프에서 적어도 100%, 적어도 125%, 적어도 150%, 적어도 175%, 적어도 200%, 적어도 225%, 적어도 250%, 적어도 275%, 적어도 300%, 적어도 350%, 적어도 400%, 적어도 450%, 또는 적어도 500%로 될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 자가면역 질환은 SSc 또는 DM이다. 일 실시양태에서, DM으로부터 SSc를 구별하는 식별 펩타이드는 도 13a에 제공되는 하나 이상의 모티프로 압축된다.

어떤 실시양태에서, 차별적 진단은 다수의 다른 자가면역 질환을 가진 기준 대상자 그룹에 비교해서 대상자에 대해 수행할 수 있다. 일 실시양태에서 차별적 진단은 복합 결합조직 질환(MCTD), 미분화 결합조직 질환(UCTD), 근육염, 다발근육염, 전신 홍반성 루푸스 및 국소피부경화증을 포함하는 다른 자가면역 질환을 가진 대상자 군과 비교해서 수행할 수 있다. 본원에 개시된 방법과 어레이를 사용하여 대상자에 있는 자가면역 질환을 차별적으로 진단하기 위한 면역특징 결합 패턴의 식별 펩타이드는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 다른 아미노산으로 압축된다. 아미노산의 압축은 자가면역 질환에 대한 면역특징을 포함하는 펩타이드에 대한 적어도 한개의 아미노산에서 적어도 100%, 적어도 125%, 적어도 150%, 적어도 175%, 적어도 200%, 적어도 225%, 적어도 250%, 적어도 275%, 적어도 300%, 적어도 350%, 적어도 400%, 적어도 450%, 또는 적어도 500%로 될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 자가면역 질환은 SSc 또는 DM이다. 다양한 다른 질환을 가지는 기준 대상자로부터 SSc를 가진 대상자를 구별하는 식별 펩타이드는 하나 이상의 아스파르트산, 글루탐산, 프롤린, 발린, 글리신 및 세린으로 압축된다.

기준 대상자로부터 DM을 가진 대상자를 구별하는 식별 펩타이드는 하나 이상의 리신, 히스티딘, 세린, 아르기닌, 글루탐산, 알라닌 및 글리신으로 압축된다.

어떤 양태에서, 본원에 개시된 방법과 어레이를 사용하여 대상자에 있는 자가면역 질환을 차별적으로 진단하기 위한 면역특징 결합 패턴의 식별 펩타이드는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 다른 서열 모티프로 압축된다. 서열 모티프의 압축은 자가면역 질환에 대한 면역특징을 포함하는 펩타이드에 대한 적어도 한개의 아미노산에서 적어도 100%, 적어도 125%, 적어도 150%, 적어도 175%, 적어도 200%, 적어도 225%, 적어도 250%, 적어도 275%, 적어도 300%, 적어도 350%, 적어도 400%, 적어도 450% 또는 적어도 500%로 될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 자가면역 질환은 SSc 또는 DM이다. 일 실시양태에서, 다양한 다른 자가면역 질환 중의 하나를 가지는 기준 대상자 군으로부터 SSc를 구별하는 식별 펩타이드는 도 7a에 제공되는 하나 이상의 모티프로 압축된다. 일 실시양태에서, 다양한 다른 자가면역 질환 중의 하나를 가지는 기준 대상자 군으로부터 DM을 구별하는 식별 펩타이드는 도 19a에 제공되는 하나 이상의 모티프로 압축된다.

기준, 즉 건강한 면역 프로파일에 대하여 질환 면역 프로파일을 비교하고 펩타이드에 차별적으로 결합한 것을 확인하는 것은, 적어도 일부 식별 펩타이드가 기준과 비교하여 질환 면역 프로파일에 있는 항체에 더 잘 결합하는지; 및/또는 적어도 일부 식별 펩타이드가 기준과 비교하여 질환 면역 프로파일에 있는 항체에 더 적게 결합하는지를 보여줄수 있다. 따라서, 일 실시양태에서, 본 발명의 방법은 자가면역 질환을 진단 또는 검출하는 방법이며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 환자 또는 대상자로부터의 첫번째 생물학적 샘플을 펩타이드 어레이에 접촉시키는 단계; b) 펩타이드 어레이와 상기 첫번째 생물학적 샘플에 존재하는 항체의 결합을 검출하여 첫번째 면역특징 프로파일을 얻는 단계; c) 자가면역 질환 또는 장애를 가진것으로 알려진 개개인으로부터 얻은 대조군 샘플을 펩타이드 어레이에 접촉시키는 단계; d) 펩타이드 어레이와 대조군 샘플에 있는 항체의 결합을 검출하여 두번째 면역특징 프로파일을 얻는 단계; 및 e) 상기 첫번째 면역특징 프로파일과 두번째 면역특징 프로파일을 비교하고, 두번째 면역특징 프로파일과 비교된 첫번째 면역특징 프로파일에서 대략 항체가 결합하는 차별적으로 결합된 펩타이드를 확인하는 단계; 및 f) 환자 또는 대상자가 자가면역 질환 또는 장애가 있는지 여부를 결정하는 단계.

더 가벼운 형태의 피부경화증은 일반적으로 피부 부위, 대게 손가락 및/또는 얼굴이 두꺼워지는 것으로 제한된다. 피부경화증이 있는 모든 사람은 피부와 조직 아래에 칼슘이 쌓이는 석회증, 레이노 증후군, 식도 운동장애, 손발가락경화증 및 모세관 확장증을 포함하는 다양한 형태의 증상을 가질 수 있다. 그러나, 피부경화증은 더 많은 부위와 관련된 확산성 질환으로 진행될 수 있으며, 피부를 두꺼워지게 하는데, 상기 피부는 팔, 다리, 그리고 몸통의 피부를 포함할 수 있다. 꽉 끼는 피부는 손가락, 손, 그리고 다른 관절들을 구부리기 어렵게 만든다. 때때로 관절, 힘줄, 근육의 염증이 있다. 얼굴의 꽉 끼는 피부는 좋은 치과 치료에 있어서 매우 중요한 사람의 입 크기를 줄이게 할 수 있다. 피부는 색소를 잃거나 얻을 수 있어서; 밝거나 어두운 피부 영역을 만든다. 일부 사람들은 피부 손상으로 인해 팔다리에 털이 빠지고 땀이 줄며 건조한 피부를 갖게 된다. 더욱 중요한 것은 확산된 피부경화증은 위장관, 심장, 폐 또는 신장 같은 내부 장기에도 영향을 줄 수 있다는 것이다. 장기 관련 정도는 매우 다양해서 어떤 장기는 전혀 영향을 받지않고 다른 환자 장기는 심각하게 영향을 받을 수 있다. 또한, 식별 펩타이드는 질환, 예를 들어 자가면역 질환의 진행을 반영하는 다른 상태를 구별할 수 있다. 예를 들어, SSc의 진행은 간질성 폐질환(ILD)의 소견을 나타낼 수 있다. 어떤 경우, SSc는 위전정부 혈관확장증(GAVE)의 임상 증상으로 진행될 수 있다. 다른 경우, SSc는 신장 관련 소견으로 진행될 수 있다. 또한, ILD와 GAVE와 관련된 합병증은 다른 유사 자가면역 질환 즉 DM에서 발생할 수 있다.

다른 측면에서 본 발명의 방법은 대상자에 있는 자가면역 질환의 상태 또는 진행을 결정하는 방법이며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a. 개별 환자 또는 자가면역 질환으로 알려진 대상자로부터 얻은 첫번째 생물학적 샘플을 펩타이드 어레이에 접촉시키는 단계; b. 펩타이드 어레이와 상기 첫번째 생물학적 샘플에 존재하는 항체의 결합을 검출하여 첫번째 면역특징 프로파일을 얻는 단계; c. 자가면역 질환 또는 장애를 가진 것으로 알려진 하나 이상의 개개인으로부터 얻은 대조군 샘플을 펩타이드 어레이에 접촉시키는 단계; d. 펩타이드 어레이와 대조군 샘플에 있는 항체의 결합을 검출하여 두번째 면역특징 프로파일을 얻는 단계; 및 e. 상기 첫번째 면역특징 프로파일과 두번째 면역특징 프로파일을 비교하여 환자 또는 자가면역 질환 또는 장애를 가진 대상자가 질병 상태인지 진행중인지를 결정하는 단계.

일 실시양태에서, 본 발명에 제공되는 분석법, 방법 및 장비는 자가면역 질환을 가진 것으로 알려진 대상자에서 질환의 진행을 결정할 수 있다. 본 발명의 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 대상자로부터 얻은 샘플을, 계내 합성된 적어도 10,000개의 다른 펩타이드를 포함하는 펩타이드 어레이에 접촉시키는 단계; (b) 상기 어레이 상에 있는 적어도 25개의 펩타이드에 대한, 상기 샘플에 존재하는 항체의 결합을 검출하여 결합 신호의 첫번째 조합을 얻는 단계; 및 (c) 적어도 하나의 기준 결합 신호의 두번째 조합과 상기 결합 신호의 첫번째 조합을 비교하는 단계로서, 상기 기준 결합 신호의 두번째 조합은 자가 면역 질환의 진행을 가리키는 임상 증상을 가진 복수의 대상자를 포함하는 복수의 기준 그룹으로부터 얻은 결합 신호의 조합을 포함하는 기준 그룹으로부터 얻어지는 결합 신호의 조합을 포함하며, 이로 인해 상기 차별적 진단을 가능하게 하고, 여기서 방법의 수행능은 ROC의 면적(AUC)이 0.6보다 큰 것을 특징으로 한다. 일 실시양태에서, 질환의 진행은 ILD를 동반하는 SSc를 가지는 대상자에서 결정한다. 다른 실시양태에서, 진행은 ILD를 동반하는 SSc를 가지는 대상자에서 결정한다. 또 다른 실시양태에서, 진행은 ILD를 동반하는 DM을 가지는 대상자에서 결정한다.

어떤 실시양태에서, 본원에 개시된 방법과 어레이를 사용하여 대상자에 있는 자가면역 질환의 진행을 결정하기 위한 면역특징 결합 패턴의 식별 펩타이드는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 다른 아미노산으로 압축된다. 아미노산의 압축은 자가면역 질환에 대한 면역특징을 포함하는 펩타이드에 대한 적어도 한개의 아미노산에서 적어도 100%, 적어도 125%, 적어도 150%, 적어도 175%, 적어도 200%, 적어도 225%, 적어도 250%, 적어도 275%, 적어도 300%, 적어도 350%, 적어도 400%, 적어도 450%, 또는 적어도 500%로 될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 질환의 진행의 결정은 SSc가 있는 대상자 사이에서 수행하며, 진행도는 ILD 및/또는 GAVE가 있는 대상자에서 결정한다. 어떤 실시양태에서, ILD가 없는 SSc를 가진 대상자와 비교하여 ILD가 있는 SSc를 가진 대상자에서의 질환 진행을 결정하는 식별 펩타이드는 하나 이상의 프롤린, 아르기닌, 리신, 히스티딘 및 아스파르트산으로 압축된다. 다른 실시양태에서, GAVE가 없는 SSc를 가진 대상자와 비교하여 GAVE가 있는 SSc를 가진 대상자에서의 질환 진행을 결정하는 식별 펩타이드는 하나 이상의 아르기닌, 티로신, 세린, 히스티딘, 리신 및 페닐알라닌으로 압축된다.

일 실시양태에서, 본원에 개시된 방법과 어레이를 사용하여 대상자에 있는 자가면역 질환의 진행을 결정하기 위한 면역특징 결합 패턴의 식별 펩타이드는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 다른 서열 모티프로 압축된다. 서열 모티프의 압축은 자가면역 질환에 대한 면역특징을 포함하는 펩타이드에 대한 적어도 한개의 모티프에서 적어도 100%, 적어도 125%, 적어도 150%, 적어도 175%, 적어도 200%, 적어도 225%, 적어도 250%, 적어도 275%, 적어도 300%, 적어도 350%, 적어도 400%, 적어도 450%, 또는 적어도 500%로 될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 자가면역 질환은 SSc 또는 DM이다. 바람직한 실시양태에서, 질환의 진행의 결정은 SSc가 있는 대상자 사이에서 수행하며, 진행도는 ILD 및/또는 GAVE가 있는 대상자에서 결정한다. 어떤 실시양태에서, SSc 및 ILD를 가진 대상자를 ILD를 동반하지 않는 SSc를 가진 대상자와 비교하여 질환의 진행도를 결정하는 식별 펩타이드는 도 15a에 제공되는 하나 이상의 모티프로 압축된다. 다른 실시양태에서 SSc 및 GAVE를 가진 대상자를 GAVE를 동반하지 않는 SSc를 가진 대상자와 비교하여 질환의 진행도를 결정하는 식별 펩타이드는 도 11a에 제공되는 하나 이상의 모티프로 압축된다.

어떤 실시양태에서, 본원에 개시된 방법과 어레이를 사용하여 대상자에 있는 자가면역 질환의 진행을 결정하기 위한 면역특징 결합 패턴의 식별 펩타이드는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 다른 아미노산으로 압축된다. 아미노산의 압축은 자가면역 질환에 대한 면역특징을 포함하는 펩타이드에 대한 적어도 한개의 아미노산에서 적어도 100%, 적어도 125%, 적어도 150%, 적어도 175%, 적어도 200%, 적어도 225%, 적어도 250%, 적어도 275%, 적어도 300%, 적어도 350%, 적어도 400%, 적어도 450%, 또는 적어도 500%로 될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 질환의 진행의 결정은 신장 위기가 없는 SSc가 있는 대상자 사이에서 수행하며, 진행도는 신장 위기가 있는 SSc가 있는 대상자에서 결정한다. 어떤 실시양태에서, 신장 위기가 있는 SSc를 가진 대상자를 신장 위기가 없는 SSc를 가진 대상자와 비교하여 질환의 진행도를 결정하는 식별 펩타이드는 하나 이상의 프롤린, 아스파르트산 및 글루탐산으로 압축된다.

일 실시양태에서, 본원에 개시된 방법과 어레이를 사용하여 대상자에 있는 자가면역 질환의 진행을 결정하기 위한 면역특징 결합 패턴의 식별 펩타이드는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 다른 서열 모티프로 압축된다. 서열 모티프의 압축은 자가면역 질환에 대한 면역특징을 포함하는 펩타이드에 대한 적어도 한개의 서열 모티프에서 적어도 100%, 적어도 125%, 적어도 150%, 적어도 175%, 적어도 200%, 적어도 225%, 적어도 250%, 적어도 275%, 적어도 300%, 적어도 350%, 적어도 400%, 적어도 450%, 또는 적어도 500%로 될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 질환의 진행의 결정은 신장 위기가 없는 SSc가 있는 대상자 사이에서 수행하며, 진행도는 신장 위기가 있는 SSc가 있는 대상자에서 결정한다. 어떤 실시양태에서, 신장 위기가 있는 SSc를 가진 대상자를 신장 위기가 없는 SSc를 가진 대상자와 비교하여 질환의 진행도를 결정하는 식별 펩타이드는 도 9a에 제공되는 하나 이상의 모티프로 압축된다.

일 실시양태에서, 본원에 개시된 방법과 어레이를 사용하여 대상자에 있는 자가면역 질환의 진행을 결정하기 위한 면역특징 결합 패턴의 식별 펩타이드는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 다른 아미노산으로 압축된다. 아미노산의 압축은 자가면역 질환에 대한 면역특징을 포함하는 펩타이드에 대한 적어도 한개의 아미노산에서 적어도 100%, 적어도 125%, 적어도 150%, 적어도 175%, 적어도 200%, 적어도 225%, 적어도 250%, 적어도 275%, 적어도 300%, 적어도 350%, 적어도 400%, 적어도 450%, 또는 적어도 500%로 될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 질환의 진행의 결정은 DM을 가진 대상자 사이에서 수행하며, 진행도는 ILD 및/또는 GAVE를 동반하는 대상자에서 결정한다. 어떤 실시양태에서, ILD를 동반하는 DM을 가진 대상자를 ILD를 동반하지 않는 DM을 가진 대상자와 비교하여 질환의 진행도를 결정하는 식별 펩타이드는 하나 이상의 프롤린, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 글리신 및 글루타민으로 압축된다.

일 실시양태에서, 본원에 개시된 방법과 어레이를 사용하여 대상자에 있는 자가면역 질환의 진행을 결정하기 위한 면역특징 결합 패턴의 식별 펩타이드는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 다른 서열 모티프로 압축된다. 서열 모티프의 압축은 자가면역 질환에 대한 면역특징을 포함하는 펩타이드에 대한 적어도 한개의 모티프에서 적어도 100%, 적어도 125%, 적어도 150%, 적어도 175%, 적어도 200%, 적어도 225%, 적어도 250%, 적어도 275%, 적어도 300%, 적어도 350%, 적어도 400%, 적어도 450%, 또는 적어도 500%로 될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 질환의 진행의 결정은 DM을 가진 대상자 사이에서 수행하며, 진행도는 ILD 및/또는 GAVE를 동반하는 대상자에서 결정한다. 어떤 실시양태에서, ILD를 동반하는 DM을 가진 대상자를 ILD를 동반하지 않는 DM을 가진 대상자와 비교하여 질환의 진행도를 결정하는 식별 펩타이드는 도 21a에서 제공하는 하나 이상의 모티프로 압축된다.

본원에는 질환의 진행을 반영하는 기준에 대하여 질환 면역 프로파일, 즉 장기 관련성을 가지는 대상자의 질환 면역 프로파일을 비교하여 자가면역 질환을 진단하고 차별적으로 진단하는 방법, 및 기준과 비교하였을 때 질환 면역 프로파일에 있는 항체에 더 많이 결합하는 최소한의 식별 펩타이드; 및/또는 기준과 비교하였을 때 질환 면역 프로파일에 있는 항체에 더 적게 결합한 최소한의 식별 펩타이드를 보여줄 수 있는 차별적으로 결합한 펩타이드를 확인하는 방법이 개시되어 있다. 일 실시양태에서, 본 발명의 방법은 자가면역 질환의 상태 또는 진행을 결정하는 방법이며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 자가면역 질환 또는 장애를 가진 환자 또는 대상자로부터의 첫번째 생물학적 샘플을 펩타이드 어레이에 접촉시키는 단계; b) 펩타이드 어레이와 첫번째 생물학적 샘플에 있는 항체의 결합을 검출하여 첫번째 면역특징 프로파일을 얻는 단계; c) 자가면역 질환 또는 장애의 단계 또는 상태인 것으로 알려진 개개인으로부터 얻은 대조군 샘플로 펩타이드 어레이를 접촉시키는 단계; d) 펩타이드 어레이와 대조군 샘플에 있는 항체의 결합을 검출하여 두번째 면역특징 프로파일을 얻는 단계; e) 두번째 면역특징 프로파일과 상기 첫번째 면역특징 프로파일을 비교하고, 두번째 면역특징 프로파일과 비교된 첫번째 면역특징 프로파일에 있는 더 적거나 더 많이 결합한 항체에 차별적으로 결합한 펩타이드를 확인하는 단계; 및 f) 자가면역 질환 또는 장애를 가진 환자 또는 대상자의 질환 상태 또는 진행을 결정하는 단계.

자가면역 질환

본원에 제공되는 분석법, 방법 및 장비는 모든 자가면역 질환을 진단하는데 이용될 수 있으며, 이는 다른 자가면역 질환, 비-자가면역 유사 질환 뿐만 아니라 다른 중첩 질환에 대하여 자가면역 질환을 차별적으로 진단하고, 자가면역 질환의 진행을 결정하고, 자가면역 질환의 활성을 점수로 매기며, 자가면역 질환의 치료를 위한 치료법으로써 평가하기 위한 후보 표적을 확인하며, 치료에 대한 예측된 반응을 바탕으로 임상 실험에서 환자를 계층화하는 것을 제공한다. 본 발명의 분석법, 방법 및 장비에 따라 진단되고, 모니터되며, 예방되고, 치료되며 또는 표적 치료법을 확인하는데 사용하기 위한 자가면역 질환 또는 장애의 예는 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 다음의 질환을 포함한다: 전신성 홍반 루푸스(SLE) (예, 전신성 홍반 루푸스, 원반모양 루푸스, 약물-유도된 루푸스, 신생아 루푸스), 류마티스 관절염, 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증(MS), 염증성 창자병(IBD), 예를 들어 크론병, 궤양 대장염, 림프성 대장염, 허혈 대장염, 전환 대장염, 베체트 증후군, 염증성 대장염, 부정형 대장염, 간질성 방광염, 건성성 관절염, 피부경화증(SSc), 제1형 당뇨병, 애디슨 씨병, 무감마글로불린혈증, 원형탈모증, 아밀로이드증, 강직척추염, 항-GBM/항-TBM 신장염, 항인지질 증후군(APS), 자가면역성 간염, 자가면역성 내이 질환(AIED), 축삭 및 신경성 신경병(AMAN), 베체트병, 물집유사 물집증, 캐슬맨병(CD), 소아 지방변증, 샤가스병, 만성 염증성 탈수초 다발신경병증(CIDP), 만성 재발성 다초점 골수염(CRMO), 만성폐쇄성폐질환(COPD), 초그-스토라우스, 흉터유사물집증/양성 점막 물집증, 코간증후군, 저온응집병, 선천성 심장병, 콕사키 심근염, CREST 증후군, 크론병, 포진성 피부염, 피부근육염, 데빅병(시신경척수염), 원반모양 루푸스, 드레슬러 증후군, 자궁내막증, 호산구식도염(EoE), 호산구 근막염, 결절홍반, 본태성 혼합한랭글로불린혈증, 에반스 증후군, 섬유근통, 섬유화폐포염, 거대세포 동맥염(측두동맥염), 거대세포 심근염, 사구체신염, 굿페스쳐 증후군, 예를들어 신장, 폐, 간 또는 심장 이식 거부반응인 이식편대 숙주질환(GVHD), 다발혈관염을 동반한 육아종증, 그레이브스병, 길랭-바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 용혈빈혈, 헤노흐-쇤라인자색반(HSP), 임신헤르페스 또는 임신유사물집증(PG), 저감마글로불린혈증, IgA 신장병증, IgG4 연관 경화병, 봉입체근육염(IBM), 간질성방광염(IC), 소아관절염, 소아근육염(JM), 카와사키병, 람베르트-이튼 증후군, 백혈구파괴혈관염, 편평태선, 경화태선, 목질결막염, 선형 IgA 질환(LAD), 만성 라임병, 메니에르병, 현미경다발혈관염 (MPA), 혼합결합조직질환(MCTD), 잠식성각막궤양, Mucha-Habermann 병, 중증근육무력증, 근육염, 기면증, 시신경척수염, 호중성백혈구감소증, 눈 흉터유사물집증, 시신경염, 재발류머티즘(PR), PANDAS(스트렙토코커스 관련된 소아 자가면역 신경정신병 질환), 신생물딸림 소뇌변성(PCD), 발작성야간혈색뇨(PNH), 안면편측 위축증, 주변포도막염(말초 포도막염), Parsonnage-터너증후군, 천포창, 말초신경병증, 정맥주위성 뇌척수염, 악성빈혈(PA), POEMS 증후군(다발성신경병증, 장기종대, 내분비병증, 단일클론성 감마글로불린병증, 피부변화), 결절다발동맥염, 류마티스성 다발성 근육통, 다발근육염, 심근경색후증후군, 심막절개술후증후군, 원발쓸개관간경화증, 원발 경화 쓸개관염, 프로게스테론 피부염, 건선, 순수적혈구 무형성증(PRCA), 괴저성농피증, 레이노현상, 반응성 관절염, 반사교감신경이상증, 라이터 증후군, 재귀다발연골염, 하지불안증후군(RLS), 복막뒤 섬유증, 류마티스열, 류마티스관절염(RA), 사코이드증, 슈미드 증후군, 공막염, 고환 및 정액 자가면역, 강직인간 증후군(SPS), 아급성세균심내막염(SBE), 수삭 증후군, 교감눈염증(SO), 타까야수동맥염, 측두동맥염/거대세포동맥염, 저혈소판자색반병(TTP), 톨로사헌트 증후군(THS), 횡단척수염, 궤양대장염(UC), 미분화 결합조직 질환(UCTD), 포도막염, 혈관염, 백반증 및/또는 베게너 육아종증(현재는 다발혈관염을 가지는 육아종증의 의미임, GPA).

샘플

본 발명에 제공되는 방법에 따라 사용되는 샘플은 모든 생물학적 샘플이 될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 항체를 포함하는 생물학적 액체 샘플이 될 수 있다. 적합한 생물학적 액체 샘플은 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 혈액, 혈장, 혈청, 땀, 눈물, 가래, 소변, 대변액, 귀 흐름액, 림프, 타액, 뇌척수액, 황폐액(ravages), 골수 부유액, 질액, 경경추 경사 세척액, 윤활액, 방수, 양수, 귀지, 모유, 기관지폐포 세척액, 뇌액, 낭종액, 흉막 및 복막액, 심낭액, 복수, 젖, 췌장액, 호흡 분비액, 소화관 및 비뇨생식기관, 양수액, 젖 및 류코포레시스(leukophoresis) 샘플을 포함한다. 또한, 생물학적 샘플은 배반포구멍, 재대혈, 또는 태아 또는 모계가 기원인 모체 순환액이 될 수 있다. 어떤 실시양태에서, 샘플은 비침습성 방법에 의해 쉽게 얻어지는 샘플, 예를 들어 혈액, 혈장, 혈청, 땀, 눈물, 가래, 소변, 대변액, 귀 흐름액 또는 타액이다. 어떤 실시양태에서 샘플은 말초혈액 샘플 또는 말초혈액 샘플로부터의 혈장 또는 혈청 분획이다. 본원에 사용된 용어 "혈액", "혈장" 및 "혈청"은 그 자체 분획 또는 가공된 분핵을 포함하는 것으로 표현된다.

최소한의 침습성의 접근가능성 및 이의 쉬운 이용가능성으로 인해, 혈액이 바람직하며, 인체의 유액은 임상적 방법으로 측정되며 수집된다. 또한, 혈액은 모든 신체 조직을 기능하고 이의 조성은 개인의 전반적인 생리학적 지표로서 관련이 있다. 일 실시양태에서, 면역특징/항체 결합 프로파일을 얻기 위해 사용되는 생물학적 샘플은 혈액 샘플이다. 다른 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈장 샘플이다. 또 다른 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈청 샘플이다. 또 다른 실시양태에서, 생물학적 샘플은 건조된 혈액 샘플이다. 생물학적 샘플은 항체 결합 프로파일의 분석을 수행하지 않은 사람 및/또는 펩타이드 어레이에 대해 결합 측정을 수행한 사람과 같은 제3자를 통해 얻어질 수 있다. 예를 들어, 샘플은 샘플이 추출된 대상의 임상의사, 의사 또는 기타 의료 관리자를 통해 획득할 수 있다. 또는, 생물학적 샘플은 펩타이드 어레이에 대하여 샘플 결합 측정을 수행한 사람 및/또는 항체 결합 프로파일/IS를 분석한 유사한 사람에 의해 획득할 수 있다. 측정되는 생물학적 샘플은 저장(예, 냉동)되거나 보존적 상태하에서 다르게 보존될 수 있다.

용어 "환자 샘플" 및 "대상자 샘플"은 본원에서 환자 즉 의료적 치료, 관리 또는 치료를 받는 사람으로부터 얻어진 샘플, 즉 생물학적 유액 샘플을 의미하는 것으로 호환적으로 사용된다. 환자 샘플은 본원에 기술된 모든 샘플이 될 수 있다. 어떤 실시양태에서, 환자 샘플은 비침습적 방법에 의해 얻어진 것, 즉 말초 혈액 샘플이다.

바이오유체 샘플에 순환하는 항체의 항체 결합 프로파일은 제한된 샘플 정량법을 사용하여 본 발명에 제공된 방법에 따라 얻어질 수 있다. 예를 들어, 어레이 상의 펩타이드는 대상자의 건강 상태 정보를 확인하기 위한 충분한 수의 펩타이드-단백질 복합체 정보를 포함하는 항체 결합 프로파일을 얻기 위하여 1 밀리리터의 혈액으로 접촉될 수 있다.

어떤 실시양태에서, 항체 결합 프로파일을 얻기위해 필요한 생물학적 샘플의 부피는 10ml 미만, 5ml 미만, 3ml 미만, 2ml 미만, 1ml 미만, 900㎕ 미만, 800㎕ 미만, 700㎕ 미만, 600㎕ 미만, 500㎕ 미만, 400㎕ 미만, 300㎕ 미만, 200㎕ 미만, 100㎕ 미만, 50㎕ 미만, 40㎕ 미만, 30㎕ 미만, 20㎕ 미만, 10㎕ 미만, 1㎕ 미만, 900nℓ 미만, 800nℓ 미만, 700nℓ 미만, 600nℓ 미만, 500nℓ 미만, 400nℓ 미만, 300nℓ 미만, 200nℓ 미만, 100nℓ 미만, 50nℓ 미만, 40nℓ 미만, 30nℓ 미만, 20nℓ 미만, 10nℓ 미만 또는 1nℓ 미만이다. 어떤 실시양태에서, 생물학적 유액 샘플은 항체 결합 프로파일을 얻기 위해 몇배로 희석될 수 있다. 예를 들어, 대상자로부터 얻은 생물학적 샘플은 적어도 2배, 적어도 4배, 적어도 8배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 200배, 적어도 300배, 적어도 400배, 적어도 500배, 적어도 600배, 적어도 700배, 적어도 800배, 적어도 900배, 적어도 1000배, 적어도 5000배 또는 적어도 10,000배로 희석될 수 있다. 희석된 혈청 샘플에 존재하는 항체는 대상자의 건강상태에 대해 유의적인 것으로 간주되는데, 이는 희석된 혈청 샘플 내에 잔여 항체가 존재한다면, 이는 환자의 혈액에서 비교적 많은 양으로 존재하는 것이 틀림없기 때문이다.

본원에 개시된 방법에 따라 대상자에 있는 질환을 검출하는 예가 실시예에 제시되어 있다. 실시예에서는 단 100 마이크로리터의 혈청이나 혈장을 사용하여 정확한 진단을 제공한다는 것을 보여준다.

후보 표적 단백질의 확인

얻어진 면역특징은 본원에 개시된 방법과 장비에 따라 확인된 자가면역 질환으로부터 개개인에 대한 후보 치료 표적을 확인하고 치료법을 개발하는데 사용될 수 있다. 다른 측면에서, 둘 이상의 다른 건강 조건을 가진 대상자의 샘플에 있는 항체가 어레이 상의 식별 펩타이드에 차별적으로 결합하는지가 분석될 수 있는데, 예를 들면 단백질 데이터베이스에 있는 어레이 서열에서 둘 이상의 건강 상태 사이의 차이를 식별해 내는 하나 이상의 식별 펩타이드 서열을 비교함으로써 후보 표적 단백질을 확인할 수 있다. 어떤 실시양태에서, 펩타이드 어레이(면역특징, IMS) 상에 항체 레퍼토리를 분사하고, 건강한 기준 대상자 또는 다른 질환이나 상태에 있는 대상자로부터의 샘플에 대한 질환자의 샘플을 비교하는 것에 있어서, 식별 펩타이드는 인지된 단백질 즉 항체에 의해 결합된 단백질을 나타내기 위해 확인될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드는 정보학상의 방법으로 확인될 수 있다.

불연속적인 에피토프의 경우와 같이 정보학자가 추정적 매치를 식별할 수 없는 경우, 반응성 항체를 정제하기 위한 친화 제제로서 정보 펩타이드가 사용될 수 있다. 그리고, 정제된 항체는 표적을 확인하기 위한 표준 면역학적 기술로 사용될 수 있다.

상태를 진단하는데 있어서, 적절한 기준 프로테옴은 샘플에 있는 항체에 의해 결합된 펩타이드를 식별하는 서열에 연관시키기 위해 조회(query)될 수 있다. 기준 프로테옴은 모든 프로테옴 중에서 선별되어(여러 기준에 따라 수동적 및 알로리즘적으로) 생명의 나무에 대한 폭넓은 커버리지를 제공하게 된다. 기준 프로테옴은 인터넷 사이트 http://www.uniprot.org/proteomes/?query=reference:yes에 있는 UniProtKB 내에서 발견되는 분류학적 다양성의 대표적인 단면을 구성한다. 기준 프로테옴은 연구가 잘된 모델 기관의 프로테옴 및 생의학적 및 생명공학적 연구를 위한 흥미로운 다른 프로테옴을 포함한다. 특히 중요한 종은 특정 생태형 또는 관심종류에 대한 수많은 기준 프로테옴형으로 표현될 수 있다. 프로테옴의 예는 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만, 인간 프로테옴 및 다른 포유동물, 비-포유동물, 바이러스, 박테리아 및 원생 기생충을 포함하는 것으로 조회될 수 있다. 더불어, 다른 종류의 단백질은 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 질병과 관련된 단백질 목록, 알려지거나 알려지지 않은 돌연변이(단일 뉴클레오타이드 다형, 삽입, 치환 및 결실을 포함)를 포함하는 단백질 목록, 알려지거나 알려지지 않은 접합 변형체로 구성되는 단백질 목록 또는 조합 라이브러리(자연발생 및 자연발생하지 않은 아미노산을 포함)로부터의 펩타이드 또는 단백질 목록을 포함하는 것으로 조회될 수 있다. 일 실시양태에서, 프로테옴은 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만, 각 단일 유전자 번호에 대해 가장 긴 전사체 변이체를 이용하여 2016년 3월 10일에 편집된 인간 게놈 빌드 GrCh38 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/)에 상응하는 인간 프로테옴 RefSeq 릴리즈 84를 포함하는 식별 펩타이드를 이용하여 조회될 수 있다.

프로테옴 또는 단백질 목록에 있는 단백질에 단일 및 복합 단백질을 정렬하기 위한 소프트웨어는 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 BLAST, CS-BLAST, CUDAWS++, DIAMOND, FASTA, GGSEARCH(GG 또는 GL), Genoogle, HMMER, H-suite, IDF, KLAST, MMseqs2, USEARCH, OSWALD, Parasail, PSI-BLAST, PSI_Protein, Sequilab, SAM, SSEARCH, SWAPHI, SWIMM, 및 SWIPE를 포함한다.

또는, 어레이 상의 전체 펩타이드에서 발견되는 모티프에 대해 상대적인 식별 펩타이드에서 압축된 서열 모티프는 프로테옴내의 전체 길이 단백질 또는 단백질 절편에 맞춰 정렬될 수 있으며, 이를 통해 상태를 치료하기 위한 가능한 치료적 표적으로 검증될 수 있는 표적 단백질을 확인할 수 있게 한다. 식별 펩타이드는 프로테옴 데이터베이스 내에서 이용가능한 가장 긴 전사체에 정렬된다. 단백질 도메인, 패밀리 및 작용 부위를 확인하기 위한 온라인 데이터베이스 및 검색 수단은 예를 들어 ExPASy에 있는 Prosite, Motif Scan(MyHits, SIB, Switzerland), Interpro 5, MOTIF(GenomeNet, Japan), 및 Pfam(EMBL-EBI)에서 이용가능하다.

어떤 실시양태에서, 정렬 방법은 조회 서열의 아미노산을 더 긴 단백질 서열에 매핑하는 모든 방법이 사용될 수 있으며, 여기에는 BLAST (Altschul, S.F. & Gish, W. [1996] "Local alignment statistics." Meth. Enzymol. 266:460-480), 조성적 치환 및 점수 매트리스, 간격 및 간격 없는 정확한 매치, 에피토프 예측, 항원성 예측, 소수성 예측, 표면 접근적 예측을 이용한다. 각각의 접근을 위해 펩타이드 라이브러리 구성의 편향을 보정하기 위해 최적화된 보정된 채점 시스템을 사용하는, 표준 또는 보정된 채점 시스템이 사용될 수 있다. 일 실시양태에서, 변형된 BLAST 정렬이 사용되는데, 이는 어레이의 아미노산 조성을 반영하도록 보정된(States, D.J., Gish, W., Altschul, S.F. [1991] "Improved sensitivity of nucleic acid database searches using application-specific scoring matrices." Methods 3:66-70.) BLOSUM62 점수 매트릭스(Henikoff, J.G.　Amino acid substitution matrices from protein blocks.　Proc. Natl. Acad. Sci. USA　89, 10915-10919 [1992])를 이용하여, 간격 패널티 4를 갖는 3개의 아미노산 시드를 필요로 한다. 아미노산 시드 및 간격 패널티의 수는 당업자에 의해 쉽게 식별될 수 있다. 이러한 보정은 퇴행 치환 점수의 증가, 어레이에 없는 아미노산에 대한 페널티 제거, 모든 정확한 매치 점수를 포함할 수 있다.

식별 펩타이드는 본 발명에 제공되는 방법에 따라 후보 바이오마커 단백질을 확인하는데 사용될 수 있으며, 2개 이상의 다른 건강한 상태 사이의 차이를 구분하기 위한 능력에 따라 선별된다. 따라서, 식별 펩타이드는 두개 이상의 조건 사이의 식별 가능성에 대해 사전에 결정된 통계적 엄격성, 예를 들어 p-값; 두개 이상의 조건 사이의 상대적 결합 신호 강도 변화에 있어서의 차이점; 단일 조건에서의 이의 강도 순위; 두개 이상의 조건에 대하여 훈련된 기계 훈련 모델에서의 이의 상수 예를 들어, AUC 또는 하나 이상의 연구 파라미터를 이용한 이의 연관성에 의해 선택될 수 있다.

후보 단백질 바이오마커를 확인하기 위해 제공되는 방법은 식별 펩타이드와 프로테옴 또는 다른 단백질 목록의 단백질 사이의 상동성을 이용하지만, 목록에 대해 상대적으로 큰 펩타이드를 포함하는 목록로부터의 잠재적인 과샘플링에 대해 보정한다.

조회 펩타이드는 둘 이상의 다른 건강 상태를 구분할 수 있는 정렬된 식별 펩타이드로서, 두개 이상의 조건 사이를 식별하기 위한 p-값, 두 개 이상의 조건 간의 상대적 강도의 변화, 단일 조건에서의 이의 강도 순위, 두 개 이상의 조건에 대해하여 훈련된 기계 훈련 모델에서의 상수 또는 하나 이상의 연구 파라미터를 이용한 이의 연관성에 의해 선택될 수 있다.

조회되어야 하는 식별 펩타이드와 프로테옴 또는 단백질 목록의 세트를 확인하는데 있어서, 모든 식별 펩타이드가 프로테옴 또는 단백질 목록에서 사용 가능한 가장 긴 단백질 전사체에 정렬되며, 양성 BLAST 점수를 가진 펩타이드가 확인된다. 식별 펩타이드가 정렬된 각 단백질에 대해, 정렬에서의 BLAST-양성 펩타이드에 대한 점수가 매트릭스, 예를 들어 보정된 BLOSUM62로 구성된다. 이러한 보정에는 퇴행 치환 점수의 증가, 어레이 상에 없는 아미노산에 대한 페널티 제거, 모든 정확한 매치 점수를 포함할 수 있다.

매트릭스의 각 열은 정렬된 펩타이드에 해당하며, 각 컬럼은 단백질에 대해 정렬하기 위해 허락된 펩타이드 열 내에서 허락된 간격과 결실을 가지는 단백질을 포함하는 연속된 아미노산 중 하나에 해당한다.

상기에 기술한 변형된 BLAST 점수 매트릭스를 이용하여, 매트릭스에 있는 각 위치는 해당 컬럼에 있는 펩타이드와 단백질의 아미노산 쌍에 대한 점수를 받는다. 그리고 나서, 단백질에 있는 각 아미노산에 대해, 대응되는 컬럼이 합산되어 면역특징 식별 펩타이드에 의해 아미노산의 범위를 표현하는 "중첩 점수"가 생성된다.

아미노산 중첩 점수인 s는 식별 펩타이드에 있는 아미노산 출현의 보정 점수이며, 라이브러리의 조성을 설명한다. 예를 들어, 어레이 상의 펩타이드는 하나 이상의 20개의 자연발생적 아미노산을 제외할 수 있다. 따라서, 중첩 점수는 라이브러리에 있는 아미노산 내용물을 설명한다. 라이브러리 조성에 대한 이 점수를 보정하기 위해, 중첩 점수는 모든 어레이 펩타이드 목록에 대하여 동일한 방법에 의해 계산된다. 이는 아래 수학식에 따라 각 아미노산에서 중첩 점수인 s를 계산하게 한다.

s=a-(b/d)*c

상기 식에서, (a)는 면역특징 펩타이드로부터의 중첩 점수이고, (b)는 면역특징 펩타이드의 수이고, (c)는 전체 펩타이드 어레이에 대한 중첩 점수이며, (d)는 전체 어레이 상에 있는 펩타이드의 수이다.

다음으로, 각 식별 펩타이드의 정렬로부터 얻은 아미노산 중첩 점수는 단백질 점수인 S로 전환된다. 아미노산 레벨에서의 이 점수, s를 전체-단백질 수준, S로 전환하기 위해, 단백질 내의 가능한 모든 n-mer 에피토프에 대한 점수의 합이 계산되며, 최종 점수는 최대 20-mer 범위가 된다.

확인된 후보 바이오 마커의 순위는 무작위로 선정된 비식별 펩타이드 순위에 따라 결정된다. 따라서, 동일한 프로테옴 또는 단백질 목록의 하나 이상의 단백질 각각에 대해 정렬하는 비식별 펩타이드에 대한 중첩 점수(비식별 's' 점수)는 식별 펩타이드에 대해 기술된 바에 따라 얻어진다. 그리고 난뒤, 비식별 's' 점수는 무작위로 선택된 다양한 비식별 펩타이드 각각에 대해 비식별 단백질 'S' 점수로 전환된다. 예를 들어, 비식별 단백질 'S' 점수는 적어도 25개, 적어도 50개, 적어도 100개 또는 그 이상의 무작위로 선별된 비식별 펩타이드에 대해 얻어질 수 있다.

그리고 난뒤, 확인된 단백질 바이오마터는 비식별 펩타이드 정렬에 의해 확인된 단백질에 대해 상대적으로 점수가 매겨진다.

어떤 실시양태에서, 인간 대상자에 있는 자가면역 질환을 치료하기 위한 후보 표적 단백질을 확인하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 하나 이상의 다른 자가면역 질환으로부터 상기 자가면역 질환을 구별하는 식별 펩타이드 세트를 확인하는 단계; (b) 인간 프로테옴에 있는 단백질에 펩타이드 세트를 정렬하는 단계; (c) 상기 세트에 있는 각 펩타이드와 면역성 단백질 부위 사이의 부위 상동성을 확인하는 단계; 및 (d) 상기 자가면역 질환을 치료하기 위한 후보 표적 단백질로서의 상기 단백질을 확인하는 단계. 상기 방법은 건강한 상태로부터 자가면역 질환을 구별하는 식별 펩타이드 세트를 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 실시예 3은 건강한 대상자로부터의 샘플을 SSc를 가진 대상자로부터의 샘플과 구분하게 하는 차별적 펩타이드를 이용하여 후보 표적 단백질을 확인하는 방법을 설명한다. 후보 단백질 표적의 목록은 표 3에 제공된다. 유사하게, 후보 단백질 표적은 건강한 대상자로부터의 샘플, 다른 자가면역 질환을 가진 대상자로부터의 샘플 및 유사하거나 다른 중첩 질환, 이는 자가면역 질환일수도 아닐수도 있는 질환을 가진 대상자로부터의 샘플로부터 다른 자가면역 질환을 가진 대상자로부터의 샘플을 구분하는 차별적 펩타이드를 이용하여 확인될 수 있다.

일 실시양태에서, 인간 대상자에 있는 자가면역 질환에 대한 후보 단백질 바이오마커를 확인하기 위한 방법은 하기 단계를 포함한다: 하나 이상의 다른 건강 상태로부터 상기 자가면역 질환을 구별하는 식별 펩타이드 세트를 확인하는 단계; (b) 상기 식별 펩타이드 세트를 프로테옴에 있는 단백질에 정렬하여 상기 프로테옴의 하나 이상의 단백질에 대한 식별 펩타이드 세트의 정렬 점수를 얻고; 통계적 유의성에 따라 확인된 단백질의 순위를 매기는 단계; 및 상기 자가면역 질환에 대한 후보 단백질 바이오마커로서의 상기 단백질을 확인하는 단계. 일 실시양태에서, 상기 방법은 중첩 점수를 얻는 단계를 추가로 포함하는데, 상기 중첩 점수는 펩타이드 라이브러리의 펩타이드 조성에 대해 보정한다. 어떤 실시양태에서, 상기 방법에 사용된 식별 펩타이드는 p-값이 10^-5 미만, 10^-6 미만, 10^-7 미만, 10^-8 미만, 10^-9 미만, 10^-10 미만, 10^-11 미만, 10^-12 미만, 10^-13 미만, 10^-14 미만 또는 10^-15 미만이다.

일 실시양태에서, 상기 방법은 건강한 상태로부터 자가면역 질환을 구별하는 식별 펩타이드 세트를 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 질환의 진행을 구별하는 펩타이드를 확인하는 단계를 포함한다. 어떤 실시양태에서, 차별화 펩타이드는 기관 연관성이 없는 SSc를 가진 대상자로부터 기관 연관성이 있는 SSc를 가진 대상자를 구별한다. 따라서, 후보 바이오마커는 질환을 진단하고, 질환의 진행 단계를 확인하기 위해 제공될 수 있다. 또한 바이오마커는 질환을 모니터링하는데 제공될 수 있다. 피부경화증에 대한 후보 바이오마커의 예가 표 3에 나열되어 있다. 일 실시양태에서, 본 발명의 방법에 따라 확인된 후보 바이오마커 단백질은 10^-3 미만, 10^-4 미만, 10^-5 미만 또는 10^-6 미만의 p-값에 따라 순위가 매겨진다.

또는, 본 발명에 제공된 방법에 따라 확인된 식별 펩타이드는 두개의 다른 상태를 구별하는 대부분의 식별 펩타이드에 압축된 서열 모티프를 이용하여 후보 표적 단백질을 확인할 수 있다. 일 실시양태에서, 인간 대상자에 있는 자가면역 질환을 치료하기 위한 후보 표적을 확인하기 위한 방법은 하기 단계를 포함한다, (a) 하나 이상의 다른 자가면역 질환으로부터 자가면역 질환을 구별하는 식별 펩타이드 세트를 얻는 단계; (b) 상기 식별 펩타이드에 대한 모티프 세트를 확인하는 단계; (c) 상기 모티프 세트를 인간 프로테옴에 정렬하는 단계; (d) 세트에 있는 각 모티프와 면역성 단백질 부위 사이의 상동성 부위를 확인하는 단계; 및 (e) 상기 단백질을 상기 자가면역 질환을 치료하기 위한 후보 단백질로 확인하는 단계. 상기 방법은 건강한 상태로부터 자가면역 질환을 구별하는 식별 펩타이드 세트를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 대부분의 식별 펩타이드에 압축된 모티프는 다양한 자가면역 질환을 치료하는데 개발하고 사용하기 위한 후보 표적 단백질을 확인하는데 사용될 수 있으며, 다른 진행 단계의 일부가 도 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 및 21에 제공된다.

어떤 실시양태에서, 대상자의 샘플에서 자가면역 질환을 확인하는 단계는 하기 단계를 포함한다: (i) 계내 합성된 적어도 10,000개의 다른 펩타이드를 포함하는 펩타이드 어레이에 대상자의 샘플을 접촉시키는 단계; (ii) 상기 어레이 상에 있는 적어도 25개의 펩타이드에 대한, 샘플에 존재하는 항체의 결합을 검출하여 결합 신호의 조합을 얻는 단계; 및 (iii) 기준 결합 신호의 조합 중 하나 이상의 그룹과 상기 결합 신호의 조합을 비교하는 단계로서, 상기 기준 결합 신호의 조합의 그룹의 각각은 다른 자가면역 질환을 가진 다수의 대상자로부터 얻은 결합 신호의 조합을 포함하는 단계. 어떤 실시양태에서, 대상자로부터의 결합 신호 조합은 하나 이상의 건강한 기준 대상자로부터 얻은 결합 신호 조합과 비교된다.

또한, 식별 펩타이드는 표적 단백질-단백질 상호작용을 저해하거나 활성화하는 약물을 디자인하기 위한 기초로서 제공될 수 있다. 다른 측면에서, 본 발명의 방법에 의해 확인된 신규한 식별 펩타이드의 치료적 및 진단적 용도가 제공된다. 따라서, 일측면 및 실시양태는 본 발명에 따른 펩타이드 및 이의 유도체를 포함하는 처방, 약제 및 약제학적 조성물을 포함한다. 어떤 실시양태에서, 신규한 식별 펩타이드 또는 이의 유도체는 약제에 사용하기 위해 제공된다. 보다 바람직하게는 세포 표면 수용체와 같은 표적 리간드의 기능을 대항하거나 길항하는데 사용한다. 본 발명의 식별 펩타이드는 인간 또는 동물체의 다양한 질환 및 상태, 즉 암 및 퇴행성 질환의 치료에 사용될 수 있다. 또한 치료법은 질환 또는 상태의 예방 뿐만 아니라 치료적 처치 및 완화를 포함할 수 있다.

따라서, 본원에 개시된 방법, 시스템 및 어레이 장비는 스크리닝하고, 치료학적 표적을 확인하며, 표적 백신을 확인 및/또는 초기 단계의 질환 및/또는 상태에 있는 질환 및/또는 상태를 치료할 수 있다. 예를 들어 본원에 개시된 방법, 시스템 및 어레이 장비는 전통적인 바이오마커 기반 분석법을 수행하기 수일 또는 수주 전에 질환 및/또는 상태를 검출하고, 진단하며 모니터링할 수 있게 한다. 더불어, 염증성 상태, 자가면역 질환, 암 및 병원성 감염을 포함하는 광범위한 질환과 상태를 검출하고, 진단하며 모니터하는데 오직 한개의 어레이, 즉 한개의 면역특징 어레이가 필요하다.

치료학적 후보 표적은 본원 모든 곳에 인용된 모든 자가면역 질환에 대해 제공된 본 발명의 방법에 따라 확인될 수 있다. 어떤 실시양태에서, 치료학적 후보 표적은 SSc를 검증하고 후속 치료하기 위해 확인될 수 있다. SSc를 치료하기 위한 치료학적 후보의 예가 표 3에 제공된다.

질환 점수 시스템

본 발명에 개시된 방법, 장비 및 분석법에 의해 얻어진, 차별적 결합 활성 또는 특징, 즉 "면역특성"(IS)이라고 불리는 특징은 알려진 질환 점수 시스템과 연관될 수 있다. 예를 들어 본원에 개시된 방법과 분석법으로 얻어진 면역특징 결합 패턴은 SSc 및 DM 용으로 개발된 임상 및 실험실 점수 시스템을 포함하는 공지된 면역-유도된 질환 점수 시스템과 비교시, 자가면역 질환 또는 장애를 가진 것으로 분석되고 진단된 환자에 대해 비교하였을때 ROC 곡선 하 면적(AUC)이 적어도 0.6, 적어도 0.65, 적어도 0.7, 적어도 0.75, 적어도 0.8, 적어도 0.85, 적어도 0.9, 적어도 0.95, 적어도 0.97, 적어도 0.99 또는 적어도 1.0이다. 예를 들어, 식별 펩타이드에 대한 결합 신호 데이터는 자가면역 질환의 활성에 대한 점수를 제공하는데 사용될 수 있다. 상기 점수는 기존 점수 매김 시스템과 연관될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 제공된 분석법, 방법 및 장비에 따라 SSc에 대해 얻어진 점수는 피부경화증에 대한 변형된 Rodnan 피부 점수, Medsger Severity Scale (Clin Exper Rheumatol 21:S42-S46 [2분석법]), 및 CT 점수 시스템(Assayag et al, [2012] High Resolution Computed Tomography Scoring Systems for Evaluating Interstitial Lung Disease in Systemic Sclerosis Patients. Rheumatology S1:003. doi:10.4172/2161-1149.S1-0030)과 연관될 수 있다.

본원에 개시된 바와 같이, AUC는 공지된 점수 시스템에 따라 활성 질환을 가진 환자가, 공지된 점수 시스템에 따라 질환이 비활성이거나 없는 환자보다 면역특징 결합 패턴과 관련된 수치가 더 높은 것으로 해석될 수 있다.

치료 및 상태

본 발명의 방법과 분석법은 자가면역 질환의 검출 및 진단을 위한 방법, 분석법 및 장비를 제공한다. 본원 모두에 나열된 모든 자가면역 질환이 검출되고 진단될 수 있다. 본원에 기술된 실시양태의 방법과 분석법은 예를 들어 대상자에 있는 면역 질환을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 대상자는 인간, 기니피그, 개, 고양이, 말, 생쥐, 토끼 및 다양한 다른 동물이 될 수 있다. 대상자는 모든 나이 예를 들어 신생아, 유아, 어린이, 미성년자, 성년자, 성인 또는 노인을 아우르는 모든 나이일 수 있다.

대상자의 상태는 질환 또는 건강한 상태에 해당될 수 있다. 어떤 실시양태에서, 대상자의 상태가 건강한 상태이면, 본 발명의 방법은 건강한 상태를 모니터한다. 어떤 실시양태에서, 대상자의 상태가 질환 상태이면 본 발명의 방법은 상태의 현상 및/또는 진행을 진단/모니터하는데 사용된다. 또한, 본 발명의 방법은 상태를 예방하는데 사용될 수 있다. 어떤 실시양태에서, 본 발명의 방법은 예방 치료와 함께 사용된다.

본 발명의 어레이 및 방법은 사용자에 의해 사용될 수 있다. 많은 사용자가 질환을 확인 및/또는 치료하기 위해 본 발명의 방법을 사용할 수 있다. 사용자는 예를 들어 자기 자신의 건강을 모니터하기 원하는 사람이 될 수 있다. 예를 들어 사용자는 건강 관리 제공자일 수 있다. 예를 들어 건강 관리 제공자는 의사일 수 있다. 어떤 실시양태에서, 사용자는 해당 실험에 참여하는 건강 관리 제공자이다. 본 발명의 사용자가 될 수 있는 의사 및 건강관리 제공자의 비제한적인 예로는 마취의사, 비만수술 전문의, 혈액 은행 수혈 전문의, 심장 전기생리학자, 심장 외과의사, 심장전문의, 공인 간호 조수, 임상 심장 전기생리학 전문의, 임상 신경생리학 전문의, 임상 간호 전문의, 결장직장 외과의사, 중환자 치료 전문의, 중환자 수술 전문의, 치위생의, 치과의사, 피부과전문의, 응급 의료 기술자, 응급 의료 의사, 위장 외과의사, 혈액학자, 호스피스 간호 및 완화의학 전문의, 동종요법 전문가, 감염 질환 전문의, 내과의사, 상악안면 외과의사, 의료 보조원, 검시관, 유전체 분석자, 종양전문의, 조산사, 신생아-태아 전문가, 신장전문의, 신경전문의, 신경외과의사, 핵의학전문의, 간호사, 간호실습자, 산과전문의, 종양전문의, 구강외과의사, 치과교정전문의, 정형외과 전문의, 통증관리 전문의, 병리학자, 소아과전문의, 체외 순환사, 치주전문의, 성형외과의사, 발전문가, 직장병전문의, 보철전문의, 정신과의사, 호흡기내과의, 방사선과의사, 외과의사, 흉부외과전문의, 이식전문의, 혈관전문의, 혈관외과의사 및 수의사를 포함한다. 본 발명의 어레이 및 방법으로 확인된 진단은 대상자의 의료 기록에 포함될 수 있다.

어레이 플랫폼

일 실시양태에서, 본원에 기술된 방법과 과정은 어레이 플랫폼에 제공되는데, 이는 화학적 라이브러리 합성의 다양성과 충실도를 증가시키기 위해 허용된다. 상기 어레이 플랫폼은 어레이 표면상에 다양한 개별적 특징을 포함한다. 일반적으로 각 특징은 어레이 표면상에서 계내 합성된 다양한 개별 분자를 포함하며, 상기 분자는 특징 내에서 동일하지만, 분자의 서열 또는 정체성은 특징들마다 다르다. 상기 어레이 분자는 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 핵산(DNA, RNA, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 이의 구조적 유사체 또는 조합을 포함), 펩타이드, 펩타이드 유사체 및 이의 조합 등을 포함하며, 상기 어레이 분자는 분자 내에 자연발생적인 또는 비자연발생적인 모노머를 포함할 수 있다. 이러한 어레이 분자는 큰 합성 펩타이드 어레이의 합성을 포함한다. 어떤 실시양태에서, 어레이에 있는 분자는 에피토프 구조를 모방하며 에피토프 유발된 항체에 결합할 수 있는 분자인 미모토프(mimotope)이다. 어떤 실시양태에서, 어레이에 있는 분자는 파라토프 또는 항체(또는 T 세포 수용체)의 다양한 부위에 있는 위치를 포함하는 파라토프 유사체이며, 에피토프 항원에 결합한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 어레이는 무작위, 의사무작위 또는 최대 다양한 펩타이드 서열을 포함하는 펩타이드 어레이이다.

펩타이드 어레이는 잘 특성화된 단일클론 항체(mAbs)의 에피토프와 일치하는 대조 서열을 포함할 수 있다. 대조군 서열 및 라이브러리 펩타이드에 대한 결합 패턴은 어레이 및 면역특징 측정 단계를 정량화하기 위해 측정될 수 있다. 공지된 에피토프를 갖는 mAb, 예를 들어 4C1, p53Ab1, p53Ab8 및 LnKB2가 다른 용량에서 측정될 수 있다. 또한, 웨이퍼 간 신호 정밀도는 다른 웨이퍼의 어레이에서 샘플, 즉 혈장 샘플 반복 실험을 테스트하고 모든 라이브러리 펩타이드에 대한 변동 계수(CV)를 계산하여 결정할 수 있다. 결합 신호 측정의 정밀도는 동일한 배치의 웨이퍼에서(웨이퍼 배치 내에서) 합성된 어레이에서 생성된 어레이 간, 슬라이드 간, 웨이퍼 간 및 일 간 변화를 종합하여 결정할 수 있다. 더불어, 측정의 정밀도는 다른 배치의 웨이퍼(웨이퍼 배치 간)에 있는 어레이에 대해 결정될 수 있다. 어떤 실시양태에서, 결합 신호의 측정은 웨이퍼 배치 내 및/또는 사이에서 5% 미만, 10% 미만, 15% 미만, 20% 미만, 25% 미만 또는 30% 미만의 다양한 정밀도를 가지는 것으로 수행될 수 있다.

본원에 기재된 기술은 반도체 제조 공정과 조합 화학 합성을 결합하여 실리콘 웨이퍼에 대한 어레이 기반 라이브러리를 생산하는 포토리소그래피(photolithographic) 어레이 합성 플랫폼을 포함한다. 포토리소그래피 기능 패턴의 엄청난 발전을 활용함으로써, 어레이 합성 플랫폼은 확장성이 높으며 8인치 웨이퍼에 4000만 개의 특징을 갖춘 조합 화학 라이브러리를 제작할 수 있다. 포토리소그래피 어레이 합성은 반도체 웨이퍼 생산 장비를 사용하여 높은 재현성을 달성하기 위해 클래스 10,000 클린룸에서 수행된다. 웨이퍼는 표준 현미경 슬라이드 크기에 담겨지며, 각 슬라이드는 3백만 개 이상의 서로 다른 화학 물질을 포함하게 된다.

어떤 실시양태에서, 본원에 기재된 포토리소그래피 기술에 의해 제작된 화학 라이브러리를 갖는 어레이는 면역기반 진단 분석법, 예를 들어 면역특징 분석법으로 불리는 방법에 사용된다. 어레이에 결합된 한방울의 혈액으로부터의 환자의 항체 레퍼토리를 이용하면, 결합한 어레이의 형광 결합 프로파일 이미지는 질환자와 건강한 사람을 분류하기 위한 충분한 정보를 제공한다.

어떤 실시양태에서, 자가면역질환을 진단/모니터링하고 자가면역치료에 대한 반응을 평가하기 위해 임상적으로 적용하기 위한 면역특징 분석법이 개발되고 있다. 면역특징 분석법의 예시가 미국 공개공보 제2012/0190574호(발명의 명칭: 샘플 프로파일용 어레이 화합물) 및 미국 공개공보 제2014/0087963호(발명의 명칭: 면역특징: 초기 진단 및 건강 모니터링을 위한 과정)에 자세히 기재되어 있으며, 이 특허 모두는 본 명세서에 참조로서 삽입되어 있다. 본원에서 개발된 분석법은 편광 해석법, 질량 분석계 및 형광을 포함한 직교 분석 방법을 사용하여 각 합성된 어레이 내에 분석 측정 기능을 포함한다. 이러한 측정으로 어레이 합성 기능의 종방향 정성 및 정량 평가가 가능하다.

어떤 실시양태에서, 펩타이드 어레이 상에 결합한 항체의 결합의 검출은 본원에 기재된 방법에 의해 해결될 수 있는 몇가지 문제점을 제기한다. 따라서, 어떤 실시양태에서, 본원에 기재된 분석법 및 방법은 어레이 표면 상에 있는 특정 코팅과 기능 그룹 밀도를 이용하는데, 이는 면역특징 분석 수행에 필요한 바람직한 특징을 조절할 수 있다. 예를 들어, 펩타이드 어레이상의 비특이적 항체 결합은 보통 친수성 단일층 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리비닐 알코올, 카복시메틸 덱스트란 및 이의 조합으로 실리콘 표면을 코팅함으로써 최소화 할 수 있다. 어떤 실시양태에서, 친수성 단일층은 균질한다. 두번째로, 합성된 펩타이드들은 표면으로부터 펩타이드가 방해받지 않는 방향으로 항체가 제시되도록 표면에 있는 스페이서를 사용하여 실리콘 표면에 링크된다.

검출 장비

어떤 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템, 플랫폼 및 방법은 본원에 기재된 어레이 포맷에 대한 결합을 검출하기 위한 검출 장비, 본원에 기재된 펩타이드 어레이 상에 결합한 항체를 포함한다. 어떤 실시양태에서, 광학적 검출 방법(ccd, pmt, 다른 광학 검출기, 광학 필터 및 다른 광학 검출 장비)과 연계하여 사용되는, 항체 결합 검출은 실시간으로 또는 시간 간격에 따라 광학 검출을 통해 보고된다. 특정 예에서, 최종 결합 활성의 정량화는 AFU(임의 형광 단위)로 변환되거나 임피던스 측정 또는 기타 전기 화학적 감지를 통해 전기적 신호로 변환되는 광학 감지를 통해 보고된다. 다른 예에서, 항체 결합은 가시적 범위에서 또는 펩타이드 장비에 적용되는 프로브의 광학 탐지 가능 라벨에서 빛 또는 전자기 에너지의 방출 또는 흡수에 의해 검출된다. 광학적으로 검출가능한 라벨은 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만, 형광, 화학발광, 전자화학발광, 발광, 인광, 형광 양극화 및 충전 라벨을 포함한다. 어떤 예에서, 형광 라벨된 프로브는 특정 표적 또는 항체의 존재하에서만 활성을 띄며, 이로 인해 샘플로부터의 형광 반응은 표적 또는 항체의 존재를 알려준다.

어떤 예에서, 광전달 방식은 항체 결합의 광학적 흥분 및/또는 방출 및/또는 검출을 제공하기 위해 이용된다. 특정 실시양태에서, 이는 유동세포물질(아크릴 유사 열성 폴리머(PMMA) 고리형 올레핀 폴리머(COP), 고리형 올레핀 코폴리머(COC), 등)을 광학적 파동 가이드로 이용함으로써 외부 구성요소의 사용 필요성을 제거한다. 또한, 광원 즉 발광다이오드-LED, 수직강 표면 방출 레이저-VCSEL 및 다른 발광 조합은 카트리지 또는 검출 장비 내부에 직접 통합되거나 펩타이드 어레이 표면에 직접 내장되어 이써 내부적으로 제어되고 광원이 공급된다. 또한, PMT, CCD, 또는 CMOS 검출기는 검출 장비 또는 카트리지 내부에 내장될 수 있다.

디지털 처리 장비

어떤 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템, 플랫폼, 소프트웨어, 네트워크 및 방법은 디지털 처리 장비를 포함하거나 이를 이용한다. 다른 실시양태에서, 상기 디지털 처리 장비는 하나 이상의 하드웨어 중앙 처리 장치(CPU), 즉 장비의 기능을 수행하는 처리기를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 디지털 처리 장비는 실행 가능한 명령을 수행하도록 구성된 운영 체제를 추가로 포함한다. 어떤 실시양태에서, 상기 디지털 처리 장비는 선택적으로 컴퓨터 네트워크에 연결된다. 다른 실시양태에서, 상기 디지털 처리 장비는 인터넷에 연결되어 월드 와이드 웹에 접속한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 디지털 처리 장비는 선택적으로 클라우드 컴퓨팅 인프라에 연결된다. 다른 실시양태에서, 상기 디지털 처리 장비는 선택적으로 인트라넷에 연결된다. 다른 실시양태에서, 상기 디지털 처리 장비는 선택적으로 데이터 저장 장비에 연결된다.

본원의 설명에 따르면, 적합한 디지털 처리 장비는 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 서버 컴퓨터, 데스크톱 컴퓨터, 랩탑 컴퓨터, 노트북 컴퓨터, 서브 노트북 컴퓨터, 넷북 컴퓨터, 넷패드 컴퓨터, 셋톱 컴퓨터, 핸드헬드 컴퓨터, 인터넷 어플라이언스, 모바일 스마트폰, 태블릿 컴퓨터, 개인 디지털 보조 장치, 비디오 게임 콘솔 및 차량을 포함한다. 당업계의 기술자라면 많은 스마트폰이 본원이 기재된 시스템에서 사용하기에 적합하다는 것을 인식할 수 있을 것이다. 또한 당업계의 기술자라면 선택적인 컴퓨터 네트워크 접속이 가능한 텔레비전, 비디오 플레이어, 디지털 음악 플레이어들이 본원에 설명된 시스템에서 사용하기에 적합하다는 것을 인식하게 될 것이다. 적합한 태블릿 컴퓨터는 당업계의 기술자에게 잘 알려져 있는 소책자, 슬레이트 및 컨버터블 구성을 포함한다.

어떤 실시양태에서, 디지털 처리 장비는 실행 가능한 명령을 수행하도록 구성된 운영 체제를 포함한다. 예를 들어 상기 운영 체제는 프로그램 및 데이터를 포함한 소프트웨어로서, 장비의 하드웨어를 관리하고 애플리케이션 실행을 위한 서비스를 제공한다. 당업계의 기술자라면 적합한 서버 운영 체제가, 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 FreeBSD, OpenBSD, NetBSD^®, Linux, Apple^® Mac OS X Server^®, Oracle^® Solaris^®, Windows Server^® 및 Novell^® NetWare^®를 포함한다는 것을 인식할 수 있을 것이다. 당업계의 기술자라면 적합한 개인용 컴퓨터 운영 체제가, 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 Microsoft^® Windows^®, Apple^® Mac OS X^®, UNIX^®, 및 GNU/Linux^®과 같은 UNIX 유사 운영 체제를 포함한다는 것을 인식할 수 있을 것이다. 어떤 실시양태에서, 운영 시스템은 클라우드 컴퓨터에 의해 제공된다. 당업계의 기술자라면 적합한 모바일 스마트폰 운영 체제가, 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 Nokia^® Symbian^® OS, Apple^® iOS^®, Research In Motion^® BlackBerry OS^®, Google^® Android^®, Microsoft^® Windows Phone^® OS, Microsoft^® Windows Mobile^® OS, Linux^®, 및 Palm^® WebOS^®를 포함한다는 것을 인식할 수 있을 것이다.

어떤 실시양태에서, 디지털 처리 장비는 저장 및/또는 메모리 장비를 포함한다. 상기 저장 및/또는 메모리 장비는 데이터나 프로그램을 임시 또는 영구적 기준으로 저장하는데 사용되는 하나 이상의 물리적 부속물이다. 어떤 실시양태에서, 상기 장비는 휘발성 메모리이며 저장된 정보를 유지하기 위해 전원을 필요로 한다. 어떤 실시양태에서 상기 장비는 비휘발성 메모리이며 디지털 처리 장치에 전원이 공급되지 않을 때에도 저장된 정보를 유지한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 비휘발성 메모리는 플래시 메모리를 포함한다. 어떤 실시양태에서, 상기 비휘발성 메모리는 동적 랜덤 액세스 메모리(DRAM)를 포함한다. 어떤 실시양태에서, 상기 비휘발성 메모리는 강유전성 랜덤 엑세스 메모리(FRAM)를 포함한다. 어떤 실시양태에서, 상기 비휘발성 메모리는 상변이 랜덤 엑세스 메모리(PRAM)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 장비는 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 CD-ROM, DVD, 플래시 메모리 장비, 자기 디스크 드라이브, 자기 테이프 드라이브, 광디스크 드라이브, 및 클라우드 컴퓨팅 기반 저장장치를 포함한다. 또 다른 실시양태에서 상기 저장 및/또는 메모리 장비는 본원에 기재된 것과 같은 장비들의 조합이다.

어떤 실시양태에서, 디지털 처리 장비는 사용자에게 시각적 정보를 전해주는 디스플레이를 포함한다. 어떤 실시양태에서, 상기 디스플레이는 음극선관(CRT)이다. 어떤 실시양태에서, 상기 디스플레이는 액정디스플레이(LCD)이다. 다른 실시양태에서, 상기 디스플레이튼 박막 트랜지스터 액정 디스플레이(TFT-LCD)이다. 어떤 실시양태에서, 상기 디스플레이는 유기발광 다이오드(OLED) 디스플레이이다. 추가의 다양한 실시양태에서, OLED 디스플레이는 수동매트릭스 OLED(PMOLED) 또는 자동매트릭스 OLED(AMOLED) 디스플레이이다. 어떤 실시양태에서, 상기 디스플레이트 플라즈마 디스플레이이다. 다른 실시양태에서, 상기 디스플레이는 비디오 프로젝터이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 디스플레이는 본원에 기재된 장비들의 조합이다.

어떤 실시양태에서, 디지털 처리 장비는 사용자로부터 정보를 받을 수 있는 입력 장비를 포함한다. 어떤 실시양태에서, 상기 입력 장비는 키보드이다. 어떤 실시양태에서, 상기 입력 장비는 포인팅 장비이며, 이는 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만, 마우스, 트랙볼, 트랙 패드, 조이스틱, 게임 컨트롤러 또는 스타일러스를 포함한다. 어떤 실시양태에서, 상기 입력 장비는 터치 스크린 또는 멀티 터치 스크린이다. 다른 실시양태에서, 상기 입력 장비는 음성이나 다른 소리 입력을 캡처하는 마이크이다. 다른 실시양태에서, 상기 입력 장비는 동작이나 시각적 입력을 캡처하는 비디오 카메라이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 입력 장비는 본원에 기재된 장비의 조합이다.

어떤 실시양태에서, 디지털 처리 장비는 디지털 카메라를 포함한다. 어떤 실시양태에서, 디지털 카메라는 디지털 이미지를 캡처한다. 어떤 실시양태에서, 상기 디지털 카메라는 자동포커스 카메라이다. 어떤 실시양태에서, 디지털 카메라는 충전결합 장비(CCD) 카메라이다. 다른 실시양태에서, 디지털 카메라는 CCD 비디오 카메라이다. 다른 실시양태에서, 디지털 카메라는 상보형 금속산화 반도체(CMOS) 카메라이다. 어떤 실시양태에서, 디지털 카메라는 정지 이미지를 캡처한다. 다른 실시양태에서, 디지털 카메라는 비디오 이미지를 캡처한다. 다양한 실시양태에서, 적합한 디지털 카메라는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 및 이의 증가를 포함하는 그 이상의 메가픽셀 카메라를 포함한다. 어떤 실시양태에서, 디지털 카메라는 표준 화질 카메라이다. 다른 실시양태에서 디지털 카메라는 HD 비디오 카메라이다. 또 다른 실시양태에서, HD 비디오 카메라는 적어도 약 1280 x 약 720 픽셀 또는 적어도 약 1920 x 약 1080 픽셀의 이미지를 캡처한다. 어떤 실시양태에서, 디지털 카메라는 컬러 디지털 이미지를 캡처한다. 다른 실시양태에서, 디지털 카메라는 그레이스케일 디지털 이미지를 캡처한다. 다양한 실시양태에서, 디지털 이미지는 모든 적합한 디지털 이미지 포맷으로 저장된다. 적합한 디지털 이미지 포맷은 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 JPEG(Joint Photographic Experts Group), JPEG 2000, Exif(Exchangeable image file format), TIFF(Tagged Image File Format), RAW, PNG(Portable Network Graphics), GIF(Graphics Interchange Format), Windows^® BMP(bitmap), PPM(portable pixmap), PGM(portable graymap), PBM(portable bitmap file format) 및 WebP를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 디지털 이미지는 모든 적합한 디지털 비디오 포맷으로 저장된다. 적합한 디지털 비디오 포맷은 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만, AVI, MPEG, Apple^®QuickTime^®, MP4, AVCHD^®, Windows Media^®, DivX^TM, Flash Video, Ogg Theora, WebM 및 RealMedia를 포함한다.

비전송 컴퓨터 판독가능 저장 매체

어떤 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템, 플랫폼, 소프트웨어, 네트워크 및 방법은, 선택적으로 네트워크로 연결된 디지털 처리 장비의 운영체제에 의해 실행 가능한 명령을 포함하는 프로그램으로 인코딩된 하나 이상의 비전송 컴퓨터 판독가능 저장 매체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 컴퓨터 판독가능 저장 매체는 디지털 처리 장비의 유형 구성요소이다. 또 다른 실시양태에서, 컴퓨터 판독가능 저장 매체는 디지털 처리 장비로부터 선택적으로 제거가능하다. 어떤 실시양태에서, 컴퓨터 판독가능 저장 매체는 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만, CD-ROM, DVD, 플래시 메모리 장비, 반도체 기억장치, 자기식 디스크 드라이브, 광디스크 드라이브, 클라우드 컴퓨팅 시스템 및 서비스 등을 포함한다. 어떤 경우에 있어, 프로그램과 지침은 매체 상에 영구적으로, 상당히 영구적으로, 반영구적으로, 또는 비일시적으로 미디어 상에 암호화되어 있다.

컴퓨터 프로그램

어떤 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템, 플랫폼, 소프트웨어, 네트워크 및 방법은 적어도 한개의 컴퓨터 프로그램을 포함한다. 컴퓨터 프로그램은 지정된 작업을 수행하기 위해 작성된 디지털 처리 장비의 CPU에 있는 명령어 시퀀스를 포함한다. 본원에 제공되는 명세서를 고려하여, 당해 분야의 기술자들은 컴퓨터 프로그램이 다양한 언어의 다양한 버전으로 쓰여질 수 있다는 것을 인식할 것이다. 어떤 실시양태에서, 컴퓨터 프로그램은 한개의 명령어 시퀀스를 포함한다. 어떤 실시양태에서, 컴퓨터 프로그램은 많은 수의 명령어 시퀀스를 포함한다. 어떤 실시양태에서, 컴퓨터 프로그램은 한 장소에서 제공된다. 다른 실시양태에서 컴퓨터 프로그램은 많은 장소에서 제공된다. 다양한 실시양태에서, 컴퓨터 프로그램은 하나 이상의 소프트웨어 모듈을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 컴퓨터 프로그램은 부분적으로 또는 전체적으로 하나 이상의 웹 애플리케이션, 하나 이상의 모바일 애플리케이션, 하나 이상의 독립형 애플리케이션, 하나 이상의 웹브라우저 플러그인, 확장, 애드인 또는 애드온 또는 이의 조합을 포함한다.

웹 애플리케이션

어떤 실시양태에서, 컴퓨터 프로그램은 웹 애플리케이션을 포함한다. 본원에 제공되는 명세서를 고려하여, 당업계의 기술자라면 다양한 실시양태에 있는 웹 애플리케이션이 하나 이상의 소프트웨어 프레임워크 및 하나 이상의 데이터베이스 시스템을 이용한다는 것을 인식할 것이다. 어떤 실시양태에서, 웹 애플리케이션은 Microsoft^® .NET 또는 RoR(Ruby on Rails)과 같은 소프트웨어 프레임워크 상에서 만들어진다. 어떤 실시양태에서, 웹 애플리케이션은 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 관계형, 비관계형, 객체 지향, 연관성 및 XML 데이터베이스 시스템을 포함하는 하나 이상의 데이터베이스 시스템을 이용한다. 다른 실시양태에서, 적합한 관계형 데이터베이스 시스템은 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 Microsoft^® SQL Server, mySQL_TM 및 Oracle^®을 포함한다. 또한 당업계의 기술자라면 다양한 실시양태에서 웹 애플리케이션이 하나 이상의 언어로 이루어진 하나 이상의 버전으로 작성되었다는 것을 인식할 것이다. 웹 애플리케이션은 하나 이상의 마크업 언어, 프레젠테이션 정의 언어, 클라이언트측 스크립팅 언어, 서버측 코딩 언어, 데이터베이스 쿼리 언어 또는 이들의 조합으로 작성될 수 있다. 어떤 실시양태에서, 웹 애플리케이션은 어느정도 HTML(Hypertext Markup Language), XHTML(Extensible Hypertext Markup Language), 또는 XML(eXtensible Markup Language)과 같은 마크업 언어로 기록된다. 어떤 실시양태에서, 웹 애플리케이션은 어느정도 CSS(Cascading Style Sheets)와 같은 프리젠테이션 정의 언어로 기록된다. 어떤 실시양태에서, 웹 애플리케이션은 어느정도 AJAX(Asynchronous Javascript and XML), Flash^® Actionscript, Javascript, 또는 Silverlight^®과 같은 클라이언트측 스크립팅 언어로 기록된다. 어떤 실시양태에서, 웹 애플리케이션은 어느정도 ASP(Active Server Pages), ColdFusion^®, Perl, Java^TM, JSP(JavaServer Pages), PHP(Hypertext Preprocessor), Python^TM, Ruby, Tcl, Smalltalk, WebDNA^®, 또는 Groovy와 같은 서버측 코딩 언어로 기록된다. 어떤 실시양태에서, 웹 애플리케이션은 어느정도 SQL(Structured Query Language)과 같은 데이터베이스 쿼리 언어로 기록된다. 어떤 실시양태에서, 웹 애플리케이션은 IBM^® Lotus Domino^®과 같은 엔터프라이즈 서버 제품을 통합한다. 어떤 실시양태에서, 기술자가 일부 구현된 정보 및 미디어 파일을 업로드할 수 있도록 기술자용 경력 개발 네트워크를 제공하는 웹 애플리케이션은 미디어 플레이어 요소를 포함한다. 다양한 다른 실시양태에서, 미디어 플레이어 요소는 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 Adobe^® Flash^®, HTML 5, Apple^®QuickTime^®, Microsoft^®Silverlight^®, Java^TM 및 Unity^®를 포함하는 하나 이상의 적합한 멀티미디어 기술을 이용한다.

모바일 애플리케이션

어떤 실시양태에서, 컴퓨터 프로그램은 모바일 디지털 처리 장비에 제공되는 모바일 애플리케이션을 포함한다. 어떤 실시양태에서, 모바일 애플리케이션은 그것이 제조될 때 모바일 디지털 처리 장치에 제공된다. 다른 실시양태에서, 모바일 애플리케이션은 본원에 기재된 컴퓨터 네트워크를 통해 모바일 디지털 처리 장비에 제공된다.

본원에 제공되는 명세서를 고려하여, 모바일 애플리케이션은 당업계에 알려진 하드웨어, 언어 및 개발 환경을 사용하여, 당업계의 기술에 의해 만들어질 수 있다. 당업계의 기술자라면 모바일 애플리케이션이 다양한 언어로 기재되어 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 적합한 프로그램 언어는 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 C, C++, C#, Objective-C, Java^TM, Javascript, Pascal, Object Pascal, Python^TM, Ruby, VB.NET, WML 및 CSS가 있거나 없는 XHTML/HTML 또는 이의 조합을 포함한다.

적합한 모바일 애플리케이션 개발 환경은 여러 소스로부터 이용가능하다. 상업적으로 이용가능한 개발 환경은 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 AirplaySDK, alcheMo, Appcelerator^®, Celsius, Bedrock, Flash Lite, .NET Compact Framework, Rhomobile 및 WorkLight 모바일 플랫폼을 포함한다. 비용이 들지 않는 다른 이용가능한 개발 환경은 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 Lazarus, MobiFlex, MoSync 및 Phonegap을 포함한다. 또한, 모바일 장비 제조업체에서 배포하는 소프트웨어 개발 키트는 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 iPhone 및 iPad(iOS)SDK, Android^TM SDK, BlackBerry^TM SDK, BREW SDK, Palm^®OS SDK, Symbian SDK, webOS SDK 및 Windows^®Mobile SDK를 포함한다.

당업계에 있는 기술자라면 몇가지 상업적 포럼이 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 Apple^® App Store, Android^TM Market, BlackBerry^® App World, App Store for Palm devices, App Catalog for webOS, Windows^® Marketplace for Mobile, Ovi Store for Nokia^® devices, Samsung^® Apps 및 Nintendo^® DSi Shop를 포함하는 모바일 애플리케이션 배포용으로 가능하게 한다는 것을 잘 알것이다.

독립형 애플리케이션

어떤 실시양태에서, 컴퓨터 프로그램은 독립형 애플리케이션을 포함하는데, 이것은 플러그인이 아닌 기존 프로세스에 대한 추가 기능이 아니라 독립 컴퓨터 프로세스로 실행되는 프로그램이다. 당업계에 있는 기술자라면 독립형 애플리케이션이 종종 컴파일된다는 것을 잘 알것이다. 컴파일러는 프로그래밍 언어로 작성된 소스 코드를 어셈블리 언어 또는 기계 코드와 같은 이진 개체 코드로 변환하는 컴퓨터 프로그램이다. 적합한 컴파일 프로그램은 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 C, C++, Objective-C, COBOL, Delphi, Eiffel, Java^TM, Lisp, Python^TM, Visual Basic, 및 VB .NET, 또는 이의 조합을 포함하며, 실행가능한 프로그램을 만든다. 컴파일은 실행가능한 프로그램을 만들기 위해, 종종 적어도 부분적으로 수행된다. 어떤 실시양태에서, 컴퓨터 프로그램은 하나 이상의 실행가능한 컴파일 애플리케이션을 포함한다.

소프트웨어 모듈

다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템, 플랫폼, 소프트웨어, 네트워크 및 방법은 소프트웨어, 서버 및 데이터베이스 모듈을 포함한다. 본원에 제공되는 명세서를 고려하여, 소프트웨어 모듈은 당업계에 공지된 기계, 소프트웨어 및 언어를 사용하여, 당업계의 기술자에게 알려진 기술에 의해 만들어진다. 본원에 기재된 소프트웨어 모듈은 다양한 방식으로 구현된다. 다양한 실시양태에서, 소프트웨어 모듈은 파일, 코드 섹션, 프로그래밍 객체, 프로그래밍 구조 또는 이의 조합을 포함한다. 다른 다양한 실시양태에서, 소프트웨어 모듈은 많은 파일, 많은 코드 섹션, 많은 프로그래밍 객체, 많은 프로그래밍 구조 또는 이의 조합을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 하나 이상의 소프트웨어 모듈은 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 웹 애플리케이션, 모바일 애플리케이션 및 단독형 애플리케이션을 포함한다. 일 실시양태에서, 소프트웨어 모듈은 하나의 컴퓨터 프로그램 또는 애플리케이션 내에 있다. 다른 실시양태에서, 소프트웨어 모듈은 하나 이상의 컴퓨터 프로그램 또는 애플리케이션 내에 있다. 어떤 실시양태에서, 소프트웨어 모듈은 하나의 기계에서 호스트된다. 다른 실시양태에서, 소프트웨어 모듈은 하나 이상의 기계에서 호스트된다. 다른 실시양태에서, 소프트웨어 모듈은 클라우드 컴퓨팅 플랫폼 상에 호스트된다. 어떤 실시양태에서, 소프트웨어 모듈은 한 위치에 있는 하나 이상의 시스템에 호스트된다. 다른 실시양태에서 소프트웨어 모듈은 하나 이상의 위치에 있는 하나 이상의 시스템에 호스트된다.

어떤 실시양태에서, 시스템은 차별적 진단을 수행하기 위해 제공되며, 상기 시스템은 하기의 구성을 포함한다: (a) 계내 합성된 적어도 10,000개의 다른 펩타이드를 포함하는 펩타이드 어레이로서, 대상자로부터 얻은 샘플이 어레이 상에 접촉되는 것인 펩타이드 어레이; (b) 상기 어레이 상에 있는 적어도 25개의 펩타이드에 대한, 상기 샘플에 존재하는 항체의 결합을 검출하여 결합 신호의 조합을 얻는 검출기; 및 (c) 기준 결합 신호의 조합 중 하나 이상의 그룹과 상기 결합 신호의 조합을 비교 및 분석하는 디지털 처리 장비로서, 상기 기준 결합 신호의 조합의 그룹의 각각은 다른 질환을 가진 복수의 대상자로부터 얻은 결합 신호를 포함하며, 이로 인해 상기 차별적 진단을 실시하고, 상기 방법의 수행능은 ROC 곡선 하 면적(AUC)가 0.6보다 큰 것을 특징으로 하는 디지털 처리 장비.

다른 실시양태에서, 자가면역 질환을 갖는 것으로 알려진 대상자에서의 질환의 진행을 결정하기 위한 시스템이 제공되며, 상기 시스템은 하기를 포함한다:(a) 계내 합성된 적어도 10,000개의 다른 펩타이드를 포함하는 펩타이드 어레이; (b) 상기 어레이상에 있는 적어도 25개의 펩타이드에 대한, 상기 샘플에 존재하는 항체의 결합을 검출하여 결합 신호의 첫번째 조합을 얻는 검출기; 및 (c) 상기 결합 신호의 첫번째 조합을 하나 이상의 기준 결합 신호의 두번째 조합과 비교 및 분석하는 디지털 처리 장비로서, 기준 결합 신호의 두번째 조합은 상기 자가면역 질환의 진행을 가리키는 임상 증상을 가진 복수의 대상자를 포함하는 기준 그룹으로부터 얻은 결합 신호의 조합을 포함하며, 이로 인해 상기 차별적 진단을 실시하고, 상기 방법의 수행능은 ROC 곡선 하 면적(AUC)이 0.6보다 큰 것을 특징으로 하는 디지털 처리 장비.

본 발명은 하기 실시예에 보다 자세히 기재되어 있으며, 하기 실시예가 청구되는 발명의 범위를 제한하려는 의도는 전혀 없다. 첨부된 도면은 본 발명의 사양과 상세한 설명에 있어 필수적인 부분으로서 간주되어야 한다. 하기 실시예는 단지 예시로서 제공되는 것이며 본 발명에 청구되는 것에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에 보여지고 기술되어져 있으며, 이는 오직 예시로서 제공된다는 것임을 당업자라면 명확히 알 수 있다. 당업자라면 본 발명으로부터 벗어나지 않는 범위에서 다양한 변형, 변화 및 치환을 수행할 수 있을 것이다. 본원에 기술된 실시양태에 대한 다양한 변형이 본 발명을 예측하는데 사용될 수 있는 것으로 이해될 수 있다. 하기 청구항은 본 발명의 범위를 명확히 하는 것이며 청구항의 범위 내에 있는 방법과 구조 및 이의 등가물은 청구항에 의해 보호된다.

실시예

실시예 1 - 분석 방법

대략적으로, "면역특징" 분석법 프로토콜은 ELISA의 원리를 따른다. 펩타이드 어레이 슬라이드를 세척하고 물에 수화시켰다. 그리고 난뒤, 상기 슬라이드를 BSA 용액(3% w/v BSA가 든 PBS-T)에 넣어 실온에서 천천히 흔들면서 60분 동안 블로킹시켰다. 질환자 및 건강한 지원자로부터 얻은 혈청 또는 혈장 샘플 100 ㎕를 PBST 베이스 완충액에 희석시켰다. 그리고 난 뒤, 각 샘플 90 ㎕를 펩타이드 어레이 상에서 1시간 동안 37℃에서 교차 혼합 프로토콜로 인큐베이트하였다. 샘플(일차 항체)을 인큐베이트한 뒤에 어레이를 PBST 세척 완충액으로 세척하였다. 상기 세척 단계 후에, 상기 어레이를 90 ㎕의 이차 항체(Alexa-555에 콘쥬게이트된 양 항-인간 IgG, Life-Technologies)로 인큐베이트하였다. 상기 이차 시약을 1시간 동안 37℃에서 교차 혼합 프로토콜로 인큐베이트하였다. 측정의 정량화와 재현성을 확보하기 위해 이차 항체-단독 대조군(음성 대조군)을 정상 혈청 대조군 샘플을 각 슬라이드에 포함시켰다. 한시간 동안 인큐베이트한 후에, 어레이를 PBST 세척 완충액으로 다시 세척하고, 뒤따라 물과 이소프로판올로 세척하였으며, 원심분리기로 건조시켰다. 그리고 난 후, 이 슬라이드를 Innopsys 910AL 마이크로어레이 스캐너(InnoScan, Inc. Serial number 913p03)로 스캔하였다. 532nm에서 레이저 자극, 547nm에서 양자화하여 형광 신호를 측정하였다.

Innopsys Mapix 소프트웨어 패키지(Innopsys Inc)를 사용해 데이터를 수득하였다. 어레이는 이상치 데이터를 위해 분석하였다. 중간값 규격화와 log₁₀-변환을 하고 난 뒤, 기술 반복실험에 걸친 각 특징의 중간 강도를 계산하여 분류기 개발 작업에 사용하였다.

서포트 벡터 머신(SVM) 분류기를 훈련시켰고 교차-입증 그룹의 4분의 1에 각 샘플을 배정함으로써 교차-입증하였다. 훈련 그룹에 있는 대조군과 사례군을 구별하는 특성은 p-값별로 순위가 매겨졌다. 상위의 k 특성은 SVM 모델에 입력값으로 사용하였으며, 4개 모델로부터의 모든 예측값 vs 실제 질환 분류로부터 얻은 모든 예측값을 사용하여 곡선 하 면적(AUC) 또는 민감도/특이도/정확도를 계산하여 수행하였다. 평균값을 계산하였고 신뢰구간(CI)을 계산하였다. "볼케이노" 플롯(즉, p-값 vs. log 배수 변화), ROC(수신기 작동 특성) 곡선 및 실행 vs 입력 펩타이드 수를 포함하는 것으로 진단을 시각화하였다.

실시예 2 - 피부경화증 및 전신경화증을 위한 진단 및 예측 분석법

배경: 피부경화증과 전신경화증(SSc)은 피부가 두꺼워지고, 흉터형성, 혈관 문제 및 피부 뿐만 아니라 내부 장기에도 다양한 염증을 나타내는 양상을 나타내는 결합조직의 질환이다. 피부경화증의 진단은 다른 자가면역 질환과 중복되기도 하고 복잡한 임상 증상을 가지기 때문에 진단이 어렵다. 이는 일반적으로 병력의 검토, 진찰, 실험실 테스트 및 X-레이의 조합을 필요로 한다. 하나의 바이오마커만은 이용할수 없지만 혈청학 테스트에서 환자의 60%-80%에 ANA 및 항센트로미어 항체(ACA)가, 환자의 30%에 ScL 70 항체가 있는 것으로 확인되었다. 그러나, 이들 항체들은 어떤 건강한 사람이나 다른 자가면역 질환, 예를 들어 피부근육염(DM)을 가진 환자에서도 발견되었다. 더 훌륭한 진단을 하기 위해서는 더 좋은 예측 테스트가 필요하다. 레이노증후근은 피부경화증 환자의 약 75%에서 나타나 피부경화증의 첫번째 임상 증상이 되지만 예측적 도구로는 제공되지 않는다. 제한된 부위의 피부 보다는 광범위한 부위에 있는 환자는 ILD, PAH, GAVE 및 신장 합병증과 같은 더 심각한 상태로 진행하는 경향이 있다. 그러나, 이러한 관찰은 예측을 하기에는 충분히 믿음직하지 않은 것이다.

방법: 719개의 혈장 샘플로 실험을 수행하였다; 이는 SSC(n=301), DM(205), MCTD, UCTD, 루푸스, 근육염 & 다발근육염, 국소피부경화증을 포함하는 다른 자가면역 질환 그룹(95), 및 건강한 샘플(118)로 구성되어 진다. 84개의 대조군 샘플 패널은 측정을 정량화하기 위해 사용하였다.

모든 환자들은 진단에서 ACR 분류 기준을 만족하였다. IS 분석은 약 126,000개까지의 단일 펩타이드로 이루어진 마이크로어레이에 결합한 혈장 항체를 검출하는데 사용하였다. 펩타이드 서열은 광범위하게 샘플 복합 공간에 디자인(16개 내지 20개의 아미노산을 사용하여)하였으며, 이를 통해 항체가 선별적으로 경쟁적으로 결합하게 하는 다양한 에피토프 모방체의 라이브러리를 제공한다. SSc를 가장 식별가능하게 하는 특징은 T 검정을 통해 확인하였다. 서포트 벡터 머신(SVM) 분류기를 훈련시켰고 5배의 교차 입증 분석을 100번 반복함으로써 평가하였다. 25 내지 10,000개 범위의 펩타이드 입력 모델을 평가하였다.

결과: 10,000개의 차별적으로 결합한 펩타이드 상에서 훈련된 분류기는 강력한 퍼포먼스 특징을 가지고 건강한 지원자로부터 SSc 환자를 구분하도록 하였다. 비슷한 모델 사이즈를 가진 다른 알고리즘을 만들어서 DM과 같은 다른 자가면역 질환으로부터 SSc를 차별화하게 하였다. 마지막으로, ILD, 신장 위기 및 GAVE와 같은 몇가지 더 심각한 상태로 진행된 적이 있는 SSc 환자는, 이런 SSc 환자로부터 누구도 한적이 없었던 구별을 할 수 있게 하였다. 이러한 분류기 작업의 교차-검증된 추정 결과는 표 1에 나타내었다.

도 5는 SSc를 가진 환자를 건강한 지원자와 비교시 면역특징 상에서 상위의 차별적 펩타이드를 나타내는 표이다. 도 5a는 상위의 서브-모티프를 나타낸다. 도 5b는 상위 1000개의 차별적 펩타이드에서 압축된 펩타이드를 나타낸다. 도 6은 도 5의 결과를 그래프로 나타낸 것이다. (A)에 있는 모티프의 목록 및 (B)에 있는 아미노산 및 본원에 제공되는 차별적 펩타이드의 모든 표에 적용된 제목에서, "n"은 상위 식별 펩타이의 서열에 나타난 모티프의 횟수이며; "n. lib"는 라이브러리에 나타난 모티프의 횟수이며; "압축"은 라이브러리에 있는 모든 서열에서 발견되는 모든 모티프와 비교시 식별 펩타이드에 있는 모티프의 압축 인자를 말하며; "padj. holm"은 다중 검증 에러에 대한 대조군에 대한 p-보정 값이다.

도 7은 SSc로 진단된 환자를 다른 자가면역 질환자와 비교시 면역특징에서 상위의 차별적 펩타이드를 표시한 표이다. "다른 자가면역 질환"은 비정형 근육염, 여드름 장미증, ILD와 근육염을 동반하는 항-PL7, 비정형 근육염, 베체트병, 비전형 크론병, 발진, 피부 루푸스, 원반모양 루푸스, DM, 항체에 음성인 DM 발진, DM vs 루푸스, DM vs UCTD, 약물 발진,　호산구 근막염, 이식 편대 숙주 질환(GVHD), 호치킨병, 편평태선, lSSc, 루푸스 지방층염, 혼합 결합조직 질환(MCTD), 국소피부경화증, 약물 유도 근육염, Jo-1 항체를 가진 근육염, 신장기원 전신 섬유증, 류마티스성 다발성 근육통, 다발근육염, 가능한 DM--대기 혈청구분, 발생 가능한 약물 발진, 건선, 폐섬유증, 항-J01이 있는 폐섬유증, 오직 레이노병, 횡문근융해, Sle, 혼합된 SLE, SSc, SSc/DM 중첩, SSc/SLE, 미분화된 결합조직 질환(UCTD), 발진을 동반한 UCTD, 원인불명, 두드러기 특징을 나타내는 원인불명 및 진단하지 않은 쇠약을 포함한다. 도 7a는 상위 서브-모티프를 나타낸다. 도 7b는 상위 1000개의 차별적 펩타이드 내에 있는 압축된 펩타이드를 나타낸다. 도 8은 도 7에 있는 결과를 나타낸 그래프이다.

도 9는 SSc로 진단된 환자를 신장 위기를 가진 환자와 비교시 면역특징에서 상위의 차별적인 펩타이드를 표시한 표이다. 도 9a는 상위 서브-모티프를 나타낸다. 도 9b는 상위 1000개의 차별적 펩타이드 내에 있는 압축된 펩타이드를 나타낸다. 도 10은 도 9에 있는 결과를 나타낸 그래프이다.

도 11은 SSc로 진단된 환자를 위전정부 혈관확장증(GAVE)을 가진 환자와 비교시 면역특징에서 상위의 차별적인 펩타이드를 표시한 표이다. 도 11a는 상위 서브-모티프를 나타낸다. 도 11b는 상위 1000개의 차별적 펩타이드 내에 있는 압축된 펩타이드를 나타낸다. 도 12은 도 11에 있는 결과를 나타낸 그래프이다.

도 13은 SSc로 진단된 환자를 DM을 가진 환자와 비교시 면역특징에서 상위의 차별적인 펩타이드를 표시한 표이다. 도 13a는 상위 서브-모티프를 나타낸다. 도 13b는 상위 1000개의 차별적 펩타이드 내에 있는 압축된 펩타이드를 나타낸다. 도 14는 도 13에 있는 결과를 나타낸 그래프이다.

도 15는 간질성 폐질환을 동반한(ILD+) SSc로 진단된 환자를 간질성 폐질환을 동반하지 않은(ILD-) SSc 환자와 비교시 면역특징에서 상위의 차별적인 펩타이드를 표시한 표이다. 도 15a는 상위 서브-모티프를 나타낸다. 도 15b는 상위 1000개의 차별적 펩타이드 내에 있는 압축된 펩타이드를 나타낸다. 도 16은 도 15에 있는 결과를 나타낸 그래프이다.

결론: 유사-펩타이드 마이크로어레이 상에서 말초-혈액 항체에 의해 만들어지는 재현성 결합 패턴은 건강한 자원자와 다른 자가면역 질환자로부터 SSc를 차별적으로 구별해낼 수 있게 한다. 또한, 변별적인 면역특징은 더 심각한 질환의 임상 증상으로 진행한 적이 있는 SSc 환자에 대해서도 적용될 수 있다. 이를 통해 IS 기술이 SSc에 대한 신규한 진단법과 예측법 모두를 개발하는 수단이 될 수 있음을 알 수 있다.

표 1. SSc를 진단 및 예측하기 위한 IS의 기능 분류 평가

실시예 3 - 간질성 폐질환을 가진 환자로부터 피부근육염과 전신경화증의 구별

배경: 피부근육염(DM)은 피부, 근육 및 폐에 영향을 주는 비균질한 임상 증상을 나타나는 염증성 자가면역 질환이다. 복잡한 발현은 임상적 진단과 예측을 하는데 있어서 도전적이게 한다. 조직학적 발견도 또한 다양해서 이들의 능력을 어리둥절하게 만든다. 혈청학 진단에서 제안된 것으로 확인된 몇몇 DM-특이 항원이 가능할 지도 모른다. 그러나, 많은 DM 환자들이 이러한 항원에 대한 항체를 보유하고 있지 않기 때문에 대체가능한 항원이 필요하다. 간질성 폐질환(ILD)은 환자의 20-40%에서 발생하며, 미약한 수준에서부터 급속히 진행되는 넓은 스펙트럼을 가지고 있고 치명적일 수도 있는 폐질환이다. 어떤 DM-혈청형은 ILD 진행에 있어서 다른 것 보다도 훨씬 위험성이 높지만, 혈청형 자체는 임상적 치료를 가이드하는데 있어서 충분히 민감하거나 특이적이지 않다.

다른 염증성 자가면역 질환으로부터 DM을 차별화하고 예측하기 위한 간단한 테스트는 ILD로 진행하고 있는 환자의 치료를 향상시킬 수 있을 것이다. 더불어, 새로운 DM-항원을 발견하는 방법은 진단적 및 치료학적 노력을 향상시킬수 있을 것이다. 면역특징(IS) 플랫폼은 임상적 및 개발적 목표 모두를 달성하는 지를 확인하기 위해 개발되었다.

방법: 719개의 혈장 샘플로 실험을 수행하였다; 이는 SSC(n=301), DM(205), MCTD, UCTD, 루푸스, 근육염 & 다발근육염, 국소피부경화증을 포함하는 다른 자가면역 질환 그룹(95), 및 건강한 샘플(118)로 구성되어 진다. 84개의 대조군 샘플 패널은 측정을 정량화하기 위해 사용하였다. 모든 환자들은 진단에서 ACR 분류 기준을 만족하였다. IS 분석은 약 126,000개의 유일 펩타이드로 이루어진 마이크로어레이에 결합한 혈장 항체를 검출하는데 사용하였다. 펩타이드 서열은 광범위하게 샘플 복합 공간에 디자인하였으며, 이를 통해 항체가 선별적으로 경쟁적으로 결합하게 하는 다양한 에피토프 모방체의 라이브러리를 제공한다. DM을 가장 식별가능하게 하는 특징은 T 검정을 통해 확인하였다. 분류 효과는 5배의 교차 입증 분석을 100번 반복함으로써 서포트 벡터 머신(SVM)에서 평가하였다.

결과: 이러한 분류기 작업의 교차-검증된 추정 결과는 표 2에 나타내었다. 차별적으로 결합한 펩타이드 상에서 훈련된 알고리즘은 건강한 자원자와 SSc와 같은 다른 AI로부터 DM을 구분하였다. ILD로 진행된 적이 있는 DM과 SSc 환자는, 이런 환자로부터 누구도 한적이 없었던 구별을 할 수 있게 하였다. 10,000개 까지의 펩타이드의 항체-결합 특징은 질환 군을 구별하는 것으로 확인되었고 이러한 분류를 위한 입력값으로 사용되었다. 특히, DM:ILD+/- 및 SSc:ILD+/-를 위한 모델은 유사하게 예측을 하지만; 이러한 2개의 분류에 사용된 유의적으로 선별가능한 펩타이드는 중첩이 전혀 없었다.

표 2. DM 대비를 위한 IS의 기능 분류 평가

도 17은 DM으로 진단된 환자를 건강한 대상와 비교시 면역특징에서 상위의 차별적인 펩타이드를 표시한 표이다. 도 17a는 상위 서브-모티프를 나타낸다. 도 17b는 상위 1000개의 차별적 펩타이드 내에 있는 압축된 펩타이드를 나타낸다. 도 18는 도 17에 있는 결과를 나타낸 그래프이다.

도 19는 DM으로 진단된 환자를 다른 자가면역 질환자와 비교시 면역특징에서 상위의 차별적인 펩타이드를 표시한 표이다. "다른 자가면역 질환"은 비정형 근육염, 여드름 장미증, ILD와 근육염을 동반하는 항-PL7, 비정형 근육염, 베체트병, 비전형 크론병, 발진, 피부 루푸스, 원반모양 루푸스, DM, 항체에 음성인 DM 발진, DM vs 루푸스, DM vs UCTD, 약물 발진,　호산구 근막염, 이식 편대 숙주 질환(GVHD), 호치킨병, 편평태선, lSSc, 루푸스 지방층염, 혼합 결합조직 질환(MCTD), 국소피부경화증, 약물 유도 근육염, Jo-1 항체를 가진 근육염, 신장기원 전신 섬유증, 류마티스성 다발성 근육통, 다발근육염, 가능한 DM--대기 혈청구분, 발생 가능한 약물 발진, 건선, 폐섬유증, 항-J01이 있는 폐섬유증, 오직 레이노병, 횡문근융해, Sle, 혼합된 SLE, SSc, SSc/DM 중첩, SSc/SLE, 미분화된 결합조직 질환(UCTD), 발진을 동반한 UCTD, 원인불명, 두드러기 특징을 나타내는 원인불명, 및 진단하지 않은 쇠약을 포함한다. 도 19a는 상위 서브-모티프를 나타낸다. 도 19b는 상위 1000개의 차별적 펩타이드 내에 있는 압축된 펩타이드를 나타낸다. 도 20은 도 19에 있는 결과를 나타낸 그래프이다.

도 21은 간질성 폐질환을 동반한(ILD+) DM으로 진단된 환자를 간질성 폐질환을 동반하지 않은(ILD-) DM으로 진단된 환자와 비교시 면역특징에서 상위의 차별적인 펩타이드를 표시한 표이다. 도 21a는 상위 서브-모티프를 나타낸다. 도 21b는 상위 1000개의 차별적 펩타이드 내에 있는 압축된 펩타이드를 나타낸다. 도 22는 도 21에 있는 결과를 나타낸 그래프이다.

미모토프(mimotope) 결합 패턴은 비-DM 환자로부터 DM 환자를 확인할 수 있게 한다. 이들 펩타이드가 모방하는 항원을 복호화하는 것은 새로운 DM-특이적 항원을 드러내어 줄 수 있게 한다. 또한, 다른 AI 및 ILD로 진행된 환자로부터 DM을 분류하는 것이 확인되었다. DM vs SSc 환자에 대한 ILD 예측 펩타이드 사이의 어떠한 중첩의 부족함도 이들이 공통의 임상 증상과 치료법을 가짐에도 불구하고, 단일 질환이라는 결론을 내리는데 지원할 수 있다.

유사-펩타이드 마이크로어레이상에서 말초-혈액 항체에 의해 만들어지는 재현성 결합 패턴은 건강한 자원자와 다른 자가면역 질환자로부터 SSc를 차별적으로 구별해낼 수 있게 한다. 또한, 변별적인 면역특징은 더 심각한 질환의 임상 증상으로 진행한 적이 있는 SSc 환자에 대해서도 적용될 수 있다. 이를 통해 IS 기술이 SSc에 대한 신규한 진단법과 예측법 모두를 개발하는 수단이 될 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에 보여지고 기술되어져 있으며, 이는 오직 예시로서 제공된다는 것임을 당업자라면 명확히 알 수 있다. 당업자라면 본 발명으로부터 벗어나지 않는 범위에서 다양한 변형, 변화 및 치환을 수행할 수 있을 것이다. 본원에 기술된 실시양태에 대한 다양한 변형이 본 발명을 예측하는데 사용될 수 있는 것으로 이해될 수 있다. 하기 청구항은 본 발명의 범위를 명확히 하는 것이며 청구항의 범위 내에 있는 방법과 구조 및 이의 등가물은 청구항에 의해 보호된다.

실시예 4 - 면역원성 자가항원 표적의 확인

SSc를 가진 대상자로부터 건강한 대상자를 구별하는 식별 펩타이드를 원래의 면역원성 자가항원 표적을 나타내기 위한 인간 프로테옴에 대해 상대적으로 분석하였다. 식별 펩타이드는 p-값이 p<2.53E-06 미만인 것으로 선별하였다.

프로테옴 정렬: 각각의 단일 유전자 ID에 대한 가장 긴 전사체 변이를 사용하여, 2016년 3월 10일에 편집한 인간 게놈 빌드 GrCh38 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/)에 대응하는 인간 프로테옴 RefSeq 릴리즈 84에 있는 단백질에 어레이 펩타이드를 정렬시켰다. 정렬 알고리즘은 변형된 BLAST 수단(Altschul, S.F. & Gish, W. (1996) "Local alignment statistics." Meth. Enzymol. 266:460-480)을 사용하며, 갭 패널티 4를 가지는 3개의 아미노산 시드를 필요로 하며, 어레이의 아미노산 조성을 반영해(States, D.J., Gish, W., Altschul, S.F. (1991) "Improved sensitivity of nucleic acid database searches using application-specific scoring matrices." Methods 3:66-70) 변형한 스코어 매트릭스 BLOSUM62(Henikoff, J.G.　Amino acid substitution matrices from protein blocks.　Proc. Natl. Acad. Sci. USA　89:10915-10919 [1992])를 이용한다. 이 변형은 치환의 생성, 어레이로부터 부재하는 아미노산에 대한 패널티의 제거 및 모든 정확한 매치를 동등하게 하는 점수를 증가시킨다.

단백질에 대한 면역특징 펩타이드 세트의 정렬을 위한 p-값을 만들기 위해, 단백질에 대해 양의 BLAST 점수를 나타내는 모든 펩타이드를 매트릭스 내로 장착시켰으며, 이 매트릭스는 정렬된 펩타이드에 대응하는 매트릭스의 각 열과 이 단백질을 포함하는 연이은 아미노산 중의 하나에 상응하는 각 컬럼을 가지고 있으며, 단백질에 정렬을 가능하게 하는 펩타이드 열 내에 허락된 갭과 결손을 가지고 있다. 프로테옴 정렬을 위해 비슷한 점수의 매트릭스로부터 얻어진 매트릭스 내의 각 위치는 점수이며, 여기에 짝이 맺어진 펩타이드와 단백질 아미노산이 위치해 있다. 그리고, 단백질 내에 있는 각 아미노산에 대해, 대응되는 컬럼은 면역특징 펩타이드에 의해 그 아미노산을 커버하는 것으로 나타내어진 "중첩 점수"를 만들기 위해 합산된다. 라이브러리 조성에 대한 이 점수를 조정하기 위해, 중첩 점수는 모든 어레이 펩타이드 목록에 대해 동일한 방법을 사용하여 계산한다. 마지막으로, Fischer Exact 테스트는 전체 라이브러리 중첩 점수에 대한 면역특징 중첩 점수의 p-값을 계산하기 위해 사용된다. 이 아미노산 레벨에서의 p-값을 전체 단백질 통계치로 변환시키기 위해, 단백질 내의 모든 가능한 20-mer 에피토프에 대한 p-값의 음성 로그값의 값을 계산하였으며, 최종 점수는 각 단백질에 대한 롤링 윈도우 중에서 최대값이다.

표 3은 본 발명의 방법에 따라 확인한 상위 점수 표적 단백질의 목록을 제공한다. 169개의 후보 바이오마커가 확인되었다. 식별 펩타이드는 Welch's T 검정을 통해 p-값이 p<2.53E-06 미만인 것으로 선택하였다.

표 3. 건강한 대상자의 샘플로부터 SSc를 가진 대상자의 샘플을 구별하는 식별 펩타이드의 정렬로부터 확인된 후보 표적 단백질

RNA 폴리머라제 II 서브유닛 L은 SSc를 가진 대상자로부터 건강한 대상자를 구별하는 차별적 펩타이드를 이용하는 방법에 의해 확인된 면역원성 자가항원의 예이다(도 23a 및 b).

도 23a는 펩타이드 중첩 차이 점수를 보여주며, 이 점수 (s)는 RNA 폴리머라제 II 서브유닛 L aa 위치에 나란히 플롯된 IMS 펩타이드-모티프를 정렬하는데 계산된 것이다. SSc vs 건강한 대조군으로부터의 펩타이드는 프로테옴에 있는 인간 단백질 20,378개 중에 35개에서 RNA 폴리머라제 II 서브유닛 L이 유의적인 정렬을 나타내는 것을 보여주었다. 오른쪽의 공-막대모양 모델에서는 RNA 폴리머라제 II 서브유닛 L의 구조를 보여준다. 공 모양으로 표시된 부분은 그래프 내에 있는 빨간색 박스내에 표시된 aa 위치에 대응된다. 가장 높은 점수의 aa는 아스파르트산인 D이며, RNA 폴리머라제 클러스터의 중심에 위치하고 있고; 이는 오렌지색의 공모양으로 표시된다. 우리는 클러스터의 중심 근처에 트레오닌(T)이 거의 표시되지 않은 것을 확인하였는데; IMS 어레이 서열 내에는 T가 없다. 도 23b는 인간 프로테옴에 있는 각 단백질 vs SSc vs 건강한 분류 펩타이드에 대한 단백질 에피토프 점수 (S)의 분포를 나타내는 히스토그램을 보여준다. POLR2L의 점수는 583이다.

RNA 폴리머라제 II는 피부경화증을 가진 환자에서 특징적으로 나타나는 알려진 자가항원이다.

도 24는 예시적인 자가 항원인 CCL22를 보여주며, 이는 조직합병증이 없는(GAVE-) 피부경화증 환자로부터 조직 합병증이 있는(GAVE+) 피부경화증 환자를 비교하는 식별 펩타이드에 의해 확인된 후보 단백질 바이오마커로 결정되었다.

이 결과값은 다른 질환 상태를 구별하는 식별 펩타이드가 치료법을 개발하기 위해 사용될 수 있는 후보 항원 또는 자가항원 표적을 확인하는데 사용될 수 있음을 보여준다. 추가로, 특정 항원 또는 자가항원 표적의 존재는 질환의 심각도를 결정하고 잠재적으로 질환의 진행이 있는지를 예측하는데 사용될 수 있다.

실시예 5 - 결합 신호의 측정 정밀도

200개의 어레이 특징(다른 펩타이드)의 결합 정밀도는 혈청-음성인 대상자로부터 샤가스병에 대해 혈청-양성인 것으로 테스트된 대상자를 구별하는데 사용되었으며, 8개의 혈청 샘플 세트를 사용하여 측정하였다. 4개의 샤가스 양성 샘플과 3개의 샤가스 음성 샘플이 공여자의 전체 코호트로부터 선별되었고, 두번의 실험 디자인에서 복합 웨이퍼에서 각 슬라이드 상에서 3번 측정하였다. 한개의 사내 정상 공여자 샘플도 각 슬라이드에 대해 두번 측정하였다.

웨이퍼 로트 내 :　한개의 생성물로부터 3개의 웨이퍼가 선별되었고 한개-슬라이드 QC 샘플 세트를 이용하여 정량화하였다. 각 웨이퍼로부터 남은 12개의 슬라이드는 예측 실험 샘플 세트를 사용해 평가하였다. 슬라이드는 3일 동안 하루에 3개 카세트를 통과하게 하였다. 각 웨이퍼로부터의 슬라이드는 3일 동안 균등하게 통과하도록 분포시켰으며 이 각각의 카세트는 웨이퍼의 3분의 1로부터 2개 슬라이드를 포함하며 남은 두개의 웨이퍼로부터 각 1개의 슬라이드를 포함한다.

웨이퍼 로트 사이 :　4개의 생성물로부터 1개의 웨이퍼가 선별되었고 한개-슬라이드 QC 샘플 세트를 이용하여 정량화하였다. 각 웨이퍼로부터 남은 12개의 슬라이드는 예측 실험 샘플 세트를 사용해 평가하였다. 슬라이드는 3일 동안 하루에 4개 카세트를 통과하게 하였다. 각 웨이퍼로부터의 슬라이드는 3일 동안 균등하게 통과하도록 분포시켰으며 이 각각의 카세트는 웨이퍼의 4분의 2로부터 2개 슬라이드를 포함한다.

데이터 분석: 혼합 영향 모델은 실험의 차이를 확인하는데 사용하였다. 공여자는 고정된 영향으로 처리하였다. 내포 인자 '웨이퍼', '슬라이드' 및 '어레이'는 '일'로 교차하였고, 랜덤 영향으로 처리하였다. 모델은 lme4 패키지를 이용하는 r 내에 맞추었다.

표 4. 결합 신호 측정의 정밀도

이 데이터는 웨이퍼 배치 내에 있는 어레이 상에 만들어진 결합 신호의 측정이 15% 미만의 예측 변이를 가지는 것으로 만들어 질 수 있고; 웨이퍼 배치 사이의 어레이상에 만들어진 결합 신호의 측정이 25% 미만의 예측 변이를 가지는 것으로 만들어 질 수 있다는 것을 보여준다.

Claims (67)

1. 자가면역 질환의 차별적 진단을 수행하는 방법으로서,
   (a) 대상자로부터 얻은 샘플을, 계내(in situ) 합성된 적어도 10,000개의 다른 펩타이드를 포함하는 펩타이드 어레이에 접촉시키는 단계;
   (b) 상기 어레이 상에 있는 적어도 25개의 펩타이드에 대한, 상기 샘플에 존재하는 항체의 결합을 검출하여 결합 신호의 조합을 얻는 단계; 및
   (c) 기준 결합 신호의 조합 중 하나 이상의 그룹과 상기 결합 신호의 조합을 비교하는 단계로서, 상기 기준 결합 신호의 조합의 각 그룹의 적어도 하나가 대상자의 자가면역 질환과는 다른 질환을 가지고 있는 것으로 알려진 복수의 기준 대상자로부터 얻어지며, 이로 인해 자가면역 질환에 대해 상기 대상자의 차별적 진단을 가능하게 하고, 방법의 수행능(performance)이 자가면역 질환과 기준 결합 신호의 조합의 각 그룹 사이의 수신기 작동 특성(ROC) 곡선 하 면적(AUC)이 0.6보다 큰 것을 특징으로 하는 단계
   를 포함하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 기준 결합 신호의 조합 각각은 계내 합성된 적어도 10,000개의 다른 펩타이드를 포함하는 펩타이드 어레이 상에 있는 상기 적어도 25개의 펩타이드에 대한, 상기 기준 그룹에서 상기 복수의 대상자 각각으로부터의 샘플에 존재하는 항체의 결합을 검출함으로써 얻어지는 것인 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 적어도 25개의 펩타이드에 대한 상기 기준 결합 신호의 조합과 상기 결합 신호의 조합 사이의 차이가 상기 차별적 진단을 결정하는 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 다른 질환은 자가면역 질환인 방법.
5. 제1항에 있어서,
   (d) 자가면역 질환을 가진것으로 알려져 있는 복수의 기준 대상자로부터 얻은 기준 결합 신호와 상기 결합 신호의 조합을 비교하는 단계
   를 추가로 포함하는 방법.
6. 제4항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 피부근육염(DM)이며, 상기 다른 자가면역 질환은 피부경화증(SSc)인 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 상기 어레이에 있는 적어도 10,000개의 펩타이드와 비교시 세린, 글리신, 티로신, 아르기닌, 알라닌, 글루타민 및 발린으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산으로 적어도 100% 압축(enrich)되는 것인 방법.
8. 제6항에 있어서, 상기 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 상기 어레이에 있는 적어도 10,000개의 펩타이드와 비교시 도 13a에 나열된 하나 이상의 모니프로 압축되는 것인 방법.
9. 제1항에 있어서, 건강한 대상자로부터 얻은 기준 결합 신호의 조합과 상기 대상자로부터 얻은 결합 신호를 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 SSc이며, 상기 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 티로신, 리신, 아르기닌, 페닐알라닌, 세린, 트립토판, 글리신 및 알라닌으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산으로 적어도 100% 압축되는 것인 방법.
11. 제9항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 SSc이며, 상기 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 상기 어레이에 있는 적어도 10,000개의 펩타이드와 비교시 도 5a에 나열된 하나 이상의 모니프로 압축되는 것인 방법.
12. 제9항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 DM이며, 상기 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 티로신, 트립토판, 세린, 글리신, 아스파르트산 및 페닐알라닌으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산으로 적어도 100% 압축되는 것인 방법.
13. 제9항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 DM이며, 상기 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 상기 어레이에 있는 적어도 10,000개의 펩타이드와 비교시 도 17a에 나열된 하나 이상의 모니프로 압축되는 것인 방법.
14. 제1항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 SSc이며, 상기 기준 결합 신호의 한 그룹은 복합 결합조직 질환(MCTD), 미분화 결합조직 질환(UCTD), 근육염, 다발근육염, 전신 홍반성 루푸스 및 국소피부경화증을 포함하는 다른 자가면역 질환을 가진 복수의 대상자로부터 얻은 결합 신호의 조합을 포함하는 것인 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 SSc이며, 상기 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 아스파르트산, 글루탐산, 프롤린, 발린, 글리신 및 세린으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산으로 적어도 100% 압축되는 것인 방법.
16. 제14항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 SSc이며, 상기 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 상기 어레이에 있는 적어도 10,000개의 펩타이드와 비교시 도 7a에 나열된 하나 이상의 모니프로 압축되는 것인 방법.
17. 제1항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 DM이며, 상기 기준 결합 신호의 한 그룹은 MCTD, UCTD, 근육염, 다발근육염, 전신 홍반성 루푸스 및 국소피부경화증을 포함하는 다른 자가면역 질환을 가진 복수의 대상자로부터 얻은 결합 신호의 조합을 포함하는 것인 방법.
18. 제17항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 DM이며, 상기 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 리신, 히스티딘, 세린, 아르기닌, 글루탐산, 알라닌 및 글리신으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산으로 적어도 100% 압축되는 것인 방법.
19. 제16항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 DM이며, 상기 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 상기 어레이에 있는 적어도 10,000개의 펩타이드와 비교시 도 19a에 나열된 하나 이상의 모니프로 압축되는 것인 방법.
20. 제1항에 있어서, 방법의 수행능은 수신기 작동 특성(ROC) 곡선 하 면적(AUC)이 0.60 내지 0.70, 0.70 내지 0.79, 0.80 내지 0.89, 또는 0.90 내지 1.00의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
21. 자가면역 질환을 가진 것으로 알려진 대상자에서 질환의 진행을 결정하는 방법으로서,
    (a) 대상자로부터 얻은 샘플을, 계내 합성된 적어도 10,000개의 다른 펩타이드를 포함하는 펩타이드 어레이에 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 어레이 상에 있는 적어도 25개의 펩타이드에 대한, 상기 샘플에 존재하는 항체의 결합을 검출하여 결합 신호의 첫번째 조합을 얻는 단계; 및
    (c) 적어도 기준 결합 신호의 두번째 조합과 상기 결합 신호의 첫번째 조합을 비교하는 단계로서, 상기 기준 결합 신호의 두번째 조합은 상기 자가면역 질환의 진행을 가리키는 임상 증상을 가진 복수의 대상자를 포함하는 기준 그룹으로부터 얻은 결합 신호의 조합을 포함하며, 이로 인해 차별적 진단을 실시하고, 방법의 수행능은 수신기 작동 특성(ROC) 곡선 하 면적(AUC)이 0.6보다 큰 것을 특징으로 하는 단계
    를 포함하는 방법.
22. 제21항에 있어서, (d) 자가면역 질환을 가진 것으로 알려져 있는 복수의 기준 대상자로부터 얻은 기준 결합 신호와 상기 결합 신호의 조합을 비교하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
23. 제21항에 있어서, 상기 기준 결합 신호의 조합 각각은 계내 합성된 적어도 10,000개의 다른 펩타이드를 포함하는 펩타이드 어레이 상에 있는 상기 적어도 25개의 펩타이드에 대한, 상기 기준 그룹에서 상기 복수의 대상자 각각으로부터 얻은 샘플에 존재하는 항체의 결합을 검출함으로써 얻어지는 것인 방법.
24. 제23항에 있어서, 상기 적어도 25개의 펩타이드에 대한 상기 기준 결합 신호의 조합과 상기 결합 신호의 조합 사이의 차이가 상기 질환의 진행을 결정하는 것인 방법.
25. 제21항에 있어서, 상기 질환의 진행은 피부경화증(SSc)에서 결정하는 것인 방법.
26. 제21항에 있어서, 상기 질환의 진행은 SSc에서 결정되고, 상기 임상 증상은 신장 위기(renal crisis), 간질성 폐질환(ILD) 및 위전정부 혈관확장증(GAVE)으로부터 선택되는 것인 방법.
27. 제21항에 있어서, 상기 질환의 진행은 SSc를 가진 대상자에서 결정되고, 상기 임상 증상은 신장 위기인 방법.
28. 제27항에 있어서, 상기 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 상기 어레이에 있는 적어도 10,000개의 펩타이드와 비교시 프롤린, 아스파르트산 및 글루탐산으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산으로 적어도 100% 압축되는 것인 방법.
29. 제27항에 있어서, 상기 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 상기 어레이에 있는 적어도 10,000개의 펩타이드와 비교시 도 9a에 나열된 하나 이상의 모니프로 적어도 압축되는 것인 방법.
30. 제21항에 있어서, 상기 질환의 진행은 SSc에서 결정되고, 상기 임상 증상은 ILD인 방법.
31. 제30항에 있어서, 상기 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 상기 어레이에 있는 적어도 10,000개의 펩타이드와 비교시 프롤린, 아르기닌, 리신, 히스티딘 및 아스파르트산으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산으로 적어도 압축되는 것인 방법.
32. 제30항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 SSc이며, 상기 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 상기 어레이에 있는 적어도 10,000개의 펩타이드와 비교시 도 15a에 나열된 하나 이상의 모니프로 압축되는 것인 방법.
33. 제21항에 있어서, 상기 질환의 진행은 SSc에서 결정되고, 상기 임상 증상은 GAVE인 방법.
34. 제33항에 있어서, 상기 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 상기 어레이에 있는 적어도 10,000개의 펩타이드와 비교시 아르기닌, 티로신, 세린, 히스티딘, 리신 및 페닐알라닌으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산으로 적어도 압축되는 것인 방법.
35. 제33항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 SSc이며, 상기 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 상기 어레이에 있는 적어도 10,000개의 펩타이드와 비교시 도 11a에 나열된 하나 이상의 모니프로 압축되는 것인 방법.
36. 제21항에 있어서, 상기 질환의 진행은 피부근육염(DM)에서 결정되는 것인 방법.
37. 제21항에 있어서, 상기 질환의 진행은 DM에서 결정되고, 상기 임상 증상은 ILD인 방법.
38. 제37항에 있어서, 상기 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 상기 어레이에 있는 적어도 10,000개의 펩타이드와 비교시 프롤린, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 글리신 및 글루타민으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산으로 적어도 압축되는 것인 방법.
39. 제37항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 DM이며, 상기 기준 결합 신호의 조합으로부터 상기 결합 신호의 조합을 구별하는 상기 적어도 25개의 펩타이드는 상기 어레이에 있는 적어도 10,000개의 펩타이드와 비교시 도 21a에 나열된 하나 이상의 모니프로 압축되는 것인 방법.
40. 제21항에 있어서, 방법의 수행능은 수신기 작동 특성(ROC) 곡선 하 면적(AUC)이 0.60 내지 0.70, 0.70 내지 0.79, 0.80 내지 0.89, 또는 0.90 내지 1.00의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
41. 제1항 내지 제40항 중 어느 하나의 항에 있어서, 대상자는 인간인 방법.
42. 제1항 내지 제41항 중 어느 하나의 항에 있어서, 샘플은 혈액 샘플인 방법.
43. 제40항에 있어서, 혈액 샘플은 전혈, 혈장 또는 혈청으로부터 선택되는 것인 방법.
44. 제1항 내지 제43항 중 어느 하나의 항에 있어서, 샘플은 혈청 샘플인 방법.
45. 제1항 내지 제44항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 샘플은 혈장 샘플인 것인 방법.
46. 제1항 내지 제45항 중 어느 하나의 항에 있어서, 샘플은 건조된 혈액 샘플인 방법.
47. 제1항 내지 제46항 중 어느 하나의 항에 있어서, 펩타이드 어레이 상에 있는 적어도 10,000개의 다른 펩타이드는 적어도 5개의 아미노산 길이를 갖는 것인 방법.
48. 제1항 내지 제47항 중 어느 하나의 항에 있어서, 펩타이드 어레이 상에 있는 적어도 10,000개의 다른 펩타이드는 5 내지 15개의 아미노산 길이를 갖는 것인 방법.
49. 제1항 내지 제48항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 10,000개의 다른 펩타이드는 20개 미만의 아미노산으로부터 합성되는 것인 방법.
50. 제1항 내지 제49항 중 어느 하나의 항에 있어서, 펩타이드 어레이 상에 있는 적어도 10,000개의 다른 펩타이드는 시스테인, 메티오닌, 이소류신 및 트레오닌 중 하나 이상을 제외하고 합성되는 것인 방법.
51. 자가면역 질환에 대한 후보 단백질 바이오마커를 확인하는 방법으로서,
    (a) 하나 이상의 다른 건강 상태로부터 상기 자가면역 질환을 구별하는 식별 펩타이드 세트를 확인하는 단계;
    (b) 상기 (식별) 펩타이드 세트를 프로테옴 내에 있는 단백질에 정렬하여 상기 프로테옴의 하나 이상의 단백질에 대한 상기 식별 펩타이드 세트의 정렬 점수를 얻는 단계;
    (c) 통계적 유의성에 따라 상기 확인된 단백질의 순위를 매기는 단계; 및
    (d) 상기 자가면역 질환을 치료하기 위한 후보 단백질 바이오마커로서의 상기 단백질을 확인하는 단계
    를 포함하는 방법.
52. 제51항에 있어서, 중첩 점수를 얻는 단계를 추가로 포함하며, 상기 점수는 펩타이드 라이브러리의 펩타이드 조성에 대해 보정하는 것인 방법.
53. 제51항에 있어서, 건강한 상태로부터 상기 자가면역 질환을 구별하는 식별 펩타이드 세트를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
54. 제51항에 있어서, 상기 후보 단백질 바이오마커는 표 3에 나열된 표적으로부터 선택되는 것인 방법.
55. 제51항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 p-값이 10^-5 미만, 10^-6 미만, 10^-7 미만, 10^-8 미만, 10^-9 미만, 10^-10 미만, 10^-11 미만, 10^-12 미만, 10^-13 미만, 10^-14 미만 또는 10^-15 미만을 갖는 것으로 확인되는 것인 방법.
56. 제51항에 있어서, 상기 후보 단백질 바이오마커는 10^-3 미만, 10^-4 미만, 10^-5 미만 또는 10^-6 미만의 p-값에 따라 순위가 매겨지는 것인 방법.
57. 자가면역 질환의 차별적 진단을 수행하기 위한 시스템으로서,
    (a) 계내 합성된 적어도 10,000개의 다른 펩타이드를 포함하는 펩타이드 어레이로서, 대상자로부터 얻은 샘플이 어레이에 접촉되는 것인 펩타이드 어레이;
    (b) 상기 어레이 상에 있는 적어도 25개의 펩타이드에 대한, 상기 샘플에 존재하는 항체의 결합을 검출하여 결합 신호의 조합을 얻는 검출기; 및
    (c) 기준 결합 신호의 조합 중 하나 이상의 그룹과 상기 결합 신호의 조합을 비교 및 분석하는 디지털 처리 장비로서, 상기 기준 결합 신호의 조합의 그룹의 각각은 다른 질환을 가진 복수의 대상자로부터 얻어진 결합 신호의 조합을 포함하며, 이로 인해 상기 차별적 진단을 실시하고, 방법의 수행능은 수신기 작동 특성(ROC) 곡선 하 면적(AUC)이 0.6보다 큰 것을 특징으로 하는 디지털 처리 장비
    를 포함하는 시스템.
58. 제57항에 있어서, 상기 다른 질환은 자가면역 질환인 시스템.
59. 제58항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 피부근육염(DM)이며, 상기 다른 자가면역 질환은 피부경화증(SSc)인 시스템.
60. 자가면역 질환을 가진 것으로 알려진 대상자의 질환의 진행을 결정하기 위한 시스템으로서,
    (a) 계내 합성된 적어도 10,000개의 다른 펩타이드를 포함하는 펩타이드 어레이;
    (b) 상기 어레이 상에 있는 적어도 25개의 펩타이드에 대한, 상기 샘플에 존재하는 항체의 결합을 검출하여 결합 신호의 첫번째 조합을 얻는 검출기; 및
    (c) 적어도 기준 결합 신호의 두번째 조합과 상기 결합 신호의 첫번째 조합을 비교 및 분석하는 디지털 처리 장비로서, 상기 기준 결합 신호의 두번째 조합은 상기 자가면역 질환의 진행을 가리키는 임상 증상을 가진 복수의 대상자를 포함하는 기준 그룹으로부터 얻어진 결합 신호의 조합을 포함하며, 이로 인해 상기 차별적 진단을 실시하고, 방법의 수행능은 수신기 작동 특성(ROC) 곡선 하 면적(AUC)이 0.6보다 큰 것을 특징으로 하는 디지털 처리 장비
    를 포함하는 시스템.
61. 제60항에 있어서, 상기 질환의 진행은 피부경화증(SSc)에서 결정되는 것인 시스템.
62. 제61항에 있어서, 상기 질환의 진행은 SSc에서 결정되고, 상기 임상 증상은 신장 위기, 간질성 폐질환(ILD) 및 위전정부 혈관확장증(GAVE)으로부터 선택되는 것인 시스템.
63. 제60항에 있어서, 상기 질환의 진행은 SSc를 가진 대상자에서 결정되고, 상기 임상 증상은 신장 위기인 시스템.
64. 제60항에 있어서, 상기 질환의 진행은 SSc에서 결정되고, 상기 임상 증상은 ILD인 시스템.
65. 제60항에 있어서, 상기 질환의 진행은 SSc에서 결정되고, 상기 임상 증상은 GAVE인 시스템.
66. 제60항에 있어서, 상기 질환의 진행은 피부근육염(DM)에서 결정되는 것인 시스템.
67. 제60항에 있어서, 상기 질환의 진행은 DM에서 결정되고, 상기 임상 증상은 ILD인 시스템.

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