CN1590559A - 一种单分子dsDNA微阵列芯片制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种新的在固相支持物表面制备单分子(unimolecular)双链脱氧核糖核酸(double－stranded DNA，dsDNA)微阵列(microarray)的方法。该方法首先用固相化学合成两条寡核苷酸，一条为靶寡核苷酸(target oligonucleotide)，另一条为通用寡核苷酸(universaloligonucleotide)；其中靶寡核苷酸从5′端到3′端含有如下构件：反向互补序列、蛋白质结合位点和通用寡核苷酸互补序列；通用寡核苷酸的5′端修饰特定化学基团，以便将DNA连接固定到固相支持物表面，3′端为羟基。芯片制备时，首先将靶寡核苷酸和通用寡核苷酸复性，将复性产物点印连接到固相支持物表面，制成寡核凸酸微阵列；对寡核苷酸微阵列进行在片(on－chip)DNA聚合酶延伸反应，使寡核苷酸微阵列成为双分子(bimolecular)dsDNA微阵列；将微阵列变性处理，使其成为单链DNA(single－stranded DNA，ssDNA)微阵列；将ssDNA微阵列进行DNA复性处理，使单链DNA自由3′端形成发卡(hairpin)结构；最后对复性的ssDNA微阵列再进行在片DNA聚合酶延伸反应，使ssDNA微阵列成为单分子(unimolecular)dsDNA微阵列。本发明制备的单分子dsDNA微阵列芯片，在基础分子生物学研究，特别是基因表达调控研究及生物医学研究，如DNA结合蛋白相关疾病诊断、药物作用机理和药物性分子筛选研究中有广泛的应用价值。

Description

一种单分子dsDNA微阵列芯片制备方法

一、技术领域：

本发明提出一种新的在固相支持物(solid sustracts)上制备单分子双链脱氧核糖核酸微阵列(unimolecular dsDNA microarray)的技术方法，所制备的单分子dsDNA微阵列芯片，在基础分子生物学及生物医学领域中具有重要的应用价值。在基础分子生物学研究中，本发明制备的单分子dsDNA微阵列芯片可以作为高通量(high throughput)鉴定DNA结合蛋白(DNA-binding proteins)的DNA结合靶点、筛选及检测DNA结合蛋白、分析DNA结合蛋白与其DNA结合靶点相互作用等的技术平台；在生物医学研究中，本发明制备的单分子dsDNA微阵列芯片可以作为DNA结合蛋白相关疾病辅助诊断、药物作用机理研究、药物有效成分筛选等的技术平台。

二、背景技术：

DNA/蛋白质的相互作用在基因组染色体结构维护等细胞结构和功能活动中担负重要作用，特别是序列特异性DNA/蛋白质相互作用(Sequence-specific DNA/protein interaction)在基因表达调控(gene expression regulation)和DNA重组(recombination)、限制(restriction)及复制(replication)等细胞功能中发挥极其重要的作用，因此DNA/蛋白质的相互作用是生物化学、分子生物学和生物物理学研究的重要内容，序列特异性DNA结合蛋白也是目前功能基因组(functional genome)和蛋白质组(proteome)研究的重要内容。因此，研究DNA/蛋白质相互作用的方法一直受到重视，并逐渐发展了多种研究技术，包括硝酸纤维素结合分析(Nitrocellulose-binding Assays)、凝胶迁移实验(Gel Mobility-shift Analysis)、酶联免疫吸附分析(ELISA)、Southwestern印记(Southwestern blotting)、报告构体(Reporter Construct)，染色体免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP)，噬菌体展示(Phage Display)，结合位点签名(Binding-site Signatures)，体外选择(in-vitro selection)，紫外交联(UVCrosslinking)，甲基化干扰分析(Methylization Interfering Assay)，X-射线晶体衍射(X-rayCrystallography)，原子力显微镜(Atomic Force microscopy，AFM)，表面激元共振(SurfacePlasmon Resonance，SPR)，毛细管电泳(Capillary Electrophoresis，CE)，扫描力显微镜(ScanningForce Microscopy，SFM)，脱氧核糖核酸酶足迹法(DNasel footprinting)，荧光足迹法(Fluorescence Footprinting)，荧光各向异性(Fluorescence Anisotropy)，荧光共振能量传递(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)等，这些技术方法能够非常有效地反应DNA/蛋白质相互作用的某一方面的特征，至今在实验研究中发挥重要作用；但这些方法都存在对实验样品消耗多、实验耗时长、分析效率低或存在放射性标记对实验人员及环境的危害等缺点，而且难以高通量获取DNA/蛋白质相互作用的生物信息。因此建立一种高通量的DNA/蛋白质相互作用的研究方法非常必要。

生物芯片技术是近几年迅速崛起的一项极其重要的生物技术，它以微型化、平行化及自动化等技术特点，成为目前最有效地高通量获取生物信息的前沿技术。特别是生物分子、细胞或组织构成的微阵列芯片，在检测生物信号领域得到迅速地应用，尤其以基因芯片应用最数深入广泛。微阵列芯片高通量获取生物信息的特点为建立高通量DNA/蛋白质相互作用研究的新方法提供了新的技术思路。但由于分子生物学中发挥许多重要生物学作用的序列特异性DNA蛋白质相互作用都发生在基因组双链DNA与蛋白质分子之间，因此用于DNA多态性、DNA测序和基因表达研究的常规单链DNA微阵列芯片，都不能直接用于序列特异性DNA/蛋白质相互作用的研究。于是如何在固相载体表面制备双链DNA微阵列就成为科学家关注的焦点。在这一背景下，双链DNA(dsDNA)微阵列芯片应运而生，由于dsDNA微阵列芯片表面的分子探针为双链DNA，在分子结构上满足了细胞自然状况下DNA/蛋白质相互作用分子结构特征，因此dsDNA微阵列芯片成为目前高通量获取DNA/蛋白质相互作用生物信息的重要技术平台。

Lockhart最早(1996)提出在固相基质表面制备由大量不同的单分子(unimolecular)dsDNA构成的核酸阵列(“library comprising a plurality of different members of unimolecular，double-stranded oligonucleotides on a solid support”)，使之用于筛选生物样品中肽、蛋白质等分子与阵列上的dsDNA相互作用的新思想和新方法(US.Pat.5556752)。该方法在固相基质表面原位合成或点样制备较长的单链寡核苷酸(ssDNAs)，这些单链寡核苷酸包含两段反向互补序列，通过链内退火形成“茎—环”(Stem-loop)结构，其中“茎”部dsDNA可用于检测DNA结合蛋白。Lockhart技术的重要贡献是最早将DNA微阵列技术引入到高通量检测DNA/蛋白质相互作用的研究领域，但他提出的dsDNA阵列制备方法在应用中却存在严重的技术和经济问题，其dsDNA阵列制备技术若借助光导向原位DNA微阵列合成技术，则不仅合成的全长dsDNA数量极少，使大部分合成寡核苷酸为残缺(truncated molecules)分子，严重干扰检测反应，而且生产成本非常高昂；若借助基因芯片点样法完成，则生产成本更加高昂。Mirzabekov等(1999，2001)提出运用杂交复性的方法制备dsDNA微阵列，他们首先制备ssDNA微阵列，再用互补单链寡核苷酸DNA与芯片杂交复性，使ssDNA微阵列芯片成为dsDNA微阵列芯片；这一方法最根本的缺点是不能用来制备碱基序列非常相似的dsDNA微阵列芯片，如单碱基多态性的dsDNA微阵列芯片，而且这一方法的实际生产成本也是难以接受的。Bulyk等在1999年提出了用核酸聚合酶引物延伸的办法将ssDNA微阵列转变为dsDNA微阵列方法，并申报了美国专利(US.Pat.6326489)。这一方法首先在玻片上通过Affymetrix光导向原位合成专利技术制备ssDNA微阵列，使ssDNA微阵列的每条寡核苷酸靠近玻片的3′端含有长16个碱基的通用(constant)引物退火序列，ssDNA微阵列与通用引物退火后，进行聚合酶引物延伸反应，合成第二链核酸，从而形成dsDNA微阵列。这一方法的优点是能利用DNA微阵列原位合成技术制备高密度dsDNA微阵列；但这一方法同样存在严重的经济和技术问题，在技术上它依赖于光刻掩膜原位DNA微阵列合成专利技术，但固相基质表面的单链寡核苷酸合成的效率不高，每个核苷酸的合成效率在92～96％，这样合成一个40碱基长的寡核苷酸，则只有4～20％的寡核苷酸达到要求的40碱基长度，因此，以光刻掩膜原位合成技术制备的ssDNA及dsDNA微阵列严重地受到残缺截短分子(truncated molecules)的污染。众多竞争性残缺截短分子将可能强烈抑制和误导蛋白质结合实验；并且没有理由相信光刻掩膜原位合成的单链寡核苷酸微阵列上的每个寡核苷酸都可以被引物寡核苷酸结合，这样就会使一部分40碱基全长寡核苷酸不能被转换双链核酸，这不但进一步降低了芯片上理想双链核酸探针的数量，而且那些未被转换为双链的单链寡核苷酸同样会干扰蛋白质结合实验。另外，这一方法制备的dsDNA微阵列是双分子(bimolecular)dsDNA微阵列，存在探针稳定性问题，即双分子dsDNA受到结合、洗片等实验环节的影响，会发生双链解链而丧失探针功能，使只能使用一次，因此其使用效率低、使用成本高。由于这一方法制备的dsDNA微阵列依赖目前非常昂贵的光刻掩膜原位DNA微阵列合成专利技术，加之这一方法本身的专利保护，使其不仅商业化应用成本非常昂贵。

dsDNA微阵列芯片是进行高通量DNA/蛋白质相互作用研究的重要技术，这种芯片已经证明能够非常有效地用于序列特异性DNA/蛋白质相互作用的研究，可高效分析生物分子结合相互作用(binding interaction)。我们在2000年就认识到dsDNA微阵列芯片研究的重要价值，并开始着手研发能够性能稳定、成本较低的高通量检测序列特异性DNA/蛋白质相互作用的单分子dsDNA微阵列芯片。在中国博士后科学基金(2001)和国家自然科学基金(60201005)的资助下，建立了两种高效制备高性能dsDNA微阵列芯片的专利技术(中国专利申请号：02112780.8；02137945.9)。我们的研究成果已经受到国内外学者的关注，有关论文发表在国际刊物Nanotechnology、Molecules、Analytical Biochemistry、Journal of Biochemicaland Biophysical Methods以及专著″The frontiers of biochip technologies″of Iternational Forumof Biochip Technology 2002(published by Kluwer Academic Publishers)上；研究成果在2002年参加三次国际学术会议，并在清华大学、北京生物芯片技术国家工程研究中心、科技部、教育部和国家自然科学基金委员会主办的“2002年国际生物芯片论坛”会议上获得唯一的Poster奖励。我们的研究表明运用我们的两项专利技术，不仅可以高效地制备性能良好的单分子(unimolecular)dsDNA微阵列芯片，而且我们制备的可检测多种疾病相关转录因子NF-κB(Nuclear Factor κB)的“点突变单分子dsDNA微阵列芯片”(中国专利申请号：03132206.9)，可以灵敏地定量检测细胞核抽提物中NF-κB蛋白的数量、测定DNA/NF-κB相互作用的序列特异性和亲合性、确定DNA/NF-κB相互作用中碱基和氨基酸的键合(base-amino acidcontacting)。我们设计的单分子dsDNA微阵列芯片制备方法与国内外基因芯片点样制备技术完全兼容，而且在应用中与基因表达芯片的反应、检测设备完全兼容，提高了芯片使用的简便性。我们的方法尤其适宜制备最具应用价值的“点突变单分子dsDNA微阵列芯片”，这种芯片在研究DNA/蛋白质相互作用中碱基和氨基酸的接触规律、预测基因组中蛋白质结合位点和构建基因表达调控网络非常有效。目前我们已经着手研究“单分子dsDNA微阵列芯片”在筛选组合化学分子和天然药物分子的应用，这一研究在生物医学上具有重要应用价值。

“单分子dsDNA微阵列芯片”的诸多重要应用价值，使我们必须研究如何大幅度降低其生产成本和应用成本、提高其检测的信息量、特异性和灵敏性，为了实现这一目的，我们对已有技术中造成较高成本的环节进行了深入思考，提出了本发明设计的新方法，旨在大幅度降低其生产成本和应用成本，为商业化生产奠定基础。因此，本发明技术在基础生物学和生物医学的研究中具有重要意义。

三、发明内容：

(1)发明目的

本发明在我们已有单分子dsDNA微阵列芯片专利制备技术(中国专利申请号：02112780.8；02137945.9)的基础上，提出一种在固相支持物上制备单分子双链脱氧核糖核酸微阵列(unimolecular dsDNA microarray)的新方法，旨在大幅度降低单分子dsDNA微阵列芯片的生产成本和应用成本，为单分子dsDNA微阵列芯片的商业化生产奠定基础。

本发明技术所制备的单分子dsDNA微阵列芯片，为基础分子生物学及生物医学领域中DNA/蛋白质相互作用相关研究提供高通量的技术平台。在基础分子生物学研究中，本发明制备的单分子dsDNA微阵列芯片可以作为高通量(high throughput)鉴定DNA结合蛋白(DNA-binding proteins)的DNA结合靶点、筛选及检测DNA结合蛋白、分析DNA结合蛋白与其DNA结合靶点相互作用等的技术平台；在生物医学研究中，本发明制备的单分子dsDNA微阵列芯片可以作为DNA结合蛋白相关疾病辅助诊断、药物作用机理研究、药物有效成分筛选等的技术平台。

(2)技术方案

本发明提出的单分子双链DNA微阵列制备新方法，该方法通过如下技术方案完成单分子双链DNA微阵列的制备：

①、固相化学合成两种单链寡核苷酸片段，一种为靶寡核苷酸，其5′端为两段反向碱基互补序列，3′端为通用寡核苷酸互补序列；另一种为通用寡核苷酸，其3′端为羟基，5′端为化学修饰基团；

②、在液相反应体系中将该通用寡核苷酸与靶寡核苷酸复性；

③、两寡核苷酸复性产物点样固定到固相支持物表面，形成寡核苷酸微阵列；

④、寡核苷酸微阵列在片核酸聚合酶延伸，形成双分子dsDNA微阵列；

⑤、双链DNA微阵列芯片变性处理，使其成为单链DNA(ssDNA)微阵列芯片；

⑥、ssDNA微阵列复性，单链3′端形成发卡结构；

⑦、复性后ssDNA微阵列在片核酸聚合酶延伸，形成单分子dsDNA微阵列。

该技术方案流程示意见附图1。

该方案技术流程可做适当调整，作为辅助方案，见附图2。

本发明制备的单分子dsDNA微阵列芯片结构示意图见附图3。

由于本发明是依靠目前DNA微阵列制备的最普及的技术，即点样法制备单分子双链DNA微阵列的技术，制备芯片所使用的寡核苷酸须由商业化的核酸固相合成技术提供，因此合成制备芯片所使用的寡核苷酸是制备芯片的主要成本所在，为了使制备成本最小化，本发明设计了如下两种技术方案扩增商业化固相化学合成的靶寡核苷酸，低成本生产大量点样用寡核苷酸，使固相化学合成的靶寡核苷酸持续利用，极大地芯片制备的成本降低。

方案1包括如下步骤：

①、固相化学合成靶寡核苷酸和通用寡核苷酸，另合成一寡核苷酸，使其序列与靶寡核苷酸5′端反向碱基互补序列完全互补；

②、三种寡核苷酸在PCR反应体系中混合并进行PCR扩增反应；

③、PCR扩增反应产物点样固定到固相支持物表面，形成双分子dsDNA微阵列；

④、双分子dsDNA微阵列芯片变性处理，使其成为ssDNA微阵列芯片；

⑤、ssDNA微阵列复性，单链3′端形成发卡结构；

⑥、复性后ssDNA微阵列在片核酸聚合酶延伸，形成单分子dsDNA微阵列。

方案1技术流程见附图4。

方案2包括如下步骤：

①、固相化学合成靶寡核苷酸和通用寡核苷酸，在靶寡核苷酸5′端反向碱基互补序列外增加合成其它序列，该序列和反向碱基互补序列间存在特定限制性内切酶识别位点；另合成一寡核苷酸，使其序列与靶寡核苷酸5′端反向碱基互补序列外增设序列完全互补；

②、三种寡核苷酸在PCR反应体系中混合并进行PCR扩增反应；

③、PCR扩增反应产物点样固定到固相支持物表面，形成双分子dsDNA微阵列；

④、双分子dsDNA微阵列进行限制性内切酶彻底酶切；

⑤、酶切后双分子dsDNA微阵列芯片变性处理，使其成为ssDNA微阵列芯片；

⑥、ssDNA微阵列复性，单链3′端形成发卡结构；

⑦、复性后ssDNA微阵列在片核酸聚合酶延伸，形成单分子dsDNA微阵列。

方案2技术流程见附图5。

上述方案中，为了实现通用寡核苷酸在固相支持物上的固定而进行的5′末端化学修饰，其修饰基团应与固相支持物表面修饰的化学基团发生共价化学反应，以便将DNA稳定牢固地连接在固相支持物表面，如通用寡核苷酸5′端修饰氨基，固相支持物玻片表面修饰醛基，则可以形成Schiffbase，DNA稳定牢固地连接在固相支持物表面。

上述方案中，用于进行DNA聚合反应的核酸聚合酶包括一切可以完成DNA聚合功能的酶，如核糖核酸聚合酶、脱氧核糖核酸聚合酶及反转录酶等；用于进行核苷酸聚合反应的核苷酸包括所有核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、稀有核苷酸及化学修饰核苷酸；用于固定单链寡核苷酸的固相支持物包括可用于表面化学研究的拥有刚性和半刚性表面的材料。

(3)技术效果

为了验证本发明技术方案的可靠性，设计合成下列两条寡核苷酸作为靶寡核苷酸和通用寡核苷酸进行芯片制备实验：

其中靶寡核苷酸序列中的矩形方框内序列为示例DNA结合蛋白NF-κB的结合位点(我们用点突变芯片筛选出的突变型高特异性和亲合性结合位点)、箭头指示序列为反向互补序列、底化线指示序列为限制性内切酶HaeIII酶切位点。

运用该该靶寡核苷酸实验可以证明技术方案中在片DNA聚合酶能够成功地延伸发卡引物，并能将延伸反应进行到紧接玻片的两个腺嘌呤AA处。实验中第一次在片DNA聚合酶延伸反应分两组进行，一组的反应体系含有正常的四种dNTP，另一组反应体系含有正常的dATP、dGTP、dCTP及Cy3-dUTP；结果第一次在片DNA聚合酶延伸反应后，第一组芯片扫描无荧光信号，第二组芯片扫描出现荧光信号，说明第一次在片DNA聚合酶延伸反应在中成功进行。实验中第二次在片DNA聚合酶延伸反应也分两组进行，将第一次在片DNA聚合酶延伸反应中含有正常的四种dNTP的芯片，经热变性再复性后，分为两组进行实验，一组的DNA聚合酶延伸反应体系仍含有正常的四种dNTP，另一组反应体系仍含有正常的dATP、dGTP、dCTP及Cy3-dUTP；结果第二次在片DNA聚合酶延伸反应后，第一组芯片扫描无荧光信号，第二组芯片扫描出现荧光信号，说明第二次在片DNA聚合酶延伸反应成功进行，并能将延伸反应进行到紧接玻片的两个腺嘌呤AA处。因为该靶寡核苷酸中只有5′端的这两个A才有机会使Cy3-dUTP进入聚合反应，因此第二次在片DNA聚合酶延伸反应结束后，对清洗干净的芯片进行Cy3通道的荧光扫描时，若DNA聚合酶延伸反应体系中含有正常的dATP、dGTP、dCTP及Cy3-dUTP的一组芯片出现荧光信号，则证明在片DNA聚合酶延伸反应成功地将单链寡核苷酸微阵列转变为单分子dsDNA微阵列。

为了进一步考察本发明技术方案的可靠性和所制备的芯片用于检测DNA/蛋白质相互作用的可行性，将第二次在片DNA聚合酶延伸反应体系中含有正常的四种dNTP，延伸反应后扫描无荧光信号的芯片进行蛋白结合实验：

将NF-κB蛋白p50与芯片反应，结合后用Cy3标记的NF-κB单克隆抗体再与芯片反应，反应后芯片进行Cy3通道的荧光扫描时，出现荧光信号；芯片再用HaeIII酶切过夜酶切，酶切后芯片再进行Cy3通道的荧光扫描时，荧光信号降低甚至除去。证明所制备的芯片能够与转录因子DNA结合蛋白(NF-κB)发生结合反应，也可以与酶蛋白(HaeIII)发生酶切反应。

上述实验的技术方案流程示意及实验结果见附图6。

本发明提出的单分子dsDNA阵列芯片制备方法，在核酸材料的最初制备上使用技术是核酸固相化学合成技术，在芯片制备中使用阵列芯片微点样制备技术，这两相相关技术都已经成为商业化的一般生物技术，因此本项目提出的单分子dsDNA微阵列芯片制备方法非常有利于商业化应用。本项目提出的单分子dsDNA阵列芯片制备方法是发明人对自己原有单分子双链核酸微阵列芯片制备方法的重要技术创新。本发明技术方案的优点体现在以下几个方面。

一是本发明技术方案极大地降低了单分子dsDNA阵列芯片的制备成本，体现在以下几个方面：①使用通用寡核苷酸解决寡核苷酸在固相基质上的固定问题，避免在每条不同的探针寡核苷酸上修饰氨基等化学基团；②运用PCR扩增商业化提供的原始寡核苷酸，生产大量点样用寡核苷酸，避免再次合成，做到持续利用合成材料；③芯片制备中只需要一个在片核酸聚合反应，核酸聚合酶不仅价格低廉，而且反应效率高，无需其他分子生物学试剂消耗；④其他材料(如杂交液、洗片液等)价格非常廉价且消耗极少。

二是本发明技术方案极大地简化了生产工艺、维护单分子dsDNA阵列芯片可以反复利用(见附图7)的优良特性，进一步显著降低了芯片使用成本。本发明的技术方案完全可以进行自动化进行，为商业化大批量生产单分子dsDNA阵列芯片铺平了道路。

四、附图说明：

图1：单分子dsDNA微阵列芯片制备技术方案流程示意图；

图2：单分子dsDNA微阵列芯片制备技术方案辅助流程示意图；

图3：制备的单分子dsDNA微阵列芯片结构示意图；

图4：PCR生产点样核酸制备单分子dsDNA微阵列芯片技术方案1示意图；

图5：PCR生产点样核酸制备单分子dsDNA微阵列芯片技术方案2示意图；

图6：单分子dsDNA微阵列芯片制备技术效果示意图；

图7：单分子dsDNA微阵列芯片回收利用示意图；

图8：Cy3-dUTP渗入单分子dsDNA微阵列芯片制备效果图；

图9：Cy3-NF-κB与单分子dsDNA微阵列芯片杂交效果图。

附图注解：

A：复性(Annealing)；

AB：抗体结合(Antibody Binding)；

De：变性(Denaturing)；

Di：消化(Digesting)；

E：延伸(Elongating)；

E1：以Cy3-dUTP延伸(Elongating with dATP，dGTP，dCTP and Cy3-dUTP)；

E2：以正常dNTP延伸(Elongating with dATP，dGTP，dCTP and dTTP)；

I：固定(Immobilizing)；

NH2：通用寡核苷酸示例修饰基团——氨基(Amino group，NH2)；

P1、P2：引物(Primer)；

PB：蛋白质结合(Protein Binding)；

R：循环(Recycling)；

S：扫描(Scanning)；

SS：固相基质(Solid Substrct)；

St：剥离(Striping)；

TO：靶寡核苷酸(Targrt Oligonucleotides)；

UO：通用寡核苷酸(Universal Oligonucleotide)。

五、具体实施方式

此处仅用表面以氨基硅烷处理的玻片为固相支持物，在芯片上制备含有同一检测NF-κB蛋白的DNA探针的单分子dsDNA微阵列芯片为例，说明本发明单分子dsDNA微阵列芯片制备及应用的具体实施方式。

1.玻片的准备及硅烷化及醛基修饰：

若使用商业化提供的基因芯片专用玻片如Telechem公司的SuperAldehyde Slides等，则此步不需要再执行；若从普通制备组织切片的玻片开始，则不许对玻片进行处理。首先对玻片进行常规清洗，再用硅烷化试剂如Sigma公司的aminopropyltriethoxysilane(三乙氧基氨基硅烷)进行硅烷化处理5-10分钟(含2％aminopropyltriethoxysilane的95％丙酮，acetone)。硅烷化处理后用去离子水洗涤两次，在75℃烘烤45分钟。将硅烷化处理好的玻片浸泡在含5％戊二醛(glutaraldehyde)的磷酸缓冲液(0.01M PB，pH7.0)中30分钟，之后用去离子水洗涤两次，氮气吹干，保存在4℃，半月内使用。

2.寡核苷酸的设计及化学合成：

设计并用固相化学合成技术合成下面序列的靶寡核苷酸及通用寡核苷酸，合成产物需纯化处理：

靶寡核苷酸：3′TTGGAGGAGAGGGGTTTGGGACTTTCC GAATTCT -5′；

通用寡核苷酸：5′NH₂-AACCTCCTCTCCCC-OH 3′。

3.寡核苷酸复性并准备点样样品：

两寡核苷酸以80μM溶解在TE缓冲液中，混合并在95℃变性5分钟，之后缓慢降温到室温，保持1小时使两寡核苷酸复性；复性产物中加入等体积碳酸缓冲液(0.1M carbonatebuffer，pH9.0)；

4.DNA点样样品在玻片表面固定及芯片制备：

①.DNA点样样品用PixSys5500(Cartesian Technology Inc.)点样(湿度80％)到醛基修饰玻片表面，点样后置于湿盒内0.1M碳酸缓冲液(pH9.0)浸湿的滤纸上，密封湿盒，在37℃温育30分钟，再用2×SSC/1％SDS溶液洗涤2分钟，用灭菌双蒸水简单淋洗，N₂吹干；

②.将DNA聚合酶反应液[Polymerase Reaction：50mM Tris-HCl(pH 7.2)，10mMMgSO4，0.1mM DTT，40μM of each dNTP，20μg/ml acetylated BSA，2U/μl DNA polymerase Ilarge(Klenow)fragment(3′to 5′exo-；Promega，Madison，WI)]加到步骤①制备的寡核苷酸微阵列上，用憎水硅烷[Plusone Repel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2％w/v inoctamethylcyclotetrasixane)，Pharmacia Biotech)处理的盖玻片覆盖溶液及微阵列，放置于密封湿盒内37℃延伸反应30分钟；反应后玻片用2×SSC/0.1％SDS和0.2×SSC/0.1％SDS溶液各洗涤2分钟，用灭菌双蒸水简单淋洗，N2吹干；

③.将步骤②处理寡核苷酸微阵列芯片在95℃水煮变性5分钟；反应后玻片用2×SSC/0.1％SDS和0.2×SSC/0.1％SDS溶液各洗涤5分钟，用灭菌双蒸水简单淋洗，N₂吹干；

④.将步骤③处理的寡核苷酸微阵列芯片用杂交液覆盖，在45℃复性30分钟；复性后用灭菌双蒸水简单淋洗，N₂吹干；

⑤.将DNA聚合酶反应液[Polymerase Reaction：50mM Tris-HCl(pH 7.2)，10mMMgSO4，0.1mM DTT，40μM of each dNTP，20μg/ml acetylated BSA，2U/μl DNA polymerase Ilarge(Klenow)fragment(3′to 5′exo-；Promega，Madison，WI)]加到步骤④处理的寡核苷酸微阵列芯片上，用憎水硅烷[Plusone Repel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2％w/v inoctamethylcyclotetrasixane)，Pharmacia Biotech)处理的盖玻片覆盖溶液及微阵列，放置于密封湿盒内37℃延伸反应30分钟；反应后玻片用2×SSC/0.1％SDS和0.2×SSC/0.1％SDS溶液各洗涤2分钟，用灭菌双蒸水简单淋洗，N₂吹干；

为了反映制备效果，在此步DNA聚合酶反应中，一组芯片用四种正常dNTPs处理，另一组用dATP、dGTP、dCTP、Cy3-dUTP处理。

⑥.将步骤⑤处理的寡核苷酸微阵列芯片用微阵列芯片扫描仪(如ScanArray Lite，Packard Biochip Technologies)扫描(适当参数：channel、laserpower，PMT gain，resolution.)，记录荧光信号；结果在步骤⑤中以dATP、dGTP、dCTP、Cy3-dUTP处理的芯片出现荧光信号，如附图8；而以四种正常dNTPs处理的芯片无荧光信号。

5.单分子dsDNA微阵列芯片检测NF-κB蛋白：

①.转录因子NF-κB p50蛋白用人p50全长cDNA(编码453氨基酸)表达载体在细菌中表达提取(Promega，Madison，WI)；

②.将上面芯片制备中用四种正常dNTPs处理的单分子dsDNA微阵列芯片用5％BSA/PBS溶液封闭室温封闭10分钟；

③.适量NF-κB蛋白溶解于DNA结合缓冲液中(DNA-binding buffer：10mM HEPESpH7.9，50mM KCl，2.5mM DTT，0.1mM EDTA，0.05％NP-40，10％Glycerol，5％BSA)，室温保育30分钟；取10μL DNA结合缓冲液滴加到NF-κB检测DNA微阵列上，用憎水硅烷[PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2％w/v in octamethylcyclotetrasixane)，Pharmacia Biotech)处理的盖玻片覆盖溶液及微阵列，置密封湿盒内37℃或室温保育30分钟；

④.反应后玻片在室温下分别用PBS/0.05％Tween 20，PBS/0.01％Triton 100及PBS(141mM NaCl，7.2mM Na₂HPO₄，2.8mM NaH₂PO₄，pH7.4)各洗涤10分钟；

⑤.N₂吹干玻片，取10μL含有适量荧光素Cy3(FluoroLink^TM Cy3 monofunctional dye，Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)标记的NF-κB蛋白抗体[NF-κB p50(E-10)：sc-8414，Santa Cruz Biotechnology，Inc.]的PBS(141mM NaCl，7.2mM Na₂HPO₄，2.8mMNaH₂PO₄，pH7.4)溶液，滴加到NF-κB检测DNA微阵列上，用憎水硅烷[Plusone Repel-SilaneES(Dimethyldichlorosilance solution 2％w/v in octamethylcyclotetrasixane)，Pharmacia Biotech)处理的盖玻片覆盖溶液及微阵列，置密封湿盒内37℃或室温保育30分钟；

⑥.抗体反应后，玻片用PBS(141mM NaCl，7.2mM Na₂HPO₄，2.8mM NaH₂PO₄，pH7.4)溶液室温洗涤10分钟，再用用灭菌双蒸水简单淋洗，N₂吹干。

⑦.芯片在微阵列芯片扫描仪(如ScanArray Lite，Packard Biochip Technologies)上扫描(适当参数：channel、laserpower，PMT gain，resolution.)，记录荧光信号；结果见附图9。

Claims (11)

1、一种制备单分子双链脱氧核糖核酸(dsDNA)微阵列芯片的新方法，包括步骤：

(1)、固相化学合成两种单链寡核苷酸片段，一种为靶寡核苷酸，其5′端为两段反向碱基互补序列，3′端为通用寡核苷酸互补序列；另一种为通用寡核苷酸，其3′端为羟基，5′端为化学修饰基团；

(2)、在液相反应体系中将该通用寡核苷酸与靶寡核苷酸复性；

(3)、两寡核苷酸复性产物点样固定到固相支持物表面，形成寡核苷酸微阵列；

(4)、寡核苷酸微阵列在片核酸聚合酶延伸，形成双分子dsDNA微阵列；

(5)、双分子dsDNA微阵列变性，形成单链脱氧核糖核酸(ssDNA)微阵列；

(6)、ssDNA微阵列复性，单链3′端形成发卡结构；

(7)、复性后ssDNA微阵列在片核酸聚合酶延伸，形成单分子dsDNA微阵列。

2、根据权利要求1所述的单分子dsDNA微阵列制备方法，其特征在于步骤(1)中合成的靶寡核苷酸和通用核苷酸具有下述结构特征，包括；

(1)、靶寡核苷酸的5′端两反向碱基互补序列间无其他核苷酸或连接分子间隔；

(2)、靶寡核苷酸的5′端反向互补序列和3′端通用寡核苷酸互补序列间可含有特定使用目的的核苷酸序列，如DNA结合蛋白的识别位点；

(3)、通用寡核苷酸的5′端序列必须与靶寡核苷酸片段3′端序列完全互补，且互补序列的长度和碱基构成足够使两种寡核苷酸形成稳定的杂合体；

(4)、通用寡核苷酸序列和靶寡核苷酸序列中可存在特定目的的碱基序列，如DNA限制性内切酶识别位点；

(5)、通用寡核苷酸的5′端化学修饰基团必须与固相支持物表面修饰的化学基团发生化学反应，形成共价连接；

3、根据权利要求1所述的单分子dsDNA微阵列制备方法，其特征在于步骤(1)中合成的靶寡核苷酸，可以依靠与其5′端反向碱基互补序列配对的寡核苷酸和通用寡核苷酸为引物，通过核酸聚合酶扩增反应，合成大量双链寡核苷酸，用于制备单分子dsDNA微阵列；

4、根据权利要求3所述的靶寡核苷酸核酸聚合酶扩增反应，其特征在于用扩增产物点样制备单分子dsDNA微阵列时，扩增产物点样制备的双分子dsDNA微阵列，可接权利要求1步骤(5)进行单分子dsDNA微阵列制备；

5、根据权利要求1所述的单分子dsDNA微阵列制备方法，其特征在于步骤(1)中合成的靶寡核苷酸，可以在其5′端反向碱基互补序列外增加合成其它序列，该序列和反向碱基互补序列间存在特定限制性内切酶识别位点；

6、根据权利要求5所述的靶寡核苷酸，其特征在于该种靶寡核苷酸可以依靠与其5′增加序列配对的寡核苷酸和通用寡核苷酸为引物，通过核酸聚合酶扩增反应，合成大量双链寡核苷酸，用于制备单分子dsDNA微阵列；

7、根据权利要求6所述的靶寡核苷酸核酸聚合酶扩增反应，其特征在于用扩增产物点样制备单分子dsDNA微阵列时，扩增产物点样制备的双分子dsDNA微阵列，先用限制性内切酶进行彻底消化后，再接权利要求1步骤(5)进行单分子dsDNA微阵列制备；

8、根据权利要求1所述的单分子dsDNA微阵列制备方法，其特征在于步骤(3)中固相支持物的表面必须化学修饰特定的化学基团，该化学基团可与通用寡核苷酸的5′端修饰的化学基团发生化学反应，形成共价连接；

9、根据权利要求1所述的单分子dsDNA微阵列制备方法，其特征在于步骤(3)中固相支持物为刚性或半刚性材料，包括LB膜、(聚)四氟乙烯膜、(聚)偏二氟乙烯膜、聚苯乙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚碳酸酯、凝胶、玻片、硅片等；

10、根据权利要求1所述的单分子dsDNA微阵列制备方法，其特征在于步骤(4)和(7)中核酸聚合酶包括脱氧核糖核酸聚合酶及反转录酶等；

11、根据权利要求1所述的单分子dsDNA微阵列制备方法，其特征在于步骤(4)和(7)中参与核酸聚合反应的核苷酸包括所有四种脱氧核糖核苷酸及其他化学修饰的核苷酸；

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