CN1142292C - 双链核酸微阵列芯片制备方法 - Google Patents

Abstract

双链核酸微阵列芯片制备方法是一种由单链寡核苷酸制备双链核酸微阵列芯片的方法。该方法制备双链核酸微阵列时先将固相化学合成的3′端含有两段反向互补序列的单链寡核苷酸片段转移到固相支持物表面，经5′端连接在固相支持物表面形成单链寡核苷酸微阵列，再将两反向互补序列退火形成发夹结构提供引物，依靠核酸聚合酶聚合反应填平单链寡核苷酸片段的剩余单链部分，从而在固相支持物表面形成完整的双链核酸分子，成为双链核酸微阵列芯片。本发明制备的双链核酸微阵列芯片可用于高通量检测双链核酸如dsDNA与蛋白质等生物分子的相互作用，在基础分子生物学研究和核酸结合药物的筛选中有广泛的应用价值。

Description

双链核酸微阵列芯片制备方法

一、技术领域：

本发明是生物医学领域中制备微阵列芯片的方法，尤其是一种由单链寡核苷酸制备双链核酸微阵列芯片的方法。

二、背景技术：

生物芯片主要是指在固相支持物上组装的核酸、蛋白质、细胞、微小组织等生物活性物质构成的微阵列。应用生物芯片可实现对待检样品中目标核酸分子、蛋白质分子、细胞、微小组织等物质的有无及多少进行准确、快速、大信息量检测。具有微型化、高通量和自动化的检测特征。生物芯片在生物检测、医学检测及疾病诊断、药物筛选和基因序列分析上有着极其重要的应用价值意义，因此受到广泛关注和投资，使其已经成为一个全球性的新型产业，即生物芯片产业。

目前生物芯片的研究和开发种类逐渐趋于多样化，包括最初开发并广泛应用的基因芯片、暂露头角却气势逼人的蛋白质芯片、具有生命特色的细胞芯片和组织芯片。基因芯片和蛋白质芯片能够在转录和翻译两个层面上实现对基因表达的检测，在基因组和蛋白质组的研究中已经成为极其重要的技术平台，同时对医学临床诊断、新药筛选、疗效分析等生物医学领域产生了革命性的影响。

从构成上来说，基因芯片和蛋白质芯片分别由单链DNA寡核苷酸分子和蛋白质分子构成，因此基因芯片只能依靠核酸分子之间的杂交检测经核酸扩增后的样品中目标单链DNA分子的有无及多少，蛋白质芯片主要通过蛋白质与样品中靶蛋白分子的识别及结合检测靶蛋白分子的有无及多少。因此基因芯片不能检测蛋白质，蛋白质芯片也难于检测DNA，这限制了运用DNA芯片直接对蛋白质的检测，而DNA与蛋白质的识别及相互作用在基因组稳定性维持及基因的表达调节中发挥极其重要的作用。传统分子生物学中用来研究DNA与蛋白质相互作用的常规方法主要是凝胶迁移实验(gel shift mobility assay)，但这种方法对实验样品数量需求大、实验耗时长、分析效率低，而且存在放射性标记对实验人员及环境的危害。

双链核酸微阵列芯片是一种生物芯片。双链核酸微阵列芯片能够克服单链核酸微阵列不能检测蛋白质的缺陷，因为DNA结合蛋白常常识别和结合的是双链DNA，籍此在基因的表达调控中发挥重要作用。双链核酸微阵列芯片的制备是这种芯片应用的关键。Lockhart等最早在1996年就提出在固相介质上制备双链DNA探针分子的方法(US patent No.5,556,752)，其基本方法是将两段碱基互补的寡核苷酸运用连接分子连接在一起，将一段固定到固相介质上，通过退火使两段碱基互补的寡核苷酸复性，形成带有突环的双链核酸单分子，用于检测DNA结合生物分子；这一方法由于化学合成两段寡核苷酸，因此生产效率低，成本较高。Bulyk等在1999年最早提出双链核酸微阵列芯片概念，并运用核酸聚合酶引物延伸方法制备双链核酸微阵列(US.Pat.6,326,489)。其主要内容是首先在玻片上通过光刻掩膜原位合成单链寡核苷酸微阵列，合成的每条单链寡核苷酸靠近玻片的3′含有通用引物退火序列，单链寡核苷酸微阵列与通用引物退火后，进行聚合酶引物延伸反应，合成第二链核酸，从而形成双链核酸微阵列。这一方法的缺点是需要在固相介质表面合成含有引物结合位点的较长的寡核苷酸，不利于降低生产成本。由于受到知识产权的保护不能在我国进行商业开发应用。

三、发明内容：

(1)发明目的

本发明的目的是提供一种便于在普通设备条件制备双链核酸微阵列的方法，而且制备成本较低、芯片双链核酸的碱基错配率较单纯互补单链核酸复性制备双链核酸的方法低。可以用来生产价值更大的单碱基突变双链核酸微阵列芯片的双链核酸微阵列芯片制备方法

(2)技术方案

本发明是双链核酸微阵列芯片的制备方法，其特征在于该制备方法包括如下步骤：(a)将化学合成的固定的单链寡核苷酸片段通过其5′端连接到固相支持物表面，形成单链寡核苷酸微阵列；固定的单链寡核苷酸片段在其自由3′端含有两段反向碱基互补序列；(b)固定的单链寡核苷酸片段其自由3′端两段反向碱基互补序列退火，在单链寡核苷酸片段3′端形成一发夹结构；(c)核酸聚合酶以发夹结构为引物进行核苷酸聚合反应，填平固定的单链寡核苷酸片段的剩余单链部分，在支持物表面合成完整双链核酸分子，使单链寡核苷酸微阵列成为双链核酸微阵列；固定的单链寡核苷酸片段其自由3′端与固相支持物表面不连接，处于自由状态；固定的单链寡核苷酸片段3′端两段反向碱基互补序列退火形成发卡结构；这一发卡结构为一段较短的双链寡核苷酸片段，它只拥有一开放状态的3′端，且3′端为羟基；退火形成的发卡结构充当核酸聚合反应的引物，在被核酸聚合酶识别结合，启动核苷酸聚合反应，填平固定的单链寡核苷酸片段的剩余单链部分，从而将制备的单链寡核苷酸微阵列转变为双链寡核苷酸微阵列；固定的单链寡核苷酸片段包括核糖核酸和脱氧核糖核酸两类核酸；用于进行核苷酸聚合反应的核酸聚合酶包括核糖核酸聚合酶、脱氧核糖核酸聚合酶及反转录酶；用于进行核苷酸聚合反应的核苷酸包括所有核糖核苷酸、所有脱氧核糖核苷酸及特殊稀有核苷酸；用于固定单链寡核苷酸的固相支持物包括拥有刚性和半刚性表面的材料。

(3)技术效果

本发明提出的双链核酸微阵列芯片制备方法在标准化、批量化生产上具有三点重要价值：一是提出的双链核酸微阵列芯片制备方法依靠固定的单链核酸本身含有的反向互补序列退火形成发卡结构提供引物，通过聚合酶引物延伸合成双链核酸，不需要任何额外合成序列较长的第二分子引物或更长的全序列互补单链核酸与固定的微阵列单链核酸退火杂交，降低了生产成本；本发明提出的双链核酸微阵列生产中，只需要化学合成单链核酸即可，其余互补核酸通过价格低廉的聚合酶发卡结构引物延伸反应就合成，这对较长序列的双链核酸微阵列生产尤其重要；二是本发明提出发卡结构提供引物通过引物聚合酶延伸合成双链核酸的方法，由于核酸聚合酶的保真性、进行性较化学合成的高，因此对于较长或含有简并核苷酸的核酸片段合成具有重要意义；三是本发明提出的双链核酸微阵列合成方法，能够保证合成的双链核酸中极低的碱基错配率，这对于生产具有更大商业价值的单碱基突变双链核酸微阵列芯片具有非常重要的价值；这一方法能够克服高价合成一套与在片合成的微阵列单链核酸互补的单链核酸却不能通过杂交复性的方法生产具有单碱基突变特征的双链核酸微阵列芯片的致命缺陷。

本发明提出的双链核酸微阵列芯片制备方法对DNA结合蛋白的研究尤其具有重要价值。DNA与蛋白质的相互作用在基因组稳定性维持及基因表达调控中发挥着极其重要的作用，特别是序列特异性DNA结合蛋白，这类蛋白质虽然只占细胞核总蛋白的不到0.1％，但这类蛋白质常常是包括转录因子在内的调控基因以一定的时空性、数量性表达的重要反式作用因子，它们通过自己特殊的结构如亮氨酸拉链、锌指结构等基因组中序列特异性双链DNA识别结合，精确调节一类功能相关基因的表达，因此对这类蛋白质及其特异性识别结合的DNA位点的研究在分子生物学、基因组学及目前已成为重点研究对象的蛋白质组学中都占据非常重要的地位。然而对这类蛋白质及其特异性识别结合的DNA位点的研究目前除了传统分子生物学中发展的凝胶迁移实验、DNA酶I足迹实验等方法外，没有一种高通量的标准化筛选方法，且目前已经发展的单链DNA基因芯片及蛋白质芯片都难以进行这类蛋白质的高效筛选及鉴定。本发明提出的双链DNA微阵列及其制备方法就是专门用来填补这一缺陷，进行细胞核全蛋白组范围内筛选序列特异性DNA结合蛋白及其DNA识别位点的研究方法。这一研究平台的建立，对于研究如下课题具有重要价值。

一是运用本发明提出的双链核酸微阵列及其制备方法可以通过基因芯片点样仪标准化高效制备出某种序列特异性双链DNA结合蛋白如NF-kB的低密度全套单碱基突变双链DNA微阵列芯片，这种芯片与荧光基团标记的对应序列特异性双链DNA结合蛋白如NF-kB反应，通过标准化基因芯片扫描仪对杂交信号的获取的分析，就能够获得这种DNA结合蛋白识别及结合的序列特异性双链DNA位点的碱基构成特点，发现那些参与DNA与蛋白质识别及结合的最关键的碱基及其作用规律。

二是运用本发明提出的双链核酸微阵列及其制备方法可以通过机器点样制备出含有6～10碱基所有可能组合的功能序列的高密度双链DNA微阵列芯片，如含有8碱基所有可能组合功能序列的66536个双链探针的双链DNA微阵列、含有10碱基所有可能组合功能序列的1048576个双链探针的双链DNA微阵列，运用这样一个双链DNA微阵列芯片与某种细胞全细胞核蛋白进行反应，就可以获得某种细胞全细胞核蛋白中所有可能的序列特异性DNA结合蛋白对芯片上其DNA结合序列的识别及结合信息，从而扫描出芯片上存在的所有可能的DNA结合蛋白识别的DNA位点，同时扫描出与芯片上DNA位点结合的所有可能的DNA结合蛋白。这对于高通量筛选DNA结合蛋白及DNA结合蛋白DNA识别位点非常有价值。

三是运用本发明提出的双链核酸微阵列及其制备方法可以通过点样制备出适当密度但含有目前已研究发现的所有DNA结合蛋白结合位点DNA片段的双链DNA微阵列芯片，通过与处于不同器官组织、不同发育阶段、不同病理状态等的细胞全细胞核蛋白杂交反应，就可以获得与双链DNA微阵列芯片上所有DNA结合的DNA结合蛋白在不同器官组织、不同发育阶段、不同病理状态等细胞中的表达信息，从而揭示它们的功能和相互关系；这种数据信息若结合常规表达型基因芯片的基因表达信息，就可以获得某种DNA结合蛋白参与调控的所有可能的基因，并可将不同的基因进行功能归类，理顺基因表达的相互关系，这对于研究生物的发育、病理及分子医学诊断、治疗、新药开发等重大生物学问题具有非常重要的价值。

本发明创立的独特的双链核酸微阵列(芯片)制备方法可以精确、高效、经济地在固相支持物如玻片上合成双链核酸微阵列，这种双链核酸微阵列不但其制备基础与国内外基因芯片制备技术完全兼容，而且在应用中与通用基因表达芯片的反应、检测设备完全兼容，提高了该发明产品的使用简便性。

因此本发明提出一种新的双链核酸微阵列芯片制备方法，这种方法不需要在片原位合成的复杂过程，只需要化学合成一条单链核酸分子，通过点样制作成单链核酸微阵列，再通过一个复性和聚合酶延伸反应，就可以将单链核酸微阵列转变成双链核酸微阵列，不仅便于普通设施条件下制备双链核酸微阵列，而且制备成本较低、芯片双链核酸的碱基错配率较单纯地互补单链核酸复性制备双链核酸的方法低。最重要的是这种双链核酸微阵列制备方法可以用来生产价值更大的单碱基突变双链核酸微阵列芯片，而这是依靠单纯地互补单链核酸复性制备双链核酸的方法不能解决的。

四、附图说明：

图1是化学合成后将被固定在固相支持物表面的单链寡核苷酸片段。其中包括反向互补序列S1、S2。

图2是通过5′固定在固相支持物表面的单链寡核苷酸片段。

图3是3′反向碱基互补序列退火形成发卡结构及核酸聚合酶结合3′羟基。

图4是核酸聚合酶延伸反应填平单链寡核苷酸片段的剩余单链部分。

图5是核酸聚合酶延伸反应终止后形成的双链核酸阵列。

图6是用于合成双链DNA微阵列的单链寡核苷酸的基本构件。

图7是Cy3标记dATP渗入双链DNA微阵列合成及酶切实验。

图8是Cy3标记NF-kB与双链DNA微阵列杂交及酶切实验。

五、具体实施方式

1、固相支持物的准备

用做固定本发明双链核酸微阵列的固相支持物包括生物和非生物的、有机和无机的材料，或者这些材料的复合物。这些材料可能以微粒、线状、沉淀物、凝胶、薄片、管道、球体、容器、毛细管、衬垫、切片、薄膜、盘片、玻片的状态存在，但更适宜采用盘片、玻片、小珠、小球、圆盘等方便的形状。固相支持物材料最好至少有一面充分平坦。固相支持物也可选择其他表面形状，如表面有或凹或凸的区域以便在上面进行合成反应。有时选择适当的固相支持物用以提供适当的光吸收特性，如支持物可能是聚合的LB膜、功能化的玻璃、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO2、SiN4、修饰的硅或任何种类的凝胶体、聚合物如(聚)四氟乙烯((poly)tetrafluoroethylene)，(聚)偏二氟乙烯((poly)vinylidendifluoride)，聚苯乙烯(polystyrene)，聚碳酸酯(polycarbonate)或它们的联合物；固相支持物表面最好含有活性基团如羧基、氨基、羟基、硫醇基等类似基团。另外固相支持物表面最好是光学透明并有如硅材料表面那样的Si--OH表面。

2、单链寡核苷酸的化学合成

依据具体应用所需要的核酸序列设计单链寡核苷酸，并在其3′端包含两段适宜长度的反向碱基互补序列(图1：S1、S2)，采用商业化固相化学合成的程序合成设计好的单链寡核苷酸。合成合成后在单链寡核苷酸5′端连接与固相支持物表面活性基团能够进行化学反应而连接到一起的化学基团，如氨基等，3′端为羟基基团。如图1。

3、单链寡核苷酸在固相支持物表面的固定

固相化学合成的单链寡核苷酸合成后通过机器、手工或电泳等适当方式转移到固相支持物表面，在适当条件下单链寡核苷酸连接到固相支持物表面。如图2。

4、单链寡核苷酸3′端反向互补序列退火复性形成发卡结构

经3中固定单链寡核苷酸的固相支持物在重蒸水中100℃煮沸5分钟，氮气吹干后，加适宜温度预热的核酸杂交缓冲液，在适宜温度杂交适当时间。如图3。

5、寡核苷酸发卡结构3′端羟基与核酸聚合酶结合

经4中处理的固相支持物用重蒸水简单洗涤除去杂交缓冲液后，加所需核苷酸及核酸聚合酶后，在适宜温度反应适当时间。如图4。

6、终止聚合反应，形成包括原发卡结构在内的完整双链DNA片段

经5中聚合酶聚合反应后的固相支持物依次用2×SSD、0.1％SDS和0.2×SSD、0.1％SDS洗涤，最后用重蒸水简单洗涤，置4℃保存备用。如图5。

设计和合成含有下列构件成分的单链寡核苷酸DNA片段进行本发明双链核酸微阵列芯片的可行性验证实验：

5′NH₂----4碱基近端旁序列----4碱基HaeIII酶切位点----10碱基DNA结合蛋白NF-kB结合位点(功能序列)----4碱基远端旁序列----5碱基发卡结构序列1(反向互补序列1)----2个无关碱基间隔序列(发卡环序列)----5碱基发卡结构序列2(反向互补序列2)----3′羟基(OH)。

运用这种单链寡核苷酸进行如下两个实验。

本发明荧光标记(Cy3)ATP渗入法征实聚合酶对第二链的合成

(1)将上面合成的单链寡核苷酸借助5′NH₂点样连接到硅烷化戊二醛处理的玻片上形成3×3阵列，4℃过夜后用硼氢化钠浸泡封闭，再用重蒸水洗涤玻片。

(2)将玻片沸水中煮沸5分钟，冷却至55℃后吹干，迅速在单链寡核苷酸微阵列处滴加55℃预热的核酸杂交缓冲液，盖玻片覆盖后，玻片放湿盒内在55℃水浴保温2小时。

(3)用重蒸水简单洗涤除去杂交缓冲液，玻片寡核苷酸微阵列处滴加含dGTP、dCTP、dTTP、Cy3-dATP及DNA聚合酶(Klenow酶)的聚合反应缓冲液，盖玻片覆盖后，玻片放湿盒内置37℃水浴保温2小时。

(4)用重蒸水简单洗涤除去聚合反应缓冲液，吹干玻片后基因芯片扫描仪中扫描。

(5)将扫描后的玻片取出后，在玻片寡核苷酸微阵列处滴加HaeHI及其酶切缓冲液，盖玻片覆盖后，玻片放湿盒内在37℃水浴保温2小时。

(6)用重蒸水简单洗涤除去聚合反应缓冲液，吹干玻片后基因芯片扫描仪中扫描。

荧光标记(Cy3)NF-kB与双链DNA微阵列结合证实本发明制备的双链DNA微阵列与DNA结合蛋白识别结合的可行性

(1)将上面合成的单链寡核苷酸借助5′NH₂点样连接到硅烷化戊二醛处理的玻片上形成3×3阵列，4℃过夜后用硼氢化钠浸泡封闭，再用重蒸水洗涤玻片。

(2)将玻片沸水中煮沸5分钟，冷却至55℃后吹干，迅速在单链寡核苷酸微阵列处滴加55℃预热的核酸杂交缓冲液，盖玻片覆盖后，玻片放湿盒内在55℃水浴保温2小时。

(3)用重蒸水简单洗涤除去杂交缓冲液，在玻片寡核苷酸微阵列处滴加含dGTP、dCTP、dTTP、dATP及DNA聚合酶(Klenow酶)的聚合反应缓冲液，盖玻片覆盖后，玻片放湿盒内置37℃水浴保温2小时。

(4)用重蒸水简单洗涤除去聚合反应缓冲液，甩干玻片后在玻片寡核苷酸微阵列处滴加含Cy3标记的NF-kB及DNA结合缓冲液，盖玻片覆盖后，玻片放湿盒内置25℃水浴保温30分钟。

(5)用重蒸水简单洗涤除去结合反应缓冲液，吹干玻片后基因芯片扫描仪中扫描。

(6)将扫描后的玻片取出后，在玻片寡核苷酸微阵列处滴加HaeIII及其酶切缓冲液，盖玻片覆盖后，玻片放湿盒内在37℃水浴保温2小时。

(7)用重蒸水简单洗涤除去聚合反应缓冲液，吹干玻片后基因芯片扫描仪中扫描。

Claims (8)

1、一种双链核酸微阵列芯片制备方法，其特征在于该制备方法包括如下步骤：

(a)将化学合成的单链寡核苷酸片段通过其5′端连接到固相支持物表面，形成单链寡核苷酸微阵列；固定的单链寡核苷酸片段在其自由3′端含有两段反向碱基互补序列；

(b)固定的单链寡核苷酸片段其自由3′端两段反向碱基互补序列退火，在单链寡核苷酸片段3′端形成一发夹结构；

(c)核酸聚合酶以发夹结构为引物进行核苷酸聚合反应，填平固定的单链寡核苷酸片段的剩余单链部分，在支持物表面合成完整双链核酸分子，使单链寡核苷酸微阵列成为双链核酸微阵列。

2、根据权利要求1所述的双链核酸微阵列芯片制备方法，其特征在于固定的单链寡核苷酸片段其自由3′端与固相支持物表面不连接，处于自由状态。

3、根据权利要求1所述的双链核酸微阵列芯片制备方法，其特征在于固定的单链寡核苷酸片段3′端含有两段反向碱基互补序列，它们能够退火形成发卡结构；这一发卡结构为一段较短的双链寡核苷酸片段，它只拥有一开放状态的3′端，且3′端为羟基。

4、根据权利要求1或3所述的双链核酸微阵列芯片制备方法，其特征在于退火形成的发卡结构能够充当核酸聚合反应的引物，可被核酸聚合酶识别结合，启动核苷酸聚合反应，填平固定的单链寡核苷酸片段的剩余单链部分，从而将制备的单链寡核苷酸微阵列转变为双链寡核苷酸微阵列。

5、根据权利要求1所述的双链核酸微阵列芯片制备方法，其特征在于固定的单链寡核苷酸片段包括核糖核酸和脱氧核糖核酸两类核酸。

6、根据权利要求1所述的双链核酸微阵列芯片制备方法，其特征在于用于进行核苷酸聚合反应的核酸聚合酶包括核糖核酸聚合酶、脱氧核糖核酸聚合酶及反转录酶。

7、根据权利要求1所述的双链核酸微阵列芯片制备方法，其特征在于用于进行核苷酸聚合反应的核苷酸包括所有核糖核苷酸、所有脱氧核糖核苷酸及特殊稀有核苷酸。

8、根据权利要求1所述的双链核酸微阵列芯片制备方法，其特征在于用于固定单链寡核苷酸的固相支持物包括拥有刚性和半刚性表面的材料。

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