CN1438324A - 一种寡聚核苷酸微阵列芯片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种寡聚核苷酸微阵列芯片及其制备方法。通过一条通用的寡聚核苷酸片段将寡聚核苷酸探针固定于固体基片上构成微阵列芯片。这条通用的寡聚核苷酸链可以是经过特殊基团修饰(如氨基)，然后与未经任何修饰的寡聚核苷酸探针在离心管中复性，形成双链。最后通过点样装置将其固定于特殊处理的玻璃片或其它材料上(如醛基)构成微阵列芯片。也可以通过原位合成技术将这条通用的寡聚核苷酸合成到玻璃片或其它材料上，然后用点样装置将未经任何修饰的寡聚核苷酸探针点到已合成通用寡聚核苷酸的玻璃片或其它材料上，经复性、清洗，便可制备高通量的微阵列芯片。虽然也用了原位合成技术，但仅仅合成了一条相同的序列，较为简单。
Description
技术领域
本发明涉及一种低成本寡聚核苷酸微阵列芯片的制备方法。通过一条通用的寡聚核苷酸链，将未经任何修饰的寡聚核苷酸探针固定于玻璃片或其它材料上构成微阵列芯片。该技术在保留原有芯片的高通量、方便、适用、可靠性高的基础上，使其成本大大降低。
技术背景
基因芯片是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术。所谓基因芯片就是按特定的排列方式固定有大量基因探针或基因片段的硅片、玻片、塑料片。基因芯片技术是高效地大规模获取相关生物信息的主要手段。目前，该技术应用领域主要有基因表达谱分析、新基因发现、基因突变及多态性分析、基因组文库作图、疾病诊断和预测、药物筛选、基因测序等。九十年代初以美国为主开始进行的各种生物芯片的研制，不到十年的功夫，芯片技术得以迅速发展，并呈现发展高峰。国外的多家大公司及政府机构均对此表现出极大兴趣，并投以可观的财力。
芯片种类较多，制备方法也不尽相同，目前基本上可分为两大类：一类是原位合成；一类是直接点样。原位合成适用于寡核苷酸探针微阵列芯片；直接点样可用于大片段DNA，有时也用于寡核苷酸探针微阵列芯片。
原位合成有三种途径，一是光刻法；二是压电打印法；三是分子印章法。光刻合成技术是由Affymetrix公司开发的，采用的技术原理是在合成碱基单体的5′羟基末端连上一个光敏保护基。合成的第一步是利用光照射使羟基端脱保护，然后一个5′端保护的核苷酸单体连接上去，这个过程反复进行直至合成完毕。但鉴于光刻设备技术复杂，只能有专业化公司生产，加之成本高及合成效率不高的问题，因此还不能被广泛应用。
压电打印法原理与喷墨打印类似，不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基等液体而不是碳粉。喷印头可在整个芯片上移动并根据芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯片上特定位置。该技术采用的化学原理与传统的DNA固相合成一致，因此不需要特殊制备的化学试剂，但工艺还不十分成熟，并且制备的成本很高，目前已被淘汰。
分子印章法是由东南大学吴健雄实验室开发研制的，分子印章技术与上述两种方法在合成原理上相同，区别仅在于该技术利用预先制作的印章将特定的合成试剂以印章印刷的方式分配到支持物的特定区域。后续反应步骤类似与压电打印原位合成技术。上述三种原位合成技术适用于标准化大批量芯片制备，制备工序较为复杂，投资很大。对于小批量专用的生物芯片很难被广泛应用。
与原位合成法比较点样法较灵活和简便。只需将预先制备好的寡核苷酸探针通过自动点样装置点于经特殊处理的玻璃片或其它材料上即可。但是由于每条寡聚核苷酸探针上必须修饰化学活化基团(如氨基)才能固定于特殊处理的玻璃片或其它材料上(如醛基)，而在一条寡聚核苷酸探针修饰一个活化基团目前市场价格为350元。因此，对于密度较高的寡聚核苷酸微阵列芯片，制备成本很高。例如，合成一条30个碱基的寡聚核苷酸探针价格为500元，其中寡聚核苷酸的合成价格仅为150元。对于一块10,000个寡聚核苷酸探针的微阵列芯片，仅仅其寡聚核苷酸探针的合成成本就为500万元。这样高的制备成本大大限制了寡聚核苷酸微阵列芯片的推广应用。
发明内容
本发明的目的是针对上述不足之处提供一种寡聚核苷酸微阵列芯片及其制备方法，该芯片通过一条通用的寡聚核苷酸片段将寡聚核苷酸探针固定于固体基片上无需修饰价格昂贵的化学活性基团，而是在其序列上增加了一段可与设计的通用寡聚核苷酸片段互补的核酸序列，通过与固体基片上的通用寡聚核苷酸片段杂交结合，把特异性的寡聚核苷酸探针固定在芯片的不同位置。该芯片制备简单、结果可靠、使用方便、且成本大大降低。
技术方案：通过一条通用的寡聚核苷酸链，将未经任何修饰的寡聚核苷酸探针固定于玻璃片或其它材料上构成微阵列芯片。这条通用的寡聚核苷酸链可以是经过特殊基团修饰(如氨基)，然后与未经任何修饰的寡聚核苷酸探针在离心管(Eppendorf管)中复性，形成双链。最后通过点样装置将其固定于特殊处理的玻离片或其它材料上(如醛基)构成微阵列芯片。也可以通过原位合成技术将这条通用的寡聚核苷酸合成到玻离片或其它材料上，然后用点样装置将未经任何修饰的寡聚核苷酸探针点到已合成通用寡聚核苷酸的玻离片或其它材料上，经复性、清洗，便可制备高通量的微阵列芯片。虽然也用了原位合成技术，但仅仅合成了一条相同的序列，较为简单。
一种寡聚核苷酸微阵列芯片，其特征在于在固体基片上有化学活性基团；在有化学活性基团的基片(部分或全部)表面上化学共价连接有一大于10个碱基的通用的寡聚核苷酸片段；通过寡聚核苷酸片段将未经任何修饰的寡聚核苷酸探针固定于基片上，该寡聚核苷酸探针至少含有两部分序列：一为与通用的寡聚核苷酸片段互补的序列，另一为与被检测的目的基因序列互补的序列。寡聚核苷酸探针是一组针对多个不同的目的基因序列互补的寡聚核苷酸片段，不同的目的基因互补的寡聚核苷酸探针位于基片的不同位置。
一种寡聚核苷酸微阵列芯片制备方法为：(1)制备一条大于10个碱基的通用的寡聚核苷酸片段，其序列的任意一端修饰有一个化学活化基团；(2)制备若干寡聚核苷酸探针，其一端包含与上述通用的寡聚核苷酸片段互补序列、另一端包含与目的基因互补的序列；(3)将上述制备的针对不同目的基因的寡聚核苷酸探针与通用的寡聚核苷酸片段进行杂交，制备一组分别包含不同寡聚核苷酸探针的点样液；(4)将上述点样液分别点在固体基片的不同地方，共价固定于基片上，制备成寡聚核苷酸微阵列芯片。
另一种寡聚核苷酸微阵列芯片制备方法为：(1)通过原位合成技术在技术在基片上合成一条大于10个碱基的通用的寡聚核苷酸片段；(2)制备若干寡聚核苷酸探针，其一端包含有与上述通用的寡聚核苷酸片段互补的序列、另一端包含与目的基因序列互补的序列；(3)分别将上述含有不同的目的基因的寡聚核苷酸探针溶液点在固体基片的不同地方；(4)通过复性杂交将这些寡聚核苷酸探针固定于基片上，制备成寡聚核苷酸微阵列芯片。
通用的寡聚核苷酸片段具有化学活化基团氨基、巯基、醛基、氰基。制备芯片所用的基片是玻璃、硅片、凝胶、固体基板、薄膜。制备芯片所用的基片经过醛基、巯基基团修饰。
有益效果：本发明仅仅通过一条带有化学活性基团的通用寡聚核苷酸片段，就可以将大量的未经任何修饰的寡聚核苷酸探针固定于玻离片或其它材料上构成微阵列芯片。这种方法既可以避免原位合成技术所带来的工序复杂、较难广泛应用，也可以避免点样法所带来的高成本。该技术在保留原有芯片的高通量、方便、适用、可靠性高的基础上，可以使芯片的制备成本降低70％以上。
附图说明
以下将结合附图对本发明进一步说明。
图1为本发明实施例1的流程图。
图2为本发明实施例2的流程图。
1、通用寡聚核苷酸片段；2、寡聚核苷酸探针；3、通用寡聚核苷酸互补序列；4、目的基因互补序列；5、基片。
具体实施方式
参照附图1、2一种寡聚核苷酸微阵列芯片，在固体基片5上有化学活性基团；在有化学活性基团的基片5(部分或全部)表面上化学共价连接有一大于10个碱基的通用的寡聚核苷酸片段3；通过寡聚核苷酸片段3将未经任何修饰的寡聚核苷酸探针2固定于基片5上，该寡聚核苷酸探针2至少含有两部分序列：一为与通用的寡聚核苷酸片段的互补序列3，另一为与被检测的目的基因序列互补序列4。寡聚核苷酸探针是一组针对多个不同的目的基因序列互补的寡聚核苷酸片段，不同的目的基因互补的寡聚核苷酸探针2位于基片5的不同位置。
实施例1：参照附图1一种寡聚核苷酸微阵列芯片的制备方法。具体如下：1、合成一条带有特殊基团标记的通用寡聚核苷酸1(如氨基或巯基等)；2、合成未经任何基团修饰的寡聚核苷酸探针2，该探针包括两部分(通用寡聚核苷酸互补区3和探针特异区4)，探针特异区序列是根据我们需要自行设计；3、将通用寡聚核苷酸1分别与不同的寡聚核苷酸探针2在离心管(Eppendorf管)中等比例混合；4、将上述的Eppendorf管在沸水中放置2分钟～5分钟，然后自然冷却到室温，使其复性。5、通过点样装置将复性产物点到事先处理好的基片5上(如醛基或巯基化玻璃片)构成寡聚核苷酸微阵列。
实施例2：参照附图2另一种寡聚核苷酸微阵列芯片的制备方法。具体如下：1、利用原位合成技术在基片5(如玻璃片或其它材料)上合成一条通用的寡聚核苷酸序列1；2、合成未经任何基团修饰的寡聚核苷酸探针2，该探针包括两部分(通用寡聚核苷酸互补序列3和目的基因互补序列4)，目的基因互补序列4是根据我们需要自行设计；3、通过点样装置将寡聚核苷酸探针2点到上述的基片上构成微阵列芯片；4、将点样后的芯片放置在湿润的杂交盒中，42℃～62℃复性4小时；5、用0.1％的十二烷基硫酸钠(SDS)去除未结合的寡聚核苷酸探针2，然后用双蒸水彻底清洗，干燥后待用。
Claims (7)
1、一种寡聚核苷酸微阵列芯片，其特征在于在固体基片上有化学活性基团；在有化学活性基团的基片的部分或全部表面上化学共价连接有一大于10个碱基的通用的寡聚核苷酸片段；通过寡聚核苷酸片段将未经任何修饰的寡聚核苷酸探针固定于基片上，该寡聚核苷酸探针至少含有两部分序列：一为与通用的寡聚核苷酸片段互补的序列，另一为与被检测的目的基因序列互补的序列。
2、根据权利要求1所述的一种寡聚核苷酸微阵列芯片，其特征在于寡聚核苷酸探针是一组针对多个不同的目的基因序列互补的寡聚核苷酸片段，不同的目的基因互补的寡聚核苷酸探针位于基片的不同位置。
3、权利要求1所述的一种寡聚核苷酸微阵列芯片制备方法，其特征在于(1)制备一条大于10个碱基的通用的寡聚核苷酸片段，其序列的任意一端修饰有一个化学活化基团；(2)制备若干寡聚核苷酸探针，其一端包含与上述通用的寡聚核苷酸片段互补序列、另一端包含与目的基因互补的序列；(3)将上述制备的针对不同目的基因的寡聚核苷酸探针与通用的寡聚核苷酸片段进行杂交，制备一组分别包含不同寡聚核苷酸探针的点样液；(4)将上述点样液分别点在固体基片的不同地方，共价固定于基片上，制备成寡聚核苷酸微阵列芯片。
4、根据权利要求1所述的一种寡聚核苷酸微阵列芯片，其制备方法为(1)通过原位合成技术在基片上合成一条大于10个碱基的通用的寡聚核苷酸片段；(2)制备若干寡聚核苷酸探针，其一端包含有与上述通用的寡聚核苷酸片段互补的序列、另一端包含与目的基因序列互补的序列；(3)分别将上述含有不同的目的基因的寡聚核苷酸探针溶液点在固体基片的不同地方；(4)通过复性杂交将这些寡聚核苷酸探针固定于基片上，制备成寡聚核苷酸微阵列芯片。
5、根据权利要求1或2所述的一种寡聚核苷酸微阵列芯片及其制备方法，其特征是通用的寡聚核苷酸片段具有化学活性基团氨基、巯基、醛基、氰基。
6、根据权利要求1、2或3所述的一种寡聚核苷酸微阵列芯片及其制备方法，其特征是制备芯片所用的基片是玻璃、硅片、凝胶、固体基板、薄膜、微球。
7、根据权利要求1、2或4所述的一种寡聚核苷酸微阵列芯片及其制备方法，其特征是制备芯片所用的基片经过醛基、巯基基团修饰。
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