CN1721547A - 核酸外切酶ⅲ消化包被在微孔板上的含有特殊标记的双链核酸分子检测转录因子蛋白 - Google Patents

Abstract

转录因子是一类负责基因表达调控的重要蛋白质，是基因表达调控通路及网络的枢纽，是功能基因组和蛋白质组研究的重要对象，也是转录治疗和药物研究的重要靶点。本专利提出了一种检测转录因子表达和活化水平的新方法“核酸外切酶III消化微孔板包被特殊标记双链核酸分子检测转录因子蛋白”。运用该方法分析转录因子表达和活化水平包括如下步骤：(a)准备核酸分子；(b)核酸分子连接固定到微孔板孔内；(c)含转录因子细胞或组织抽提物与微孔板孵育；(d)核酸外切酶III反应液与微孔板与孵育；(e)核酸分子上特殊标记的特异性结合物与微孔板孵育；(f)对特异性结合物进行检测分析，反映转录因子蛋白表达和活化水平。

Description

核酸外切酶III消化包被在微孔板上的 含有特殊标记的双链核酸分子检测转录因子蛋白

一、技术领域：

转录因子(transcription factor)是生物蛋白质组(proteomics)中一类负责基因表达调控(geneexpression regulation)的重要蛋白质，是基因表达调控通路(pathway)及网络(network)的枢纽，是功能基因组(functional genomics)和蛋白质组研究的重要对象；许多疾病都与转录因子的异常表达(expression)及活化(activation)存在密切的关系，成为转录治疗(transcriptional therapy)和药物研究的重要靶点(drug target)。转录因子表达及活化程度的检测分析是研究其功能的主要手段。本专利提出了一种检测转录因子表达和活化水平的新方法，该方法将为是分子生物学(molecular biology)、功能基因组学、蛋白质组学及生物医学(Biomedicine)领域中的转录因子相关研究提供一种新的检测分析技术，可促进这些领域中转录因子相关的科学研究，以及在生物医学领域中提供一种疾病相关转录因子的诊断技术、以及转录因子为靶点的药物筛选(drug screening)技术。

二、背景技术：

转录因子蛋白是生物蛋白质组中一类负责基因表达调控的重要蛋白质，是基因表达调控通路及网络的枢纽，是功能基因组和蛋白质组研究的重要对象；许多疾病都与转录因子的异常表达及活化存在密切的关系，成为转录治疗和药物研究的重要靶点。转录因子表达及活化程度的检测分析是研究其功能的主要手段。因此，有关检测分析转录因子表达及活化程度技术的研究一直受到科学界的重视。

分子生物学研究表明，在基因的上下文(context)存在一些发挥启动(promote)、增强(enhance)或衰减(attenuate)基因转录作用的特定DNA序列，称为顺式作用元件(cis-actingelements)，如启动子(promoter)、增强子(enhancer)、衰减子(attenuater)；转录因子蛋白是生物蛋白质组中一类特殊的蛋白质，这类蛋白质的细胞质中完成其翻译(translation)后，在正常细胞功能状态或细胞受到特定因子诱导下，进入细胞核，与基因组中的顺式作用元件发生特异性识别结合，组成基因转录机器(transcription apparatus)，实现其基因表达的调控功能，称为反式作用因子(trans-acting factors)。转录因子蛋白与顺式作用元件组成基因转录机器的首要环节是转录因子蛋白中一些具有特殊结构转录因子直接与顺式作用元件DNA序列发生序列特异性结合(sequence-specific binding)，完成基因转录机器组装的第一步。因此，检测分析转录因子表达及活化程度的技术主要建立在DNA/蛋白质相互作用这一层次，即运用含有顺式作用元件的DNA为探针，探测转录因子的表达及活化。

时至目前，科学家们已经建立多种基于DNA/蛋白质相互作用这一层次的转录因子表达及活化程度的检测分析技术。其中最经典的是电泳迁移率变动分析(Electrophoresis MobilityShift Assay)，即凝胶迁移实验(gel shift assay)。该技术一般是人工合成含有转录因子结合序列(consensus，binding sites)的双链(double-stranded)寡核苷酸(oligonucleotides)，并用放射性同位素标记寡核苷酸，将标记寡核苷酸与含有转录因子蛋白的细胞或组织抽提物混合孵育一段时间后，进行自然聚丙烯酰胺凝胶电泳(native polyacrylamide gel eletrophoresis，PAGE)，分离游离(free DNA)和与蛋白质结合的DNA(retarded DNA)，在通过X-光底片暴光显现与蛋白质结合的DNA(retarded DNA)，来反映转录因子表达及活化程度。这一技术目前仍非常有效地用于转录因子蛋白检测分析。但存在放射性标记对实验人员及环境危害的缺陷。因此，对这一技术后来进行了非放射性标记的改进。即用地高辛(digoxigenin，DIG)标记寡核苷酸，进行自然聚丙烯酰胺凝胶电泳，再将电泳产物转印(blotting)到尼龙膜(nylon membrane)等介质上，依靠碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶耦联的DIG抗体和相应酶的生色(colorimetric)或发光(chemiluminescent)底物(substrate)，进行化学生色或发光检测，来反映转录因子表达及活化程度。也有采用荧光(fluorescent)标记寡核苷酸进行电泳迁移率变动分析的改进技术。这些技术也能够很好地用于转录因子蛋白检测分析。但这些技术仍然存在自身的缺点，即它们虽然避免了经典放射性标记探针凝胶迁移实验的缺点，但同时带来实验流程的复杂化和更多的影响因素，如尼龙膜实验的高背景、转引设备需求及实验成本提高等问题。同时，这些改进技术从根本上未摆脱种凝胶迁移实验的技术思想，无法克服凝胶迁移实验对实验样品数量需求大、实验耗时长、分析效率低等缺陷。

鉴于这些技术目前仍然存在的缺点，建立从技术思想角度上完全不同于凝胶迁移实验的转录因子表达及活化检测及分析技术是非常必要的。为此我们已经进行了诸多相关研究，并发展了一些新的技术。例如，利用基因芯片技术的策略，我们曾经致力于将含有转录因子蛋白结合位点的双链DNA固定到固相载体如玻片表面，制备双链DNA微阵列芯片(double-stranded DNA microarray chip)，用于转录因子表达及活化的检测及分析。我们发明了数种制备双链DNA微阵列芯片的技术(中国专利ZL02112780.8，02137945.9，03152881.3)，并成功制备了专用于检测转录因子蛋白NF-κB的双链DNA微阵列芯片(中国专利03132206.9)，而且由此建立了一种在“DNA/蛋白质”相互作用的分子层面上从复杂组分物质如中药和组合化学混合物中高通量筛选、捕获和分离目标分子的技术(中国专利03152882.1)。

技术的有效性和实用性是技术的命脉。虽然我们的双链DNA微阵列芯片技术已经达到了实用化水平，但我们注意到该项技术的推广应用仍然面临很大的困难，即芯片的制备和使用成本比较高昂。特别是芯片的实际使用中必须依赖于目前非常昂贵的基因芯片扫描装置，极大地限制了双链DNA微阵列芯片技术的商业化。由此，我们着力改进这一技术，将DNA固相化技术与核酸外切酶III及传统的微孔板实验技术结合在一起，提出了本发明“核酸外切酶III消化包被在微孔板上的含有特殊标记的双链核酸分子检测转录因子蛋白”技术。这一技术将双链DNA微阵列芯片技术中的DNA固定介质有玻片改为微孔板，检测仪器自然由昂贵的基因芯片扫描装置改变为成本低廉的酶标仪等。这一改进，极大地降低了制备和使用成本，能够很好地解决我们建立的双链DNA微阵列芯片技术的应用化问题。

三、发明内容：

(1)、发明目的

本发明的目的是提供一种制备和使用成本较低的检测转录因子表达和活化水平的新方法，便于在普通设备条件下制备双链核酸分子包被微孔板，依靠用于传统酶联免疫吸附实验的酶标仪、洗板机等低价设备，运用成熟的酶联免疫吸附实验技术流程实现转录因子表达和活化水平的高通量检测分析。为分子生物学、功能基因组学、蛋白质组学及生物医学等领域中的转录因子的相关研究提供一种新的实验技术，促进这些领域中转录因子相关的科学研究，以及针对转录因子的临床检测和药物筛选研究。

(2)、技术方案

本专利提出了一种检测转录因子表达和活化水平的新技术，即“核酸外切酶III消化微孔板包被特殊标记双链核酸分子检测转录因子蛋白”。

运用该方法检测转录因子蛋白表达和活化水平包括如下步骤：

a)准备特殊标记的核酸分子；

b)将特殊标记的核酸分子连接固定到微孔板孔内；

c)将转录因子蛋白与微孔板孵育；

d)将核酸外切酶III反应液与微孔板与孵育；

e)将核酸分子上特殊标记的特异性结合物与微孔板孵育；

f)对特异性结合物进行检测分析，反映转录因子蛋白表达和活化水平。

以上步骤的技术思想包括三个部分，首先是准备特殊标记的核酸分子，其次是双链核酸分子包被微孔板的制备，最后是运用制备的微孔板检测转录因子蛋白。

准备特殊标记的核酸分子是实现本发明技术的第一步，也是非常重要的一步，关键问题是准备的特殊标记的核酸分子要满足在微孔板上固定、核酸外切酶III作用、转录因子蛋白结合、对特殊标记便于检测等要求。用于本发明中的特殊标记的核酸分子在结构上应满足下列条件：

a)所准备的核酸分子，为两条具有特殊结构特征的核酸分子A和B；

b)核酸分子A和B是两条碱基序列反向互补的核酸分子；

c)核酸分子A和B退火后形成的双链核酸分子上，含有转录因子蛋白可识别并与之结合的核苷酸序列；

d)核酸分子A的3′末端依据微孔板表面的化学基团进行了相应的化学修饰，以便将其通过化学反应连接固定到微孔板表面；

e)核酸分子A和B退火后，B的3′末端与A的5′末端平齐或B的3′末端凹进，以便外切核酸酶作用于AB复合物时，能从B的3′末端进行性降解B；

f)核酸分子B的5′末端或靠近5′末端含有特殊标记耦连的核苷酸，特殊标记耦连的核苷酸数目至少为一个；

g)核酸分子B所含有的特殊标记耦连的核苷酸，其特殊标记为地高辛、生物素、荧光素等可依靠其化学特性进行检测分析的化学分子；

h)核酸分子B的转录因子蛋白结合序列位于特殊标记耦连的核苷酸和3′末端之间；

双链核酸分子包被微孔板的制备，其技术思想来源于我们对双链DNA微阵列芯片技术的研究和发明，以及传统分子生物学中运用DNA包被的介质进行DNA结合蛋白亲合层析分离纯化的实验技术。制备双链核酸分子包被微孔板的技术关键是如何将双链核酸分子牢固地连接固定到微孔板孔内，使固定的双链核酸分子既保持与液相中转录因子蛋白的结合活性，又能够经受检测过程中频繁的洗涤而不致脱落。

为了使固定的双链核酸分子具有与液相中转录因子蛋白的结合活性，要求用于固定的双链核酸分子具有足够的长度，特别是双链核酸分子上所嵌合的转录因子蛋白结合序列，要与微孔板表面间存在充分的距离，避免微孔板表面对核酸分子与蛋白质的结合反应造成空间障碍(steric hindrance)。用于与微孔板表面连接的核酸分子的一端应连接较长的手臂分子(arm，linker，spacer molecules)，如C12、PEG(Hexaethylene glycol)、等。另外微孔板表面固定的核酸分子密度(density)也要适宜，避免过密的核酸分子造成蛋白质结合的空间障碍。由于与转录因子蛋白发生序列特异性识别结合的DNA为双链DNA，因此固定的核酸分子应在检测的全过程中维持稳定的双链状态，避免解链丧失活性，为此DNA分子的两条链应有足够的GC含量和长度，以便双链DNA分子有较高的Tm值，耐受检测过程中一定温度和盐浓度环境而不致解链。

为了牢固地将双链核酸分子连接固定到微孔板孔内，使其能够经受检测过程中频繁的洗涤而不致脱落，制备双链核酸分子包被的微孔板时，应对针对不同材质的微孔板如玻璃底微孔板(glass-bottom microplate)、聚苯乙烯微孔板(polystyrene)、聚乙烯微孔板(polyethylene)、聚丙烯微孔板(polypropylene)，聚碳酸酯微孔板(polycarbonate)等进行表面活化处理，如玻璃底微孔板的硅烷化处理、聚苯乙烯及聚乙烯微孔板的紫外线照射(ultravioletirradiation)、低能量多原子离子束照射(Low-Energy Polyatomic Ion Beams)、等离子处理(plasma treatment)、γ射线等物理、化学处理，使微孔板表面形成特定的反应基团(reactivegroups)，如氨基(amino)、醛基(aldehyde)、羧基(carboxyl)、羟基(hydroxyl)、硫醇基(thiol)、N-氧琥珀酰亚胺酯(N-oxysuccinimide esters，NOS groups)等。这些反应基团能够和化学修饰在核酸分子末端的相应反应基团发生化学反应，形成共价键(covalent bond)，如希夫碱(Schiffbase)等，将核酸分子共价连接固定(immobilizing)在微孔板孔内。除了这种共价连接外，也可以利用链亲合素包被的微孔板(Streptavidin coated microplate)将生物素(biotinated)标记的核酸分子固定到微孔板孔内。另外通过在微孔板孔内铺设葡聚糖(allyldextran)、琼脂糖(agarose)、聚丙烯酰胺(polyacrylamide)、亲水胶(hydrogel)薄层(monolayer，layer)等手段造就反应基团，也可以实现核酸分子的固定。

在微孔板内包被双链核酸分子，可以通过多种途径来实现。一般表现为两种方式，一是首先将带反应基团的一条单链核酸分子连接固定到微孔板表面，再通过核酸杂交复性的手段将另一条碱基序列互补的单链核酸分子退火上去，形成固定的双链核酸分子；二是先将两条碱基序列互补的单链核酸分子在液相中复性，形成双链核酸分子，再将双链核酸分子加入微孔板内固定连接。PCR产物可以在扩增后直接加入微孔板内固定连接或经纯化更换溶液后再加入微孔板内固定连接。

完成微孔板内包被双链核酸分子后，首先要采用适宜的洗涤措施，除去微孔板内未通过化学键连接到微孔板表面的物理吸附的核酸分子，如用2×SSC、0.1％的洗涤液洗涤等。在洗涤除去微孔板内未通过化学键连接到微孔板表面的核酸分子后，还要采用适宜的技术灭活微孔板表面剩余的反应基团，避免它们处于活性状态，与蛋白质分子发生化学反应，造成非特异性结合的假阳性结果，如采用NaBH₄溶液灭活醛基、用牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)及Tris溶液灭活N-氧琥珀酰亚胺酯基团等。

通过上述技术流程，则制备出了可以用于转录因子蛋白检测的双链核酸分子包被的微孔板。微孔板包被的质量决定了微孔板检测转录因子蛋白的可靠性。因此制备高质量双链核酸分子包被的微孔板是实现本发明转录因子蛋白检测功能的关键所在。

制备了双链核酸分子包被的微孔板为本发明转录因子蛋白的检测提供了工具。利用这种双链核酸分子包被的微孔板检测转录因子蛋白，首先要将含有转录因子蛋白的细胞或组织抽提物(cell or tissue extracts)，一般为细胞核抽提物(nuclear extracts)，与特定化学物质配方的DNA结合缓冲液(DNA binding buffer)混合，在微孔板外孵育适当时间，再将孵育物加入双链核酸分子包被的微孔板内，在适宜温度下继续孵育适当时间，使抽提物中的转录因子蛋白与包被到微孔板表面双链核酸分子结合，形成“核酸/蛋白质”复合物(complex)。需要强调的是，此步反应中，应在DNA结合缓冲液中加入适量的非竞争性DNA(noncompetitiveDNA)，如鲑鱼精DNA(salmon sperm DNA)、鲱鱼精DNA(herring sperm DNA)、担体DNA[poly(dI-dC)、poly(dA-dT)]等，先将“非竞争性DNA/抽提物/结合缓冲液”系统在微孔板外孵育适当时间，才可以加入双链核酸分子包被的微孔板，以防形成非特异性结合。另外，在细胞或组织抽提物与微孔板孵育前，可先用封闭剂对微孔板进行封闭处理，如BSA、脱脂奶粉、Denhardt试剂、BLOTTO试剂、商业化Blocking试剂等，以防形成非特异性结合和增高背景。转录因子蛋白与双链核酸分子包被的微孔板的特异性反应，可以通过向结合体系中掺入过量的冷探针DNA观察其对信号的影响加以评判。含有转录因子蛋白的细胞或组织抽提物与双链核酸分子包被的微孔板反应后，除去反应液，再用适宜的洗涤液洗涤微孔板，如含有微量非离子去污剂Tween 20、Triton X-100的马莱酸缓冲液(maleate buffer)、磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)，以除去非特异性结合的蛋白质。

含有转录因子蛋白的细胞或组织抽提物与双链核酸分子包被的微孔板孵育反应并充分洗涤后，将核酸外切酶III反应液加入微孔板孵育一定时间，使核酸外切酶III与微孔板中的DNA发生酶切反应；酶切反应结束后，除去酶切反应液，再用适宜的洗涤液洗涤微孔板，如含有微量非离子去污剂Tween20、Triton X-100的马莱酸缓冲液(maleate buffer)、磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)，以除去非特异性吸附的酶等。

核酸外切酶III在微孔板中的酶切反应有两种情况，当微孔板中的DNA与转录因子蛋白形成“DNA/转录因子蛋白”复合物时，则当核酸外切酶III消化至转录因子蛋白覆盖的DNA附近时，由于转录因子蛋白形成的空间障碍，核酸外切酶III不能继续前进，则位于被消化链(核酸分子B)5′端或附近的特殊标记耦连的核苷酸不能被酶切释放入反应溶液中，即成为游离的单核苷酸；而当微孔板中的DNA未与转录因子蛋白形成“DNA/转录因子蛋白”复合物时，则核酸外切酶III的消化可到达被消化链(核酸分子B)5′端或附近的特殊标记耦连的核苷酸，特殊标记耦连的核苷酸则被酶切释放入反应溶液中，成为游离的单核苷酸。酶切反应结束后，从微孔板除去转录因子蛋白抗体包括能与待检转录因子蛋白发生特异性结合的单抗、双抗及肽段，一般最好为单克隆抗体，以保证检测的特异性。转录因子蛋白抗体与微孔板孵育反应后，除去核酸外切酶III反应液并洗涤微孔板，那些被核酸外切酶III酶切释放入反应溶液中的游离的单核苷酸则从微孔板被清除。在被检测分析的细胞或组织抽提物中转录因子蛋白的含量越高、活性越好，则在细胞或组织抽提物与微孔板孵育时，形成的“DNA/转录因子蛋白”复合物越多，相应保留在微孔板上的受转录因子蛋白保护而不被核酸外切酶III酶切的特殊标记耦连的核苷酸则越多，后续反应中针对特殊标记的检测信号则越强，使转录因子蛋白与特殊标记的检测信号间存在数量依存关系。

核酸外切酶III反应结束并充分洗涤后，将针对核酸分子上特殊标记的特异性结合物加入微孔板孵育一定时间，使特异性结合物与核酸分子上的特殊标记发生特异性结合，形成“特殊标记/特异性结合物”复合物。此处仅举两例对此步“特殊标记/特异性结合物”复合物形成加以说明：

若核酸分子B含有的特殊标记耦连的核苷酸，其特殊标记为地高辛(digoxigenin，DIG)，则加入微孔板孵育的特异性结合物为地高辛抗体；若核酸分子B含有的特殊标记耦连的核苷酸，其特殊标记为生物素(biotin)，则加入微孔板孵育的特异性结合物可为生物素抗体、亲合素(avidin)、链亲合素(streptavidin)。

为便于检测分析，加入微孔板孵育的特异性结合物，可对其进行化学修饰、标记等处理，包括放射性同位素标记、荧光染料标记、碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，AP)、过氧化物酶(Peroxidase)等酶标、胶体金(gold)等金属颗粒标记等。一般情况下，为降低实验成本和提高检测的灵敏性，特异性结合物的标记最好是碱性磷酸酶、过氧化物酶等酶标。

微孔板中核酸分子B上的特殊标记与其特异性结合物发生特异性结合反应后，依据特异性结合物所携带的化学修饰或标记的物理或化学性质进行下一步检测分析。此处仅举四例对此步反应加以说明：

若特异性结合物用放射性同位素标记，如³H、¹²⁵I、³²P等同位素，则加入特异性结合物孵育适当时间后洗板，再对微孔板进行γ射线仪、液闪仪等测定；若特异性结合物用荧光素标记，如FITC、Cy3、Cy5等，则加入特异性结合物孵育适当时间后洗板，再对微孔板进行荧光测定；若特异性结合物用胶体金(gold)等金属颗粒标记，则加入特异性结合物孵育适当时间后洗板，再对微孔板进行分光光度测定。一般情况下，特异性结合物标记为碱性磷酸酶、过氧化物酶等酶标，此种情况下，加入特异性结合物孵育适当时间后洗板，再加入酶反应底物(developing substrate，developing solution)，采用化学生色(colorimetric)或发光(chemiluminescent)等技术进行信号检测。化学生色试剂如BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate)、BCIP/INT[2-(4-iodophenyl)-5-(4-nitrophenyl)-3-phenyltetrazolium chloride]、BCIP/NBT、BCIP/TNBT(5-bromo-4-chloro-3-indoxyl phosphate/tetranitroblue tetrazolium)、NBT(4-Nitroblue tetrazolium chloride)、pNPP(p-Nitrophenyl phosphate)、ABTS(2，2′-AZINO-bis[3-ethylbenziazoline-6-sulfonic acid])、Fast RED、TMB(3，3′，5，5′-tetramethylbenzidine)等，化学发光试剂如CDP-Star、CSPD、LumiGLO、POD、AttoPhos等。根据反应性质，选择相应的检测仪器，如化学生色标记可以采用酶标仪(如SUNRISE酶标仪)进行检测分析，化学发光标记可以采用带化学发光检测功能的凝胶成相系统等进行检测分析。

(3)、技术效果

转录因子蛋白因负责基因表达的调控成为目前基因组和蛋白组研究所重视的一类重要蛋白质，而且许多疾病与转录因子异常表达及活化间存在的密的关系，引起了生物医药领域对转录因子研究的关注，转录因子已经成为转录治疗和药物研究的重要靶点。在这些背景下，有关转录因子功能检测及分析的技术研究受到科学界的重视。多种基于DNA/蛋白质相互作用这一层次的转录因子检测分析技术得到发展，如电泳迁移率变动分析。这一技术及相关的改进技术目前虽然有效地用于转录因子的检测分析，但它们存在放射性标记对实验人员及环境危害的缺陷、对实验样品数量需求大、实验耗时长、分析效率低及难以高通量化获取生物等缺陷。为了建立从技术思想角度上完全不同于凝胶迁移实验的转录因子表达及活化检测及分析技术，我们已经进行了诸多相关研究，并发展了一些新的技术。其中，最重要的是利用基因芯片技术的策略，将含有转录因子蛋白结合位点的双链DNA固定到固相载体如玻片表面，制备双链DNA微阵列芯片，用于转录因子表达及活化的检测及分析(中国专利ZL02112780.8，02137945.9，03152881.3，03132206.9)，并将这些技术用于从复杂组分物质如中药和组合化学混合物中高通量筛选、捕获和分离目标分子(中国专利03152882.1)。

但我们注意到这些技术目前的推广应用仍然面临很大的困难，特别是价值昂贵的芯片制备和信号获取设备，极大地限制了双链DNA微阵列芯片技术的商业化。因此，我们采用本发明提出的技术对双链DNA微阵列芯片技术进行改进，即将DNA固相化技术与核酸外切酶III及微孔板实验技术结合在一起，提出了“核酸外切酶III消化微孔板包被特殊标记双链核酸分子检测转录因子蛋白”的技术。这一技术将双链DNA微阵列芯片技术中的DNA固定介质有玻片改为常用于进行酶联免疫吸附实验的微孔板，检测仪器自然由昂贵的基因芯片扫描装置改变为成本低廉的酶标仪等。这一改进，保持了双链DNA微阵列芯片技术的高通量分析功能，但极大地降低了制备和使用成本，能够很好地解决我们建立的双链DNA微阵列芯片技术的应用化问题。

本发明提供了一种制备和使用成本较低的检测转录因子表达和活化水平的新方法，便于在普通设备条件下制备双链核酸分子包被微孔板，依靠用于传统酶联免疫吸附实验的酶标仪、洗板机等低价设备，运用成熟的酶联免疫吸附实验技术流程实现转录因子表达和活化水平的高通量检测分析。我们的研究及产品研发实验说明，在普通实验设备条件下，使用较小的资金消耗，就可以实现双链核酸分子包被微孔板、转录因子蛋白及抗体的制备等重要生产，出产出可投入到科研、医疗等产品应用场所所能够使用的双链核酸分子包被微孔板试剂盒。质量检测和分析表明，双链核酸分子包被微孔板试剂盒可稳定可靠地用于在短时间内实现对转录因子蛋白的表达、活化及其与DNA相互作用的检测分析。因此，该技术将为分子生物学、功能基因组学、蛋白质组学等领域中的转录因子的相关研究提供一种新的实验技术，促进这些领域中转录因子相关的科学研究。

需要特别说明的是，本发明技术生产的双链核酸分子包被微孔板试剂盒，将在临床辅助诊断和生物医学中针对转录因子的药物筛选研究具有非常重要的应用价值。例如，转录因子p53、NF-kB的表达及活化异常，在许多疾病中发挥的重要作用，因此成为临床诊断中观测的重要靶点，同时也是转录治疗和药物筛选重要靶点。我们目前已经着手申报该产品的药证及建立系统的转录治疗药物筛选体系，促进产品的商业化应用。

四、附图说明：

图1双链核酸分子包被的微孔板示意图

图2核酸外切酶III消化微孔板包被特殊标记双链核酸分子检测转录因子实验流程图例a

注解：PBS：蛋白质结合位点(Protein Binding Site)

DIG：地高辛(digoxigenin)

PB：蛋白质结合(Protein Binding)

EB：核酸外切酶III结合(exonucleaseIII Binding)

ED：核酸外切酶III降解(exonucleaseIII degrading)

W：洗涤(washing)

ADAB：碱性磷酸酶标记的DIG抗体结合(AP-coupled DIG antibody binding)

DS：发展溶液(developing solution)

S：扫描(Scanning)

图3核酸外切酶III消化微孔板包被特殊标记双链核酸分子检测转录因子实验流程图例b

注解：PBS：蛋白质结合位点(Protein Binding Site)

BIO：生物素(biotin)

PB：蛋白质结合(Protein Binding)

EB：核酸外切酶III结合(exonucleaseIII Binding)

ED：核酸外切酶III降解(exonucleaseIII degrading)

W：洗涤(washing)

ASB：碱性磷酸酶标记的链亲合素结合(AP-coupled streptavidin binding)

DS：发展溶液(developing solution)

S：扫描(Scanning)

图4核酸外切酶III消化微孔板包被特殊标记双链核酸分子检测转录因子结果示例图

注解：行A：不加转录因子p50、核酸外切酶III不处理的BluePhos生色检测结果行B：不加转录因子p50、核酸外切酶III处理的BluePhos生色检测结果行C-D：加不同量转录因子p50、核酸外切酶III处理的BluePhos生色检测结果该示例图为本说明书第五项具体实施方式中3的实验结果。

五、具体实施方式

此处仅以制备DIG标记的双链核酸分子包被微孔板及检测转录因子蛋白NF-κB的实验，示例说明本发明专利的具体实施方式。

1、双链核酸分子的设计及化学合成

NF-κB(Nuclear Factor kappaB)是一类序列特异性转录因子，当细胞受到炎症介质、病毒感染、氧化应激等多种物质刺激后，NF-κB在胞质内被激活，进入细胞核与病毒、细胞因子、生长因子、细胞粘附分子、急性相反应蛋白、酶等基因增强子序列结合，增强基因转录；因而在一系列由细胞因子、炎症介质及蛋白酶类参与的疾病的发病过程中发挥重要作用。大量研究表明NF-κB过度活化与炎症、血管疾病、肿瘤、病毒感染、脑血管疾病、阿尔茨海默病、帕金森氏病、过敏性脑炎、感染性休克、风湿性关节炎、支气管哮喘、动脉粥样硬化、溃疡性结肠炎等病理过程存在非常密切的关系。目前，NF-κB已成为新药开发的重要靶点，许多生物和生化抑制剂能够阻断NF-κB信号通路或抑制NF-κB/DNA结合，从而有助于NF-κB相关疾病的治疗。

NF-κB是由RelA/p65、RelB、c-Rel、NF-κB1/p50和NF-κB2/p52五种蛋白构成的一个蛋白家族，五种蛋白间可以形成同二聚体(homodimer)或异二聚体(heterodimer)，与基因组DNA中的共同基序(consensus)DNA序列发生序列特异性识别结合，调控今音的表达。基因组中与NF-κB结合的共同基序DNA序列表达一般为5′-GGGACTTTCC-3′。因此，设计和制备用于检测转录因子NF-κB的双链核酸分子包被微孔板时，所准备的双链核酸分子上必须含有NF-κB结合的共同基序DNA序列，此处我们使用最常见的5′-GGGACTTTCC-3′位点。

我们设计并由中国上海博亚生物技术有限公司(BIOASIA Biologic Technology Co.LTD.，Shanghai，China)合成如下两条碱基序列反向互补的寡核苷酸，用于包被微孔板：TFexoDE-1：5′...TGCGATTAGAACTGGGGACTTTCCCAGCGATTGACTGAGTGGTCGTCGGCGTGTGCTTTT-NH₂...3′TFexoDE-1c：3′...ACGCTAATCTTGACCCCTGAAAGGGTCGCTAAC TGACTCACCAG CAGCCGCACACG...5′( T：dT-DIG-labeled)

将寡核苷酸TFexoDE-1以100uM浓度溶解在寡核苷酸结合缓冲液(50mM Na₃PO₄，pH8.5，1mM EDTA)中，将寡核苷酸TFexoDE-1c以50nM浓度溶解在标准杂交液(5×SSC，0.02％SDS，0.1％N-lauroylsarcosine，1×blocking solution，其中blocking solution为Roche产品)中。

2、双链核酸分子包被微孔板的制备

我们选用Coming Costar公司生产的DNA-BIND^TM透明聚苯乙烯96微孔板(DNA-BIND^TM clear96 well polystyrene microplate，Cat.No.2505，Coming Costar)来制备双链核酸分子包被的微孔板。该类聚苯乙烯96微孔板表面已经包备了一层反应性N-氧琥珀酰亚胺酯(N-oxysuccinimide esters，NOS groups)基团，即NOS基团。NOS基团被共价连接在聚苯乙烯微孔板表面，可与α-氨基(primary amino)等亲核基团发生反应，从而将氨基末端修饰的DNA分子共价连接到聚苯乙烯微孔板表面。其反应程式如下：

具体操作中，将100μM浓度溶解在寡核苷酸结合缓冲液中的寡核苷酸TFexoDE-1再用寡核苷酸结合缓冲液稀释到DNA浓度为1pmol/ul，再将稀释后的DNA溶液以每孔100μl的体积加入DNA-BIND^TM聚苯乙烯96微孔板中。将微孔板在4℃冰箱孵育过夜。

次日从4℃冰箱中取出微孔板，吸去DNA溶液，用马莱酸缓冲液(100mM maleate，150mMNaCl，pH7.5)洗涤微孔板3次，除去未藕联(coupled)的DNA。

向微孔板中加入200μl含有3％BSA的寡核苷酸结合缓冲液，37℃孵育30分钟，再吸干溶液。该步处理的目的在于封闭微孔板表面未反应的活性基团。

微孔板封闭处理后，每孔内加入100μl溶解在标准杂交液中的寡核苷酸TFexoDE-1c，65℃孵育60分钟。吸干杂交液，用56℃预热的2×SSC，0.1％SDS溶液洗涤微孔板两次，并浸泡5分钟，吸干溶液。

至此，则制备好了可用于检测转录因子NF-κB的双链核酸分子包被微孔板。包被好的微孔板应密闭保存在4℃冰箱。

3、用双链核酸分子包被微孔板检测转录因子NF-κB(纯蛋白)

向上面制备的双链核酸分子包被微孔板中加入200μl 1×blocking溶液(Cat.No.1096176，Roche)。37℃孵育30分钟，再吸干溶液。

将转录因子NF-κB蛋白[rhNF-κB(p50)，E3770，Promega)]以不同的浓度稀释在DNA结合缓冲液(10mM HEPES pH7.9，50mM KCl，2.5mM DTT，0.1mM EDTA，0.05％NP-40，10％Glycerol，5％fetal bovine serum)中，37℃孵育10分钟后，以每孔100μl的体积加入双链核酸分子包被微孔板中，37℃继续孵育50分钟。吸干DNA结合缓冲液，用含0.3％Tween 20的马莱酸缓冲液洗涤微孔板2次，每次10分钟。

将核酸外切酶III(Fermentas Life Science)反应液(1U/μl ExonucleaseIII，66mM Tris-HCl，pH8.0 at 30℃，0.66mM MgCl₂)以每孔100ul的体积加入微孔板中，37℃孵育10分钟。吸干核酸外切酶III反应液，用含0.3％Tween20的马莱酸缓冲液洗涤微孔板2次，每次10分钟。

将碱性磷酸酶标记的DIG抗体(Anti-Digoxigenin-AP，Fab fragments，Cat.No.1093274，Roche)以1∶10000的浓度稀释在1×blocking溶液(Cat.No.1096176，Roche)中，以每孔100μl的体积加入核酸外切酶III处理的微孔板中，37℃孵育30分钟。吸干抗体溶液，用含0.3％Tween20的马莱酸缓冲液洗涤微孔板2次，每次10分钟。

将碱性磷酸酶化学生色底物(BluePhosMicrowell Phosphatase Substrate System，Cat.No.50-88-00，KPL)室温预热(SolutionA，SolutionB)，按实验所需量等量混合SolutionA和SolutionB，混匀后以每孔100μl的体积加入二抗结合过的微孔板中，室温孵育适宜时间。加入100μl2.5％的EDTA溶液，终止显色反应。

将终止显色反应的微孔板置入SUNRISE酶标仪(TECAN)，在602nm波长下读取吸光值。依据蛋白梯度和吸光值制作标准曲线。

4、用双链核酸分子包被微孔板检测转录因子NF-κB(核抽提物)

向上面制备的双链核酸分子包被微孔板中加入200μl 1×blocking溶液(Cat.No.1096176，Roche)。37℃孵育30分钟，再吸干溶液。

将5-10μg含有转录因子NF-κB蛋白的核抽提物(HeLa Nuclear Extract，TNF-α-stimulated，20min)稀释在DNA结合缓冲液[10mM HEPES pH7.9，50mM KCl，2.5mM DTT，0.1mM EDTA，0.05％NP-40，10％Glycerol，5％fetal bovine serum，0.05mg/ml poly(dI-dC)]中，37℃孵育10分钟后，以每孔100μl的体积加入双链核酸分子包被微孔板中，37℃继续孵育50分钟。吸干DNA结合缓冲液，用含0.3％Tween20的马莱酸缓冲液洗涤微孔板2次，每次10分钟。

将核酸外切酶III(Fermentas Life Science)反应液(1U/μl Exonuclease III，66mM Tris-HCl，pH8.0 at 30℃，0.66mM MgCl₂)以每孔100μl的体积加入微孔板中，37℃孵育10分钟。吸干核酸外切酶III反应液，用含0.3％Tween 20的马莱酸缓冲液洗涤微孔板2次，每次10分钟。

将碱性磷酸酶标记的DIG抗体(Anti-Digoxigenin-AP，Fab fragments，Cat.No.1093274，Roche)以1∶10000的浓度稀释在1×blocking溶液(Cat.No.1096176，Roche)中，以每孔100μl的体积加入核酸外切酶III处理的微孔板中，37℃孵育30分钟。吸干抗体溶液，用含0.3％Tween20的马莱酸缓冲液洗涤微孔板2次，每次10分钟。

将碱性磷酸酶化学生色底物(BluePhosMicrowell Phosphatase Substrate System，Cat.No.50-88-00，KPL)室温预热(SolutionA，SolutionB)，按实验所需量等量混合SolutionA和SolutionB，混匀后以每孔100μl的体积加入二抗结合过的微孔板中，室温孵育适宜时间。加入100μl2.5％的EDTA溶液，终止显色反应。

将终止显色反应的微孔板置入SUNRISE酶标仪(TECAN)，在602nm波长下读取吸光值。依据蛋白标准曲线进行定量。

Claims (19)

1、核酸外切酶III消化包被在微孔板上的含有特殊标记的双链核酸分子检测转录因子蛋白，提出了一种检测转录因子表达和活化水平的新方法，其特征在于运用该方法检测转录因子蛋白表达和活化水平包括如下步骤：

a)准备含有特殊标记的核酸分子；

b)将含有特殊标记的核酸分子连接固定到微孔板孔内；

c)将转录因子蛋白与微孔板孵育；

d)将核酸外切酶III反应液与微孔板与孵育；

e)将核酸分子上特殊标记的特异性结合物与微孔板孵育；

f)对特异性结合物进行检测分析，反映转录因子蛋白表达和活化水平。

2、根据权利要求1所述的核酸外切酶III消化包被在微孔板上的含有特殊标记的双链核酸分子检测转录因子蛋白，其特征在于步骤(a)中准备的核酸分子，包括化学合成的寡核苷酸、通过聚合酶链式反应制备的核酸分子及来自生物基因组的核酸分子；

3、根据权利要求1所述的核酸外切酶III消化包被在微孔板上的含有特殊标记的双链核酸分子检测转录因子蛋白，其特征在于步骤(a)中准备的核酸分子，为两条具有特殊结构特征的单链核酸分子A和B复性后形成的双链核酸分子；

4、根据权利要求3所述的核酸分子A和B，其特征在于核酸分子A和B是两条碱基序列反向互补的单链核酸分子；

5、根据权利要求3所述的核酸分子A和B，其特征在于核酸分子A的3′末端依据微孔板表面的化学基团进行了相应的化学修饰，以便将核酸分子通过化学反应连接固定到微孔板表面；

6、根据权利要求3所述的核酸分子A和B，其特征在于核酸分子A和B退火后，核酸分子B的3′末端与核酸分子A的5′末端或平齐、或凹进、或突出1到4个核苷酸，以便外切核酸酶III作用于A和B复性后形成的双链核酸分子时，能从核酸分子B的3′末端降解B；

7、根据权利要求3所述的核酸分子A和B，其特征在于在核酸分子B的5′末端或靠近5′末端含有特殊标记耦连的核苷酸；

8、根据权利要求3所述的核酸分子A和B，其特征在于核酸分子B含有特殊标记耦连的核苷酸，特殊标记为地高辛、生物素、荧光素等可依靠其化学特性进行检测分析的化学分子；

9、根据权利要求3所述的核酸分子A和B，其特征在于核酸分子A和B退火后形成的双链核酸分子上，含有转录因子蛋白可识别并与之结合的核苷酸序列；

10、根据权利要求3所述的核酸分子A和B，其特征在于核酸分子B的转录因子蛋白结合序列位于特殊标记耦连的核苷酸和3′末端之间；

11、根据权利要求1所述的核酸外切酶III消化包被在微孔板上的含有特殊标记的双链核酸分子检测转录因子蛋白，其特征在于步骤(b)中所用于连接固定核酸分子的微孔板，包括各种类型和材料的微孔板，并且为便于将核酸分子连接固定到微孔板孔内，对微孔板进行了物理或化学处理，使微孔板表面带有某种化学基团；

12、根据权利要求1所述的核酸外切酶III消化包被在微孔板上的含有特殊标记的双链核酸分子检测转录因子蛋白，其特征在于步骤(b)中将核酸分子连接固定到微孔板孔内的过程，是核酸分子末端所修饰的化学基团与微孔板表面修饰的化学基团间发生化学反应，从而将核酸分子牢固地固定到微孔板表面的过程；

13、根据权利要求1所述的核酸外切酶III消化包被在微孔板上的含有特殊标记的双链核酸分子检测转录因子蛋白，其特征在于步骤(c)中与微孔板孵育的转录因子蛋白，为各种来源的转录因子蛋白，包括人工表达制备的转录因子蛋白、从细胞或组织裂解物中分离纯化的转录因子蛋白、含有转录因子蛋白的细胞或组织抽提物；

14、根据权利要求1所述的核酸外切酶III消化包被在微孔板上的含有特殊标记的双链核酸分子检测转录因子蛋白，其特征在于步骤(c)中转录因子蛋白与微孔板的孵育，是转录因子蛋白与微孔板表面固定的核酸分子间特异性识别并结合的过程；

15、根据权利要求1所述的核酸外切酶III消化包被在微孔板上的含有特殊标记的双链核酸分子检测转录因子蛋白，其特征在于步骤(d)中核酸外切酶III反应液与微孔板的孵育，是将含有核酸外切酶III的反应溶液加入微孔板内，使核酸外切酶III对微孔板上包被的核酸分子产生酶切反应的过程；

16、根据权利要求1所述的核酸外切酶III消化包被在微孔板上的含有特殊标记的双链核酸分子检测转录因子蛋白，其特征在于步骤(e)中核酸分子上特殊标记的特异性结合物，是依靠其特殊的化学性质，可与核酸分子上特殊标记发生特异性结合反应的化学物质，包括抗体、亲合素、链亲合素等化学物质；

17、根据权利要求1所述的核酸外切酶III消化包被在微孔板上的含有特殊标记的双链核酸分子检测转录因子蛋白，其特征在于步骤(e)中核酸分子上特殊标记的特异性结合物，为便于对其检测分析，可进行化学修饰、标记等处理，包括放射性同位素标记、荧光染料标记、碱性磷酸酶、过氧化物酶等酶标、胶体金等金属颗粒标记；

18、根据权利要求1所述的核酸外切酶III消化包被在微孔板上的含有特殊标记的双链核酸分子检测转录因子蛋白，其特征在于步骤(e)中核酸分子上特殊标记的特异性结合物与微孔板孵育，是特异性结合物与微孔板表面核酸分子上的特殊标记间发生特异性识别并结合的过程；

19、根据权利要求1所述的核酸外切酶III消化包被在微孔板上的含有特殊标记的双链核酸分子检测转录因子蛋白，其特征在于步骤(f)中对特异性结合物的检测分析，是依据特异性结合物本身的物理或化学性质直接对其进行检测分析，或依据特异性结合物的化学修饰及标记的物理或化学性质进行检测分析；特异性结合物的检测分析结果间接地反映转录因子蛋白表达和活化水平。

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