KR20200031613A - 감별 진단을 위한 면역서명 - Google Patents

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로버트 윌리엄 거윈
테오도르 마이클 타라소우
조나단 스콧 멜닉
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헬스텔 인크.
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Abstract

개시된 실시양태는 전신 홍반성 루푸스(SLE) 및 류머티스성 관절염(RA)을 포함하는 자가면역 질환의 감별 진단을 제공하기 위한 방법, 장치, 및 시스템에 관한 것이다. 개시된 실시양태는 자가면역 질환 서로에 대해, 다른 자가면역 질환에 대해, 및 자가면역 질환으로서 분류되지 않으나 종종 자가면역 질환과 관련된 증상이 존재하는 모방 질환 상태에 대해 감별적으로 진단하는 것을 가능하게 한다.

Description

감별 진단을 위한 면역서명
상호 참조
본 출원은 2017년 6월 19일에 제출된 미국 가출원 제62/522,052호; 2017년 6월 20일에 제출된 미국 가출원 제62/522,636호; 및 2017년 11월 3일에 제출된 미국 가출원 제62/581,581호를 우선권으로 주장하며, 상기 가출원들의 전체 내용은 본 출원에 참고로 인용되어 있다.
면역 매개 질환, 예를 들어 자가면역 질환을 검출하고 진단하는 것은 도전적인 일이고, 환자들은 정확하거나 올바른 진단을 받기 위해 어려운 시기를 겪는다. 많은 경우, 환자들은 종종 다른 자가면역 질환으로 잘못 진단되는데, 그 이유는 이들 질환들의 밀접하게 관련된 특성 때문이다. 현재 자가면역 질환들 또는 질병들의 검출 및 평가를 위해 사용할 수 있는 신뢰할 수 있는 바이오마커는 존재하지 않는다.
본 출원에서 자가면역 질환을 갖는 대상체 또는 자가면역 질환을 갖는 것으로 의심되는 대상체에서 자가면역 질환의 감별 진단을 제공하기 위한 방법, 장치, 및 시스템이 개시된다. 아울러, 상기 방법, 장치, 및 시스템은 자가면역 질환의 진단, 예후, 모니터링, 활성 및 스크리닝을 위해 및/또는 자가면역 질환의 치료를 위한 치료적 타겟으로서 유용한 단백질 바이오마커를 포함하는 후보 바이오마커를 확인하기 위해 제공된다.
몇몇 예에서, 방법, 장치, 시스템, 및 키트는 전신 홍반성 루푸스(SLE), 류머티스성 관절염(RA), 쇼그렌 증후군(SS), 피부경화증, 골관절염(OA), 및 섬유근육통(FM)을 포함하는 자가면역 질환의 감별 진단을 제공하기 위해 제시된다. 개시된 실시양태는 자가면역 질환 서로를, 및 자가면역으로서 분류되지 않으나 특정 자가면역 질환과 종종 관련되는 징후를 나타내는 모방 질환 상태를 감별적으로 진단하는 것을 제공한다. 모방 질환 상태의 비제한적인 예는 골관절염 및 섬유근육통을 포함하는데, 이들은 자가면역 질환, 예를 들어 SLE 및 RA와 징후학적으로 중첩된다. 아울러, 방법, 장치, 및 시스템은 SLE 및 RA를 포함하는 자가면역 질환과, 다른 자가면역 질환 및 비-자가면역 질환을 포함하는 상태의 혼합된 집단으로부터 얻은 샘플의 감별 진단을 제공하기 위해 제시된다. 몇몇 예에서, 또한 혼합된 집단은 건강한 대상체 유래의 샘플을 포함한다. 또한, 상이한 상태를 식별하는 후보 바이오마커도 제공된다.
한 실시양태에서, 본 출원에서 자가면역 질환의 감별 진단을 수행하기 위한 방법, 장치, 시스템, 및 키트가 제공되는데, 상기 방법은 자가면역 질환의 감별 진단을 수행하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 (a) 대상체로부터 얻은 샘플을, 적어도 10,000개의 상이한 펩타이드를 포함하는 펩타이드의 어레이에 접촉시키는 단계; (b) 상기 어레이 상의 적어도 25개의 펩타이드에 대한, 상기 샘플에 존재하는 항체의 결합을 검출하여 결합 신호 조합을 얻는 단계; 및 (c) 상기 결합 신호 조합을 기준 결합 신호 조합의 하나 이상의 그룹과 비교하는 단계로서, 상기 기준 결합 신호 조합의 그룹 중 적어도 하나는, 자가면역 질환에 대해 상기 대상체의 감별 진단을 가능하게 하도록 대상체의 자가면역 질환과는 상이한 질환을 갖는 것으로 공지된 복수의 기준 대상체로부터 수득는 것인 단계를 포함하고, 방법 성능은 자가면역 질환과 기준 결합 신호 조합의 각 그룹 사이의 수신자 조작 특성(ROC) 곡선하 면적(AUC)이 0.6 초과인 것을 특징으로 한다. 몇몇 예에서, 본 출원에 개시된 방법, 시스템 및 장치는 (i) 감별화 기준 결합 신호 조합을 확인하는 단계로서, 상기 감별화 기준 결합 신호는 상기 자가면역 질환을 갖는 것으로 공지된 기준 대상체 유래의 샘플과, 자가면역 질환과는 상이한 상기 질환을 갖는 것으로 공지된 기준 대상체 유래의 샘플을 구별하는 단계; 및 (ii) 자가면역 질환의 감별 진단을 가능하게 하도록 감별화 기준 결합 신호 조합을 상기 단계 1(c)에 개시된 방법, 시스템 및 장치에 적용하는 단계를 추가로 포함한다. 아직 다른 예에서, 상기 감별화 기준 결합 신호 조합 각각은 상기 개시된 방법, 시스템 및 장치의 단계 (a)의 적어도 10,000개의 상이한 펩타이드를 포함하는 펩타이드의 어레이 상의 상기 적어도 25개의 펩타이드에 대한, 상기 복수의 기준 대상체 각각에서 유래한 샘플에 존재하는 항체의 결합을 검출함으로써 얻는다.
몇몇 예에서, 개시된 방법, 장치, 시스템, 및 키트는 상기 결합 신호 조합과, 자가면역 질환을 갖는 것으로 공지된 복수의 기준 대상체로부터 얻은 기준 결합 신호를 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 예에서, 상이한 질환은 자가면역 질환 및/또는 비-자가면역 질환이다. 몇몇 예에서, 자가면역 질환은 전신 홍반성 루푸스이고, 상이한 자가면역 질환은 도 7a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프 및/또는 도 7b에 열거된 바와 같은 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는(enriched) 식별 펩타이드에서 예시된, 류머티스성 관절염이다.
몇몇 예에서, 자가면역 질환은 전신 홍반성 루푸스이고, 상이한 비-자가면역 질환은 도 8a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프 및/또는 도 8b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 식별 펩타이드에서 예시된, 골관절염이다.
몇몇 예에서, 자가면역 질환은 전신 홍반성 루푸스이고, 상이한 비-자가면역 질환은 도 9a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프 및/또는 도 9b에 열거된 바와 같은 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 식별 펩타이드에서 예시된, 섬유근육통이다.
몇몇 예에서, 자가면역 질환은 전신 홍반성 루푸스이고, 상이한 자가면역 질환은 도 10a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프 및/또는 도 10b에 열거된 바와 같은 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 식별 펩타이드에서 예시된, 쇼그렌 증후군이다.
몇몇 예에서, 자가면역 질환은 전신 홍반성 루푸스이고, 상이한 질환은 도 5a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프 및/또는 도 5b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 식별 펩타이드에서 예시된, 자가면역 질환 및 비-자가면역 모방 질환의 그룹이다.
몇몇 예에서, 자가면역 질환은 전신 홍반성 루푸스이고, 상이한 질환은 도 6a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프 및/또는 도 6b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 식별 펩타이드에서 예시된, 자가면역 질환, 비-자가면역 모방 질환, 및 건강한 대조군의 그룹이다.
몇몇 예에서, 상기 방법, 시스템 및 장치는 전신 홍반성 루푸스를 갖는 대상체로부터의 결합 신호와 도 4a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프 및/또는 도 4b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 상기 식별 펩타이드에서 예시된, 건강한 대상체로부터 얻은 기준 결합 신호 조합을 비교하는 단계를 추가로 포함한다.
몇몇 예에서, 자가면역 질환은 류머티스성 관절염(RA)이고, 상기 상이한 질환은 도 22a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프 및/또는 도 22b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 식별 펩타이드에서 예시된, OA이다.
몇몇 예에서, 자가면역 질환은 류머티스성 관절염(RA)이고, 상기 상이한 질환은 도 23a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프 및/또는 도 23b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 식별 펩타이드에서 예시된, FM이다.
몇몇 예에서, 자가면역 질환은 류머티스성 관절염(RA)이고, 상기 상이한 질환은 도 24a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프 및/또는 도 24b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 식별 펩타이드에서 예시된, SS이다.
몇몇 예에서, 자가면역 질환은 RA이고, 상기 상이한 질환은 도 21a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프 및/또는 도 21b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 식별 펩타이드에서 예시된, 자가면역 질환 및 비-자가면역 질환의 그룹이다.
몇몇 예에서, 자가면역 질환은 RA이고, 상기 상이한 질환은 도 20a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프 및/또는 도 20b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 식별 펩타이드에서 예시된, 자가면역 질환, 비-자가면역 질환, 및 건강한 대조군의 그룹이다.
몇몇 예에서, 상기 방법, 장치, 시스템, 및 키트는 RA를 갖는 대상체로부터의 결합 신호와 도 18a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프 및/또는 도 18b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 식별 펩타이드에서 예시된, 건강한 대상체(HC)로부터 얻은 기준 결합 신호 조합을 비교하는 단계를 추가로 포함한다.
몇몇 예에서, 상기 방법, 장치, 시스템, 및 키트는 SLE, RA, FM, OA, SS 및 HC 각각으로부터의 샘플을 서로 구별하는 감별화 결합 신호를 조합하여 도 30a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프 및/또는 도 30b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 식별 펩타이드에서 예시된, 각각의 상태를 서로 동시에 구별하는 식별 펩타이드의 다중클래스 세트를 얻는 단계를 추가로 포함한다.
또한, 본 출원에서 전신 홍반성 루푸스(SLE) 및 류머티스성 관절염(RA)을 포함하는 자가면역 질환에 대한 적어도 하나의 후보 바이오마커를 확인하는 방법, 장치, 시스템, 및 키트가 제공된다.
아울러, 본 출원에서 자가면역 질환에 대한 적어도 하나의 후보 바이오마커를 확인하는 방법, 장치, 시스템, 및 키트가 개시되는데, 상기 방법은 (a) 펩타이드 어레이를 제공하고, 펩타이드 어레이에 대해 자가면역 질환을 갖는 것으로 공지된 복수의 기준 대상체 유래의 생물학적 샘플을 인큐베이션하는 단계; (b) 상기 대상체 유래의 생물학적 샘플 내의 항체에 결합된 식별 펩타이드의 세트를 확인하는 단계로서, 식별 펩타이드의 세트는 건강한 대상체 유래의 샘플로부터 자가면역 질환을 감별화할 수 있는 결합 신호를 나타내는 단계; (c) 식별 펩타이드의 세트 내의 펩타이드 각각을 이용하여 프로테옴 데이터베이스를 조회하는 단계; (d) 인간 프로테옴 데이터베이스 내의 하나 이상의 단백질에 대해 식별 펩타이드의 세트 내의 펩타이드 각각을 정렬하는 단계; 및 (e) 프로테옴 데이터베이스로부터 확인된 단백질 각각에 대한 관련성 스코어 및 순위(ranking)를 얻는 단계를 포함하고, 이때 각각의 확인된 단백질이 자가면역 질환에 대한 후보 바이오마커이다.
본 출원에서 개시된 방법, 장치, 시스템, 및 키트의 여전히 다른 실시양태에서, 샘플은 혈액 샘플이다. 몇몇 예에서, 혈액 샘플은 전혈, 혈장, 또는 혈청으로부터 선택된다. 다른 예에서, 샘플은 혈청 샘플이다. 아직 다른 예에서, 샘플은 혈장 샘플이다. 여전히 다른 예에서, 샘플은 건조된 혈액 샘플이다. 여전히 다른 실시양태에서, 펩타이드의 어레이는 적어도 50,000개의 상이한 펩타이드를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 펩타이드의 어레이는 적어도 300,000개의 상이한 펩타이드를 포함한다. 다른 실시양태에서, 펩타이드의 어레이는 적어도 500,000개의 상이한 펩타이드를 포함한다. 아직 다른 예에서, 펩타이드의 어레이는 적어도 2,000,000개의 상이한 펩타이드를 포함한다. 여전히 다른 실시양태에서, 펩타이드의 어레이는 적어도 3,000,000개의 상이한 펩타이드를 포함한다. 아직 다른 예에서, 펩타이드 어레이 상의 상이한 펩타이드는 그 길이가 적어도 5개의 아미노산이다. 여전히 다른 예에서, 펩타이드 어레이 상의 상이한 펩타이드는 그 길이가 5개 내지 13개의 아미노산이다. 몇몇 다른 예에서, 상이한 펩타이드는 20개 미만의 아미노산으로부터 합성된다. 몇몇 다른 예에서, 펩타이드 어레이 상의 상이한 펩타이드는 침착된다. 여전히 다른 실시양태에서, 상기 어레이 상의 상이한 펩타이드는 계내에서(in situ) 합성된다.
참고 인용
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은, 각각의 개별적인 간행물, 특허, 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참고 인용된 것과 같이, 본 출원에 참고 인용된다.
특허 또는 출원 파일은 컬러로 작성된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)을 포함하는 이러한 특허 또는 특허 출원 공보는 신청 및 필요한 비용의 납부 시 특허청에 의해 제공될 것이다.
본 발명의 신규한 특징은 첨부된 청구범위에 구체적으로 기재되어 있다. 본 발명의 특징과 이점에 대한 더 바람직한 이해는 본 발명의 원칙이 이용되는 예시적인 실시양태를 기재하는 하기 발명의 상세한 설명 및 후술하는 첨부 도면을 참고하여 얻어질 것이다.
도 1은 면역서명(immunosignature, IS)의 항체 결합된 어레이 펩타이드의 검출을 나타낸다.
도 2는 개시된 실시양태에서 사용하기 위한 예시적인 펩타이드 어레이의 모식도를 나타낸다.
도 3은 5-폴드 교차 검증(5-fold cross validation)의 서포트 벡터 머신(support vector machine, SVM) 프로세스를 나타낸다.
도 4a 및 도 4b는 전신 홍반성 루푸스(SLE) 샘플과 건강한 공여자(HC) 샘플 사이를 식별하는 펩타이드에서 농후화되는 펩타이드 모티프(도 4a) 및 아미노산(도 4b)을 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 SLE 샘플과, 자가면역 및 비-자가면역 모방 질환인 상이한 질환의 그룹(다른 AI+비-AI 모방) 사이를 식별하는 펩타이드에서 농후화되는 펩타이드 모티프(도 5a) 및 아미노산(도 5b)을 나타낸다.
도 6a 및 도 6b는 SLE 샘플과, 다른 자가면역 질환, 비-자가면역 모방 질환 및 건강한 대조군의 샘플인 "Not SLE" 샘플 사이를 식별하는 펩타이드에서 농후화되는 펩타이드 모티프(도 6a) 및 아미노산(도 6b)을 나타낸다.
도 7a 및 도 7b는 SLE 샘플과 샘플의 류머티스성 관절염(RA) 그룹 사이를 식별하는 펩타이드에서 농후화되는 펩타이드 모티프(도 7a) 및 아미노산(도 7b)을 나타낸다.
도 8a 및 도 8b는 SLE 샘플과 샘플의 골관절염(OA) 그룹 사이를 식별하는 펩타이드에서 농후화되는 펩타이드 모티프(도 8a) 및 아미노산(도 8b)을 나타낸다.
도 9a 및 도 9b는 SLE 샘플과 샘플의 섬유근육통(FM) 그룹 사이를 식별하는 펩타이드에서 농후화되는 펩타이드 모티프(도 9a) 및 아미노산(도 9b)을 나타낸다.
도 10a 및 도 10b는 SLE 샘플과 샘플의 쇼그렌 증후군(SS) 그룹 사이를 식별하는 펩타이드에서 농후화되는 펩타이드 모티프(도 10a) 및 아미노산(도 10b)을 나타낸다.
도 11a는 SLE 샘플과 건강한 공여자 유래의 샘플을 유의적으로 감별화하는 항체 결합 신호를 나타내는 라이브러리 펩타이드를 시각화하는 볼케이노 플롯(Volcano plot)을 나타낸다.
도 11b는 SLE 샘플과 "다른 AI+비-AI 모방" 그룹의 대상체의 샘플을 유의적으로 감별화하는 항체 결합 신호를 나타내는 라이브러리 펩타이드를 시각화하는 볼케이노 플롯을 나타낸다.
도 11c는 SLE 샘플과 "Not SLE" 그룹의 대상체의 샘플을 유의적으로 감별화하는 항체 결합 신호를 나타내는 라이브러리 펩타이드를 시각화하는 볼케이노 플롯을 나타낸다.
도 12는 각각의 대조(contrast)에서 본페로니 컷오프를 통과한 펩타이드 및 모든 대조, 즉 SLE vs. "NOT SLE"로서 나타낸 다른 AI+비-AI 모방 질환+건강한; SLE vs. 건강한; 및 SLE vs. "다른 AI"로서 나타낸 다른 AI+비-AI 모방 질환에서 공통인 478개의 펩타이드의 분포를 나타내는 벤 다이어그램(Venn diagram)을 나타낸다.
도 13은 SLE 건강한 공여자 어세이에서 입력 식별 펩타이드의 수(피쳐, 즉 펩타이드의 수; x-축)의 함수로서 95% 신뢰도 레벨에서 5-폴드 교차 검증 성능(y-축)의 그래프를 나타낸다.
도 14는 SLE 샘플과 HC(건강한), 다른 AI+비-AI 모방(다른 AI), 및 "Not SLE" 그룹, 즉 다른 AI+비-AI 모방+HC의 식별에서 어세이 성능으로서 수용기 작동 특성 곡선하 면적(AUC)을 나타내다. 각각의 그룹에서, 좌측 막대는 나타낸 조건으로부터 SLE만을 단독으로 식별하는 데 있어서의 성능을 나타내고, 우측 막대는 혼합된 SLE 및 다른 AI 샘플의 혼합물을 식별하는 데 있어서의 성능을 나타낸다.
도 15는 RA, 쇼그렌 증후군, OA, 및 섬유근육통으로부터 SLE의 감별 진단을 위한 어세이 성능을 나타낸다.
도 16은 나머지 다른 질환의 혼합물로부터 각각의 질환을 동시에 식별하는 다중분류기를 이용하는 어세이 성능을 나타낸다.
도 17a, 도 17b, 도 17c는 건강한 대상체(도 17a), 다른 자가면역 질환 또는 자가면역 모방 질환(다른 AI+비-AI 모방)(도 17b), 및 다른 AI+비-AI 모방 및 HC 유래의 샘플로 나타낸 "Not SLE"(도 17c)로부터 SLE를 식별하는 펩타이드에 의해 확인된 상위 후보 바이오마커를 나타낸다.
도 18a 및 도 18b는 RA 샘플과 건강한 공여자(HC) 샘플 사이를 식별하는 펩타이드에서 농후화되는 펩타이드 모티프(도 18a) 및 아미노산(도 18b)을 나타낸다.
도 19a 및 도 19b는 RA 샘플과 다른 류머티스성 질환 유래의 샘플 사이를 식별하는 펩타이드에서 농후화되는 펩타이드 모티프(도 19a) 및 아미노산(도 19b)을 나타낸다.
도 20a 및 도 20b는 RA 샘플과 다른 AI+비-AI 모방 및 HC(C) 유래의 샘플로 나타낸 "Not RA" 그룹 사이를 식별하는 펩타이드에서 농후화되는 펩타이드 모티프(도 20a) 및 아미노산(도 20b)을 나타낸다.
도 21a 및 도 21b는 RA 샘플과 다른 AI+비-AI 모방 그룹 사이를 식별하는 펩타이드에서 농후화되는 펩타이드 모티프(도 21a) 및 아미노산(도 21b)을 나타낸다.
도 22a 및 도 22b는 RA 샘플과 샘플의 OA 그룹 사이를 식별하는 펩타이드에서 농후화되는 펩타이드 모티프(도 22a) 및 아미노산(도 22b)을 나타낸다.
도 23a 및 도 23b는 RA 샘플과 샘플의 FM 그룹 사이를 식별하는 펩타이드에서 농후화되는 펩타이드 모티프(도 23a) 및 아미노산(도 23b)을 나타낸다.
도 24a 및 도 24b는 RA 샘플과 샘플의 SS 그룹 사이를 식별하는 펩타이드에서 농후화되는 펩타이드 모티프(도 24a) 및 아미노산(도 24b)을 나타낸다.
도 25a는 RA 샘플과 건강한 공여자 유래의 샘플을 유의적으로 감별화하는 항체 결합 신호를 나타내는 라이브러리 펩타이드를 시각화하는 볼케이노 플롯을 나타낸다.
도 25b는 RA 샘플과 "다른 AI+비-AI 모방" 그룹의 대상체의 샘플을 유의적으로 감별화하는 항체 결합 신호를 나타내는 라이브러리 펩타이드를 시각화하는 볼케이노 플롯을 나타낸다.
도 25c는 RA 샘플과 "Not RA" 그룹의 대상체의 샘플을 유의적으로 감별화하는 항체 결합 신호를 나타내는 라이브러리 펩타이드를 시각화하는 볼케이노 플롯을 나타낸다.
도 26은 각각의 대조에서 본페로니 컷오프를 통과한 펩타이드 및 모든 대조, 즉 RA vs. "NOT RA"로서 나타낸 다른 AI+비-AI 모방 질환+건강한; RA vs. 건강한; 및 RA vs. "다른 AI"로서 나타낸 다른 AI+비-AI 모방 질환에서 공통인 491개의 펩타이드의 분포를 나타내는 벤 다이어그램을 나타낸다.
도 27은 RA 샘플과 HC, 다른 AI+비-AI 모방(다른 AI), 및 "Not RA" 그룹, 즉 다른 AI+비-AI 모방+HC의 식별에서 어세이 성능으로서 수용기 작동 특성 곡선하 면적(AUC)을 나타내다. 각각의 그룹에서, 좌측 막대는 나타낸 조건으로부터 RA만을 단독으로 식별하는 데 있어서의 성능을 나타내고, 우측 막대는 혼합된 RA 및 다른 AI 샘플의 혼합물을 식별하는 데 있어서의 성능을 나타낸다.
도 28은 RA와 SLE, 쇼그렌 증후군, OA, 및 섬유근육통의 감별 진단에 대한 어세이 성능을 나타낸다.
도 29a, 도 29b, 및 도 29c는 RA와 건강한 대상체(29a), RA와 다른 자가면역 질환(다른 AI+비-AI 모방 질환)을 보유하는 대상체의 그룹(29b), 및 RA와 다른 AI+비-AI 모방 및 HC 유래의 샘플로 나타낸 "Not RA" 그룹(29c)을 식별하는 펩타이드에 의해 확인된 후보 바이오마커를 나타낸다.
도 30a 및 도 30b는 SLE, RA, FM, OA, SS, 및 HC 서로를 동시에 식별하는 펩타이드에서 농후화되는 펩타이드 모티프(도 30a) 및 아미노산(도 30b)을 나타낸다.
도 31은 SLE, RA, FM, OA, SS, 및 HC 클래스 할당의 확률을 시각화하는 열 지도를 나타낸다. 각각의 샘플은 0(흑색) 내지 100%(백색)의 범위로 각각의 질환 클래스에 대한 예측된 클래스 멤버십을 보유한다.
도 32는 SLE 샘플과 샘플의 건강한(HC) 그룹 사이를 식별하는 상위의 유의적인 펩타이드를 나타낸다.
도 33은 SLE 샘플과 샘플의 다른 자가면역 및 비-자가면역 모방 질환(다른 AI+비-AI) 그룹 사이를 식별하는 상위의 유의적인 펩타이드를 나타낸다.
도 34는 SLE 샘플과 샘플의 Not SLE(Not SLE - 다른 AI+비-AI+HC) 그룹 사이를 식별하는 상위의 유의적인 펩타이드를 나타낸다.
도 35는 RA 샘플과 샘플의 건강한(HC) 그룹 사이를 식별하는 상위의 유의적인 펩타이드를 나타낸다.
도 36은 RA 샘플과 샘플의 다른 자가면역 및 비-자가면역 모방 질환(다른 AI+비-AI) 그룹 사이를 식별하는 상위의 유의적인 펩타이드를 나타낸다.
도 37은 RA 샘플과 샘플의 Not RA(Not RA - 다른 AI+비-AI+HC) 그룹 사이를 식별하는 상위의 유의적인 펩타이드를 나타낸다.
면역 매개 질환, 예를 들어 자가면역 질환을 검출하고 진단하는 것은 도전적인 일이고, 환자들은 정확하거나 올바른 진단을 받기 위해 어려운 시기를 겪는다. 많은 경우, 환자들은 종종 다른 자가면역 질환으로 잘못 진단되는데, 그 이유는 이들 질병들의 밀접하게 관련된 특성 때문이다. 현재 자가면역 질환 또는 질병의 검출 및 평가를 위해 사용할 수 있는 신뢰할 수 있는 바이오마커는 존재하지 않는다.
전신 홍반성 루푸스(SLE) 및 류머티스성 관절염(RA)은 신체의 세포 및 조직을 공격하여 결과적으로 염증 및 조직 손상을 일으킬 수 있는 자가면역 질환의 예이다. SLE 및 RA의 발병 과정 및 메커니즘은 잘 알려져 있지 않다. 징후의 유사성 때문에, 이들 두 질환의 감별 진단 및 치료는 해결 대상이다. 아울러, SLE 또는 RA를 갖는 환자는 동시에 하나 초과의 질환, 즉 자가면역 질환, 또는 상기 질환의 징후를 모방하는 비-자가면역 상태일 수 있는 중첩 질환 또는 상태를 보유할 수 있다. 결과적으로, 그러한 질환에 대한 올바른 진단은 결정을 위해 수개월 또는 심지어 수년이 소요될 수 있다. 전형적으로 병력 검토, 다수의 물리적인 검사, 수많은 실험실 테스트, 및 종종 스캔의 조합이 요구된다. 임상적으로, 실험실 테스트는 다양한 혈청 마커를 이용하여 수행될 수 있다. 그러나, 마커들은 비특이적이고, SLE 및 RA의 감별 진단, 예측 및 질환 활성 평가에서 그들의 역할은 잘 알려져 있지 않다.
개시된 실시양태는 전신 홍반성 루푸스(SLE) 및 류머티스성 관절염(RA)을 포함하는 자가면역 질환의 감별 진단을 제공하기 위한 방법, 장치, 시스템, 및 키트에 관한 것이다. 개시된 실시양태는 자가면역 질환 서로를, 및 자가면역으로서 분류되지 않으나 특정 자가면역 질환과 종종 관련되는 징후를 나타내는 모방 질환 상태를 감별적으로 진단하는 것을 제공한다. 비-자가면역 모방 질환/상태의 비제한적인 예는 골관절염 및 섬유근육통을 포함한다.
본 출원에서 펩타이드 어레이에 결합하는 말초 혈액 항체의 감별적 패턴을 확인하는 단일의 비침습적 스크리닝 방법을 이용하는 자가면역 질환(AI)의 감별 진단을 가능하게 하는 방법, 장치, 시스템, 및 키트가 제공된다. 펩타이드 어레이에 대한 환자 샘플의 감별적 결합은 환자의 건강 상태, 예를 들어 자가면역 질환의 지표인 특이적인 결합 패턴, 즉 면역서명(IS)을 생성한다. 아울러, 본 출원에 제공된 장치 및 시스템은 생물학적 샘플의 항체에 대한 항원 또는 결합 파트너의 확인을 가능하게 하는데, 이는 타겟팅된 치료적 중재를 위한 후보 바이오마커로서 평가될 수 있다.
전형적으로, 상태의 면역서명 특성은 하나 이상의 기준 면역서명에 대해 결정되는데, 이는 기준 샘플의 하나 이상의 상이한 세트로부터 얻어지고, 각각의 세트는 기준 대상체의 하나 이상의 그룹으로부터 얻어지며, 각각의 그룹은 상이한 상태, 예를 들어 상이한 자가면역 질환(AI)을 보유한다. 예를 들어, 테스트 대상체로부터 얻은 면역서명은, 상이한 AI를 보유하는 기준 대상체, 테스트되는 AI의 징후를 모방하는 비-AI 질환 또는 상태를 보유하는 대상체, 상이한 AI 및/또는 모방 상태를 포함하는 중첩 질환을 갖는 대상체의 면역서명과 비교되는 경우, 테스트 대상체의 AI를 확인한다. 따라서, 기준 대상체 유래의 면역서명과 테스트 대상체의 면역서명의 비교는 AI에 대한 감별 진단을 제공할 수 있다. 기준 그룹은 건강한 대상체의 그룹일 수 있고, 상기 상태는 본 출원에서 건강한 상태로 언급된다.
제공된 방법, 장치, 시스템, 및 키트는 AI 질환을 갖는 것으로 의심되거나 또는 공지된 대상체의 집단 내의 상이한 개인 유래의 샘플, 예를 들어 혈액에서 다수의 상이한 AI 질환을 검출할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, IS는 대표적인 공지의 프로테옴 서열보다는 오히려 20개 미만의 아미노산의 아미노산 조합의 적어도 일부분의 비편향 샘플링(unbiased sampling)을 제공하기 위해 선택된 펩타이드의 어레이에 대한 항체 결합의 다양하지만 재현 가능한 패턴에 기초한다. 대상체 유래의 샘플 내의 항체에 의해 결합된 펩타이드는 천연 타겟 서열이 아닐 수 있지만, 대신에 유사한 천연 에피토프의 서열 또는 구조를 모방할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항체에 의해 결합된 펩타이드는 공지된 프로테옴 서열과 적어도 부분적으로 동일하거나, 유사하거나, 또는 그렇지 않으면 관련될 수 있다. 예를 들어, 실시예 1에 기재된 IST 라이브러리 내의 펩타이드 중 공지된 프로테옴 데이터베이스 내의 임의의 9 mer 서열에 대한 동일한 매치는 존재하지 않는다. 이는 놀라운 일은 아닌데, 그 이유는 가능한 9 mer 펩타이드의 수는 프로테옴 데이터베이스에서 연속하는 9 mer 서열의 수보다 수십배의 크기(several orders of magnitude)로 더 크기 때문이다. 따라서, 천연 서열에 정확하게 상응하는 임의의 모방성 펩타이드의 확률은 낮다. 항체에 의해 선택적으로 결합된 각각의 IS 펩타이드 서열은 항체가 생체 내에서 인식한 에피토프의 기능성 대리일 수 있다. 결과적으로, 항체 결합된 어레이 펩타이드 서열의 부분 또는 전부를 포함하는 단백질의 서열은 후보 단백질 바이오마커를 확인하기 위해 작용할 수 있는데, 이는 치료적 타겟으로서 평가될 수 있다.
한 관점에서, 자가면역 질환, 예를 들어 SLE 또는 RA의 감별 진단을 위한 방법이 제공되는데, 상기 방법은 (a) 대상체 유래의 샘플을, 적어도 10,000개의 상이한 펩타이드를 포함하는 펩타이드 어레이에 접촉시키는 단계; (b) 상기 어레이 상의 적어도 25개의 펩타이드에 대한, 상기 샘플에 존재하는 항체의 결합을 검출하여 결합 신호 조합을 얻는 단계; 및 (c) 상기 결합 신호 조합을 기준 결합 신호 조합의 하나 이상의 그룹과 비교하는 단계로서, 상기 기준 결합 신호 조합의 각 그룹 중 적어도 하나가 대상체의 자가면역 질환과는 상이한 질환을 갖는 것으로 공지된 복수의 기준 대상체로부터 얻어지며, 이로 인해 자가면역 질환에 대해 상기 대상체의 감별 진단을 가능하게 하고, 방법 성능은 자가면역 질환과 기준 결합 신호 조합의 각 그룹 사이의 수신자 조작 특성(ROC) 곡선하 면적(AUC)이 0.6 초과인 것을 특징으로 하는 단계를 포함한다. 몇몇 예에서, 상기 방법, 시스템 및 장치는 (i) 감별화 기준 결합 신호 조합을 확인하는 단계로서, 상기 감별화 기준 결합 신호는 상기 자가면역 질환을 갖는 것으로 공지된 기준 대상체 유래의 샘플과, 자가면역 질환과는 상이한 상기 질환을 갖는 것으로 공지된 기준 대상체 유래의 샘플을 구별하는 단계; 및 (ii) 감별화 펩타이드의 조합을 확인하는 단계를 추가로 포함하고, 이때 상기 감별화 기준 결합 신호 조합은 감별화 펩타이드의 조합에 상응한다. 몇몇 실시양태에서, 기준 대상체는 상이한 AI를 보유하는 대상체, 테스트되는 AI의 징후를 모방하는 비-AI 질환 또는 상태를 보유하는 대상체, 상이한 AI 및/또는 모방 상태를 포함하는 중첩 질환을 갖는 대상체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 기준 대상체는 건강한 대상체이다. 어레이 펩타이드는 고체 표면 상에 침착될 수 있거나, 또는 고체 표면 상에서 계내에서 합성될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 방법 성능은 수신자 조작 특성(ROC) 곡선하 면적(AUC)이 0.6 초과인 것을 특징으로 할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 AI 샘플, 예를 들어 SLE 또는 RA와, 상이한 질환을 갖는 것으로 공지된 하나 이상의 기준 대상체를 구별하는 감별화 기준 결합 신호 조합을 확인하는 단계, 및 감별화 결합 신호 조합을 나타내는 어레이 펩타이드, 즉 식별 펩타이드의 조합을 확인하는 단계를 추가로 포함하는데, 이때 감별화 기준 결합 신호 조합은 식별 펩타이드의 조합에 상응한다. 감별화 결합 신호 조합은 증가되거나 감소된 신호, 새롭게 추가된 신호, 및/또는 기준 샘플로부터 얻은 상응하는 결합 신호에 대해 AI 질환의 존재 하에서 상실된 신호를 포함할 수 있다. 감별화 결합 신호 조합을 나타내는 어레이 펩타이드는 식별 펩타이드로서 공지되어 있다. 본 출원에서 어레이 펩타이드에 관하여 사용된 경우 용어 "식별(discriminating)"은 "분류(classifying)"와 상호 교환 가능하게 사용된다. 몇몇 실시양태에서, 감별화 기준 결합 신호 조합은 어레이 상에서 적어도 1, 적어도 2, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 125, 적어도 150, 적어도 175, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900, 적어도 1000, 적어도 2000, 적어도 3000, 적어도 4000, 적어도 5000, 적어도 6000, 적어도 7000, 적어도 8000, 적어도 9000, 적어도 10000, 적어도 20000개, 또는 그 초과의 식별 펩타이드에 대한 결합 신호 조합을 포함한다. 예를 들어, 10,000개의 펩타이드의 어레이 상에서 적어도 25개의 펩타이드는 주어진 조건에 대한 식별 펩타이드로서 확인된다. 몇몇 실시양태에서, 감별화 결합 신호의 각각의 조합은 적어도 10,000개의 상이한 펩타이드를 포함하는 펩타이드의 동일한 어레이 상의 적어도 25개의 펩타이드에 대한 복수의 기준 대상체 각각으로부터의 기준 샘플 내에 존재하는 항체의 결합을 검출함으로써 얻어진다. 몇몇 실시양태에서, 펩타이드는 인 신츄 합성된다. 몇몇 실시양태에서, 식별 펩타이드는 어레이 기판 상에서 적어도 5,000, 적어도 10,000, 적어도 15,000, 적어도 20,000, 적어도 25,000, 적어도 50,000, 적어도 100,000, 적어도 200,000, 적어도 300,000, 적어도 400,000, 적어도 500,00, 적어도 1,000,000, 적어도 2,000,000, 적어도 3,000,000, 적어도 4,000,000, 적어도 5,000,000 또는 적어도 100,000,000개 또는 그 초과의 상이한 펩타이드의 라이브러리를 포함하는 펩타이드 어레이에 감별적으로 결합하는 항체로부터 확인된다.
키트
다른 관점에서, 자가면역 질환, 예를 들어 SLE 또는 RA의 감별 진단을 수행하기 위한 키트가 제공되는데, 상기 키트는 펩타이드 어레이 및 상기 펩타이드 어레이 상에서 대상체 유래의 샘플을 어세이하고, 상기 펩타이드 어레이 상에서 신호를 검출하기 위한 수단을 포함하며, 상기 수단은 (a) 대상체 유래 샘플을, 적어도 10,000개의 상이한 펩타이드를 포함하는 펩타이드의 어레이에 접촉시키는 것; (b) 결합 신호 조합을 얻기 위해 상기 어레이 상의 적어도 25개의 펩타이드에 대한, 상기 샘플 내에 존재하는 항체의 결합을 검출하는 것; 및 (c) 상기 기준 결합 신호 조합의 각각의 그룹 중 적어도 하나와 상기 결합 신호 조합을 비교하는 것으로서, 상기 기준 결합 신호 조합의 각각의 그룹 중 적어도 하나가 대상체의 자가면역 질환과는 상이한 질환을 갖는 것으로 공지된 복수의 기준 대상체로부터 수득되어, 자가면역 질환에 대해 상기 대상체의 감별 진단을 가능하게 하고, 키트 성능은 자가면역 질환과 기준 결합 신호 조합의 각각의 그룹 사이의 수신자 조작 특성(ROC) 곡선하 면적(AUC)이 0.6 초과인 것을 특징으로 한다. 몇몇 예에서, 상기 키트는 (i) 감별화 기준 결합 신호 조합을 확인하기 위한 수단으로서, 상기 감별화 기준 결합 신호는 상기 자가면역 질환을 갖는 것으로 공지된 기준 대상 유래의 샘플과 자가면역 질환과는 상이한 상기 질환을 갖는 것으로 공지된 기준 대상체 유래의 샘플을 구별하는 것인 수단; 및 (ii) 식별 펩티드의 조합을 확인하기 위한 수단으로서, 상기 감별화 기준 결합 신호 조합은 식별 펩티드의 조합에 상응하는 수단을 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 기준 대상체는 상이한 AI를 보유하는 대상체, 테스트되는 AI의 징후를 모방하는 비-AI 질환 또는 상태를 보유하는 대상체, 상이한 AI 및/또는 모방 상태를 포함하는 중첩 질환을 갖는 대상체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 기준 대상체는 건강한 대상체이다. 어레이 펩타이드는 고체 표면 상에 침착될 수 있거나, 또는 고체 표면 상에서 계내에서 합성될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 키트 성능은 수신자 조작 특성(ROC) 곡선하 면적(AUC)이 0.6 초과인 것을 특징으로 할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 상기 키트는 AI 샘플, 예를 들어 SLE 또는 RA와, 상이한 질환을 갖는 것으로 공지된 하나 이상의 기준 대상체를 구별하는 감별화 기준 결합 신호 조합을 확인하는 것, 및 감별화 결합 신호 조합을 나타내는 어레이 펩타이드, 즉 식별 펩타이드의 조합을 확인하는 것을 추가로 포함하는데, 이때 감별화 기준 결합 신호 조합은 식별 펩타이드의 조합에 상응한다. 감별화 결합 신호 조합은 증가되거나 감소된 신호, 새롭게 추가된 신호 및/또는 기준 샘플로부터 얻은 상응하는 결합 신호에 대한 AI 질환의 존재 하에서 상실된 신호를 포함할 수 있다. 감별화 결합 신호 조합을 나타내는 어레이 펩타이드는 식별 펩타이드로서 공지되어 있다. 본 출원에서 어레이 펩타이드에 관하여 사용된 경우 용어 "식별"은 "분류"와 상호 교환 가능하게 사용된다. 몇몇 실시양태에서, 감별화 기준 결합 신호 조합은 어레이 상에서 적어도 1, 적어도 2, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 125, 적어도 150, 적어도 175, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900, 적어도 1000, 적어도 2000, 적어도 3000, 적어도 4000, 적어도 5000, 적어도 6000, 적어도 7000, 적어도 8000, 적어도 9000, 적어도 10000, 적어도 20000개, 또는 그 초과의 식별 펩타이드에 대한 결합 신호 조합을 포함한다. 예를 들어, 10,000개의 펩타이드의 어레이 상에서 적어도 25개의 펩타이드는 주어진 조건에 대한 식별 펩타이드로서 확인된다. 몇몇 실시양태에서, 감별화 결합 신호의 각각의 조합은 적어도 10,000개의 상이한 펩타이드를 포함하는 펩타이드의 동일한 어레이 상의 적어도 25개의 펩타이드에 대한 복수의 기준 대상체 각각으로부터의 기준 샘플 내에 존재하는 항체의 결합을 검출함으로써 얻어진다. 몇몇 실시양태에서, 펩타이드는 인 신츄 합성된다. 몇몇 실시양태에서, 식별 펩타이드는 어레이 기판 상에서 적어도 5,000, 적어도 10,000, 적어도 15,000, 적어도 20,000, 적어도 25,000, 적어도 50,000, 적어도 100,000, 적어도 200,000, 적어도 300,000, 적어도 400,000, 적어도 500,00, 적어도 1,000,000, 적어도 2,000,000, 적어도 3,000,000, 적어도 4,000,000, 적어도 5,000,000 또는 적어도 100,000,000개 또는 그 초과의 상이한 펩타이드의 라이브러리를 포함하는 펩타이드 어레이에 감별적으로 결합하는 항체로부터 확인된다.
몇몇 실시양태에서, 어레이 상의 펩타이드의 총 수의 적어도 0.00005%, 적어도 0.0001%, 적어도 0.0005%, 적어도 0.0001%, 적어도 0.001%, 적어도 0.003%, 적어도 0.005%, 적어도 0.01%, 적어도 0.05%, 적어도 0.1%, 적어도 0.5%, 적어도 1%, 적어도 0.5%, 적어도 1.5%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%는 식별 펩타이드이다. 다른 실시양태에서, 어레이 상의 모든 펩타이드는 식별 펩타이드이다.
결합 어세이
대상체의 면역서명은 어레이 펩타이드에 결합된 항체의 결합의 패턴으로서 확인된다. 펩타이드 어레이는 어레이 상에 고정화된 펩타이드에 대한 샘플 내의 항체의 결합을 촉진하기 위한 임의의 적합한 조건하에서 샘플, 예를 들어 혈액, 혈장 또는 혈청과 접촉될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법 및 키트는 사용된 결합 조건의 임의의 특이적인 유형에 의해 제한되지 않는다. 이러한 조건은 사용되는 어레이, 기판의 유형, 기판 상에 어레이된 펩타이드의 밀도, 결합 상호작용의 원하는 엄중성, 및 결합 용액 내 경쟁 물질의 특성에 따라 달라질 것이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 조건은 주소 지정 가능한 어레이로부터 결합되지 않은 항체를 제거하는 단계를 포함한다. 그러한 단계를 위한 요구를 결정하는 것 및 그러한 단계를 위한 적절한 조건은 당해 기술분야의 기술 수준 내에서 용이하다.
임의의 적합한 검출 기법은 AI에 대한 결과인 면역 프로파일을 생성하기 위해 어레이 상의 펩타이드에 대한 샘플 내의 항체의 결합을 검출하기 위한, 본 출원에 기재된 방법, 장치, 시스템, 및 키트에서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 검출 가능한 라벨의 임의의 유형은 어레이 상의 펩타이드를 레이블링하기 위해 사용될 수 있으며, 방사성 동위원소 라벨, 형광 라벨, 발광 라벨 및 전기화학 라벨(즉, 상이한 전극 중간점 전위를 보유하는 리간드 라벨로서, 이때 검출은 라벨의 전위를 검출하는 것을 포함한다)을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 대안적으로, 결합된 항체는, 예를 들어 검출 가능하게 레이블링된 2차 항체를 이용하여 검출될 수 있다.
검출 가능한 라벨로부터 신호의 검출은 당해 기술분야의 기술 수준 내에서 용이하다. 예를 들어, 형광 어레이 판독기는 기판 상에 전위를 기록하는 장비로서 당해 기술분야에 잘 알려져 있다(전기화학적 검출을 위해, 예를 들어 J. Wang (2000) Analytical Electrochemistry, Vol., 2nd ed., Wiley-VCH, New York 참조). 또한, 결합 상호작용은 SPR 및 질량 분광법과 같은 다른 라벨-프리 방법을 이용하여 검출될 수 있다. SPR은 해리 상수 및 해리율의 측정을 제공한다. 예를 들어, A-100 Biocore/GE 장비는 이러한 유형의 분석에 적합하다. FLEX 칩은 동일한 지지체 상에서 최대 400개의 결합 반응에 사용될 수 있다.
대안적으로, 어레이 상에서의 샘플 내의 항체와 펩타이드 사이의 결합 상호작용은 경쟁 포맷으로 검출될 수 있다. 결합의 경쟁적 억제제가 존재하는 경우 대 부재하는 경우에서 샘플에 대한 어레이의 결합 프로파일의 차이는 샘플의 특성화에 유용할 수 있다.
분류 알고리즘
항체 결합 신호 데이터의 분석, 즉 면역서명(IS)의 분석 및 그로부터 유도된 감별 진단은 전형적으로 다양한 컴퓨터 알고리즘 및 프로그램을 사용하여 수행된다. 레이블링된 2차 항체에 의해 생성된 항체 결합 패턴은, 예를 들어 레이저 스캐너를 이용하여 스캔된다. 스캐너에 의해 획득된 결합 신호의 이미지는 GenePix Pro 8 소프트웨어(Molecular Devices, Santa Clara, CA)와 같은 소프트웨어를 이용해 불러와 처리되어 각각의 펩타이드에 대해 0-65,535 범위의 연속적인 값으로 표로 정리된 정보를 제공한다. 표로 정리된 데이터는, 예를 들어 통계학적 연산을 위한 R 언어 및 환경(통계학적 연산을 위한 R 재단, Vienna, Austria. URL https://www.R-project.org/)을 이용하여 불러오고 통계학적 분석이 수행된다.
기준 대상체, 예를 들어 건강한 대상체 또는 상이한 질환을 갖는 대상체로부터 얻은 샘플들 사이에서 감별적인 신호전달 패턴을 나타내는 펩타이드, 즉 식별 펩타이드는 공지된 통계학적 테스트, 예를 들어 스튜던트 t-테스트 또는 ANOVA를 이용하여 확인될 수 있다. 통계학적 분석은 미리 결정된 엄중성 레벨에서 상이한 상태를 구별하는 식별 펩타이드를 선택하기 위해 적용된다. 몇몇 실시양태에서, 대부분의 식별 펩타이드의 목록은 그들의 p-값과 같은 통계학적 수단에 의해 펩타이드를 순위 매김으로써 얻을 수 있다. 예를 들어, 식별 펩타이드는 0과 1 사이의 p-값을 보유함으로써 순위 매겨지고 확인될 수 있다. 또한, p-값에 대한 컷오프는, 종속적인 또는 독립적인 통계학적 테스트가 단일 데이터 세트 상에서 동시에 수행되는 경우를 설명하기 위해 조정될 수 있다. 예를 들어, 본페로니 보정은, 다중 데이터의 단일 세트에 대해 다중 쌍 테스트가 수행되는 경우 허위 양성을 얻기 위한 기회를 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 보정은 어레이 라이브러리의 크기에 따라 달라진다. 몇몇 실시양태에서, 식별을 결정하기 위한 컷오프 p-값은 10-20 미만, 10-19 미만, 10-18 미만, 10-17 미만, 10-16 미만, 10-15 미만, 10-14 미만, 10-13 미만, 10-12 미만, 10-11 미만, 10-10 미만, 10-9 미만, 10-8 미만, 10-7 미만, 10-6 미만, 또는 10-5 미만, 또는 10-4 미만, 또는 10-3 미만, 또는 10-2 미만으로 조정될 수 있다. 상기 조정은 어레이 라이브러리의 크기에 따라 달라진다. 대안적으로, 식별 펩타이드는 순위를 매기지 않고, 최대 확인된 식별 펩타이드 모두를 나타낸 결합 신호 정보는 상태, 예를 들어 샘플의 혈청학적 상태를 분류하기 위해 사용된다.
후속적으로, 통계학적 분석 후 선택된 식별 펩타이드의 결합 신호 정보는 통계학적 또는 수학적 모델, 즉 정확도, 민감도 및 특이도로 항체 프로파일 데이터를 분류하고 샘플의 혈청학적 상태를 결정하는 분류기, 및 본 출원의 다른 곳에 기재된 다른 적용을 얻기 위한 머신 러닝 알고리즘으로 후속적으로 불러올 수 있다. 다수의 컴퓨터 알고리즘 중 임의의 알고리즘이 분류 목적을 위해 이용될 수 있다.
분류기는 규칙 기반일 수 있거나, 컴퓨터적으로 지능적일 수 있다. 또한, 컴퓨터적으로 지능적인 분류 알고리즘은 관리될 수 있거나 관리되지 않을 수 있다. 기본 분류 알고리즘인 선형 판별 분석(LDA, Linear Discriminant Analysis)은 두 개 이상의 질환 클래스를 분류하기 위해 생체의료 데이터를 분석하는데 널리 사용될 수 있다. LDA는 예를 들어, 분류 알고리즘일 수 있다. 좀 더 복잡한 분류 방법인 서포트 벡터 머신(SVM)은 수학적 커널(mathematical kernel)을 사용하여 원래 예측 변수를 고차원 공간에 투영하고, 이어서 그들의 클래스에 따라 샘플을 최적으로 분리하는 하이퍼플레인을 확인한다. 몇몇 공통 커널은 선형, 다항식, S자형 또는 방사형 기본 함수를 포함한다. 당해 기술분야에 공지된 공통 분류기에 대한 비교 연구가 문헌(Kukreja et al, BMC Bioinformatics 2012; 13: 139)에 기재되어 있다. 항체 결합 프로파일의 데이터에 기초한 데이터 분석 및 예측 모델링을 위한 다른 알고리즘은 Naive Bayes Classifiers, Logistic Regression, Quadratic Discriminant Analysis, K-Nearest Neighbors(KNN), K Star, Attribute Selected Classifier(ACS), Classification via clustering, Classification via Regression, Hyper Pipes, Voting Feature Interval Classifier, Decision Trees, Random Forest, 및 딥 러닝 어프로치를 포함하는 신경망을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
몇몇 실시양태에서, 항체 결합 프로파일은 샘플의 훈련 세트로부터 얻어지는데, 이는 SVM 분석에 기초한 제거 알고리즘을 적용함으로써 펩타이드의 가장 식별성 조합을 확인하는 데 사용된다. 통계학적 유의성 레벨에 의해 순위가 매겨진 다양한 수의 입력 펩타이드를 이용하는 알고리즘의 정확도는 교차 검증에 의해 결정될 수 있다. 가능한 수의 식별 펩타이드의 항체 결합 프로파일을 생성하고 평가하기 위해, 복수의 식별 펩타이드를 이용하여 다중 모델을 구축함으로써 최상의 성능 모델을 확인할 수 있다. 상기 방법은 펩타이드의 수를 제한하는 것을 배제하지 않는 반면, 상기 방법은 모든 또는 실질적으로 모든 가용한 펩타이드 결합 정보, 예를 들어 결합 신호를 이용할 수 있다. 따라서, 상기 방법은 서열이 결합 목적을 위해 이용될 수 있는 선험적인 펩타이드를 결정하기 위해 시도하는 접근법과 대조된다. 몇몇 실시양태에서, 어레이 상의 최대 모든 펩타이드는 식별 펩타이드이다. 몇몇 실시양태에서, 적어도 25, 적어도 50, 적어도 75, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1000, 적어도 1500, 적어도 2000, 적어도 3000, 적어도 4000, 적어도 5000, 적어도 6000, 적어도 7000, 적어도 8000, 적어도 9000, 적어도 10,000, 적어도 11,000 적어도 12,000, 적어도 13,000, 적어도 14,000, 적어도 15,000, 적어도 16,000, 적어도 17,000, 적어도 18,000, 적어도 19,000, 적어도 20,000개 또는 그 초과의 식별 펩타이드는 특이적인 질환 분류 모델을 훈련시키기 위해 사용된다. 몇몇 실시양태에서, 어레이 상의 펩타이드의 총 수의 적어도 0.00001%, 적어도 0.0001%, 적어도 0.0005%, 적어도 0.001%, 적어도 0.005%, 적어도 0.01%, 적어도 0.05%, 적어도 0.1%, 적어도 0.5%, 적어도 1.0%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%는 식별 펩타이드이고, 상응하는 결합 신호 정보는 특이적인 상태 분류 모델을 훈련시키기 위해 사용된다. 몇몇 실시양태에서, 어레이 상의 모든 펩타이드에 대해 얻은 신호 정보는 상태 특이적 모델을 훈련시키기 위해 사용된다.
상이한 수의 식별 펩타이드를 포함하는 다중 모델이 생성될 수 있으며, 각각의 모델의 성능은 교차 검증 프로세스에 의해 평가될 수 있다. SVM 분류기는 샘플의 훈련 세트의 각각의 샘플을 복수의 교차 검증 그룹 중 하나에 할당하여 훈련 및 교차 검증될 수 있다. 예를 들어, 5-폴드 교차 검증의 경우, 각각의 샘플은 4개의 교차 검증 그룹 중 하나에 할당되는데, 각각의 그룹은 테스트 및 대조군, 즉 기본 샘플; 교차 검증 그룹 중 하나, 예를 들어 그룹 1은 보류되고, SVM 분류기 모델은 그룹 2-4의 샘플을 사용하여 훈련된다(도 3). 훈련 그룹에서 테스트 사례 및 기준 샘플을 식별하는 펩타이드는 예를 들어 통계학적 p-값에 의해 분석되고 순위가 매겨지며; 이어서, 상위 k 펩타이드가 SVM 모델의 예측 변수로 사용된다. 입력 예측 변수 수와 모델 성능 사이의 관계를 설명하고 오버피팅(overfitting)을 방지하기 위해, sub=loop는 k의 범위, 예를 들어 25, 50, 100, 250, 1000, 200, 3000개 상위 펩타이드 또는 그 초과에 대해 반복된다. 예측, 즉 그룹 1 내의 샘플의 분류는 그룹 2-4를 이용하여 생성된 모델을 이용하여 수행된다. 4개 그룹 각각에 대한 모델이 생성되며, 성능(AUC, 민감도 및/또는 특이도)은 진정 질환 샘플로부터의 신호 결합 데이터를 이용하는 4개 모델로부터의 예측을 모두 사용하여 계산된다. 교차 검증 단계는 적어도 100회 반복되며, 평균 성능은 신뢰 구간, 예를 들어 95%에 대해 계산된다. 진단 시각화는 예를 들어 입력 펩타이드의 수에 대한 모델 성능을 이용하여 생성될 수 있다.
식별 입력 펩타이드의 세트(최상의 식별 펩타이드의 목록, k)에 대한 항체 결합 정보에 기초한 최적 모델/분류기가 선택되고, 테스트 세트의 질환 상태를 예측하기 위해 사용된다. 상이한 분류기의 성능은 검증 세트를 이용하여 결정되고, 샘플의 테스트 세트를 이용하여, 성능 특성, 예를 들어 정확도, 민감도, 특이도 및 수용기 작동 특성의 곡선하 면적(AUC)은 최상의 성능을 보유하는 모델로부터 얻는다. 몇몇 실시양태에서, 식별 펩타이드의 상이한 세트는 상이한 상태를 구별하기 위해 확인된다. 따라서, 최상의 식별 입력 펩타이드의 세트에 기초한 최적 모델/분류기는 감별 진단을 제공하기 위해 AI 질환 각각에 대해 확립된다.
상태(conditions)의 분류
몇몇 실시양태에서, 개별적인 이진 분류기는 상이한 질환에 대해 AI를 감별적으로 진단하기 위해 얻을 수 있다. 예를 들어, 실시예 3에 나타낸 바와 같이, 식별 펩타이드의 조합에 기초한 최적 분류기는 SLE와, 상이한 AI를 보유하는 기준 대상체, 테스트되는 AI의 징후를 모방하는 비-AI 질환 또는 상태, 상이한 AI 및/또는 모방 상태를 포함하는 중첩 질환을 갖는 대상체를 감별적으로 진단하기 위해 선택된다.
실시예 2에서, 식별 펩타이드는 SLE를 보유하는 대상체 유래의 샘플과 표 1에 나타낸 바와 같은 대상체의 상이한 그룹 유래의 기준 샘플을 구별함으로써 SLE의 감별 진단을 제공하기 위해 결정된다.
식별 펩타이드의 조합의 특성은 확인된 식별 펩타이드 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 출현율 및/또는 특이적인 서열 모티프의 출현 빈도를 포함한다. 아미노산 및 모티프 함량의 농후화는 어레이 라이브러리 내의 모든 펩타이드의 상응하는 총 아미노산 및 모티프 함량에 대한 것이다. 몇몇 실시양태에서, AI를 보유하는 것으로 공지되거나, 또는 의심되는 대상체와 상이한 질환을 갖는 기준 대상체를 구별하는 면역서명 결합 패턴은 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 또는 적어도 10개의 상이한 아미노산에서 농후화될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 식별 펩타이드에서 아미노산의 농후화는 모든 라이브러리 펩타이드 내에 존재하는 아미노산 각각의 총 함량에 대해 100% 초과, 125% 초과, 150% 초과, 175% 초과, 200% 초과, 225% 초과, 250% 초과, 275% 초과, 300% 초과, 350% 초과, 400% 초과, 450% 초과, 또는 500% 초과일 수 있다.
유사하게, 몇몇 실시양태에서, AI 질환을 갖는 대상체와, 상이한 질환을 갖는 기준 대상체를 구별하는 면역서명 결합 패턴의 식별 펩타이드는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 또는 적어도 10개의 상이한 서열 모티프에서 농후화될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 서열 모티프의 농후화는 모든 라이브러리 펩타이드 내에 존재하는 모티프 각각의 총 함량에 대해 100% 초과, 125% 초과, 150% 초과, 175% 초과, 200% 초과, 225% 초과, 250% 초과, 275% 초과, 300% 초과, 350% 초과, 400% 초과, 450% 초과, 또는 500% 초과일 수 있다.
농후화된 모티프는, 해당 목록이 100개 미만의 펩타이드 길이가 아니라면, 유의적인 펩타이드의 목록으로부터 확인되었는데, 이 경우 웰치의 t-테스트와 관련된 p-값을 기초로 한 상위 500개의 펩타이드가 사용되었다. 이 펩타이드 목록 내의 상이한 n-mer는 어떤 것이 농후화되었는지 여부를 결정하기 위해 전체 라이브러리에서 동일한 크기의 n-mer와 비교되었다. 폴드 농후화는 목록에서 발생하는 모티프(예를 들어, ABCD)의 횟수를 라이브러리에서 발생하는 모티프(ABCD)의 횟수로 나눈 값을 결정함으로써 계산된다. 또한, 이 값은 라이브러리에 나타나는 모티프 유형(예를 들어, 4량체)의 상대적인 횟수(즉, 목록에 있는 모든 4량체의 총 수를 라이브러리의 총 4량체의 수로 나눈 값)로 나누어진다. 상기 농후화(E) 계산은 하기 식으로 나타낼 수 있다:
E=(m/M)/(t/T)
상기 식에서, m은 식별 펩타이드 목록의 일부로서 모티프가 발생하는 횟수이고; M은 라이브러리에서 모티프가 발생하는 총 횟수이며; t는 목록에 모티프 유형이 나타나는 횟수이며; 및 T는 라이브러리에서 모티프가 발생하는 횟수이다. 또한, 폴드 농후화는 농후화 백분율, 즉 100을 곱한 "농후화 값(enrichment value)"으로 보고될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, AI 질환은 SLE이고, SLE를 보유하는 대상체 유래의 샘플과, 상이한 자가면역 질환, 비-자가면역 질환, 건강한 대상체(HC)를 포함하는 상태를 보유하는 대상체 유래의 샘플, 혼합된 그룹 내에서 건강한 대상체를 포함하고 배제하는 다른 자가면역 질환을 갖는 대상체 및 비-자가면역 모방 질환을 갖는 대상체를 포함하는 혼합된 집단 유래의 샘플을 구별하는 식별 펩타이드는 도 4a, 도 5a, 도 6a, 도 7a, 도 8a, 도 9a, 및 도 10a에 제공된 바와 같은 농후화된 하나 이상의 모티프이다. 다른 실시양태에서, AI 질환은 RA이고, RA를 갖는 대상체 유래의 샘플과, 상이한 자가면역 질환, 비-자가면역 질환, 건강한 대상체(HC)를 포함하는 상태를 보유하는 대상체 유래의 샘플, 혼합된 그룹 내에서 건강한 대상체를 포함하고 배제하는 다른 자가면역 질환을 갖는 대상체 및 비-자가면역 모방 질환을 갖는 대상체를 포함하는 혼합된 집단 유래의 샘플을 구별하는 식별 펩타이드는 도 18a, 도 19a, 도 20a, 도 21a, 도 22a, 도 23a, 및 도 24a에 제공된 바와 같은 농후화된 하나 이상의 모티프이다. 하나 이상의 모티프의 농후화는 어레이 라이브러리 내의 모든 펩타이드의 상응하는 총 모티프 함량에 대해 100% 초과, 125% 초과, 150% 초과, 175% 초과, 200% 초과, 225% 초과, 250% 초과, 275% 초과, 300% 초과, 350% 초과, 400% 초과, 450% 초과, 또는 500% 초과 또는 그 초과일 수 있다.
몇몇 실시양태에서, AI 질환은 SLE이고, SLE를 보유하는 대상체 유래의 샘플과, 상이한 자가면역 질환, 비-자가면역 질환, 건강한 대상체(HC)를 포함하는 상태를 보유하는 대상체 유래의 샘플, 혼합된 그룹 내에서 건강한 대상체를 포함하고 배제하는 다른 자가면역 질환을 갖는 대상체 및 비-자가면역 모방 질환을 갖는 대상체를 포함하는 혼합된 집단 유래의 샘플을 구별하는 식별 펩타이드는 도 4b, 도 5b, 도 6b, 도 7b, 도 8b, 도 9b, 및 도 10b에 제공된 바와 같은 농후화된 하나 이상의 아미노산이다. 다른 실시양태에서, AI 질환은 RA이고, RA를 갖는 대상체 유래의 샘플과, 상이한 자가면역 질환, 비-자가면역 질환, 건강한 대상체(HC)를 포함하는 상태를 보유하는 대상체 유래의 샘플, 혼합된 그룹 내에서 건강한 대상체를 포함하고 배제하는 다른 자가면역 질환을 갖는 대상체 및 비-자가면역 모방 질환을 갖는 대상체를 포함하는 혼합된 집단 유래의 샘플을 구별하는 식별 펩타이드는 도 18b, 도 19b, 도 20b, 도 21b, 도 22b, 도 23b, 및 도 24b에 제공된 바와 같은 농후화된 하나 이상의 아미노산이다. 하나 이상의 아미노산의 농후화는 어레이 라이브러리 내의 모든 펩타이드의 상응하는 총 아미노산 함량에 대해 100% 초과, 125% 초과, 150% 초과, 175% 초과, 200% 초과, 225% 초과, 250% 초과, 275% 초과, 300% 초과, 350% 초과, 400% 초과, 450% 초과, 또는 500% 초과 또는 그 초과일 수 있다.
아미노산 및 모티프 함량의 농후화는 어레이 라이브러리 내의 상응하는 모든 펩타이드의 총 아미노산 및 모티프 함량에 대한 것이다. 몇몇 실시양태에서, 본 출원에 개시된 방법 및 어레이를 사용하여 대상체에서 AI 질환을 감별적으로 진단 또는 검출하는 데 있어서 AI 질환을 갖는 대상체와 상이한 질환을 갖는 대상체의 그룹을 구별하는 면역서명 결합 패턴의 식별 펩타이드는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 또는 적어도 10개의 상이한 아미노산에서 농후화된다.
어세이 성능
몇몇 실시양태에서, AI를 감별적으로 진단하기 위한 결과적인 방법 성능은 수신자 조작 특성(ROC) 곡선하 면적을 특징으로 한다. 분류의 특이도, 민감도, 및 및 정확도 지표는 ROC 곡선하 면적(AUC)에 의해 결정될 수 있다. 대안적인 방법에 의해 이미 건강 상태가 공지된 복수의 환자에 적용되는 경우, 상기 방법의 성능 또는 정확도는 수신자 조작 특성(ROC) 곡선하 면적(AUC)이 0.90 초과임을 특징으로 한다. 다른 실시양태에서, 상기 방법 성능은 수신자 조작 특성(ROC) 곡선하 면적(AUC)이 0.70 초과, 0.80 초과, 0.90 초과, 0.95 초과임을 특징으로 하고, 상기 방법 성능은 수신자 조작 특성(ROC) 곡선하 면적(AUC)이 0.97 초과임을 특징으로 하고, 상기 방법 성능은 수신자 조작 특성(ROC) 곡선하 면적(AUC)이 0.99 초과임을 특징으로 한다. 다른 실시양태에서, 상기 방법 성능은 수신자 조작 특성(ROC) 곡선하 면적(AUC)이 0.60 내지 0.69, 0.70 내지 0.79, 0.80 내지 0.89, 또는 0.90 내지 1.0 범위임을 특징으로 한다. 아직 다른 실시양태에서, 상기 방법 성능은 선택도, 특이도, 및/또는 정확도의 관점에서 표현된다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 적어도 60%의 민감도, 예를 들어 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 민감도를 보유한다.
다른 실시양태에서, 상기 방법은 적어도 60%의 특이도, 예를 들어 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 특이도를 보유한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 적어도 60%의 정확도, 예를 들어 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 정확도를 보유한다.
후보 바이오마커의 확인
제공된 바와 같이 얻은 면역서명은 향후 본 출원에 개시된 방법 및 장치에 따라 후보 치료적 타겟을 확인하는 것, AI 질환을 감별적으로 진단하는 것, 상기 질환의 활성을 모니터링하는 것, 및 확인된 AI 질환에 대해 개인을 위한 치료를 개발하는 것을 포함하는 다수의 응용분야에서 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 펩타이드(면역서명, IS)의 어레이 상에 항체 레퍼토리를 펼치고(splaying out), AI 질환, 예를 들어 SLE를 보유하는 대상체 유래의 샘플과 상이한 질환, 예를 들어 RA를 갖는 대상체 유래의 샘플을 비교함으로써, 유용한 정보를 주는 식별 펩타이드는 인식된, 즉 상기 항체에 의해 결합된 펩타이드를 나타내는 것으로 확인될 수 있다.
예를 들어, 상기 펩타이드는 정보학적 방법을 이용하여 확인될 수 있다. 정보학이 추정적인 매치를 확인할 수 없는 경우, 예를 들어 불연속 에피토프의 경우에, 유용한 정보를 주는 펩타이드는 반응성 항체를 정제하기 위한 친화성 시약으로서 사용될 수 있다. 정제된 항체는 향후 타겟을 확인하기 위해 표준 면역학적 기법에서 사용될 수 있다.
AI 질환, 예를 들어 SLE를 감별적으로 진단하기 위해, 적합한 기준 프로테옴은 샘플 내의 항체에 의해 결합된 식별 펩타이드의 서열과 연관시키기 위해 조회될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 확인된 식별 펩타이드를 이용하여 조회될 수 있는 프로테옴은 2016년 3월 10일에 컴파일된 인간 게놈 빌드 GrCh38(https://wwwncbinlmnihgov/refseq/)에 상응하는 인간 프로테옴 RefSeq 릴리즈 84이다. 아울러, 조회될 수 있는 단백질의 다른 컴필레이션은 질환-관련 단백질의 목록, 공지되거나 미지의 돌연변이(단일 뉴클레오티드 다형성, 삽입, 치환 및 결실을 포함)를 함유하는 단백질의 목록, 공지된 및 미지의 스플라이스 변이체로 구성되는 단백질의 목록, 또는 조합 라이브러리(천연 및 비천연 아미노산을 포함) 유래의 펩타이드 또는 단백질의 목록을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
프로테옴 또는 단백질 목록에 대해 단일 및 다수의 단백질을 정렬하기 위한 소프트웨어는 BLAST, CS-BLAST, CUDAWS++, DIAMOND, FASTA, GGSEARCH(GG 또는 GL), Genoogle, HMMER, H-suite, IDF, KLAST, MMseqs2, USEARCH, OSWALD, Parasail, PSI-BLAST, PSI_Protein, Sequilab, SAM, SSEARCH, SWAPHI, SWIMM, 및 SWIPE를 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
대안적으로, 어레이 상의 전체 펩타이드에서 확인된 모티프에 비해 식별 펩타이드에서 농후화되는 서열 모티프는 상태의 치료를 위한 가능한 치료적 타겟으로서 검증될 수 있는 타겟 단백질을 확인하기 위해 프로테옴에 정렬될 수 있다. 단백질 도메인, 패밀리 및 작용 부위를 확인하기 위한 온라인 데이터베이스 및 검색 수단은 예를 들어, ExPASy에 있는 Prosite, Motif Scan(MyHits, SIB, Switzerland), Interpro 5, MOTIF(GenomeNet, Japan), 및 Pfam(EMBL-EBI)에서 이용할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 정렬 방법은 조회 서열의 아미노산을 더 긴 단백질 서열에 맵핑하기 위한 임의의 방법이 사용될 수 있으며, 상기 방법은 BLAST(Altschul, SF & Gish, W [1996] "Local alignment statistics" Meth Enzymol 266:460-480), 조성적 치환 및 스코어링 매트리스, 갭이 있고 및 갭이 없는 정확한 매칭, 에피토프 예측, 항원성 예측, 소수성 예측, 표면 접근 가능성 예측을 포함한다. 각각의 접근을 위해, 펩타이드 라이브러리 조성의 바이어스를 보정하기 위해 최적화된 변형된 스코어링 시스템을 사용하는, 표준 또는 변형된 스코어링 시스템이 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 변형된 BLAST 정렬이 사용되는데, 이는 어레이의 아미노산 조성을 반영하도록 변형된(States et al., Methods 3:66-70) BLOSUM62의 스코어링 매트릭스(Henikoff, J.G.　Proc. Natl. Acad. Sci. USA　89, 10915-10919 [1992])를 이용하여, 4의 갭 패널티를 갖는 3개의 아미노산 시드를 필요로 한다. 이들 변형은 유사한 치환의 스코어를 증가시키고, 어레이에 없는 아미노산에 대한 페널티를 제거하며, 모든 정확한 매치를 균등하게 스코어링한다.
제공된 방법에 따라 후보 바이오마커 단백질을 확인하기 위해 사용될 수 있는 식별 펩타이드는 2개 이상의 상이한 건강 상태 사이를 구별할 수 있는 그들의 능력에 따라 선택된다. 본 출원에 다른 곳에 기재된 바와 같이, 식별 펩타이드는 미리 결정된 통계학적 엄중성, 예를 들어 2개 이상의 상태 사이의 식별 확률의 경우 p-값에 의해; 2개 이상이 상태 사이의 상대적인 결합 신호 세기 변화에서의 차이에 의해; 단일 상태에서 그들의 세기 순위에 의해; 2개 이상의 상태에 대해 훈련된 머신 러닝 모델에서 그들의 계수, 예를 들어 AUC에 의해, 또는 하나 이상의 연구 파라미터와 그들의 상관관계, 예를 들어 R 스퀘어드(squared), 스피어만 상관관계에 의해 선택될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 후보 바이오마커를 확인하기 위해 선택된 식별 펩타이드는 p<1E-03, p<1E-04, 또는 p<1E-05의 p-값을 보유하는 것으로서 선택된다.
본 출원의 다른 곳에 기재된 바와 같이, AI 질환의 감별 진단을 위해 식별 펩타이드의 세트가 확인된 후, 식별 펩타이드는 하나 이상의 병원체 프로테옴에 정렬되고, 양성 BLAST 스코어를 보유하는 펩타이드가 확인된다. 식별 펩타이드가 정렬되는 각각의 단백질의 경우, 정렬에서 BLAST 양성 펩타이드에 대한 스코어는 매트릭스, 예를 들어 정렬된 펩타이드에 상응하는 매트릭스의 각각의 열(row) 및 단백질을 포함하는 연속적인 아미노산의 하나에 상응하는 각각의 행(column)을 갖는 변형된 BLOSUM62로 어셈블리된다. 매트릭스의 각각의 열은 정렬된 펩타이드에 상응하고, 각각의 행은 단백질 상의 아미노산에 상응하는데, 단백질에 대한 정렬을 가능하게 하기 위해 펩타이드 열 내에 허용된 갭 및 결실을 보유한다.
앞에 기재된 변형된 BLAST 스코어링 매트릭스를 이용하여, 매트릭스 내의 각각의 위치는 그 행 내의 펩타이드 및 단백질의 쌍을 이룬 아미노산에 대한 스코어를 수용한다. 이어서, 단백질 내의 각각의 아미노산의 경우, 상응하는 행은 식별 펩타이드에 의해 단백질 내의 위치에서 그 아미노산의 커버리지를 나타내는 아미노산 "중첩 스코어"를 생성하기 위해 합산된다.
아미노산 중첩 스코어는 조성, 즉 어레이 라이브러리의 아미노산 함량에 대해 후속적으로 보정된다. 예를 들어, 보정은 20개의 천연 아미노산 중 하나 이상을 배제하는 라이브러리 어레이 펩타이드를 설명하기 위해 수행된다. 라이브러리 조성에 대해 이 스코어를 보정하기 위해, 아미노산 중첩 스코어는 모든 어레이 펩타이드의 목록을 위해 동일한 방법에 의해 계산된다. 이는 하기 식에 따라 각각의 아미노산 위치에서 식별 펩타이드에 기초한 펩타이드 중첩 차이 스코어 sd의 계산을 가능하게 한다:
sd=a-(b/d)*c
상기 식에서, "a"는 식별 펩타이드로부터의 중첩 스코어이고, "b"는 면역서명 식별 펩타이드의 수이고, "c"는 펩타이드의 전체 어레이에 대한 중첩 스코어이며, "d"는 전체 어레이 상의 라이브러리 펩타이드의 수이다.
다음으로, 식별 펩타이드의 정렬로부터 얻은 아미노산 중첩 스코어는 단백질 스코어 Sd로 전환된다. 아미노산 레벨에서 상기 스코어 sd를 전체-단백질 통계 Sd로 전환하기 위해, 단백질 내의 가능한 모든 n-mer 에피토프에 대한 스코어의 합이 계산되며, 이때 n은 20(등)일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 스코어는 10-mer 에피토프, 15-mer-에피토프, 20-mer 에피토프, 25-mer 에피토프, 30 mer-에피토프, 35-mer-에피토프, 40-mer-에피토프, 45-mer 에피토프, 또는 50-mer 에피토프를 타일링(tiling)하기 위해 얻을 수 있다. 단백질 스코어 Sd는 롤링 윈도우를 따라 얻은 최대 스코어이다. 몇몇 실시양태에서, n-mer는 단백질의 전체 길이에 상관관계가 있는데, 즉 식별 펩타이드는 단백질의 전체 서열에 정렬된다. 대안적으로, 상기 스코어는 전체 단백질 서열에 대해 펩타이드 서열을 정렬함으로써 얻을 수 있다.
확인된 후보 바이오마커의 순위 매김은 무작위로 선택된 비-식별 펩타이드의 순위 매김에 대해 후속적으로 수행된다. 따라서, 비-식별 펩타이드에 대한 중첩 스코어(비-식별 무작위 'sr' 스코어), 즉 동일한 프로테옴 또는 단백질의 하나 이상의 단백질 각각에 정렬하는 무작위 선택된 펩타이드는 식별 펩타이드에 대해 기술된 바와 같이 얻어진다. 아미노산 중첩 스코어는 무작위 펩타이드에 대해 계산되고, 비-식별 또는 무작위 sr 스코어를 제공하기 위해 펩타이드 라이브러리의 아미노산 함량에 대해 후속적으로 보정된다. 이어서, 비-식별 sr 스코어는 복수의 무작위로 선택된 비-식별 펩타이드 각각에 대한 비-식별 단백질 'Sr' 스코어로 전환된다. 예를 들어, 비-식별 무작위 단백질 'Sr' 스코어는 적어도 25, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200개, 또는 그 초과의 무작위로 선택된 비-식별 펩타이드에 대해 얻을 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 무작위로 선택된 비-식별 펩타이드에 대한 최종 단백질 스코어인 Sr 스코어는 단백질 스코어 Sd를 얻기 위해 사용된 균등한 수의 식별 펩타이드를 이용하여 계산될 수 있다. 다른 실시양태에서, Sd를 결정하기 위해 사용된 식별 펩타이드의 수의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%는 비-식별 단백질 'Sr' 스코어를 결정하기 위해 사용된다.
몇몇 실시양태에서, 후보 단백질 바이오마커는 비-식별 펩타이드의 정렬에 의해 확인된 단백질의 Sr 스코어에 대한 그들의 Sd 스코어에 의해 순위 매겨진다. 몇몇 실시양태에서, 순위 매김은 p-값에 따라 결정될 수 있다. 상위 후보 바이오마커는 10-3 미만, 10-4 미만, 10-5 미만, 10-6 미만, 10-7 미만, 10-8 미만, 10-9 미만, 10-10 미만, 10-12 미만, 10-15 미만, 10-18 미만, 10-20, 또는 그 미만의 p-값을 보유하는 것으로서 선택될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 120, 적어도 150, 적어도 180, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500개, 또는 그 초과의 후보 바이오마커는 상기 방법에 따라 확인된다.
다른 실시양태에서, 후보 바이오마커는 앞의 문단에 기재된 바와 같이 n-mer 에피토프에 대해 복수의 식별 펩타이드를 타일링(tiling)하고, 병원체의 프로테옴에 대한 가장 큰 Sd 스코어를 보유하는 단백질의 백분율로서 후보 바이오마커의 수를 선택함으로써 얻은 Sd 스코어에 따라 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 후보 바이오마커는 가장 높은 순위의 Sd 스코어를 보유하고 병원체의 프로테옴의 단백질의 총 수의 적어도 0.01%를 포함하는 단백질이다. 다른 실시양태에서, 후보 바이오마커는 가장 높은 순위의 Sd 스코어를 보유하고 병원체의 프로테옴의 단백질의 총 수의 적어도 0.02%, 적어도 0.03%, 적어도 0.04%, 적어도 0.05%, 적어도 0.1%, 적어도 0.15%, 적어도 0.2%, 적어도 0.25%, 적어도 0.3%, 적어도 0.35%, 적어도 0.4%, 적어도 0.45%, 적어도 0.5%, 적어도 0.55%, 적어도 0.6%, 적어도 0.65%, 적어도 0.7%, 적어도 0.75%, 적어도 0.8%, 적어도 0.85%, 적어도 0.9%, 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 또는 그 초과를 포함하는 단백질이다.
몇몇 실시양태에서, 전신 홍반성 루푸스(SLE)를 위한 적어도 하나의 후보 단백질 바이오마커를 확인하는 방법 또는 키트가 제공되는데, 상기 방법은 (a) 펩타이드 어레이를 제공하고, 펩타이드 어레이에 대해 자가면역 질환을 갖는 것으로 공지된 복수의 기준 대상체 유래의 생물학적 샘플을 인큐베이션하는 단계; (b) 상기 대상체 유래의 생물학적 샘플 내의 항체에 결합된 식별 펩타이드의 세트를 확인하는 단계로서, 식별 펩타이드의 세트는 건강한 대상체 유래의 샘플로부터 전신 홍반성 루푸스를 감별화할 수 있는 결합 신호를 나타내는 단계; (c) 식별 펩타이드의 세트 내의 펩타이드 각각을 이용하여 프로테옴 데이터베이스를 조회하는 단계; (d) 인간 프로테옴 데이터베이스 내의 하나 이상의 단백질에 대해 식별 펩타이드의 세트 내의 펩타이드 각각을 정렬하는 단계; 및 (e) 프로테옴 데이터베이스로부터 확인된 단백질 각각에 대한 관련성 스코어 및 순위를 얻는 단계를 포함하고, 이때 확인된 단백질 각각이 전신 홍반성 루푸스에 대한 후보 바이오마커이다. 상기 식별 펩타이드는 통계학적 수단, 예를 들어 10-3 미만, 10-4 미만, 10-5 미만, 10-6 미만, 10-7 미만, 10-8 미만, 10-9 미만, 10-10 미만, 10-11 미만, 10-12 미만, 10-13 미만, 10-14 미만, 또는 10-15 미만의 p-값을 보유하는 t-테스트에 의해 확인될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 결과적인 후보 바이오마커는, 비식별 펩타이드를 이용하는 상기 방법에 따라 확인된 단백질과 비교하는 경우, 10-3 미만, 10-4 미만, 10-5 미만, 10-6 미만의 p-값에 따라 순위 매겨질 수 있다.
샘플
제공된 방법에 따라 사용되는 샘플은 모든 생물학적 샘플일 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 항체를 포함하는 생물학적 액체 샘플일 수 있다. 적합한 생물학적 액체 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 땀, 눈물, 가래, 소변, 대변액, 귀 흐름액, 림프, 타액, 뇌척수액, 황폐액(ravages), 골수 부유액, 질액, 경경추 경사 세척액, 활액, 방수, 양수, 귀지, 모유, 기관지폐포 세척액, 뇌액, 낭종액, 흉막 및 복막액, 심낭액, 복수, 젖, 췌장액, 호흡 분비액, 소화관 및 비뇨생식기관, 양수액, 젖 및 류코포레시스(leukophoresis) 샘플을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 또한, 생물학적 샘플은 배반포구멍, 재대혈, 또는 태아 또는 모계가 기원인 모체 순환액이 될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 샘플은 비침습성 방법에 의해 쉽게 얻어지는 샘플, 예를 들어 혈액, 혈장, 혈청, 땀, 눈물, 가래, 소변, 대변액, 귀 흐름액 또는 타액이다. 몇몇 실시양태에서 샘플은 말초혈액 샘플 또는 말초혈액 샘플로부터의 혈장 또는 혈청 분획이다. 본 출원에 사용된 바와 같이, 용어 "혈액", "혈장" 및 "혈청"은 그 자체 분획 또는 가공된 분핵을 포함하는 것으로 표현된다.
최소한의 침습적인 접근 가능성 및 이의 용이한 이용 가능성 때문에, 통상적인 임상 실습에서 측정되는 가장 바람직하고 사용되는 인간 체액은 혈액이다. 더구나, 혈액은 모든 신체 조직을 관류하고, 따라서 이의 조성은 개인의 전반적인 생리학적 지표로서 관련이 있다. 몇몇 실시양태에서, 면역서명/항체 결합 프로파일을 얻기 위해 사용되는 생물학적 샘플은 혈액 샘플이다. 다른 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈장 샘플이다. 또 다른 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈청 샘플이다. 아직 다른 실시양태에서, 생물학적 샘플은 건조된 혈액 샘플이다. 생물학적 샘플은 항체 결합 프로파일의 분석을 수행하지 않은 당사자 및/또는 펩타이드 어레이에 대해 결합 측정을 수행한 당사자와 같은 제3자를 통해 얻을 수 있다. 예를 들어, 샘플은 샘플이 추출된 대상체의 임상의사, 의사 또는 기타 의료 관리자를 통해 얻을 수 있다. 대안적으로, 생물학적 샘플은 펩타이드 어레이에 대해 샘플의 결합 어세이를 수행한 당사자 및/또는 항체 결합 프로파일/IS를 분석한 동일한 당사자에 의해 얻을 수 있다. 어세이되는 생물학적 샘플은 저장(예를 들어, 냉동)되거나, 그렇지 않으면 보존 조건 하에서 저장될 수 있다.
용어 "환자 샘플" 및 "대상체 샘플"은 본 출원에서 상호 교환 가능하게 사용되고, 환자 즉 의료적 관심, 관리 또는 치료를 받는 대상으로부터 얻은 샘플, 예를 들어 생물학적 샘플을 의미한다. 대상체 샘플은 본 출원에 기재된 임의의 샘플일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 대상체 샘플은 비침습적 절차에 의해 얻어지는데, 예를 들어 말초 혈액 샘플이다.
샘플 내에서 순환 항체의 항체 결합 프로파일은 샘플의 제한된 양을 이용하여 제공된 방법에 따라 얻을 수 있다. 예를 들어, 어레이 상의 펩타이드는 대상체의 건강 상태를 확인하기 위한 충분한 수의 유익한 펩타이드-단백질 복합체 정보를 포함하는 항체 결합 프로파일을 얻기 위하여 1 밀리리터의 혈액 분획과 접촉될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 항체 결합 프로파일을 얻기 위해 필요한 생물학적 샘플의 부피는 10 ml 미만, 5 ml 미만, 3 ml 미만, 2 ml 미만, 1 ml 미만, 900 ㎕ 미만, 800 ㎕ 미만, 700 ㎕ 미만, 600 ㎕ 미만, 500 ㎕ 미만, 400 ㎕ 미만, 300 ㎕ 미만, 200 ㎕ 미만, 100 ㎕ 미만, 50 ㎕ 미만, 40 ㎕ 미만, 30 ㎕ 미만, 20 ㎕ 미만, 10 ㎕ 미만, 1 ㎕ 미만, 900 nℓ 미만, 800 nℓ 미만, 700 nℓ 미만, 600 nℓ 미만, 500 nℓ 미만, 400 nℓ 미만, 300 nℓ 미만, 200 nℓ 미만, 100 nℓ 미만, 50 nℓ 미만, 40 nℓ 미만, 30 nℓ 미만, 20 nℓ 미만, 10 nℓ 미만, 또는 1 nℓ 미만이다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 유체 샘플은 항체 결합 프로파일을 얻기 위해 몇 배로 희석될 수 있다. 예를 들어, 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플은 적어도 2배, 적어도 4배, 적어도 8배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 200배, 적어도 300배, 적어도 400배, 적어도 500배, 적어도 600배, 적어도 700배, 적어도 800배, 적어도 900배, 적어도 1000배, 적어도 5000배 또는 적어도 10,000배로 희석될 수 있다. 희석된 혈청 샘플에 존재하는 항체는 대상체의 건강에 대해 유의적인 것으로 간주되는데, 그 이유는 희석된 혈청 샘플 내에서도 항체가 잔존하는 경우, 그들은 환자의 혈액 내에 비교적 많은 양으로 존재해 왔던 것이라고 생각하는 것이 합리적이기 때문이다.
치료 및 상태(conditions)
본 발명의 방법과 어레이는 식별 펩타이드를 확인하는 방법, 어세이 및 장치를 제공하는데, 이는 AI 질환을 감별적으로 진단하고, AI 질환의 후보 바이오마커를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 본 출원에 개시된 실시양태의 방법 및 어레이는 예를 들어, AI 질환의 감별 진단 및/또는 대상체에서 AI 질환을 위한 하나 이상의 후보 바이오마커의 확인을 위해 사용될 수 있다. 대상체는 인간, 기니피그, 개, 고양이, 말, 마우스, 토끼, 및 다양한 다른 동물일 수 있다. 대상체는 임의의 연령일 수 있는데, 예를 들어 신생아, 유아, 어린이, 사춘기 이전의 아이, 청소년, 성인 또는 노인일 수 있다.
본 발명의 어레이 및 방법은 사용자에 의해 사용될 수 있다. 복수의 사용자는 상태를 확인하고/하거나 치료하기 위해 본 발명의 방법을 사용할 수 있다. 사용자는, 예를 들어 자기 자신의 건강을 모니터링하기 원하는 인간일 수 있다. 예를 들어, 사용자는 건강 관리 제공자일 수 있다. 예를 들어, 건강 관리 제공자는 의사일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 사용자는 해당 실험에 참여하는 건강 관리 제공자이다. 본 발명의 사용자일 수 있는 의사 및 건강 관리 제공자의 비제한적인 예로는 마취의사, 비만수술 전문의, 혈액 은행 수혈 전문의, 심장 전기생리학자, 심장 외과의사, 심장전문의, 공인 간호 조수, 임상 심장 전기생리학 전문의, 임상 신경생리학 전문의, 임상 간호 전문의, 결장직장 외과의사, 중환자 치료 전문의, 중환자 수술 전문의, 치위생의, 치과의사, 피부과전문의, 응급 의료 기술자, 응급 의료 의사, 위장 외과의사, 혈액학자, 호스피스 간호 및 완화의학 전문의, 동종요법 전문가, 감염 질환 전문의, 내과의사, 상악안면 외과의사, 의료 보조원, 검시관, 유전체 분석자, 종양전문의, 조산사, 신생아-태아 전문가, 신장전문의, 신경전문의, 신경외과의사, 핵의학전문의, 간호사, 간호실습자, 산과전문의, 종양전문의, 구강외과의사, 치과교정전문의, 정형외과 전문의, 통증관리 전문의, 병리학자, 소아과전문의, 체외 순환사, 치주전문의, 성형외과의사, 발전문가, 직장병전문의, 보철전문의, 정신과의사, 호흡기내과의, 방사선과의사, 외과의사, 흉부외과전문의, 이식전문의, 혈관전문의, 혈관외과의사 및 수의사를 포함한다. 본 발명의 어레이 및 방법으로 확인된 진단은 대상자의 의료 기록에 포함될 수 있다.
어레이 플랫폼
몇몇 실시양태에서, 본 출원에서 화학적 라이브러리 합성의 증가된 다양성 및 충실도를 가능하게 하는 어레이 플랫폼을 제공하는 방법, 프로세스, 및 키트가 개시된다. 상기 어레이 플랫폼은 어레이 표면 상에 복수의 개별적인 피쳐를 포함한다. 전형적으로 각각의 피쳐는 어레이의 표면 상에 복수의 개별적인 분자, 즉 펩타이드를 포함하는데, 이들은 필요에 따라 어레이의 표면 상에서 계내에서 합성되며, 이때 상기 분자는 피쳐 내에서 동일하지만, 분자의 서열 또는 아이덴티티는 피쳐 사이에서 상이하다. 상기 어레이 분자는 핵산(DNA, RNA, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 이의 구조적 유사체 또는 조합을 포함함), 펩타이드, 펩타이드 모방체, 및 이의 조합 등을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니며, 상기 어레이 분자는 분자 내에 천연 또는 비천연 모노머를 포함할 수 있다. 그러한 어레이 분자는 큰 합성 펩타이드 어레이의 합성을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 어레이 내의 분자는 에피토프의 구조를 모방하여 에피토프 유발된 항체에 결합할 수 있는 분자인 미모토프(mimotope)이다. 몇몇 실시양태에서, 어레이 내의 분자는 파라토프 또는 파라토프 모방체인데, 이들은 항원의 에피토프에 결합하는 항체(또는 T 세포 수용체)의 가변부에 있는 위치를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 어레이는 무작위, 의사무작위 또는 최대로 다양한 펩타이드 서열을 포함하는 펩타이드 어레이이다.
펩타이드 어레이는 잘 특성화된 단일클론 항체(mAb)의 에피토프와 매칭되는 대조군 서열을 포함할 수 있다. 대조군 서열 및 라이브러리 펩타이드에 대한 결합 패턴은 어레이 및 면역서명 어세이 프로세스에 자격을 부여하기 위해 측정될 수 있다. 공지된 에피토프를 갖는 mAb, 예를 들어 4C1, p53Ab1, p53Ab8 및 LnKB2는 상이한 용량에서 어세이될 수 있다. 또한, 웨이퍼 간 신호 정밀도는 상이한 웨이퍼 유래의 어레이 상에서 샘플 복제물, 예를 들어 혈장 샘플을 테스트하고 모든 라이브러리 펩타이드에 대한 변동 계수(CV)를 계산함으로써 결정될 수 있다. 결합 신호의 측정의 정밀도는 동일한 배치의 웨이퍼 상에서(웨이퍼 배치 내에서) 합성된 어레이 상에서 생성된 어레이들 사이, 슬라이드들 사이, 웨이퍼들 사이 및 일 사이(inter-day) 변화의 합계로서 결정될 수 있다. 아울러, 측정의 정밀도는 상이한 배치의 웨이퍼(웨이퍼 배치들 사이) 상의 어레이에 대해 결정될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 결합 신호의 측정은 5% 미만, 10% 미만, 15% 미만, 20% 미만, 25% 미만 또는 30% 미만으로 정밀도를 가지는 웨이퍼 배치들 내 및/또는 사이에서 수행될 수 있다.
본 출원에 개시된 기술은 반도체 제조 공정과 조합 화학 합성을 결합하여 실리콘 웨이퍼 상에 어레이 기반 라이브러리를 생산하는 포토리소그래피 어레이 합성 플랫폼을 포함한다. 포토리소그래피 피쳐 패터닝의 엄청난 발전을 활용함으로써, 어레이 합성 플랫폼은 확장성이 높으며 8인치 웨이퍼에 4000만 개의 피쳐를 보유하는 조합 화학 라이브러리를 제작할 수 있다. 포토리소그래피 어레이 합성은 반도체 웨이퍼 생산 장비를 사용하여 높은 재현성을 달성하기 위해 클래스 10,000 클린룸에서 수행된다. 웨이퍼가 표준 현미경 슬라이드 치수로 절단되는 경우, 각각의 슬라이드는 3백만개 초과의 구별되는 화학 물질을 함유한다.
몇몇 실시양태에서, 본 출원에 개시된 포토리소그래피 기술에 의해 제작된 화학 라이브러리를 보유하는 어레이는 면역 기반 진단 어세이, 예를 들어 소위 면역서명 어세이를 위해 사용된다. 어레이에 결합된 한 방울의 혈액 유래의 환자의 항체 레퍼토리를 이용하면, 결합된 어레이의 형광 결합 프로파일 이미지는 AI 질환을 감별적으로 진단하기 위한 충분한 정보를 제공한다.
몇몇 실시양태에서, 면역서명 어세이는 AI 질환을 감별적으로 진단/모니터링하고 치료에 대한 반응을 평가하기 위한 임상적 적용을 위해 개발되고 있다. 면역서명 어세이의 예시적인 실시양태는 발명의 명칭이 "샘플 프로파일링을 위한 화합물 어레이"인 미국 공개공보 제2012/0190574호 및 발명의 명칭이 "초기 진단 및 건강 모니터링을 위한 과정"인 미국 공개공보 제2014/0087963호에 상세히 기재되어 있으며, 이들 둘 다는 그 개시내용에 대해 본 출원에 참고로 인용된다. 본 출원에서 개발된 어레이는 편광 해석법, 질량 분석법 및 형광을 포함하는 직교(orthogonal) 분석 방법을 사용하여 각각 합성된 어레이 내에 분석적인 측정 능력을 통합한다. 이들 측정은 어레이 합성 성능의 종방향 정성 및 정량 평가를 가능하게 한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 어레이는 조합 서열 펩타이드의 확장 가능한 수의 어레이를 얻기 위해 재사용 가능한 마스크 및 자동화를 이용하여 생성된 웨이퍼 기반의 포토리소그래픽 계내 펩타이드 어레이이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 펩타이드 어레이는 상이한 서열을 보유하는 적어도 5,000, 적어도 10,000, 적어도 15,000, 적어도 20,000, 적어도 30,000, 적어도 40,000, 적어도 50,000, 적어도 100,000, 적어도 200,000, 적어도 300,000, 적어도 400,000, 적어도 500,000, 적어도 1,000,000, 적어도 2,000,000, 적어도 3,000,000, 적어도 4,000,000, 적어도 5,000,000, 적어도 10,000,000, 적어도 100,000,000개 또는 그 초과의 펩타이드를 포함한다. 상이한 서열 펩타이드 각각의 다수의 카피는 피쳐로 공지된 주소 지정 가능한 위치에서 웨이퍼 상에 위치될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 펩타이드 어레이 상에서 항체 결합의 검출은 본 출원에 개시된 기술에 의해 해결될 수 있는 몇몇 도전을 제기한다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 본 출원에 개시된 어레이 및 방법은 면역서명 어세이를 수행하기 위해 필요한 원하는 특징을 조절할 수 있는, 어레이의 표면 상에서 특이적인 코팅 및 작용기 밀도를 이용한다. 예를 들어, 펩타이드 어레이 상의 비특이적 항체 결합은 보통 친수성 단일층 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리비닐 알코올, 카르복시메틸 덱스트란 및 이의 조합으로 실리콘 표면을 코팅함으로써 최소화할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 친수성 단일 층은 균질하다. 둘째로, 합성된 펩타이드는 표면으로부터 펩티드를 떨어뜨리는 스페이서를 이용하여 실리콘 표면에 링크되어 펩티드가 방해받지 않는 배향으로 항체에 제시되도록 한다.
계내에서 합성된 펩타이드 라이브러리는 질환 불가지성이고, 그들이 진단하려고 의도하는 질환의 사전 인식 없이 합성될 수 있다. 동일한 어레이는 임의의 건강 상태를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
본 출원에 사용된 바와 같이 용어 "펩타이드"는 선형 사슬로 또는 환형 사슬로 함께 연결된 복수의 아미노산을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해, 상기 용어 펩타이드는 임의 특정 수의 아미노산으로 제한되지 않는다. 그러나, 바람직하게는, 그들은 최대 약 400개의 아미노산, 최대 약 300개의 아미노산, 최대 약 250개의 아미노산, 최대 약 150개의 아미노산, 최대 약 70개의 아미노산, 최대 약 50개의 아미노산, 최대 약 40개의 아미노산, 최대 30개의 아미노산, 최대 20개의 아미노산, 최대 15개의 아미노산, 최대 10개의 아미노산, 또는 최대 5개의 아미노산을 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 어레이의 펩타이드는 5 내지 30개의 아미노산, 5 내지 20개의 아미노산, 또는 5 내지 15개의 아미노산이다. 펩타이드 분자의 전부 또는 일부를 형성하는 아미노산은 20개의 전통적인 자연 발생 아미노산, 즉 알라닌(A), 시스테인(C), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 페닐알라닌(F), 글리신(G), 히스티딘(H), 이소루신(I), 라이신(K), 루신(L), 메티오닌(M), 아스파라진(N), 프롤린(P), 글루타민(Q), 아르기닌(R), 세린(S), 트레오닌(T), 발린(V), 트립토판(W), 및 타이로신(Y) 중 임의의 아미노산일 수 있다. 본 발명의 어레이를 형성하는 펩타이드 내의 임의의 아미노산은 비-전통적인 아미노산에 의해 대체될 수 있다. 일반적으로, 보존적 치환이 바람직하다. 몇몇 실시양태에서, 어레이 상의 펩타이드는 20개 미만의 아미노산으로부터 합성된다. 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 메티오닌, 시스테인, 이소루신 및 트레오닌은 상기 펩타이드의 합성 중에 배제된다.
검출기 장치
몇몇 실시양태에서, 본 출원에 개시된 시스템, 플랫폼 및 방법은 본 출원에 개시된 펩타이드 어레이 상에서 항체 결합을 포함하는 본 출원에 개시된 어레이 포맷 상에서 결합을 검출하기 위한 검출기 장치를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 광학적 검출 방법(ccd, pmt, 다른 광학 검출기, 광학 필터 및 다른 광학 검출기 장치)과 연계하여 사용되는 경우, 항체 결합의 검출은 실시간으로 또는 시간 간격에 따라 광학 검출을 통해 보고된다. 특정 예에서, 최종 결합 활성의 정량화는 AFU(임의 형광 단위)로 변환되거나 임피던스 측정 또는 기타 전기 화학적 센싱을 통해 전기적 신호로 변환되는 광학 감지를 통해 보고된다. 다른 예에서, 항체 결합은 가시적 범위 내에서 또는 그렇지 않으면 펩타이드 장치에 적용되는 프로브의 광학적으로 탐지 가능한 라벨로부터의 빛 또는 전자기 에너지의 방출 또는 흡수에 의해 검출된다. 광학적으로 검출 가능한 라벨은 형광, 화학발광, 전자화학발광, 발광, 인광, 형광 양극화 및 충전 라벨을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 몇몇 예에서, 형광 레이블링된 프로브는 특정 표적 또는 항체의 존재하에서만 활성을 띄며, 이로 인해 샘플로부터의 형광 반응은 표적 또는 항체의 존재를 알려준다.
몇몇 예에서, 광 전달 방식은 항체 결합의 광학적 여기 및/또는 방출 및/또는 검출을 제공하기 위해 이용된다. 특정 실시양태에서, 이는 유동 세포 물질(열적 폴리머 유사 아크릴(PMMA) 고리형 올레핀 폴리머(COP), 고리형 올레핀 코폴리머(COC) 등)을 광학적 파동 가이드로서 이용함으로써 외부 구성요소의 사용 필요성을 제거한다. 또한, 광원 즉 발광다이오드-LED, 수직강 표면 방출 레이저-VCSEL 및 다른 발광 조합은 카트리지 또는 검출 장치 내부에 직접 통합되거나 펩타이드 어레이 표면 상에 직접 내장되어 있어 내부적으로 제어되고 광원이 공급된다. 또한, PMT, CCD, 또는 CMOS 검출기는 검출기 장치 또는 카트리지 내부에 내장될 수 있다.
디지털 처리 장치
몇몇 실시양태에서, 본 출원에 개시된 시스템, 플랫폼, 소프트웨어, 네트워크 및 방법은 디지털 처리 장치를 포함하거나 이를 이용한다. 다른 실시양태에서, 상기 디지털 처리 장치는 하나 이상의 하드웨어 중앙 처리 장치(CPU), 즉 장비의 기능을 수행하는 프로세서를 포함한다. 여전히 추가의 실시양태에서, 상기 디지털 처리 장치는 실행 가능한 명령을 수행하도록 구성된 운영 체계를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 디지털 처리 장치는 선택적으로 컴퓨터 네트워크에 연결된다. 추가의 실시양태에서, 상기 디지털 처리 장치는 인터넷에 연결되어 월드와이드 웹에 접속되게 한다. 여전히 추가의 실시양태에서, 상기 디지털 처리 장치는 선택적으로 클라우드 컴퓨팅 인프라에 연결된다. 다른 실시양태에서, 상기 디지털 처리 장치는 선택적으로 인트라넷에 연결된다.
다른 실시양태에서, 상기 디지털 처리 장치는 선택적으로 데이터 저장 장치에 연결된다. 본 출원의 설명에 따르면, 적합한 디지털 처리 장치는 서버 컴퓨터, 데스크톱 컴퓨터, 랩탑 컴퓨터, 노트북 컴퓨터, 서브 노트북 컴퓨터, 넷북 컴퓨터, 넷패드 컴퓨터, 셋톱 컴퓨터, 핸드헬드 컴퓨터, 인터넷 어플라이언스, 모바일 스마트폰, 태블릿 컴퓨터, 개인 디지털 보조 장치, 비디오 게임 콘솔 및 비히클을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 당해 기술분야의 통상의 기술자는 많은 스마트폰이 본 출원에 기재된 시스템에서 사용하기에 적합하다는 것을 인식할 것이다. 또한, 당해 기술분야의 통상의 기술자는 임의의 컴퓨터 네트워크 접속이 가능한 텔레비전, 비디오 플레이어, 디지털 음악 플레이어가 본 출원에 기재된 시스템에서 사용하기에 적합하다는 것을 인식할 것이다. 적합한 태블릿 컴퓨터는 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 소책자, 슬레이트 및 컨버터블 구성을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 디지털 처리 장치는 실행 가능한 명령을 수행하도록 구성된 운영 체계를 포함한다. 예를 들어, 상기 운영 체계는 프로그램 및 데이터를 포함하는 소프트웨어로서, 장치의 하드웨어를 관리하고 애플리케이션 실행을 위한 서비스를 제공한다. 당해 기술분야의 통상의 기술자는 적합한 서버 운영 체계가 FreeBSD, OpenBSD, NetBSD®, Linux, Apple® Mac OS X Server®, Oracle® Solaris®, Windows Server®, 및 Novell® NetWare®를 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니라는 점을 인식할 것이다. 당해 기술분야의 통상의 기술자는 적합한 개인용 컴퓨터 운영 체계가 Microsoft® Windows®, Apple® Mac OS X®, UNIX®, 및 GNU/Linux®과 같은 UNIX 유사 운영 체계를 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니라는 점을 인식할 것이다. 몇몇 실시양태에서, 운영 시스템은 클라우드 컴퓨터에 의해 제공된다. 당해 기술분야의 통상의 기술자는 적합한 모바일 스마트폰 운영 체계가 Nokia® Symbian® OS, Apple® iOS®, Research In Motion® BlackBerry OS®, Google® Android®, Microsoft® Windows Phone® OS, Microsoft® Windows Mobile® OS, Linux®, 및 Palm® WebOS®를 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니라는 점을 인식할 것이다.
몇몇 실시양태에서, 디지털 처리 장치는 저장 및/또는 메모리 장치를 포함한다. 상기 저장 및/또는 메모리 장치는 데이터나 프로그램을 임시 또는 영구적 기준으로 저장하는데 사용되는 하나 이상의 물리적 부속물이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 장치는 휘발성 메모리이며, 저장된 정보를 유지하기 위해 전원을 필요로 한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 장치는 비휘발성 메모리이며, 디지털 처리 장치에 전원이 공급되지 않을 때에도 저장된 정보를 유지한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 비휘발성 메모리는 플래시 메모리를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 비휘발성 메모리는 동적 랜덤 액세스 메모리(DRAM)를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 비휘발성 메모리는 강유전성 랜덤 엑세스 메모리(FRAM)를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 비휘발성 메모리는 상변이 랜덤 엑세스 메모리(PRAM)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 장치는 CD-ROM, DVD, 플래시 메모리 장치, 자기 디스크 드라이브, 자기 테이프 드라이브, 광디스크 드라이브, 및 클라우드 컴퓨팅 기반 저장 장치를 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 또 다른 실시양태에서 상기 저장 및/또는 메모리 장치는 본 출원에 개시된 것과 같은 장치들의 조합이다.
몇몇 실시양태에서, 디지털 처리 장치는 사용자에게 시각 정보를 전달하는 디스플레이를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 디스플레이는 음극선관(CRT)이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 디스플레이는 액정디스플레이(LCD)이다. 추가의 실시양태에서, 상기 디스플레이는 박막 트랜지스터 액정 디스플레이(TFT-LCD)이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 디스플레이는 유기발광 다이오드(OLED) 디스플레이이다. 다양한 추가의 실시양태에서, OLED 디스플레이는 수동 매트릭스 OLED(PMOLED) 또는 능동 매트릭스 OLED(AMOLED) 디스플레이이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 디스플레이는 플라즈마 디스플레이이다. 여전히 추가의 실시양태에서, 상기 디스플레이는 비디오 프로젝터이다. 여전히 추가의 실시양태에서, 상기 디스플레이는 본 출원에 개시된 장치들의 조합이다.
몇몇 실시양태에서, 디지털 처리 장치는 사용자로부터 정보를 받을 수 있는 입력 장치를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 입력 장치는 키보드이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 입력 장치는 포인팅 장치이며, 이는 마우스, 트랙볼, 트랙 패드, 조이스틱, 게임 컨트롤러 또는 스타일러스를 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 몇몇 실시양태에서, 상기 입력 장치는 터치 스크린 또는 멀티 터치 스크린이다. 다른 실시양태에서, 상기 입력 장치는 음성이나 다른 소리 입력을 캡처하는 마이크이다. 다른 실시양태에서, 상기 입력 장치는 동작이나 시각적 입력을 캡처하는 비디오 카메라이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 입력 장치는 본 출원에 개시된 것과 같은 장치의 조합이다.
몇몇 실시양태에서, 디지털 처리 장치는 디지털 카메라를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 디지털 카메라는 디지털 이미지를 캡처한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 디지털 카메라는 자동초점 카메라이다. 몇몇 실시양태에서, 디지털 카메라는 전하 결합 소자(CCD) 카메라이다. 다른 실시양태에서, 디지털 카메라는 CCD 비디오 카메라이다. 다른 실시양태에서, 디지털 카메라는 상보적 금속 산화물 반도체(CMOS) 카메라이다. 몇몇 실시양태에서, 디지털 카메라는 정지 이미지를 캡처한다. 다른 실시양태에서, 디지털 카메라는 비디오 이미지를 캡처한다. 다양한 실시양태에서, 적합한 디지털 카메라는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 및 이의 증분을 포함하는 더 높은 메가픽셀 카메라를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 디지털 카메라는 표준 화질 카메라이다. 다른 실시양태에서 디지털 카메라는 HD 비디오 카메라이다. 추가의 실시양태에서, HD 비디오 카메라는 적어도 약 1280 x 약 720 픽셀 또는 적어도 약 1920 x 약 1080 픽셀의 이미지를 캡처한다. 몇몇 실시양태에서, 디지털 카메라는 컬러 디지털 이미지를 캡처한다. 다른 실시양태에서, 디지털 카메라는 그레이스케일 디지털 이미지를 캡처한다. 다양한 실시양태에서, 디지털 이미지는 임의의 적합한 디지털 이미지 포맷으로 저장된다. 적합한 디지털 이미지 포맷은 JPEG(Joint Photographic Experts Group), JPEG 2000, Exif(Exchangeable image file format), TIFF(Tagged Image File Format), RAW, PNG(Portable Network Graphics), GIF(Graphics Interchange Format), Windows® BMP(bitmap), PPM(portable pixmap), PGM(portable graymap), PBM(portable bitmap file format) 및 WebP를 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 다양한 실시양태에서, 디지털 이미지는 모든 적합한 디지털 비디오 포맷으로 저장된다. 적합한 디지털 비디오 포맷은 AVI, MPEG, Apple® QuickTime®, MP4, AVCHD®, Windows Media®, DivXTM, Flash Video, Ogg Theora, WebM 및 RealMedia를 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
비-일시적인 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체
몇몇 실시양태에서, 본 출원에 개시된 시스템, 플랫폼, 소프트웨어, 네트워크, 및 방법은, 선택적으로 네트워크에 연결된 디지털 처리 장치의 운영 체계에 의해 실행 가능한 명령을 포함하는 프로그램으로 인코딩된 하나 이상의 비-일시적인 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체는 디지털 처리 장치의 유형의 구성요소이다. 여전히 추가의 실시양태에서, 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체는 디지털 처리 장치로부터 임의로 제거할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체는 CD-ROM, DVD, 플래시 메모리 장치, 반도체 기억 장치(solid state memory), 자기식 디스크 드라이브, 광디스크 드라이브, 클라우드 컴퓨팅 시스템 및 서비스 등을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 몇몇 경우에서, 프로그램 및 명령은 매체 상에 영구적으로, 실질적으로 영구적으로, 반영구적으로, 또는 비-일시적으로 암호화되어 있다.
컴퓨터 프로그램
몇몇 실시양태에서, 본 출원에 개시된 시스템, 플랫폼, 소프트웨어, 네트워크, 및 방법은 적어도 하나의 컴퓨터 프로그램을 포함한다. 컴퓨터 프로그램은 지정된 작업을 수행하기 위해 작성된 디지털 처리 장치의 CPU에 있는 명령어 시퀀스를 포함한다. 본 출원에 제공된 개시내용을 고려하여, 당해 기술분야의 통상의 기술자는 컴퓨터 프로그램이 다양한 언어의 다양한 버전으로 쓰여질 수 있다는 것을 인식할 것이다. 몇몇 실시양태에서, 컴퓨터 프로그램은 한 개의 명령 시퀀스를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 컴퓨터 프로그램은 복수의 명령 시퀀스를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 컴퓨터 프로그램은 한 장소에서 제공된다. 다른 실시양태에서 컴퓨터 프로그램은 복수의 위치로부터 제공된다. 다양한 실시양태에서, 컴퓨터 프로그램은 하나 이상의 소프트웨어 모듈을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 컴퓨터 프로그램은 부분적으로 또는 전체적으로 하나 이상의 웹 애플리케이션, 하나 이상의 모바일 애플리케이션, 하나 이상의 독립형 애플리케이션, 하나 이상의 웹브라우저 플러그인, 확장, 애드인 또는 애드온, 또는 이의 조합을 포함한다.
웹 애플리케이션
몇몇 실시양태에서, 컴퓨터 프로그램은 웹 애플리케이션을 포함한다. 본 출원에 제공된 개시내용의 관점에서, 당해 기술분야의 통상의 기술자는 다양한 실시양태에 있는 웹 애플리케이션이 하나 이상의 소프트웨어 프레임워크 및 하나 이상의 데이터베이스 시스템을 이용한다는 것을 인식할 것이다. 몇몇 실시양태에서, 웹 애플리케이션은 Microsoft® .NET 또는 RoR(Ruby on Rails)과 같은 소프트웨어 프레임워크 상에서 생성된다.
몇몇 실시양태에서, 웹 애플리케이션은 관계형, 비관계형, 객체 지향, 연관성 및 XML 데이터베이스 시스템을 포함하나 이들로 제한되는 것은 아닌 하나 이상의 데이터베이스 시스템을 이용한다. 추가의 실시양태에서, 적합한 관계형 데이터베이스 시스템은 Microsoft® SQL 서버, mySQLTM 및 Oracle®을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 또한, 당해 기술분야의 통상의 기술자는 다양한 실시양태에서 웹 애플리케이션이 하나 이상의 언어로 이루어진 하나 이상의 버전으로 작성되었다는 것을 인식할 것이다. 웹 애플리케이션은 하나 이상의 마크업 언어, 프레젠테이션 정의 언어, 클라이언트측 스크립팅 언어, 서버측 코딩 언어, 데이터베이스 쿼리 언어 또는 이들의 조합으로 작성될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 웹 애플리케이션은 어느 정도 HTML(Hypertext Markup Language), XHTML(Extensible Hypertext Markup Language), 또는 XML(eXtensible Markup Language)과 같은 마크업 언어로 기록된다. 몇몇 실시양태에서, 웹 애플리케이션은 어느 정도 CSS(Cascading Style Sheets)와 같은 프리젠테이션 정의 언어로 기록된다. 몇몇 실시양태에서, 웹 애플리케이션은 어느 정도 AJAX(Asynchronous Javascript 및 XML), Flash® Actionscript, Javascript, 또는 Silverlight®과 같은 클라이언트측 스크립팅 언어로 기록된다. 몇몇 실시양태에서, 웹 애플리케이션은 어느 정도 ASP(Active Server Pages), ColdFusion®, Perl, JavaTM, JSP(JavaServer Pages), PHP(Hypertext Preprocessor), PythonTM, Ruby, Tcl, Smalltalk, WebDNA®, 또는 Groovy와 같은 서버측 코딩 언어로 기록된다. 몇몇 실시양태에서, 웹 애플리케이션은 어느 정도 SQL(Structured Query Language)과 같은 데이터베이스 쿼리 언어로 기록된다. 몇몇 실시양태에서, 웹 애플리케이션은 IBM® Lotus Domino®와 같은 엔터프라이즈 서버 제품을 통합한다. 몇몇 실시양태에서, 정보 및 미디어 파일을 업로드하는 것이 가능한 기술자용 경력 개발 네트워크를 제공하기 위한 웹 애플리케이션은 미디어 플레이어 요소를 포함한다. 다양한 추가의 실시양태에서, 미디어 플레이어 요소는 Adobe® Flash®, HTML 5, Apple® QuickTime® , Microsoft® Silverlight®, JavaTM 및 Unity®를 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아닌 하나 이상의 적합한 멀티미디어 기술을 이용한다.
모바일 애플리케이션
몇몇 실시양태에서, 컴퓨터 프로그램은 모바일 디지털 처리 장치에 제공되는 모바일 애플리케이션을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 모바일 애플리케이션은 그것이 제조되는 시점에서 모바일 디지털 처리 장치에 제공된다. 다른 실시양태에서, 모바일 애플리케이션은 본 출원에 개시된 컴퓨터 네트워크를 통해 모바일 디지털 처리 장치에 제공된다.
본 출원에 제공된 개시내용의 관점에서, 모바일 애플리케이션은 당해 기술분야에 공지된 하드웨어, 언어 및 개발 환경을 사용하여, 당해 기술분야의 기술에 의해 생성될 수 있다. 당해 기술분야의 통상의 기술자는 모바일 애플리케이션이 다양한 언어로 기재된다는 것을 인식할 것이다. 적합한 프로그램 언어는 C, C++, C#, Objective-C, JavaTM, Javascript, Pascal, Object Pascal, PythonTM, Ruby, VBNET, WML 및 CSS가 있거나 없는 XHTML/HTML 또는 이의 조합을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
적합한 모바일 애플리케이션 개발 환경은 여러 소스로부터 이용할 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 개발 환경은 AirplaySDK, alcheMo, Appcelerator®, Celsius, Bedrock, Flash Lite, .NET Compact Framework, Rhomobile 및 WorkLight 모바일 플랫폼을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 비용이 들지 않는 다른 이용 가능한 개발 환경은 Lazarus, MobiFlex, MoSync 및 Phonegap을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 또한, 모바일 장치 제조사에서 배포하는 소프트웨어 개발 키트는 iPhone 및 iPad(iOS)SDK, AndroidTM SDK, BlackBerry® SDK, BREW SDK, Palm® OS SDK, Symbian SDK, webOS SDK, 및 Windows® Mobile SDK를 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
당해 기술분야의 통상의 기술자는 몇가지 상업적 포럼이 Apple® 앱 스토어, AndroidTM 마켓, BlackBerry® 앱 월드, 팝 디바이스 용 앱 스토어, webOS 용 앱 카탈로그, 모바일용 Windows® 마켓플레이스, Nokia® 디바이스용 Ovi 스토어, Samsung® 앱스 및 Nintendo® DSi 숍을 포함하나 이들로 제한되는 것은 아닌 모바일 애플리케이션 배포를 위해 가용하다는 것을 인식할 것이다.
독립형 애플리케이션
몇몇 실시양태에서, 컴퓨터 프로그램은 독립형 애플리케이션을 포함하는데, 이는 예를 들어 플러그인이 아닌 기존 프로세스에 대한 추가 기능이 아니라 독립적인 컴퓨터 프로세스로서 실행되는 프로그램이다. 당해 기술분야의 통상의 기술자는 독립형 애플리케이션이 종종 컴파일된다는 것을 인식할 것이다. 컴파일러는 프로그래밍 언어로 작성된 소스 코드를 어셈블리 언어 또는 기계 코드와 같은 이진 대상체 코드로 변환하는 컴퓨터 프로그램이다. 적합한 컴파일 프로그램은 C, C++, Objective-C, COBOL, Delphi, Eiffel, JavaTM, Lisp, PythonTM, Visual Basic, 및 VB.NET, 또는 이의 조합을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 컴파일은 실행 가능한 프로그램을 생성하기 위해, 종종 적어도 부분적으로 수행된다. 몇몇 실시양태에서, 컴퓨터 프로그램은 하나 이상의 실행 가능한 컴파일 애플리케이션을 포함한다.
소프트웨어 모듈
다양한 실시양태에서, 본 출원에 개시된 시스템, 플랫폼, 소프트웨어, 네트워크, 및 방법은 소프트웨어, 서버 및 데이터베이스 모듈을 포함한다. 본 출원에 제공되는 명세서를 고려하여, 소프트웨어 모듈은 당해 기술분야에 공지된 기계, 소프트웨어, 및 언어를 사용하여, 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 기술에 의해 만들어진다. 본 출원에 개시된 소프트웨어 모듈은 다양한 방식으로 구현된다. 다양한 실시양태에서, 소프트웨어 모듈은 파일, 코드 섹션, 프로그래밍 객체, 프로그래밍 구조 또는 이의 조합을 포함한다. 추가의 다양한 실시양태에서, 소프트웨어 모듈은 복수의 파일, 복수의 코드 섹션, 복수의 프로그래밍 객체, 복수의 프로그래밍 구조 또는 이의 조합을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 하나 이상의 소프트웨어 모듈은 웹 애플리케이션, 모바일 애플리케이션 및 독립형 애플리케이션을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 몇몇 실시양태에서, 소프트웨어 모듈은 하나의 컴퓨터 프로그램 또는 애플리케이션 내에 존재한다. 다른 실시양태에서, 소프트웨어 모듈은 하나 초과의 컴퓨터 프로그램 또는 애플리케이션 내에 존재한다. 몇몇 실시양태에서, 소프트웨어 모듈은 하나 초과의 기계에서 호스트된다. 다른 실시양태에서, 소프트웨어 모듈은 하나 이상의 기계에서 호스트된다. 다른 실시양태에서, 소프트웨어 모듈은 클라우드 컴퓨팅 플랫폼에 호스트된다. 몇몇 실시양태에서, 소프트웨어 모듈은 한 위치에 있는 하나 이상의 시스템에 호스트된다. 다른 실시양태에서 소프트웨어 모듈은 하나 초과의 위치 내의 하나 이상의 시스템에 호스트된다.
본 발명은 하기 실시예에 보다 상세히 기재되어 있으며, 어떤 방식으로든 하기 실시예가 청구되는 발명의 범위를 제한하려는 의도는 전혀 없다. 첨부된 도면은 본 발명의 사양과 상세한 설명에 있어 필수적인 부분으로서 간주되어야 한다. 하기 실시예는 단지 예시로서 제공되는 것이며, 청구된 발명을 제한하지 않는다.
실시예
실시예 1 - 면역서명 방법
면역서명 어세이(immunosignature assay)는 자가면역 질환(AI): 전신 홍반성 루푸스(SLE) 및 류머티스성 관절염(RA)과, 골관절염(OA), 쇼그렌 증후군(SS), 섬유근육통(FM)을 포함하는 다른 자가면역 및 모방 질환을 감별화하기 위해 사용되었다.
공여자 샘플. 공여자 혈장 샘플은 알버트 아인슈타인 컬리지 오브 메디신(Bronx, NY)으로부터 얻었다. 철저하게 주석을 단 400개의 혈청 샘플 집단(cohort)은 본 연구를 위해 장래에 수집되었고, SLE(n=75), RA(n=95), 쇼그렌 증후군(SS)(n=20), 골관절염(OA)(n=24), 섬유근육통(n=22), 다른 질환(OD)(n=76), "모든 질환"(AD)(n=237); "다른 류머티스성 질환"(ORD)(n=144), 및 건강한 대조군(HC)(n=59)을 포함하였다.
다른 자가면역 질환 및 비-자가면역 모방 질환(OD 또는 다른 AI)(n=76): ANCA 혈관염(2), CIA(4), CNS 혈관염, 피부근염(6), 원반형 루푸스, DMPM(3), DMPM/MCTD, GCA(2), 통풍(9), 루푸스(4), MCTD(9), 근염(5), 중첩(overlap), 다관절 통풍, 다발연골염, 다발성근염, 가성통풍, 건선성 관절염(11), 피부경화증(7), 세로스폰(serospon)(2), 및 혈관염(4). SLE의 경우, 다른 AI+비-AI 모방 질환은 섬유근육통/RA, 루푸스/RA, OA/RA/세로스폰, RA/세로스폰, RA, 및 RAVASC를 추가로 포함한다. RA의 경우, 다른 AI+비-AI 모방 질환은 섬유근육통/SLE, MCTD/SLE, SLE/MCTD, SLE/피부경화증, 및 SLE/SS를 추가로 포함한다.
"다른 류머티스성 질환"(ORD)(n=144): SLE, SS, OA, 건선성 관절염(11), 통풍(9), 혈청 반응 음성 척수관절염(2), 가성통풍(1). 류머티스학적 질환을 갖는 대상체는 ACR 기준에 기초하여 진단되었다.
SLE에 대한 "Not" 그룹은 다른 AI+비-AI 모방 질환+ HC, 즉 SLE+HC 이외의 AI 질환의 샘플이다.
RA에 대한 "Not" 그룹은 다른 AI+비-AI 모방 질환+HC, 즉 RA+HC 이외의 AI 질환의 샘플이다.
각각 도 14 및 도 27에 나타낸 "혼합된 SLE 및 다른 AI" 및 "혼합된 RA 및 다른 AI" 그룹은 혼합된 진단을 보유하는 대상체 유래의 샘플 및 다른 AI 및/또는 모방 질환: CIA/OA, 통풍/OA, OA/RA, OA/RA, OA/RA/세로스폰/DMPM/FM/SLE/피부경화증/DMPM/SLE, 루푸스/RA/MCTD/SLE, FM/루푸스, FM/OA, FM/RA, FM/SLE, RA/세로스폰, RA/SLE, RA/SS, RA/혈관염, SLE/MCTD, SLE/RA, SLE/피부경화증, SLE/SS, ANCA 혈관염, CIA, CNS 혈관염, 피부근염, 원반성 루푸스, DMPM, DMPM/MCTD, GCA, 통풍, 루푸스, MCTD, 근염, 중첩, 다관절 통풍, 다발연골염, 다발성근염, 가성통풍, 건선성 관절염, 피부경화증, 세로스폰, 및 혈관염을 보유하는 대상체 유래의 샘플의 조합을 나타낸다.
샘플은 동결방지제로서 에틸렌 글리콜과 1:1로 혼합되었고, 단일 사용 부피로 나누어 표본으로 준비되었다. 단일 사용 표본은 필요할 때까지 -20℃에서 저장되었다. 각각의 경우에, 잔류 샘플 부피는 -80℃에서 순수 저장되었다. 모든 샘플의 아이덴티티는 2D 바코드 튜브(Micronic, Leystad, the Netherlands)를 이용하여 추적되었다. 어세이를 위한 준비에서, 샘플 표본은 얼음 상에서 4℃로 가온되었고, 1차 인큐베이션 완충액(0.05% 트윈 20이 첨가된 포스페이트 완충 염수(PBST) 및 1% 만니톨)에서 1:100으로 희석되었다. 이어서, 1:100 희석액을 함유하는 미량역가 플레이트는 어세이에서 사용하기 위해 1:625으로 희석되었다.
어레이. 9개 잔기의 중간 길이 및 5개 내지 13개 아미노산 범위를 가진 126,009개 펩타이드의 조합 라이브러리는 16개 아미노산의 모든 가능한 4-mer의 99.9% 및 모든 가능한 5-mer의 48.3%를 포함하도록 디자인되었다(메티오닌, M; 시스테인, C; 이소루신, I; 및 트레오닌, T는 배제되었다). 이들은 tert-부틸옥시카르보닐(BOC) 보호기 펩타이드 화학(Legutki JB et al., Nature Communications. 2014; 5: 4785)을 위해 채택된 표준 반도체 포토리소그래피를 이용하여 200 mm 실리콘 옥사이드 웨이퍼 상에서 합성되었다. 개략적으로, 아미노실란 작용화된 웨이퍼는 BOC-글리신으로 코팅되었다. 다음, UV 광에 의해 활성화되는 광산 발생제를 함유하는 포토레지스트는 스핀 코팅에 의해 웨이퍼에 도포되었다. 포토마스크를 통한 UV 광(365 nm)에 대한 웨이퍼의 노광은 웨이퍼 상의 피쳐가 주어진 마스크를 이용하여 노광될 고정된 선택을 가능하게 한다. UV 광에 대한 노광 후, 웨이퍼는 가열되어 노광된 피쳐의 BOC-탈보호를 가능하게 하였다. 후속적인 세척, 이어서 활성화된 아미노산의 적용에 의해 사이클은 완료된다. 각각의 사이클에 의해 특이적인 아미노산은 어레이 상의 특정 위치에 위치된 펩타이드의 N-말단에 첨가되었다. 이들 사이클은 마크스 및 커플링된 아미노산을 변경하면서 반복되어 조합 펩타이드 라이브러리를 달성하였다. 표준 현미경 슬라이드 치수를 가진 13개의 직사각형 영역은 각각의 웨이퍼로부터 절단되었다. 각각의 완성된 웨이퍼는 표준 현미경 슬라이드 크기(25mm X 75mm)를 가진 13개의 직사각형 영역으로 절단되었다. 이들 슬라이드 각각은 8열(row) x 3행(column)으로 24 어레이를 함유하였다. 최종적으로, 몇몇 아미노산의 측쇄 상의 보호기는 표준 칵테일을 이용하여 제거되었다. 완성된 슬라이드는 필요할 때까지 무수 질소 환경에서 저장되었다. 다수의 품질 테스트가 수행되어 어레이가 각각의 단계에 대한 3σ 통계학적 한계의 이용을 포함하는 공정 사양 내에서 제조되는 것을 담보한다. 웨이퍼 배치는 MALDI-MS에 의해 간헐적으로 샘플링되어 각각의 아미노산이 정확한 단계에서 커플링되었는지 확인하고, 조합 합성을 구성하는 개별적인 단계들이 올바른 것인지를 담보한다. 웨이퍼 제조는 처음부터 끝까지 비주얼 베이직으로 작성되고, 액세스 프론트 엔드 및 SQL 백 엔드를 보유하는 전자 커스텀 관계형 데이터베이스에 의해 추적된다. 프론트 엔드 사용자 인터페이스는 오퍼레이터로 하여금 생산 정보를 용이하게 데이터베이스로 입력할 수 있도록 한다. SQL 백엔드는 우리에게 데이터베이스 백업 및 필요에 따라 데이터 공유를 위한 다른 컴퓨터 시스템과의 통합을 위한 단순한 방법을 제공한다. 전형적으로 추적된 데이터는 화학물질, 레시피, 시간 및 기술자 수행 임무를 포함한다. 웨이퍼가 제조된 후, 데이터는 검토되고, 기록은 잠기고 저장된다. 최종적으로, 각각의 로트는 후술하는 바와 같이 성능을 확인하기 위해 결합 어세이에서 평가된다.
어세이. 생산 품질 제조된 마이크로어레이가 얻어졌고, 증류수 내에서 1 h 동안, PBS 내에서 30분 동안 및 1차 인큐베이션 완충액(PBST, 1% 만니톨) 내에서 1 h 동안 부드럽게 교반하면서 침지함으로써 사용 전에 재수화되었다. 슬라이드는 미량역가 플레이트 풋프린트에 개별적인 마이크로어레이를 조정하기 위해 ArrayIt 마이크로어레이 카세트(ArrayIt, Sunnyvale, CA) 내에 로딩되었다. 액체 핸들러를 이용하여 각각의 샘플 90 μl는 1차 인큐베이션 완충액(PBST, 1% 만니톨) 내에서 1:625 희석율로 제조되었고, 이어서 상기 카세트로 이전되었다. 이 혼합물은 TeleShake95(INHECO, Martinsried, Germany) 상에서 혼합하면서 어레이 상의 37℃에서 1 h 동안 인큐베이션되어 항체-펩타이드 결합을 촉진하였다. 인큐베이션 후, 상기 카세트는 BioTek 405TS(BioTek, Winooski, VT)를 이용하여 PBST 중에서 3회 세척되었다. 결합된 항체는 37℃에서 TeleShake95 플랫폼 혼합기 상에서 혼합하면서 1 h 동안 2차 인큐베이션 완충액(PBST 내의 0.5% 카제인) 내의 AlexaFluor 555(Thermo-Invitrogen, Carlsbad, CA)에 컨쥬게이트된 4.0 nM 염소 항-인간 IgG(H+L) 또는 DyLight 550(Novus Biologicals, Littleton, CO)에 컨쥬게이트된 4.0 nM 염소 항-인간 IgA를 이용하여 검출되었다. 2차 항체와 함께 인큐베이션 후, 슬라이드는 다시 PBST로 세척되었고, 이어서 증류수로 세척되었으며, 상기 카세트로부터 제거되었고, 이소프로판올로 분무되고, 원심분리되어 건조되었다. 정량 신호 측정값은 후술하는 바와 같이 각각의 주소 지정 가능한 펩타이드 피쳐에 대한 상대적인 형광 값을 결정함으로써 얻었다.
데이터 획득. 어세이된 마이크로어레이는 532nm 레이저 및 572nm BP 34 필터(Innopsys, Carbonne, France)가 장착된 Innopsys 910AL 마이크로어레이 스캐너를 이용하여 이미지화되었다. Mapix 소프트웨어 애플리케이션(버젼 7.2.1)은 자동화된 그리딩 알고리즘을 이용하여 각각의 펩타이드 피쳐와 관련된 이미지의 영역을 확인하였다. 각각의 펩타이드 피쳐에 대한 중간 픽셀 세기는 탭-한계가 정해진 텍스트 파일로 저장되었고, 분석을 위해 데이터베이스 내에 저장되었다.
데이터 분석. 피쳐 세기는 등분산성을 개선하기 위해 100의 상수 값을 더한 후 log10 변환되었다. 각각의 어레이 상의 세기는 모든 샘플에 걸쳐 그 어레이에 대한 조합 라이브러리 피쳐의 중간 세기를 빼고, 총 중위수를 다시 더함으로써 정규화되었다.
각각의 피쳐에 대한 혈장 항체의 결합은 형광 신호를 정량함으로써 측정되었다. 그룹 사이에서 감별적 신호를 나타낸 펩타이드 피쳐는 이분산(unequal variance)에 대한 웰치 조정을 이용하는 평균 펩타이드 세기의 t-테스트에 의해 결정되었다. 제1 상태를 보유하는 대상체 유래의 샘플 내 항체의 결합은 상이한 제2 상태를 보유하는 대상체 유래의 기준 샘플 내 항체의 결합과 비교되었고, 유의적으로 감별적인 신호를 나타내는 펩타이드가 확인되었다. 제1 상태와 다른 상태를 식별한 펩타이드의 세트는 제1 상태를 보유하는 환자들 사이의 평균 세기와 제2, 제3, 제4 등의 상태를 보유하는 환자들 사이의 평균 세기를 비교함으로써 확인되었다. 유의적인 식별을 나타낸 펩타이드, 즉 식별 펩타이드는 다중도에 대한 본페로니 보정(즉, p <4e-7)을 적용한 후 허위 양성에 대한 5% 역치에 기초하여 확인되었다.
분류기(classifier)를 구성하기 위해, 식별 펩타이드의 피쳐는 제1 상태와 제2 상태를 비교하거나, 또는 다중 질병 모델에서 상이한 상태 사이를 비교하는 웰치의 t-테스트와 관련된 p 값에 기초하여 제1 상태와 제2 상태를 감별화할 수 있는 그들의 능력에 대해 순위가 매겨졌다. 분석을 위해 선택된 펩타이드의 수는 10개 미만에서 100개 또는 1000개 초과로 가변적일 수 있고, 선택된 펩타이드 피쳐 각각은 분류기를 훈련시키기 위한 선형 커널(linear kernel) 및 0.01의 코스트 파라미터를 이용하여 서포트 벡터 머신(Cortes C., 및 Vapnik V. Machine Learning. 1995; 20(3):273-97)에 입력되었다. 5-폴드 교차 검증은 100회 반복되었고, 수신자 조작 특성 곡선하 면적(AUC)으로서 산정된 모델 성능을 정량하기 위해 사용되었다(도 3).
최종적으로, 고정된 SVM 분류기는 그들의 t-테스트 p-값에 의해 선택된, 교차 검증 하의 성능에 기초한 최적 피쳐의 수를 이용하여 집단 내에 정합되었다. SVM 분류기는 상기 플랫폼의 재현성 평가에 사용되었다.
모든 분석은 R 버젼 3.2.5.(팀 RC. R: 통계학적 연산을 위한 A 언어 및 환경. 통계학적 연산을 위한 R 재단 Vienna 2016. https://www.R-project.org/.에서 이용할 수 있음)을 이용하여 수행되었다.
펩타이드 정렬 스코어링. 라이브러리 펩타이드는 각각의 독특한 유전자 ID에 대한 최장 전사체 변이체를 이용하여 2016년 3월 10일에 컴파일된 인간 게놈 빌드 GrCh38(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/)에 상응하는 인간 프로테옴 RefSeq release 84에 정렬되었다. 펩타이드들은 프로테옴 서열의 중첩하는 20 mer 부분에 정렬되었다; 중첩은 10 mer였다.
정렬 알고리즘은 3개의 아미노산의 시드, 4개의 아미노산의 갭 패널티, 및 상기 어레이[States DJ et al.,(1991) Methods 3: 66-70]의 아미노산 조성을 반영하기 위해 변형된 BLOSUM62[Henikoff and, Henikoff JG(1992) Proc Natl Acad Sci U S A 89: 10915-10919]의 스코어링 매트릭스를 필요로 하는 변형된 BLAST 전략[Altschul SF 및 Gish W(1996) Methods Enzymol 266: 460-480]을 사용하였다. 이들 변형은 유사한 치환의 스코어를 증가시키고, 상기 어레이에 부재하는 아미노산에 대한 패널티를 제거하며, 및 모든 정확한 매치를 균등하게 스코어링한다.
식별 라이브러리 펩타이드의 세트를 위한 정렬 스코어를 생성하기 위해, 양성 BLAST 스코어를 산출한 펩타이드는 정렬된 펩타이드에 상응하는 매트릭스의 각각의 열 및 단백질의 서열 내의 아미노산 중 하나에 상응하는 각각의 컬럼을 이용하여 매트릭스 내로 어셈블리되었다. 갭 및 결실은 단백질에 대한 정렬을 위한 펩타이드 열 내에서 허용되었다. 이러한 방식에서, 매트릭스 내의 각각의 위치는 펩타이드 및 단백질의 정렬된 아미노산과 관련된 스코어를 수용하였다. 이어서, 단백질 내의 아미노산에 상응하는 각각의 컬럼은 중첩 스코어를 생성하기 위해 총합되었고; 이는 분류 펩타이드에 의한 그 아미노산 위치의 범위(coverage)를 나타낸다. 라이브러리 조성을 위해 이러한 스코어를 보정하기 위해, 다른 중첩 스코어는 모든 어레이 펩타이드의 리트스에 대해 동일한 방법을 이용하여 계산되었다. 이는 하기 식에 따라 각각의 아미노산 위치에서 펩타이드 중첩 차이 스코어, s의 계산을 가능하게 한다:
s=a-(b/d)*c
상기 식에서, a는 식별 펩타이드 유래의 중첩 스코어이고, b는 식별 펩타이드의 수이며, c는 펩타이드의 전체 라이브러리에 대한 중첩 스코어이며, 및 d는 라이브러리 내 펩타이드의 수이다.
(아미노산 수준에서 존재한) 이들 s 스코어를 전체 단백질 통계로 전환하기 위해, 단백질 내의 모든 가능한 타일링 20-mer 에피토프에 대한 스코어의 합이 계산되었다. 단백질 에피토프 스코어로도 공지된 최종 단백질 스코어, S는 각각의 단백질에 대한 20개의 이러한 회전하는 중첩 윈도우를 따르는 최대값이다. 스코어의 유사한 세트는 식별 펩타이드의 수에 대해 동일한 횟수로 상기 라이브러리로부터 펩타이드를 무작위로 선택하는 100회의 반복 라운드에 대해 계산되었다. 각각의 스코어 S에 대한 p-값은 횟수에 기초하여 계산되고, 이 스코어는 반복 횟수를 조절하는 무작위로 선택된 펩타이드의 정렬에 기초하여 확인된 단백질들 사이에서 충족되거나, 또는 초과된다.
SLE를 보유하는 대상체 유래의 샘플과 건강한 대상체(HC), 다른 AI+비-AI 모방 질환, 및 Not SLE 유래의 샘플을 구별하기 위해 결정된 식별 펩타이드의 정렬로부터 확인된 상위 25개의 후보 바이오마커는 도 17a, 도 17b, 및 도 17c에 각각 나타내고, RA를 갖는 대상체 유래의 샘플과 건강한 대상체(HC), 다른 AI+비-AI 모방 질환, 및 Not RA 유래의 샘플을 구별하기 위해 결정된 식별 펩타이드의 정렬로부터 확인된 상위 25개의 후보 바이오마커는 도 29a, 도 29b, 및 도 29c에 각각 나타낸다. 상기 후보 바이오마커는 정렬 스코어에 따라 열거된다.
실시예 2 - SLE의 감별 진단
면역서명은 SLE만 및 혼합된 진단을 보유하는 환자에서 SLE를 보유하는 대상체의 그룹 내의 대상체와, 건강한 대조군(HC), "모든 질환"(AD), RA를 갖는 대상체, OA를 보유하는 대상체, 섬유근육통(FM)을 보유하는 대상체, 및 쇼그렌 증후군을 보유하는 대상체를 포함하는 대상체의 상이한 그룹을 감별화하기 위해 얻었다. "모든 질환"은 비-SLE AI 질환 및 비-AI 모방 질환을 포함한다.
면역서명 어세이는 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행되었고, 각각의 피쳐에서 신호 세기 측정치를 획득하기 위해 스캔되었다. 그룹들 사이에서 감별적 신호를 나타낸 펩타이드 피쳐는 이분산(unequal variance)에 대한 웰치 조정을 이용하는 평균 펩타이드 세기의 t-테스트에 의해 결정되었다. 이진 분류기는 각각의 대조에 대해 전개(develop)되었다.
표 1은 AUC 값으로서 각각의 대조에 대한 어세이 성능의 결과를 나타낸다.
Figure pct00001
각각의 그룹으로부터 SLE를 식별한 유의적인 펩타이드는 몇몇 아미노산 및 펩타이드 모티프에서 농후화되는 것으로 확인되었다. 도 4-10은 각각의 대조에서 식별하는 유의적인 펩타이드의 일부분에서 농후화된 모티프(도 4a-10a) 및 아미노산(도 4b-10b)을 나타낸다. 대조에서 확인된 유의적인, 즉 식별 펩타이드의 총 수는 각각의 도면에 나타낸다. 도 4a, 도 4b, 도 5a, 도 5b, 도 6a, 도 6b, 도 7a, 도 7b, 도 8a, 도 8b, 도 9a, 도 9b, 도 10a, 및 도 10b의 각각의 표에서:
"n" = 상위 식별 펩타이드에서 발생하는 모티프의 횟수;
n. lib = 어레이 라이브러리에서 발생하는 모티프의 횟수;
"농후화(enrich)" = 어레이 라이브러리에서 발생하는 모티프의 횟수에 대한 상위 식별 펩타이드에서 모티프의 폴드 농후화(fold enrichment);
P = 상위 식별 펩타이드에서 모티프의 발생의 통계학적 유의성
폴드 농후화 = (목록에서 발생하는 모티프의 횟수(예를 들어, ABCD)/라이브러리에서 발생하는 모티프(ABCD)의 회수)/(목록에서 발생하는 모티프 유형(예를 들어, 사량체)의 총수/라이브러리에서 발생하는 모티프 유형(예를 들어, 사량체)의 총수). 농후화 백분율은 "농후화" X 100이다.
도 4a 및 도 4b는 SLE 샘플과 건강한 공여자(HC) 샘플 사이를 식별하는 펩타이드에서 농후화되는 펩타이드 모티프(도 4a) 및 아미노산(도 4b)을 나타낸다. SLE 대상체 유래의 샘플로부터 얻은 신호 결합 데이터와 HC 그룹 유래의 결합 데이터의 비교는, SLE 샘플과 HC 그룹을 식별한 펩타이드가 전체 펩타이드 라이브러리에서 동일한 모티프의 발생률에 비해 도 4a에 열거된 하나 이상의 모티프에서 4.2배(420%) 초과로 농후화되었음을 확인시켜 주었다. 아울러, SLE 샘플과 HC 샘플을 식별한 펩타이드는 개별적인 아미노산에서 1배(100%) 초과로 농후화되는 것으로 확인되었다(도 4b).
도 5a 및 도 5b는 SLE 샘플과 다른 AI+비-AI 모방 질환 사이를 식별하는 펩타이드에서 농후화되는 펩타이드 모티프(도 5a) 및 아미노산(도 5b)을 나타낸다. 질환 그룹은 전체 펩타이드 라이브러리에서 동일한 모티프의 발생율에 비해 도 5a에 열거된 하나 이상의 모티프에서 4.9배(490%) 초과로 농후화되었다. 아울러, SLE 샘플과 HC 샘플을 식별한 펩타이드는 개별적인 아미노산에서 1.1배(110%) 초과로 농후화되는 것으로 확인되었다(도 5b).
도 6a 및 도 6b는 SLE 샘플과 샘플의 "Not SLE" 그룹 사이를 식별하는 펩타이드에서 농후화되는 펩타이드 모티프(도 6a) 및 아미노산(도 6b)을 나타낸다. SLE 대상체 유래의 샘플로부터 얻은 신호 결합 데이터와 "Not SLE" 그룹 유래의 결합 데이터의 비교는, SLE 샘플과 "Not SLE" 그룹을 식별한 펩타이드가 전체 펩타이드 라이브러리에서 동일한 모티프의 발생률에 비해 도 6a에 열거된 하나 이상의 모티프에서 5배(500% 농후화) 초과로 농후화되었음을 확인시켜 주었다. 아울러, SLE 샘플과 "Not SLE" 샘플을 식별한 펩타이드는 개별적인 아미노산에서 1.00배(100% 농후화) 초과로 농후화되는 것으로 확인되었다(도 6b).
도 7a 및 도 7b는 SLE 샘플과 샘플의 RA 그룹 사이를 식별하는 펩타이드에서 농후화되는 펩타이드 모티프(도 7a) 및 아미노산(도 7b)을 나타낸다. SLE 대상체 유래의 샘플로부터 얻은 신호 결합 데이터와 RA 그룹 유래의 결합 데이터의 비교는, SLE 샘플과 RA 그룹을 식별한 펩타이드가 전체 펩타이드 라이브러리에서 동일한 모티프의 발생률에 비해 도 7a에 열거된 하나 이상의 모티프에서 3.5배(360%) 초과로 농후화되었음을 확인시켜 주었다. 아울러, SLE 샘플과 RA 샘플을 식별한 펩타이드는 개별적인 아미노산에서 1.2배(120%) 초과로 농후화되는 것으로 확인되었다(도 7b).
도 8a 및 도 8b는 SLE 샘플과 샘플의 OA 그룹 사이를 식별하는 펩타이드에서 농후화되는 펩타이드 모티프(도 8a) 및 아미노산(도 8b)을 나타낸다. SLE 대상체 유래의 샘플로부터 얻은 신호 결합 데이터와 OA 그룹 유래의 결합 데이터의 비교는, SLE 샘플과 OA 그룹을 식별한 펩타이드가 전체 펩타이드 라이브러리에서 동일한 모티프의 발생률에 비해 도 8a에 열거된 하나 이상의 모티프에서 3.8배(380%) 초과로 농후화되었음을 확인시켜 주었다. 아울러, SLE 샘플과 OA 샘플을 식별한 펩타이드는 개별적인 아미노산에서 1.2배(120%) 초과로 농후화되는 것으로 확인되었다(도 8b).
도 9a 및 도 9b는 SLE 샘플과 샘플의 FM 그룹 사이를 식별하는 펩타이드에서 농후화되는 펩타이드 모티프(도 9a) 및 아미노산(도 9b)을 나타낸다. SLE 대상체 유래의 샘플로부터 얻은 신호 결합 데이터와 FM 그룹 유래의 결합 데이터의 비교는, SLE 샘플과 FM 그룹을 식별한 펩타이드가 전체 펩타이드 라이브러리에서 동일한 모티프의 발생률에 비해 도 9a에 열거된 하나 이상의 모티프에서 5배(500%) 초과로 농후화되었음을 확인시켜 주었다. 아울러, SLE 샘플과 FM 샘플을 식별한 펩타이드는 개별적인 아미노산에서 1.1배(110%) 초과로 농후화되는 것으로 확인되었다(도 9b).
도 10a 및 도 10b는 SLE 샘플과 샘플의 SS 그룹 사이를 식별하는 펩타이드에서 농후화되는 펩타이드 모티프(도 10a) 및 아미노산(도 10b)을 나타낸다. SLE 대상체 유래의 샘플로부터 얻은 신호 결합 데이터와 SS 그룹 유래의 결합 데이터의 비교는, SLE 샘플과 SS 그룹을 식별한 펩타이드가 전체 펩타이드 라이브러리에서 동일한 모티프의 발생률에 비해 도 10a에 열거된 하나 이상의 모티프에서 4.2배(420%) 초과로 농후화되었음을 확인시켜 주었다. 아울러, SLE 샘플과 SS 샘플을 식별한 펩타이드는 개별적인 아미노산에서 1.3배(130%) 초과로 농후화되는 것으로 확인되었다(도 10b).
볼케이노 플롯은 t-테스트 p-값의 결합 분포 대 신호 세기 평균의 로그 차이(폴드 변경)로서 샘플들 사이의 식별을 평가하기 위해 사용되었다. 각각의 플롯된 위치에서 펩타이드의 밀도는 열 스케일에 의해 나타낸다. 녹색 점선 위의 펩타이드는 다중도에 대한 본페로니 조정을 적용한 후 95% 신뢰도로 면역서명에 의해 각 비교의 두 그룹 사이를 구별하는 식별 펩타이드로서 선택되었다(도 11a, 도 11b, 및 도 11c에서 녹색 선으로 나타냄). 볼케이노 플롯은 다수의 식별 펩타이드가 모든 SLE 그룹에서 낮은 결합 세기를 나타냈음을 보여준다. 도 11a, 도 11b, 및 도 11c 각각은 중앙-정규화된 어레이 펩타이드 세기의 볼케이노 플롯을 나타낸다.
웰치 t-테스트는 유의적인 펩타이드를 확인시켜 주었는데, 이들은 SLE 그룹 유래의 샘플과 각각의 대조 그룹 유래의 샘플 사이의 평균 신호에서 유의적인 차이를 보유한 개별적인 펩타이드이다. 예를 들어, 도 11a, 도 11b, 및 도 11c에 나타낸 바와 같이, 웰치 t-테스트는 대상체의 SLE 그룹 유래의 샘플과 건강한 공여자의 그룹 유래의 샘플 사이에서 유의적인 차이를 보유한 5121개의 개별적인 펩타이드(도 11a); 대상체의 SLE 그룹 유래의 샘플과 다른 AI+비-AI 모방 질환을 갖는 대상체의 그룹 사이에서 유의적인 차이를 보유한 684개의 개별적인 펩타이드(도 11b); 및 대상체의 SLE 그룹과 SLE를 보유하지 않는 대상체, 즉 "Not SLE"의 그룹 사이에서 차이를 나타낸 2042개의 유의적인 피쳐(도 11c)를 확인시켜 주었다. 각각의 대조에서 본페로니 컷오프를 통과한 펩타이드는 도 12에 나타낸다. 478개의 펩타이드는 모든 대조에서 공통적이다. 이들 478개의 펩타이드는 SLE vs. 다른 AI+비-AI 모방 질환("다른 AI"로 나타냄)의 2/3를 포함하는데, 이는 이들 펩타이드가 유사 질환으로부터 SLE를 독특하게 확인할 수 있음을 나타낸다.
서포트 벡터 머신(SVM) 분류기는 각각의 대조에 대해 전개되었다. 교차 검증 하에서, 최고 성능(AUC)은 웰치 t-테스트에 의해 순위를 매긴 바와 같이 상위 k 펩타이드가 모델에 입력되었을 때 달성되었는데, 이때 k는 25개 내지 10,000개 피쳐 사이에서 가변적일 수 있다. 도 13은 각각의 대조 내에서 상위 k 펩타이드를 이용하여 5-폴드 교차 검증 모델을 100회 반복한 후의 어세이의 성능을 나타낸다. 최적 k는, AUC 자체가 넓은 범위의 샘플 크기에 걸쳐 매우 일정함에도 불구하고, 가장 높은 AUC를 나타내는 k로서 선택되었다. 이진 분류기는 각각의 대조에 대해 전개되었다. 도 13에 나타낸 그래프는 각각의 대조 모델을 위한 입력 펩타이드의 최적 크기는 클 수 있음을 나타낸다. 예를 들어, SLE vs (HC)의 대조를 위한 입력 펩타이드의 크기는 10000이었다. 또한, 상기 그래프는 AUC가 입력 펩타이드의 수가 증가함에 따라 유의적으로 변화되지 않음을 나타낸다.
서포트 벡터 머신(SVM) 모델은 SLE 대 건강한 개인 또는 다른 유사한 질환의 가능성을 예측할 수 있는 펩타이드의 조합을 확인하기 위해 사용되었다. p-값에 의해 순위를 매긴 바와 같이 최대 4000개의 펩타이드는 SVM 입력으로서 사용되었다. 5-폴드 교차 검증의 100회 반복은 오버-피팅의 가능성을 최소화하였다. 도 14의 히스토그램은 SLE와 열거된 서브그룹: 건강한 공여자(HC), 다른 AI 및 비-AI 모방 질환("다른 AI"), 및 Not SLE 그룹(다른 AI+비-AI 모방+HC) 사이를 식별하기 위한 수용기 작동 특성 곡선하 면적(AUC)을 나타낸다. SLE vs. 건강한에 대한 0.9의 AUC는 진단 세팅에서 강력한 식별을 암시한다. SLE와 유사한 질병 사이의 식별은 더 어려울 수 있는데, 그 이유는 중첩 인과관계 및 징후 때문인 것으로 생각된다.
도 15는 SLE와 RA, 쇼그렌 증후군, OA, 및 FM을 구별하는데 있어서의 어세이 성능을 나타내는 히스토그램을 나타낸다.
다중 클래스 모델, 즉 잔여 관련 질병의 그룹으로부터 하나의 질병의 동시 식별은 도 16에 나타내는데, 이로부터 이들 감별 진단을 위한 AUC 및 예측을 산출한다.
이들 데이터는 SLE 샘플이 0.9의 AUC로 건강한 샘플로부터 식별될 수 있음을 나타낸다. 또한, 이들 데이터는 SLE는 비-자가면역 질환(OA 및 섬유근육통)으로부터 및 쇼그렌 증후군으로부터 용이하게 구별되었음을 나타낸다. 아울러, 또한 상기 데이터는 SLE가 다른 AI+비-AI 모방 질환을 갖는 환자의 샘플로부터 구별될 수 있음을 나타낸다.
따라서, 면역서명(IS) 기술은 건강한 대조군 또는 통상적인 징후 또는 근본적인 면역학적 조절장애를 보유하는 질환을 갖는 대상체로부터 SLE를 보유하는 대상체를 분류하기 위해 사용될 수 있다.
실시예 3 - SLE -분류 펩타이드의 프로테옴 맵핑은 SLE의 후보 바이오마커를 확인한다
실시예 2에 기재된 대조에 의해 확인된 유의적인 식별 펩타이드는 후보 바이오마커를 확인하기 위해 사용되었다.
SLE와 관련된 유의적인 펩타이드는 SSB의 공지된 면역원성 에피토프를 포함한 추정적인 항원에 대해 맵핑되었다.
건강한 대상체, 다른 AI+비-AI 모방 질환, 및 "Not SLE" 대상체와 SLE를 유의적으로 구별한 라이브러리 펩타이드는 중첩하는 20-mer의 슬라이딩 윈도우를 사용한 변형된 BLAST 알고리즘 및 스코어링 시스템을 이용하여, 각각의 독특한 유전자 ID에 대한 최장 전사체 변이체를 이용하여 2016년 3월 10일 컴파일된 인간 게놈 빌드 GrCh38(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/)에 상응하는 인간 프로테옴 RefSeq release 84에 정렬되었다(실시예 1). 펩타이드는 10 mer까지 중첩하는 단백질의 20 mer 절편에 정렬되었다. 결과적으로 얻어진 상위 25개의 후보 단백질-타겟 영역의 순위 매겨진 리스트는 도 17a, 도 17 b, 및 도 17c에 제공된다. 유전자 명칭/에피토프 출발~~정렬 스코어가 제공된다. 이들 분류 펩타이드는 라이브러리로부터 무작위로 선택된 펩타이드의 10개의 균등한 크기의 세트를 이용하여 동일한 분석을 수행함으로써 얻은 최대 스코어를 크게 초과한 정렬 스코어의 높은 빈도를 나타낸다.
그 중에서 SLE 분류 펩타이드에 의해 맵핑된 상위 스코어링 후보는 표면 막 전위된 La/SSB 항원이었다. 특히, 공지된 및 임상적으로 사용된 SLE 자가항원 SSB는 각각의 리스트 상에서 상위에 순위 매김되었다. 구체적으로, 위치 340-360에서 아미노산 내에 함유된 3개의 면역우세성 에피토프 중 하나가 확인된다. SSB 자가항원은 내세포성 인간 La 단백질의 면역우세성 에피토프의 아미노산 340-360에 맵핑되는데, 이는 아폽토시스 중 핵 국부화 신호의 상실 후, 핵으로부터 세포 표면으로 재분포된다[Neufing et al. (2005), Exposure and binding of selected immunodominant La/SSB epitopes on human apoptotic cells. Arthritis & Rheumatism, 52: 3934-3942. doi:10.1002/art.21486](도 17a, 도 17b, 및 도 17c).
SLE 식별 펩타이드에 의해 맵핑된 다른 상위 스코어링 후보 바이오마커는 히스톤 단백질을 포함하였다. 히스톤은 핵 항체 및 항-핵 항체(ANA)의 중요한 표적 항원이고, 항-히스톤 항체 테스트는 SLE의 진단에 관련된 자가항체를 검출하는데 있어서 전형적으로 수행된다[Manson 및 Rahman (2006), Systemic Lupus Erythematosus. Orphanet Journal of Rare Diseases 1:6. doi 10.1186/1750-1172-1-6](도 17a, 도 17b, 및 도 17c).
SLE 식별 펩타이드에 의해 맵핑된 다른 상위 스코어링 후보 바이오마커는 HMGN https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8318042?dopt=Abstract로서 확인되었다.
각각의 대조에서 25개의 후보 프로테옴 타겟은 함께 정렬된 식별 펩타이드를 설명하였다. 또한, 선도 후보 바이오마커는 최대 식별 펩타이드의 모든 총 수에 의해 확인될 수 있다.
이들 데이터는 SLE 자가항원 에피토프를 모방하는 어레이 펩타이드가 SLE 대상체 내에서 말초 혈액 항체의 의해 감별적으로 결합되었다는 것을 나타낸다. 이들 식별 펩타이드는 SLE의 몇몇 공지된 마커에 대해 맵핑되었다. 다른 열거된 후보 타겟은 SLE의 신규한 마커일 수 있다.
실시예 4 - RA의 감별 진단
면역서명(IS)은 RA를 갖는 RA 대상체의 그룹 내의 대상체와, 건강한 대조군(HC)을 포함하는 대상체의 그룹, 다른 류머티스성 질환(ORD), SLE, OA, 섬유근육통(FM), 쇼그렌 증후군(SS)을 보유하는 대상체, 다른 AI/비-AI 모방 질환을 갖는 대상체의 그룹, 및 Not RA 대상체를 감별화하기 위해 얻었다. 다른 류머티스성 질환 그룹(ORD)(239)은 RA, SS, OA, 건선성 관절염, 통풍, 혈청 반응 음성 척추관절병, 및 가성통풍으로 구성되었다. 류머티즘학적 질환을 갖는 대상체는 ACR 기준에 기초하여 진단되었다.
어세이는 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행되었고, 각각의 피쳐에서 신호 세기 측정치를 획득하기 위해 스캔되었다. 그룹 사이에서 감별적 신호를 나타낸 펩타이드 피쳐는 이전에 기재한 바와 같이 이분산을 위한 웰치 보정을 이용하는 평균 펩타이드 세기의 t-테스트에 의해 결정되었다.
표 2는 각각의 대조에 대한 어세이 성능에 대한 결과를 AUC 값으로서 나타낸다.
Figure pct00002
각각의 그룹으로부터 RA를 식별한 유의적인 펩타이드는 몇몇 아미노산 및 펩타이드 모티프에서 농후화되는 것으로 확인되었다. 도 18-24는 각각의 대조에서 식별성의 유의적인 펩타이드의 일부분이 농후화된 모티프(도 18a-24a) 및 아미노산(도 18b-24b)을 나타낸다. 유의적인 펩타이드의 총 수는 각각의 도면에 나타낸다.
도 18a 및 도 18b는 RA 샘플과 건강한 공여자(HC) 샘플 사이를 식별하는 펩타이드에서 농후화되는 펩타이드 모티프(도 18a) 및 아미노산(도 18b)을 나타낸다. SLE 대상체 유래의 샘플로부터 얻은 신호 결합 데이터와 HC 그룹으로부터 얻은 결합 데이터의 비교는 SLE 샘플과 HC 그룹을 식별한 펩타이드가 전체 펩타이드 라이브러리 내의 동일한 모티프의 발생률에 비해 도 18a에 열거된 하나 이상의 모티프에서 4.6배(460%) 초과로 농후화되었음을 확인시켜 주었다. 아울러, SLE 샘플과 HC 샘플을 식별한 펩타이드는 개별적인 아미노산에서 1배(100%) 초과로 농후화되는 것으로 확인되었다(도 18b).
도 19a 및 도 19b는 RA 샘플과 샘플의 "다른 류머티스성 질환"(ORD) 그룹 사이를 식별하는 펩타이드에서 농후화되는 펩타이드 모티프(도 19a) 및 아미노산(도 19b)을 나타낸다. RA 대상체 유래의 샘플로부터 얻은 신호 결합 데이터와 ORD 그룹으로부터 얻은 결합 데이터의 비교는 RA 샘플과 ORD 그룹을 식별한 펩타이드가 전체 펩타이드 라이브러리 내의 동일한 모티프의 발생률에 비해 도 19a에 열거된 하나 이상의 모티프에서 4.8배(480%) 초과로 농후화되었음을 확인시켜 주었다. 아울러, RA 샘플과 ORD 샘플을 식별한 펩타이드는 개별적인 아미노산에서 1.1배(110%) 초과로 농후화되는 것으로 확인되었다(도 19b).
도 20a 및 도 20b는 RA 샘플과 샘플의 "Not RA" 그룹 사이를 식별하는 펩타이드에서 농후화되는 펩타이드 모티프(도 20a) 및 아미노산(도 20b)을 나타낸다. RA 대상체 유래의 샘플로부터 얻은 신호 결합 데이터와 "Not RA" 그룹으로부터 얻은 결합 데이터의 비교는 RA 샘플과 "Not RA" 그룹을 식별한 펩타이드가 전체 펩타이드 라이브러리 내의 동일한 모티프의 발생률에 비해 도 20a에 열거된 하나 이상의 모티프에서 4.9배(492%) 초과로 농후화되었음을 확인시켜 주었다. 아울러, RA 샘플과 "Not RA" 샘플을 식별한 펩타이드는 개별적인 아미노산에서 1.1배(110%) 초과로 농후화되는 것으로 확인되었다(도 20b).
도 21a 및 도 21b는 RA 샘플과 샘플의 "다른 AI+비-AI 모방 질환" 그룹 사이를 식별하는 펩타이드에서 농후화되는 펩타이드 모티프(도 21a) 및 아미노산(도 21b)을 나타낸다. RA 대상체 유래의 샘플로부터 얻은 신호 결합 데이터와 "다른 AI+비-AI 모방 질환" 그룹으로부터 얻은 결합 데이터의 비교는 RA 샘플과 "다른 AI+비-AI 모방 질환" 그룹을 식별한 펩타이드가 전체 펩타이드 라이브러리 내의 동일한 모티프의 발생률에 비해 도 21a에 열거된 하나 이상의 모티프에서 4.8배(480%) 초과로 농후화되었음을 확인시켜 주었다. 아울러, RA 샘플과 "다른 AI+비-AI 모방 질환" 샘플을 식별한 펩타이드는 개별적인 아미노산에서 1배(100%) 초과로 농후화되는 것으로 확인되었다(도 21b).
도 22a 및 도 22b는 RA 샘플과 OA 샘플 사이를 식별하는 펩타이드에서 농후화되는 펩타이드 모티프(도 22a) 및 아미노산(도 22b)을 나타낸다. RA 대상체 유래의 샘플로부터 얻은 신호 결합 데이터와 OA 그룹으로부터 얻은 결합 데이터의 비교는 RA 샘플과 OA 그룹을 식별한 펩타이드가 전체 펩타이드 라이브러리 내의 동일한 모티프의 발생률에 비해 도 22a에 열거된 하나 이상의 모티프에서 3.3배(330%) 초과로 농후화되었음을 확인시켜 주었다. 아울러, RA 샘플과 OA 샘플을 식별한 펩타이드는 개별적인 아미노산에서 1.6배(156%) 초과로 농후화되는 것으로 확인되었다(도 22b).
도 23a 및 도 23b는 RA 샘플과 샘플의 FM 그룹 사이를 식별하는 펩타이드에서 농후화되는 펩타이드 모티프(도 23a) 및 아미노산(도 23b)을 나타낸다. RA 대상체 유래의 샘플로부터 얻은 신호 결합 데이터와 HC 그룹으로부터 얻은 결합 데이터의 비교는 SLE 샘플과 FM 그룹을 식별한 펩타이드가 전체 펩타이드 라이브러리 내의 동일한 모티프의 발생률에 비해 도 23a에 열거된 하나 이상의 모티프에서 3.9배(390%) 초과로 농후화되었음을 확인시켜 주었다. 아울러, RA 샘플과 FM 샘플을 식별한 펩타이드는 개별적인 아미노산에서 1.1배(110%) 초과로 농후화되는 것으로 확인되었다(도 23b).
도 24a 및 도 24b는 RA 샘플과 샘플의 SS 그룹 사이를 식별하는 펩타이드에서 농후화되는 펩타이드 모티프(도 24a) 및 아미노산(도 24b)을 나타낸다. RA 대상체 유래의 샘플로부터 얻은 신호 결합 데이터와 SS 그룹으로부터 얻은 결합 데이터의 비교는 RA 샘플과 SS 그룹을 식별한 펩타이드가 전체 펩타이드 라이브러리 내의 동일한 모티프의 발생률에 비해 도 24a에 열거된 하나 이상의 모티프에서 4.2배(420%) 초과로 농후화되었음을 확인시켜 주었다. 아울러, RA 샘플과 SS 샘플을 식별한 펩타이드는 개별적인 아미노산에서 1.3배(130%) 초과로 농후화되는 것으로 확인되었다(도 24b).
SLE 대조에 대해 기재된 바와 같이, 볼케이노 플롯은 t-테스트 p-값의 결합 분포 대 신호 세기 평균의 로그 차이(배수 변화도)로서 샘플들 사이의 식별을 평가하기 위해 사용되었다. 각각의 플롯된 위치에서 펩타이드의 밀도는 열 스케일에 의해 나타낸다. 녹색 점선 위의 펩타이드는 다중도에 대한 본페로니 조정을 적용한 후 95% 신뢰도로 면역서명에 의해 각각의 비교의 두 그룹 사이를 구별하는 식별 펩타이드로서 선택되었다(도 25a, 도 25b, 및 도 25c에서 녹색 선으로 나타냄). 볼케이노 플롯은 다수의 식별 펩타이드가 모든 SLE 그룹에서 낮은 결합 세기를 나타냈음을 보여준다. 도 25a, 도 25b, 및 도 25c 각각은 중앙-정규화된 어레이 펩타이드 세기의 볼케이노 플롯을 나타낸다.
웰치 t-테스트는 유의적인 펩타이드를 확인시켜 주었는데, 이들은 대상체의 RA 그룹 유래의 샘플과 각각의 대조 그룹 유래의 샘플 사이의 평균 신호에서 유의적인 차이를 보유한 개별적인 펩타이드이다. 예를 들어, 도 25a, 도 25b, 및 도 25c에 나타낸 바와 같이, 웰치 t-테스트는 대상체의 RA 그룹 유래의 샘플과 건강한 공여자의 그룹 유래의 샘플 사이에서 유의적인 차이를 보유한 3062개의 개별적인 펩타이드(도 25a); 대상체의 RA 그룹 유래의 샘플과 "모든 질환", 즉 다른 AI+비-AI 모방 질환을 갖는 대상체의 그룹 사이에서 유의적인 차이를 보유한 742개의 개별적인 펩타이드(도 25b); 및 대상체의 RA 그룹과 RA를 보유하지 않는 대상체, 즉 "Not RA"의 그룹 사이에서 차이를 나타낸 1564개의 유의적인 피쳐(도 25c)를 확인시켜 준다. 각각의 대조에서 본페로니 컷오프를 통과한 펩타이드는 도 26에 나타낸다. 491개의 펩타이드는 모든 대조에서 공통적이다. 이들 478개의 펩타이드는 RA vs. "다른 AI"로 나타낸 다른 AI+비-AI 모방 질환의 2/3를 포함하는데, 이는 이들 펩타이드가 유사 질환으로부터 RA를 독특하게 확인할 수 있음을 나타낸다.
실시예 2에서 기재된 바와 같이, 유의적인 펩타이드는 웰치 t-테스트에 의해 확인되었고, 서포트 벡터 머신(SVM) 분류기는 각각의 대조군에 대해 전개되었다. 서포트 벡터 머신(SVM) 모델은 RA 대 건강한 개인 또는 다른 유사한 질환의 가능성을 예측할 수 있는 펩타이드의 조합을 확인하기 위해 사용되었다. p-값에 의해 순위를 매긴 바와 같이 최대 4000개의 펩타이드는 SVM 입력으로서 사용되었다. 5-폴드 교차 검증의 100회 반복은 오버-피팅의 가능성을 최소화하였다.
도 27의 히스토그램은 RA와 열거된 서브그룹: 건강한 공여자(HC), 다른 AI 및 비-AI 모방 질환("다른 AI"), 및 Not SLE 그룹(다른 AI+비-AI 모방+HC) 사이를 식별하기 위한 수용기 작동 특성 곡선하 면적(AUC)을 나타낸다. SLE vs. 건강한에 대한 0.9의 AUC는 진단 세팅에서 강력한 식별을 암시한다. RA vs. 건강한에 대한 0.8의 AUC는 진단 세팅에서 식별을 나타낸다.
RA를 갖는 대상체의 샘플 유래의 어레이 결합된 항체의 신호 세기의 비교는 RA가 다른 AI 및 비-AI 모발 질환으로부터 식별될 수 있음을 나타냈다(표 2).
RA 샘플과 SLE, 쇼그렌 증후군, OA 및 섬유근육통을 식별하는 데 있어서의 어세이 성능을 나타내는 히스토그램은 도 28에 제공된다.
IS 기술을 이용하여, RA는 루푸스를 갖는 환자 및 건강한 대조군을 포함하는 구별되는 상태로부터 최상으로 식별된다. 그럼에도 불구하고, 또한, RA는 보통의 cvAUC를 보유하는 SS와 같은 밀접하게 관련된 상태와 식별될 수 있다. 상기 결과는 IS 기술이 일정 범위의 징후적으로 관련된 질환에 대해, 또는 류머티즘학적 평가와 관련된 상태를 보유하는 환자에서 다중 분류를 가능하게 하는 적은 혈청 샘플을 이용하는 단일 테스트를 제공할 수 있음을 나타낸다.
실시예 5 - RA-분류 펩타이드의 프로테옴 맵핑은 SLE의 후보 바이오마커를 확인한다
실시예 4에 기재된 바와 같이, 건강한 대상체, 다른 AI+비-AI 모방 질환, 및 "Not RA" 대상체로부터 RA를 유의적으로 구별한 p-값에 의해 순위를 매긴 바와 같은 상위 1000개의 라이브러리 펩타이드는 중첩하는 20-mer의 슬라이딩 윈도우를 사용한 BLOSUM62 기반 스코어링 시스템 및 변형된 BLAST 알고리즘을 이용하여, 각각의 독특한 유전자 ID에 대한 최장 전사체 변이체를 이용하여 2016년 3월 10일 컴파일된 인간 게놈 빌드 GrCh38(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/)에 상응하는 인간 프로테옴 RefSeq release 84에 정렬되었다(실시예 1). 펩타이드는 10 mer까지 중첩하는 단백질의 20 mer 절편에 정렬되었다. 결과적으로 얻어진 상위 25개의 후보 단백질-타겟 영역의 순위 결정된 리스트는 도 29a, 도 29 b, 및 도 29c에 제공된다. 유전자 명칭/에피토프 출발~~정렬 스코어가 제공된다.
이들 분류 펩타이드는 라이브러리로부터 무작위로 선택된 펩타이드의 10개의 균등한 크기의 세트를 이용하여 동일한 분석을 수행함으로써 얻은 최대 스코어를 크게 초과하는 정렬 스코어의 높은 빈도를 나타낸다.
그 중에서 RA 분류 펩타이드에 의해 맵핑된 상위 스코어링 후보는 BrCA 암과 관련된 MN1 자가항체였다[Wang, et al. "Plasma autoantibodies associated with basal-like breast cancers" Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2015 Sep; 24(9): 1332-1340].
각각의 대조에서 25개의 후보 프로테옴 타겟은 함께 정렬된 식별 펩타이드를 설명하였다. 또한, 선도 후보 바이오마커는 최대 식별 펩타이드의 모든 총 수에 의해 확인될 수 있다.
이들 데이터는, RA 자가항원 에피토프를 모방하는 어레이 펩타이드가 RA 대상체 내의 말초 혈액 항체에 의해 감별적으로 결합되었음을 나타낸다. 이들 식별 펩타이드는 RA의 신규한 마커일 수 있는 수 개의 마커로 맵핑되었다.
실시예 6 - 상이한 건강 상태의 동시 분류
다중분류기 분석에서 SLE, RA, FM, OA, SS 및 HC를 서로 동시에 식별하는 펩타이드는 전체 펩타이드 라이브러리 내의 동일한 모티프의 발생률에 비해 도 30a에 열거된 하나 이상의 모티프에서 100% 초과로 농후화되었다. 아울러, 다중분류기 분석에서 SLE, RA, FM, OA, SS 및 HC 샘플을 서로 식별한 펩타이드는 도 30b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되었다.
도 31에 나타낸 열 지도(heat map)는 모두 6개의 상태를 포함하는 테스트 집단 샘플 각각에 대한 아웃 오브 백 교차 검증 모델 예측(out of the bag cross validation model prediction)의 클래스 멤버십의 평균 예측된 확률을 시각화한다. 각각의 샘플은 0(흑색)으로부터 100%(백색)까지의 범위에서 각각의 결과에 대한 예측된 클래스 멤버십을 보유한다.
이들 데이터는, 면역서명 분석이 하나의 건강한 상태를 2개 이상의 다른 상태를 동시에 구별할 수 있음을 나타낸다.
실시예 7 - 자동화된 어세이 및 이미징 시스템
펩타이드 마이크로어레이 및 이미징 프로세스는 자동화된 시스템이다. 상기 시스템은 중요한 작동을 자동화하는 2개의 하부시스템을 보유한다: 자동화된 어세이 시스템 및 자동화된 이미징 시스템. 상기 프로세스는 4개의 단계를 보유한다. 자동화된 어세이 시스템은 첫 번째 3개의 단계를 담당한다: 샘플 재포맷팅, 샘플 희석, 및 어세이 실행. 자동화된 이미징 시스템은 이미징 프로세스의 자동화를 담당한다. 샘플 재포맷팅 및 샘플 희석은 어세이에 앞서 샘플을 준비하기 위한 별도의 준비 프로토콜로서 실행되도록 의도된다.
샘플 재포맷팅은 한 번에 1-96개의 샘플에 대해 수행된다. 상기 시스템은 샘플 플레이트 위치 및 바코드 정보를 함유하는 바코드 플레이트(들) 내에 바코드 샘플 및 그들의 재포맷된 위치의 맵핑 출력 파일(예를 들어, *.xls 또는 *.csv 포맷으로)을 생성한다. 이 정보는 샘플 추적 및 사슬 보관을 위한 하류 프로토콜에서 사용된다. 또한, 이는 인간 친화적 리포트 파일, 예를 들어 포맷된 엑셀 문서를 생성한다. 예시적인 샘플 재포맷팅 프로토콜은 하기 표 3에 제공된다:
Figure pct00003
개략적으로, 샘플 재포맷팅은 그들의 원래 용기, 예를 들어 튜브에 샘플을 로딩하고, 목적 플레이트에 로딩하는 것을 포함한다. 팁은 튜브로부터 플레이트에 샘플을 이전하기 위해 시스템에 제공된다. 바코드는 샘플을 추적하기 위해 사용된다. 8개의 그룹에서, 모든 샘플이 플레이트에 이전될 때까지 샘플은 튜브로부터 목적 플레이트의 웰에 이전된다.
예시적인 샘플 희석 프로토콜은 하기 표 4에 제공된다:
Figure pct00004
개략적으로, 플레이트 내의 이전 단계 유래의 샘플은 희석 플레이트 및 원래 플레이트로부터 희석된 플레이트로 액체를 이전하기 위한 팁을 따라 시스템 내로 로딩된다. 샘플은 2단계로 순차 희석된다: 원래 플레이트의 일부분은 일정 부피의 완충용액 내에 투입되고, 혼합되고, 이어서 제1 희석 플레이트의 일부분은 제2 희석 플레이트 내의 일정 부피의 완충용액 내로 위치된다.
몇몇 경우에서, 샘플은 추가로 희석된다. 예시적인 샘플 희석 프로토콜은 하기 표 5에 제공된다:
Figure pct00005
몇몇 샘플은 어세이에서 샘플의 농도를 최적화하기 위해 순차적으로 희석되었다. 예시적인 순차 희석 프로세스는 하기 표 6에 제공된다:
Figure pct00006
어세이는 희석된 샘플에 대해 수행된다. 예시적인 어세이 프로토콜은 하기 표 7에 제공된다:
Figure pct00007
개략적으로, 시스템은 어세이 카세트 및 희석된 샘플이 로딩된 플레이트로 로딩된다. 희석된 샘플은 카세트에 적용된다. 카세트는 밀봉되고, 한 시간 동안 진탕/인큐베이션된다. 카세트는 개봉되고, 세척된다. 2차 항체는 카세트에 첨가되고, 밀봉되고, 한 시간 동안 진탕/인큐베이션된다. 카세트는 세척되고, 이어서 이미징을 위해 준비된다.
일단 어세이가 수행되면, 이미징은 어세이의 결과를 포착한다. 예시적인 이미징 프로토콜은 하기 표 8에 제공된다:
Figure pct00008
SEQUENCE LISTING <110> HEALTHTELL INC. <120> IMMUNOSIGNATURES FOR DIFFERENTIAL DIAGNOSIS <130> 43638-730.601 <140> PCT/US2018/038240 <141> 2018-06-19 <150> 62/581,581 <151> 2017-11-03 <150> 62/522,636 <151> 2017-06-20 <150> 62/522,052 <151> 2017-06-19 <160> 329 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Pro Gln Asn Asn 1 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Pro Gly Gly Asn 1 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Pro Ser Glu Lys 1 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Pro Lys Asp Asp 1 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Pro Ser Lys Gly 1 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gln Lys Gly Ala 1 <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Pro Glu Leu Leu 1 <210> 8 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Pro His His Asn 1 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Pro Leu Lys Pro 1 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Pro Val His Gln 1 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24 Tyr Pro Pro Ser 1 <210> 25 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Tyr Pro Pro Val 1 <210> 26 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Pro Leu Ala Glu 1 <210> 27 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Pro Pro Leu Asn 1 <210> 28 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Pro Ser Leu Ala 1 <210> 29 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Pro Ser Leu Lys 1 <210> 30 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Ala Ser Phe Gln 1 <210> 31 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Ala Asp Ala Asp 1 <210> 32 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Pro Ser Arg Glu 1 <210> 33 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Tyr Val His His 1 <210> 34 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Pro Val His Trp 1 <210> 35 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Lys Pro Pro Gly 1 <210> 36 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Pro Arg Trp Tyr 1 <210> 37 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Pro Phe Ala Pro 1 <210> 38 <211> 4 <212> PRT 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Trp His Phe Ser 1 5 10 <210> 184 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 184 Gly Ala Ala Val Lys Gly 1 5 <210> 185 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 185 Gly Pro Asn Leu Gln Lys Gln Leu Gly 1 5 <210> 186 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 186 Gly Lys Pro Ala Gln Gln Leu Gly 1 5 <210> 187 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 187 Pro Tyr Gln Gly Lys Phe Glu Leu Asn His Leu Ser 1 5 10 <210> 188 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 188 Asn Pro Ser Gln Arg Tyr Ala Asp Gly 1 5 <210> 189 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 189 Ala Pro Leu Lys Pro Gln Ser Gly 1 5 <210> 190 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 190 Asp Pro Arg Lys Ser Val Ser Gly 1 5 <210> 191 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 191 Pro Lys Gly Val Gln His Tyr His Gly 1 5 <210> 192 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 192 Arg Gln Gly Pro Ser Asp Lys Gly 1 5 <210> 193 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 193 Arg Gly Glu Lys Leu Pro Gly 1 5 <210> 194 <211> 9 <212> PRT 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Trp Arg Val Leu 1 5 10 <210> 205 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 205 Val Arg Asn Pro Lys Asp Gly 1 5 <210> 206 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 206 Pro Lys His Arg Glu Arg Val Tyr Ala Asn Arg Asp 1 5 10 <210> 207 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 207 Val Pro Asp Lys Val Lys Gly 1 5 <210> 208 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 208 Pro Leu Pro His Glu Asn Tyr Gln Arg Gly 1 5 10 <210> 209 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 209 Arg Pro Ser Pro Ala Gly Gly 1 5 <210> 210 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 210 Ala Val Glu Val Gly Glu Ala Val Leu Gly 1 5 10 <210> 211 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 211 Pro Asp Val Pro Glu Gly Asp Gly 1 5 <210> 212 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 212 Pro Tyr Ser His Gln Arg Gln Val Glu 1 5 <210> 213 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 213 Pro Asp Leu Pro Asp Leu Glu Asp 1 5 <210> 214 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 214 Asn Ser Arg Glu Pro Lys Asp Ala Leu Phe 1 5 10 <210> 215 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 215 Pro Val Lys Val Gly Glu Ala Glu Asp 1 5 <210> 216 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 216 Pro Val Val Val His Asp Gly 1 5 <210> 217 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 217 Pro His Tyr Arg Val Gln Gln Glu Gly 1 5 <210> 218 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 218 Glu Leu Pro Asp Asp Gly 1 5 <210> 219 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 219 Tyr Pro His Lys Tyr Gln His Gly 1 5 <210> 220 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 220 Lys Val Gln Ala Pro Ser Gly 1 5 <210> 221 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 221 Pro His His Gly Ser Leu Gly 1 5 <210> 222 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 222 Pro Glu Leu His Leu Asn Val Gly 1 5 <210> 223 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 223 Gly Val Gln Tyr Gly 1 5 <210> 224 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 224 Arg Ser Glu Gly Lys Trp His Leu Pro Trp His Phe 1 5 10 <210> 225 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 225 Lys Phe Lys Val Trp Glu Trp His Phe Ser 1 5 10 <210> 226 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 226 Asn Arg Phe Arg Phe Ser Pro His Trp Gly 1 5 10 <210> 227 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 227 Gln Phe Ser Pro Arg His Ser Trp Pro Ala Leu Ser 1 5 10 <210> 228 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 228 Arg Arg Gln His Arg Val Phe Asp 1 5 <210> 229 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 229 Gln Ser Arg Lys Val Pro Trp Leu Asp 1 5 <210> 230 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 230 Arg Trp Glu Leu Trp Lys Arg Val Asp 1 5 <210> 231 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 231 Lys Phe Arg Ser Glu Trp Gln Pro His Phe Gly 1 5 10 <210> 232 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 232 Lys Arg Trp Glu Asn His Phe Tyr Asn His Val 1 5 10 <210> 233 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 233 Asn Trp Leu His Gly Pro Asn Phe Gly 1 5 <210> 234 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 234 Asn Arg Tyr Trp Gln Lys Leu Pro Gly Tyr His Val Glu 1 5 10 <210> 235 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 235 His Trp Lys Glu Ser Arg Phe Gly 1 5 <210> 236 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 236 Arg Phe Gly Trp Gly Pro Ala Pro His Leu Gly 1 5 10 <210> 237 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 237 Phe Glu Lys His Gly His Trp Gly 1 5 <210> 238 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 238 Gln Tyr Lys Leu Arg His Trp His Leu Gly 1 5 10 <210> 239 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 239 Arg Gln Tyr Asn Lys His Phe Arg Asp 1 5 <210> 240 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 240 Phe Trp Asn Ser Arg Leu Glu Asn Arg His Leu 1 5 10 <210> 241 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 241 Lys Tyr Glu His Trp Lys Phe Asp 1 5 <210> 242 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 242 Gln Tyr Lys Glu Arg His Trp Leu Gly 1 5 <210> 243 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 243 Arg Asn Trp Ala Trp His Leu Gly 1 5 <210> 244 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 244 Arg Asp Pro Gln Arg Leu Phe His Ala Trp Gly 1 5 10 <210> 245 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 245 Gln Trp Val Ser Gln Arg His Ala Phe Glu 1 5 10 <210> 246 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 246 Trp Asn Val Gly Ala Lys His Asn His Pro Tyr His Leu 1 5 10 <210> 247 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 247 Arg Asn Ser Trp Pro Trp Leu Glu Gly 1 5 <210> 248 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 248 Arg Glu Arg His Lys His Trp His Leu Gly 1 5 10 <210> 249 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 249 Gln Arg Asp Val Gln His Gln His Val Phe 1 5 10 <210> 250 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 250 Arg Gly Pro Trp Tyr Arg Pro Tyr Glu Gly 1 5 10 <210> 251 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 251 Trp Glu Arg Gly Ala Arg Asp Asn His Val Leu 1 5 10 <210> 252 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 252 Arg His Gln Trp Gln Ala His Phe Gly 1 5 <210> 253 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 253 Arg Lys Trp Asp Ala Trp Leu Gly 1 5 <210> 254 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 254 Gln His Leu Arg Val Ser Trp Arg Pro Tyr Asn His Leu 1 5 10 <210> 255 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 255 Asn His Ser Tyr Arg Leu Gly Trp Gly Trp His Ser 1 5 10 <210> 256 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 256 Ser Trp Tyr Leu Pro Asn Arg His Leu 1 5 <210> 257 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 257 Arg Val Asn Gln Trp Arg His Arg Phe Glu 1 5 10 <210> 258 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 258 Gln Ser Gln Trp Gly Tyr Trp Lys His Phe 1 5 10 <210> 259 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 259 Arg Gln Asp Ala Pro Trp Arg His Phe 1 5 <210> 260 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 260 Arg Asp Gln His Leu Pro Phe Tyr Asn Arg His Leu 1 5 10 <210> 261 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 261 Arg Val Gly Tyr Ala His Leu Asn Gly Arg Phe Glu 1 5 10 <210> 262 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 262 Lys Ser Glu Asp His Gln Phe Asn Arg His Phe 1 5 10 <210> 263 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 263 Arg Gly His Ser Trp Asn Arg Arg Leu Asp 1 5 10 <210> 264 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 264 Asn Val Val Trp Trp Asn Arg His Leu 1 5 <210> 265 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 265 Trp Pro His Arg His Leu Phe Trp Lys Glu 1 5 10 <210> 266 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 266 Gly Lys Tyr Arg Val Phe Phe Glu Gly 1 5 <210> 267 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 267 His Val Arg Ala Gln Arg Pro Trp Ser Glu 1 5 10 <210> 268 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 268 Lys Asn Ser Pro Arg Leu Pro His Phe Asp 1 5 10 <210> 269 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 269 Arg Phe Trp Lys Gly His Phe Pro Arg Glu 1 5 10 <210> 270 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 270 Arg Trp His Gln Gln Arg Phe Glu 1 5 <210> 271 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 271 Gln Ser Arg Glu Trp His Ser Gln Leu Phe Ser 1 5 10 <210> 272 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 272 Trp Tyr Asn Arg Pro Trp His Leu His Gly 1 5 10 <210> 273 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 273 Asn Gln Arg Tyr Ala Trp Ala Trp Pro His Val Ser 1 5 10 <210> 274 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 274 Trp Tyr Glu His Gly Lys Val Phe Gly 1 5 <210> 275 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 275 His Trp Leu Gly Phe Pro Ala His Gly 1 5 <210> 276 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 276 Phe His Pro His Gln Phe Ser Gly 1 5 <210> 277 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 277 His Trp Arg Trp Tyr Asn Gly 1 5 <210> 278 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 278 Tyr Val His His Gln Arg His Phe Gly 1 5 <210> 279 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 279 Trp Trp Val Ser Gly Pro Asn Pro His Phe Ser 1 5 10 <210> 280 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 280 His His Gly Tyr Trp Asn Lys Trp Gly 1 5 <210> 281 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 281 Trp Tyr Pro Gly Arg Leu Gly 1 5 <210> 282 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 282 Leu Pro Trp His Trp Gln Gly Lys His Phe Ser 1 5 10 <210> 283 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 283 Pro Val His Trp Ala Arg His Phe Gly 1 5 <210> 284 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 284 Ser Trp Phe Gly Asp Asn Lys Arg His Leu 1 5 10 <210> 285 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 285 Trp Tyr Arg Gly Gly Trp Gly 1 5 <210> 286 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 286 Trp Pro Trp Trp His Gly Tyr Arg Gly 1 5 <210> 287 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 287 Ser Tyr Pro Gln His His Val Phe 1 5 <210> 288 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 288 Trp Asp His Phe Tyr Val Gln Arg His Val 1 5 10 <210> 289 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 289 Trp Val Trp His Pro Trp Arg Ala Gly 1 5 <210> 290 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 290 Lys Val Tyr Trp His Phe Gly His His Gly 1 5 10 <210> 291 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 291 Trp Val Gln Tyr Val Pro Gly 1 5 <210> 292 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 292 Tyr His Tyr Ala Asp Tyr His Leu Pro Lys Gly 1 5 10 <210> 293 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 293 Trp Gln Gly Asp Tyr Trp Arg Pro Arg Phe Ser 1 5 10 <210> 294 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 294 Gln Trp His Tyr Val Val Ser Gly 1 5 <210> 295 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 295 Ala His Trp Leu Ala His Pro Leu Gly 1 5 <210> 296 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 296 Trp Val Leu Asn Pro Trp Tyr Trp Asn His Gly 1 5 10 <210> 297 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 297 His Phe Val His Ala Arg His Val Leu 1 5 <210> 298 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 298 Trp Ser Glu Trp Tyr Leu Lys Val 1 5 <210> 299 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 299 His Leu Trp Phe Ala Ala His Leu Gly 1 5 <210> 300 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 300 Trp Asn Val Val Asn Gly Ala Arg His Phe 1 5 10 <210> 301 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 301 His Trp Phe His Phe Ser Pro Gly 1 5 <210> 302 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 302 Trp Ser Pro Ala Gly Tyr His Tyr Asn Phe Ser 1 5 10 <210> 303 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 303 His Ala His Phe Arg Trp Gly 1 5 <210> 304 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 304 Asn Glu Pro Phe His Phe Arg His Phe Gly 1 5 10 <210> 305 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 305 Trp Gly Arg Gln Trp Gly 1 5 <210> 306 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 306 Pro Tyr Val Asn Phe Gly Trp Pro His Gly 1 5 10 <210> 307 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 307 Trp Val Ser Gln Tyr Asn Gly Trp Gly 1 5 <210> 308 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 308 Trp Ser His Pro Arg Leu His Val Gly 1 5 <210> 309 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 309 Arg His Gly Glu Trp Arg Ser Pro His Phe Ser 1 5 10 <210> 310 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 310 Lys His His Gly Trp His Pro Tyr Phe Ser 1 5 10 <210> 311 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 311 His Tyr Val Trp Tyr Trp His Ser Gly 1 5 <210> 312 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 312 Trp Tyr Pro Ala Asn Lys Gln His Val Phe 1 5 10 <210> 313 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 313 Ser Trp Val His Leu Phe Gln Gly 1 5 <210> 314 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 314 Trp Gln Tyr Ser Leu Gly His Phe Ser 1 5 <210> 315 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 315 Lys Ala His Phe Pro His Trp Lys Asp 1 5 <210> 316 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 316 Tyr Gln Phe Ala Pro Pro Trp Arg His Leu 1 5 10 <210> 317 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 317 Ser His Tyr Trp Ala Gln Val Leu Ser 1 5 <210> 318 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 318 His Val Ala His Phe Pro Pro Lys Leu Asp 1 5 10 <210> 319 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 319 Trp Arg Trp Ser Gln Ala His Phe Gly 1 5 <210> 320 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 320 Asn Phe His Val Ala Trp His Pro Phe Ser Gly 1 5 10 <210> 321 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 321 His Tyr His Trp Gly Val Gly 1 5 <210> 322 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 322 His Val Leu Gln His Val Arg His Tyr His Phe Gly 1 5 10 <210> 323 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 323 Trp Gly Trp Asn Ser Arg Asp Arg Val Leu Gly 1 5 10 <210> 324 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 324 Trp Trp Pro Lys Val Phe Pro Asn His Ser 1 5 10 <210> 325 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 325 Trp Trp Ala Val Lys His Phe Gly 1 5 <210> 326 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 326 Trp Gln Trp Gln Asn Arg Ala His Phe Gly 1 5 10 <210> 327 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 327 Gly Trp Val Trp Ala Asn Arg His Phe Gly 1 5 10 <210> 328 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 328 Asn Trp Ser Pro Phe Glu Trp Lys Gly 1 5 <210> 329 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 329 Lys Trp Trp Val His Phe Gly 1 5

Claims (146)

  1. 자가면역 질환의 감별 진단을 수행하는 방법으로서,
    (a) 대상체 유래의 샘플을, 적어도 10,000개의 상이한 펩타이드를 포함하는 펩타이드의 어레이에 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 어레이 상의 적어도 25개의 펩타이드에 대한, 상기 샘플에 존재하는 항체의 결합을 검출하여 결합 신호 조합을 얻는 단계; 및
    (c) 상기 결합 신호 조합을 기준 결합 신호 조합의 하나 이상의 그룹과 비교하는 단계로서, 상기 기준 결합 신호 조합의 그룹 중 적어도 하나는, 자가면역 질환에 대해 상기 대상체의 감별 진단을 가능하게 하도록 대상체의 자가면역 질환과 상이한 질환을 갖는 것으로 공지된 복수의 기준 대상체로부터 수득되는 것인 단계
    를 포함하고, 방법 성능은 자가면역 질환과 기준 결합 신호 조합의 각 그룹 사이의 수신자 조작 특성(ROC) 곡선하 면적(AUC)이 0.6 초과인 것을 특징으로 하는 것인, 자가면역 질환의 감별 진단을 수행하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    (i) 감별화 기준 결합 신호 조합을 확인하는 단계로서, 상기 감별화 기준 결합 신호는 상기 자가면역 질환을 갖는 것으로 공지된 기준 대상체 유래의 샘플과, 그 자가면역 질환과는 상이한 상기 질환을 갖는 것으로 공지된 기준 대상체 유래의 샘플을 구별하는 것인 단계; 및
    (ii) 자가면역 질환의 감별 진단을 가능하게 하도록 감별화 기준 결합 신호 조합을 단계 1(c)에 적용하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 감별화 기준 결합 신호 조합 각각은, 제1항의 단계 (a)의 적어도 10,000개의 상이한 펩타이드를 포함하는 펩타이드의 어레이 상의 상기 적어도 25개의 펩타이드에 대한, 상기 복수의 기준 대상체 각각에서 유래한 샘플에 존재하는 항체의 결합을 검출함으로써 얻는 것인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 적어도 25개의 펩타이드에 대한 상기 기준 결합 신호 조합과 상기 결합 신호 조합 사이의 차이가 상기 감별 진단을 결정하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    (d) 상기 결합 신호 조합과, 자가면역 질환을 갖는 것으로 공지된 복수의 기준 대상체로부터 얻은 기준 결합 신호를 비교하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 상이한 질환은 자가면역 질환인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 상이한 질환은 비-자가면역 모방 질환인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 전신 홍반성 루푸스(SLE)이고, 상기 상이한 자가면역 질환은 류머티스성 관절염(RA)인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 7a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프에서 100% 초과로 농후화되는 것인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 7b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 것인 방법.
  11. 제6항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 전신 홍반성 루푸스이고, 상기 상이한 비-자가면역 질환은 골관절염(OA)인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 8a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프에서 100% 초과로 농후화되는 것인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 8b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 것인 방법.
  14. 제6항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 전신 홍반성 루푸스이고, 상기 상이한 비-자가면역 질환은 섬유근육통(FM)인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 9a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프에서 100% 초과로 농후화되는 것인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 9b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 것인 방법.
  17. 제6항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 전신 홍반성 루푸스이고, 상기 상이한 자가면역 질환은 쇼그렌 증후군(SS)인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 10a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프에서 100% 초과로 농후화되는 것인 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 10b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 것인 방법.
  20. 제6항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 전신 홍반성 루푸스이고, 상기 상이한 질환은 자가면역 질환 및 비-자가면역 모방 질환의 그룹인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 5a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프에서 100% 초과로 농후화되는 것인 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 5b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 것인 방법.
  23. 제6항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 전신 홍반성 루푸스이고, 상기 상이한 질환은 자가면역 질환, 비-자가면역 모방 질환, 및 건강한 대조군의 그룹인 방법.
  24. 제20항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 6a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프에서 100% 초과로 농후화되는 것인 방법.
  25. 제20항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 6b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 것인 방법.
  26. 제1항에 있어서, 전신 홍반성 루푸스를 갖는 대상체로부터의 결합 신호를 건강한 대상체로부터 얻은 기준 결합 신호 조합과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 4a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프에서 100% 초과로 농후화되는 것인 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 4b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 것인 방법.
  29. 제6항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 류머티스성 관절염(RA)이고, 상기 상이한 질환은 OA인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 22a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프에서 100% 초과로 농후화되는 것인 방법.
  31. 제29항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 22b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 것인 방법.
  32. 제6항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 류머티스성 관절염(RA)이고, 상기 상이한 질환은 FM인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 23a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프에서 100% 초과로 농후화되는 것인 방법.
  34. 제32항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 23b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 것인 방법.
  35. 제6항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 류머티스성 관절염(RA)이고, 상기 상이한 질환은 SS인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 24a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프에서 100% 초과로 농후화되는 것인 방법.
  37. 제35항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 24b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 것인 방법.
  38. 제6항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 RA이고, 상기 상이한 질환은 자가면역 질환 및 비-자가면역 모방 질환의 그룹인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 21a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프에서 100% 초과로 농후화되는 것인 방법.
  40. 제38항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 21b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 것인 방법.
  41. 제6항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 RA이고, 상기 상이한 질환은 자가면역 질환, 비-자가면역 모방 질환, 및 건강한 대조군의 그룹인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 20a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프에서 100% 초과로 농후화되는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 20b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 것인 방법.
  44. 제1항에 있어서, RA를 갖는 대상체로부터의 결합 신호를 건강한 대상체(HC)로부터 얻은 기준 결합 신호 조합과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 18a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프에서 100% 초과로 농후화되는 것인 방법.
  46. 제44항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 18b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 것인 방법.
  47. 제1항에 있어서, SLE, RA, FM, OA, SS 및 HC 각각으로부터의 샘플을 서로 구별하는 감별화 결합 신호를 조합하여, 각각의 상태를 서로 동시에 구별하는 식별 펩타이드의 다중클래스 세트를 얻는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 30a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프에서 100% 초과로 농후화되는 것인 방법.
  49. 제44항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 30b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 것인 방법.
  50. 제1항에 있어서, 방법 성능은 0.60 내지 0.70, 0.70 내지 0.79, 0.80 내지 0.89, 또는 0.90 내지 1.00 범위의 수신자 조작 특성(ROC) 곡선하 면적(AUC)을 특징으로 하는 것인 방법.
  51. 자가면역 질환에 대한 적어도 하나의 후보 바이오마커를 확인하는 방법으로서,
    (a) 펩타이드 어레이를 제공하고, 펩타이드 어레이에 대해 자가면역 질환을 갖는 것으로 공지된 복수의 기준 대상체 유래의 생물학적 샘플을 인큐베이션하는 단계;
    (b) 상기 대상체 유래의 생물학적 샘플 내의 항체에 결합된 식별 펩타이드의 세트를 확인하는 단계로서, 식별 펩타이드의 세트는 건강한 대상체 유래의 샘플로부터의 자가면역 질환을 감별화할 수 있는 결합 신호를 나타내는 것인 단계;
    (c) 식별 펩타이드의 세트 내의 펩타이드 각각을 이용하여 프로테옴 데이터베이스를 조회하는 단계;
    (d) 인간 프로테옴 데이터베이스 내의 하나 이상의 단백질에 대해 식별 펩타이드의 세트 내의 펩타이드 각각을 정렬하는 단계; 및
    (e) 프로테옴 데이터베이스로부터 확인된 단백질 각각에 대한 관련성 스코어 및 순위를 얻는 단계
    를 포함하고, 확인된 단백질 각각은 자가면역 질환에 대한 후보 바이오마커인, 자가면역 질환에 대한 적어도 하나의 후보 바이오마커를 확인하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 중첩 스코어를 얻는 단계를 추가로 포함하고, 상기 스코어는 펩타이드 라이브러리의 펩타이드 조성을 보정하는 것인 방법.
  53. 제51항에 있어서, 상기 식별 펩타이드의 세트를 확인하는 단계는
    (i) 상이한 펩타이드의 어레이에 대한, 자가면역 질환을 갖는 복수의 대상체 유래의 샘플에 존재하는 항체의 결합을 검출하여 제1 결합 신호 조합을 얻는 단계;
    (ii) 펩타이드의 동일한 어레이에 대한 항체의 결합을 검출하여 제2 결합 신호 조합을 얻는 단계로서, 상기 항체는 대상체의 2개 이상의 기준 그룹 유래의 샘플에 존재하고, 각각의 그룹은 상기 질환에 대해 혈청 반응 음성인 단계;
    (iii) 상기 제1 결합 신호 조합과 제2 결합 신호 조합을 비교하는 단계; 및
    (iv) 건강한 대상체의 기준 그룹으로부터 자가면역 질환을 갖는 대상체 유래의 샘플 내의 항체에 의해 감별적으로 결합되는 상기 어레이 상의 상기 펩타이드를 확인함으로써 상기 식별 펩타이드를 확인하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  54. 제51항에 있어서, 식별 펩타이드의 수는 상기 어레이 상의 펩타이드의 총 수의 적어도 일부에 상응하는 것인 방법.
  55. 제51항에 있어서, 자가면역 질환은 전신 홍반성 루푸스인 방법.
  56. 제51항에 있어서, 상기 적어도 하나의 후보 단백질 바이오마커는 도 17a에 제공된 목록으로부터 선택되는 것인 방법.
  57. 제51항에 있어서, 자가면역 질환은 류머티스성 관절염인 방법.
  58. 제51항에 있어서, 상기 적어도 하나의 후보 단백질 바이오마커는 도 29a에 제공된 목록으로부터 선택되는 것인 방법.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 혈액 샘플인 방법.
  60. 제56항에 있어서, 혈액 샘플은 전혈, 혈장, 또는 혈청으로부터 선택되는 것인 방법.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 혈청 샘플인 방법.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 혈장 샘플인 방법.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 건조된 혈액 샘플인 방법.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드의 어레이는 적어도 50,000개의 상이한 펩타이드를 포함하는 것인 방법.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드 어레이는 적어도 300,000개의 상이한 펩타이드를 포함하는 것인 방법.
  66. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드 어레이는 적어도 500,000개의 상이한 펩타이드를 포함하는 것인 방법.
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드 어레이는 적어도 2,000,000개의 상이한 펩타이드를 포함하는 것인 방법.
  68. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드 어레이는 적어도 3,000,000개의 상이한 펩타이드를 포함하는 것인 방법.
  69. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드 어레이 상의 상이한 펩타이드는 길이가 적어도 5개의 아미노산인 방법.
  70. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드 어레이 상의 상이한 펩타이드는 길이가 5개 내지 13개의 아미노산인 방법.
  71. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상이한 펩타이드는 20개 미만의 아미노산으로부터 합성되는 것인 방법.
  72. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 어레이 상의 상이한 펩타이드는 침착되는 것인 방법.
  73. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 어레이 상의 상이한 펩타이드는 계내에서 합성되는 것인 방법.
  74. 자가면역 질환의 감별 진단을 수행하기 위한 키트로서,
    (a) 대상체 유래 샘플을 접촉시키기 위한 적어도 10,000개의 상이한 펩타이드를 포함하는 펩타이드의 어레이;
    (b) 결합 신호 조합을 얻기 위해 상기 어레이 상의 적어도 25개의 펩타이드에 대한 상기 샘플 내에 존재하는 항체의 결합을 검출하기 위한 검출제; 및
    (c) 상기 결합 신호 조합을 기준 결합 신호 조합의 하나 이상의 그룹과 비교하는 수단으로서, 기준 결합 신호 조합의 그룹 중 적어도 하나는, 자가면역 질환에 대해 상기 대상체의 감별 진단을 가능하게 하도록 대상체의 자가면역 질환과는 상이한 질환을 갖는 것으로 공지된 복수의 기준 대상체로부터 수득되는 것인 수단
    을 포함하고, 방법 성능은 자가면역 질환과 기준 결합 신호 조합의 각 그룹 사이의 수신자 조작 특성(ROC) 곡선하 면적(AUC)이 0.6 초과인 것을 특징으로 하는 것인, 자가면역 질환의 감별 진단을 수행하기 위한 키트.
  75. 제74항에 있어서,
    (i) 감별화 기준 결합 신호 조합을 확인하기 위한 수단으로서, 상기 감별화 기준 결합 신호는 상기 자가면역 질환을 갖는 것으로 공지된 기준 대상체 유래의 샘플과 자가면역 질환과는 상이한 상기 질환을 갖는 것으로 공지된 기준 대상체 유래의 샘플을 구별하는 것인 수단; 및
    (ii) 자가면역 질환의 감별 진단을 가능하도록 하기 위해 단계 1(c)에 감별화 기준 결합 신호 조합을 적용하기 위한 수단
    을 추가로 포함하는 키트.
  76. 제75항에 있어서, 상기 감별화 기준 결합 신호 조합 각각은, 제1항의 단계 (a)의 적어도 10,000개의 상이한 펩타이드를 포함하는 펩타이드의 어레이 상의 상기 적어도 25개의 펩타이드에 대한, 상기 복수의 기준 대상체 각각으로부터 유래한 샘플에 존재하는 항체의 결합을 검출함으로써 얻는 것인 키트.
  77. 제75항에 있어서, 상기 적어도 25개의 펩타이드에 대한 상기 기준 결합 신호 조합과 상기 결합 신호 조합 사이의 차이가 상기 감별 진단을 결정하는 것인 키트.
  78. 제74항에 있어서,
    (d) 상기 결합 신호 조합과, 자가면역 질환을 갖는 것으로 공지된 복수의 기준 대상체로부터 얻은 기준 결합 신호를 비교하기 위한 수단
    을 추가로 포함하는 키트.
  79. 제74항에 있어서, 상기 상이한 질환은 자가면역 질환인 키트.
  80. 제74항에 있어서, 상기 상이한 질환은 비-자가면역 모방 질환인 키트.
  81. 제79항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 전신 홍반성 루푸스이고, 상기 상이한 자가면역 질환은 류머티스성 관절염인 키트.
  82. 제81항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 7a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프에서 100% 초과로 농후화되는 것인 키트.
  83. 제81항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 7b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 것인 키트.
  84. 제79항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 전신 홍반성 루푸스이고, 상기 상이한 비-자가면역 질환은 골관절염인 키트.
  85. 제84항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 8a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프에서 100% 초과로 농후화되는 것인 키트.
  86. 제84항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 8b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 것인 키트.
  87. 제79항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 전신 홍반성 루푸스이고, 상기 상이한 비-자가면역 질환은 섬유근육통인 키트.
  88. 제87항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 9a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프에서 100% 초과로 농후화되는 것인 키트.
  89. 제87항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 9b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 것인 키트.
  90. 제79항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 전신 홍반성 루푸스이고, 상기 상이한 자가면역 질환은 쇼그렌 증후군인 키트.
  91. 제90항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 10a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프에서 100% 초과로 농후화되는 것인 키트.
  92. 제90항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 10b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 것인 키트.
  93. 제79항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 전신 홍반성 루푸스이고, 상기 상이한 질환은 자가면역 질환 및 비-자가면역 모방 질환의 그룹인 키트.
  94. 제93항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 5a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프에서 100% 초과로 농후화되는 것인 키트.
  95. 제93항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 5b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 것인 키트.
  96. 제79항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 전신 홍반성 루푸스이고, 상기 상이한 질환은 자가면역 질환, 비-자가면역 모방 질환, 및 건강한 대조군의 그룹인 키트.
  97. 제96항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 6a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프에서 100% 초과로 농후화되는 것인 키트.
  98. 제96항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 6b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 것인 키트.
  99. 제74항에 있어서, 전신 홍반성 루푸스를 갖는 대상체로부터의 결합 신호를 건강한 대상체로부터 얻은 기준 결합 신호 조합과 비교하는 수단을 추가로 포함하는 키트.
  100. 제99항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 4a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프에서 100% 초과로 농후화되는 것인 키트.
  101. 제99항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 4b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 것인 키트.
  102. 제79항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 류머티스성 관절염(RA)이고, 상기 상이한 질환은 OA인 키트.
  103. 제102항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 22a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프에서 100% 초과로 농후화되는 것인 키트.
  104. 제102항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 22b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 것인 키트.
  105. 제79항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 류머티스성 관절염(RA)이고, 상기 상이한 질환은 FM인 키트.
  106. 제105항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 23a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프에서 100% 초과로 농후화되는 것인 키트.
  107. 제105항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 23b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 것인 키트.
  108. 제79항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 류머티스성 관절염(RA)이고, 상기 상이한 질환은 SS인 키트.
  109. 제108항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 24a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프에서 100% 초과로 농후화되는 것인 키트.
  110. 제108항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 24b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 것인 키트.
  111. 제79항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 RA이고, 상기 상이한 질환은 자가면역 질환 및 비-자가면역 모방 질환의 그룹인 키트.
  112. 제111항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 21a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프에서 100% 초과로 농후화되는 것인 키트.
  113. 제111항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 21b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 것인 키트.
  114. 제79항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 RA이고, 상기 상이한 질환은 자가면역 질환, 비-자가면역 모방 질환, 및 건강한 대조군의 그룹인 키트.
  115. 제114항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 20a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프에서 100% 초과로 농후화되는 것인 키트.
  116. 제114항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 20b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 것인 키트.
  117. 제74항에 있어서, RA를 갖는 대상체로부터의 결합 신호를 건강한 대상체(HC)로부터 얻은 기준 결합 신호 조합과 비교하는 수단을 추가로 포함하는 키트.
  118. 제117항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 18a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프에서 100% 초과로 농후화되는 것인 키트.
  119. 제117항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 18b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 것인 키트.
  120. 제74항에 있어서, SLE, RA, FM, OA, SS 및 HC 각각으로부터의 샘플을 서로 구별하는 감별화 결합 신호를 조합하여, 각각의 상태를 서로 동시에 구별하는 식별 펩타이드의 다중클래스 세트를 얻기 위한 수단을 추가로 포함하는 키트.
  121. 제120항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 30a에 열거된 하나 이상의 서열 모티프에서 100% 초과로 농후화되는 것인 키트.
  122. 제120항에 있어서, 상기 식별 펩타이드는 도 30b에 열거된 하나 이상의 아미노산에서 100% 초과로 농후화되는 것인 키트.
  123. 제74항에 있어서, 방법 성능은 0.60 내지 0.70, 0.70 내지 0.79, 0.80 내지 0.89, 또는 0.90 내지 1.00 범위의 수신자 조작 특성(ROC) 곡선하 면적(AUC)을 특징으로 하는 것인 키트.
  124. 자가면역 질환에 대한 적어도 하나의 후보 바이오마커를 확인하기 위한 키트로서,
    (a) 자가면역 질환을 갖는 것으로 공지된 복수의 기준 대상체 유래의 생물학적 샘플을 인큐베이션하기 위한 펩타이드 어레이;
    (b) 상기 대상체 유래의 생물학적 샘플 내의 항체에 결합된 식별 펩타이드의 세트를 식별하기 위한 수단으로서, 식별 펩타이드의 세트는 건강한 대상체 유래의 샘플로부터 자가면역 질환을 감별화할 수 있는 결합 신호를 나타내는 것인 수단;
    (c) 식별 펩타이드의 세트 내의 펩타이드 각각을 이용하여 프로테옴 데이터베이스를 조회하기 위한 수단;
    (d) 인간 프로테옴 데이터베이스 내의 하나 이상의 단백질에 대해 식별 펩타이드의 세트 내의 펩타이드 각각을 정렬하기 위한 수단; 및
    (e) 프로테옴 데이터베이스로부터 확인된 단백질 각각에 대한 관련성 스코어 및 순위를 얻기 위한 수단
    을 포함하고, 확인된 단백질 각각은 자가면역 질환에 대한 후보 바이오마커인, 자가면역 질환에 대한 적어도 하나의 후보 바이오마커를 확인하기 위한 키트.
  125. 제124항에 있어서, 중첩 스코어를 얻기 위한 수단을 추가로 포함하고, 상기 스코어는 펩타이드 라이브러리의 펩타이드 조성을 보정하는 것인 키트.
  126. 제124항에 있어서, 상기 식별 펩타이드의 세트를 확인하기 위한 수단은
    (i) 상이한 펩타이드의 어레이에 대한, 자가면역 질환을 갖는 복수의 대상체 유래의 샘플에 존재하는 항체의 결합을 검출하여 제1 결합 신호 조합을 얻기 위한 수단;
    (ii) 펩타이드의 동일한 어레이에 대한 항체의 결합을 검출하여 제2 결합 신호 조합을 얻기 위한 수단으로서, 상기 항체는 대상체의 2개 이상의 기준 그룹 유래의 샘플에 존재하고, 각각의 그룹은 상기 질환에 대해 혈청 반응 음성인 수단;
    (iii) 상기 제1 결합 신호 조합과 제2 결합 신호 조합을 비교하기 위한 수단; 및
    (iv) 건강한 대상체의 기준 그룹으로부터 자가면역 질환을 갖는 대상체 유래의 샘플 내의 항체에 의해 감별적으로 결합되는 상기 어레이 상의 상기 펩타이드를 확인함으로써, 상기 식별 펩타이드를 확인하기 위한 수단
    을 포함하는 것인 키트.
  127. 제124항에 있어서, 식별 펩타이드의 수는 상기 어레이 상의 펩타이드의 총 수의 적어도 일부에 상응하는 것인 키트.
  128. 제124항에 있어서, 자가면역 질환은 전신 홍반성 루푸스인 키트.
  129. 제124항에 있어서, 상기 적어도 하나의 후보 단백질 바이오마커는 도 17a에 제공된 목록으로부터 선택되는 것인 키트.
  130. 제124항에 있어서, 자가면역 질환은 류머티스성 관절염인 키트.
  131. 제51항에 있어서, 상기 적어도 하나의 후보 단백질 바이오마커는 도 29a에 제공된 목록으로부터 선택되는 것인 키트.
  132. 제1항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 혈액 샘플인 키트.
  133. 제132항에 있어서, 혈액 샘플은 전혈, 혈장, 또는 혈청으로부터 선택되는 것인 키트.
  134. 제1항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 혈청 샘플인 키트.
  135. 제1항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 혈장 샘플인 키트.
  136. 제1항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 건조된 혈액 샘플인 키트.
  137. 제1항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드의 어레이는 적어도 50,000개의 상이한 펩타이드를 포함하는 것인 키트.
  138. 제1항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드 어레이는 적어도 300,000개의 상이한 펩타이드를 포함하는 것인 키트.
  139. 제1항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드 어레이는 적어도 500,000개의 상이한 펩타이드를 포함하는 것인 키트.
  140. 제1항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드 어레이는 적어도 2,000,000개의 상이한 펩타이드를 포함하는 것인 키트.
  141. 제1항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드 어레이는 적어도 3,000,000개의 상이한 펩타이드를 포함하는 것인 키트.
  142. 제1항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드 어레이 상의 상이한 펩타이드는 길이가 적어도 5개의 아미노산인 키트.
  143. 제1항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드 어레이 상의 상이한 펩타이드는 길이가 5개 내지 13개의 아미노산인 키트.
  144. 제1항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 상이한 펩타이드는 20개 미만의 아미노산으로부터 합성되는 것인 키트.
  145. 제1항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 어레이 상의 상이한 펩타이드는 침착되는 것인 키트.
  146. 제1항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 어레이 상의 상이한 펩타이드는 계내에서 합성되는 것인 키트.
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