JP3799392B2

JP3799392B2 - １個の抗原特異的ｂリンパ球を用いた抗原特異的抗体産生ハイブリドーマの作製方法及びモノクローナル抗体の製造方法

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Description

本発明は、１個の抗原特異的Ｂリンパ球を用いた抗原特異的抗体産生ハイブリドーマの作製方法及びモノクローナル抗体の製造方法に関する。

従来から、モノクローナル抗体を製造するために、抗原特異的抗体産生ハイブリドーマが作製されている。従来のハイブリドーマの作製方法では、ハイブリドーマを作製した後に抗原特異的抗体を産生するハイブリドーマクローンをスクリーニングする。しかし、ハイブリドーマの作製はあまり効率の良いものではない。すなわち、全てのＢリンパ球がハイブリドーマになるわけではなく、ミエローマと細胞融合を起こしたＢリンパ球の一部がハイブリドーマになるからである。また、抗原で刺激した脾細胞を用いてハイブリドーマを作製しても、抗原特異的抗体産生ハイブリドーマだけができるわけではなく、できてくるハイブリドーマのほとんどは関係ない抗体を産生しているか、抗体自身を産生していない。
例えば、従来の方法で目的の抗体を産生しているハイブリドーマを見つけようとする場合、免疫したマウスから取ってきた脾細胞を使ってミエローマとの細胞融合を行い、９６ウェルプレート１０枚くらいに蒔く。全部の細胞を使うともっと蒔けるが、１人でスクリーニングを行う場合は時間的制限があり、残りはフリーズなどして保存する。この方法により、通常５００個くらいのウェルのハイブリドーマが増殖する。
ところが、５００個のウェルからハイブリドーマが全て同じようなスピードで増殖してくるわけではなく、早く増殖するものもあればゆっくり増殖するものもある。従って、５００個全部の増殖を同時にチェックできない。まず、顕微鏡下でどのウェルから細胞が増殖してきており、抗体をチェックするのに適した細胞数まで増殖しているかをチェックする。その上で、適当なウェルから細胞上清を採取し、抗原特異的抗体を産生しているかをチェックする。この細胞のチェックと細胞上清のチェックは素早く行う必要がある。というのは、ハイブリドーマはどんどん増殖するので、放っておくと増殖しすぎて培地の栄養状態が悪くなり死滅するからである。従って、欲しいハイブリドーマが死んでしまわないうちにスクリーニングし終わらなければならない。
また、目的のハイブリドーマが増殖しているウェルが見つかった場合、そのウェルには通常、目的の抗体を産生しているハイブリドーマのほかに別の抗体を産生しているハイブリドーマが増殖していることがしばしばある。また、ハイブリドーマ自体染色体を落としながら増殖するので、抗体を産生していたハイブリドーマが抗体の染色体を喪失してしまうことにより抗体を作らなくなる場合もある。このような細胞の増殖は通常、抗体を産生しているハイブリドーマよりも速いことが多く、放っておくと培養している細胞のほとんどが抗体を産生していない細胞になってしまう。従って、欲しいハイブリドーマが増殖しているウェルが見つかるとすぐにそのウェルの細胞を９６ウェルプレートに１個の細胞が１個のウェルになるようにまき直して（限界希釈法）、もう一度、ほしい抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングし直す（二次スクリーニング）。目的のハイブリドーマを検出後、二次スクリーニングまでを速やかに、細胞の状態が悪くならないうちに終えてしまう必要がある。
上記のように、全ての作製したハイブリドーマをスクリーニングせずに、一部だけを使ってスクリーニングすることになることがあるので、頻度の低い抗原特異的抗体産生ハイブリドーマを得ることはむずかしくなる。
より具体的には、人の抗原特異的抗体の場合、末梢Ｂリンパ球をＥＢウィルスで形質転換させ株化して抗原特異的抗体を産生している細胞をスクリーニングする方法がある（リンパ球機能検索法（改訂５版）矢田純一、藤原道夫編著、中外医学社、１９９４年、「ヒトモノクローナル抗体作製へのＥＢウィルストランスフォームＢ細胞の利用」水野文雄、大里外誉郎、ｐｐ３８１−３９１）。この方法の場合、樹立できるリンパ球細胞株の頻度が低いことから、抗原特異的抗体産生Ｂリンパ球細胞株を得られる確率は非常に低い。また、細胞株の樹立に１ヶ月程度かかり時間がかかる。さらに、樹立されたＢリンパ球細胞株が産生する抗体量は少ない。マウスの場合はハイブリドーマを作製することができるが、人の場合は効率のよいハイブリドーマの系は作成されていない。
マウスの場合、ハイブリドーマを作製することができる。従来、ハイブリドーマの作製は、マウスを抗原で免疫し、そのマウスから脾臓あるいはリンパ節を取りだし、リンパ球を調製し、調製した約１０^８個のリンパ球と約１０^７個のミエローマ細胞とをポリエチレングリコールを用いて、ないしは電圧をかけることにより融合させ、ＨＡＴ等の選択培地で培養し、増殖してきたハイブリドーマが抗原特異的抗体を産生しているかをＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー等を用いてスクリーニングし、抗原特異的抗体産生ハイブリドーマを選択する（リンパ球機能検索法（改訂５版）矢田純一、藤原道夫編著、中外医学社、１９９４年、「Ｂ細胞ハイブリドーマによるモノクローナル抗体作製法」成内秀夫、ｐｐ５７４−５７６、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｉｎ“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”ｂｙＥｄＨａｒｌｏｗａｎｄＤａｖｉｄＬａｎｅ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ１３９−ｐｐ２４４，１９８８）。この方法を用いることにより、３００〜４００ウェルからハイブリドーマが増殖するが、その中で抗原特異的抗体を産生しているハイブリドーマが増殖しているウェルは数％である。この数は用いた抗原によって異なるが、抗原特異的抗体産生Ｂリンパ球の頻度が低い場合、この方法でハイブリドーマを作製することは困難である。
そこで本発明は、頻度が比較的高い抗原特異的リンパ球は勿論のこと、頻度の低い抗原特異的リンパ球であっても、簡便に特定の抗原に特異的に反応するリンパ球を選択し、この選択された抗原特異的Ｂリンパ球から、抗原特異的抗体産生ハイブリドーマを作製する方法を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、作製された抗原特異的抗体産生ハイブリドーマからモノクローナル抗体を製造する方法を提供することも目的とする。

本発明は、ある抗原に特異的に反応するＢリンパ球（以下、抗原特異的Ｂリンパ球という）を１個選択し、選択した抗原特異的Ｂリンパ球を培養し、培養により増殖した抗原特異的Ｂリンパ球をミエローマ細胞と融合させハイブリドーマを作製することを含む、抗原特異的抗体産生ハイブリドーマの作製方法に関する。
上記作製方法においては、前記選択した抗原特異的Ｂリンパ球の培養は、抗ＣＤ４０抗体またはＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）及びインターロイキン４（ＩＬ−４）を含むインターロイキンの共存下で行うこと、
前記選択した抗原特異的Ｂリンパ球の培養は、Ｂリンパ球を増殖することができるマイトーゲン（例えば、ＬＰＳなど）の共存下で行うこと、または
前記選択した抗原特異的Ｂリンパ球の培養は、抗ＣＤ４０抗体またはＣＤ４０ＬおよびＩＬ−４を含むインターロイキンおよびマイトーゲン（例えば、ＬＰＳなど）の共存下で行うこと、
箭記１個の抗原特異的リンパ球の選択はフローサイトメータ、またはマイクロウェルアレイチップを用いて行うこと、
前記１個の抗原特異的リンパ球の選択は、１個の被検体リンパ球が含まれるマイクロウェルを複数有する抗原特異的リンパ球検出用マイクロウェルアレイチップの各マイクロウェルに抗原を添加し、次いで、抗原に反応したリンパ球を検出し、検出された抗原特異的リンパ球をマイクロウェルから取り出すことにより行うこと、並びに
抗原特異的リンパ球は、頻度が０．１％以下であることができる。
さらに本発明は、上記本発明の方法により作製されたハイブリドーマを用いて、モノクローナル抗体を製造する方法に関する。

図１は、細胞内Ｃａイオンの濃度変化をＣａイオン依存性の蛍光色素を用いることにより測定する方法の説明図である。
図２は、蛍光色素を用いる方法におけるマイクロウェルアレイチップへの細胞の分注、抗原刺激、取り出しまでについての説明図である。
図３はＯＶＡで免役したマウス血清中のＯＶＡに対する抗体をＥＬＩＳＡにより測定した結果である。
図４は方法で樹立したＯＶＡ特異的抗体を産生するハイブリドーマの培養上清中の抗体をＥＬＩＳＡにて測定した結果である。

血液中のリンパ球は１個１個がそれぞれ別々の抗原に反応する。そこで、本発明では、例えば、抗原に特異的に反応したＢリンパ球を検出し、このＢリンパ球から、ハイブリドーマを作製する。
従来のハイブリドーマの作製では、免疫したマウスから調製してきた脾細胞を何の処理もせず、直接ミエローマ細胞と融合して、ハイブリドーマを作製し、抗原特異的な抗体を産生しているかは、ハイブリドーマが増殖してから調べはじめた。それに対して本発明の方法では、抗原特異的な抗体を作っているＢリンパ球をまず検出、採取し、採取された抗原特異的Ｂリンパ球を用いて、ハイブリドーマを作製する。
［抗原特異的リンパ球の選択］
１個の抗原特異的リンパ球の選択は、例えば、フローサイトメータ、またはマイクロウェルアレイチップを用いて行うことができる。
フローサイトメータを用いる１個の抗原特異的リンパ球の選択は、常法により行うことができる。
マイクロウェルアレイチップを用いた方法では、例えば、１個の被検体リンパ球が含まれるマイクロウェルを複数有する抗原特異的リンパ球検出用マイクロウェルアレイチップの各マイクロウェルに抗原を添加し、次いで、抗原に反応したリンパ球を検出し、検出された抗原特異的リンパ球をマイクロウェルから取り出すことにより、１個の抗原特異的リンパ球を得ることができる。この方法について、より具体的に説明する。
（マイクロウェルアレイチップ）
マイクロウェルアレイチップとしては、複数のマイクロウェルを有し、かつ各マイクロウェルが被検体リンパ球を１個含むことができるものを使用することができる。各マイクロウェルが被検体リンパ球を１個含むことで、抗原特異的リンパ球を細胞レベルで特定することが可能になる。即ち、このマイクロウェルアレイチップを用いると、マイクロウェルに含まれる被検体リンパ球が１個であることから、抗原に反応する被検体リンパ球を１個の細胞として特定でき、結果として、抗原特異的リンパ球を１個の細胞として検出できる。そして、検出された１個の抗原特異的リンパ球を取り出して、ハイブリドーマの作製に用いる。
但し、同一のマイクロウェルには、リンパ球以外の細胞が被検体リンパ球とともに含まれていても良い。リンパ球以外の細胞であれば、抗原に反応せず、検出されることもないからである。
マイクロウェルの形状や寸法には特に制限はないが、マイクロウェルの形状は、例えば、円筒形であることができ、円筒形以外に、直方体、逆円錐型等であることもできる。また、円筒形のマイクロウェルの寸法は、例えば、直径５〜１００μｍ、好ましくは５〜１５μｍであり、深さ５〜１００μｍ、好ましくは５〜３０μｍであることができる。
１つのマイクロウェルアレイチップが有するマイクロウェルの数は、特に制限はないが、抗原特異的リンパ球の頻度が１０^５個に１個から多い場合には約５００個であるという観点から、１ｃｍ^２当たり、例えば、２，０００〜１００，０００個の範囲であることができる。
マイクロウェルには、被検体リンパ球が培養液とともに格納されている。培養液としては、例えば、以下のものを挙げることができる。
１．１３７ｍＭＮａＣｌ，２．７ｍＭＫＣｌ，１．８ｍＭＣａＣｌ_２，１ｍＭＭｇＣｌ_２，１ｍｇ／ｍｌグルコース，１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ，２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）
２．１０％ＦＣＳ（牛胎仔血清）含有ＲＰＭＩ１６４０培地
３．１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ含有ＲＰＭＩ１６４０培地
４．１０％ＦＣＳ（牛胎仔血清）含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭＥＭ培地
５．１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭＥＭ培地
被検体リンパ球は血液由来であることができ、例えば、Ｂリンパ球またはＴリンパ球であることができる。それ以外に扁桃腺（リンパ節）、脾臓等のリンパ組織由来リンパ球、がん浸潤リンパ球などの病変部位浸潤リンパ球等を挙げることができる。
（抗原特異的リンパ球の検出方法）
抗原特異的リンパ球の検出方法は、上記マイクロウェルアレイチップの各マイクロウェルに抗原を添加し、細胞を刺激し、抗原に反応する細胞を検出することを含む。
各マイクロウェルへの抗原の添加は、以下のように行うことができる。
１．ピペットを用いてマイクロウェルアレイチップ全面を覆うように抗原液を添加する。
２．１ウェルずつ自動スポッターを用いて抗原液を添加する。
この方法により検出される抗原には、特に制限はないが、例えば、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、または糖鎖等であることができる。また、抗原は、細菌、ウィルス、自己抗原、がん抗原またはアレルゲン等であることができる。
細胞の培養は、例えば、リンパ球を培養液に懸濁させ、ウェルに分注後、室温あるいは３７℃にて、空気中あるいはＣＯ_２インキュベータ内にて培養することで行うことができる。
抗原に反応する細胞の検出は、以下のように行うことができる。
例えば、Ｂリンパ球の抗原受容体（免疫グロブリン）に抗原が結合するとまず細胞内シグナル伝達が起こり、それに続いて細胞増殖、抗体産生が起こる。従って、細胞内シグナル伝達、細胞増殖、抗体産生を種々の方法により検知することにより、抗原に反応する細胞を検出することができる。
細胞内シグナル伝達を検出することによる、抗原に反応する細胞の検出は、例えば、細胞内Ｃａイオンの濃度変化をＣａイオン依存性の蛍光色素を用いることにより行うことができる。
細胞内Ｃａイオン濃度変化は、蛍光色素としてＦｕｒａ−２、Ｆｌｕｏ−３あるいはＦｌｕｏ−４を用い、検出装置として蛍光顕微鏡あるいはマイクロアレイスキャナーを用いる。
具体的には、図１に示すように、Ｂリンパ球にＣａイオン依存性蛍光色素であるＦｕｒａ−２、Ｆｌｕｏ−３あるいはＦｌｕｏ−４を導入する。次いで抗原でＢリンパ球を刺激すると、細胞内Ｃａイオン濃度が上昇する。その結果、ＣａイオンがＣａイオン依存性蛍光色素に結合し、蛍光強度が増強される。Ｃａイオン濃度が低いと青っぽい色、高いと赤っぽい色で示されている。この方法では、抗原で刺激されることにより細胞内Ｃａイオンが上昇したＢリンパ球（抗原特異的）を、マイクロウェルアレイチップを用いて検出できる。
細胞増殖を検出することによる、抗原に反応する細胞の検出は、例えば、細胞数を、生細胞特異的蛍光色素を用いて計測することによっても行うことができる。この方法は、具体的には、抗原でＢリンパ球を刺激しＣＯ_２インキュベータ内にて３７℃、３日間培養すると、細胞が増殖する。細胞が増殖後、培養液中にフルオレッセイン・ジアセテート（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｄｉａｃｅｔａｔｅ（ＦＤＡ））あるいはカルボキシ・フルオレッセイン・ジアセテート・スクシンイミジル・エステル（Ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｄｉａｃｅｔａｔｅ，ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅｓｔｅｒ（ＣＦＳＥ））溶液を加える。これらの試薬は生細胞の膜を透過し、細胞内でエステラーゼによって分解され、膜不透過性の蛍光色素を生成する。この蛍光色素の発光は細胞数に比例するためウェル内の生細胞が発光する蛍光強度の和を蛍光顕微鏡あるいはマイクロアレイスキャナーを用いて計測することにより生細胞数を測定する。
抗体産生を計測することによっても、抗原に反応する細胞の検出を行うことができる。抗体産生は抗体を免疫化学的に計測することにより検出できる。
具体的には、抗原でＢリンパ球を刺激しＣＯ_２インキュベータ内にて３７℃、１週間培養すると、抗体が培養液中に分泌される。培養液中に分泌された抗原特異的抗体をＥＬＩＳＡ法（酵素標識免疫吸着法）により検出する。
尚、この検出方法では、マイトゲン、レクチン、抗体、サイトカイン、ＰＭＡ、Ｃａイオノフォアを用いても、シグナル伝達、細胞増殖、抗体産生を検出することができる。
以下に、蛍光色素を用いる方法におけるマイクロウェルアレイチップへの細胞の分注、抗原刺激、取り出しまでについて図２に基づいて説明する。
（１）細胞の分注
ウェル１つずつに細胞を入れる。
ウェルに入れる細胞は、抗原により免疫したマウスの脾臓、リンパ節からリンパ球画分を分離後、Ｂリンパ球画分をさらに分離精製して得られる。
次に、Ｆｌｕｏ３／ＡＭ（２μＭ）溶液に細胞を懸濁させ、室温に３０分置き、さらに緩衝液で細胞を洗浄し、細胞内に負荷されなかった色素を除去する。
その後この細胞をマイクロウェルに分注する。
チップの両側にプラスチックシールを貼り、その上にカバーグラスを乗せ、緩衝液を満たすことで、乾燥を防ぐ。
（２）蛍光測定
まず、未刺激の細胞の蛍光を測定する。その際の蛍光強度（Ａ）を測定する。
次いで抗原溶液をスライドグラスとカバーグラスの隙間に流し入れ緩衝液と交換し、抗原による刺激を受けた細胞の蛍光を測定する。刺激後１〜２分後の蛍光強度（Ｂ）を測定する。刺激前後の蛍光強度比（Ｂ／Ａ）の高いウェルの細胞を選別する。
（３）抗原刺激に反応した細胞の取り出し
スライドグラスとカバーグラスの隙間に空気を入れると、カバーグラスは容易に剥がれる。抗原刺激により反応した細胞を、未刺激の細胞の蛍光強度と抗原による刺激を受けた細胞の蛍光強度の比（Ｂ／Ａ）により選別し、取り出す。
［ハイブリドーマの作製］
本発明の方法では、選択した１個の抗原特異的Ｂリンパ球を培養し、培養により増殖した抗原特異的Ｂリンパ球をミエローマ細胞と融合させハイブリドーマを作製する。１個のＢリンパ球だけではハイブリドーマを作製することは事実上困難である。そこで、まず、１個の抗原特異的Ｂリンパ球を培養し、増殖させる。抗原特異的Ｂリンパ球の培養は、例えば、抗ＣＤ４０抗体またはＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）及びインターロイキン４（ＩＬ−４）を含むインターロイキンの共存下で行う事ができる。この方法では、ＣＤ４０とＩＬ−４による刺激で抗原特異的Ｂリンパ球は増殖する。この増殖方法自体は公知である（ＢａｎｃｈｅｒｅａｕＪ，ｄｅＰａｏｌｉＰ，ＶａｌｌｅＡ，ＧａｒｃｉａＥ，ＲｏｕｓｓｅｔＦ．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍｈｕｍａｎＢｃｅｌｌｌｉｎｅｓｄｅｐｅｎｄｅｎｔｏｎｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４ａｎｄａｎｔｉｂｏｄｙｔｏＣＤ４０．Ｓｃｉｅｎｃｅ２５１：７０−７２，１９９１）。しかし、従来、ハイブリドーマの作製にこの方法を用いた例は無い。
また、Ｂリンパ球の培養は、Ｂリンパ球を増殖することができるマイトーゲン（例えば、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）など）の共存下で行うこと、または抗ＣＤ４０抗体またはＣＤ４０ＬおよびＩＬ−４を含むインターロイキンおよびＬＰＳの共存下で行うことができる。Ｂ細胞の増殖を誘導するものとして、ＬＰＳ以外に、例えば、ＰＭＡ（ｐｈｏｒｂｏｌ１２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ１３−ａｃｅｔａｔｅ）、Ｃａイオノフォア、抗免疫グロブリン抗体等を挙げることができる。
ＬＰＳ等のマイトーゲンで刺激したＢリンパ球を用いてハイブリドーマが作製できることは公知である（例えば、（１）ＶａｎＳｎｉｃｋＪＬ，ＣｏｕｌｉｅＰ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉ−ＩｇＧａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｓｐｌｅｅｎｃｅｌｌｓｏｆ１２９／Ｓｖｍｉｃｅ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，１５５：２１９−２３０，１９８２．
（２）ＬａｎｇｅＭ，ＬｅＧｕｅｒｎＣ，ＣａｚｅｎａｖｅＰＡ，Ｃｏｖａｌｅｎｔｃｏｕｐｌｉｎｇｏｆａｎｔｉｇｅｎｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙａｃｔｉｖａｔｅｄｌｉｐｏｐｏｌｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：ａｔｏｏｌｆｏｒｉｎｖｉｖｏａｎｄｉｎｖｉｔｒｏｓｐｅｃｉｆｉｃＢｃｅｌｌｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，６３：１２３−１３１，１９８３参照。）。但し、１個の抗原特異的Ｂリンパ球を増殖させ、ハイブリドーマ作製に用いた例はない。
抗原特異的Ｂリンパ球の培養は、具体的には、以下の様に行うことができる。
１．マイクロウェルから回収した抗原特異的Ｂリンパ球は、あらかじめ抗ＣＤ４０抗体あるいはＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）をコートしておいた９６ウェルプレートのウェルに移す。このウェルの中には２００μＬのインターロイキン４（ＩＬ−４）が入った細胞培養液（１０％ＦＣＳ入りＲＰＭＩ１６４０培地）もあらかじめ入っている。
２．９６ウェルプレートをＣＯ_２インキュベータ（５％ＣＯ_２）に移し３７℃で１週間から１０日間、細胞を培養する。
３．ＣＤ４０およびＩＬ−４のシグナルにより増殖したＢリンパ球をウェルから回収し、定法にしたがってミエローマ細胞と融合させハイブリドーマを作製する。
４．ＣＤ４０とＩＬ−４のシグナルを加えるときに、可溶性の抗ＣＤ４０抗体あるいはＣＤ４０Ｌを使用する代わりに、ＣＤ４０ＬとＩＬ−４の遺伝子を導入しＣＤ４０ＬとＩＬ−４を産生する付着性の細胞をあらかじめ９６ウェルプレートのウェルに培養しておき、その上で回収した抗原特異的Ｂリンパ球を培養することも可能である。
５．ＩＬ−４に加えて、ＩＬ−２，ＩＬ−５，ＩＬ−６等を加えてもよい。
本発明のハイブリドーマ作製方法では、抗原で免疫したマウスから調製したリンパ球をマイクロウェルアレイチップに添加し、抗原刺激を加えることによりまず抗原特異的Ｂリンパ球を同定する。この同定した１個の抗原特異的Ｂリンパ球を増殖させ、それを用いてハイブリドーマを作製する。従って、増殖し抗体を産生するハイブリドーマの大部分は抗原特異的抗体を産生すると予想される。マイクロウェルアレイチップを用いた抗原特異的Ｂリンパ球の検出法は頻度の低い抗原特異的Ｂリンパ球を検出できるため、これまで困難であった抗原に対する抗体を産生するハイブリドーマを産生することが可能である。
また、従来のハイブリドーマ作製法では、人手および時間がかかったが、マイクロウェルアレイチップを用いることにより抗原特異的Ｂリンパ球の検出が短時間でおこなえるため、人手および時間の節約が可能になる。

以下本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
１．Ｂリンパ球の分離
抗原で免疫したマウスの脾臓およびリンパ節よりリンパ球画分を分離し、さらにＡｕｔｏＭＡＣＳ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ，ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてリンパ球画分からＢリンパ球画分をさらに分離精製する。
２．Ｆｌｕｏ３の細胞への導入（図１参照）
２ｘ１０^６個のＢリンパ球を２μＭＦｌｕｏ３／ＡＭ（同仁、熊本）／ｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（１３７ｍＭＮａＣｌ，２．７ｍＭＫＣｌ，１．８ｍＭＣａＣｌ_２，１ｍＭＭｇＣｌ_２，１ｍｇ／ｍｌグルコース，１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ，２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））に懸濁し、室温に３０分インキュベーションする。ｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒで細胞を洗浄し、細胞内に導入されなかったＦｌｕｏ３／ＡＭを除く。その後細胞をＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳ溶液に懸濁する。
３．マイクロウェルアレイチップ（図２参照）
マイクロウェルアレイチップはｐｏｌｙ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）（ＰＤＭＳ）あるいはシリコンを用いて作製されており、直径１０μｍ、深さ２０μｍのマイクロウェルが２ｃｍｘ２ｃｍのチップ上に縦・横３０μｍの間隔（マイクロウェルの中心から中心までの距離は４０μｍ）で配置されている。チップの両側には厚さ１ｍｍ幅約１ｍｍ長さ２ｃｍのシールを貼る。
４．マイクロアレイスキャナー
本装置は基本的に日立ソフトエンジニアリング（横浜市）のマイクロアレイスキャナー（ＣＲＢＩＯＩＩｅ）を用いており、以下の変更を加えている。搭載されているレーザー（Ｃｙ３用，５３２ｎｍ；Ｃｙ５用，６３５ｎｍ）のうちの１本（Ｃｙ５用，６３５ｎｍ）を４７３ｎｍのレーザーと置換してある。
５．マイクロウェルアレイチップを用いた活性化Ｂリンパ球の検出（図２参照）
上記マイクロウェルアレイチップに上記細胞懸濁液を添加し、５分間静置する。マイクロウェルに入らなかった細胞をＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳ溶液を用いて洗い流す。リンパ球の直径は約１０μｍであり、使用するマイクロウェルの直径が１０μｍであるためにひとつのマイクロウェルにはリンパ球は１個入る。カバーグラスを上記シールの上に置き、チップとカバーグラスの間にＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳ溶液を満たす。このマイクロウェルアレイチップをマイクロアレイスキャナーに挿入し、解像度２．５μｍでスキャンし、データを保存する（抗原刺激前の蛍光のデータ：Ａ）。
次に、チップとカバーグラスの間のＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳ溶液を除き、そこへＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳ溶液に溶解させた抗原（１０μｇ／ｍＬ）を加える。抗原を加えて１分後にマイクロウェルアレイチップをマイクロアレイスキャナーに挿入し、解像度２．５μｍでスキャンし、データを保存する（抗原刺激後の蛍光のデータ：Ｂ）。
刺激前後の蛍光強度の比（Ｂ／Ａ）を計算し、比の大きいウェルを特定する。このウェルの中に抗原特異的Ｂリンパ球が存在する。
６．マイクロウェルからの細胞の分取。
マイクロマニピュレータを用いてガラスキャピラリーを用いることにより顕微鏡下で細胞を分取する。
７．ハイブリドーマの作製方法
１）９６穴プレートのウェルに１０μｇ／ｍＬの抗ＣＤ４０抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を加え、一晩インキュベーションすることにより、抗ＣＤ４０抗体をウェルにコーティングしておく。分離した細胞を９６穴プレートのウェルにあらかじめ加えておいた培地（１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０、１００Ｕ／ｍｌリコンビナントＩＬ−４（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に加え、３７℃、５％ＣＯ_２存在下で、約１週間から１０日培養する。
２）細胞をウェルから回収しエッペンドルフチューブに移す。そこへ約２００個のマウスミエローマ細胞（Ｘ６３．Ａｇ８．６５３）を加え、２０００回転、２分間遠心する。
３）細胞の沈渣をほぐさないよう注意深く上清を取り除き、１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地（ＦＣＳ不含）を加え、細胞を懸濁し、２０００回転、２分間遠心する。
４）細胞の沈渣をほぐさないよう注意深く上清を取り除き、さらに２０００回転、１０秒間遠心する。
５）細胞の沈渣をほぐさないよう注意深く上清を完全に取り除く。
６）２０μｌの３０％ポリエチレングリコール（Ｓｉｇｍａ）を加え、軽く細胞を撹拌する。
７）２０００回転、５分間遠心する。５００μｌのＲＰＭＩ１６４０培地（ＦＣＳ不含）を加え、細胞を懸濁する。次に２０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を５００μｌ添加し、細胞を懸濁する。
８）２０００回転、５分間遠心後、上清を取り除き、細胞を１ｍｌの２０％ＦＣＳ含有ＨＡＴ選択培地に懸濁する。さらに、２０ｍｌの２０％ＦＣＳ含有ＨＡＴ選択培地を加え、２ｍｌずつ２４ウェルプレートのウェルに添加する。
ＨＡＴ選択培地：ＲＰＭＩ１６４０，１ｘ１０^−４Ｍｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ，４ｘ１０^−７Ｍａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ，１．６ｘ１０^−５Ｍｔｈｙｍｉｄｉｎｅ
９）３７℃、５％ＣＯ_２存在下で約７〜８日培養する。
１０）ハイブリドーマの増殖を光学顕微鏡下で観察し、培養上清中の抗体をＥＬＩＳＡ法等を用いて検出する。
８．ハイブリドーマの作製方法（別法）
１）Ｂリンパ球を〔５０，０００個の放射線照射（５０Ｇｙ）したＥＬ４細胞、５００Ｕ／ｍＬヒトＩＬ−２、５ｎｇ／ｍＬＰＭＡ、ＰＷＭで刺激したヒトＴ細胞の培養上清（５％ｖ／ｖ）〕を含む１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（２００μＬ／ｗｅｌｌ）で１週間培養（３７℃，５％ＣＯ_２）する。
２）培養上清を１００μＬ除き、そこへ１０，０００個の放射線照射（５０Ｇｙ）したＣＤ４０リガンドを発現させた付着細胞と５ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ−４を加え、〔５００Ｕ／ｍＬヒトＩＬ−２、５ｎｇ／ｍＬＰＭＡ、ＰＷＭで刺激したヒトＴ細胞の培養上清（５％ｖ／ｖ）〕を含む１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（２００μＬ／ｗｅｌｌ）で１週間培養（３７℃，５％ＣＯ_２）する。
３）培養上清を１００μＬ除き、そこへ１０，０００個の放射線照射（５０Ｇｙ）したＣＤ４０リガンドを発現させた付着細胞を加え、〔５ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ−４、５００Ｕ／ｍＬヒトＩＬ−２、５ｎｇ／ｍＬＰＭＡ、ＰＷＭで刺激したヒトＴ細胞の培養上清（５％ｖ／ｖ）〕を含む１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（２００μＬ／ｗｅｌｌ）で１週間培養（３７℃，５％ＣＯ_２）する。
以下、上記「７．ハイブリドーマの作製方法」の２）〜１０）の操作と同様の操作を繰り返して、ハイブリドーマを検出した。
（抗ＯＶＡ抗体産生ハイブリドーマの調製）
以下に抗ＯＶＡ抗体産生ハイブリドーマの調製例を示す。
免疫
ＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に卵白アルブミン（ＯＶＡ）１０μｇをＣｏｍｐｌｅｔｅＦｒｅｕｎｄＡｄｊｕｖａｎｔに混合したものを注入した。２週間後にＯＶＡ１０μｇをＩｎｃｏｍｐｌｅｔｅＦｒｅｕｎｄＡｄｊｕｖａｎｔに混合したものを同マウス皮下に注入した。さらに２週間後にＯＶＡ１０μｇをＩｎｃｏｍｐｌｅｔｅＦｒｅｕｎｄＡｄｊｕｖａｎｔに混合したものを同マウス皮下に注入した。その後、マウス血清を採取し、ＥＬＩＳＡにてＯＶＡに対する抗体が産生されていることを以下の方法によりチェックした。
血清中の抗ＯＶＡ抗体の検出は以下のように行った。
９６穴プレートにＯＶＡ蛋白をコーティングし、非特異的な結合が起こらないようにブロッキングを行った。この各ウェルに免疫したマウスより得た血清を希釈したものを添加し、室温で２時間反応させた後、洗浄し、アルカリフォスファターゼ標識抗マウス免疫グロブリンを添加し、さらに室温で２時間反応させた。洗浄後、アルカリフォスファターゼの基質を加え、室温で１５分反応させた後、４１４ｎｍの吸光度を測定した。結果を図３に示す。
細胞への蛍光色素の負荷
２週間後にＰＢＳに溶解させたＯＶＡ１０μｇを腹腔内に注入した。４日後に脾臓を取り出し、脾細胞を調製した。脾細胞を１μＭＦｌｕｏ−４ＡＭ、１μＭＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＯｒａｎｇｅ、０．０２％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−１２７を含む緩衝液Ａ（２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，１３７ｍＭＮａＣｌ，２．７ｍＭＫＣｌ，１．８ｍＭＣａＣｌ_２，１ｍＭＭｇＣｌ_２，１ｍｇ／ｍＬｇｌｕｃｏｓｅ，１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ）に１０^７／ｍＬの細胞密度になるように懸濁し、３０分間室温にてインキュベーションした。その後同緩衝液Ａにて細胞を洗浄し、細胞に取り込まれなかったＦｌｕｏ−４およびＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＯｒａｎｇｅを除いた後、細胞を１０^５／μＬになるように１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０液（緩衝液Ｂ）に懸濁した。
ＯＶＡ特異的Ｂリンパ球の検出
マイクロウェルアレイチップ（シリコン製、ウェル直径１０μｍ、ウェル深さ約１５μｍ、ウェルピッチ２０μｍ，約２４万ウェル）に蛍光色素を負荷した脾細胞（１０^５／μＬ）を添加し、ウェルに入らなかった余分な細胞を除去した。カバーグラスでチップを覆った後日立ソフトウェアエンジニアリング（株）製ＣＲＢＩＯＩＩｅ−ＦＩＴＣに挿入し、４７３ｎｍの励起波長、５３５ｎｍの蛍光波長でＦｌｕｏ−４の蛍光を、次いで５３５ｎｍの励起波長、５８５ｎｍの蛍光波長にてＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＯｒａｎｇｅの蛍光をスキャンした。次に、チップをスキャナーから取り出し、チップとカバーグラスの間に入っている緩衝液Ｂを除去し、そこへ緩衝液Ｂに溶解させたＯＶＡ（１００μｇ／ｍＬ）を添加した。チップをスキャナーに挿入し、ＯＶＡ添加後１分後に解像度２．５μｍでスキャンした。刺激前および刺激後のＦｌｕｏ−４の蛍光の比を計算し、蛍光の比が５倍から１０倍増加した細胞のアドレスを特定した。
ＯＶＡ特異的Ｂリンパ球の回収および培養
チップとカバーグラスの間入っていた緩衝液Ｂを除去し、カバーグラスを外した。その後乾燥しないように緩衝液Ｂをチップに添加した。チップを蛍光顕微鏡にセットし、顕微鏡下で観察しながらマイクロマニピュレータを用いて上でスキャナーを用いて同定したＯＶＡ特異的Ｂリンパ球を回収した。
回収したＢリンパ球を〔５０，０００個の放射線照射（５０Ｇｙ）したＥＬ４細胞、５００Ｕ／ｍＬヒトＩＬ−２、５ｎｇ／ｍＬＰＭＡ、ＰＷＭで刺激したヒトＴ細胞の培養上清（５％ｖ／ｖ）〕を含む１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（２００μＬ／ｗｅｌｌ）で１週間培養（３７℃，５％ＣＯ_２）した。次に培養上清を１００μＬ除き、そこへ１０，０００個の放射線照射（５０Ｇｙ）したＣＤ４０リガンドを発現させた付着細胞と５ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ−４を加え、〔５００Ｕ／ｍＬヒトＩＬ−２、５ｎｇ／ｍＬＰＭＡ、ＰＷＭで刺激したヒトＴ細胞の培養上清（５％ｖ／ｖ）〕を含む１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（２００μＬ／ｗｅｌｌ）で１週間培養（３７℃，５％ＣＯ_２）した。さらに培養上清を１００μＬ除き、そこへ１０，０００個の放射線照射（５０Ｇｙ）したＣＤ４０リガンドを発現させた付着細胞を加え、〔５ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ−４、５００Ｕ／ｍＬヒトＩＬ−２、５ｎｇ／ｍＬＰＭＡ、ＰＷＭで刺激したヒトＴ細胞の培養上清（５％ｖ／ｖ）〕を含む１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（２００μＬ／ｗｅｌｌ）で１週間培養（３７℃，５％ＣＯ_２）した。
ハイブリドーマの作製
Ｂリンパ球の増殖を光学顕微鏡にて観察し、細胞が増殖しているウェルから細胞を回収しエッペンドルフチューブへ移した。そこへ約２００個のマウスミエローマ細胞（Ｘ６３．Ａｇ８．６５３）を加え、２０００回転、２分間遠心した。細胞の沈渣をほぐさないよう注意深く上清を取り除き、１ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地（ＦＣＳ不含）を加え、細胞を懸濁し、２０００回転、２分間遠心した。細胞の沈渣をほぐさないよう注意深く上清を取り除き、さらに２０００回転、１０秒間遠心し細胞の沈渣をほぐさないよう注意深く上清を完全に取り除いた。２０μＬの３０％ポリエチレングリコール（Ｓｉｇｍａ）を加え、軽く細胞を撹拌後、２０００回転、５分間遠心した。５００μＬのＲＰＭＩ１６４０培地（ＦＣＳ不含）を加え、細胞を懸濁した。次に２０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を５００μＬ添加し、細胞を懸濁した。２０００回転、５分間遠心後、上清を取り除き、細胞を１ｍＬの２０％ＦＣＳ含有ＨＡＴ選択培地（ＲＰＭＩ１６４０，１ｘ１０^−４Ｍｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ，４ｘ１０^−７Ｍａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ，１．６ｘ１０^−５Ｍｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）に懸濁した。さらに、２０ｍＬの２０％ＦＣＳ含有ＨＡＴ選択培地を加え、２ｍＬずつ２４ウェルプレートのウェルに添加し、３７℃、５％ＣＯ_２存在下で７〜１０日培養した。ハイブリドーマの増殖を光学顕微鏡下で観察し、培養上清中の抗ＯＶＡ抗体を、下記に示すＥＬＩＳＡ法を用いて検出した。図４は検出したハイブリドーマの培養上清中の抗ＯＶＡ抗体のＥＬＩＳＡの結果を示している。培養上清の希釈倍数に応じて吸光度が変化しており、可溶性のＯＶＡを培養上清に加えることで、ウェル底面のＯＶＡに対する抗体の結合が特異的に阻害されることから、培養上清中に抗ＯＶＡ抗体が産生されていることがわかる。
ハイブリドーマ上清中の抗ＯＶＡ抗体の検出は以下のように行った。
９６穴プレートにＯＶＡ蛋白をコーティングし、非特異的な結合が起こらないようにブロッキングを行った。この各ウェルにハイブリドーマの培養上清を希釈したものを添加した（ＰＢＳ）。また、ＥＬＩＳＡ反応の特異性を検討するために別のウェルにはハイブリドーマの培養上清を加える時に同時に２μｇ／ｍＬのＯＶＡあるいはγ−ｇｌｏｂｕｌｉｎを添加した。室温で２時間反応させた後、洗浄し、アルカリフォスファターゼ標識抗マウス免疫グロブリンを添加し、さらに室温で２時間反応させた。洗浄後、アルカリフォスファターゼの基質を加え、室温で１５分反応させた後、４１４ｎｍの吸光度を測定した。結果を図４に示す。

産業上の利用の可能性

本発明によれば、抗原特異的抗体産生Ｂリンパ球を選択、採取し、これを利用してハイブリドーマを作製することで、従来のハイブリドーマの作製方法に比べて、抗原特異的抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングの手間が大幅に省け、ハイブリドーマの作製効率等は大幅に改善される。具体的には、以下の通りである。
（ａ）扱う細胞数が減るので、プレートにまくときのウェル数が減少する。扱う細胞数が少ないのでスクリーニングにかける時間が減り、スクリーニングする人の負担が軽減する。
（ｂ）ハイブリドーマが増殖してきたときに、抗原特異的抗体を産生していないハイブリドーマも増殖してくるが、抗原特異的抗体産生Ｂリンパ球を初めに選択、濃縮しているので、このようなネガティブの細胞の頻度が減少する。
（ｃ）また、マイクロウェルアレイチップを用いて頻度の低い抗原特異的抗体産生Ｂ細胞を検出、採取して、増殖させ、確実にハイブリドーマを作製することで、これまでは作製することができなかった頻度の低い抗原特異的抗体産生Ｂ細胞由来のハイブリドーマを作製することが可能になる。

Claims

ある抗原に特異的に反応するBリンパ球（以下、抗原特異的Bリンパ球という）を１個選択し、選択した１個の抗原特異的Bリンパ球を培養し、培養により増殖した抗原特異的Bリンパ球をミエローマ細胞と融合させハイブリドーマを作製することを含む、抗原特異的抗体産生ハイブリドーマの作製方法であって、
前記１個の抗原特異的リンパ球の選択は、１個の被検体リンパ球が含まれるマイクロウェルを複数有する抗原特異的リンパ球検出用マイクロウェルアレイチップの各マイクロウェルに抗原を添加し、次いで、抗原に反応したリンパ球を検出し、検出された抗原特異的リンパ球をマイクロウェルから取り出すことにより行うこと、並びに
各マイクロウェルへの抗原の添加および抗原に反応したリンパ球の検出を、マイクロウェルをカバーグラスで覆い乾燥を防ぎながら行う、上記方法。
前記選択した抗原特異的Bリンパ球の培養は、抗CD40抗体またはCD40リガンド（CD40L）及びインターロイキン4（IL-4）を含むインターロイキンの共存下で行う請求項１に記載の方法。
前記選択した抗原特異的Bリンパ球の培養は、Bリンパ球を増殖することができるマイトーゲンの共存下で行う請求項1に記載の方法。
前記選択した抗原特異的Bリンパ球の培養は、抗CD40抗体またはCD40LおよびIL-4を含むインターロイキンおよびマイトーゲンの共存下で行う請求項1に記載の方法。
ある抗原に特異的に反応するBリンパ球（以下、抗原特異的Bリンパ球という）を１個選択し、選択した１個の抗原特異的Bリンパ球を培養し、培養により増殖した抗原特異的Bリンパ球をミエローマ細胞と融合させハイブリドーマを作製することを含む、抗原特異的抗体産生ハイブリドーマの作製方法であって、
前記１個の抗原特異的リンパ球の選択は、１個の被検体リンパ球が含まれるマイクロウェルを複数有する抗原特異的リンパ球検出用マイクロウェルアレイチップの各マイクロウェルに抗原を添加し、次いで、抗原に反応したリンパ球を検出し、検出された抗原特異的リンパ球をマイクロウェルから取り出すことにより行うこと、並びに
前記選択した１個の抗原特異的Bリンパ球の培養は、（１）抗CD40抗体またはCD40リガンド（CD40L）及びインターロイキン4（IL-4）を含むインターロイキンの共存下で行うか、（２）Bリンパ球を増殖することができるマイトーゲンの共存下で行うか、または（３）抗CD40抗体またはCD40LおよびIL-4を含むインターロイキンおよびマイトーゲンの共存下で１週間から１０日間行う、上記方法。
抗原特異的リンパ球は、頻度が０．１％以下である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法によりハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマを用いて、モノクローナル抗体を製造する方法。